Eliminacin de virus entricos y/o

sistemas modelo vricos en productos

alimenticios

Informe final
para:

Direccin de Innovacin y Desarrollo Tecnolgico,

Viceconsejera de Poltica e Industria Alimentaria,
Dpto. Agricultura, Pesca y Alimentacin , Eusko
Jaurlaritza - Gobierno Vasco

Sukarrieta, 14 de enero de 2008

 Tipo documento Informe final
Avances en Eliminacin de virus entricos y/o sistemas modelo
Titulo documento
vricos en productos alimenticios
Fecha 14/01/2008
VIREL : Eliminacin de virus entricos y/o de sistemas modelo
Proyecto
vricos en productos alimenticios
Cdigo IA2006025
Direccin de Innovacin y Desarrollo Tecnolgico,
Viceconsejera de Poltica e Industria Alimentaria, Dpto.
Cliente
Agricultura, Pesca y Alimentacin , Eusko Jaurlaritza -
Gobierno Vasco

Equipo de proyecto: Nerea Casas

Iigo Martnez de Maran

Responsable
proyecto Nerea Casas Maeso

Informe final 2/14 AZTI Tecnalia 2005

1. INTRODUCCION ................................................................................................4

2. PRINCIPALES AVANCES REALIZADOS BENEFICIOS GENERADOS......7

ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO. 2.1ESTADO DEL ARTE
7ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

2.2 RESULTADOS MS IMPORTANTES Y UTILIDAD DE

ESTOS.7ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
2.3 PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACION PLAN DE
DIFUSION...9ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.
2.4. POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA-INTERES DE EMPRESAS10
2.5 PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS Y OTRAS ACCIONES........ 8
2.6 FORMACIN DE PERSONAL Y DEL GRUPO DEL TRABAJO . 11
2.7 ENTREGABLES Y OTROS INFORMES. .12
3. CONCLUSIONES.ERROR! MARCADOR NO

DEFINIDO. 13

4. BIBLIOGRAFA.. .ERROR! MARCADOR NO

DEFINIDO........................................14

Informe final 3/14 AZTI Tecnalia 2005

1. INTRODUCCION

El origen de este proyecto se basa en que en los ltimos aos ha habido un

incremento importante de enfermedades vricas como hepatitis infecciosa y
gastroenteritis transmitidas por alimentos que se consumen crudos o
insuficientemente cocinados. Los alimentos ms frecuentemente implicados
son moluscos bivalvos (ej. almejas, ostras, berberechos y mejillones) dado que
son concentradores naturales y utilizan la filtracin como sistema de
alimentacin y acumulan, de esta manera, partculas en suspensin como
bacterias y virus. Otros alimentos involucrados son los vegetales regados por
aguas contaminadas fecalmente. Entre los virus de mayor relevancia
destacamos el virus de la Hepatitis A y el virus Norwalk. Estos virus
patgenos para el humano se encuentran relacionados con materias fecales y
las vas de transmisin ms frecuentes son a travs de aguas contaminadas
fecalmente o bien a travs de manipuladores de alimentos infectados.

Recientemente, Bosch et al. (2001) estudiaron un brote de hepatitis que

afect a 183 personas en Valencia y que se asoci al consumo de almejas. En
nuestra comunidad, en el ao 2000 se registr un brote de hepatitis A
transmitida por almejas contaminadas. Este hecho, junto a la importancia de
las industrias de moluscos bivalvos (depuracin y cultivo almejas) en el Pas
Vasco, ha despertado un gran inters en este campo.

El control sanitario de estos alimentos basado en la determinacin de

indicadores bacterianos de contaminacin fecal en las muestras no es fiable
con respecto a la contaminacin por virus. El VHA y otros virus entricos

Informe final 4/14 AZTI Tecnalia 2005

patgenos se han detectado en muestras de moluscos bivalvos cultivados en
zonas libres de contaminacin y que cumplan la Normativa Europea en
referencia a los niveles de indicadores bacterianos de contaminacin fecal.

Por todo lo anteriormente expuesto, la preocupacin est aumentando tanto

desde el punto de vista epidemiolgico, metodolgico (estandarizacin de
mtodos de deteccin y cuantificacin) como de seguridad alimentaria (riesgos
asociados al consumo de alimentos crudo, poco cocinados o mal manipulados).

Para garantizar la calidad virolgica de los productos alimenticios que salen

al mercado y proteger al consumidor, se requiere, por tanto, de metodologas
de deteccin y/o infectividad as como de tecnologas de inactivacin efectivas
para asegurar la inocuidad de dicho producto sin alterar sus caractersticas
organolticas.

En Azti, se ha empezado a trabajar en el ao 2004 sobre este tema,

empezando la puesta a punto de metodologa de deteccin de VHA y agente
Norwalk en el ao 2005. Sin embargo, y visto la complejidad del tema, todos
los recursos en el ao 2005 se estn centrando en este campo y en el
desarrollo de protocolos para el empleo de otros virus (indicadores no
patgenos) como posibles agentes vricos de ms fcil uso y permitir, de esta
manera, la evaluacin de los diferentes procesos de inactivacin.

El proyecto estar centrado en desarrollar mtodos que permitan detectar la

presencia de virus antes y despus de la aplicacin de procesos de
descontaminacin y en evaluar el impacto de stos sobre la inactivacin de
virus entricos (Hepatitis A, norwalk, y/o surrogates) y/o bacterifagos

Informe final 5/14 AZTI Tecnalia 2005

Los objetivos especficos son:

1. Identificacin de virus no patgenos para el hombre que puedan ser usados

como indicadores a la hora de evaluar la eficacia de las diferentes tecnologas
de descontaminacin

2. Desarrollo de nuevas metodologas de deteccin y/o evaluacin de

infectividad que permitan validar y/o evaluar la eficacia de procesos de
descontaminacin de aguas y/o moluscos y/o vegetales.

3. Seleccin de tecnologas o procesos aplicables a la inactivacin de virus y/o

de modelos vricos en aguas y/o en moluscos y/o en vegetales.

4. Evaluacin tcnica de procesos de descontaminacin (agua y productos

alimenticios).

5. Evaluacin de otras posibles aplicaciones de las metodologas (virus,

bacterifagos, clulas hosperadoras, deteccin e infectividad) y procesos
desarrollados (tratamiento de aguas y/o productos alimenticios)

6. Implementar una metodologa de trabajo en AZTI para validar y evaluar la

eficacia de procesos frente a agentes biticos no convencionales (patgenos
emergentes) presentes en alimentos.

Informe final 6/14 AZTI Tecnalia 2005

2. PRINCIPALES AVANCES REALIZADOS-BENEFICIOS GENERADOS

2.1. ESTADO DEL ARTE

Se ha progresado en la recopilacin y anlisis de la literatura sobre nuevas

metodologas de evaluacin de infectividad de diversos agentes patgenos, y
se ha mantenido un seguimiento de los avances en el rea, con especial
atencin a las aportaciones en el rea de biologa celular y metodologas
moleculares.

Se han estudiado las publicaciones aparecidas en el rea de nuevas

tecnologas de inactivacin que puedan aplicarse en alimentos para la
eliminacin de virus y/o sistemas modelo.

Se ha recopilado informacin relacionada con la utilizacin de bacterifagos

como posibles agentes lticos de bacterias entricas implicadas en infecciones
de origen alimentario como Listeria monocytogenes, Salmonella sppetc.

2.2. RESULTADOS MS IMPORTANTES Y UTILIDAD DE ESTOS

Primeramente se seleccion el virus no patgeno Calicivirus felino como

indicador de los procesos de descontaminacin en diversas matrices
alimentarias. Dada su facilidad de cultivo, rapidez de crecimiento y similitud
con respecto a otros virus patgenos como Norovirus y virus de la hepatitis A
en relacin a su estabilidad y supervivencia en diversos alimentos, el
Calicivirus felino es un virus modelo de inters y relevancia para diversos
estudios de inactivacin en alimentos mediante tecnologas de
descontaminacin.

Con respecto al objetivo 2, se puso a punto la metodologa de deteccin

molecular RT-PCR cuantitativa mediante la seleccin de cebadores y sondas

Informe final 7/14 AZTI Tecnalia 2005

para la deteccin del Calicivirus felino. Esta deteccin se realiz tanto por el
mtodo SYBR Green como mediante la utilizacin de sondas MGB marcadas
con fluorocromos. Paralelamente, se optimiz la metodologa de cultivos
celulares mediante ensayos de infectividad para la evaluacin de la
viabilidad/infectividad de dichas partculas vricas modelo. Para ello, se
compararon dos metodologas de cuantificacin: el mtodo Reed-Muench y el
mtodo de ensayos de calvas. Se seleccion el segundo mtodo por su
simplicidad y rapidez en obtener los resultados de cuantificacin.

Dentro del objetivo 3, realiz una vigilancia tecnolgica con respecto a las
tecnologas o procesos aplicables a la inactivacin de virus y/o de modelos
vricos en aguas y/o en moluscos y/o en vegetales. Se seleccionaron dos
tecnologas de descontaminacin no trmicas: la aplicacin de agua
ozonizada, una tecnologa qumica que se basa en el gran poder oxidante del
ozono para inactivar microorganismos patgenos como bacterias y virus. En
segundo lugar, se seleccion una tecnologa fsica basada en la aplicacin de
pulsos de luz. Ambas tecnologas se aplicaron primeramente en soluciones
modelo y, seguidamente, se evaluaron en la inactivacin de vegetales
inoculados con Calicivirus felino.

Con respecto al objetivo 4, primeramente hemos evaluado la aplicacin de

agua ozonizada para la inactivacin del Calicivirus felino en soluciones
modelo. Para ello, hemos contemplado los siguientes parmetros: tiempo de
contacto con el agua ozonizada, el efecto de la agitacin en la efectividad del
tratamiento y t del agua ozonizada durante su aplicacin. Seguidamente y
con el objetivo de evaluar dicha tecnologa de descontaminacin en vegetales
inoculados, hemos optimizado un mtodo para la extraccin de virus entricos
(Hepatitis A, norwalk, y/o surrogates) en este tipo de alimentos.
Primeramente, hemos comparado dos mtodos de concentracin de virus

Informe final 8/14 AZTI Tecnalia 2005

(Calicivirus felino) en este tipo de matriz alimentaria: la ultraconcentracin a
100.000 xg y la precipitacin con polietilen glycol (PEG-6000). Para ello,
hemos evaluado y comparado ambas metodologas con respecto al porcentaje
de virus recuperado, su simpleza y rapidez. Seguidamente, hemos
comprobado que los extractos finales obtenidos a partir de la metodologa
elegida son compatibles con su anlisis por RT-PCR a tiempo real para la
deteccin del Calicivirus felino.

Con respecto al objetivo 5, se ha establecido un contacto con la empresa EBI

Food Safety, empresa productora de bacteriofagos. Tras varias conversaciones
y cartas cruzadas, se espera firmar un convenio de colaboracin con ellos para
que AZTI sea un centro de validacin de su tecnologa. El primer borrador del
acuerdo ha sido ya enviado a AZTI por parte de la empresa, borrador sobre el
que se ha aportado alguna modificacin y se est a la espera de obtener el
documento final.

Con respecto al objetivo 6, se han puesto a punto varias

herramientas/metodologas de trabajo tanto a nivel interno, incluyendo
tambin la incorporacin de un equipo (microscopio invertido) necesario para
el trabajo, como a nivel externo (relaciones con Hospital de Donostia e
Inbiomed).

2.3. PRODUCCION CIENTIFICA, DIVULGACIN-PLAN DE DIFUSION

Los resultados de este trabajo se han difundido a travs de publicaciones

tcnicas y cientficas, as como mediante presentaciones en congresos y/o
jornadas, tal como se indica a continuacin:

Publicaciones

Casas, N., Amarita, F., Martnez de Maran., I. (2007). Evaluation of an

extracting method for the detection of Hepatitis A virus in shellfish by SYBR-

Informe final 9/14 AZTI Tecnalia 2005

Green Real-time RT-PCR. International Journal of Food Microbiology 120 (1-
2), 179-185.

Casas, N. y Martnez de Maran., I. (2007). Desarrollo de un mtodo de

deteccin de virus entricos patgenos en moluscos bivalvos. Productos del
mar 234-235, 78-79.

Contribuciones a congresos

Casas, N., Montes, M., Amarita, F., Franco, J., Vicente, D. and Iigo Martnez
de Maran (2006). Norovirus and hepatitis A virus RNA detection by reverse
transcription-nested PCR in shellfish. Poster participation. FEMS Madrid,
Spain.

Casas, N., Amarita, F., Montes, M., Vicente, D., Franco, J.,and Iigo Martnez
de Maran (2006). Development of an extracting for the detection of
Norovirus and Hepatitis A virus RNA in shellfish by RT-PCR. Oral
participation. Food Micro. Bologna, Italy.

2.4. POSIBILIDADES DE TRANSFERENCIA-INTERES DE EMPRESAS

El reglamento CE 2073/2005 ha propuesto recientemente incluir parmetros

vricos como NoV en el control sanitario de moluscos bivalvos para garantizar
su calidad microbiolgica. Por esta razn, la obtencin de una metodologa
rpida y eficaz para la deteccin molecular de virus patgenos de inters
resulta de gran relevancia para las empresas agroalimentarias.

Una empresa importante del Pais Vasco se ha puesto ya en contacto con

nosotros para tener informacin de las metodologas desarrolladas en AZTI y
para ver la posibilidad de adaptar stas a sus laboratorios. Tras varias
reuniones con ellos, se ha decidido en AZTI modificar algo la metodologa
previamente desarrollada para adaptarse a algunas de las necesidades

Informe final 10/14 AZTI Tecnalia 2005

planteadas por dicha empresa u otros planteamientos que pudiesen surgir de
otras empresas.

2.5. PLANTEAMIENTO DE NUEVOS PROYECTOS y OTRAS ACCIONES

Los resultados obtenidos en este estudio han permitido adems la generacin

de nuevos proyectos y la preparacin de propuestas para futuros proyectos de
investigacin:

-Se ha presentado, en el marco del convenio de colaboracin susrito entre el

Dpto de Agricultura, Pesca y Alimentacin y la Fundacin Azti, el proyecto
CULTICEL, Desarrollo de cultivos celulares para la validacin/evaluacin de
tecnologas de descontaminacin de agentes biolgicos en aguas y/o
alimentos. Este proyecto hace uso de conocimientos generados en el
transcurso del proyecto VIREL, y est centrado en evaluar el impacto de
diferentes procesos de descontaminacin sobre agentes biolgicos de diversa
naturaleza mediante cultivos celulares.

-Se ha establecido un contacto para una colaboracin futura con la empresa

EBI Food Safety para que AZTI sea un centro de validacin de la tecnologa
emergente de bioconservacin mediante la utilizacin de bacteriofagos lticos
de bacterias patgenas como Listeria monocytogenes.

-Se mantiene la colaboracin con el Hospital Donostia con el fin de plantear

futuras propuestas relacionadas con la incidencia de virus entricos en el
Pas Vasco.

2.6. FORMACION DE PERSONAL Y DEL GRUPO DE TRABAJO

Informe final 11/14 AZTI Tecnalia 2005

Se est formando y especializando un grupo de personas de esta Unidad, y as
acometer actividades de mayor alcance y rigor cientfico-tcnico.
Concretamente se ha asistido a los siguientes congresos y Symposium con el
objetivo de profundizar en tecnologas emergentes de descontaminacin como
ozono y sus aplicaciones as como conocer el procedimiento correcto para la
validacin de nuevas tecnologas de descontaminacin de alimentos.

Asistencia a XII Internacional Ozone Congress, Valencia. Noviembre

2007.

Asistencia a Food Safety: Novel foods: Barcelona. Noviembre 2006.

2.7. ENTREGABLES Y OTROS INFORMES

Trabajamos en la redaccin de protocolos donde se describen la metodologa

desarrollada. Por ejemplo:

Protocolos de extraccin de Norovirus y Virus de la hepatitis A de

diversas matrices alimentarias como vegetales y moluscos.
Protocolos de deteccin molecular de Calicivirus Felino por RT-PCR a
tiempo real.
Protocolo de deteccin de infectividad/viabilidad de Calcivirus felino
por tcnicas de cultivo celular.
Protocolo de evaluacin de la eficacia de las tecnologas de inactivacin
seleccionadas (agua ozonizada y pulsos de luz) mediante tcnicas de
cultivo celular y herramientas moleculares.

Informe final 12/14 AZTI Tecnalia 2005

3. CONCLUSIONES

Como resultado del trabajo realizado a lo largo de este proyecto, se ha

optimizado la aplicacin del Calicivirus felino como indicador a la hora de
evaluar la eficacia de las diferentes tecnologas de descontaminacin. Para
ello, se ha puesto a punto su deteccin por herramientas moleculares y se ha
optimizado una metodologa para su extraccin a partir de diversas matrices
alimentarias.

Asimismo, se ha conseguido introducir en AZTI-Tecnalia una metodologa de

trabajo basada en cultivos celulares para la deteccin de virus
infectivos/viables presentes en alimentos frecuentemente implicados en
transmisin de enfermedades vricas.

La implantacin de un sistema de cultivos celulares permitir la evaluacin

de la eficacia de aquellas tecnologas de descontaminacin en la eliminacin
de diversos agentes biolgicos no convencionales de transmisin alimentaria
para la posterior validacin de dichas tecnologas emergentes.

Informe final 13/14 AZTI Tecnalia 2005

4. BIBLIOGRAFA

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Informe final 14/14 AZTI Tecnalia 2005