Tratamiento con Endonucleasas de Restriccin

Las endonucleasas de restriccin son enzimas de origen bacteriano cuya actividad comprende el reconocimiento
de regiones de secuencia especfica y el posterior corte del DNA doble cadena.
Se conocen decenas de enzimas de restriccin diferentes, y la gran mayora son comercializadas por las empresas
de Biotecnologa (Gibco, Promega, New England, etc). Algunas son protenas recombinantes, mientras que otras son
purificadas de la fuente de origen.
La formulacin de las mismas comprende, en general, un tubo conteniendo la solucin con la enzima en buffer de
almacenamiento apropiado, y otro tubo conteniendo el buffer de reaccin (generalmente como stock 10X).
La digestin de un DNA doble cadena dado consiste en generar una mezcla conteniendo al mismo, ms la cantidad
de enzima adecuada (unidades de actividad enzimtica recomendadas para la concentracin de molde utilizada, para
un tiempo de incubacin dado y para el fin buscado) y el buffer de reaccin en concentracin 1X.. Se lleva al
volumen deseado con agua estril libre de nucleasas.

Ejemplo de protocolo de digestin:

DNA (cuantificado) x l
Buffer de Reaccin (10X) (Vf/10) l
Enzima de Restriccin (X U/l) n l
H20 10l - (x+Vf/10+n) l
Vf Vf

La mezcla se incuba a la temperatura de reaccin recomendada, que en general es 37C.

La unidad enzimtica para las endonucleasas de restriccin suele definirse como la cantidad de enzima necesaria
para digerir 1gr de DNA de fago en un perido de incubacin de 1 hora. Es posible alargar el tiempo de
incubacin de manera de introducir menor cantidad de unidades enzimticas. As, es comn realizar digestiones
incubando overnight a la temperatura recomendada. Para DNAs genmicos o de gran tamao, se recomiendan otras
condiciones de reaccin.
El grado de digestin del DNA molde depende no slo de la presencia de las regiones de secuencia de
reconocimiento para la enzima en cuestin, sino tambin del grado de limpieza o pureza de la muestra. La presencia
de sales o protenas pueden disminuir la eficiencia de la digestin enzimtica por las endonucleasas de restriccin.

De acuerdo a cuales son los pasos o experimentos diseados a partir del DNA digerido (ligaciones, nuevas
digestiones, tratamientos con otras enzimas) ser necesaria la inactivacin de la endonucleasa de restriccin utilizada
y/o la eliminacin del buffer de reaccin. Para ello, algunas son inactivables por calentamiento a 60-75 C durante
10-15 minutos. Otras es necesario extraerlas con fenol y luego precipitar el DNA. Siempre que sea necesario eliminar
el buffer, porque despus es necesario utilizar otro no compatible, habr que realizar una precipitacin del DNA para
luego poder resuspenderlo en la solucin deseada. Muchas enzimas presentan actividad (total o parcial) en varios
buffers de composiciones ligeramente diferentes. As es posible realizar varias digestiones con endonucleasas de
restricin diferentes al mismo tiempo y con un nico buffer de reaccin. Por ello es til analizar en los catlogos la
composicin de las soluciones donde tienen lugar la reacciones, puesto que una buena eleccin de esos buffers
permite hacer un buen diseo experimental que puede permitir ahorrar pasos y por ende evitar manipulaciones y
prdidas del DNA molde.

Referencias.

1)Catlogo Gibco (1999).

2)Catlogo New England (1999).
3)Catlogo Promega (1999).
4)Setting Up Digestions with Restriction Enzimes. Molecular cloning. Sambrook, Fritsch y Maniatis.