GUIA DE LABORATORIO

DE TECNICAS BASICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

TECNICO EN LABORATORIO CLINICO

INSTITUTO PTOFESIONAL VIRGINIO GOMEZ

 2013

LABORATORIO N1
EXTRACCION DE ADN DESDE UN VEGETAL
Las frutas contienen clulas de plantas, que estn protegidas por una pared celular. Esta
pared se puede destruir fsicamente para exponer los contenidos de la clula. Hacer pulpa
de la fruta rompiendo las clulas permite que los contenidos sean expuestos a los agentes
para la extraccin y separacin. Los agentes usados para el experimento de extraccin
ayudan a extractar el ADN del ncleo y separarlo visiblemente de los otros materiales. La
extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas: En primer lugar tiene que
romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la
clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el
ADN. Los jabones utilizados como lava vajillas emulsionan los lpidos de las membranas
celulares y las rompen. La sal evita la unin de las protenas al ADN. Para aislar el ADN hay
que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra
en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Adems de
permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los
cuales son dejados en la solucin acuosa.
OBJETIVO DEL PRACTICO
Obtener desde un vegetal (pltano), fsicamente hebras de ADN
ANTECEDENTES
La extraccin de ADN (cido desoxirribonucleico) es un proceso vital con muchas
aplicaciones cientficas. En la investigacin y la medicina, sus usos incluyen secuenciacin
del ADN, la deteccin de los virus y las bacterias, y la investigacin de enfermedades y
trastornos con base gentica. En el campo de la ciencia forense, es utilizado para la
identificacin de los muertos y los vivos, as como el anlisis de la escena de crimen. A
pesar de sus resultados sofisticados, la extraccin de ADN es en realidad muy simple, y
las tcnicas de extraccin bsicas funcionan igual de bien en un laboratorio de
investigacin o en casa. La extraccin de ADN comienza con la obtencin de una muestra
de ADN. Dado que todos los organismos vivos contienen ADN, las opciones disponibles
para la muestra son prcticamente infinitas, y la eleccin por lo general se relaciona
directamente con el tema del objeto de estudio. El ADN humano es fcil de obtener por
pequeos toques en el interior de la mejilla con un hisopo de algodn. Las muestras de
plantas pueden ser adquiridas cortando una seccin del material de origen.

BENEFICIOS
La extraccin de ADN sirve muchos propsitos diferentes. La evidencia derivada de las
pruebas de ADN han condenado o absuelto a numerosas personas por violacin,
asesinato y otros casos criminales. Tambin es el factor decisivo en muchos casos de
paternidad. Las pruebas tambin han sido capaces de desbloquear los caracteres
hereditarios y caminos ancestrales. Las pruebas han ayudado a identificar cuerpos
encontrados que no se pueden verificar de otra manera.
CONCEPTOS ERRNEOS
Aunque las pruebas de ADN se han vuelto populares en el tribunal de justicia y en la
opinin pblica, no son infalibles. Ha habido casos donde las pruebas de ADN realizadas
correctamente resultaron ser errneas. En el estado de Washington, el ADN de la madre
no coincida con el de sus hijos, a pesar de que ella los dio a luz. Otro ejemplo proviene de
un mdico que violaba pacientes, pero enga a los oficiales mediante la plantacin de
sangre de otra persona en su brazo.
PRECAUCIONES
La mayora de los errores de las pruebas de ADN se producen por un error humano. Los
laboratorios de ensayo han sido objeto de crticas por prcticas deficientes, la
contaminacin de la muestra de sangre y la documentacin descuidada. Ha habido
estadsticas que adopta la ley de los promedios en el tema que discute la posibilidad de
una coincidencia de ADN en contra de las probabilidades de culpabilidad o inocencia.
Esta defensa en el mbito legal se conoce como falacia del fiscal. sta y otras
discrepancias han alimentado los argumentos judiciales contra las pruebas de ADN. Con
estos retos, las pruebas de ADN nunca estarn como nica prueba en un caso penal.
El ADN tanto vegetal como animal se puede extraer y separar para un mejor estudio y las
personas que hacen esto son personas altamente capacitadas, es decir, que tienen los
suficientes conocimientos para llevarlo a cabo correctamente. Ya que requiere de una
serie de pasos y un laboratorio qumico que tenga las suficientes sustancias que se
requieren y los aparatos necesarios.

FUNDAMENTO TERICO
El proceso de extraccin del DNA geonmico sigue ciertas pautas para su correcta
purificacin que son muy diferentes a los empleados en la purificacin de protenas, lo que
refleja las diferencias bsicas en la estructura de estos dos tipos de macromolculas. Una
vez que la muestra es obtenida, se debe degradar para obtener el material gentico que
se encuentra dentro de las clulas individuales. El primer paso en la purificacin del DNA
consiste en homogeneizar las clulas y distar los ncleos de los cuales se extrae el DNA. El
medio de extraccin de ordinario contiene un detergente, (como el SDS), que sirve para
lisar los ncleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la
solucin. El detergente inhibe tambin cualquier actividad nucleasa en la preparacin. El
objetivo de los pasos de purificacin es separar el DNA de materiales contaminantes,
como RNA y protenas. Una solucin de sal concentrada se aade para agrupar la
protena indeseada y los restos celulares.
El ADN normalmente se resuspende en una solucin que contenga Tris y EDTA. Esto se
llama solucin amortiguadora. EDTA (por sus siglas en ingls) significa cido
etilendiaminotetraactico, y por lo general est en el laboratorio como una sal disdica,
Na2C10H16N2O8. Los amortiguadores (solucin Tampn) se usan para prevenir cambios
drsticos del pH, y en este caso, la solucin Tris/EDTA mantiene el ADN en una solucin
con un rango de pH alrededor de 7.0 a 9.0.
El tubo se coloca en una pequea centrfuga, en donde la fuerza centrfuga deja el ADN
difundido en una capa de la solucin por encima del exceso de material ms pesado. A
continuacin, el ADN se retira y se coloca en otro tubo. Se requiere centrifugar la
suspensin para separar las bases, permaneciendo el DNA (y el RNA) en la solucin
dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado
concentrado en la interface. Aadiendo etanol fro. El etanol fro forma una capa arriba de
la solucin acuosa del DNA, el cual, se asla de las dems molculas conforme sale de la
solucin. Este proceso hace que el ADN de la solucin se agrupe en filamentos visibles.
Entonces, el material se coloca otra vez en la centrfuga para forzar a las hebras de ADN a
juntarse. El alcohol se retira y el ADN se deja secar. Una vez que se haya completado el
proceso, la muestra de ADN resultante podr ser almacenada y utilizada para cualquiera
de sus muchos propsitos.
La electroforesis es una de las tcnicas ms empleada en bioqumica y biologa
molecular, usada para separar y a veces purificar macromolculas, especialmente
protenas y cidos nucleicos, que difieren en tamao, carga o conformacin. Cuando las
molculas cargadas son sometidas a un campo elctrico, migran hacia el polo positivo
(nodo) como es el caso de los cidos nucleicos o negativo (ctodo) de acuerdo a sus
cargas. Los fragmentos de DNA lineal migran a travs del gel de agarosa con una
movilidad inversamente proporcional al log10 de su masa molecular, situndose los ms
pequeos ms cerca del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un cdigo de
barras. Cada barra contiene un fragmento de ADN de un tamao determinado ms o
menos cada 23 pares de bases. Entre los diferentes factores que afectan la movilidad de
los fragmentos de ADN en el gel de agarosa que pueden optimizarse para la separacin
de los fragmentos est la concentracin de agarosa.
En resumen. La extraccin de ADN tiene de tres a cuatro pasos operacin, que consiste
en:
1. Romper las clulas abiertas, comnmente conocido como disrupcin de la clula o lisis
celular, para exponer el ADN. sto se consigue comnmente mediante trituracin o
sonicacin de la muestra.
2. Extraccin de lpidos de la membrana mediante la adicin de un detergente.
3. Extraccin de protenas mediante la adicin de una proteasa (opcional pero casi
siempre se hace).
4. Precipitar el ADN con un alcohol, normalmente etanol o isopropanol helado.
Los instrumentos que se utilizan comnmente en las extracciones de ADN son un cuadro
de gel, batidor de cuentas y una centrfuga. Un cuadro de gel se usa para separar el ADN
mediante el envo de cargas a travs de gel de agarosa. Un batidor de cuentas se utiliza
para lisar o se rompen las clulas para acceder a ADN y se gira la centrfuga a
velocidades de ms de 15,000 rpm para ayudar a separar el ADN en diferentes fases de la
extraccin. Aunque los laboratorios forenses y mdicos saben hacer este tipo de trabajo,
cualquiera puede obtener el ADN de cualquier organismo vivo por el siguiente protocolo.
 MATERIALES Y METODOS
Materiales
Agua destilada
Sal
Bicarbonato de sodio
Detergente enzimtico
Etanol 96%
Mortero
Vaso pp
Centrfuga
Cuchillos
Bagueta
Pipetas Pasteur Desechables
Tubos de ensayo grandes y de centrifuga
Probeta
Fruta

Preparacin del Tampn

Medir 120 ml de agua destilada, vaciar a frasco
Agregar 1,5 g de sal
Agregar 5 g de bicarbonato, disolver bien
Agregar 5 ml de detergente enzimtico
Agitar suavemente para evitar formacin de espuma
Dejar enfriar la solucin a 0C

METODO

1. Tozar la fruta en pedazos pequeos

2. Agregarlos a un vaso precipitado
3. Aadir un poco de agua destilada fra
4. Ayudarse con la bagueta y triturar lo que ms se pueda
5. Vaciar 5 ml del triturado a un tubo de ensayo grande
6. Agregar 10 ml de tampn fro
7. Agitar vigorosamente por 3 minutos
8. Vaciar contenido en 3 tubos de ensayo Khan
9. Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm
10. Retirar sobrenadante con pipeta Pasteur plstica a vaso precipitado pequeo
11. Aadir 10 ml de Etanol 96% fro por las paredes del vaso pp
12. Introducir bagueta con cuidado en la interfase que queda con el etanol y la
muestra y moverla suavemente por 1 minuto
13. Sacar la bagueta con el cido Nucleico que contena la fruta.
 CUESTIONARIO

1. Porque el ADN en solucin se precipita en presencia de un alcohol frio?

2. Cul es la funcin de la solucin tampn?

3. cul es la funcin del detergente?

4. cmo podras cuantificar la cantidad de ADN de tu muestra?

5. cul es su funcin y la importancia del ADN en los organismos?

6. Por qu es necesario centrifugar?

7. Se puede extraer ADN vegetal o animal?

8. Conque objetivo se extrae el ADN?

9. Qu tcnicas me permiten estudiar este ADN obtenido? (al menos dos tcnicas)
Expliquelas.
 LABORATORIO N2
Separacin de pigmentos vegetales por
Cromatografa en papel
OBJETIVO:
Conocer la cromatografa como tcnica de separacin de mezclas de sustancias, sus
caractersticas y los factores que en ella intervienen. Estudiar la incidencia del coeficiente
de reparto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Analizar la influencia del solvente en la
separacin cromatogrficas. Observar las diferentes caractersticas de la placa en la
cromatografa.
Introduccin
La palabra cromatografa significa grfica de colores y fue diseada por Michael Tswett
en el 1903. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas
verdes y luego pas este extracto a travs de un tubo de vidrio empacado con carbonato
de calcio; de esta forma logr separar los pigmentos presentes en las hojas.
Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas utilizadas en
la determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin de componentes de las
mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta tcnica es muy efectiva y por lo tanto se
utiliza tanto a nivel de investigacin como a nivel industrial.
Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el mismo
principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria y una fase
mvil.
Los colores de las plantas se deben a la combinacin de los diferentes pigmentos que
contienen. Para aislar y extraer dichos pigmentos se pueden utilizar diferentes
procedimientos. Uno de ellos es la cromatografa, que consiste en la separacin en
bandas de los diferentes pigmentos en funcin de su solubilidad.
La cromatografa en capa fina (CCF) es una forma de cromatografa de adsorcin slido-
lquido que constituye una tcnica importante en Qumica Orgnica para el anlisis rpido
de muestras que en algunos casos puede estar en el rango de los 10-9 g. Frecuentemente
se usa para el seguimiento de la evolucin del progreso de una reaccin, o para el control
y seguimiento de las separaciones que se producen mediante una cromatografa en
columna preparativa.
Para realizar el anlisis de una muestra por CCF se utiliza un adsorbente slido como gel
de slice (SiO2. H2O) o almina (Al2O3), unido a una placa rectangular de vidrio o plstico.
El adsorbente sirve de fase estacionaria. La muestra se aplica en disolucin con un capilar
de vidrio en un extremo de la placa, pero no sobre el mismo borde. A continuacin se
introduce la placa en un tanque cerrado conteniendo un disolvente o mezcla de
disolventes (fase mvil), de manera que la placa quede apoyada sobre el fondo y el punto
con la muestra, por encima del nivel del lquido. El tanque contiene una atmsfera
saturada en el disolvente para lo cual se introduce un trozo de papel de filtro. La fase mvil
asciende por capilaridad, de forma que se produce el mayor o menor avance de los
componentes de la mezcla, segn su polaridad.
Cromatografa en papel: Se basa en la diferencia de velocidad al desplazarse los distintos
pigmentos sobre una banda de papel poroso. Los pigmentos deben estar previamente
disueltos en un disolvente. Los ms solubles se desplazarn ms deprisa y los menos
solubles ms despacio, apareciendo sobre el papel diferentes bandas de color. Para
comprobarlo se ha utilizado un extracto de hoja de espinaca disuelto en etanol y otro de
hoja de lombarda disuelto en acetona. De abajo arriba, con el extracto de espinaca se
observan las siguientes bandas: clorofila a (verde claro), clorofila b (verde oscuro),
xantofilas (amarilla) y carotenos (anaranjada). Con el de lombarda: clorofilas (verde),
xantofilas (amarilla) y antocianinas (morada).
Cromatografa de particin se fundamenta en que las sustancia problema, puedan
tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmisibilidad limitada, uno
permanece fijo en la superficie del papel fase estacionaria generalmente en agua, la
fase mvil constituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente
miscibles en ella. Hay varios tipos de Cromatografa la ascendente (papel hacia arriba),
descendente (papel invertido), radial y de separacin de zonas y sectores.
Las cmaras cromatogrficas son de varios tipos, de forma cilndrica, de unos 30-40 cm
de altura deben cerrar perfectamente, para evitar la evaporacin del disolvente que
satura la atmsfera, se trabaja con papel cromatogrfico (Schleider, Schull, Whatman,
etc.) Al las sustancias a analizar estas al entrar en contacto con los disolventes empiezan
su fase de movilidad, produciendo unas manchas caractersticas nicas para cada
sustancia, las cuales dependern de la cantidad de compuestos que las compongan.
Generalmente, estas manchas no son coloreadas de por s y se ponen de manifiesto por
su posible fluorescencia a la luz ultravioleta frecuente en sustancias orgnicas o mediante
reactivos qumicos que pueden dar una reaccin coloreada y que se reparten en gran
estado de divisin. Los contornos de las manchas as reveladas se sealan con lpiz y
constituyen la referencia para la identificacin de las sustancias aisladas. Como medida
en cromatografa sobre papel se emplea el Rf (del ingls: Retencin factor). Se define
como el cociente de dividir el recorrido 9 la sustancia por el del disolvente, o sea la
distancia que media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la
distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvlente (S). Rf = X/S.
Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a
(verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo
anaranjado) en diferentes proporciones.
El colorante es un compuesto que al aplicarse a un sustrato en forma de dispersin o
difusin le da un color permanente. Tiene que interactuar con el sustrato y este tiene que
ser capaz de absorverlo. Los colorantes tien.
Los pigmentos son compuestos que tienen color y en forma de finas partculas siempre va
disperso en un vehiculo adherente, que suele ser un polmero. Recubre, forma una capa
encima del sustrato (pinturas, barnices, tintas de imprenta, etc.) y es muy insoluble.
Generalmente son inorgnicos: TiO2, ZnO finamente dividido constituyen la pintura
blanca; el negro de humo es Carbono finamente dividido
FUNDAMENTO
Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes
apolares, lo que permite su separacin cuando una solucin de las mismas asciende por
capilaridad a travs de una tira de papel poroso (papel de cromatografa o de filtro)
dispuesta verticalmente sobre una pelcula de un disolvente orgnico (etanol), ya que las
ms solubles se desplazarn a mayor velocidad, pues acompaarn fcilmente al
disolvente a medida que ste asciende. Las menos solubles avanzarn menos en la tira de
papel de filtro.
Aparecern, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o ms,
dependiendo del material utilizado) que estarn ms o menos alejados de la disolucin
alcohlica segn la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseern
diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolucin.

Materiales

Flores u hojas de distintos colores

Alcohol 96%
Bagueta
Placa
 Eter
Vaso pp
Vidrio reloj
Micropipeta de 50 ul y puntas desechables
Papel filtro (tiras de aprox. 5 cm. de ancho y 25 cm de largo)

Procedimiento

Triturar las flores u hojas en una placa con el alcohol hasta que stas se decoloren
y el disolvente adquiera una coloracin intensa.
Decantar y dejar slo el lquido.
En un vaso precipitado poner aproximadamente 10 ml de ter (fase mvil) y tapar
con un vidrio reloj.
Al papel filtro (fase estacionaria) se le debe realizar una lnea a 1 cm del borde con
una regla y lpiz grafito en un extremo.
En esta lnea se colocar la siembra con el extracto obtenido anteriormente a una
distancia entre una y otra de 1 cm.
Introducir el papel en la cmara, sujetndolo con una vagueta en la parte superior
y tapar con el vidrio reloj.
Proteger de la luz, tapndolo con una bolsa oscura.
Dejar aproximadamente 30 minutos o hasta cuando el disolvente llegue al extremo
superior.
Marcar el papel filtro con lpiz grafito la llegada del disolvente y sacarlo de la
cmara.
Esperar que se seque por un momento y observar con luz UV.
 CUESTIONARIO
1-En que se basa la cromatografa?
2-Qu es Rf, como se utiliza?
3-Qu papel juega el solvente?
4para que se ocupa el alcohol?
5-Explique que entiende por fase mvil y fase estacionaria
6- porque es necesario marcar con una lnea en el papel , antes de comenzar la
cromatografa?
7- Qu se espera obtener al final del experimento?
8- Por qu debemos ver el resultado a la luz UV?
9- Qu otros tipos de cromatografa conoce?, explique a lo menos dos