HIPERPRODUCCIN DE BENCILPENICILINA DE Penicillium chrysogenum.

Clasificacin taxonmica de Penicillium chrysogenum.

Reino: Fungi.
Phylum: Ascomycota.
Subphylum: Pezizomycotina.
Clase: Eurotiomycetes.
Orden: Eurotiales.
Familia: Trichocomaceae.; mitosporic Trichocomaceae.
Gnero: Penicillium.
NCBI Taxonomy ID: 5076.

La produccin de fenilacetil-6-APA bencilpenicilina, por Penicillium chysogenum,

donde se obtiene otro metabolito que es la lisina importante para la
retroalimentacin de la va metablica.(Gonzalez,L.J. 2010)
La biosntesis de penicilina en P. chrysogenum est fuertemente regulada por
glucosa, sacarosa y en un nivel ms bajo por otros azcares como la maltosa,
fructosa y galactosa. Esta regulacin no aparece cuando se utiliza como fuente de
carbono la lactosa, por este motivo inicialmente la produccin industrial de penicilina
en P. chrysogenum, fue llevada a cabo utilizando como fuente de carbono lactosa,
ya que se comporta de forma contraria a la glucosa, siendo menor el crecimiento en
biomasa del microorganismo pero no poseyendo un efecto represor sobre la
produccin de penicilina. La lactosa no ejerce efecto represor debido,
probablemente a una lenta hidrlisis de este azcar como resultado de la muy baja
actividad -galactosidasa en este hongo.
La glucosa en altas concentraciones reprime la formacin del tripptido ACV
(reprimiendo la enzima ACVS) y la represin no es reversible por la adicin del cido
-aminoadpico, cistena o valina y tambin reprime la isopenicilina N sintasa, pero
no tiene efecto sobre la isopenicilina N aciltransferasa (IAT) (Revilla y col., 1986).

Una elevada concentracin de fosfato de en el medio reprime la sntesis de muchos

enzimas implicados en la biosntesis de diferentes antibiticos.
Por otra parte, cuando el metabolito secundario procede de un precursor que es
intermediario comn con la biosntesis de un metabolito primario, este ltimo inhibe
la formacin del metabolito secundario.

Por tanto es necesario un medio de cultivo, con adicin de Zn, Hierro y magnesio
(Pars, R y Jurez, A. 2002)

MEDIO DE CULTIVO
INGREDIENTE FUNCION MECANISMO DE REFERENCIA
TRANSPORTE
Macronutrientes
Suero de Leche Fuente de Difusin facilitada Revilla y col.,
carbono 1986
glutamina Fuente de Transporte activo Marzluf, 1993;
Nitrgeno canales de Caddick y col.,
membrana 1994.
CaCl2 Fuente de calcio Canal bomba Gonzlez, L.J.
sodio/ calcio 2010
Clorhidrato de Fuente de azufre Carrier o Lennhinger, 2013,
cistena permeasa por pp.365
difusin facilitada
Mg3(PO4)2 Fuente de fosforo Permeasas, Lennhinger, 2013,
y magnesio difusin facilitada, pp.349
canales inicos
 FeSO4 . 7H2O Fuente de hierro Ferrinas, Bioqumica de
protenas de harper, 2010,
reconocimiento pp.346
Micronutrientes
KMnO4 Fuente de Canales inicos Bioqumica Voet,
manganeso anclados a la 1988,pp.345
membrana
difusin simple
ZnSO4 Fuente de zinc Canal inico Bioqumica de
transmembrana Harper 2010, pp
346
Tabla 1
*MISMO MEDIO SE UTILIZARA PARA LA OBTENCION DE ESPORAS Y PARA
LOS CALDOS FERMENTATIVOS EN EL PRIMER CASO SE USARA AGAR
PARA LA SOLIDIFICACIN DEL MEDIO
Las diferentes cepas de Penicillium se sembraron en placas de medio y se
incubaron a 28 C durante 4-5 das para lograr una completa esporulacin. Los
cultivos en medio lquidos se realizaran en matraces erlenmeyer lisos de 250 ml y
500 ml con un volumen de medio de 50 ml y 100 ml respectivamente. Las
condiciones de cultivo, tanto para el inculo como para la fermentacin, sern de 25
C y 250 rpm en agitadores orbitales. El cultivo de inculo se obtendr extrayendo
las esporas de una placa de medio Power (raspando la superficie del micelio con
una pipeta invertida estril) e inoculndolas en 100 ml de medio de inculo. Tras 24-
48 horas (dependiendo de la cepa), se iniciara la fermentacin aadiendo 10 ml de
este cultivo de inculo (10 % del volumen de la fermentacin) por cada 100 ml de
medio de fermentacin. Para las fermentaciones del escalado se utilizaron
fermentadores de marca comercial de 5 litros de capacidad. Las condiciones de
cultivo sern de 25 C de temperatura, 350 rpm de agitacin inicial y un caudal inicial
de aire estril de 2.5 litros/minuto. En todos los experimentos realizados se
mantandra el mismo porcentaje de siembra utilizado en las fermentaciones en
matraz, adems de utilizar un mismo cultivo de inculo para todos los fermentadores
para poder cerciorarse de tener las mismas condiciones iniciales de fermentacin.
MEDIOS COMERCIALES
Penicillium chrysogenum
Czapek (Cz) Medio mnimo de crecimiento, se usa para microorganismos
capaces de utilizar el NaNO3 como nica fuente de nitrgeno y para la realizacin
de bioensayos en placa (Smith, 1960). Sacarosa......30
g
NaNO3 ....2 g
K2HPO4 ..0.5 g
MgSO4 x 7 H2O....0.5 g
FeSO4 x 7 H2O...0.01 g
Agua destilada..hasta 1 litro
pH 7.0
Se aade agar al 2% (p/v).
Medio Power (PW) Medio de esporulacin y mantenimiento para P. chrysogenum.
Consiste en una fusin de los medios PM1 (Lpez-Nieto y col., 1985) y Czapek-
KCl 0.7 M. Sacarosa..................................................25 g
Lactosa.......................................................5 g
Peptona...................................................2.5 g
Slidos de maceracin de maz..............0.5 g
KCl........................................................26.1 g
NaCl...........................................................2 g
NaNO3.....................................................1.5 g
K2HPO4 .................................................0.25 g
MgSO4 x 7 H2O.....................................0.25 g
Sales PW..................................................1 ml
Agua destilada ..............................hasta 1 litro
pH 6.75
Se aade agar en una concentracin de 2% (p/v)
Sales PW:
KH2PO4 ......................................................6 g
FeSO4 x 7 H2O...........................................1 g
FeCl3 x 6 H2O..........................................0.4 g
CuSO4 x 5 H2O.................................0.2 g
Se completa el volumen hasta 200 ml con agua destilada. El precipitado formado
se homogeiniza por agitacin antes de su uso.
MDP Medio definido de P. chrysogenum (Casqueiro y col., 1999).
cido ctrico.......................................20 g
cido actico................................4.76 ml
Etilamina...3 g
(NH4)2SO4..........................................10 g
KH2PO4................................................2 g
MgSO4 x 7 H2O....................................1 g
FeSO4 x 7 H2O..................................0.1 g
ZnSO4 x 7 H2O................................0.02 g
CuSO4 x 5 H2O................................0.02 g
MnSO4 x 4 H2O..............................0.015 g
CoSO4.............................................0.01 g
NaCl..............................................0.002 g
Agua destilada...................hasta 1.6 litros
pH 5.5
Este medio se dispensa en botellas (80 ml) y se esteriliza en olla a presin.
MDIP El medio definido de inculo para fermentaciones de Penicillium se prepara
suplementando cada 80 ml de MDP con 20 ml de glucosa al 20 % estril.
MDFP El medio de fermentacin de Penicillium se prepara suplementando el MDP
(cada 80 ml) con: 10 ml de sacarosa al 10 %. 10 ml de lactosa al 30 %. Si en la
fermentacin se quiere producir bencilpenicilina se aade adems 2.5 ml de
fenilacetato potsico al 40 % por litro (fenilacetato potsico 40 %: 20 g de cido
fenilactico, 25 ml de KOH 40 % y 25 ml de agua destilada, pH 8.0-8.2).
MCIP Medio complejo de inculo para Penicillium.
Slidos de maceracin del maz.20 g
Extracto de levadura.10 g
Sacarosa.20 g
CaCO35 g
Agua destilada...hasta 1 litro
pH 5.7

MCFP Medio complejo de fermentacin para Penicillium.

Fenilacetato potsico0.4%
Pharmamedia.20 g
Lactosa....50 g
(NH4)2SO4.4 g
CaCO3...5 g
Agua destilada..hasta 1 litro pH 6.1
La lactosa se esteriliza por separado y se aade en condiciones estriles.
FUNCIN Y ACTIVIDAD DE LA BENCILPENICILINA
FUNCIN:
La principal funcin de la bencilpenicilina producida por Penicillium chysogenum es
la de defensa frente a otros microorganismos principalmente estafilococos y
estreptococos, presentes en el medio ambiente, el hongo en su fase estacionaria
produce este metabolito secundario para poder inhibir el crecimiento de estos
microorganismos y as seguir optimizando su crecimiento hasta llegar a la fase
esporulativa, tambin la funcin de este metabolito es proteccin frente a posibles
hongos oportunistas que colonizan a Penicillium chysogenum en su etapa
estacionaria, generando una capa serosa alrededor de sus hifas que se pueden
observar al microscopio y visualmente se observa como un halo blanco y grisaseo,
cuando existe la ausencia de este metabolito se observan hifas y septos fracturados
por hongos parsitos.

ACTIVIDAD:
El propio ncleo de penicilina es el elemento estructural fundamental de actividad
biolgica, la transformacin metablica o la alteracin qumica de esta parte de la
molcula hace que se pierda toda accin bacteriana importante. La cadena lateral
es la que rige muchas de las caractersticas antibacterianas y farmacolgicas de un
tipo particular de penicilina.
Se han producido penicilinas naturales con base en la composicin qumica del
medio de fermentacin utilizado en el cultivo de Penicillium chysogenum. La
bencilpenicilina es la que presenta mayor actividad antimicrobiana de todas y la
nica penicilina natural que se utiliza en clnica.
Las paredes de las bacterias son esenciales para su proliferacin y desarrollo
normales. El peptidoglucano es un componente heteropolimrico de la pared
bacteriana que le da su estabilidad mecnica rgida, gracias a su estructura en forma
de entramado, con innumerables entrecruzamientos. La biosntesis del
petidoglucano incluye unas 30 enzimas bacterianas y puede considerarse en tres
etapas. La tercera etapa de la biosntesis es precisamente la que inhiben los
antibiticos betalctamicos.

Actividad antibitica principalmente en grupos de cocos y bacilos, siendo ms

susceptibles bacterias Gram +, en dosis cristalizadas funciona como bacteriosttico.
ACTIVIDAD:

Metabolito primario

Nodo flexible

Metabolito
secundario

Metabolito
secundario de
inters
ENZIMAS LIMITANTES

El primer paso consiste en la formacin del tripptido ACV llevada a cabo por la
enzima ACV sintetasa
El segundo paso de la va biosinttica es la ciclacin oxidativa del tripptido ACV
para dar lugar al compuesto isopenicilina N ya con una dbil actividad antibitica.
La enzima responsable de la ciclacin es la isopenicilina N sintasa (IPNS), tambin
denominada ciclasa.

El paso final de la biosntesis de penicilinas consiste en la sustitucin de la cadena

lateral de L--aminoadpico por un cido orgnico activado mediante coenzima A,
que en el caso de la bencilpenicilina es el cido fenilactico. Este ltimo paso es
llevado a cabo por la enzima
acil-CoA: isopenicilina N aciltrasferasa.
En hongos filamentosos y actinomicetos productores de cefalosporinas, la ruta
prosigue con la epimerizacin de la isopenicilina N a penicilina N. Se ha propuesto
que esta reaccin transcurre en dos etapas: en primer lugar la isopenicilina N es
activada por la enzima que codifica el gen cefD1 a su derivado de CoA y despus
es epimerizada por la epimerasa que codifica el gen cefD2.
Posteriormente, se produce la expansin del anillo tiazolidnico de la penicilina N
dando lugar a la desacetoxicefalosporina C (DAOC). La enzima DAOC sintasa
(expandasa) es quien lleva a cabo esta reaccin. La DAOC es hidroxilada y oxidada
por la enzima
desacetilcefalosporina C sintetasa (hidroxilasa), sintetizando desacetilcefalosporina
C (DAC). El ltimo paso es llevado a cabo por la DAC acetiltransferasa, que acetila
DAC mediante la transferencia de acetil-CoA al grupo hidroxilo, obtenindose
cefalosporina C.(Gonzalez, L.J. 2010)
 Mecanismo de Vas en las que Referencia
Regulacin interviene Bibliogrfica
Retroalimentacin 1,3-diaminopropanoinduce la Gonzlez, L. J. 2010
sntesis de la espermidina
sintasa,
Retroalimentacin 6-APA a bencilpenicilina Pares, F.R.; Jurez, G.A
por la intervencin de
una enzima
aciltranferasa y
IsopenicilinaN (L-
ismero)
Regulacin Producto L-lisina a Enzima ACV Pares, F.R.; Jurez, G.A
final Sintetasa.

ESTRATEGIAS PARA LA SUPERPRODUCCIN DEL METABOLITO

Todas las evidencias disponibles sugieren que la regulacin catablica por fuente
de carbono en la biosntesis de penicilina es ejercida por una protena reguladora,
el factor transcripcional CreA que regula la produccin de penicilina mediante dos
mecanismos; uno indirecto, controlando el metabolismo general del hongo y otro
directo regulando la expresin del gen pcbAB unindose a las cajas creA. La
mutacin de las cajas creA presentes en la regin intergnica pcbAB-pcbC
disminuye la tasa de represin de, al menos, el primer gen de la ruta biosinttica de
penicilina. Actualmente, el problema de la represin por glucosa ha sido
parcialmente superado usando como fuente de carbono glucosa pero en dosis no
represoras.
De este modo la produccin de penicilina es favorecida bajo condiciones
subptimas para el crecimiento del microorganismo (Demain y col., 1998).

Como se mencion anteriormente la temperatura ptima para este microorganismo

se mantendr en un rango de 23 a 27 C para su crecimiento, como medio de
cultivo se propone en la tabla 1, el uso de papa ya que este contiene un alto
contenido de almidn que racionara la disponibilidad de monosacridos para evitar
la catlisis y as obtener una mayor cantidad de metabolitos secundarios, el jugo de
carne se propone como fuente de protena, ya que para el hongo a usar es un
sustrato rico en N indispensable para que no exista inhibicin del crecimiento, el uso
de Fe, Zn y Mg es para aumentar la produccin de metabolitos secundarios; se
mantendr el medio de cultivo en un rango de pH de 6 a 6.5 y se inocular el 10%
de la cepa madre en proporcin al volumen del medio fermentativo, se usar una
agitacin constante de 340 rpm con el fin de homogenizar el medio; se usara como
ingeniera metablica tcnica de mutacin:
gen pcbAB codifica la ACV-sintetasa

El gen que codifica para la enzima ACV-sintetasa fue denominado pcbAB porque
se supone que son dos los genes implicados en la biosntesis de L--aminoadipil-L-
cisteinil (AC) ya que son enzimas que promueven la sntesis de bencilpenicilina aun
en presencia de lisina (inhibidor de la bencilpenicilina)

El gen pcbC codifica la isopenicilina N-sintasa (ciclasa).

El gen que codifica esta enzima se denomina pcbC, tiene un tamao de 1 Kb y su
secuencia no se encuentra interrumpida por ningn intrn. El primer gen pcbC que
se clon fue el de A. chrysogenum (Samson y col., 1985). Posteriormente, P.
chrysogenum (Carr y col., 1986; Barredo y col., 1989b), enzima limitante para
bencilpenicilina.

Para la optimizacin de la obtencin de bencilpenicilina se usara estas cepas como

alternativa para la mejora de produccin del metabolito de interes

Hoy se conoce uno de los motivos del incremento de produccin de bencilpenicilina

de
P. chrysogenum NRRL-1951. Bsicamente es debido a que P. chrysogenum NRRL-
1951 presenta una mutacin en la posicin 1357 del gen pahA involucrado en el
catabolismo del cido fenilactico, reduciendo la oxidacin de ste y permitiendo
as que se genere mayor produccin de bencilpenicilina (Rodrguez-Siz y col.,
2001).
A partir de la cepa P. chrysogenum NRRL-1951 y por mutagnesis al azar, utilizando
mutgenos tanto fsicos (luz UV, rayos X) como qumicos (nitrosoguanidina) se
fueron obteniendo sucesivas cepas que se seleccionaron segn su mayor
produccin.
Dichos programas han conseguido aumentar la productividad ms de 1000 veces
(Lein, 1986; Elander, 2003). No solo ha sido importante el aumento del rendimiento
en el desarrollo de las cepas, sino que tambin han sido optimizados otros factores
que tienen un efecto muy importante sobre la recuperacin del producto, como por
ejemplo, la eliminacin de pigmentos que se purificaban junto con la penicilina.
Han sido varios los grupos que han investigado desde un punto de vista molecular
las cepas industriales de P. chrysogenum con el fin de poder establecer una relacin
entre las modificaciones genticas existentes en las cepas de alta produccin con
respecto a las cepas utilizadas inicialmente y la alta produccin de penicilina
conseguida.
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