Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
como pptidos, protenas,cidos y lpidos, en el marco de las relaciones entre sus estructuras,
funciones y propiedades, as como Su aplicacin a reas tales como el desarrollo de nuevos
biomateriales, biosensores, bioimgenes y diagnsticos clnicos y teraputica. La nanotecnologa
tambin se puede utilizar para disear y ajustar los tamaos, formas, propiedades y
Nanomateriales. Como tal, existen considerables superposiciones entre la nanotecnologa y la
ingeniera biomolecular, Que ambos se ocupan de la estructura y el comportamiento de los
materiales a escala nanomtrica o menor. Por lo tanto, En combinacin con la nanotecnologa, se
espera que la ingeniera biomolecular abra nuevos campos de nanobio / Bionanotecnologa y
contribuir al desarrollo de nuevos nanobiomateriales, nanobiodevicios y nanobiosistemas.
Esta revisin destaca estudios recientes que usan molculas biolgicas modificadas (por ejemplo,
oligonucletidos, pptidos, Protenas, enzimas, polisacridos, lpidos, cofactores biolgicos y
ligandos) combinados con nanomateriales funcionales En aplicaciones nanobio /
bionanotecnologa, incluyendo teraputica, diagnstico, biosensing, bioanlisis y biocatalizadores.
Adems, esta revisin se centra en fve reas de los ltimos avances en la ingeniera biomolecular:
(a) cido nucleico Ingeniera, (b) ingeniera gentica, (c) ingeniera de protenas, (d) tecnologas de
conjugacin qumica y enzimtica, Y (e) ingeniera de engarces. Se anticipa nanobiomateriales,
nanobiodevicios y nanobiosistemas de ingeniera precisa
La nanobiotecnologa se utiliza en relacin con las formas en que la nanotecnologa se utiliza para
crear materiales, dispositivos y sistemas para estudiar sistemas biolgicos y desarrollar nuevos
sistemas de ensayo biolgico, diagnstico, teraputico, almacenamiento de informacin e
informtica, entre otros. Estos sistemas utilizan la nanotecnologa para avanzar en las metas de los
campos biolgicos. Algunas nanobiotecnologas escalan desde arriba hacia abajo, como
microfludicas a biochips nanofludicos (por ejemplo, el laboratorio sobre un chip para la
separacin de flujo continuo y la deteccin de tales macromolculas como el ADN y las protenas
[2], biosensores de punto de atencin Para la deteccin de biomarcadores y el diagnstico clnico
[3 - 7], y nanopore sensores de estado slido para la secuenciacin del ADN [8]). Otras
nanobiotecnologas escalan desde abajo hacia arriba para la fabricacin de materiales hbridos a
nanoescala, tales como complejos que consisten en nanopartculas (NPs) (por ejemplo, NPs
magnticos, AuNPs y AgNPs, slice NPs, puntos cunticos (QDs), micelas polimricas, liposomas,
dendrmeros, Y fullerenos) y molculas biolgicas, que son muy tiles para biosensing, bioimagen,
diagnstico y aplicaciones teraputicas en la asistencia sanitaria [9 - 15].
Por otro lado, la bionanotecnologa se refiere a las formas en que la biotecnologa se utiliza para
mejorar las nanotecnologas existentes o crear nuevas a travs del estudio de cmo funcionan los
sistemas biolgicos y las aplicaciones de las molculas y sistemas biolgicos a la nanotecnologa.
Nanotecnologas de ADN y ARN, la utilizacin de las propiedades de acoplamiento de bases y
autoensamblaje molecular de los cidos nucleicos para crear materiales tiles, como el ADN
origami, las nanomquinas de ADN, los andamios de ADN para la electrnica, la fotnica y los
arrays de protenas y los aptmeros de ADN y ARN, Ribozimas y riboswitches, son importantes
ejemplos de bionanotecnologa [16, 17]. Otra rea importante de investigacin consiste en
aprovechar las propiedades de autoensamblaje de pptidos, protenas y lpidos para generar
estructuras 3D bien definidas, complejos de protenas funcionales, nanofilms y otras
nanoestructuras, como micelas, micelas inversas y liposomas, que podran utilizarse Como nuevos
enfoques para la produccin a gran escala de los nanomateriales programables [18 - 20]. La
aplicacin de los polmeros de hidratos de carbono combinados con la nanotecnologa en la
ingeniera de tejidos y la medicina son tambin posibles campos de investigacin para el desarrollo
de biomateriales novedosos para biosensing, bioimaging, diagnstico y drugdelivery sistemas [21].
Ya sea con nanobiotecnologa o bionanotecnologa, las molculas biolgicas son indispensables
para fabricar nanomateriales funcionales, nanodispositivos y nanosistemas. Sin embargo, desde el
punto de vista de la aplicacin de materiales biolgicos a la nanotecnologa, los materiales
biolgicos encontrados en la naturaleza siempre tienen suficientes funciones y propiedades. Los
avances recientes en la ingeniera biomolecular, tales como ingeniera gentica, ingeniera de ADN
y ARN, ingeniera de protenas, tecnologas de conjugacin enzimtica y enzimtica especficas del
sitio, tecnologa de autoensamblaje y mtodos masivos de deteccin de alto rendimiento, nos han
permitido mejorar, estabilizar, integrar Y alterar las funciones y propiedades de los materiales
biolgicos. Por lo tanto, es posible crear materiales biolgicos de ingeniera con funciones y
propiedades optimizadas para diversos usos en los campos de bioelectrnica, biosensores,
biocatlisis, imgenes moleculares, actuadores biolgicos, sistemas de administracin de
frmacos, biomateriales para ingeniera de tejidos y medicina regenerativa. En esta revisin, se
discuten estudios recientes que aplican materiales biolgicos modificados a nanobio /
bionanotecnologa y se destacan varias tecnologas de ingeniera biomolecular.
La modificacin superficial de NPs con ligandos biolgicos, tales como folato, pptidos de
arginina-glicina-aspartato (RGD), aptmeros, transferrina, anticuerpos o pequeos fragmentos de
anticuerpo, facilita la seleccin de NP, formacin de imgenes e internalizacin en clulas
especficas, por ejemplo clulas cancerosas y Tejidos tumorales. El folato es una molcula pequea
bien conocida frecuentemente usada como un ligando de la clula de cncer que se dirige a los
receptores de folato con alta afinidad. La conjugacin qumica de folato en la superficie de NPs
puede promover significativamente su entrega dirigida a las clulas cancerosas que sobreexpresan
los receptores de folato [37]. Se sabe que los tumores proliferantes generan nuevos vasos
sanguneos. Este proceso es una caracterstica importante del desarrollo tumoral caracterizado
por la nica sobreexpresin de las integrinas 3 y 5 por las clulas endoteliales nacientes
durante la angiognesis en diversos tumores, pero no por las clulas endoteliales ordinarias. Los
pptidos que poseen la secuencia RGD unen las integrinas 3 y 5 con alta afinidad. Cyclic
RGD pptidos muestran mayor afinidad y estabilidad que los pptidos lineales RGD, lo que permite
su uso para el desarrollo de integrina selectiva, dirigida NPs [38]. Los aptmeros son ARN de
cadena sencilla o oligonucletidos de ADN (15-40 bases) que se pueden unir a molculas diana con
alta afinidad y especificidad debido a la capacidad de las molculas para doblarse en
conformaciones nicas con estructuras tridimensionales (3D). Se ha seleccionado un gran nmero
de aptmeros contra protenas activadas aberrantemente en clulas cancerosas, tales como
endoteliales vasculares
La modificacin de la superficie de NPs con pptidos celulares (CPPs) [43], como el pptido Tat,
penetrain,PVEC, transportan, MPG, Pep-1 y polyarginines, podra facilitar la internalizacin de NP
en las clulas a travs de la entrada directa en el citosol o vas endosmicas. El pptido Tat,
penetrain y pVEC son pptidos cortos (~ 20-mers) derivados del dominio bsico del trans-activador
del VIH-1 de la protena de transcripcin (Tat), la tercera hlice del homeodominio de
Antennapedia y la cadherina, respectivamente. Transportan, MPG y Pep-1 son pptidos
quimricos (~ 30-mers) que se forman por la fusin de dos secuencias naturales derivadas de
galanina / mastoparn, antgeno-T de HIV-gp41 / SV40 y antgeno-T de transcriptasa inversa /
SV40 de HIV , Respectivamente. Estos CPPs llevan principalmente una carga positiva neta y
consisten en secuencias de aminocidos (AA) con unidades AA bsicas repetidas y AAs hidrfobos
o aromticos. Las unidades AA bsicas repetidas podran contribuir no slo a la unin de CPPs a la
superficie de la clula cargada negativamente, sino tambin al escape endosmico de los CPP a
travs del cambio conformacional bajo las condiciones de pH cido de los endosomas tardos.
En muchos casos, NPs en los endosomas o el citoplasma debe colapsar para permitir la liberacin
de sus cargas tiles. Varias estrategias de uso de estmulo-reactivos motities construido en NPs se
han utilizado para mejorar la eficiencia de la liberacin controlada [31]. Estos incluyen los
polmeros sensibles al pH y sensibles a la temperatura, que controlan las interacciones entre las
cargas tiles y NPs [52], y externos reticulantes estimulantes sensibles, que conjugan las cargas
tiles con NPs [53], tales como pH-lbil, enlazadores fotosensibles y enzima-escindibles , Y
reticulantes disulfuro que son sensibles a un entorno intracelular reductor. Se ha utilizado
ampliamente la diferencia en los valores de pH existentes entre los tejidos sanos (pH 7,4) y el
ambiente extracelular de los tumores slidos (pH 6,5-6,8), as como entre el citosol (pH 7,4) y los
endosomas (pH 5,6) Para activar la liberacin de frmacos en un rgano o compartimento
intracelular especfico. Los polmeros con grupos funcionales que pueden alterar la estructura e
hidrofobicidad de NPs como resultado de la protonacin o desprotonacin en respuesta a la
variacin del pH pueden utilizarse en NPs polimricos sensibles al pH. Ejemplos notables de
polmeros sensibles al pH incluyen poli (acrilamida) (PAAm), poli (cido acrlico) (PAA), poli (cido
metacrlico) (PMAA), poli (acrilato de metilo) (PMA), poli (metacrilato de dietilaminoetilo)
PDEAEMA), poli (cloruro de dialil dimetilamonio) (PDDA) y poli (metacrilato de dimetilaminoetilo)
(PDMAEMA). Los polmeros e hidrogeles sensibles a la temperatura presentan una transicin de
fase de volumen a cierta temperatura, lo que provoca un cambio drstico en el estado de
hidratacin. Esta transicin de fase refleja las propiedades competidoras de enlace de hidrgeno,
donde el hidrgeno intra e intermolecular
Los agregados de protenas fotolticas (P-Aggs) para nanocarriers controlables por luz tambin se
han desarrollado utilizando SA [62]. Se construyeron P-Aggs a escala submicrnica mezclando SA y
protenas de carga marcadas con un reactivo de enjaular biotinilado (BCR) y se utilizaron como una
plataforma fcil y verstil para la liberacin inducida por luz de protenas de carga (Figura 4). El
tamao de P-Aggs podra ser controlado ya sea aadiendo un exceso de biotina a la mezcla
anterior para detener el aumento en el tamao de P-Agg o llevando a cabo una reaccin de mezcla
en una piscina de agua de micelas inversas y aadiendo PEG biotinilado para detener el En el
tamao de P-Agg. Por ejemplo, los P-Aggs se prepararon mezclando SA, un conjugado de
transferrina-doxorubicina enjaulado con BCR (Tf-DOX)
Y AF647 biotinilado. Estas P-Aggs multifuncionalizadas con Tf, Alexa Fluor 647 y DOX se
introdujeron en clulas de cncer de colon humano mediante endocitosis va TfR, seguido por la
liberacin selectiva de DOX a partir de P-Aggs en clulas irradiadas con luz, dando como resultado
la induccin espacio-temporal de la diana Apoptosis de clulas cancergenas (Fig. 5). Tambin se
desarroll un mtodo para la preparacin de SA nanohydrogels redox-inmovilizado inmovilizado
va pptido taginduced disulfide formacin mediada por peroxidasa de rbano picante (HRP) (Fig.
6a) [63]. En este sistema, los pptidos con secuencias de HHHHHHC (C-tag) y GGGGY (Y-tag) se
fusionaron genticamente a los terminales N y C de SA (C-SA-Y), respectivamente. Aqu, H, C, G e Y
denotan histidina, cistena, glicina y tirosina, respectivamente. El C-SA-Y se mezcl con PEG de 4
brazos funcionalizado con HRP y tiol para producir un hidrogel inmovilizado en C-SA-Y (gel C-SA-Y)
reticulado con enlaces disulfuro sensibles a redox. El C-SA-Y inmovilizado en el hidrogel conserva
su afinidad por la biotina, permitiendo la incorporacin de cualquier biomolculas funcionales
biotiniladas o sustancias qumicas sintticas Agentes en el hidrogel a travs de la interaccin
biotina-SA. El gel C-SA-Y se prepar adicionalmente dentro de un sistema de micelas inversas para
producir un hidrogel nanomtrico, hacindolo un vehculo de suministro de frmaco potencial. Se
prepar un nanogel C-SA-Y funcionalizado con CPP biotinilado (biotina-G3R15GYC-Alexa Fluor 546)
y la saporina marcada con Alexa Fluor 488, e investigamos su eficacia como un sistema de
administracin de frmacos para las clulas DLD1 de adenocarcinoma de colon humano (Figura 6a
). Los resultados del ensayo de viabilidad celular revelaron que el nanogel C-SA-Y preparado sin
CPP o saporina apenas afect la viabilidad de las clulas DLD1. Por el contrario, el tratamiento de
las clulas de cncer de colon humano con el gel C-SA-Y funcionalizado con CPP y saporina dio
como resultado una marcada disminucin de la proliferacin celular (Figura 6b). Estos resultados
indicaron que el nanogel C-SA-Y haba sido internalizado en las clulas a travs de la CPP,
reduciendo la variabilidad celular por citotoxicidad de la saporina. La capacidad de internalizacin
de CPP y la citotoxicidad de la saporina se integraron con xito en el nanogel C-SA-Y, con ambas
propiedades trabajando cooperativamente para producir un nanogel C-SA-Y citotxico.
Varios nanomateriales han demostrado gran promesa en la imagen debido a sus caractersticas
intrnsecas de la proyeccin de imagen, tales como su brillo, ancho de banda agudo y estabilidad a
largo plazo (por ejemplo, agentes fluorescentes, tales como QDs [72], NP magnticos en MRI [73] y
AuNPs coloidales [74]). Para la obtencin de imgenes, los nanomateriales pueden ser dirigidos a
sitios especficos de la enfermedad dentro del cuerpo conjugando los materiales con biomolculas
especficas de biomarcadores. Estos agentes de formacin de imgenes basados en biomateriales
tambin pueden proporcionar informacin adems de datos anatmicos, por ejemplo,
informacin relacionada con la fisiologa y la funcin, lo que permite un diagnstico ms preciso y
temprano de la enfermedad, como la deteccin altamente sensible del cncer en estadio
temprano.
Las microarrays [76] y las plataformas microfludicas [77, 78] combinadas con nanomateriales
conjugados con biomolculas (por ejemplo, QDs, NPs o CNTs conjugados con enzimas,
anticuerpos, ADN o aptmeros) han permitido la deteccin multiplex simultnea de muchos
biomarcadores de enfermedad para el cncer , Enfermedades infecciosas, diabetes, enfermedades
cardiovasculares y enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, la nueva matriz de microclula de
electroquimioluminiscencia (ECL) [79] y microfludica [80]
La fabricacin debe emplear estrategias para controlar la qumica para asegurar no slo que los
patrones y las estructuras se generen en la ubicacin deseada y dentro de un marco de tiempo
adecuado, sino tambin que se evitan las reacciones secundarias no deseadas. La
bionanofabricacin, el uso de materiales biolgicos y mecanismos para la construccin de
nanodispositivos para biosensibilidad y bioanlisis, ofrece enfoques convergentes para la
construccin de nanointerfaces entre biomolculas y dispositivos por ensamblaje enzimtico o
autoensamblaje. Por ejemplo, el quitosn sensible al pH formador de pelcula se monta
directamente en electrodos bajo condiciones fisiolgicas en respuesta a voltajes impuestos por
electrodo (es decir, electrodeposicin). A travs de la tecnologa recombinante, la ingeniera
biomolecular permite que las protenas diana sean dotadas de etiquetas peptdicas [por ejemplo,
una etiqueta de Glutamina (Gln) para la reticulacin mediada por transglutaminasa entre las
cadenas laterales de residuos Gln y Lisina (Lys)], Controles
Para superar estos problemas, se han desarrollado muchas estrategias para la inmovilizacin de
enzimas. Un enfoque se conoce como "nanopartculas de una sola enzima (SEN)", en las que una
red de polmero hbrido orgnico-inorgnico de menos de unos pocos nanmetros de espesor se
construye a partir de la superficie de una enzima. La sntesis de SEN implica tres reacciones: en
primer lugar, los grupos amino en la superficie de la enzima reaccionan con cloruro de acriloilo
para producir grupos vinilo superficiales; Entonces, los radicales libres inician la polimerizacin de
vinilo a partir de la superficie de la enzima utilizando un grupo monmero de vinilo y grupos
trimetoxi-silano colgantes; Finalmente, la polimerizacin ortogonal se produce mediante
reacciones de condensacin de silanol para reticular las cadenas de polmero unidas a una red
(figura 9). Se demostr que las SEN pueden ser inmovilizadas en slice mesoporosa; Adems, se
demostr que este mtodo de inmovilizacin proporciona un sistema enzimtico inmovilizado
mucho ms estable que el de las enzimas nativas inmovilizadas por adsorcin o unin covalente en
el mismo material [90]. Otro enfoque consiste en introducir interfaces moleculares entre una
superficie slida y enzimas. Varios mtodos basados en este enfoque han sido reportados, como la
modificacin superficial de soportes slidos con polmeros sintticos hidrfilos [91, 92] y pptidos
[93] con especificidades y afinidades hacia las enzimas, y la fusin de enzimas con etiquetas
peptdicas [94] O protenas de anclaje [95, 96].
Los pptidos con una afinidad para los nanomateriales se han identificado a partir de una
biblioteca de pptidos combinatoria, y estos pptidos son herramientas prometedoras para la
tecnologa de fabricacin bottom-up en el campo de la bionanotecnologa. Mediante el uso de
estos pptidos, las enzimas pueden inmovilizarse directamente sobre una superficie de sustrato
con las orientaciones deseadas y sin necesidad de modificar la superficie del sustrato o de
complicados procesos de conjugacin. Por ejemplo, se aplic un pptido de unin a Au para dirigir
el autoensamblaje de la hidrolasa de organofosforado sobre un chemosensor de grafeno revestido
con AuNP. Este sistema de biosensores electroqumicos podra detectar plaguicidas con un tiempo
de respuesta rpido, un bajo lmite de deteccin, una mejor estabilidad operativa y una alta
sensibilidad [97].
La protena anfiflica HFBI (7,5 kDa), clase II hidrofobina, producida por Trichoderma reesei, se
adhiere a superficies slidas y exhibe autoorganizacin en las interfaces agua-slido. Se construy
una protena de fusin entre HFBI y glucosa oxidasa (GOx-HFBI) con un enlazador flexible 21-AA
(secuencia de enlace: SGSVTSTSKTTATASKTSTST). Esta protena de fusin exhibi los niveles ms
altos tanto de adsorcin de protenas como de alta actividad de GOx debido a la presencia del
espaciador de HFBI y del ligador flexible, que forma una capa de protena auto-organizada sobre
superficie slida y permite que el componente de GOx en la protena de fusin sea altamente
Mviles, respectivamente [95].
Las protenas de la capa superficial de clulas bacterianas cristalinas (capa S) de los organismos
procariotas constituyen un sistema nico de autoensamblaje que puede emplearse como
elemento de formacin de patrones para diversas molculas biolgicas, por ejemplo glicanos,
polisacridos, cidos nucleicos y lpidos. Una de las propiedades ms excelentes de las protenas
de la capa S es su capacidad para autoensamblarse en redes de protenas monomolculas en
superficies artificiales (por ejemplo, plsticos, metales nobles o obleas de silicio) o en pelculas o
liposomas lipdicos de Langmuir. Una protena de fusin entre la protena SbpA de la capa S de
Bacillus sphaericus CCM 2177 y la enzima laminarinasa (LamA) de Pyrococcus furiosus retuvo
completamente la capacidad de autoensamblaje del resto de la capa S y el dominio cataltico de
LamA fue expuesto en el exterior Superficie de la red de protenas formada. La actividad
enzimtica de la monocapa de la protena de fusin de la capa S sobre obleas de silicio,
diapositivas de vidrio y diferentes tipos de membranas polimricas se compar con la de slo
LamA inmovilizada con tcnicas convencionales. LamA alineado dentro de la capa de S de la
protena de fusin reticulado catalizada de dos veces mayor liberacin de glucosa de la laminar
polisacrido sustrato en comparacin con la enzima inmovilizada aleatoriamente. Por lo tanto, las
protenas de la capa S se pueden utilizar como bloques de construccin y plantillas para generar
nanoestructuras funcionales en las escalas meso y macroscpica [98].
En muchos organismos, las arquitecturas enzimticas complejas se ensamblan ya sea por simple
fusin gentica o agrupamiento enzimtico, como en el caso de los metabolos, o por la
organizacin cooperativa y espacial utilizando andamios biomoleculares, y estas estructuras
enzimticas mejoran el comportamiento general de la va biolgica (Figura 10) [103, 106, 107]. En
los metabolos, tales como la sintasa de pptido no ribosomal, la sintetasa de poliqutido, la
sintasa de cido graso y la acetil-CoA carboxilasa, los compuestos intermedios de reaccin estn
unidos covalentemente a dominios o subunidades funcionales y transferidos entre dominios o
subunidades. Alternativamente, la canalizacin de sustratos en tales complejos multienzimticos
como metabolos, incluyendo por glucolisis, ciclos de Calvin y Krebs, sintasa de triptfano, fosfato
sintetasa de carbamoilo y sntesis de durrina, se utiliza para evitar la prdida de intermedios de
baja abundancia, para proteger intermedios inestables de interactuar Con disolventes y para
aumentar la concentracin efectiva de reactivos. Adems, las protenas del andamio estn
implicadas en muchas cascadas enzimticas en vas de sealizacin (por ejemplo, el andamiaje
MAPK en la ruta de la cascada de fosforilacin de MAPK) y procesos metablicos (por ejemplo,
celulosomas de Clostridium thermocellum). Desde un punto de vista prctico, existen varios
obstculos para la fusin gentica de ms de tres enzimas para construir complejos
multienzimticos. En primer lugar, las protenas de fusin recombinantes grandes se pliegan
fcilmente y posteriormente se proteolizan o forman cuerpos de inclusin inactivos en E. coli.
Adems, las condiciones ptimas de replegamiento de cada motivo enzimtico en protenas de
fusin no son siempre idnticas. Por ltimo, los mtodos de diseo racional para los enlazadores
peptdicos entre las enzimas que permiten el control o enlazador de la disposicin espacial y la
orientacin an no se han desarrollado [106]. Adems, la ingeniera de las interacciones
interfaciales necesarias para el agrupamiento eficiente de enzimas es extremadamente difcil. Por
lo tanto, los mtodos postraduccionales flexibles que usan conjugacin enzimtica de protena-
protena especfica de sitio y andamios sintticos empleando dominios de interaccin ortogonales
para el montaje han sido particularmente atractivos debido a la naturaleza modular del diseo
biomolecular.
Las protenas de andamio permiten la colocacin espacial precisa de los componentes de una
cascada de reaccin multienzimtica a escala nanomtrica. Los andamios estn involucrados en
muchas cascadas de reaccin enzimtica en vas de sealizacin y procesos metablicos [110], y
pueden proporcionar ventajas sobre reacciones catalizadas por enzimas libremente difusoras
segregando reacciones, aumentando el rendimiento y proporcionando modularidad para la
construccin de redes de reaccin novedosas. Recientemente, se han desarrollado varios sistemas
multienzimticos utilizando protenas de andamios naturales [111] y andamios sintticos [112]
compuestos de elementos de protenas de andamios naturales, como celulosomas [113] y
andamios de transduccin de seales [114].
El antgeno nuclear de proliferacin de clulas (PCNA) es una abrazadera de DNAsliding que forma
una estructura simtrica en forma de anillo que rodea al ADN bicatenario (dsDNA) y acta como
un andamio para enzimas relacionadas con el ADN, tales como ADN polimerasa y helicasa. El
archaeon Sulfolobus solfataricus tiene tres genes PCNA distintos con las tres protenas PCNA
expresadas, PCNA1, PCNA2 y PCNA3, que forman un complejo heterotrimrico. Estos tres PCNA se
fusionaron a las protenas de tres componentes (es decir, PdR, PdX y P450cam) que componan el
sistema P450 de P. putida (Figura 12a). Las protenas de fusin resultantes, PCNA1-PdR, PCNA2-
PdX y PCNA3-P450cam, retuvieron completamente las funciones de las protenas componentes,
incluyendo la heterotrimerizacin de los PCNAs, las actividades catalticas de PdR y P450cam y la
funcin de transferencia de electrones de PdX. Las tres protenas de fusin formaron
inmediatamente un complejo heterotrimrico in vitro por mezcla. Comparado con una mezcla
equimolar de PdR, PdX y P450cam, el complejo mostr un aumento de 52 veces en la actividad de
monooxigenasa de P450cam debido a la transferencia de electrones eficiente dentro del complejo
de PdR a PdX y de PdX a P450cam [111]. Este sistema basado en el andamio PCNA se extendi
adicionalmente a un sistema de P450cam autosuficiente impulsado por fosfito in vitro mediante la
incorporacin de fosfito deshidrogenasa (PTDH) para la regeneracin del cofactor NADH (Fig. 12b)
[115]. El valor de Km de PUPPET incorporado a PTDH (PTDH-PUPPET) para NAD + (51,0 2,7 M)
en presencia de d-alcanfor
Y el fosfito fue ligeramente menor que el de una mezcla equimolar de PUPPET y PTDH (69,7 4,8
M). Este resultado indica que la oxidacin de NADH por el dominio PdR en PTDH-PUPPET podra
incrementar la concentracin local efectiva de NAD + alrededor del dominio PTDH y que este
efecto de proximidad sobre la canalizacin de cofactor podra potencialmente ser mejorado
optimizando la disposicin de PTDH y PdR en el Andamio PCNA.
Se han descrito celulosomas de dise~no que contienen cuatro enzimas diferentes (dos celulasas y
dos xilanasas) de Thermomifida fusca, en donde se incorporaron cuatro enzimas celulolticas
fusionadas con dockerina en localizaciones especficas en un armazn artificial, quimrico, que
contena cuatro cohesinas correspondientes a cada dockerina. Como era de esperar, en
comparacin con su sistema de mezcla enzimtica libre sin el andamio quimrico, los complejos
multienzimticos resultantes mostraron una mayor actividad (~ 2,4 veces) en la paja de trigo como
un sustrato celulsico complejo [116]. Recientemente, Deuber et al. Demostraron la formacin de
complejos multienzimticos in vivo en clulas de E. coli a travs de la expresin de scaffold de
protena sinttica. Se construyeron andamios de protenas con diversas disposiciones de dominios
de fusin a partir de los dominios de interaccin de las protenas de sealizacin, los dominios SH3
y PDZ de ratn y el dominio de unin a protenas de GTPasa de rata (GBD). Las tres enzimas
acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa y hidroximetilglutaril-CoA reductasa, que
catalizan una reaccin en cascada de acetil-CoA a mevalonato, se marcaron genticamente con sus
ligandos peptidilo afines. Estos andamios de protenas y enzimas con ligandos de peptidilo fueron
coexpresados en clulas de E. coli. Un significativo aumento de 77 veces en la produccin de
mevalonato se logr mediante la expresin del andamio optimizado: (GBD) 1- (SH3) 2- (PDZ) 2
[114].
Un tipo modular similar de nanoreactor de cascada de enzimas fue construido usando bloques de
construccin 3D de origami de ADN. Cada una de las unidades de ADN origami contena tres
hebras conjugadas con biotina que sobresalan de la superficie interna de la estructura tubular. La
avidina desglicosilada y NTV se inmovilizaron en la superficie interna de las unidades a travs de la
interaccin biotina-avidina para facilitar la unin adicional de enzimas biotiniladas. El GOx y el HRP
biotinilados se anclaron dentro del compartimiento del origami con la ayuda de NTV. Las
estructuras de origami de ADN tubular inmovilizadas por GOx y HRP resultantes fueron conectadas
entre s por hibridacin de 32 secuencias cortas (3-6 bases). La reaccin en cascada de GOx / HRP
del nanorreactor de dmero montado mostr una actividad significativamente mayor que aquella
sin un armazn de ADN [125].
Estas funciones de las biomolculas, especialmente los cidos nucleicos y las protenas, pueden
manipularse mediante ingeniera de cido nucleico (ADN / ARN), ingeniera gentica, ingeniera de
protenas, tecnologas de conjugacin qumica y enzimtica y ingeniera de engarces.
Posteriormente, las biomolculas diseadas pueden aplicarse a diversos campos, tales como
terapia, diagnstico, biosensing, bioanlisis, bioimagen y biocatlisis (Fig. 14).
Los cidos nucleicos, como el ADN y el ARN, presentan una amplia gama de funciones
bioqumicas, que incluyen el almacenamiento y la transferencia de informacin gentica, la
regulacin de la expresin gnica, el reconocimiento molecular y la catlisis. La ingeniera de
cidos nucleicos basada en las caractersticas de emparejamiento de bases y de autoensamblaje
de los cidos nucleicos es clave para las nanotecnologas de ADN / ARN, como las que implican
ADN / ARN origami, aptmeros y ribozimas [16, 17, 127].
3.1.1 Origami de ADN / ARN El origami de ADN / ARN de origami, un nuevo sistema de ensamblaje
de cido nucleico programado, utiliza la naturaleza de la complementariedad de cidos nucleicos
(es decir, la especificidad del emparejamiento de bases de Watson-Crick) para la construccin de
nanoestructuras mediante interacciones intermoleculares De los hilos de ADN / ARN. Se han
creado nanoestructuras de ADN / ARN 2D y 3D con una amplia variedad de formas y tamaos
definidos con un control preciso sobre sus geometras, periodicidades y topologas [16, 128, 129].
Rothemund desarroll una
Y el mtodo simple del "uno-pote" 2D del origami del ADN nombrado "origami del ADN del
andamio", que implica el plegamiento de una sola hebra larga del ADN viral en un andamio del
ADN de una forma deseada, tal como cuadrado, rectngulo, tringulo, Estrella acentuada, e
incluso una cara sonriente usando mltiples hebras cortas de "grapa" [130]. Para fabricar y
estabilizar diversas formas de azulejos de ADN, los motivos cruzados han sido diseados a travs
del intercambio recproco de backbones de ADN. Los azulejos de ADN ramificado tambin se han
construido utilizando extremos pegajosos y motivos de unin cruzada, tales como tringulos de
tensegridad (estructuras rgidas en forma de matriz peridica) y tringulos algortmicos de
Sierpinski autoensamblados (un fractal con la forma general de un tringulo equiltero). Estos
azulejos de ADN puede auto-ensamblar ms en NTs, hlice haces y complejos motivos de ADN y
arrays [17]. Las estructuras 3D de origami de ADN se pueden disear extendiendo el sistema de
origami de ADN 2D, por ejemplo, empaquetando dsDNAs, donde la posicin relativa de dsDNAs
adyacentes es controlada por crossovers o plegando dominios 2D de origami en estructuras 3D
usando hebras de interconexin. Las redes de ADN 3D con topologas tales como cubos, poliedros,
prismas y buckyballs tambin se han fabricado usando un conjunto mnimo de hebras de ADN
basadas en la flexibilidad de la unin y la rigidez de los bordes.
Debido a que las propiedades de plegado de ARN y ADN no son exactamente iguales, el conjunto
de ARN se desarroll generalmente bajo una perspectiva ligeramente diferente debido a las
interacciones secundarias en una cadena de ARN. Por esta razn, la tectnica de ARN basada en
las interacciones terciarias se han introducido para el autoensamblaje del ARN. En particular,
horquilla-horquilla o horquilla-receptor interacciones se han utilizado ampliamente para construir
estructuras de ARN [16]. Sin embargo, los principios fundamentales del origami de ADN son
aplicables al origami de ARN. Por ejemplo, el uso de uniones de tres y cuatro vas para construir
nuevas y diversas arquitecturas de ARN es muy similar a los enfoques de ramificacin utilizados
para el ADN. Tanto el ARN como el ADN pueden formar rompecabezas y desarrollarse en paquetes
[17]. Una de las caractersticas ms importantes de ADN / ARN origami es que cada posicin
individual de la estructura 2D contiene informacin de secuencia diferente. Esto significa que las
molculas funcionales y las partculas que estn unidas a las hebras de la grapa se pueden colocar
en las posiciones deseadas en la estructura 2D. Por ejemplo, NPs, protenas o tintes se
posicionaron selectivamente en estructuras 2D con control preciso conjugando ligandos y
aptmeros a las hebras de grapas. Estos andamios de ADN / ARN origami se podran aplicar a la
funcionalizacin biomolecular selectiva, una sola molcula de imgenes, ADN nanorobot, y el
diseo de la mquina molecular [131]. El uso potencial de nanoestructuras de ADN / ARN como
andamios para cristalografa de rayos X y nanomateriales para dispositivos nanomecnicos,
biosensores, sistemas biomimticos para transferencia de energa y fotnica, y diagnsticos
clnicos y teraputicos se han revisado a fondo en otro lugar [16, 17, 127-129] ; Los lectores son
referidos a estos estudios para obtener informacin ms detallada.
3.1.2 Aptmeros
Los aptmeros son cidos nucleicos monocatenarios (ARN, ADN y ARN o ADN modificado) que se
unen a sus blancos con alta selectividad y afinidad debido a su forma 3D. Se aislan de 1012 a 1015
bibliotecas oligonucleotdicas combinatorias sintetizadas qumicamente mediante seleccin in
vitro [132]. Se han desarrollado muchos protocolos, incluyendo secuenciacin de prxima
generacin de alto rendimiento y bioinformtica para la seleccin in vitro de aptmeros, y han
demostrado la capacidad de los aptmeros para unirse a una amplia variedad de molculas diana,
que van desde pequeos iones metlicos, molculas orgnicas, Y los pptidos de grandes
protenas e incluso clulas complejas o tejidos [39, 133 - 136]. El procedimiento general de
seleccin in vitro para un aptmero, SELEX (figura 15), es el siguiente: se prepara una acumulacin
de ADN sinttico por sntesis qumica. Los ADN consisten en una regin de secuencia aleatoria o
mutagenizada flanqueada en cada extremo por una secuencia constante y con un promotor de
ARN polimerasa de T7 en el extremo 5 '. Este ADN se amplifica mediante unos pocos ciclos de
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y posteriormente se transcribe in vitro para formar el
pool de ARN. Las molculas de ARN son entonces seleccionadas en base a su afinidad de unin a la
molcula diana, por ejemplo, pasndolas a travs de una columna de afinidad inmovilizada por
diana. Los ARN retenidos son eluidos, inversos
Transcrito, amplificado por PCR y transcrito; Entonces, se repite todo el ciclo. Despus de mltiples
rondas de seleccin (generalmente 6-18 rondas), se pueden tamizar poblaciones bastante grandes
(> 1013 secuencias diferentes), aumenta la proporcin de secuencias de ARN activo a inactivo y
finalmente el grupo se ve dominado por molculas que pueden unirse al blanco molcula.
Los nucletidos modificados qumicamente proporcionan varias ventajas, tales como una
resistencia mejorada a la nucleasa, una afinidad de unin mejorada, una mayor diversidad de
agrupaciones de oligonucletidos y una tasa de xito mejorada de seleccin. Por lo tanto, un
grupo de oligonucletidos modificado se est volviendo ms popular para la seleccin de
aptmeros. Aunque los nucletidos modificados qumicamente y los desoxinucletidos trifosfatos
no pueden ser reconocidos por las polimerasas de ARN T7 de tipo salvaje y las ADN polimerasas de
tipo A, tales como Taq polimerasa, afortunadamente, los nucletidos trifosfatos modificados (2'-
fluoro pirimidinas, 2'-O-metil nucletidos) y (P. Ej., Restos de indol, bencilo o alquino) pueden ser
reconocidos por algunas polimerasas de ARN mutantes [137] y polimerasas de tipo B, y Pwo y Vent
(exo) ADN polimerasas [ 138], respectivamente.
3.1.3 Ribozymes
Las ribozimas naturales son molculas de ARN que tienen actividad enzimtica para escindir
enlaces fosfodister. Por lo tanto, las ribozimas tienen un potencial significativo para el uso en
cncer, enfermedades genticas y teraputicas vricas mediante la inhibicin especfica de la
expresin gnica a travs de la escisin de sustratos de ARN, como el ARNm, con el genoma viral
del ARN que contiene una secuencia complementaria al centro cataltico de los ribozimas. ].
Las ribozimas naturales se unen a los ARN del sustrato a travs del emparejamiento de bases de
Watson-Crick, que ofrece la divisin secuencial de los ARN del sustrato. Dos ribozimas, la "martillo
cabeza" ribozima y la "horquilla" ribozima, han sido ampliamente estudiados [142]. El motivo
cataltico de una ribozima est rodeado por una secuencia flanqueante que es responsable de
'guiar' la ribozima a su ARN diana y dar estabilidad a la estructura. Con la ribozima de cabeza de
martillo, la escisin depende de iones metlicos divalentes, como el magnesio, y puede ocurrir
despus de cualquier triplete NUH (donde N = cualquier nucletido y H = A, C o U) dentro de la
secuencia de ARN diana. La cintica de la reaccin puede variar significativamente (hasta uno o
ms rdenes de magnitud) con diferentes combinaciones de secuencias flotantes de tripletes; Por
lo tanto, la eleccin de un apropiado sitio de escisin de ribozima es el primer paso y ms
importante en el diseo de ribozyme cabeza de martillo [143].
Se han aislado ribozimas artificiales con propiedades catalticas mediante seleccin in vitro a partir
de bibliotecas de cido nucleico aleatorias o combinatorias. Pueden usarse variaciones de las
estrategias de seleccin de aptmeros para aislar secuencias de cido nucleico catalticas
cambiando el paso de seleccin de unin del proceso de seleccin de aptmero a un paso de
seleccin de actividad (figura 15). Tales aproximaciones se han utilizado para cambiar la funcin de
ribozimas conocidas y para crear completamente nuevas de una piscina de cido nucleico
aleatoria o combinatoria [144]. Se podra catalizar una amplia gama de reacciones qumicas, tales
como la formacin, escisin y reordenacin de diversos tipos de enlaces covalentes. Ejemplos que
incluyen no slo la escisin o ligadura de sustratos de ARN por transferencia de fosfoester en el
centro de fsforo [144, 145], sino tambin reacciones de Diels-Alder, formacin de enlaces N-
glicosdicos, alquilaciones, acilaciones y formaciones de enlaces amdicos en los centros de
carbono. , 146]. El rendimiento cataltico, la resistencia a las nucleasas y la diversidad de las
agrupaciones de oligonucletidos de ribozimas tambin podran ser mejorados mediante la
incorporacin de nucletidos modificados qumicamente, tal como se utiliza en los protocolos de
seleccin de aptmeros [146].
Las ribozimas se pueden expresar a partir de un vector, que ofrece la ventaja de la produccin
intracelular continua de estas molculas. Sin embargo, las tasas de rotacin de las ribozimas son
bastante bajas en algunos casos, ya que la disociacin del producto de escisin es la etapa de
limitacin de la velocidad que controla su utilidad. Adems, algunas ribozimas requieren altas
concentraciones de iones metlicos divalentes para una escisin eficiente del sustrato, lo que
puede limitar su uso en ambientes intracelulares. Todas estas preocupaciones,
La ingeniera gentica es una poderosa herramienta para crear genes artificiales para protenas y
enzimas con propiedades deseadas, mejoradas y mltiples, tales como reconocimiento molecular,
unin molecular, autoensamblaje, catlisis, transporte molecular, transduccin de seales,
transferencia de energa, transferencia de electrones y luminiscencia, Que contribuyen a
desarrollar nuevos nanobiomateriales, nanobiodevices y nanobiosistemas. Esta tecnologa se ha
empleado para desarrollar genes in vitro a travs de un proceso iterativo que consiste en la
generacin recombinante. Junto con el poderoso HTS o mtodos de seleccin, la ingeniera
gentica se ha aplicado ampliamente para resolver problemas en la ingeniera de protenas. Esta
tecnologa incluye tecnologas para la manipulacin directa de genes, tales como mutagnesis
gnica, amplificacin de secuencia de ADN [por ejemplo, PCR y amplificacin de crculo rodante
(RCA)], mezcla de ADN y fusin gnica.
Existen muchos mtodos para generar diversidad gentica y crear bibliotecas combinatorias. Por
ejemplo, en la ltima dcada se han desarrollado diversas tcnicas de manipulacin gnica in vitro
que permiten diversos tipos de cambios dirigidos en un gen mediante la modificacin (insercin,
delecin o sustitucin) de uno o ms codones (mutagnesis gnica), intercambio de dominios
entre los genes relacionados (DNA shuffling) y fusionando dominios de diferentes secuencias de
genes funcionales (fusin de genes), dando como resultado la creacin de diversas colecciones de
clones de genes mutantes. Existen dos tipos principales de mutagnesis, es decir, la mutagnesis
aleatoria y dirigida.
La mutagnesis dirigida a un sitio es un mtodo para alterar una secuencia gnica en una
localizacin seleccionada usando PCR de extensin superpuesta. Las mutaciones puntuales,
inserciones o deleciones se introducen incorporando cebadores de ADN que contienen la
modificacin deseada con una ADN polimerasa en una reaccin de amplificacin. La mutagnesis
de saturacin de sitios permite adems la sustitucin de sitios de protena predeterminados
contra los veinte posibles AAs a la vez empleando cebadores degenerados en los que las tres bases
del codn dirigido son reemplazadas por mezclas, ms comnmente NNN o NNK (N = A, C, G O T, K
= G o T). Un codn completamente aleatorio, NNN, da como resultado un tamao de biblioteca de
64 secuencias diferentes que codifican todos los 20 AA y 3 codones de parada. Por otra parte, los
codones NNK reducen el tamao de la biblioteca a la mitad, todava codificando 20 AA, con la
ventaja de tener slo un codn de parada. En esta configuracin, los AAs W, F, I, Y, Q, N, H, K, D, E,
M y C estn codificados por un solo codn, mientras que G, A, V, P y T y L , S, y R son codificados
por dos y tres codones, respectivamente [154].
Puede usarse el mtodo de mezclado de ADN; Este mtodo implica la fragmentacin de los genes
parentales utilizando enzimas de restriccin en lugar de DNasa I [156] o utiliza singlestranded ADN
(ssDNA) plantillas en lugar de dsDNA plantillas para DNase I fragmentacin [157]. Puesto que el
uso de ssDNA como plantillas disminuir la probabilidad de formacin homo-dplex, el porcentaje
de los genes parentales en la biblioteca barajada debe ser reducido significativamente.
Exon barajar es un mecanismo molecular natural para la formacin de nuevos genes eucariotas.
Las nuevas combinaciones de exones pueden ser generadas por recombinacin dentro de las
secuencias de intrones intermedias, dando nuevos genes reordenados con funciones alteradas. El
proceso natural de exon barajar puede imitarse in vitro mediante la generacin de bibliotecas de
genes exon-barajados y, posteriormente, la deteccin de ADN objetivo de las bibliotecas [162]. En
este mtodo, los exones o combinaciones de exones que codifican dominios de protenas se
amplifican mediante PCR usando mezclas de oligonucletidos quimricos que determinan qu
exones se empalman juntos. Por medio de una reaccin de polimerasa de superposicin de
autocebado, las mezclas de estos fragmentos de PCR se combinan combinatoriamente en genes
de longitud completa. La recombinacin se realiza conectando un exn de un gen a un exn de un
gen diferente. De esta manera, dos o ms exones de diferentes genes se pueden combinar
conjuntamente ectpicamente, o el mismo exn puede ser duplicado, para crear una nueva
estructura exn-intrn.
Los genes de fusin se crean mediante la fusin gentica de los marcos de lectura abiertos de dos
o ms genes en el marco a travs de la ligadura o PCR de extensin de solapamiento. Para
construir tales genes de fusin, son posibles dos tipos de conexin. Una es la fusin "de extremo a
extremo", en la que el extremo 5 'de un gen est unido al extremo 3' del otro gen. La segunda es la
fusin insercional, en la que un gen se inserta en el marco en el centro del otro gen padre [163].
Estos mtodos ofrecen varias ventajas para la produccin de genes de fusin con alto rendimiento
en diferentes orientaciones e incluyendo secuencias enlazador para maximizar el rendimiento de
los socios de fusin [164].
[161]. Sin embargo, el principal inconveniente del rediseo de protenas es que el conocimiento
estructural detallado de una protena a menudo no est disponible, e incluso cuando est
disponible, las sustituciones en sitios enterrados dentro de las protenas son ms propensas a
romper sus estructuras y funciones. Por lo tanto, todava es muy difcil predecir los efectos de
diversas mutaciones en las propiedades estructurales y funcionales de la protena mutada, aunque
muchos estudios se han hecho para predecir los efectos de las sustituciones de AA en las
funciones de protenas [168]. Otro mtodo racional de diseo de protenas es el diseo de
protenas computacionales, que tiene como objetivo el diseo de nuevas molculas de protenas
con una estructura de protenas diana plegable, funcin y / o comportamiento novedoso. En este
enfoque, las protenas se pueden disear mediante la configuracin trascendental de AA
secuencias compatibles con estructuras existentes o postulados plantilla de la columna vertebral
(de novo diseo) o haciendo variaciones calculadas a una estructura de protenas conocidas y su
secuencia (protena rediseo) [169]. Los enfoques de diseo de protenas racionales hacen
predecir secuencias AA de protenas que se doblarn en estructuras 3D especficas.
Posteriormente, estas secuencias predichas deben ser validadas experimentalmente a travs de la
sntesis qumica de un gen artificial, seguido por la expresin y purificacin de la protena. Los
detalles de los mtodos computacionales de diseo de protenas no sern cubiertos en esta
revisin; Los lectores se remiten a varias revisiones recientemente publicadas [170, 171].
El enfoque de evolucin dirigida (Figura 17, el panel de la derecha) implica muchas tecnologas,
tales como la diversificacin de bibliotecas de genes, las tecnologas de vinculacin genotipo-
fenotipo, tecnologas de visualizacin, sntesis de protenas libres de clulas y tecnologas de
deteccin y evaluacin de fenotipo. ]. Este enfoque imita el proceso de seleccin natural
(evolucin darwiniana) para evolucionar las protenas hacia una meta objetivo. Implica someter un
gen a rondas iterativas de mutagnesis (creacin de una biblioteca molecular con diversidad
suficiente para la funcin alterada), seleccin (expresin de las variantes y miembros aislantes con
la funcin deseada) y amplificacin (generacin de una plantilla para la siguiente ronda). Este
proceso se puede realizar in vivo (en clulas vivas), o in vitro (libre en soluciones o microgotas). La
diversidad molecular se crea tpicamente mediante diversos mtodos de mutagnesis aleatoria y /
o recombinacin gnica in vitro, como se describe en "Gene engineering".
Los mtodos de generacin de la diversidad y los mtodos de seleccin / HTS. La tecnologa clave
de HTS / mtodos de seleccin es la vinculacin del genotipo (el cido nucleico que se puede
replicar) y el fenotipo (el rasgo funcional, como la unin o la actividad cataltica). La seleccin de
aptmeros y ribozimas a partir de las bibliotecas de cido nucleico se puede realizar mucho ms
rpido que las de las protenas funcionales porque los propios cidos nucleicos tienen actividades
de unin o catalticas (es decir, fenotipos seleccionables), de tal manera que el genotipo y el
fenotipo son idnticos. Sin embargo, puesto que las protenas no pueden ser amplificadas, es
necesario tener un enlace entre el fenotipo exhibido por la protena y el genotipo (ARNm o ADN)
que lo codifica para desarrollar protenas.
Las tecnologas de visualizacin in vitro se basan en sistemas CFPS. Los avances recientes en las
tecnologas y aplicaciones del CFPS se han revisado en otra parte [182-185]. La tecnologa de
visualizacin de ARN incluye la visualizacin de ARNm y la visualizacin de ribosomas [186]. MRNA
muestra de forma covalente una protena a su ARNm de codificacin a travs de un enlazador de
puromicina que est unido covalentemente a la protena a travs de la formacin de enlaces
peptdicos catalizada por ribosomas. La presentacin de ribosomas vincula no covalentemente una
protena a su ARNm de codificacin genticamente fusionado a una secuencia espaciadora que
carece de un codn de parada a travs de un ribosoma porque la protena naciente no se disocia
del ribosoma. Tales tecnologas de visualizacin que utilizan reacciones de traduccin in vitro
pueden detectar protenas que seran
Txicas para las clulas y pueden cubrir bibliotecas bastante grandes (1015) evitando el cuello de
botella restringido del tamao de la biblioteca de las tecnologas de visualizacin in vivo (Tabla 1).
Existen varias tecnologas de visualizacin de ADN in vitro, tales como visualizacin CIS [187],
visualizacin de M. Hae III [188], visualizacin STABLE [189], visualizacin de microbead [190] y
compartimentacin in vitro (IVC) [191]. CIS mostrar enlaces no covalentemente RepA (protena de
unin a ADN) protena de fusin y su plantilla de ADN de codificacin a travs de la interaccin
entre RepA y el elemento CIS de la plantilla de ADN. Para la presentacin de M. Hae III, la ADN
metiltransferasa M. HaeIII enlaza covalentemente una protena y su plantilla de ADN. La
tecnologa IVC utiliza las gotitas acuosas en emulsiones agua-aceite para compartimentar genes
individuales y productos gnicos. Las tecnologas de exhibicin STABLE y de microperlas utilizan la
unin de biotina-estreptavidina no covalente para unir plantillas de ADN marcadas con biotina y
protenas fusionadas con estreptavidina.
Los detalles de HTS y mtodos de seleccin, como la fluorescencia de clulas activadas por
clasificacin de fenotipo basado en la deteccin y evaluacin de tecnologas junto con estas
tecnologas de visualizacin [172, 192-195], as como las aplicaciones de la evolucin dirigida de
las enzimas, anticuerpos, receptores Y otras protenas en reas tales como cuestiones
ambientales, catlisis, terapia gnica y desarrollo teraputico de protenas y vacunas no sern
cubiertas en esta revisin; Los lectores se refieren a varios artculos y revisiones recientemente
publicados [42, 172, 175, 177, 180, 181, 186, 187, 193-208].
Recientes, los avances significativos en la ingeniera de protenas han llegado a travs de mtodos
computacionales, tales como SCHEMA, ProSAR y ROSETTA. El diseo computacional basado en
estos mtodos disminuye en gran medida la necesidad de probar espacio de secuencia
aleatorizado, haciendo la ruta a nuevos biocatalizadores mucho ms eficiente [195, 209-212]. Por
lo tanto, en el futuro, un conocimiento ms detallado sobre la relacin entre las estructuras y
funciones de las protenas, as como los avances en la tecnologa de alto rendimiento, puede
ampliar enormemente las capacidades de la ingeniera de protenas.
Materiales orgnicos para uso en nanobio / bionanotecnologa. Estas tecnologas van desde las
clsicas tecnologas de bioconjugacin qumica dirigidas a los AA naturales hasta enfoques ms
sofisticados, como la incorporacin antinatural de AA (SAU) basada en la supresin del codn de
detencin mbar, las conjugaciones qumicas bio-ortogonales, las ligaciones proteicas qumicas y
las conjugaciones enzimticas
Las tecnologas de conjugacin qumica estndar para protenas se dirigen a las cadenas laterales
de AA naturales, tales como los grupos amina primarios (R-NH2) del residuo Lys y el extremo N, los
grupos cido carboxlico (R-COOH) de Asp, Glu y C , El grupo tiol (R-SH) de Cys, el anillo de fenilo de
tirosina (Tyr) y el anillo de indol de triptfano (Trp) (Fig. 19) [213].
Lys es uno de los residuos AA ms comunes en protenas con una abundancia media de
aproximadamente 6% y es a menudo expuesto a la superficie debido a su hidrofilicidad; Por lo
tanto, es un excelente sitio objetivo para la conjugacin. Por otra parte, el extremo N-terminal
proporciona una posicin ms sittica, pero no siempre est expuesta a la superficie. La amina
primaria de Lys se ha funcionalizado predominantemente con steres de N-hidroxisuccinimidilo
(steres de NHS), sulfatos de ster de NHS o isotiocianatos. En estos reactivos electrfilos, los
steres de NHS son muy utilizados para la funcionalizacin dirigida a amina primaria debido a la
sencillez de reaccin. Una limitacin de los steres NHS es una reaccin secundaria de hidrlisis en
agua (<5 horas de vida media), que se acelera a medida que el pH aumenta por encima de 7. Esta
hidrlisis compite con las reacciones deseadas y reduce la eficiencia de la reaccin [214]. El N-
terminal puede selectivamente dirigirse para modificacin cuando es suficientemente accesible y
no se modifica despus de la traduccin. La reaccin de transaminacin mediada por piridoxal-5-
fosfato puede aplicarse a la modificacin del residuo N-terminal sin la presencia de codisolventes
orgnicos de Cu (II) o desnaturalizantes, aunque las protenas que poseen serina N-terminal (Ser),
treonina (Thr ), Cys o Trp sern incompatibles con este mtodo debido a reacciones secundarias
conocidas con aldehdos [215].
Asp y Glu son tambin los residuos AA ms comunes en las protenas naturales; Tienen una
abundancia media de aproximadamente el 12%, estn a menudo expuestos a la superficie y son
excelentes sitios de conjugacin objetivo. Las cadenas laterales de cido carboxlico de Asp, Glu y
el extremo C pueden ser funcionalizadas por qumica de carbodiimida, tpicamente usando EDC,
que ha sido ampliamente utilizado para reticular covalentemente un cido carboxlico y amina. Sin
embargo, la abundancia relativamente alta de Lys, Asp y Glu y la alta accesibilidad al disolvente de
sus cadenas laterales hacen imposible modificar un nico sitio sobre la superficie de la protena
usando estos mtodos.
Tambin se han desarrollado mtodos para la conjugacin de Tyr, que tiene una abundancia
media de 3% en protenas. En presencia de agentes oxidantes fuertes (por ejemplo, H2O2) y
catalizadores apropiados, la cadena lateral fenlica del residuo Tyr puede reticularse con otros
compuestos fenlicos. Los agentes oxidantes requeridos para catalizar estas reacciones no
discurren, y hay preocupacin por causar reacciones secundarias no deseadas a otras porciones de
protenas. Para superar este problema, se ha desarrollado una reaccin de acoplamiento de Tyr;
Implica un reactivo electroflico, iminas formadas in situ a partir de aldehdos y anilinas ricas en
electrones. Esta reaccin de acoplamiento de tipo Mannich de tres componentes es altamente
selectiva para Tyr y procede bajo condiciones suaves [217].
Los mtodos convencionales para la conjugacin de Trp, que tiene una abundancia media de
aproximadamente el 1%, requieren metales pesados txicos o condiciones bioqumicamente
incompatibles. Algunos de estos mtodos tambin muestran reactividad cruzada con otros AA
(particularmente Tyr), limitando as la gama de aplicaciones. Recientemente, se inform un
mtodo libre de metal de transicin usando 9-azabiciclo [3.3.1] nonano-3-on-N-oxilo (ceto-ABNO)
para la conjugacin de Trp. Este nuevo mtodo mostr novedosas caractersticas, como la alta
selectividad de Trp, la formacin de conjugados nicos con alta homogeneidad, una fcil
conjugacin a temperatura ambiente y un pH casi neutro y un corto tiempo de reaccin [218].
Aunque la sustitucin especfica del sitio de los AA con AA raros, tales como Cys o Tyr,
proporciona mltiples opciones para la funcionalizacin covalente de las protenas, es posible
daar el plegamiento o funcin de las protenas cuando las modificaciones genticas para tales
conjugaciones qumicas llegan a ser demasiado extenso. La incorporacin de SAU en protenas
permite una mayor flexibilidad en las modificaciones de protenas. A diferencia de los residuos
naturales de AA, estos UAA pueden contener restos reactivos totalmente nicos, tales como
grupos azida, ciano, yodo, bromo, boc y dansilo, y por lo tanto proporcionar una reactividad
completamente bioortogonal que puede ocurrir dentro de sistemas vivos sin interferir con
procesos bioqumicos nativos . La incorporacin especfica de sitio (SSI) de SAU utiliza codones sin
sentido para incorporar uno o unos pocos SAU en una nica o mltiples localizaciones definidas en
una protena. Normalmente se emplea la supresin del codn de detencin mbar, en la que el
codn de localizacin de destino se transforma en un codn de parada mbar [219]. Para
incorporar la SAU, se disea un ARNt y una ARNt-sintetasa de aminoacil (aaRS) para emparejarse
con la SAU y reconocer el codn mbar como un codn de sentido. SSI sustituye un AA natural por
un anlogo antinatural, en el que la aminoacil tRNA-sintetasa endgena (aaRS) acepta la UAA y
aminoacila el ARNt apropiado con la SAU. La incubacin de un husped de expresin auxotrfica
en medio de cultivo que contiene la SAU anloga en lugar del AA natural especfico conduce a la
incorporacin de SAU en casi todos los lugares en los que se habran incorporado los AA naturales
especficos. El SSI de SAU se ha ampliado a los sistemas CFPS [219, 221].
Las protenas o pptidos incorporados en UAA pueden conjugarse quimiolectualmente con otras
biomolculas y materiales inorgnicos / orgnicos sintticos que llevan grupos funcionales bio-
ortogonales. Otras biomolculas, tales como cidos nucleicos, lpidos y materiales inorgnicos /
orgnicos sintticos modificados con grupos funcionales bio-ortogonales, pueden someterse
tambin quimioselectivamente a una reaccin de bioconjugacin. Esta reaccin debe producirse
en una solucin acuosa a un pH casi fisiolgico, tener una cintica rpida incluso con
concentraciones submilimolares de reactivos y ocurrir a temperaturas fisiolgicas. Las reacciones
qumicas que satisfacen estos requisitos incluyen las condensaciones de ceton / hidroxiamina, la
cicloadicin de Huisgen [3 + 2], la ligadura de Staudinger, las cicloadiciones de Diels-Alder y las
cicloadiciones de foto-Click (Fig. 20) [224, 225].
Los grupos carbonilo de aldehdos y cetonas pueden reaccionar especficamente con fuertes
nuclefilos de efecto , tales como hidrazidas (R-N-NH2) y alcoxiaminas (R-O-NH2), en condiciones
cidas (pH 4-6) para producir hidrazonas estables Y oximas, respectivamente. Dado que estas
condensaciones de cetona / aldehdo muestran una cintica ms bien lenta con constantes de
velocidad de segundo orden, son necesarios grandes excesos del reactivo de conjugacin para
conseguir una buena eficacia de marcado. En general, las condensaciones de cetona / aldehdo
son las ms adecuadas para las reacciones de conjugacin in vitro o en la superficie celular porque
la reaccin requiere un pH cido y altas concentraciones del reactivo de marcaje, que son
problemticas en trminos de toxicidad celular [224].
4. Conclusin
Esta revisin destac algunos de los recientes desarrollos en estudios relacionados con nanobio /
bionanotecnologa, incluyendo las aplicaciones de molculas biolgicas diseadas combinadas con
nanomateriales funcionales en terapia, diagnstico, biosensing, bioanlisis y biocatlisis. Adems,
esta revisin se centr en los avances recientes en la ingeniera biomolecular para nanobio /
bionanotecnologa, tales como ingeniera de cidos nucleicos, ingeniera de genes, ingeniera de
protenas, tecnologas de conjugacin qumica y enzimtica y ingeniera de engarces. Basados en
tecnologas qumicas y biolgicas creativas, se describieron protocolos de manipulacin de
biomolculas, especialmente cidos nucleicos, pptidos, enzimas y protenas. Tambin resumimos
las principales estrategias adoptadas en ingeniera de cidos nucleicos, ingeniera gentica,
ingeniera de protenas, tecnologas de conjugacin qumica y enzimtica y ingeniera de engarces.
La ingeniera de cido nucleico basada en las caractersticas de emparejamiento de bases y de
autoensamblaje de los cidos nucleicos se destac como una tecnologa clave para las
nanotecnologas de ADN / ARN, tales como ADN / ARN origami, aptmeros, ribozimas. La
ingeniera gentica incluye tecnologas de manipulacin directa de genes, como la mutagnesis
gnica, la amplificacin de la secuencia de ADN, el mezclado de ADN y la fusin de genes, que son
poderosas herramientas para generar enzimas, protenas, vas metablicas completas o incluso
genomas enteros con propiedades deseadas o mejoradas. Se discutieron dos estrategias generales
para la ingeniera de protenas, es decir, el diseo racional de la protena y la evolucin dirigida (es
decir, los enfoques basados en la seleccin o en la seleccin de bibliotecas de alto rendimiento).
En las dos ltimas dcadas se han desarrollado tecnologas de conjugacin para modificar
especficamente sitios con diversas funcionalidades naturales y no naturales. Estas tecnologas
abarcan desde las tecnologas clsicas de bioconjugacin qumica, las conjugaciones qumicas bio-
ortogonales, las ligaciones qumicas proteicas y las conjugaciones enzimticas, que fueron
revisadas. La ingeniera de enlaces para controlar la distancia, la orientacin y la interaccin entre
componentes funcionales reticulados en conjugados es tambin una tecnologa importante. Se
examinaron las estrategias de diseo y optimizacin de los enlazadores qumicos y biolgicos, tales
como oligonucletidos y polipptidos. Ahora se dispone de una variedad de estrategias para
disear y fabricar nuevos nanobiomateriales con dimensiones y complejidad altamente ordenadas
basadas en caractersticas de autoensamblaje biomoleculares gobernadas por interacciones
moleculares entre nucletidos, pptidos, protenas, lpidos y ligandos pequeos, cada uno de los
cuales se centra en la simplicidad del diseo, Alto control estructural y funcional, o alta precisin
de fabricacin [16-20, 106, 127, 132, 360- 365]. Fundamentalmente, estas propiedades no son
mutuamente
Exclusiva, y las debilidades relativas de cada enfoque se resolvern en un futuro prximo. Dado el
reciente progreso en los campos de la ingeniera biomolecular y la nanotecnologa, el diseo de
dispositivos y sistemas moleculares basados en biomateriales completamente nuevos con
funciones adaptadas para aplicaciones especficas parece ser mucho ms fcil y ms factible que
antes.