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Tcnicas histolgicas
TINCIN
Introduccin ................................. 4
El proceso histolgico .................... 5
Tincin .......................................... 7
Ttinciones generale ....................... 8
Histoqumica .................................. 12
Lectinas ......................................... 15
Inmunocitoqumica ........................ 17
Hibridacin in siut ......................... 22
Tcnicas histolgicas. Introduccin. 4
Introduccin
En estas pginas dedicadas a las tcnicas caractersticas morfolgicas de las clulas slo se
histolgicas vamos a describir los procesos pueden observar con estos aparatos.
experimentales necesarios para obtener secciones Existen procedimientos rpidos y simples para
teidas y listas para observar al microscopio la observacin de tejidos y clulas vivas que
partiendo de tejidos vivos extrados de un animal reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la
o de una planta. Por tanto, dedicaremos espacios observacin del flujo sanguneo en capilares del
a la obtencin, fijacin, inclusin, corte y tincin sistema circulatorio. Otra forma de observar
de los tejidos. Todos estos apartados seguirn el clulas o tejidos vivos es mediante las tcnicas
mismo esquema que los captulos dedicados a los histolgicas supravitales, en los que las clulas y
tejidos o a la clula, partir de un esquema bsico los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera
y ampliar la informacin sucesivamente en del organismo, como es el caso de los cultivos de
pginas adicionales. No dedicaremos demasiado clulas y de tejidos.
espacio a los instrumentos, desde el punto de
vista operativo, pero s a la conveniencia de su Las tcnicas histolgicas postvitales son
uso y a sus capacidades. aquellas en las que las clulas mueren durante el
La mayora de las tcnicas histolgicas van proceso, pero las caractersticas morfolgicas y
encaminadas a preparar el tejido para su moleculares que posean en estado vivo se
observacin con el microscopio, bien sea ste conservan mejor o peor dependiendo del tipo de
ptico o electrnico. Ello es debido a que la tcnica. Estas pginas estarn dedicadas a este
estructura de los tejidos est basada en la tipo de tcnicas, puesto que son las ms
organizacin de los tipos de clulas que los comnmente usadas en los laboratorios de
componen y, salvo contadas ocasiones, las histologa.
El proceso histolgico
Denominamos proceso histolgico a una serie El proceso histolgico comienza con la
de mtodos y tcnicas utilizados para poder obtencin del tejido objeto de estudio. En el caso
estudiar las caractersticas morfolgicas y de los tejidos vegetales directamente se toman
moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos muestras de los distintos rganos que componen
para estudiar los tejidos, es decir, series de el cuerpo de la planta, mientras que para los
tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu tejidos animales podemos optar por dos opciones:
caracterstica deseemos observar. En el siguiente coger una porcin del tejido u rgano y
esquema se muestran los mtodos y tcnicas procesarla o procesar primero el animal completo
comnmente empleados para el procesamiento y luego extraer la muestra que nos interese. En
de los tejidos para su observacin con los cualquier caso las muestras son habitualmente
microscopios ptico o electrnico. Sin embargo, fijadas con unos soluciones lquidas denominadas
hay que tener en cuenta que existen muchas fijadores, las cuales se usan para mantener las
variantes a estos "caminos" y su eleccin estructuras celulares y moleculares inalterables
depender del resultado final que queramos durante el procesamiento posterior y con una
obtener. organizacin lo ms parecida posible a como se
Tincin
Los tejidos animales son en su gran mayora a) Tinciones generales. Aquellas que usan
incoloros, excepto aquellos que poseen algn tipo sustancias coloreadas que se unen a componentes
de pigmento como hemoglobina de la sangre o la tisulares por afinidad qumica.
melanina de la epidermis. En las plantas, sin b) Histoqumica. Son aquellas tcnicas de
embargo, existe una mayor variedad de tincin que implican la modificacin qumica de
pigmentos naturales que permiten su observacin algunas molculas tisulares para posteriormente
directa con el microscopio ptico, a lo que ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
tambin ayuda la presencia de las paredes apartado incluiremos tambin a los mtodos de
celulares, las cuales facilitan la delimitacin tincin basados en la capacidad cataltica de
celular y la discriminacin entre diferentes algunas enzimas presentes en los tejidos que
tejidos. Cuando se inventaron los primeros queremos estudiar.
microscopios hubo que descubrir cmo teir los
tejidos para poder desentraar sus caractersticas c) Lectinas. Las lectinas son dominios de
morfolgicas. Se observ que algunos pigmentos protenas, como las selectinas, que son capaces
como el carmn o la eosina, disueltos en agua, se de reconocer glcidos que forman parte de
unan a determinados componentes de las clulas. polisacridos. Tienen una gran especificidad y se
La expansin de la industria textil en el siglo XIX usan para determinar el tipo de glcido que
y su necesidad de colorear las telas provoc un aparece en las glucoprotenas de las clulas o de
rpido desarrollo de los tintes o pigmentos. la matriz extracelular de los diferentes tejidos.
Muchas de estas sustancias fueron usadas como d) Inmunocitoqumica. Son tcnicas
colorantes en la histologa de los animales y de histolgicas muy potentes basadas en la alta
las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la especificidad de unin de los anticuerpos a los
actualidad, alcanzndose un enorme desarrollo y antgenos contra los que se produjeron. Estos
perfeccionamiento de nuevas tcnicas y antgenos pueden ser cualquier molcula tisular
molculas sintticas que se usan segn las que, purificada en inyectada en un animal, sea
necesidades del investigador. Con la llegada de la capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos
biologa molecular se han puesto en marcha otras anticuerpos aadidos a una seccin de tejido
tcnicas mucho ms sofisticadas para observar reconocern y se unirn especficamente a dicha
elementos celulares, entre las que se pueden molcula.
destacar aquellas que usan anticuerpos,
inmunocitoqumicas, las que usan sondas de e) Hibridacin. Son tcnicas basadas en la
ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o ms unin complementaria de las bases de cidos
sofisticadas an como las que mediante el diseo nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo,
de animales transgnicos permiten identificar y y de la guanina con al citosina). Esto hace que
observar a las clulas que expresan un dos cadenas complementarias de cidos nucleicos
determinado gen, incluso en el organismos vivo, se unan entre s de forma muy especfica, es
gracias a la fluorescencia de la protena verde decir, hibriden. Siguiendo este principio se
fluorescente (GFP). pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de
ADN o ARN con una secuencia de bases
No vamos a describir con detalle las tcnicas determinada que llevan una molcula unida para
ms complejas, al menos no en estas pginas poder detectarlas. La secuencia de bases de la
bsicas, sino las ms comunes, las que se suelen sonda es complementaria a otra que est presente
emplear en un laboratorio para el estudio general en la clula, normalmente en forma de ARNm.
de los tejidos. Dividiremos el conjunto de Con ello podemos observar qu clulas expresan
tcnicas histolgicas en cuatro categoras. un determinado gen.
Tinciones generales
La mayora de los tejidos, sobre todo los de los Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina,
animales, son incoloros y por ello necesitamos safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o
teirlos para observar sus caractersticas la hematoxilina.
morfolgicas. Las tinciones generales estn
basadas en el uso de colorantes, sustancias cidos: son sales con el anin coloreado y la
mediante las cuales se consigue colorear a los base incolora. Tienen apetencia por sustancias
tejidos. Los colorantes son normalmente bsicas, sobre todo estructuras proteicas
hidrosolubles y se caracterizan por unirse a localizadas en el citoplasma celular y tambin por
ciertas molculas presentes en los tejidos gracias el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de
a afinidades electro-qumicas. Se utilizan colorantes cidos son la fucsina cida, verde
normalmente para teir a las clulas y rpido, naranja G o la eosina.
componentes tisulares que van a ser observados Neutros: poseen una porcin cida y otra
con el microscopio ptico y por ello se realizan bsica, ambas con capacidad para aportar color.
habitualmente sobre secciones de tejido, siendo Por tanto un mismo colorante puede teir tanto
las ms utilizadas las secciones obtenidas a partir las partes bsicas como las cidas de los tejidos.
de inclusiones en parafina u obtenidas en el Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.
criostato. Los colorantes son los elementos
principales de las tinciones generales. Son Indiferentes: realmente no se unen a elementos
molculas que poseen tres componentes de los tejidos por afinidad qumica sino porque se
importantes: un esqueleto incoloro, que disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante
normalmente es un anillo aromtico de benceno, sudn se disuelve en los lpidos y por tanto teir
al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que a las gotas de lpidos, especialmente en los
aporta el color, denominado cromforo, y otro adipocitos.
que posibilita la unin a elementos del tejido En algunas ocasiones necesitamos resaltar
denominado auxocromo. Al conjunto de estos elementos tisulares de manera especfica y para
tres elementos unidos en una molcula se ello usamos colorantes que tienen apetencia por
denomina cromgeno. dichas estructuras. Por ejemplo, la tincin
Segn la naturaleza qumica del cromforo hay denominada azn contiene azocarmn y naranja-
varios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos, anilina-cido actico que tie los ncleos de rojo
derivados de la antroquinona, derivados de la y sobre todo destaca el conectivo intensamente
acridina, derivados de iminas quinnicas, teido de azul. Otra tincin combinada es el
derivados de diferrilmetano y triferrilmetano, tricrmio de Mallory que tie el colgeno de
derivados del xanteno y derivados de las verde, las clulas musculares de rojo.
talocianinas. Cuando un colorante se une al tejido y refleja
Segn la naturaleza qumica del radical un color diferente al que tiene en solucin se dice
auxocromo los colorantes se clasifican en: que ha ocurrido un fenmeno de metacromasia.
Esto se debe a que las propiedades de absorcin
Bsicos: son sales en las que la base aporta el de la luz del colorante cambian al unirse a
color, mientras que la parte cida es incolora. componentes celulares. Por ejemplo, el azul de
Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido toluidina se vuelve prpura cuando se une a
como el ADN o ciertos componentes de la matriz ciertos grnulos de los mastocitos. Cuando el
extracelular como los glicosaminoglicanos. As, colorante unido al tejido tiene el mismo color que
ponen de manifiesto el ncleo y el ARN, sobre en solucin se denomina ortocromasia.
todo el ARNr presente en los ribosomas por ser
muy abundante, as como ciertas matrices Tincin general. Una de las tinciones ms
extracelulares ricas en componentes cidos. comnmente usada en histologa es la
Atlas de histologa vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Tcnicas histolgicas. Tincin. 9
Pasos que se siguen durante una tincin general de hematoxilinaeosina. Los tiempos son aproximativos
porque dependen del grosor de los cortes y de la concentracin de los colorantes. El desparafinado permite
eliminar el medio de inclusin, la parafina. El paso por agua de grifo es tpico de la hematoxilena y se
denomina diferenciacin. Las sales del agua permiten obtener una coloracin ms violcea, en vez de
prpura. La deshidratacin final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos
medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades pticas excelentes.
Adems, conservan las preparaciones durante aos en buenas condiciones. Tras el montado y secado
(evaporacin del xileno), las secciones se puede observar con el microscopio ptico.
Atlas de histologa vegetal y animal. Universidad de Vigo.
Tcnicas histolgicas. Tincin. 10
Histoqumica
Incluiremos dentro de las tcnicas dividir las tcnicas histoqumicas en dos grupos:
histoqumicas a aquellas que supongan una reacciones qumicas e histoqumica enzimtica.
reaccin qumica en la que intervienen molculas Las reacciones qumicas consisten en la
pertenecientes al propio tejido (trataremos la modificacin qumica de molculas del tejido
deteccin de glcidos mediante lectinas y la para posteriormente poder colorearlas. Existen
inmunohistoqumica en apartados diferentes a tcnicas histoqumicas para detectar glcidos,
ste, aunque algunos autores las incluyen como protenas y nucletidos. La tcnica histoqumica
tnicas histoqumicas). El objetivo de la ms empleada es la reaccin de PAS (Periodic
histoqumica es poner de manifiesto una Acid Schiff). Se utiliza para la deteccin de
molcula o familia de molculas presentes en una hidratos de carbono, libres o conjugados, cuando
seccin histolgica y estudiar su distribucin estn en cantidades relativamente grandes en los
tisular "in situ". Estas molculas son difcilmente tejidos. La modificacin qumica del tejido
discernibles con colorantes generales. Durante el consiste en la oxidacin mediante el cido
procesamiento del tejido previo a la reaccin peridico de los enlaces entre los carbonos
histoqumica, como la fijacin o la inclusin, hay prximos que contienen grupos hidroxilos. Esto
que evitar daar a la molcula que queremos provoca la formacin de grupos aldehdos que
detectar porque de otra manera resultara en sern reconocidos por el reactivo de Schiff, el
falsos negativos, es decir, no tener tincin cuando cual se combinar con ellos para dar un color
en realidad la molcula de inters s est presente rojizo brillante. Entre los componentes del
en el tejido, aunque deteriorada. En algunas reactivo de Schiff est la pararosanilina (un
ocasiones es necesario realizar pasos previos a la componente de la fucsina bsica) tratada con
reaccin histoqumica para descubrir la molcula cido sulfrico. Una gran ventaja de la tincin
que queremos detectar, por ejemplo usando un histoqumica PAS es su capacidad de
fijador adecuado, ya que de otra manera no discriminacin de tipos de glcidos con pequeas
reaccionara con los reactivos qumicos. Vamos a modificaciones de la tcnica.
Lectinas
Aparte de las tcnicas de tincin generales y produce gracias a la accin de unas lectinas
las histoqumicas, ms especficas, existen otras denominadas selectinas que expresan las clulas
que se usan para detectar molculas tisulares con endoteliales prximas al lugar de la lesin. Es
una alta especificidad. Ello es posible gracias a la decir, el linfocito puede salir por la pared
capacidad que tienen ciertas molculas como las endotelial gracias a la unin de las selectinas
lectinas o las inmunoglobulinas para reconocer y endoteliales a los glcidos de la membrana del
unirse slo a una molcula determinada presente linfocito. En el laboratorio de histologa las
en el tejido. En esta pgina vamos a tratar sobre lectinas se usan, sin embargo, para estudiar la
el uso de las lectinas para la deteccin en los distribucin tisular de distintos tipos de azcares
tejidos de distintos tipos de glcidos de manera de manera especfica. Se pueden usar diferentes
especfica. En muchos textos la tcnica de las tipos de lectinas en base a su especificidad de
lectinas se incluye dentro del apartado de la reconocimiento de azcares determinados. Hay al
histoqumica. menos cinco grupos de lectinas segn se unan a
Las lectinas son protenas que tienen dominios manosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina
o secuencias de aminocidos que son capaces de (Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc),
reconocer y unirse a glcidos terminales que a fucosa (Fuc) o a cido silico (Neu5Ac),
forman parte de cadenas de oligosacridos, bien respectivamente.
libres o formando parte de otras molculas como Comercialmente hay disponibles docenas de
las glicoprotenas. Por ello se dice que las lectinas lectinas diferentes que se nombran segn el
reconocen glicoconjugados. Las lectinas estn organismo animal o la planta de la que se
ampliamente distribuidas en los tejidos animales obtienen. En el siguiente cuadro se listan las
y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por lectinas usadas comnmente segn el glcido que
ejemplo, la salida de los linfocitos desde el reconocen.
torrente sanguneo hacia los tejidos daados se
Deteccin de lectinas mediante mtodos indirectos en cortes adyacentes de epitelio del pie de
Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda
muestra la deteccin de glucosamina mediante la lectina WGA biotinilada y su posterior
revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrn). En la imagen de la derecha se
muestra la deteccin de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un
anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la
localizacin de la fucosa (color azul).
Inmunocitoqumica
La inmunocitoqumica es una tcnica para la Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se
localizacin de molculas en los tejidos mediante usan en las tcnicas inmunocitoqumicas son del
el empleo de anticuerpos. Es una tcnica que tipo G, producidas por unas clulas del sistema
gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la inmunitario denominados linfocitos B durante la
estandarizacin de su protocolo se ha convertido respuesta inmune. La produccin masiva de
en un mtodo sencillo, rpido y muy potente. Se anticuerpos se produce en un animal cuando le
basa en la gran especificidad y alta afinidad que inyectamos una molcula, en este caso nuestra
tienen los anticuerpos para reconocer a molculas molcula problema, que reconoce como extraa.
y unirse a ellas. Adems, la conjugacin o Estos anticuerpos pasan al suero sanguneo que
combinacin de los anticuerpos con enzimas o se extrae del animal inmunizado y a partir del
con sustancias fluorescentes permite detectar cual se purifican. stos se usarn posteriormente
cantidades nfimas de molculas presentes en el en la tcnica inmunocitoqumica. Las molculas
tejido. complejas como la protenas tienen en su
estructura varios determinantes antignicos, es
decir, lugares que son
capaces de desencadenar
una respuesta inmune. Ello
implica que cada
determinante antignico
activar un clon, lnea de
linfocitos B, que producir
anticuerpos contra l. Los
anticuerpos de todos los
clones de linfocitos B
activados por la molcula
inyectada irn a parar al
suero. Cuando se emplean
sueros purificados de este
tipo en inmunocitoqumica
se dice que se estn
empleando anticuerpos
policlonales. Existe una
tcnica que perimite aislar
y cultivar en el laboratorio
(in vitro) de forma
inividualizada a cada uno
de los clones de linfocitos B
activados durante la
respuesta inmune. Cada uno
de esos cultivos producir
un solo tipo de
inmunoglobulina G que
reconocer slo a uno de
los determinantes
Esquema resumido de las diferencias en la obtencin de anticuerpos antignicos de la molcula
policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha). inyectada. A estos
anticuerpos se les denomina
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Tcnicas histolgicas. Tincin. 18
monoclonales ya que proceden de linfocitos que diferentes fijadores segn el tipo de molcula en
producen inmunoglobulinas idnticas. la que estemos interados. Tambin es necesario
considerar el mtodo de obtencin de los cortes.
Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirse Inclusiones en parafina pueden daar las
en dos dominos: la fraccin cristalizable y la molculas por lo que en la mayora de los casos
variable. El dominio variable es el que se encarga se suele trabajar con cortes de vibratomo o con
de reconocer al determinante antignico de secciones obtenidas por congelacin.
nuestra molcula. Hay dos sitios de unin por lo
que cada inmunoglubulina podra reconocer a dos Las inmunoglobulinas, aunque se unan a la
molculas o determinantes antignicos, que han molcula que queramos detectar, no son visibles
de ser iguales. La fraccin cristalizable tiene una con el microscopio por lo que la tendremos que
estructura similar para todas las conjugar (unirla) a otras molculas que nos den
inmunoglubulinas G producidas por los una seal visible. Estas molculas que aportan
individuos de una misma especie. visibilidad a los anticuerpos suelen ser de dos
tipos: molculas fluorescentes y enzimas. Las
Para que un anticuerpo se una a su primeras se pueden observar con el microscopio
determinante antignico localizado en una de fluorescencia mientras que las segundas
molcula, sta no debe alterarse. De otro modo pueden convertir determinados sustratos solubles
ese determinante antignico no ser reconocido en productos insolubles y coloreados. La seal
por el anticuerpo. Por ello el proceso de fijacin aparece all donde est la sustancia fluorescente o
del tejido debe elegirse para preservar al mximo el enzima, que es donde se ha unido la
a la molcula que queremos detectar. As, se usan inmunoglubulina.
El mtodo del marcado con sustancias
fluorescentes tiene una serie de ventajas
que veremos ms adelante, pero tiene la
desventaje de que no son marcajes
permanentes puesto que la luz emitida
por la molcula fluorescente se
desvanece con el tiempo. Sin embargo,
las secciones procesadas con
anticuerpos unidos a enzimas pueden
deshidratarse, montarse y mantenerse
permanentemente para su obeservacin.
Las enzimas habituales que se unen a
las inmunoglobulinas son la peroxidasa
y la fosfatasa alcalina.
La conjugacin directa de un
marcador (enzima o fluorescente) con la
inmunoglobulina se denomina mtodo
de deteccin directa. Hoy en da se
suele emplear el mtodo de deteccin
indirecta, que consiste en colocar una
serie de intermediarios entre la
inmunoglobulina y la molcula
marcadora. Inicialmente se us el
mtodo indirecto denominado
Mtodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios peroxidasa-antiperoxidasa (PAP; ver
unidos especficamente a una molcula del tejido. figura anterior), pero actualmente es
ms frecuente usar el mtodo del complejo matriz extracelular de forma simultnea. Esto es
avidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figura posible porque existe una gran variedad de
anterior). El mtodo indirecto permite una mayor fluorocromos que son capaces de emitir luz
versatilidad de la tcnica y mayor intensidad de visible tras ser excitados con diferentes longitudes
seal frente a una misma cantidad de antgeno. de onda, luego seleccionando el intervalo de
longitudes onda con el que iluminamos un tejido
La inmunofluorescencia se basa en las podemos excitar de modo individual, y
propiedades de los fluorocromos. Son molculas secuencial, varios fluorocromos que hayamos
que emiten luz visible cuando se les ilumina con usado, unidos a inmunoglubulinas diferentes,
una determinada longitud de onda. Aunque la para detectar molculas diferentes. Tomando
inmunofluorescencia se puede usar para detectar fotografas tras cada excitacin y superponiendo
a una sola molcula tisular, su verdadero dichas imgenes podemos averiguar si las
potencial se muestra cuando necesitamos una molculas se expresan, por ejemplo, en la misma
mltiple inmunodeteccin, es decir, dos o ms clula.
molculas presentes en una misma clula o
Hibridacin in situ
No se puede considerar a la hibridacin in situ puesto que hoy en da se pueden pedir
como una tcnica de uso general. Sin embargo, comercialmente la sntesis de forma qumica de
aporta una informacin sobre la fisiologa de las secuencias largas de ARN (hasta 1000
clulas y los tejidos que no es posible obtener con nucletidos es comn). Incluso, se pueden
otras tcnicas. La hibridacin in situ se usa comprar las sondas ya marcadas, con lo que nos
ampliamente en investigacin en desarrollo ahorramos una gran cantidad de tiempo en el
embrionario, diferenciacin de clulas madre, laboratorio.
manipulaciones genticas o cambios en la Sin embargo, en muchos casos no conocemos
fisiologa celular frente a seales externas, entre la secuencia de bases del gen deseado por lo que
otras. Permite descubrir la expresin de un gen hay que averiguarlo primero para obtener
mediante la deteccin de su transcrito procesado, posteriormente la sonda. Para obtener una sonda
el ARN mensajero. Podemos descubrir qu hay primero que clonar la secuencia de bases del
clulas expresan un gen determinado y cundo lo gen (ARN mensajero) que queremos detectar.
expresan. La expresin gnica es un testimonio Clonar implica realizar una serie de pasos: 1)
directo de la funcionalidad celular. Existe otra Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, los
aplicacin de la hibridacin in situ y consiste en ARN mensajeros se retrotranscriben
la localizacin fsica de un gen sobre un (transcripcin inversa), es decir, se hacen copias
cromosoma. complementarias de ADN de todos los
La hibridacin in situ se basa en la fragmentos de ARN mensajero. Se obtienen
complementariedad de bases de nucletidos. Del hebras de ADN denominadas cDNA. 2)
mismo modo que en la inmunocitoqumica se Mediante la tcnica de PCR ("polymerase chain
usan los anticuerpos, en la hibridacin in situ se reaction") se consiguen multitud de copias de
usa una secuencia de nucletidos, denominada manera especfica de la secuencia de ARN
sonda, que es complementaria a la secuencia del mensajero que queremos estudiar. 3) Dichas
ARN mensajero que queremos detectar y que copias se integran en un plsmido y
est conjugada con una molcula que luego posteriormente se introduce en bacterias. 4) Se
pondremos de manifiesto y que nos sirve de cultivan las bacterias para que proliferen y as
marcador. tambin conseguir gran cantidad de plsmidos,
Quiz una de las razones por las que la que se duplican en cada divisin bacteriana. 5)
hibridacin in situ no es comn todava en los Los plsmidos se extraen y purifican. 6)
laboratorios de histologa es porque sintetizar una Mediante un proceso de transcripcin similar al
sonda es complicado y generalmente no se puede que ocurre en el ncleo de las clulas, a partir de
usar en una especie animal o vegetal distinta a estos plsmidos se consiguen numerosas rplicas
aquella para la que se ha producido dicha sonda. complementarias a nuestra secuencia inserta, que
Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero) ser tambin complementaria a la secuencia del
en dos especies distintas tienen secuencias que no ARN mensajero que queremos detectar. El
son idnticas y por tanto hay que fabricar una resultado de la transcripcin realizada repetidas
sonda para cada especie. Sin embargo, una vez veces es un gran nmero de cadenas de ARN
obtenida la sonda el proceso de hibridacin es denominadas sondas. Durante su sntesis es
sencillo. cuando se aaden los nucletidos conjugados con
las molculas marcadoras que nos servirn para
Para obtner una sonda de un ARNm deseado lo detectarla una vez la hibridacin se haya
primero que tenemos que hacer es conocer la producido. Normalmente son molculas
secuencia de bases de dicho ARNm. Si esa esa pequeas como la digoxigenina y la biotina,
secuencia est publicada en las bases de datos en aunque tambin se pueden utilizar molculas
Internet todo el proceso se simplifica enormente fluorescentes, que se unen a los nucletidos que