FITOSANIDAD 3 (3) 1999 ISSN: 1562-3009

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E- mail: nhernandez@inisav.cu

Artculo: Estudio de medios de cultivo sobre el crecimiento lineal y la esporulacin de

Phytophthora infestans

Autor(es): Mara O. Lpez y Yoelquis Toms

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 No. 514 e/ 5 ta B y 5ta F. Playa,
Ciudad de La Habana. CP 11600

Resumen

El Tizn tardo de la papa causado por Phytophthora infestans, una de las enfermedades ms
importantes de las que afectan este cultivo a nivel mundial, es de aparicin frecuente en
Cuba. Con el objetivo de conocer el comportamiento de los medios de cultivo sobre el
crecimiento y capacidad esporulativa del hongo, se utiliz el mtodo de siembra en los medios
PDA, V3, V8 y V10, de un aislamiento resistente al metalaxyl. Se describieron las
caractersticas morfolgicas de las colonias para cada caso y se determin la esporulacin
mediante el conteo de esporangios en cmara de Neubauer. Se lograron resultados
importantes concernientes a la biologa de esta especie fngica con la utilizacin del medio de
cultivo V3, en el que se obtuvo un mayor y mejor crecimiento, as como capacidad
esporulativa, aspecto que resulta novedoso para los estudios del hongo en nuestras
condiciones.

Palabras clave: Phytophthora infestans, crecimiento, esporulacin, medios de cultivo

Abstract

The late blight of potato (Phytophthora infestans) is one of the most important diseases in the
world. It is frequent in Cuba. The objective of this article is to know the influence of different
culture media in the P. infestans sporulation and growth. In this case was used a metalaxyl
resistant isolation on PDA, V3, V8 y V10. The morphologic characteristics were described for
each case. The sporulation was determined in a Neubauer cell. This bioassay indicated that
V3 culture media is the most important in the biologic studies of this fungus and the better to
sporulation and growth. In our conditions these results gave new and important elements
about the late blight studies.

Key words: Phytophthora infestans, growth, sporulation, culture media

Introduccin

El Tizn Tardo de la Papa, causado por el Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary,
ha sido una de las enfermedades ms importantes en ese cultivo a nivel mundial desde hace
ms de 150 aos (Niederhauser, 1993). A partir de 1842 se desarrollaron epidemias severas
de Tizn Tardo en Estados Unidos y desde 1845 en Europa. Posteriormente se pens que el
patgeno lleg desde Mxico, regin en la que se encontraron los dos tipos de apareamiento
(A1 y A2) y sus oosporas resultantes (Fry et al., 1993).

De Bary, en 1876, fue uno de los investigadores que hizo los primeros intentos para cultivar
especies de Phytophthora en fragmentos vegetales y Brefeld, en 1883, obtuvo por primera
vez el crecimiento de P. infestans bajo condiciones estrictamente saprofticas (Erwin y Ribeiro,
1996). Pero no fue hasta 1930 que se generaliz el empleo de medios orgnicos, tales como
avena y frijol lima, descubrindose ms tarde el requerimiento de vitaminas para el desarrollo
de las especies de Phytophthora (Leonian y Lilly, 1938).

Los medios orgnicos ms recomendados son jugo V8, Avena, Zanahoria, Harina de Maz,
Papa y Arroz, aunque se han descrito diversos medios sintticos que son frecuentemente
utilizados para el crecimiento de estas especies. Antes de 1964 se desconoca la causa por la
cual estos hongos esporulaban bien sobre sustrato orgnico y muy poco sobre sustrato
sinttico, pero ms tarde se determin que era el esterol (Sitosterol), presente en los medios
orgnicos, el que estimulaba el crecimiento micelial y la formacin de estructuras
reproductivas de estos hongos (Erwin y Ribeiro, 1996), aunque tambin se determinaron
trazas de esterol en el agar empleado en medios sintticos (Nes, 1988), lo cual favorece en
alguna medida la esporulacin de Phytophthora spp.

El medio V8-agar es uno de los ms usados para el mantenimiento del cultivo, aunque el
medio Agar-Avena es tambin usado (Erwin y Ribeiro, 1996). Algunos aislados de P. infestans
no crecen tan rpido en medio V8-agar, mientras que crecen mejor en medio Centeno-Agar
(Caten y Jinks, 1968).

Este trabajo tuvo como objetivo el conocimiento acerca de la influencia de los medios de
cultivos PDA, V3, V8 y V10 sobre el crecimiento y la esporulacin de las colonias de P.
infestans, con la utilizacin de un aislamiento obtenido a travs de la semilla importada, que
result resistente al metalaxyl.

Materiales y Mtodos

En este bioensayo se utiliz un aislamiento de P. infestans resistente al metalaxyl,

denominado 35.8, procedente de semilla importada de Holanda. Para este ensayo fueron
empleadas placas Petri que contenan los medios de cultivo V3, PDA, V8 y V10. El pH se
ajust a 6 y se esterilizaron en autoclave durante 20 minutos a 120C. Posteriormente, se
vertieron en placas Petri de 9cm y se emplearon cuatro placas por variante. Se tomaron
discos de agar con micelio del hongo (de 5mm de ), y se coloc un disco en el centro de
cada placa con los diferentes medios de cultivo. Estas se incubaron a la temperatura de
191C y se chequearon diariamente, despus de la aparicin del micelio de P. infestans. El
crecimiento lineal del hongo fue determinado mediante la medicin del dimetro de las
colonias (mm) cada 24 horas durante seis das. Las caractersticas morfolgicas de las
colonias de P. infestans para cada caso fueron observadas y descritas. A los datos obtenidos
se les realiz un anlisis de varianza simple al 5% de probabilidad de error, para lo cual se
utiliz el programa estadstico Statitcf.

Adems, se grafic la dinmica de crecimiento micelial de las colonias de P. infestans en los

diferentes medios de cultivo probados.
Para la determinacin de la esporulacin en los medios de cultivo anteriormente
mencionados, se extrajeron tres discos de micelio con un perforador de 10 mm de dimetro y
0,9498 cm2 de rea, de diferentes partes de cada placa. Los discos de micelio del hongo se
introdujeron en tubos de cultivo que contenan agua destilada estril, a los cuales se les
aadi 10ml de solucin tween 80 al 1% para lograr la homogenizacin del inculo. Luego se
agitaron, frotndolos suavemente hasta lograr total homogenizacin y posteriormente se
extrajeron pequeas alcuotas con micropipetas para determinar la concentracin de
esporangios/ml, mediante el conteo de esporangios en cmara de Neubauer.

Resultados y Discusin

El aislamiento escogido 35.8 creci en los cuatro medios de cultivo utilizados, aunque en
cuanto a la velocidad del crecimiento micelial se observaron diferencias significativas entre los
sustratos probados. Los resultados obtenidos reflejan que en las cuatro evaluaciones
realizadas, el mayor crecimiento se obtuvo con el medio V3. Con las evaluaciones pudo
comprobarse que el comportamiento de los medios de cultivo se mantena de igual forma con
respecto al tiempo. Existe diferencia significativa entre el medio V3 y los medios de cultivo V8,
V10 y PDA (figura 1), los medios V8 y V10 no difieren significativamente. De manera que el
medio V3-agar result el ms idneo para el crecimiento del hongo P. infestans, alcanzando
el mximo crecimiento en este medio a los siete das. El hongo mantuvo aproximadamente
igual crecimiento en los medios V8-agar y V10-agar, de forma rpida, pero inferior a la
alcanzada en el medio V3-agar. Mientras que en el medio PDA, el hongo demor varios das
en crecer y no lleg a alcanzar el crecimiento que se logr en V3-agar; en este caso se
favoreci la contaminacin con bacterias y hongos.

FIGURA 1

El crecimiento micelial en los medios V8 y V10, que fue aparentemente muy semejante, no
super al crecimiento obtenido en V3, excepto al octavo da, por agotamiento del medio de
cultivo. A pesar de que V8 y V10 son medios con un contenido mucho ms ricos que V3, el
hongo creci ms en este ltimo, y esto puede deberse a que V8 y V10 contienen cido
ctrico, vitamina C y cido ascrbico, que aunque no estn presentes en cantidades
significativas, podran influir, aunque el pH del medio se regule. El medio V3 es adems
menos costoso, ms fcil de preparar y ms ajustable para nuestras condiciones.

En la dinmica de crecimiento micelial (figura 2), se corrobora que en el medio de cultivo V3 el

hongo creci de una forma mucho ms rpida en comparacin con los restantes medios.

FIGURA 2
Los resultados, en cuanto a la forma e intensidad del micelio en los medios estudiados, se
describen a continuacin:

V3-agar: el crecimiento del micelio es rpido, micelio medianamente algodonoso, poco

coposo, colonia de color blanco con bordes regulares.

V10-agar: el crecimiento es rpido, pero menos que en V3, micelio poco algodonoso pero un
poco ms tupido que en V3, colonia blanca con bordes regulares.

V8-agar: crecimiento muy semejante al de V10, micelio muy algodonoso y copioso, colonia
blanca con bordes regulares.

PDA: el crecimiento del micelio es pobre y lento, la colonia es blanca, pequea, adherida al
sustrato y con bordes irregulares.

En cuanto a la esporulacin del hongo, esta tambin vari en dependencia del sustrato
utilizado; aunque para los medios V8 y V10 las diferencias en la esporulacin son mnimas.
En el medio PDA el hongo no esporul y en el medio de cultivo V3 se obtuvo la mayor
concentracin de esporangios. La concentracin calculada de esporangios/cm2 fue de
2,1105 (figura 3).

FIGURA 3

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en cuanto al crecimiento lineal de P. infestans,
pues en ambos anlisis, se comprob que, con el medio de cultivo V3 los resultados fueron
muy significativos y novedosos para nuestros estudios, por lo que se corrobora que el medio
V3 resulta idneo para su crecimiento y esporulacin. Por tales razones, la introduccin del
medio de cultivo V3-agar como mtodo de aislamiento de P. infestans en los Laboratorios
Provinciales de Sanidad Vegetal de las provincias que ms se afectan con esta enfermedad,
contribuir a profundizar en estudios futuros acerca de la biologa de esta especie fngica.
Sin embargo, el medio selectivo compuesto por el jugo V8-agar ms antibiticos es
considerado y recomendado para la siembra y mantenimiento de aislamientos del hongo P.
infestans por Goodwin et al., (1992), aspecto que no coincide completamente con los
resultados del presente trabajo.

Conclusiones

El mejor y mayor crecimiento as como capacidad esporulativa se obtuvo en el medio de

cultivo V3, aspecto que resulta novedoso para los estudios biolgicos del hongo en nuestras
condiciones, seguido por los medios V8 y V10.

En el medio de cultivo PDA el crecimiento del hongo fue muy pobre y sin esporulacin.

Referencias

Caten, C. E. and J.L. Jinks. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora.

infestans. Cultural variation. Can. J. Bot. 46: 329-348, 1968.
Erwin, D. C and O. K. Ribeiro. Phytophthora. Diseases worldwide._ St Paul Minnesota: The
American Phytopathological Society, 1996.

Fry,W. E[et al.]. Historical and recent migrations of P. infestans: chronology, pathways and
implications. Plant Disease 77:653-661, 1993.

Goodwin, S. B.; A. Drenth and W. E Fry. Cloning and genetic analises of two highly
polymorphie, moderately repetitive nuclear DNAs from P. infestans. Current Genetics 22: 107-
115, 1992.

Leonian, L. H., and Lilly. V. G. Studies on the nutrition of fungi. I. thiamin, its constituens, and
source of nitrogen. Phytopathology (USA) 28: 531-548, 1938.

Nes, W. D. Phytophthorols. Novel lipids produced by Phytophthora cactorum. Lipids 23: 9-16,
1998.

Niederhauser, S. J. International Cooperation in Potato Research and Development. Annu.

Rev. Phytopathology 31: 1-21, 1993.
Figura 2. Dinmica de crecimiento micelial de P. infestans en los diferentes medios de
cultivo.

Crecimiento
9
micelial (mm)
8

7
6
5
4
3
2
1
0
Das
1 2 3 4 5 6

PDA V3 V8 V10

Figura 3. Efecto de medios de cultivo en la esporulacin de P. infestans

Esporangios/cm2

2.5

1.5

0.5

0
V3 V10 V8 PDA Medios de cultivo

V3=2,8 x 105 esp/cm 2 V10=2,1 x 105 esp/cm 2

V8=2,1 x 105 esp/cm 2 PDA=0 x 105 esp/cm 2
Figura 1. Efecto de medios de cultivo en el crecimieto micelial de P. infestans

Crecimiento micelial
(mm)

8 a
7 b b
6 c
5
4
3

2
1
0 Medios de cultivo
V3 V10 V8 PDA

CV: 5, 3 E (x): 0, 32