Aislamiento de ADN genmico de levaduras y ADN plasmdico de bacterias

1
Oscar Luis Gmez Villamil; (20132150025), Miguel ngel Fandio Palacios;
(20131150070), Manuel Andrs Prieto Senz; (20131150037).
2
Heydi Narvez
1,2
Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas
1
Estudiantes-Biologa Molecular
2
Profesor Biologa Molecular

Bogot D.C. 3-septimbre-2017

RESUMEN
Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptacin a
diferentes condiciones ambientales, para comprender la esencia de esta capacidad es
importante conocer sus bases genticas, es decir, como est organizada la informacin
gentica y que mecanismos de variacin gnica poseen, por tal motivo el siguiente informe
tiene como objetivo presentar la metodologa empleada que se llev a cabo para la extraccin
de ADN plasmdico a partir del cultivo bacteriano de Escherichia Coli, y ADN genmico de
los hongos de levadura Saccharomyces Cerevisiae, por la accin de detergentes no inicos
enzimas y calor. De lo que se concluye que el ADN plasmdico contiene todo la informacin
gentica esencial para la vida de la bacteria, la cual se encuentra unida a una sola molcula
de cido desoxirribonucleico (ADN), y del ADN genmico a vista microscpica se observ
el proceso de gemacin que experimentan estos hongos unicelulares.

PALABRAS CLAVES
ADN plasmdico, ADN genmico, Bacteria, Levadura, Extraccin de ADN, Protenas,
cidos nucleicos.

ABSTRACT
The bacteria are microorganisms with an extraordinary ability to adapt to different
environmental conditions, to understand the essence of this capacity it is important to know
their genetic bases, i.e., how genetic information is organized and mechanisms of gene
variation what have, for this reason the following report aims to present the methodology that
was held for the extraction of DNA plasmid from bacterial culture of Escherichia Coli, and
genomic DNA from fungi of Yeast Saccharomyces Cerevisiae, by the action of detergents,
nonionic enzymes and heat. From which it is concluded that the DNA plasmid contains all
the genetic information essential to the life of the bacterium, which is attached to a single
molecule of deoxyribonucleic acid (DNA), and genomic DNA to microscopic view was
observed the process of gemmation that they experience these unicellular fungi.

KEY WORDS
DNA plasmid, genomic DNA, Bacteria, yeast, DNA, proteins, nucleic acids.
INTRODUCCIN
Toda la informacin gentica esencial para fosfato unido a un monosacrido (llamado 2-
la vida de una bacteria est contenida en desoxirribosa), al que se adhiere una base, a su
una nica molcula de cido vez los nucletidos se unen entre s en cadenas
desoxirribonucleico (ADN) de doble de poli nucletidos por medio del hidroxilo 3
cadena y circular, cerrado por enlaces de la 2-desoxirribosa de un nucletido (fig. 2).
[1]
covalentes. En las bacterias dicha
molcula se denomina cromosoma
bacteriano. Muchas bacterias poseen
adems ADN extracromosmico, tambin
circular y cerrado, denominado ADN
plasmdico por estar contenido en los
plsmidos. stos, portan informacin
gnica para muchas funciones que no son
esenciales para la clula en condiciones
normales de crecimiento.

El DNA
El DNA est compuesto por cadenas de poli
nucletidos enroscados una alrededor de la
otra en la forma de una hlice de doble. En su
parte superior al igual que la inferior tienen el
mismo aspecto, esto a causa de su naturaleza
complementaria (fig1). La columna de cada
cadena de la hlice est formada por residuos
alternados de monosacridos y fosfatos; las
bases se proyectan hacia el interior pero son
accesibles a travs de los surcos mayor y
menor. [1] Figura 1. Tomada de Biologa molecular del gen pag 108.

La hlice doble se compone de dos cadenas de EL GEONOMA PROCARIOTA

poli nucletidos mantenidas juntas por
enlaces no covalentes dbiles entre pares de
bases, la adenina de una cadena serie se aparea
con timina en la otra cadena y, del mismo
modo, la guanina siempre se aparea con la
citosina; las dos cadenas tienen la misma
geometra helicoidal pero el apareamiento de
la cadena las mantienen juntas con la polaridad
opuesta, (5y 3). Este modo de apareamiento
entre las bases nitrogenadas trae como
consecuencia una relacin de
complementariedad entre la secuencia de
bases de las dos cadena entrelazadas y le
imparte al DNA su carcter auto codificante.
[1]
La naturaleza del nucletido, subunidad
fundamental del DNA. Est presente en un
Es comparativamente, de pequeo tamao y
relativamente sencillo. Se reduce a un nico
cromosoma formado por una molcula
circular de DNA, localizada en suspensin en
el citosol pero anclada a la membrana
constituyendo la zona nuclear o Nucleoide, sin
membrana que la delimite. Es frecuente
encontrar, adems, una pequea cantidad de
material gentico extra, no esencial, en forma
de pequea molculas circulares de DNA,
llamadas plsmidos. [2]
Los plsmidos son fragmentos
extracromosmico de ADN que se presentan
en el citoplasma de los procariotas, presentan
las siguientes caractersticas esenciales: es
bicatenario y de forma circular, tienen un solo
origen de replicacin, regulan su propia
replicacin a travs de una protena o RNA
represor, pueden aparecer uno o varios en una
sola clula procariota, los genes no son
siempre los mismos puesto que codifican para
enzimas que les dan ventaja para poder
sobrevivir como lo son la resistencia, la
capacidad de degradar sustancias, la fertilidad
y virulencia, esta molcula es independiente
del cromosoma de ADN y est separada de
este mismo. Su facilidad para la reproduccin
y para combinarse con otros segmentos de
ADN para formar ADN recombinante que
puede generar varias copias de esta misma son
una caracterstica muy importante para que se
usen como medios de clonacin para
segmentos de ADN. [3]
EL GENOMA EUCARIOTA
Debe distinguirse entre el genoma nuclear y el
de los organelos; el genoma nuclear aparece
bajo 2 formas estructuralmente diferentes a lo
largo del ciclo celular: la cromatina como
material filamentoso disperso por la mayor
parte del ncleo en la interfase y los
cromosomas fcilmente observables como
entidades morfolgicas o corpsculos
independientes en los momentos previos a la
divisin celular. Ambas formas estn
constituidas por las mimas molculas lineales
muy largas de DNA bicatenario,
estrechamente asociado a la protena. El
genoma de orgnulos (cloroplastos y
mitocondrias) est formado por cromosomas
circulares, al igual que el de procariotas para
una mejor diferenciacin se puede observar la
siguiente tabla. [2]
LA ESCHERICHIA COLI
Es un bacilo gramnegativo, con una sola
cadena espiral de DNA mvil, aerobio y
aerobio facultativo, co flagelos peritricos. La
mayora forma fimbrias y pilis, muchas cepas
producen una pequea micro capsula, y muy
pocos elaboran macro capsulas y no fabrican
esporas. En las pruebas bioqumicas es
positiva al indol, decarboxilasa de linasa,
fermentacin de manitol y gas a partir de la
glucosa; tiene su informacin gentica en los
plsmidos su genoma tiene un total de 5000
genes y su transcripcin se encuentra el
siguiente factor sigma.
EXTRACCION DE DNA
Los pasos necesarios para una correcta
extraccin y purificacin del ADN
mediante un procedimiento qumico son:
1. Lisis de las clulas o virus. Las sales
caotrpicas ayudan a romper la estructura
tridimensional de macromolculas como
las protenas o los cidos nucleicos
consiguiendo su desnaturalizacin. La
adicin de un detergente como el SDS es
necesaria a menudo para eliminar las
membranas.
2. Degradacin de la fraccin proteica
asociada al ADN. Se consigue mediante la
adicin de una proteasa. La fraccin
proteica puede precipitarse mejor con la
ayuda de sales como el acetato de amonio
o el acetato sdico.
3. Purificacin. Consta de 3 fases:
Precipitacin del ADN. El ADN es
insoluble en alcohol, por lo que se puede
precipitar etanol fro o isopropanol y
recuperar mediante una centrifugacin. El
alcohol del sobrenadante se llevar las
sales aadidas previamente.
Lavado del pellet. Se realiza con alcohol
fro volviendo a centrifugarse
Recuperacin. El sedimento se puede
resuspender en agua o tampn Tris tras ser
secado completamente.
La confirmacin de la presencia de ADN
se lleva a cabo mediante electroforesis en
un gel de agarosa y posterior tincin con
bromuro de etilo y observacin con luz UV
o directamente al espectrofotmetro
mediante espectro de absorcin de 200 a
350 nm. El ADN purificado se puede
cuantificar con un espectrofluormetro
mediante el uso de fluorforos especficos.
El propsito de esta prctica consisti en
la extraccin de ADN plasmdico de una
bacteria Escherichia Coli y ADN
genmico del hongo de la levadura
Saccharomyces Cerevisiae para un
proceso siguiente que pretende cuantificar
dicho ADN por un mtodo de
electroforesis en gel.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
La levadura de cerveza (Saccharomyces
cerevisiae Meyen ex E.C.Hansen, de
Saccharo azcar, myces hongo y
cerevisiae cerveza) es un hongo unicelular,
un tipo de levadura utilizado
industrialmente en la fabricacin de pan,
cerveza y vino. En su ciclo de vida alternan
dos formas, una haploide y otra diploide.
Ambas formas se reproducen de forma
asexual por gemacin. En condiciones
muy determinadas la forma diploide es
capaz de reproducirse sexualmente. En
estos casos se produce la meiosis en la
clula formndose un asca que contiene
cuatro ascosporas haploides.
S. cerevisiae es uno de los modelos ms
adecuados para el estudio de problemas
biolgicos. Es un sistema eucariota, con
una complejidad slo ligeramente superior
a la de la bacteria pero que comparte con
ella muchas de sus ventajas tcnicas.
Adems de su rpido crecimiento, la
dispersin de las clulas y la facilidad con
que se replican cultivos y aslan mutantes,
destaca por un sencillo y verstil sistema
de transformacin de ADN. Por otro lado,
la ausencia de patogenicidad permite su
manipulacin con las mnimas
precauciones.
Tiene un sistema gentico que, a diferencia
de la mayora de los otros
microorganismos, presenta dos fases
biolgicas estables: haploide y diploide.
La fase haploide permite generar, aislar y
caracterizar mutantes con mucha facilidad,
mientras que en la diploide se pueden
realizar estudios de complementacin.
Una levadura haploide contiene 16
cromosomas que varan en tamao de 200
a 2200 kilobases (kb).
METODOLOGA
Tomada de la GUA N 1 DE
AISLAMIENTO DE ADN GENMICO
DE LEVADURAS Y ADN
PLASMDICO DE BACTERIAS
(profesora: Heydi Narvez)
ANLISIS Y RESULTADOS
Extraccin de ADN plasmidico de
Escherichia Coli.
La lisis alcalina es el mtodo ms utilizado
para el aislamiento de plsmidos
circulares, provenientes de clulas
bacterianas. A continuacin, se describe lo
que ocurre en cada proceso. [6]
a. Se remueve las clulas del medio de
cultivo en caldo (centrifugacin)
b. El sobrenadante es descartado, para
reducir contaminacin mediante
fragmentos de la pared celular del
husped.
c. Se re suspenden las clulas que
contienen un amortiguador que
contenga Tris, EDTA y glucosa
(solucin 1). La funcin que cumplen
estos amortiguadores es inicialmente
la re suspensin de las clulas, estos se
encuentran en un sistema buffer a un
pH 8 (pH bsico), es decir a baja
concentracin de H+, favoreciendo la
repulsin entre cargas negativas de los
grupos fosfato de los cidos nucleicos,
como tambin la repulsin entre cargas
negativas de las cabezas polares de los
fosfolpidos de las membranas
celulares. Especficamente la
utilizacin del quelante (EDTA), que
contiene cationes divalentes (Ca2+,
Mg2+), secuestra iones Mg2+ que son
cofactores de las nucleasas impidiendo
que estas enzimas degraden. Secuestra
iones Ca2+ desestabilizando las
membranas de las bacterias, adems
por ser una solucin hipotnica
favorece el ingreso de agua a las
clulas por osmosis y se favorece su
ruptura por la diferencia de presiones.
[7]
d. Ruptura de la membrana celular por la
accin de NaOH y SDS (solucin 2).
El Dodecilsulfato sdico es utilizado
para romper las membranas y paredes
celulares. Es un detergente
(tensoactivo) que golpea
qumicamente provocando agujeros en
estos orgnulos celulares para que
deshagan mecnicamente. Al
romperlas es ms sencillo obtener el
ADN u otro contenido celular.
Figura 2. Dodecilsulfato sdico (esquema molecular). [7]
e. Unin de las hebras de ADN y
remocin de contaminacin al agregar
acetato de potasio. Esto provoca que se
cierre covalentemente el ADN
plasmidico y la precipitacin de las
protenas (por el tratamiento con el
detergente y la insolubilidad de la sal
potsica del dodecil sulfato). Despus
se procede a la precipitacin del ADN
plasmidico mediante etanol y una sal
(Acetato de sodio). El etanol limpia el
ADN de otras biomolculas por medio
de la precipitacin. En este proceso el
etanol hace que el ADN se deshidrate,
es decir pierda contacto con las
molculas de agua que lo rodean. [7]
f. Enguaje del material gentico con
EtOH al 70%. Parte del ARN precipita,
pero siempre quedan cantidades
detectables de esta molcula, a menos
que se utilicen RNasas durante el
proceso de extraccin.
Extraccin de ADN genmico
En primera instancia se procedi a la
activacin y visualizacin de las clulas de
la levadura Saccharomyces Cerevisiae, a
la cual se calent agua desionizada hasta
40 C, se disolvi azcar y luego fue
agregada la levadura, y se dej reposar a
temperatura ambiente sin entrada y salida
de oxgeno. Lo que se quera demostrar
con esto es que las levaduras son
organismos unicelulares y realizan
importantes funciones de nutricin e
incorporacin de energa que utilizan para
sus procesos vitales, cuando se agreg
sacarosa, que est compuesto por una
molcula de glucosa y una fructosa, las
levaduras utilizaron este azcar como
fuente principal de energa alimentndose
de este carbohidrato y produciendo una
liberacin excesiva de CO2 altamente
visible. Y al contener las levaduras se
deriv a su posterior visualizacin en un
microscopio ptico de luz visible, donde se
observ los hongos unicelulares de la
levadura Saccharomyces Cerevisiae y el
proceso de gemacin que sufren estos
organismos unicelulares.
Figura 3: Observacin microscpica de los hongos de la
levadura
Para la extraccin de ADN genmico se
utiliza buffer TE el cual tiene como
propsito solubilizar el ADN mientras que
lo protege de la degradacin y buffer de
lisis, que esta compuesto de NaCl 0,1M;
Tris HCl 10mM pH 8,0; EDTA 1mM pH
8,0 y Tritn X-100 al 5%. Cuando los
iones salinos del NaCl son atrados hacia
las cargas negativas pertenecientes a los
grupos fosfatoo del ADN, permiten
producir el estallido de los ncleos para
que queden libres las fibras de cromatina.
[4] Se empieza por romper las clulas
mediante un detergente, en este protocolo
se utiliza SDS, y a su vez por el empleo de
esferas de vidrio de 0,5 mm que al ser
expuestas al efecto producido por el
vrtex, produce el rompimiento celular
con mayor eficacia; vacindose su
contenido molecular en una disolucin que
en ese momento contiene ADN y una
mezcla de restos moleculares, entre los que
se pueden mencionar: ARN,
carbohidratos, protenas y otras sustancias
en menor proporcin. Las protenas
asociadas al ADN, de gran longitud, se
fraccionan en cadenas ms pequeas y
separadas por accin del detergente. El
fenol: cloroformo se utiliza para precipitar
el ADN que es soluble en agua por lo que
se encontrar en la fase acuosa de la
solucin y los restos proteicos entre otros,
que sern desnaturalizados por accin del
fenol. [5]
CONCLUSIONES
Se extrajo ADN de hongos de la levadura
Saccharomyces Cerevisiae empleado un
mtodo tradicional cuyo ADN ser
implementado para posterior anlisis
electrofortico, se logr observar mediante
el microscopio ptico de luz visible, el
proceso de gemacin que sufren los
organismos unicelulares.
Para obtener DNA plasmdico este debe
ser replicado en una clula anfitriona. Con
frecuencia se utilizan cepas de E. coli por
las facilidades que ofrecen para su
manipulacin y por ser un organismo muy
estudiado, el cultivo bacteriano debe
provenir de una sola colonia, la cual debe
ser cultivada en 5 ml de medio lquido.
Utilizando el agente selectivo adecuado
(antibitico)
BIBLIOGRAFA
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Prcticas de laboratorio de Biologa
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https://books.google.com.ec/books?id=vG
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[5] Fraga, Rodrguez, Fuentes, Castex &
Fernndez. (2004). Comparacin entre 5
mtodos para la extraccin de ADN de
Triatomneos: su utilizacin en la tcnica
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[6] Pinto (2006). Gua de laboratorio de

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http://bacteriologiaclinica.wikispaces.com
/file/view/PRACTICA_No_4_EXTRAC
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[7] Navarro, Snchez, Urrego. (2014).

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cromosmico en bacterias. Universidad de
panam, facultad de medicina,
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http://es.calameo.com/read/00378924513
77bff8ba7b