3B-2

GUA DE PRCTICAS

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA
LABORATORIO CLNICO Y ANATOMA APLICADA

Nombre de la asignatura: MICOLOGA

Autor (es): Lic. Roberto E. Rojas Len

INTRODUCCIN:

Aunque algunas veces ignorados, los hongos son importantes por las diversas patologas que producen en el
humano, las micosis, estas enfermedades de acuerdo a su severidad van desde presentaciones meramente
cosmticas hasta aquellas en las que nos ponen en riesgo de muerte. En las ltimas dcadas, la casi totalidad
del diagnstico micolgico que se desarrollaba en la mayora de los laboratorios de Micologa, estaban
relacionados con las micosis superficiales y cutneas, el cambio drstico de ese hecho se debi, en particular, al
avance tecnolgico de la medicina y el aumento de la sobrevida de los pacientes con enfermedades complejas e
inmunodeficiencias, creando una gran y altamente poblacin susceptible. Pacientes en riesgo incluyen pacientes
con cncer (con y sin neutropenia), trasplantes de rganos, SIDA, ciruga abdominal, alimentacin parenteral,
infantes prematuros, quimioterapia, entre otros. Hasta la dcada de los 80 las especies fngicas relacionas a
micosis en humanos eran de aproximadamente 150 especies, hasta el ao 2000 se incrementa sustancialmente
llegando casi a 400 especies, siendo una pequea fraccin de las aproximadamente 100,000 especies de
hongos descritas, lo cual hace suponer que cualquier hongo es un potencial oportunista. Por todo ello el alumno
de pregrado debe adquirir conocimientos y destrezas para el correcto aislamiento e identificacin de hongos de
importancia mdica.

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

I. PRCTICA No. 1 Observacin macroscpica de los hongos desarrollados sobre medios de cultivo.

1.1 Marco terico: En el laboratorio los hongos son observados de dos maneras, bajo el microscopio
(microscpicamente) y como una colonia sobre una placa de agar (microscpicamente).
1.1.1 Morfologa microscpica: Microscpicamente la clula fngica es observada ya sea como hifa
(mohos) o como levadura.

-Hifas, propia de los mohos

1. Por su tabique:

a. Septadas, presentan tabiques o paredes transversales, delimitando a cada una de las clulas que
conforman las hifas, estas hifas de 3 a 4 um de dimetro son propias de los Ascomycota, Basidiomycota y
hongos mitospricos.
b. Aseptadas (continuas, cenociticas o en sifn), usualmente no presentan tabiques, propias de los
Zygomycota, son anchas en forma de cintas de 6 a 10 um de dimetro.

2. Por su funcin:

a. Area, se extiende por encima del agar y puede soportar estructuras reproductivas (conidias).
b. Vegetativa, est por debajo de la superficie del agar sirviendo para la nutricin del hongo.
c. Hifa vegetativa no reproductiva, puede poseer caractersticas no reproductivas muy distintivas, lo cual
ayuda en la identificacin de especies.
i. Candelabros fvicos
ii. rganos nodulares
iii. Hifas en raquetas
iv. Hifas en espiral

3. Por su pigmentacin:

a. Hialinos o incoloras, como en los Mucedinceos.

b. Hongos negros o pardos como en los Demateceos.

i. Levaduras, clulas redondeadas a ovales, las cuales brotan para formar clulas hijas.

1.1.2 Morfologa macroscpica: Aunque muchos hongos no tengan una morfologa colonial
caracterstica suficiente, que permita su identificacin sin otro criterio adicional, algunas son
muy distintivas. Ciertos trminos generales son usados para describir las colonias fngicas:

ii. Textura: Describe la altura de las hifas areas. La textura est relacionada y mejor descrita si
practicramos un corte transversal de la colonia, como se ilustra en la Figura 1. Colonias
algodonosas o lanosas producen un micelio areo muy alto y denso; colonias aterciopeladas
tienen un micelio areo bajo el cual semeja a la tela terciopelo; colonias granulares o pulverulentas
son planas y friables debido a la densa produccin de conidias. La textura granular es rugosa,
semejante al azcar granulado y las pulverulentas al harina, estos dos trminos son
indistintamente usados, y las colonias glabrosas o serosas tienen una superficie lisa debido a que
ellas no producen micelio areo, usualmente las levaduras corresponderan a esta apariencia
macroscpica.

Fig. 1. Esquema de la textura de las colonias fngicas.

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 iii. Topografa: Describe las variadas disposiciones de montculos y aplanamientos vistos sobre las
colonias de hongos, Fig. 2. La topografa es a menudo enmascarado por las hifas areas, por lo
tanto esta caracterstica es mejor observada sobre el reverso de la colonia; una colonia plana
entonces no tiene topografa. Las colonias rugosas tienen surcos profundos irregularmente
radiados desde el centro de la colonia; las colonias umbilicadas poseen una elevacin central a
manera de botn, estas pueden estar acompaadas por pliegues alrededor del botn y las colonias
verrucosas exhiben una superficie arrugada y retorcidas.

iv. Color: Dado especficamente por la produccin de pigmento de la colonia, pudiendo ser en el
frente (haz) y reverso (envs), eventualmente algunas especies de hongos producen un pigmento
difusible en el medio de cultivo.

v. Velocidad de crecimiento: La velocidad de crecimiento fngico es variable, algunos hongos

maduran entre 3-4 das mientras que otros requieren de 3-4 semanas. As tenemos los de
crecimiento rpido, las cuales maduran en 5 das o menos, las de crecimiento intermedio (6-10
das) y las de crecimiento lento (11-21 das).

Fig. 2. Esquema de la topografa de las colonias fngicas

1.2 Competencias: Describe el crecimiento in vitro de los hongos.

1.3 Materiales y equipos: Cultivos en placas de levaduras y mohos.

1.4 Procedimiento: Realizar el estudio macroscpico y microscpico con objetivos de 10x, 20x y 40x de
aumento, localizando y diferenciando las principales estructuras fngicas.

1.5 Resultados: Realice esquemas de sus observaciones macroscpicas de colonias fngicas.

1.6 Cuestionario: En las observaciones macroscpicas como diferenciara un moho de una levadura?

1.7 Fuentes de informacin:

Saldarriaga O., Yamille y Pineda G., F. 2001. Manual de micologa aplicada. 1ra. Edicin. Editorial
Universidad de Antioquia. Medelln.

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili, 2000.

Koneman, E y Roberts, G (1987) Micologa. Practica de laboratorio. Traducido por Editorial Mdica
Panamericana s.a. ed. editorial mdica panamericana s.a. Bs. As. ed. Tercera.

Emmons CW, Binford CH, Utz JP, Kwon-Chung KJ. Medical Mycology. Philadelphia, Lea &
Febiger, 1977

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II. PRACTICA No. 2 Observacin de la morfologa y estructuras fngicas de hongos.

2.1 Marco terico: Levaduras, crecen como clulas nicas. Muchas se reproducen por un proceso
asexual llamado brotacin o gemacin. La clula madre produce un brote llamado blastonidio o blastospora,
la cual se separa y crece igual que su progenitora. Muchas levaduras tambin producen estructuras
llamadas pseudohifas. Estas son blastoconidias individuales que estn elongadas y permanecen unidas.
Estas se diferencian de las hifas verdaderas de los mohos por una constriccin de la pseudohifa vista al
finadle las clulas individuales. Las hifas verdaderas vistas en los mohos y ciertas levaduras no tienen
constriccin. Ciertas levaduras producen tres tipos de estructuras: blastosporas, pseudohifas e hifas. Otra
estructura producida por pocas especies de levaduras es el tubo germinativo. Este es una estructura tubular
que se desarrolla en la superficie de la levadura. Este tiene paredes paralelas sin constriccin. Los tubos
germinativos son vistos al examen directo de muestras clnicas o despus del desarrollo de levaduras en
medios que estimulan su produccin.

a) Reproduccin sexual. Las levaduras se reproducen sexualmente ya sea por ascosporas o

basidiosporas. Las ascosporas son esporas sexuales formadas dentro de un saco especial, llamado asco.
Las basidiosporas son formadas sobre unas estructuras en forma de garrote, llamada bside.

b) Reproduccin asexual. Todas las levaduras verdaderas pueden producir blastosporas y pueden producir
otras estructuras asexuales. Las levaduras pueden producir pseudohifas y verdaderas hifas. Si la hifa
verdadera se fragmenta en clulas individuales, estas son llamadas artroconidias. Muchas levaduras
producen blastoconidias y pseudohifas. Una excepcin son especies de Trichosporon, los cuales producen
blastoconidias, artroconidias, pseudohifas e hifas verdaderas.

Mohos, el filamento individual de un moho es llamado hifa, Las paredes de las hifas son paralelas y no
constreidas, como si lo son las pseudohifas las cuales se ven en las levaduras.

a) Reproduccin sexual. Los mohos se reproducen sexualmente va ascosporas, basidiosporas o por

zigosporas. Las zigosporas son formadas despus del contacto y unin de las puntas de dos hifas. Estas
puntas contienen esporas sexuales y se unen para formar una espora en reposo de pared gruesa, llamada
zigospora. Esta espora es ms grande que la hifa y es formada por el flujo de protoplasma y ncleos en la
estructura.

b) Reproduccin asexual. Los mohos se reproducen asexualmente usando una variedad de clulas o
estructuras. En los Zygomicetes, la estructura bsica es llamado esporangio. Esta es una clula en forma
de saco en la cual estructuras internas son formadas en unidades individuales, llamadas esporangiosporas.
Estas esporangiosporas pueden ser aleatoriamente distribuidas en el esporangio, o pueden estar
dispuestos en hilera. Los esporangios son llevados por una hifa especializada llamada esporangiforo, el
cual se origina de la hifa vegetativa. Muchos hongos de inters mdico no producen esporangios, pero
producen estructuras llamadas conidias. Conidia por definicin son estructuras que desarrollan de manera
asexual, diferente de un esporangio. Las conidias son producidas de hifas especializadas llamadas clulas
conidigenas.

Tipos de conidias estn basados en su clula de origen.

i. Aleuroconidia. Conidia nica producida por liberacin al final de la clula conidigena.
ii. Aneloconidia. Blastoconidia producida en la base de la clula conidigena (anlido); el conidio
ms antiguo est en el pice y la ms joven en la base. Cuando un conidio es producido, una
cicatriz o anelacin es dejada en la superficie externa de la clula conidigena.
iii. Artroconidia. Conidia producida por fragmentacin de la hifa en clulas individuales.
iv. Blastoconidia. Conidia producida por brotacin o brotes de una porcin de la clula preexistente
o progenitora
v. Fialoconidia. Conidia producida de una clula conidigena (filide) que no incrementa su longitud
cuando las conidias son producidas.
vi. Poroconidia. Conidia producida a travs de poros en la clula conidigena.

2.2 Competencias: Describe la morfologa microscpica de algunos hongos y tipo de conidio gnesis
estudiados en micologa mdica.

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 2.3 Materiales y equipos:

Lminas con microcultivos de diferentes mohos.

Lminas con levaduras de diferentes gneros.

Microscopio.

2.4 Procedimiento: Realizar el estudio microscpico con objetivos de 10x, 20x y 40x de aumento,
localizando y diferenciando las principales estructuras reproductivas fngicas.

2.5 Resultados: Realizar esquemas de sus observaciones microscpicas, que observ y aumento.

2.6 Cuestionario:

Cmo demostrara la presencia de levaduras ascgenas?

En la industria panadera Cul es la levadura ms importante?

2.7 Fuentes de informacin:

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

Koneman, E y Roberts, G. 1987. Micologa. Practica de laboratorio. Traducido por Editorial Mdica
Panamericana s.a. ed. editorial mdica panamericana s.a. Bs. As. ed. Tercera.

Emmons CW, Binford CH, Utz JP, Kwon-Chung KJ. 1977. Medical Mycology. Philadelphia, Lea &
Febiger.

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III. PRACTICA No.3 Preparacin de reactivos, colorantes y medios de cultivos

3.1 Marco terico:

a. Medios de cultivo
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes,
preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los
microorganismos. Actualmente no existe un medio de cultivo que satisfaga el aislamiento de todos
los hongos de importancia mdica, por ello en el laboratorio de micologa existe una amplia
variedad de medios de cultivo, cuyos usos estn condicionados al hongo a investigar. Tambin son
importantes la temperatura y el tiempo incubacin, as como tambin los contenedores de los
medios de cultivo (placas o tubos). Generalmente se recomienda como temperatura de incubacin
de 28-30 C, as como tambin a temperatura ambiente. Para el reparto de los medios de cultivo en
micologa, eventualmente pueden usarse placas petri, por cuanto ofrecen mayor superficie en
donde pueda diseminarse el material a cultivar, pudiendo evitarse la deshidratacin dispensando
aproximadamente 40 ml. de medio de cultivo por placa; el uso de tubos tapa rosca de gran calibre
son lo ms recomendable, usualmente no presenta el problema de deshidratacin, no debiendo
dejarse la tapa totalmente cerrada, sino ligeramente abierta, para permitir una adecuada aireacin,
porque el desarrollo ser anormal o inhibido, retardando as la identificacin de los hongos. La
incorporacin de agentes antibacterianos como cloranfenicol (16 ug/ml), gentamicina (5-100
ug/ml), penicilina (20 ug/ml), estreptomicina (40 ug/ml), norfloxacina (5 ug/ml), y ciprofloxacina
(5ug/ml), incrementan considerablemente la posibilidad de obtener cultivos libres de presencia
bacteriana como contaminante. Tambin se puede usar la cicloheximida (actidione, 0.5 ug/ml), para
inhibir el desarrollo de hongos saprfitos de rpido crecimiento, pero este es adems capaz de
inhibir el desarrollo de algunas levaduras como C. neoformans, especies de Candida, especies de
Trichosporon, especies de Aspergillus, P. boydii, entre otros; por esta razn el uso de cicloheximida
debe ser cuidadosamente empleada en los medios usados. Para incrementar la recuperacin de
algunos hongos dimrficos se emplea Agar Infusin de Cerebro-Corazn con 10-20% de sangre de
carnero. Tambin se emplea compuestos especficos o indicadores para poner de manifiesto
caracteres bioqumicos esenciales distintivos de gneros y especies.

b. Reactivos y colorantes
Para el estudio de los hongos es necesario del uso de reactivos y colorantes. Si se trata de una
muestra clnica (pus, esputo, raspados de piel, fragmentos de pelo, etc.) es necesario el empleo de
aclarantes que permitan resaltar las estructuras fngicas al disolver el moco o queratina de la
muestra. Teir es un proceso de colorear artificialmente los microorganismos con colorantes o
reactivos con el objeto de facilitar su observacin y estudio al microscopio. Los colorantes son
compuestos orgnicos conformados por anillos bencnicos que tienen un grupo auxocromo
(intensifican el color y mejoran la afinidad del colorante) y uno cromforo (imparte color). Los
colorantes deben conservarse en frascos de color mbar. Se recomienda preparar en cantidades
para un consumo no mayor de un mes. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a
los pequeos cuentagotas que se emplean para la tincin, deben filtrarse. Los frascos cuentagotas
y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado cada vez que se renueve su contenido.

3.2 Competencias:

3.2.1 Explica la preparacin de medios de cultivo, colorantes y reactivos utilizados en el laboratorio

de micologa.

3.3 Materiales y equipos

a. Peptona
b. Glucosa
c. Agar
d. Agar micobiotic o micosel
e. Papa
f. Granos de arroz blanco no enriquecido
g. Harina de maz
h. Tween 80
i. Agua destilada
j. Material de vidrio (tubos tapa rosca, probeta, matraz, beaker, otros)

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 k. Papel filtro
l. Fenol
m. Azul de metileno
n. Acido lctico
o. Glicerina
p. Azul de algodn o sol. acuosa 1%
q. Hidrxido de potasio
r. Mechero de bunsen
s. Rejilla de asbesto
t. Trpode
3.4 Procedimiento:
a. Medios de cultivo
i. AGAR SABOURAUD CON CLORANFENICOL Y CICLOHEXIMIDA (MICOBIOTIC,
MICOSEL)
Para recuperacin de hongos patgenos a partir de muestras muy contaminadas con
hongos saprfitos y bacterias, como dermatofitos y hongos dimrficos. Su utilizacin
requiere de algunas consideraciones por cuanto en capaz de inhibir hongos de
importancia mdica (Candida no albicans, especies de Aspergillus, Zygomycetes,
Cryptococcus neoformans, especies de Trichosporon, P. boydii entre otros).
Agar micobiotic o micosel 36 g
Agua destilada 1000 ml
Adicionar el agar al agua, mezclar y hervir hasta disolver el medio completamente. Ajustar
el pH a 6.5 0.2 y dispensar alcuotas de 20 ml. en tubos tapa rosca limpios. Esterilizar en
autoclave por 15 min. a 121 C. e inclinar los tubos hasta que el agar se solidifique.

ii. AGAR PAPA DEXTROSA

Medio que estimula la formacin de conidias, pigmento (rojo en T. rubrum, rosa salmn en
M. audouinii y amarillo en M. canis). Tambin utilizado en la realizacin de microcultivos o
cepario.
Papa 200 g
Glucosa 10 g
Agar 15 g
Agua destilada 1000 ml
Lavar, pelar y cortar la papa en dados pequeos, adicionar el agua y autoclavar por 10
min. a 121 C para hacer la infusin de papa. Filtrar la infusin a travs de gasa. Adicionar
el agar y la glucosa, hervir hasta disolver. Llevar el volumen total a 1000 ml con agua
destilada si fuera necesario. Dispensar en tubos tapa rosca limpios. Esterilizar en
autoclave por 15 min. a 121 C. e inclinar los tubos hasta que el agar se solidifique.

iii. AGAR SABOURAUD DEXTROSA (Modificado por Emmons)

Medio estndar para el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos.
Peptona 10 g
Glucosa 20 g
Agar 15 g
Agua destilada 1000 ml
Mezclar los componentes y hervir hasta disolucin completa. Dispensar en tubos tapa
rosca. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C. e inclinar los tubos hasta que el agar
se solidifique.

iv. AGAR HARINA DE MAIZ TWEEN 80 (Agar morfologa)

Para la identificacin morfolgica de levaduras.
Harina de maz 40 g
Agar 20 g
Tween 80 10 ml
Agua destilada 1000 ml
Mezclar el harina de maz con el agua y calentar por 1 h a 65 C., filtrar a travs de gasa y
luego con papel de filtro Whatman n 2. Agregar el agar, hervir hasta disolver. Completar a
1000 ml con agua destilada si fuese necesario, adicionar el tween 80 y mezclar. Esterilizar
en autoclave por 15 min. a 121 C. Dispensar aspticamente en placas petri estriles.

v. SOLUCION ANTIBIOTICA

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 Usado como inhibidor bacteriano de medios de cultivo.
Cloranfenicol (cpsula) 500 mg
Etanol 95% 10 ml
Disolver el contenido de la cpsula en el alcohol y utilizar 1 ml por litro de medio de cultivo
a preparar.

b. Reactivos y colorantes
i. COLORANTE DE KANE
Empleado en la demostracin de estructuras fngicas en raspados de piel, especialmente
en lesiones provenientes de la pitiriasis versicolor.
Glicerina 10.0 ml
Tween 80 10.0 ml
Fenol 2.5 g
Azul de metileno 1.0 g
Agua destilada 480.0 ml

Disolver la glicerina, el Tween 80 y el fenol en el agua destilada calentando ligeramente,

luego aadir el azul de metileno hasta disolver. Conservar en frasco color caramelo.

ii. LACTOFENOL DE AMMAN

Este aclarante se emplea preferentemente para la observacin microscpica de los
cultivos y de algunas muestras en las que se quiere mantener la estructura de sus
elementos.
Fenol 20 g
Acido lctico 20 ml
Glicerina 40 ml
Agua destilada 20 ml
Primero se mezcla el cido lctico y la glicerina con el agua destilada, y seguidamente se
aaden los cristales de fenol, previamente fundido a 60 C en bao mara, bajo agitacin
hasta la disolucin de los mismos.

iii. AZUL DE LACTOFENOL

Es usado como colorante y lquido de montaje. El cido lctico acta como agente
aclarante y ayuda en la preservacin de estructuras fngicas, el fenol acta como agente
fungicida, la glicerina previene la deshidratacin y el azul de algodn da el color a las
estructuras.
Fenol 20 g
Acido lctico 20 ml
Glicerina 40 ml
Agua destilada 20 ml
Azul de algodn (o sol. acuosa 1%, 2 ml) 0.05 g
Fundir el fenol previamente a 60 C. en bao mara y mezclar con el cido lctico, glicerina
y el agua, luego agregar el azul de algodn (azul de Poirrier y azul de anilina son anlogos
al azul de algodn).

iv. HIDROXIDO DE POTASIO 20%

Usado en la deteccin de estructuras fngicas en muestras clnicas por examen
microscpico. Su concentracin vara entre el 10 y 40%.
Hidrxido de potasio 20 g
Glicerina 10 ml
Agua destilada 70 ml
Los cristales de KOH se aaden lentamente en agitacin hasta su completa disolucin.

3.5 Resultados:
3.5.1 El alumno obtendr el material para sus futuras prcticas
3.6 Cuestionario:

3.6.1 Cul es el objetivo de usar un antibacteriano en los medio de cultivo en micologa?

3.6.2 Cules son las funciones de los componentes del azul de lactofenol?

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 3.7 Fuentes de informacin:

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

Koneman, E y Roberts, G. 1987. Micologa. Practica de laboratorio. Traducido por Editorial Mdica
Panamericana s.a. ed. editorial mdica panamericana s.a. Bs. As. ed. Tercera.

Emmons CW, Binford CH, Utz JP, Kwon-Chung KJ. 1977. Medical Mycology. Philadelphia, Lea &
Febiger.

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IV. PRACTICA No.4 Preparaciones microscpicas (fragmentacin del talo, cinta adhesiva, microcultivos)

4.1 Marco terico: Una vez que la colonia del hongo ha madurado, lo cual se observa por su morfologa
microscpica, la apariencia colonial puede ayudar a identificar a un hongo, sin embargo esta morfologa
puede variar grandemente entre cepas de hongos, tiempo y temperaturas de identificacin y medios de
cultivo empleados. Para mohos, la identificacin final depende bsicamente de la morfologa microscpica,
aunque existen pocas pruebas bioqumicas tiles. Para levaduras las pruebas bioqumicas son la base
principal para su identificacin, con menor nfasis en la apariencia microscpica y macroscpica. Hay
diferentes procedimientos frecuentemente usados para el examen microscpico de un cultivo fngico:
a. Montaje por fragmentacin del talo
Una preparacin por fragmentacin es la tcnica mas comn y rpida para montaje de
hongos y su examen microscpico. Desde que el crecimiento de los mohos, fragmentado
con agujas de diseccin, conidias o esporas pueden ser dislocadas de las clulas
conidigenas o esporgenas. Puede ser necesario el uso de tcnicas de microcultivos si la
identificacin no puede ser realizada de los montajes con cinta scotch.
b. Montaje con cinta adhesiva (scotch):
Este Mtodo usualmente mantiene la posicin original de las estructuras fngicas
caractersticas. Sin embargo, el organismo debe crecer sobre medios plaqueados adems
de ser examinados por este mtodo.
c. Microcultivos: Exacta identificacin de hongos filamentosos basada sobre examen
microscpico de estructuras de esporulacin de una colonia. Mientras que la fragmentacin
del talo es til, ella tiene 2 principales desventajas: 1) Si demasiado desarrollo es removido
o no es bien desmenuzado, o si el material es tomado de un rea sin esporulacin, ser
dificultoso discernir estructuras de esporulacin. 2) Esporas y conidias son a menudo
separadas durante la preparacin del montaje. El sistema de microcultivo consiste de una
mini cmara de incubacin diseada para producir condiciones ptimas de esporulacin.
Permite examinar la colonia en varios estadios de desarrollo y mejora las oportunidades de
observar la configuracin natural de las esporas y conidias sobre las estructuras fructferas.

4.2 Competencias: Explica las ventajas y desventajas del montaje por fragmentacin del talo, con cinta
scotch y microcultivos, para el examen de los crecimientos fngicos.

4.3 Materiales y equipos

a. Asas Micolgicas
b. Mechero
c. Lminas portaobjetos
d. Laminillas cubreobjetos
e. Pinzas
f. Cinta scotch
g. Azul de Lactofenol
h. Lactofenol de Aman
i. Sistema estril
j. Placa
k. Angulo de vidrio hueco
l. Papel filtro
m. Papel
Procedimiento
a. Montaje por fragmentacin del talo
i.Colocar una gota de azul de lactofenol justo por fuera del centro de la lmina portaobjetos
limpia.
ii.Con la aguja de inoculacin, remover suavemente un fragmento del crecimiento entre la mitad
del centro y borde de la colonia. Colocar el material en el lactofenol.
iii.Con las dos agujas de diseccin, fragmentar suavemente la porcin de colonia hasta
diseminarla finamente en el azul de lactofenol.
iv.Colocar el cubreobjetos por el borde del azul de lactofenol, y presionar suavemente con un
objeto punteagudo.
v.Evitar la formacin de burbujas de aire bajo el cubreobjetos. Remover el exceso de azul de
lactofenol de los bordes del cubreobjetos por secado con papel toalla.
vi.Sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uas para preservar el montaje
b. Montaje con cinta adhesiva (scotch)

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 i. Doblar una cinta adhesiva transparente con el lado adhesivo hacia fuera, de aproximadamente
4 cm.
ii. Mantener la punta asegurada con una pinza y presionar firmemente la superficie de la colonia
con el lado adhesivo.
iii. Retirar la cinta suavemente. Hifas areas quedan adheridas a la cinta.
iv. Separar las puntas de la cinta y colocarla sobre una pequea gota de azul de lactofenol sobre
una lmina portaobjetos gasta que se adhiera completamente sobre la lmina.
v. Examinar bajo el microscopio
c. Microcultivos
i. Preparacin del sistema estril
(1) Encaje en el fondo de la placa petri, papel filtro del mismo dimetro.
(2) Poner una varilla de vidrio doblada en forma de V sobre el papel de filtro, colocar
encima una lmina portaobjetos. Sobre el papel de filtro depositar adems 2 cubreobjetos
de 22x22.
(3) Volver a poner la tapa, envolver con papel, hornear a 180 C x 1 h.
Verter una capa delgada de agar papa dextrosa en una placa de petri estril y cortar
bloques de agar de 5 mm de lado y aproximadamente 3-4 mm de espesor. Depositar un bloque
de agar sobre el portaobjetos.
Usando en todo momento una tcnica asptica, remover con un asa en ngulo recto,
una parte de material esporulante de la colonia e inocular en los cuatro lados del bloque. Con
la ayuda de una pinza, colocar el cubreobjetos encima del bloque y presionar ligeramente.
Adicionar 1-2 ml de agua destilada estril al papel de filtro, volver a tapar la placa petri,
incubar y observar esporulacin a intervalos regulares examinando la preparacin bajo el
microscopio. Realizar el montaje con azul de lactofenol, cuando el hongo esporule antes que
sobre-desarrolle en el cubreobjetos, lo cual sucede usualmente entre 7-21 das.

4.4 Resultados: Presentar los resultados de sus observaciones de los hongos procesados, Ficha de trabajo
4.

4.5 Cuestionario:

a) Para un microcultivo permanente, que coloraciones alternativas podra emplear?

b) Con fines docentes que tcnica es la mas recomendable para la demostracin microscpica de
hongos?

4.6 Fuentes de informacin:

a) Koneman, E y Roberts, G. 1987. Micologa. Practica de laboratorio. Traducido por Editorial Mdica
Panamericana s.a. ed. editorial mdica panamericana s.a. Bs. As. ed. Tercera

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V. PRACTICA N 5 Susceptibilidad antifngica por disco difusin

5.1 Marco terico: En los ltimos aos se ha vuelto una necesidad realizar pruebas de susceptibilidad
antifngica de mas fcil disponibilidad, la prueba de susceptibilidad antifngica por disco difusin (M44-
A2004), provee y establece la metodologa por disco difusin para especies de Candida,
interpretacin de resultados para fluconazol y rangos de control de calidad para fluconazol y
voriconazol.

5.2 Competencias: Describe los procedimientos de laboratorio para la determinacin de susceptibilidad

antifngica para especies de Candida mediante el mtodo de disco difusin.

5.3 Materiales y equipos:

Estufa de 35 C

Estndar de turbidez Mc Farland 0.5

Hisopos de algodn

Solucin salina fisiolgica.

Mueller-Hinton con glucosa 2% y 0.5 ug/ml de azul de metileno (AMH+GMB)

Regla

5.4 Procedimiento:

Preparar un inculo de la levadura a testar y ajustar a la escala 0.5 Mc Farland, equivale a 1 x106
a 5 x106 clulas por ml.

Sumergir y humedecer el hisopo de algodn estril en la suspensin del inculo.

Remover el exceso de humedad por rotacin del hisopo en el interior de la pared del tubo por
encima del nivel del fluido.

Estriar el hisopo sobre el medio AMH+GMB dos o mas veces, rotando aproximadamente 60 cada
vez.

Los discos se dispensan sobre la superficie del agar, presionando ligeramente.

Las placas se invierten y se colocan en la estufa a 35 C. por 24 hrs.

Resultados

Medir los dimetros de las zonas de inhibicin completa, usando una regla, interpretando con los
rangos establecidos (fluconazol 25 ug, sensible 19 mm y resistente menor o igual a 14 mm)

5.5 Cuestionario:

El medio de cultivo empleado para la prueba de susceptibilidad antifngica Por cunto tiempo
puede ser almacenados hasta su uso?

A qu familia de antifngicos pertenecen las drogas empleadas en la M44-A CLSI?

5.6 Fuentes de informacin:

Method for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts. M44-A, 2004. CLSI.

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VI. PRACTICA N 6 Examen de cultivos y preparaciones de hongos productores de micosis superficiales

6.1 Marco terico: Las micosis superficiales y cutneas a menudo son agrupadas ya que ellas infectan las
mismas reas externas del cuerpo (piel, pelo y uas). Las micosis superficiales son no invasivas y
bsicamente asintomticas, involucrando estratos cornificados mas superficiales de la piel y el pelo.
Entre estos agentes tenemos a Malassezia spp. (pitiriasis versicolor), Piedraia hortae, Trichosporon
spp. (agentes de piedra) y Hortaea wernecki (tia negra palmar)

6.2 Competencias: Describe a los agentes causantes de micosis superficiales en nuestro pas.

6.3 Materiales y equipos:

a. Cepas
i. Malassezia spp.
ii. Trichosporon inkin
iii. Hortaea werneckii
b. Asas de Khole en ngulo recto
c. Azul de lactofenol
d. Lminas portaobjetos
e. Laminillas cubreobjetos
6.4 Procedimiento:
a. De las cepas suministradas realizar exmenes directos con ALF.
b. Visualizar y esquematizar estructuras propias de las diferentes especies de micosis
superficiales.
6.5 Resultados: Presentar mediante esquemas y cuadros los resultados de sus hallazgos.

6.6 Cuestionario:
a. Cul es la especie de Malassezia mas comn en la pitiriasis versicolor?
b. Qu grupo etreo es el ms afectado en la pitiriasis versicolor?

6.7 Fuentes de informacin:

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.
De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili

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VII. PRACTICA N 7 Examen e identificacin de cultivos de dermatofitos y Onicomicosis

7.1 Marco terico: Los dermatofitos son un grupo de hongos causantes de la dermatofitosis, conidialmente
se les agrupa en tres gneros (Trichophyton, Epidermophyton y Microsporum) y de acuerdo a su
presencia en la naturaleza son antropoflicos, geoflicos y zooflicos. De acuerdo a su ubicacin
topogrfica en individuos afectados pueden ser conocidos como tia capitis, tia barbae, t. unguium,
tia corporis, tia pedis, etc.

7.2 El estudio para su identificacin estriba fundamentalmente en el reconocimiento de estructuras

conidiales as como de caractersticas macroscpicas.

7.3 Competencias: Describe a los dermatofitos causantes de tias en nuestro pas.

7.4 Materiales y equipos:

a. Cepas:

i.Microsporum canis
ii.Microsporum gypseum
iii.Trichophyton rubrum
iv.Trichophyton mentagrophytes
v.Trichophyton tonsurans

b. Asas de Khole en ngulo recto

c. Azul de lactofenol
d. Lminas portaobjetos
e. Laminillas cubreobjetos
f. Agar urea de Christensen
g. Agar papa dextrosa
h.
7.5 Procedimiento: De las cepas suministradas realizar exmenes directos con ALF.
Visualizar y esquematizar estructuras propias de las diferentes especies de dermatofitos.
Inocular los dermatofitos sobre Agar urea de Christensen, Medio de arroz y Agar papa Dextrosa, registrar
los resultados desde los tres das hasta las dos semanas.
7.6 Resultados: Presentar mediante esquemas y cuadros los resultados de sus hallazgos.

7.7 Cuestionario:

a. Cul es el dermatofito ms comn en nuestro pas?

b. Qu grupo etreo es el mas afectado en la tia capitis?

7.8 Fuentes de informacin :

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin.
F.A. Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht &
Reus, Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

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IX. PRACTICA N 9 y 10 Identificacin de levaduras (tubo germinativo, morfologa y fisiologa)

9.1 Marco terico: La identificacin de levaduras de importancia mdica cada vez se hace ms necesaria,
por ello recurrimos a pruebas que nos garanticen su correcta identificacin. Entre estas pruebas
tenemos a la prueba del tubo germinativo, estudio de la morfologa y pruebas fisiolgicas entre otras.

9.2 Competencias: Describe la identificacin de las levaduras de importancia mdica.

9.3 Materiales y equipos:

a. Plasma o suero estril
i. Alcuotas de 0,5 ml almacenados a -20 C.
b. Organismos control
i. C. albicans
ii. C. tropicalis
c. Asas de Khole
d. Bao mara a 35 C. 1 C
e. Lminas portaobjetos.
f. Laminillas cubreobjetos
g. Harina de Maiz con Tween 80 (AHM-T80)
h. Galeria API 20 C AUX
i. Cmara de incubacin
j. Ampolla de API C Mdium
k. Hojas de resultados
l. Index de identificacin de levaduras
m. Pipetas de rango multiple de 50-200 ul y tips.
n. Recipiente con desinfectante.
o. Tubos de 16 x 150 mm con agua destilada estril.
Procedimiento
a. Tubo germinativo
i. Tocar ligeramente una colonia con el asa de Khole.
ii. Suspender las levaduras en el plasma o suero.
iii. Incubar en bao mara a 35 C por 2.5 h.
iv. Colocar 2 a 3 asadas de la suspensin sobre un portaobjetos rotulado con el nmero de
muestra.
v. Cubrir la suspensin con laminilla cubreobjetos.
vi. Examinar a 40x y 100x para la deteccin o ausencia de tubos germinativos.
b. Morfologa
i. Preparar placas con Agar Harina de Maiz con Tween 80 (AHM-T80).
ii. Con un lpiz para vidrio dividir la placa en 4 sectores y utilizar cada sector rotulando con el
nmero de muestra de cada levadura aislada.
iii. Con una aguja de inoculacin tocar ligeramente la colonia a probar, practicar dos estras
de aproximadamente 1.5 cm. de longitud separadas por 1 cm., sin excavar el medio.
iv. Despus de flamear y enfriar la aguja de inoculacin, practicar una estra en forma de S
cruzando las dos estras realizadas anteriormente, el aspecto final del preparado es similar
al signo de dlares $.
v. Finalmente cubrir el preparado con una laminilla cubreobjetos previamente flameada y
enfriada.
vi. Incubar la placa a 28 C y examinar a 24, 48 y 72 h. bajo el microscopio retirando la tapa,
empleando objetivo de bajo (10x) y alto (40x) poder.
c. Fisiologa
i. Preparar una suspensin de la levadura problema correspondiente al tubo 2 de la escala
de Mc. Farland.
ii. Verter 5 ml de agua destilada estril en la cmara de incubacin.
iii. Tomar 100 ul de la suspensin e inocular la ampolla de API C Mdium, agitar y dispensar
aproximadamente 197 ul en cada cpula de la galeria API 20 C AUX, hasta su llenado
horizontal no exceder.
iv. Colocar la galeria dentro de la cmara de incubacin y tapar.
v. Incubar a temperatura ambiente 48 72 horas.
vi. Registrar las lecturas de las 48 y 72 hrs. Respectivamente en la hoja de resultados.
Resultados

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 a. Con el perfil encontrado ubicar en el index de perfiles la identificacin de la levadura.
9.4 Cuestionario

fenotpicamente como diferenciara a C. albicans de C. dubliniensis?

9.5 Fuentes de informacin

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin.
F.A. Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht &
Reus, Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

Koneman, E y Roberts, G. 1987. Micologa. Practica de laboratorio. Traducido por Editorial

Mdica Panamericana s.a. ed. editorial mdica panamericana s.a. Bs. As. ed. Tercera.

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XI. PRACTICA N 11 y 12 Examen de cultivos y preparaciones de hongos productores de cromomicosis,
micetomas, esporotricosis y feomicosis

11.1 Marco terico: Las micosis subcutneas son aquellas que involucran la piel y el tejido subcutneo. Su
diseminacin a otros rganos usualmente no ocurre. Sin embargo involucra grandes masas musculares
pudiendo llegar incluso a los huesos. Los agentes productores de estas micosis generalmente habitan
el suelo de regiones tropicales y subtropicales. El hombre acta como husped accidental, pudiendo
infectarse ya sea por implantacin traumtica de los organismos o por introduccin de esporas viables
dentro de la lesin. Las presentaciones clnicas de estas afecciones incluyen micetomas,
cromomicosis, rinosporidiosis y esporotricosis. La cormomicosis es una enfermedad que afecta pies y
manos. Los agentes causales de esta enfermedad son conocidos como hongos demateaceos, debido
a que ellos tienen un pigmento marrn a negro debido a la presencia de melanina. Estos hongos son
de crecimiento lento, geofilicos. Los agentes ms comunes son Cladosporium carrioni, Phialophora
verrucosa, Fonsecae pedrosoi y raramente Fonsecae compacta. La esporotricosis es una micosis
producida por Sporothrix schenckii. La lesin primaria es usualmente sobre algn dedo de la mano, es
un ndulo subcutneo pequeo, mvil, que crece lentamente y se adhiere a la piel, tornndose rosado
luego con necrosis, finalmente se ulcera.

11.2 Competencias: Describe a mohos demateaceos de importancia mdica y a Sporothrix schenckii.

11.3 Materiales y equipos:

a. Cepas de demateaceos y Sporothrix schenckii.
b. Asas de Khole en ngulo recto
c. Azul de lactofenol
d. Lminas portaobjetos
e. Laminillas cubreobjetos
11.4 Procedimiento:
a. De las cepas suministradas realizar exmenes directos con ALF.
b. Visualizar y esquematizar estructuras propias de las diferentes especies de demateaceos y
Sporothrix schenckii.
c. Enfocar y esquematizar lminas patrones de microcultivos y cortes histolgicos.
11.5 Resultados: Presentar mediante esquemas los resultados de sus hallazgos.

11.6 Cuestionario:

Cul es el gnero de demateceo mas frecuente encontrado en el laboratorio de micologa?

11.7 Fuentes de informacin :

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

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XIII. PRACTICA N 13 Diseo de cartillas de control de calidad para medios de cultivo y reactivos

13.1 Marco terico: En el laboratorio de micologa se deben garantizar los procedimientos y materiales,
empleados en el correcto y oportuno aislamiento e identificacin de hongos productores de micosis; por
ello es pertinente manejar el control de calidad, inventario de almacn y mantenimiento preventivo de
equipos por ello deben contarse con fichas de registro de los mismos.

13.2 Competencias: Propondr fichas de registros de control de calidad de medios de cultivo, reactivos,
almacn y mantenimiento de equipos de un laboratorio de micologa.

13.3 Materiales y equipos:

Manuales de medios de cultivos de diferentes marcas (oxoid, merck, etc)

Hojas de seguridad de materiales de reactivos

Hojas oficio cuadriculadas

13.4 Procedimiento:

Elaborar fichas de control de calidad para Agar Sabouraud, Agar Micobiotic, Hidrxido de
potasio 20%, Azul de lactofenol.

Elaborar fichas de registro de temperaturas de incubadoras.

Elaborar fichas de mantenimiento preventivo de microscopios.

13.5 Resultados: Fichas de control de calidad de medios de cultivo, reactivos y mantenimiento preventivo
de equipos.

13.6 Cuestionario

Cmo controlara la calidad del ASD 2% y Agar Harina de maz?

13.7 Fuentes de informacin

Henry D. Isenberg. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 2nd edition, ASM Press, 2004.

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PRACTICA N 14 Examen de preparaciones microcpicas de H. capsulatum y P. brasiliensis

14.1 Marco terico: La Histoplasmosis es una infeccin aguda, subaguda crnica producida por especies
del gnero Histoplasma. Existen 3 formas clnicas, Histoplasmosis (H. clsica, Enfermedad de Darling o
H. de pequeas formas) cuyo agente es Histoplasma capsulatum; H. africana (H. de grandes formas)
cuyo agente es H. duboisii y la Linfangitis epizotica de caballos o mulos producida por H.
farciminosum. Su hbitat es el suelo rico en excremento de aves y murcilagos. Su va de ingreso es la
inhalatoria (infeccin asintomtica). H. duboisii, tambin tiene la misma va pero puede llegar incluso a
piel y hueso. Su teleomorfo es un ascomiceto la Emmonsiella capsulata. La paracoccidioidomicosis es
causada por Paracoccidioides brasiliensis, siendo una enfermedad endmica de Sudamrica. Hongo
saprfito, cuyo habitat es el suelo. Las esporas son inhaladas, produciendo lesiones pulmonares
similares a la tuberculosis y otras micosis. Presentaciones menos frecuentes son en la mucosa oral y
encas, como consecuencia de infeccin traumas del chactado de vegetales contaminados.

14.2 Competencia: Reconoce e identifica a H. capsulatum y P. brasiliensis

14.3 Materiales: Montajes permanentes de cultivos y cortes histolgicos de H. capsulatum y P. brasiliensis.

14.4 Procedimiento: Enfocar y esquematizar lminas patrones de microcultivos y cortes histolgicos.

14.5 Resultados:
Presentar mediante esquemas los resultados de sus hallazgos.

14.6 Cuestionario:
Esquematice la microscopa de los agentes de histoplasmosis y paracoccidioidomicosis?

14.7 Fuentes de informacin:

a. Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.
b. De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

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XV. PRACTICA N 15 Examen de preparaciones de hongos productores de Aspergilosis y criptococosis

15.1 Marco terico: El avance tecnolgico de la medicina y el aumento de la sobrevida de los pacientes con
enfermedades complejas e inmunodeficiencias, crean una gran y altamente poblacin susceptible,
pacientes en riesgo incluyen pacientes con cncer (con y sin neutropenia), transplantes de rganos,
SIDA, ciruga abdominal, alimentacin parenteral, infantes prematuros, quimioterapia, entre otros. Todo
hongo que se encuentra en el ambiente es un potencial productor de micosis oportunistas, las
condiciones del husped son cruciales para que se produzca este fenmeno. Hasta la dcada de los
80 las especies fngicas relacionas a micosis en humanos eran de aproximadamente 150 especies,
hasta el ao 2000 se incrementa sustancialmente llegando casi a 400 especies, siendo una pequea
fraccin de las aproximadamente 100,000 especies de hongos descritas, lo cual hace suponer que
cualquier hongo es un potencial oportunista.

15.2 Competencias: Describe a hongos productores de micosis oportunistas.

15.3 Materiales: Montajes en fresco y permanentes de cultivos y cortes histolgicos de hongos.

15.4 Procedimiento: Enfocar y esquematizar lminas patrones de montajes, microcultivos y cortes

histolgicos.

15.5 Resultados: Presentar mediante esquemas los resultados de sus hallazgos.

15.6 Cuestionario:

Cules son los hongos productores de micosis oportunistas?

Para la demostracin de la cpsula de Cryptococcus neoformans que procedimiento se

utiliza?

15.7 Fuentes de informacin:

Kern E, Martha y Blevins S., K. 1997. Medical Mycology: a self-instructional text. 2da. Edicin. F.A.
Davis Company. Philadelphia.

De Hoog GS, Guarro J, Gen J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. 2nd Ed. Utrecht & Reus,
Centraalbureau loor Schimmelcultures / Universitat Rovira i Virgili.

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