405manual Del Lab Oratorio de Biotecnologia Molecular

Instituto Politécnico Nacional
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología Molecular
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA
MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR
ELABORADO POR:
M. en C. Paola Berenice Zárate Segura
I. Bt. César A. Jiménez Sierra
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona
Dr. Claudio Garibay Orijel
Dra. María del Carmen Oliver Salvador
México D. F. Agosto 2009
Manual elaborado por Paola Berenice Zárate Segura, César Agustín Jiménez Sierra, Jesús Agustín Badillo Corona y Claudio 1
Garibay Orijel

Relación de prácticas
PRÁCTICA 1. Bioseguridad
PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN
PRÁCTICA 3. Extracción de ADN
PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

PRÁCTICA 5. Extracción de ARN
PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina
PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.
PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes
PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido
PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)
PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum)

utilizando Agrobacterium tumefaciens
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PRÁCTICA 1. Bioseguridad
Según la Ley de Bioseguridad de organismos genéticamente modificados publicada en el
Diario Oficial de la Federación el 18 de marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como:
“Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención que se deben

asumir en la realización de actividades con agentes biológicos, con el objeto de prevenir,
evitar o reducir los posibles riesgos que dichas actividades pudieran ocasionar a la salud
humana o al medio ambiente y la diversidad biológica, incluyendo los aspectos de
inocuidad de dichos organismos que se destinen para uso o consumo humano”.
Por otra parte, como Biotecnología moderna se entiende:
“la aplicación de técnicas in vitro de ácidos nucleicos, incluidos el ácido

desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) recombinante y la inyección
directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la familia
taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la
recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección tradicional,
que se aplican para dar origen a organismos genéticamente modificados, que se determinen
en las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley (1)
Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:
A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estandarizadas de manera

rutinaria para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas, en todas las
situaciones que puedan dar origen a accidentes. Estas precauciones, deben ser aplicadas por
y para TODAS las personas.
B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a agentes

biológicos infecciosos o sustancias potencialmente contaminantes, mediante la utilización
de materiales adecuados que se interpongan para evitar el contacto con estos agentes y
sustancias. La utilización de barreras (ej. bata de laboratorio, guantes, lentes de protección,
mascarillas, etc.) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las
consecuencias de dicho accidente.
C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos

y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales biológicos y químicos
utilizados en los laboratorios son depositados para su almacenamiento y posterior
eliminación sin que se presente ningún riesgo.
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Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2):

Contención
El término “contención” se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales
biológico-infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o
conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes
trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes
potencialmente peligrosos.
La contención primaria se refiere a la protección del personal y del medio ambiente
inmediato del laboratorio a la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante
buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad adecuados.
La contención secundaria, se refiere a la protección del medio ambiente externo al

laboratorio a la exposición a materiales infecciosos. Esta contención se logra utilizando una
combinación del diseño de la instalación y de las prácticas operativas. Por lo tanto, los tres
elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad
y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente
específico determinará la combinación apropiada de estos elementos.
Equipos de Seguridad (Barreras Primarias)
Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes

cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones
a materiales biológicos peligrosos.
Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de seguridad, un recipiente

cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el centrifugado.
Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias)
El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan

en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se encuentran
fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad de agentes
infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio.
Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de
combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones
de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las operaciones
llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechosas de los agentes
infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio (tabla 1).
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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2)
Grupo de Barrera Primaria Barrera Secundaria Tipo de
NIVEL Agentes Prácticas
Riesgo (Equipos) (Instalaciones) Laboratorio
Que no causen
Mesa de Laboratorio
Bajo riesgo enfermedad en
con servicio de agua y
individual individuos Prácticas
Campana de drenaje. Enseñanza
I Bajo, adultos microbiológicas
flujo laminar Básica
Riesgo saludables comunes
Comunitario (Cepas
silvestres)
NBS 1. Acceso
Asociados con Limitado. Deben
enfermedad en utilizarse Gabinetes de
humanos, en señalamientos, se Bioseguridad
donde haya deben tomar medidas Clase I o II, Servicios de
riesgo de de precaución en equipo para salud, Hospital
Moderado
infección por material punzo prevenir de nivel
riesgo
heridas cortante. Debe contar derrames o primario,
individual, NBS 1. Además, debe
II percutáneas, con manual de difusión de laboratorios de
Riesgo existir autoclave.
ingestión y Bioseguridad aerosoles. El diagnóstico y
comunitario
exposición de definiendo personal debe Laboratorios de
limitado
membrana procedimientos y utilizar Bata, nivel
mucosa políticas de guantes y cubre Universitario
(Shigella, confinamiento, bocas o careta,
Staphylococcus, desinfección de zonas de ser necesario.
Sporotrix) y materiales y
atención médica.
Agentes
autóctonos o NBS 2, Separación de
exóticos con NBS 2. Acceso los corredores de
Todas las
riesgo de controlado. acceso, puertas dobles
Alto riesgo anteriores,
transmisión por Procedimientos (sistema de exclusa). Laboratorios de
individual, incluyendo
III aerosoles y que rutinarios de Debe evitarse la Diagnóstico
Bajo riesgo protección del
causen desinfección de ropa, recirculación del aire. Especializado.
comunitario sistema
enfermedades desechos y material Presión de aire
respiratorio.
serias o letales previo al lavado. negativa en el área de
(Brucilla, trabajo
Hystoplasma)
Agentes
peligrosos o
exóticos con alto Gabinetes de
NBS 3. Ropa (trajes) NBS 3. Debe ser una
riesgo de causar Bioseguridad
individuales, zona aislada, con
enfermedad Tipo 3. Trajes
equipados en cuartos sistemas individuales Laboratorios
Alto riesgo mortal por individuales
previos al área de de obtención y que trabajan con
Individual, transmisión por sellados con
IV trabajo. Regadera a la liberación de vacío, agentes
Alto riesgo aerosoles o sistema de
salida del Laboratorio. sistema de suministro patógenos
Comunitario agentes similares respiración
Mecanismo de y descontaminación de peligrosos
con forma de autónomo y
descontaminación del aire, generador de
transmisión presión de aire
área de trabajo. energía auxiliar.
desconocida positiva
(EBOLA, SARS,
B. Antracis)
NBS = Nivel de Bioseguridad
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OBJETIVO
• Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su
aplicación activa en el trabajo de laboratorio
ACTIVIDADES
Actividad dinámica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio y
las medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos.
Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuados
para la utilización de estos equipos.
REFERENCIAS
1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE

MODIFICADOS Nueva Ley DOF 18-03-2005
2. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf
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PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN
INTRODUCCIÓN
En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una
cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede
llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el
ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, o
bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.
Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos
nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN
presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico
en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten
estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260
nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de ADN doble hebra,
40 µg/mL de ARN o 33 µg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra.
En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza

proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la
presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos.
Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible
estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La
presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el
esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta
pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8, y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0.
Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad

de medir de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es
crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de biología
molecular para medir volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como
micropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 µL,
0.5-10 µL, 10-100µL, 20-200 µL, 100-1000 µL, 1000-5000 µL. .
OBJETIVOS
Objetivo General
• Llevar a cabo al cuantificación de ADN por métodos espectrofotométricos
Objetivos específicos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,
Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes
pequeños.
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Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de
diferente tamaño para la medición de diferentes volumenes.
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Agua desionizada
Balanza analítica con límite de 0,0001 g
Tapas de cajas de petri de plástico
Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
Muestra de ADN en solución de concentración desconocida
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
MANEJO DE LA MICROPIPETA
Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la

micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la
micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la “ventana de
volumen”. Si es necesario, cambiar el volumen mediante el “dispositivo” del control o
mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su
mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita).
NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.
1) Partes de la micropipeta
a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1.
b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura
2) Llenado de la pipeta
a) Colocar una punta según corresponda.

b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si
continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia
abajo, este corresponde al segundo punto de resistencia “alto” o "tope".
d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta
una profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la
presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo
abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta
produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez
el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido
durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.
3) Expulsión de la muestra
a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.

b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.
c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este
procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden
gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al
oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta.
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d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las
soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferirá volúmenes inexactos.
4) Calibración de Micropipeta
La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un

procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta
práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión
y calibración.
Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación
(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la
micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µL y 1000 µL. Para P200 revisar los
volúmenes de 60 y 200 µL. Para P10 revisar 3 y 10 µL.
a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.
c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la
caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a
25ºC, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa
de 1 g, 300 µL a 0.3 g, 200 µL a 0.2 g, 60 µL a 0.06 g, 10 µL a 0.01 g y 3 µL a
0.003 g.
d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.
e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656
g/mL a 25 ° C.
f) Calcular la masa esperada para cada volumen
5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)
Valor medio
X = Σ Xi /n donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medio
V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)
Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100
Desviación estándar
S = Z . √ Σ(Xi – X)2
n–1
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Coeficiente de Variación
CV= (S*100)/V
Límites de tolerancia para micropipetas
Volumen (µL) E% nominal CV% nominal
1 0.8
5-10
20-50 0.7 0.4
100-1000 0.5 0.2
Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variación de las micropipetas

proporcionadas, realice la cuantificación de las muestras proporcionadas.
6) Cuantificación de ADN
Preparación de las muestras.
a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por

triplicado con agua Milli Q estéril, en tubos de polipropileno estériles.
b)
c) Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.
d) Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas
e) Cuantifique las muestras a 260 y 280mn
f) Realice los cálculos correspondientes
Muestra Dilución Lectura Lectura Relación ADN ADN ADN
260 nm 280 nm 260/280 (ng/µL) (fg/µL) (mg/µL)
ADN1
ADN2
REFERENCIAS
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs.
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PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

INTRODUCCIÓN
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza.
Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o
una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio
no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o
caras) en los protocolos de purificación.
Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:
• Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares

• Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado
Homogenización de la muestra
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para
grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las
licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un
homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de
vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un
motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente,
necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared
celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también
condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra
en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además
de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el
tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el
material de interés.
Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos
particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células
bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la
pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura
de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico
(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las
membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente
quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas
(dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas
Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros

pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño
(como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo
tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en
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forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente
entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos
utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo
general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero
por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas y lípidos

Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus
grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico
no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los
lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica.
En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la
extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.
Precipitación de ácidos nucleicos

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en
la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y
deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la
desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los
mismos.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN
• Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ADN
• Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa
MATERIALES
• Reactivos y Materiales
• Acetato de Sodio (3 M)
• Etanol absoluto
• Etanol 70%
• Fenol
• Cloroformo
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• Agua desionizada
• TE (pH 8.0)
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Gradillas
• Medio LB líquido
• Termobloques
• Tubos de polipropileno 1.5 mL
• Centrifuga
• Vortex
Muestras biológicas
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de >200 rpm.
Una muestra de suelo.
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Primera Sesión. Extracción de DNA

Extracción de ADN de E. coli
1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16 h) a
37°C con agitación constante de >200 rpm.
2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril al paquete celular.
6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
7. Agregar 250 µL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
9. Agregar 250 µL de cloroformo.
10. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
12. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
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precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la
muestra e inhibir reacciones posteriores.
mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
17. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
18. Agitar en vortex 20 s.
19. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
20. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
22. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la
pastilla.
experimento.
25. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
26. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar a -20°C.
Extracción de ADN de Suelo

1. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
2. Agregar 250 µL de agua desionizada estéril.
3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células
(aproximadamente 30 s).
4. Agregar 250 µL de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).
7. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.
8. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este
precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la
muestra e inhibir reacciones posteriores.
12. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.
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mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
14. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
15. Agitar en vortex 20 s.
16. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
17. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
experimento.
19. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.
experimento.
22. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
23. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR
24. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
25. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
26. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
27. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa
INTRODUCCIÓN
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la
cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de
agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es
tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los
grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles
de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar
mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN.
Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER
SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta
que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde
gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de
agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el
ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los
cuales son detallados a continuación.
(a) Tamaño del ADN:
Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son
inversamente proporcionales al log del número de pares de bases.
Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases
hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de
diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las
moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño.
(b) Concentración de la agarosa:
Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes
concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas
para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.
Concentración del gel de agarosa Intervalo de peso

(% w/v) molecular (kpb)
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-3
2.0 0.1-2
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(c) Conformación del ADN

El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con
un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico
peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de
agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la
concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente
eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente
(fundamentalmente en el caso de la forma I).
(d) Corriente aplicada
A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al
voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la
movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo
tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el
voltaje es incrementado.
(e) Otros factores
Otros factores que influyen (y que no se discutirán en esta INTRODUCCIÓN) son: la
dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la
temperatura y la composición del buffer de electroforesis.
OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la cantidad de ADN por densitometría de las bandas en un gel de
agarosa
Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa
Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometría
MATERIALES
Materiales y Reactivos
• Solución de Agarosa 0.5% w/v
• Solución para teñir ADN
• Regulador para electroforesis TBE 1X
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• Regulador de carga 6x
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Agua desionizada
• Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
• Muestras de ADN
• Cámara de Electroforesis
• Fuente de Poder
• Marcador de Peso Molecular (100pb)
1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen de
gel de 20 mL, si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la
concentración del gel)
2. Agregar 100 mg de agarosa
3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente
4. Adicionar 0.5µL de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.)
5. Mezclar
6. Verter la solución en una canastilla para electroforesis
7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla
8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio)
9. Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis
10. Agregar buffer de corrimiento (TBE)
11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no más de 10 µL en total)
12. Colocar las muestras adentro de los pozos
13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min
14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones.
REFERENCIAS

COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES
6x Amortiguador de carga
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)
Glicerina en agua 30% (v/v)
TBE
Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O
Tris base 54 g, Ácido Bórico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL
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PRÁCTICA 5. Extracción de ARN

En una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son homogenizadas en
tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido. El
rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de muestra y generalmente esta en un
intervalo de 4-7 µg/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106 células.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ARN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Conocer la metodología básica para extracción de ARN,
Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ARN.
Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa
MATERIALES
Cloroformo: alcohol isoamílico (49:1, v/v)
Etanol
Isopropanol
Nitrógeno liquido
Fenol
Acetato de sodio (2 M, pH 4.0)
Solución D (solución desnaturalizante)
Agua desionizada
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Gradillas
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
Material biológico
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de >200 rpm.
Una planta de tabaco o de lechuga fresca.
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IMPORTANTE:
Sesión 1. Preparación de los cultivos de
1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a
2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga están en condiciones sanas y frescas.
Sesión 2. Extracción de ARN

Preparación del cultivo de E. coli
1. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.
2. Centrifugar el tubo a 12 000 rpm. durante 2 min.
3. Decantar el sobrenadante.
4. Mantener la pastilla celular en hielo
Preparación del tejido vegetal
5. Cortar cuidadosamente 1-2 g de tejido foliar.

6. Colocar el tejido en un mortero estéril libre de RNAsas y adicionar nitrógeno
líquido.
7. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener un polvo fino.
8. Transferir el macerado a un tubo nuevo estéril.
Extracción de RNA de células bacterianas y vegetales

El tratamiento siguiente es el mismo tanto para las células bacterianas como para el
tejido vegetal a menos que se indique lo contrario.
9. Adicionar 3 mL de la solución D.
10. Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador para el
caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de
1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con macerar con un pistilo de
plástico pequeño.
11. Transferir el homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de sodio
2 M, 1 mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamílico por cada mililitro de
solución D.
12. Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 15 min.
13. Centrifugar a 9000 rpm. por 20 min a 4°C.
14. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
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15. Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar e
incubar a -20°C mínimo 1 hr.
16. Centrifugar a 10,000 g (9000 rpm.) por 30 min a 4°C.
17. Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solución D.
18. Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20°C.
19. Centrifugar 10 min a 4°C.
20. Decantar y adicionar un volumen de etanol al 70%.
21. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 min.
22. Adicionar 50-100 µl de H2O. Almacenar la solución de ARN a -70°C.
23. Estimar la concentración de ARN midiendo la absorbancia de una dilución 1:200 de
la muestra a 260 nm
24. Separar 5 µL de la muestra de ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Solución D
4 M Tiocianato de guanidina
25 mM citrato de sodio
0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio
0.1 M -mercaptoetanol
Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 mL de H2O, 17.6 mL de 0.75 M de

citrato de sodio (pH 7.0), y 26.4 mL de 10% (w/v) lauril sarcocianato de sodio. En una
parrilla a 65°C mezclar los ingredientes con ayuda de agitación magnética, guardar a
temperatura ambiente y adicionar 0.36 mL de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50 mL de la
solución D justo antes de usar.
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina
Cuando se desea introducir un gen para expresión en bacterias, es necesario que este gen se
encuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresión deseados. El
vector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partír de la
cual se purifica. La extracción por lisis alcalina consiste en la lisis de las células utilizando
una solución con NaOH y SDS. Posteriormente la separación entre los restos celulares y el
ADN se logra por precipitación mediante la adición de una solución de acetato de potasio.
Para purificaciones más exhaustivas se utiliza una solución de fenol:cloroformo. Los ácidos
nucleicos se separan en la fase acuosa y las proteínas en la fase orgánica.
OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ADN plasmídico de E. coli.
Conocer la metodología básica para extracción de ADN plasmídico de bacterias.

Determinar la integridad del ADN plasmídico por electroforesis en gel de agarosa.
MATERIALES
Soluciones
Solución de lisis alcalina I

Solución de lisis alcalina II
Solución de lisis alcalina III
Ampicilina
Etanol
Fenol: cloroformo
TE (pH 8.0)
Medios de cultivo
Cajas con medio LB con ampicilina 100 µg/mL

Cajas con medio LB
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IMPORTANTE:
Sesión 1. Preparación de los cultivos de
1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a
Sesión 2. Extracción de ADN plasmídico
Centrifugar a velocidad máxima por 30 segundos 2 mL del cultivo a temperatura ambiente.
7) Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del medio.

8) Resuspender la pastilla en 100 µL de solución Alcalina I fría, mezclar
vigorosamente con ayuda del vortex.
9) Adicionar 200 µL de solución de lisis II recién preparada, cerrar el tubo y mezclar
invirtiendo el tubo cinco veces, “No usar vortex”. Poner el tubo en hielo
10) Adicionar 150 µL de solución alcalina III fría, cerrar el tubo e invertir el tubo cinco
veces para mezclar. Guardar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR).
11) Centrifugar a máxima velocidad por cinco minutos a 4°C.
12) Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
13) Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y
centrifugar a velocidad máxima por 2 min a 4°C.
14) Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
15) Precipitar el ADN plasmídico adicionando 2 volúmenes de etanol absoluto, incubar
a -20ºC durante 20 minutos.
16) Centrifugar a máxima velocidad 5 minutos a 4°C.
17) Remover el sobrenadante.
18) Adicionar 1 mL de etanol al 70% (tener cuidado de no resuspender la pastilla),
19) Centrifugar a máxima velocidad por 2 minutos a 4°C.
20) Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir
que la pastilla quede lo más seca posible.
21) Resuspender la pastilla en 50 µL de agua desionizada estéril y guardar a -20°C.
Soluciones
Solución de lisis alcalina I
50 mM glucosa
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Guardar a 4°C
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Solución de lisis alcalina II
0.2 N NaOH
1% (w/v) SDS
Preparar la solución al momento.
Solución de lisis alcalina III
5 M acetato de potasio, 60.0 mL

Ácido acético glacial, 11.5 mL
H2O, 28.5 ml
Guardar a 4°C
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.
La ligación de fragmentes de interés en plásmidos ha sido una metodología presente en casi

todos los estudios que tienen que ver con técnicas de Biología Molecular. Se han utilizado
diferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre los que se encuentran el pUC 19,
pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la inserción de un gen o de un fragmento del
gen en un vector, generalmente se lineariza el vector con enzimas de restricción y al mismo
tiempo se digiere el gen con las misma enzimas de restricción. Después de la linearización
del vector y de la restricción del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa en
presencia de ATP para que la enzima catalize la reacción de ligación.
Objetivo General
• Realizar la inserción de material genético dentro de un vector plasmídico.
• Conocer la metodología básica para cortar un vector utilizando enzimas de

restricción.
• Conocer la metodología básica para insertar material genético de interés
dentro de un plásmido previamente tratado con enzimas de restricción.
MATERIALES
• Plásmido (cuales
• Enzimas de restricción
• Material genético de interés.
• T4 ADN Ligasa
• Buffer de restricción.
• Buffer de Ligación.
• Termo-Bloque
MÉTODOLOGÍA
Sesión 1. Reacción de restricción
1. En un tubo estéril, adicionar 2 µl de buffer de restricción.

2. Adicionar 200-500 ng de plásmido.
3. Adiciona 1 U de la enzima de restricción.
4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL
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5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el termobloque.
Sesión 2. Reacción de ligación
6. Colocar 2 µL de buffer de ligación en un tubo estéril.

7. Adicionar 1 µL de T4 ADN ligasa.
8. Añadir (100-300 ng) de plásmido previamente tratado con enzima de restricción.
9. Agregar (500-900 ng) del fragmento a insertar deseado.
10. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 µL
11. Incubar a 22ºC durante 2 horas en el termobloque.
12. Almacenar a -20ºC hasta el momento de su uso.
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).
La Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener más de 10 millones

de copias de una cadena de ADN de interés a partir de pocas moléculas de ésta. La
sensibilidad de ésta técnica requiere de cuidados para que la muestra no esté contaminada
previamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.
Existen numerosas técnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) con
diferentes aplicaciones en campos de diagnóstico, criminología, e investigación.
Objetivo General
• Obtener un producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR).
• Conocer la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa.
• Identificará la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector
en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.
MATERIALES
• Termociclador.
• ADN molde
• Tubos de polipropileno de 200 µL.
• Oligonucleótidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido
• Taq DNA polimerasa
• Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 µL
• 10X PCR buffer
• MgCl2
• dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200µL de

capacidad en hielo.
2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1.
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Tabla 1. Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa

Concentración final Muestra (µL) Control negativo(µL)
AND molde 10 pg-1 µg 1 µL* -----
Iniciador Sentido 10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
Iniciador Antisentido10 µM 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
Buffer PCR 10X 1X 5 µL 5 µL
25 mM MgCl2 1-4 mM 6 µL* 6 µL*
dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 µL 5 µL
Agua MilliQ estéril 27.6 µL * 28.6 µL *
Taq polimerasa (5U/ µL) 1.25 U / 50 µL 0.2 µL** 0.2 µL**
*El volumen depende de la concentración final requerida.

** Se coloca al final en la reacción en frío.
3. Mezclar perfectamente la reacción por y centrifugar unos segundos en caso de ser
necesario.
4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:
a) 95ºC 2 min
b) 95°C 30s (desnaturalización),
c) 55°C 30 s (alineamiento),
d) 72°C 1 min (elongación)
e) Repetir los pasos b a d 30 veces
f) 72ºC 4 min.
g) 4ºC (refrigerar hasta el momento de uso)
5. Separar el fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa.
6. Verificar que el tamaño amplificado por PCR sea el esperado.
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
Uno de las metodologías rutinarias en los laboratorios de Biología Molecular es la

preparación de células competentes. Las células competentes pueden ser almacenadas y
usarse para la propagación de vectores de interés. Hay varios métodos para preparar células
competentes pero quizá el más utilizado sea el que se realiza con cloruro de calcio ya que
es eficiente, barato y generalemente se obtienen células con altos niveles de transformación.
OBJETIVOS
Objetivo General
Aprender a preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2.
Conocerá la metodología básica para hacer células competentes de Escherichia coli

con CaCl2.
Determinará la viabilidad de las células competentes de Escherichia coli con CaCl2.
MATERIALES
- CaCl2 (0.1 M)
- Espectrofotómetro
- Gradillas para tubos
- Hielo
- Medio LB líquido
- Micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Puntas para micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Termo-bloques
- Tubos de polipropileno 1.5 mL estériles
- Ultracentrífuga
1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas de agar LB
2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de médio LB e incubar a 37°C con
agitación a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).
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3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación,
hasta que la densidad óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por
10 min a 4°C.
5. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min
6. Decantar el sobrenadante
7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.
9. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min a 4°C.
11. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete
celular en 1-2 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío.
12. Las células competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-
48 h a 4ºC.
13. Para periodos de almacenamiento más largos, guardar en alícuotas de 100 µL en
tubos estériles de 1.5 mL.
14. Guardar la células competentes a -70ºC. Las células se mantienen viables por
aproximadamente 3 meses.
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes
La ligación de fragmentos de ADN interés en plásmidos ha sido una metodología

fundamental en casi todos los estudios de transformación de organismos. Se han utilizado
este tipo de plásmidos como el pUC 19 linearizado con enzimas de restricción específicas,
una vez hecho esto se realiza una reacción de ligación plásmido-inserto con la enzima
ligasa.
El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para ser
propagado. Los metodos más utilizados para la INTRODUCCIÓN de DNA en células
competentes es la electroporación y la que involucra choque térmico. Las células
preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son las que se utilizan
mayormente. El proceso consiste en preparar la células (Práctica 9) y después incubarlas
con el vector a introducir, seguido de un choque térmico. Este método es eficiente y
generalmente da rendimientos aceptables para la inserción de vectores después de una
reacción de ligación.
Objetivo General
• Realizar la transformación de células competentes con un plásmido extraído

por lisis alcalina.
• Conocer la metodología básica para transformar células competentes con un

plásmido bacteriano
• Determinar la eficiencia de transformación de células competentes de
Escherichia coli preparadas con CaCl2.
MATERIALES
• Células competentes
• Incubadora
• Placas de agar LB-Ampicilina
• Reacción de PCR (Práctica 8)
• Termo-Bloque (Práctica 7)
• Plásmido
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A. Muestra de interés
1. Adicionar 4 µL de reacción de PCR a un tubo de polipropileno.

2. Adicionar 1 µL del buffer de ligación.
3. Adicionar 1 µL del Plásmido.
4. Mezclar la reacción suavemente.
5. Incubar por 16 h a 4°C.
6. Adicionar todo el contenido del tubo a un tubo que contiene células competentes.
7. Mezclar el tubo suavemente.
8. Incubar a -20ºC durante 20 min.
9. Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min.
10. Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min.
11. Adicionar 800 µL de medio LB.
12. Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora.
13. Agregar 200 µL en una placa con medio LB Ampicilina
14. Sembrar por extensión con varilla.
15. Incubar la caja durante 16 h a 37ºC
B. Control de viabilidad y control negativo
16. Colocar 200 µL de células competentes.

17. Mezclar el tubo suavemente.
18. Incubar a -20ºC durante 20 min.
19. Colocar el tubo en un baño o Termo-bloque a 42ºC durante 1 min.
20. Colocar el tubo a -20ºC durante 2 min.
21. Adicionar 800 µL de medio LB.
22. Colocar el tubo en un baño o un Termo-bloque a 37ºC durante 1 hora.
23. Agregar 200 µL en una placa con medio LB Ampicilina y 200 µL a una caja con
medio LB
24. Sembrar por extensión con varilla.
25. Incubar la caja durante 16 horas a 37ºC
REFERENCIAS

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PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido
El western blot es una técnica inmuno enzimática utilizada en biología molecular para la
detección de proteínas en muestras crudas o extractos celulares. Esta técnica tiene múltiples
aplicaciones, tanto en el área de investigación como en la de diagnóstico clínico, en donde
es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.
La técnica consiste en realizar la separación de las proteínas de la muestra por electroforesis
en gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.i
nitrocelulosa), ya sea por gravedad, difusión o un campo eléctrico.
Una vez en la membrana, la proteína es identificada mediante un inmunoensayo, en donde
se liga a la proteína de interés un anticuerpo específico contra ella ligado a una enzima, la
cual permite la detección.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Conocerá y realizará la técnica de westtern blot para detección de proteína

mediante la reacción antígeno-anticuerpo.
• Conocer la metodología básica para realizar electroforesis en gel de

poliacrilamida.
• Conocer la metodología básica para realizar una electrotransferencia.
• Conocer la metodología básica para detectar proteínas por medio de un
inmunoensayo.
A. Tratamiento de la muestra.
1. A una muestra de concentración conocida de proteína (ya sea antígeno o anticuerpo)

se le adiciona amortiguador de muestra hasta un volumen final de 85 µl.
2. Añadir 10 µl de solución de azul de bromofenol y 5 µl de ß-mercaptoetanol.
3. Incubar en baño maría a ebullición durante 5 minutos.
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B. Preparación del Gel.
4. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.
5. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.
6. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando
el persulfato de amonio y el temed al final.
7. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y
alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar por 20 a
30 minutos.
8. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.
9. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas.
Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
C. Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel.
10. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y esta en la cámara.
11. Preparar amortiguador decorrida 1x.
12. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa hasta
cubrir los electrodos.
13. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 µl de muestra y marcador
de peso molecular en los pozos.
14. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder.
15. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.
16. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida
alcance el final del gel.
17. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la
cámara.
18. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador de
transferencia.
NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teñido para observar
el corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.
D. Montaje de la cámara de electro transferencia y electro transferencia.
19. Incubar fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de espesor) en amortiguador de

transferencia 30 min. antes de iniciar el montaje de los cartuchos.
20. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamaño ligeramente mayor al de los geles.
Este procedimiento debe ser llevado a cabo con guantes. Colocar en un recipiente
con amortiguador de transferencia.
21. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y cuidadosamente, marcar sobre la
membrana, con lápiz, el frente decorrida y el número de carril del gel.
22. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras scotch, dos papeles filtro, el gel,
la membrana de nitrocelulosa, dos papeles filtro más y dos fibras scotch más. Hay
que eliminar cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes capas.
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23. Colocar el cartucho en la cámara de electrotransferencia de manera que el gel quede
hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+).
24. Llenar la cámara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado.
25. Cerrar la cámara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,
cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60ºC.
26. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.
NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teñir una de ellas para
observar la transferencia de las proteínas antes de proseguir con el siguiente paso.
E. Reacción inmunoenzimática
27. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y agregar l solución de

bloqueo, de manera que cubra completamente la membrana. Incubar 2 horas a
temperatura ambiente con agitación continua.
28. Retirar la solución de bloqueo y realizar 3 lavados con PBS-Twen de 5 min. cada uno,
con agitación continúa.
29. Incubar la membrana con la solución de proteína complementaria a la que se
encuentre unida en la membrana (si se tiene antígeno en la membrana, incubar con
solución e anticuerpo, y viceversa) durante 2 horas.
30. Retirar la solución de proteínas y repetir el paso 28.
31. Se adiciona a la membrana la solución de avidina – HRP (peroxidasa de rábano) y se
incuba por 2 horas con agitación continua.
32. Retirar la solución de conjugado y repetir el paso 28.
33. Se incuba la membrana en la solución de cromógeno / sustrato en agitación continua
hasta que aparezcan las bandas.
34. Se enjuaga la membrana con agua desionizada y se deja secar.
REFERENCIAS

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ANEXO I
Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)
Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5
Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 0.26 mL
Amortiguador pH 6.8 0.5 mL
Agua desionizada 1.22 mL
Persulfato de amonio 0.01 mL
TEMED 0.02
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
• Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°
C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico.
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• Amortiguador del gel separador pH 8.8
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador del gel separador pH 6.8
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y
aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.
• Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar
el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a
100 mL.
• Persulfato de amonio al 10%
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.
• Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeración.
• Solución teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de agua
desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el metanol y
adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.
• Solución desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.
• Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2
M y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4 ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar hasta 3
veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.
• Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB se
Garibay Orijel


prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato de
sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con agua
desionizada.
• Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)
A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.
• Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardar
a –20 °C.
• Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml con
agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ámbar.
• Solución cromógeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS, agregar
25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara inmediatamente antes
de usarla.
Garibay Orijel


ANEXO II
PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO
DE AMONIO.
INTRODUCCIÓN.
Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos está principalmente presente

en la fracción gamma de las proteínas del suero. Desde entonces se han diseñado diferentes
métodos para la obtención de esta fracción sérica.
Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos
específicos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus
antígenos. Así, los anticuerpos pueden ser precipitados por la adición del antígeno en
estado soluble, o ser adsorbidos al antígeno previamente insolubilizado. En ambos casos, el
complejo resultante puede disociarse por modificación del pH a valores entre 2.5 y 4.0 ó
9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentración de sales o la concentración del antígeno
soluble. Después, los anticuerpos se recuperan por alguno de los métodos de separación
inespecífica.
Las separaciones inespecíficas están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los
anticuerpos. Entre estos métodos, los más utilizados son la precipitación con etanol, con
sulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato de
celulosa, gel de almidón, etc.), cromatografía de intercambio iónico y filtración en tamices
moleculares.
Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la
precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. Generalmente, se
considera que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado de
pureza.
La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido
como “salting out”, el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la
molécula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además
neutralizan los grupos cargados de la proteína, con lo que se insolubiliza y precipita.
OBJETIVO.
Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitación con sulfato de amonio
a una saturación final del 33% y detección por medio de un gel de electroforesis con
gradiente desnaturalizante.
Garibay Orijel


MATERIALES.
Material por grupo:
1 centrífuga clínica.
6 agitadores magnéticos
5.0 mL de BaCI2 al 10%.
1 parrilla con agitación.
Material por equipo:
10 mL de suero de conejo
10 mL de suero de humano.
20 mL de solución sobresaturada de sulfato de amonio.
5.0 mL de NaOH 2N.
50 mL de solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.
20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Papel indicador de pH.
Tubo para diálisis.
10 cm de hilo grueso.
2 tubos falcón de 15 mL, graduados.
2 vasos de p.p. de 100 mL
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
1 pipeta serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.
1 matraz Erlenmeyer de 25 mL.
1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.

2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un vaso de p.p., medio volumen de la
solución sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN
CONSTANTE. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%.
3. Continuar con la agitación durante 10-15 min después de terminar la adición del sulfato
de amonio.
4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcón y centrifugar los tubos a
temperatura ambiente a 3500 rpm. durante 15 min.
5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del
suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la
mitad o un tercio del volumen original del suero.
Garibay Orijel


9. Dializar contra SSRB en frío (4° C) y con agitación, durante 2 días, realizando 2 cambios
diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para
saber si efectivamente se eliminó el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de diálisis
se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera completa si ya
no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm.
durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Guardar las gamma globulinas para la separación de isotipos.
12. Determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford.
13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas.
REFERENCIAS.
Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods in
Immunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor.
Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoquímica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa
Médica Mexicana.
Garibay Orijel


PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo ligado a enzimas (ELISA)
El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en inglés (enzyme
linked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.En este método
se utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad de
unión específica al antígeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reacción de
oxido-reducción, en la cual el sustrato se transforma en un producto colorido. En este
sistema el antígeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase sólida insoluble (micro pozos,
tubos o perlas de polivinilo o estireno). El método de ELISA tiene aplicaciones muy
variadas, lo cual lo hace muy versátil: diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o
parasitarias, cuantificación de hormonas, cuantificación de haptenos, titulación de
anticuerpos en bajas concentraciones, determinación de anticuerpos no precipitantes
Existen diversas variantes del método de ELISA, como son los métodos directo, indirecto y
en “sándwich”, y el método de ELISA competitivo. Estos permiten la determinación de
antígenos en fluidos biológicos, a excepción del método indirecto con que se detectan
anticuerpos.
En los métodos directos, el anticuerpo dirigido específicamente contra el antígeno es el que

lleva unida la enzima. En cambio en los métodos indirectos, el conjugado enzima-
anticuerpo reacciona con el primer anticuerpo, el cual ya reaccionó con el antígeno. En el
método de sándwich, el conjugado antígeno anticuerpo reacciona con el antígeno que se ha
unido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la fase sólida. El o los componentes que no
reaccionaron se eliminaron por lavados; por último se adiciona el sustrato de la enzima y se
mide la intensidad del color desarrollado, el cual es proporcional a la magnitud de la
reacción antígeno-anticuerpo.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno conocerá y realizará la técnica de ELISA para detección de antígeno o

anticuerpo.
Conocerá la metodología básica para adsorber antígenos en micro placas de ELISA.

Ligará antígenos o anti anticuerpos conjugados a antígenos adsorbidos en placas de
ELISA.
Determinará la presencia del antígeno deseado por la reacción de una enzima
conjugada a anticuerpo.
Garibay Orijel


MATERIALES
Estufa regulada a 37 °C.
Placas de ELISA de poliestireno (fase sólida)
Antígeno “H” u “O”, solución al 5% en solución salina 0.85%.
Pipetas automáticas de 20-200 ml
Anticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRP
Suero humano control positivo y suero humano control negativo
Sustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2 al 30% (v/v) en 10 ml de regulador de
citratos 0. XM pH 5.0
Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina ó 2% de albúmina sérica bovina (BSA), en
regulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6
Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05%
Tween 20.
Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de
0.25% de gelatina.
Método de ELISA indirecto.
1. Adicionar 0.2 mL de antígeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4°C
durante 24 horas para permitir la adsorción del antígeno a la fase sólida.
2. Eliminar las soluciones por inversión de la tira de pozos, y desechar el líquido
remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.
3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solución de lavado. Dejar los pozos llenos con esta
solución durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solución de la manera
descrita en el paso 2. Repetir dos veces más con el fin de eliminar todo el antígeno no
adsorbido.
4. Bloquear con 0.1 mL de una solución de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a
37°C durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbió el
antígeno.
5. Repetir el paso 2.
6. Adicionar 0.1mL de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo.
Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37°C durante 30 minutos para
permitir la reacción antígeno-anticuerpo.
7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccionó.
8. Adicionar 0.1mL de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a 37°C
durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los anticuerpos humanos
que se hayan unido al antígeno en la fase sólida.
9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado.
10. Adicionar 0.1 mL de una solución recién preparada del sustrato de la enzima: H2O2 al
0.04% en regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al
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0.04% (como cromógeno). Incubar en oscuridad para permitir la reacción enzimática y
el consecuente desarrollo de color (Nota: el cromógeno es fotosensible)
11. Detener la reacción enzimática adicionando 12 mL de H2SO4 8N en cada pozo.
12. Determinar la presencia o ausencia del antígeno de interés contra los controles de
manera visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.
REFERENCIAS
1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:43

2. Kemeny D. M. (1991) A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-
215.
3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme linked immunosorbet assay
(ELISA). A guide with abstracts of microplate application. Dynatech Laboratories, Inc.
4. Profesores del Departamento de Inmunología (1992) Manual de Prácticas de
Inmunología. ENCB, IPN pp.47-51.
Garibay Orijel


Práctica 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando

Agrobacterium tumefaciens
INTRODUCCION
La modificación genética de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generación de especies resistentes a condiciones de estrés (sequía, estrés osmótico, etc), la
mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminoácidos o precursores de
vitaminas, etc), obtención de plantas para fitoremediación (remoción de metales pesados),
la obtención de variedades con flores de color no convencional, la producción de alguna
proteína o metabolito con propiedades terapéuticas (vacunas, anticuerpos, alcaloides, etc).
Esta última es de gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción de
metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto de
los sistemas de producción. Algunas de estas ventajas son: el costo de producción es en
muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, proteínas más complejas
(anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteína que requieren un
procesamiento postraduccional, etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas y
granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
La modificación genética de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos los
cuales pueden ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se encuentra
el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol (PEG) con lo
cual se facilita la introducción del material genético. Sin embargo, el tratamiento con PEG
tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de células con pared celular
intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente en cultivo in vitro). Entre los
métodos físicos se encuentran principalmente la microinyección y el bombardeo de
micropartículas (también conocido como biobalística). Este último, que consiste en la
introducción del material genético al interior del núcleo utilizando micropartículas
aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular importancia en la última década, a
pesar del costo elevado, debido a que es altamente efectivo y reproducible.
A pesar de ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear de plantas
es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies relacionadas
como A. rhizogenes y A. vitis son patógenos no destructivos de plantas que tienen la
capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su
hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos
de la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1].
Desde el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.
tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha sido
fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas. Durante el
proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN
(ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los
genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la
síntesis de aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son utilizados por A.
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tumefaciens como fuente de carbono y nitrógeno. El T-DNA esta localizado en el plásmido
Ti (Plásmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que además contiene los genes
vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el
genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las raíces
infectadas mediante un mecanismo semejante al de A. tumefaciens. En este caso el
plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido inductor de raíces; root inducing
plasmid).
Un hallazgo crucial que permitió el diseño de vectores para la transformación

genética de plantas mediante el uso de especies de Agrobacterium es el hecho que sólo las
secuencias borde del T-DNA son requeridas para que la transferencia se lleve a cabo.
Algunos o todos los genes bacterianos del T-DNA pueden ser removidos originando
vectores desarmados, los cuales pueden transformar células vegetales sin los síntomas
generales de la infección bacteriana [3].
OBJETIVOS
Objetivo general
 Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética
nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
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 Conocer el principio básico de la modificación genética nuclear de plantas
utilizando un vector binario.
 Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención de plántulas
modificadas genéticamente.
 Conocer y llevar a cabo la metodología para la identificación de plantas
modificadas genéticamente.
MATERIALES
Materiales biológicos
• Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un derivado del plásmido pBIN 19, el cual
contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del péptido de transferencia RbcS y se
encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene además el gen nptII que
codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere resistencia a
kanamicina en las células portadoras del gen.
• Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario desarmado que
porta los genes vir.
• Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de cultivo
a 25°C durante 4-6 semanas.
• Primers para la amplificación total o parcial por PCR del gen nptII.
Equipos
• Campana de flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora
orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,
Material de laboratorio
• Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,
cajas Petri desechables, algodón, bisturí, pinzas de disección, papel filtro, papel
aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un horadador
de 0.5 cm de diámetro.
Reactivos y medios de cultivos

• Medio LB, Ampicilina 100 mg/mL, Carbamicilina 500 mg/mL, Kanamicina 100
mg/mL, etanol al 70%, solución de hipoclorito de sodio 5.5 % de cloro libre
• (solución al 10% de cloro comercial), HCl 1.0 N, NaOH 1N, agua grado biología
molecular.
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Primera sesión. Preparación de material y medios de cultivo
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición de soluciones
y reactivos)
ampicilina 100 mg/mL

kanamicina 100 mg/mL
estreptomicina 100 mg/mL
carbamicilina 500 mg/mL
Medio LB
Medio NBM
5 cajas petri con medio LB y antibióticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300

µg/mL.
5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25
µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos
5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500
µg/mL.
Segunda sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio sólido.
1. Tomar el stock de la cepa de A. tumefaciens LBA4404 y sembrar por estría simple en

una de las placas con medio LB con kanamicina y estreptomicina.
2. Control positivo. Inocular una cepa silvestre de Agrobacterium en otra placa con medio
LB con kanamicina y estreptomicina.
3. Incubar ambas cajas a 28 ºC por 36-48 h.
Tercera sesión. Cultivo de Agrobacterium en medio líquido.
1. Transferir una colonia de Agrobacterium a un matraz de 250 mL con 50 mL de medio

LB con kan 50 mg/L, estrep 300 mg/mL e incubar en agitación constante (200 rpm.) a 28ºC
durante 36-48 h.
Cuarta sesión. Preparación de Agrobacterium y modificación genética de N. tabacum
1. Centrifugar el cultivo de A. tumefaciens obtenido como resultado del trabajo

experimental de la tercera sesión a 7500 rpm. por 10 min. a 4 ºC en un tubo de
estéril de 50 mL.
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3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo).
4. Disectar 3-4 hojas de plántulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia.
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas petri.
6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener explantes
de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma rápida y evitando
dañar de manera excesiva el tejido.
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión de A.
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro
estéril.
9. Colocar los explantes en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia
arriba. Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el
medio.
10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.
Quinta sesión. Transferencia de explantes a medio de selección
1. Después de 48 h tomar los explantes (cuarta sesión) y transferirlos a las cajas de

Petri con medio NBM (kan 100 µg/mL, car 200 µg/mL). Tener cuidado de que los
explantes mantengan la misma orientación y de dañarlos lo menos posible.
2. Colocar las cajas en incubación a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 3-4
semanas.
Sexta sesión. Preparación de material y medios de cultivo
Preparar el siguiente material:
Medio NBM
5 cajas petri con medio LB y antibioticos: kanamicina 25 µg/mL y estreptomicina 300

µg/mL.
5 cajas petri con un disco de papel filtro que cubra toda la superficie
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio LB liquido con antibioticos: kanamicina 25
µg/mL y estreptomicina 300 µg/mL.
50 mL x 5 en matraces de 250 mL de medio MS0
5 cajas petri con medio NBM sin antibioticos
5 cajas petri con medio NBM con antibioticos: kanamicina 100 µg/mL y carbamicilina 500
µg/mL.
Garibay Orijel


Séptima sesión. Transferencia de explantes a medio de selección fresco
a. Después de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con kanamicina
100 µg/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientación y de no dañar el
tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son demasiado grandes,
transferirlos a dos cajas.
Octava sesión. Transferencia de transformadas a medio para formar raíces
a. Conforme vayan apareciendo, transferir los brotes resistentes a kanamicina a medio

MSB5 con kanamicina (100 mg/mL) y carbenicilina (200 mg/mL) para favorecer la
formación de raíces.
Novena sesión. PCR confirmatoria de la inserción del transgén
a. Tomar una porción de brote no mayor a 1 mm e incubarla con 20 µL de solución (2

µL buffer 10X, µL dNTP 2mM, 2.5 µL de primer F (3pm/ µL), 2.5 µL de primer R
(3pm/ µL), 3 µL MgCl2 25mM, 1 µL Taq pol 1u/µmol y 7 µmol agua). Realizar
estos pasos en hielo.
b. Realizar la PCR bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min. a 94 °C, 35
ciclos de 30s a 94°C, 30 s a 55°C, 30s a 72°C y 1 ciclo de 5 min. a 72°C.
c. Almacenar a -70°C o a -20°C.
Décima sesión. Análisis de productos de PCR en gel de agarosa
a. Prepara un gel de agarosa al 1% siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.

b. En el pozo número 1 del gel correr el marcador de peso molecular
c. Correr el producto de PCR obtenido en la novena sesión en un gel de agarosa al
1%.
d. Correr también controles negativos y positivos a la par.
e. Teñir el gel con Rojo Texas.
BIBLIOGRAFIA.
[1] Valderrama Fonseca A. M ; Arango Isaza R. ; Afanador Kafuri L. Transformación de

plantas mediada por Agrobacterium: “Ingeniería genética natural aplicada”.
Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín.Vol.58, No.1.p.2569-2585.2005.
Garibay Orijel


[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to Agrobacterium
infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1. Proceedings of the
Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-10440.
[3] Garfinkel, D. J. et al. Genetic analysis of crown gall: fine structure map of the TDNA
by site-directed mutagenesis. Cell. Vol. 27 (1981); p. 143-153.
[4]Bioline. HyperLadder I. Bandas de referencia para un gel de 1% agarosa.
www.bioline.com/images/guides/ladderguide/HL1_PopUp.jpg Consulta: 14/Junio/2009
[5] Hansen, G. and Chilton, M-D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe, in
Current Topics in Microbiology and Immunology (Vol. 240), Plant Biotechnology
Garibay Orijel

405manual Del Lab Oratorio de Biotecnologia Molecular

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Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR

México D. F. Agosto 2009

PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN

PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa

PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.

PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes

PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido

PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)

PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum)

“Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención que se deben

Por otra parte, como Biotecnología moderna se entiende:

“la aplicación de técnicas in vitro de ácidos nucleicos, incluidos el ácido

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

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B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a agentes

C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos

Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2):

La contención secundaria, se refiere a la protección del medio ambiente externo al

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El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan

1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE

En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza

Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad

Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la

NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para

a) Colocar una punta según corresponda.

a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.

La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)

Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)

Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

Límites de tolerancia para micropipetas

Volumen (µL) E% nominal CV% nominal

20-50 0.7 0.4

100-1000 0.5 0.2

Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variación de las micropipetas

Preparación de las muestras.

a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

PRÁCTICA 3. Extracción de ADN

Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:

• Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares

Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros

Extracción de proteínas y lípidos

Precipitación de ácidos nucleicos

Una muestra de suelo.

Primera Sesión. Extracción de DNA

Extracción de ADN de Suelo

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

Concentración del gel de agarosa Intervalo de peso

(c) Conformación del ADN

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed

PRÁCTICA 5. Extracción de ARN

Taq polimerasa (5U/ µL) 1.25 U / 50 µL 0.2 µL 0.2 µL