BIOTEGNOLOGA

DESARROLLO LABORATORIO VIRTUAL 1

PONENCIA ARGUMENTATIVA UNIDAD 1

INFORME

PRESENTADO POR:

JAVIER EDUARDO PINILLA

Cdigo. 80545592

PRESENTADO A:
FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA (UNAD)

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIAS
PROGRAMA INGENIARIA DE ALIMETOS
CEAD ZIPAQUIRA
2017
 INTRODUCCION

DETERMINACION DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE ORGANISMOS

UNICELULARES

Crecimiento microbiano es el aumento del nmero de microorganismos a lo largo

del tiempo ya sea en un ambiente natural o un ambiente modificado. Por tanto, no
nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo (ciclo celular) sino al
demogrfico de una poblacin. En este tema nos centraremos en el crecimiento de
microorganismo en condiciones artificiales, basado en un mtodo de cultivo fed-
batch o un lote alimentado; es un mtodo biotecnolgico de produccin basado en
la administracin del sustrato limitante del crecimiento del cultivo, el estudio que se
hace puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros
hongos.

Un cultivo en batch se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de

sus componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento,
esta tcnica permite controlar la velocidad de crecimiento (m) del microorganismo.
Por lo anterior podemos referir que si determinamos el comportamiento de una
poblacin de organismos unicelulares en funcin del tiempo (log del #de clulas o
de viables, o de absorbancias vs tiempo) podemos al menos observar cuatro
etapas o estados fisiolgicos en una curva de crecimiento. Para la prctica
propuesta se utiliza el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos
que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito, en este mtodo se pueden
distinguir cuatro fases en el cultivo: la fase latencia en la que el microorganismo
se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica
para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general
es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se
encuentra el microorganismo. La fase exponencial donde se presenta un
crecimiento balanceado. La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de
microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, pero presenta la
aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. La fase de
muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma
exponencial con una constante que depende de diferentes circunstancias.

Existen muchas tcnicas para la medicin de crecimiento microbiano entre las que
se cuentan el recuento total de clulas, conteo de viables, peso seco y
turbidimetria (espectrofotmetro) este ltimo mtodo se utilizara en la prctica
propuesta basada en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de
una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la
concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra.
OBJETIVO:

Ejercitar de la determinacin de la curva de crecimiento de organismos

unicelulares (bacterias y levaduras) determinando los parmetros principales que
la caracterizan.

METODOLOGIA

PROCEDIMIENTO DE PRCTICA

1. Prepare una suspensin de microorganismos a cultivar por lavado de un tubo

con agar inclinado de 18h de incubacin con 5ml de agua destilada.

2. De la suspensin inocule aspticamente 1ml en el Erlenmeyer de 100 ml un

contenido de 19ml de medio liquido apropiado (caldo nutritivo).

3. incube de 18-20h con agitacin

DETERMINACION CINETICA DE CRECIMIENTO

1. Transfiera 10ml de inoculo a Erlenmeyer de 250ml con 50ml de medio estril, e

incube con agitacin a 37C.

2. Lea la D.O. a 600nm (en todos los tiempos) en un espectrofotmetro y consigne

los datos. Tomar como blanco 2ml de medio estril sin inocular.

ABSORBANCIA TIEMPO(H)

0,05 0

0,06 0,5

0,07 1

0,12 1,5

0,2 2

0,3 2,5

0,45 3

0,5 3,5

0,5 4
RESULTADOS

Que fases de crecimiento puede diferenciar en la grfica.

Fase de latencia fase de aceleracin positiva fase exponencial fase de

aceleracin negativa fase estacionaria

Explique el comportamiento de la grafica desde el punto de vista metablico

Fase de latencia: Adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales
(abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo).
Fase de aceleracin positiva: Actividad metablica, aumento en el tamao
individual de las clulas, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas.
Fase exponencial: La velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de
generacin es mnimo. Consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio.
Fase de aceleracin negativa: En ella no se incrementa el nmero de
microorganismo
Fase estacionaria: Se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos
secundarios que pueden tener importancia industrial. Representa con mayor
fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes
naturales.
Fase de muerte: Disminucin progresiva en el nmero de clulas viables y
cuando esto ocurre se dice que la poblacin ha entrado en fase de muerte.

En el grafico es posible observar toda la fase de crecimiento? Explique su

respuesta.

S. Porque de acuerdo a la grfica se observa una evolucin en los estadios del

microorganismo y describe cada etapa de acuerdo a su comportamiento
metablico donde el espectro muestra una generacin ms alta de absorbancia en
la muestra hasta llegar a un punto estable

Investigue otros mtodos con los cuales puede establecer la curva de

crecimiento.

Recuento directo medida de la masa de clulas recuento de viables medida

del nmero de partculas medida de parmetros bioqumicos medida de
actividad metablica.

Cual es la aplicacin industrial de conocer la curva de crecimiento de un

microorganismo.
Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos
porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir
consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una
fermentacin. De igual forma se basa en la implementacin de estos en procesos
de transformacin o control microbiolgico dentro de la industria.

Que entiende por absorbancia

Tambin conocida como Densidad ptica (OD) la Absorbancia se define como la

relacin (logartmica) entre la intensidad de la luz que incide sobre una muestra y
la intensidad de esa misma luz que es transmitida a travs de esa muestra.

Porque es necesario utilizar una solucion blanco, cada vez que se hace una
nueva lectura en el espectrofotmetro.

Se usa para ajustar el instrumento para leer transmitancia del 100 % o 0 de

absorbancia

Que es lo que mide realmente el espectrofotmetro y como se relaciona esto

con la fases de crecimiento microbiano

Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de

cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es
proporcional a la masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos
permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la
medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colormetro, por
ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente
en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad
ptica. La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no
distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar
densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro.
 PONENCIA ARGUMENTATIVA UNIDAD I

PRODUCCIN DE ENZIMAS DE INTERS INDUSTRIAL

Hiptesis 2. Las diferencias en la actividad enzimtica se deben a la presencia de

inhibidores en el medio de cultivo 1.

La bsqueda continua de microorganismos ms eficientes en la produccin de alfa

amilasa es una alternativa, para optimizar la produccin de esta enzima de
importancia comercial.

Para ello, se ha aislado tres cepas de microorganismos amiloliticos, sin embargo

se desea saber cul de las tres cepas es ms eficiente en la degradacin de ste
polisacrido. Para ello se ha realizado un procedimiento de laboratorio entregando
como resultado los siguientes parmetros de prctica.

Como se observa en el cuadro de resultados podemos ver que el primer caldo

nutritivo entrega mayor rendimiento, Con los resultados anteriores se obtuvo la
Cepa ms eficiente en degradar el almidn, ahora se pretende optimizar las
condiciones para esta produccin.
FUENTES DE ENZIMAS

Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias, arqueas y de hongos. La

alfa amilasa es una enzima que se utiliza en la industria del almidn, el alcohol y el
papel, por lo tanto tiene una alta importancia a nivel comercial, lo que ha llevado a
realizar diversas investigaciones en Biotecnologa que permita optimizar su
produccin.

Los microorganismos que utilizan el almidn comnmente denominados amilo

ltico, pueden utilizar este polmero porque tienen enzimas como la alfa amilasa la
cual se encarga de degradar el almidn hasta las molculas de glucosa. El yodo
se utiliza como indicador de presencia de almidn, por lo tanto al colorearse de
color oscuro, indica la presencia del polisacrido.

DATOS DE EVIDENCIA LABORATORIO 2

DATOS DE EVIDENCIA LABORATORIO 3

El almidn es un homopolisacrido constituido por unidades de D-glucosa que
forman el enlace glucosdico mediante enlaces tipo a (1-4) y a (1-6). En el tejido de
los frutos y races vegetales el polmero se forma de tamaos variados con pesos
moleculares que varan desde miles hasta 500.000.

El almidn presenta dos tipos de agrupaciones moleculares: amilosa y

amilopectina. La amilosa se caracteriza porque sus cadenas largas, no
ramificadas y por lo general forman una estructura helicoidal. Es posible preparar
soluciones coloidales de amilosa, pero sta no es soluble en agua; de hecho para
las aplicaciones domsticas e industriales suelen utilizarse las preparaciones
coloidales en agua.

La amilopectina es un polmero de D-glucosa de cadenas ramificadas de longitud

media (24 a 30 unidades por ramificacin). Los enlaces glucosdicos de la cadena
principal (esqueleto) son del tipo a(14) pero los de los puntos de ramificacin
son a(16).

La amilopectina constituye el 80% de casi todos los almidones. Es muy viscosa y

es fcilmente hidrolizada por la amilasa.

El almidn se encuentra abundantemente en los granos, semillas, tubrculos y

frutas. Es la fuente principal de carbohidratos para el hombre.

INHIBIDORES DE-AMILASAS DE LA BROCA DEL CAF HYPOTHENEMUS

HAMPEI EN DIFERENTES ESPECIES VEGETALES

La broca del caf, Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Curculionidae:

Scolytinae) es actualmente la plaga ms importante para el cultivo del caf (Coffea
arabica L.) en Colombia. Dentro de las estrategias diseadas para el manejo
integrado de la broca (MIB) se ha incluido el control cultural, biolgico y qumico.

Se obtuvieron extractos proteicos de las semillas de ocho especies vegetales de

las familias Gramineae y Leguminosae. Con estos extractos y un inhibidor de -
amilasas comercial de trigo (Triticum aestivum L.), se realizaron pruebas de
actividad inhibitoria contra las -amilasas de la broca, evaluadas con
espectrofotometra utilizando el mtodo de Bernfeld y mediante zimogramas de
inhibicin enzimtica. Las especies que mostraron ms de 50% de inhibicin de
las -amilasas de broca, fueron: maz (Zea mays L.), Brachiaria decumbens Stapf
y el inhibidor comercial de trigo, corroborando su actividad mediante los
zimogramas de inhibicin. Con los extractos de brachiaria y de maz no se
encontr inhibicin de las -amilasas de mamferos, mientras que con el inhibidor
comercial de trigo si se present ms de 50% de inhibicin.
Adicionalmente se evalu el efecto de los extractos de maz y brachiaria sobre
diferentes estados de la broca en dietas artificiales, encontrndose mortalidades
de 40% y 95% de larvas respectivamente.

Estas dos especies son promisorias para la identificacin de los genes que
codifican estas protenas y para desarrollar una base gentica de resistencia
contra la broca del caf.

OBTENCIN DE -amilasa A PARTIR DE Aspergillus oryzae

La -amilasa (1,4, -glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza

los enlaces 1-4 glicsidicos de polisacridos, tales como el almidn, glicgeno o
productos de degradacin de los mismos (1). Tiene una actividad enzimtica que
oscila entre 53-129 U/L, su peso molecular va de los 40 000 a 50 000 Da, su
actividad requiere de la presencia de iones cloruro.

RESULTADOS

La temperatura, el tiempo de incubacin en la produccin, cambios de pH,

son algunos de los factores determinantes en la actividad y estabilidad de
una enzima. La actividad enzimtica se observ como parte de la hidrlisis
del almidn y fsicamente como el cambio de coloracin en el medio
utilizado.
La actividad enzimtica puede permanecer ms o menos constante por un
lapso de tiempo largo, siempre y cuando exista un agente estabilizador en
el medio de produccin como lo es el in cloro. Con lo que respecta al
tiempo de accin de la enzima, al parecer hay una relacin directamente
proporcional entre el tiempo y la actividad enzimtica, sin embargo, hay un
punto en el que la enzima pierde afinidad por el sustrato, cesando la
hidrlisis del almidn por la misma.

CONCLUSIONES

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito o batch de medio de

cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles,
sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto
duplican su masa y su material gentico.

De acuerdo al medio de cultivo, la adaptabilidad del microorganismo al sustrato

utilizado permite identificar las diferentes etapas de desarrollo y como este
 evoluciona, el cual mediante tcnicas de medicin se construye una curva de
crecimiento.

Podemos ver que al realizar una medicin de crecimiento de UFC la industria

utiliza esta informacin para el implemento de tcnicas de conservacin de
material orgnico degradable mediante la transformacin, maduracin,
fermentacin o de acuerdo al fin y la industria que lo requiera.

El sistema de medicin mediante equipos de uso tecnolgico permite un alto

grado de precisin disminuyendo el riesgo de error en los procesos.
Se logr la obtencin de -amilasa a partir de la fermentacin de Aspergillus
oryzae, as mismo, se determinaron algunas de las condiciones que favorecen
la actividad enzimtica de la -amilasa.

BIBLIOGRAFIA

(Stainer, 1996)

(microbiologia , 1998)

(Benavidez, 2014)

(A., 1993)

(BEATRIZ ELENA PADILLA H.1, 2006)