Determinacin de acrilamida y metacrilamida mediante cromatografa lquida de alto rendimiento

en fase normal y deteccin UV

Abstracto

Para el anlisis de acrilamida y metacrilamida se desarroll un mtodo que utiliz cromatografa

lquida de alta resolucin de fase normal (NP-HPLC) con deteccin UV. El mtodo se basa en la
separacin cromatogrfica de estos analitos en una columna de HPLC polar diseada para la
separacin de cidos orgnicos. La identificacin de la acrilamida y la metacrilamida se aproxima
dualmente, es decir, directamente en sus formas protonadas y como sus productos de hidrlisis
acrlico y cido metacrlico, respectivamente, para confirmacin. La deteccin y cuantificacin se
realiza a 200 nm. El mtodo es simple permitiendo una resolucin clara de los picos objetivo de
cualquier sustancia interferente. Se obtuvieron lmites de deteccin de 10 g L-1 para ambos analitos
con el RSD intra e intra-da para el anlisis estndar situado por debajo del 1,0%. El uso de
acetonitrilo en el disolvente de elucin reduce los lmites de deteccin y los tiempos de retencin, sin
afectar la resolucin de los picos. El mtodo se aplic para la determinacin de acrilamida y
metacrilamida en muestras de alimentos con puntas sin acrilamida nativa produciendo
recuperaciones entre 95 y 103%. Finalmente, se analizaron muestras comerciales de papas fritas
francesas y asadas, galletas, cacao y caf para evaluar la aplicabilidad del mtodo a la acrilamida,
dando resultados similares a los reportados en la literatura.

Palabras claves

AcrilamidaMetacrilamidaAcido acrlicoEl cido metacrlicoDeclaracin de HPLCUV de fase normal

1. Introduccin

La acrilamida (2-propenamida) es un compuesto hidrfilo de bajo peso molecular conocido

principalmente por su uso como monmero en la produccin de poliacrilamida, que a su vez se
utiliza en plsticos y como medio de electroforesis [1-3]. Aunque se clasifica como un posible
carcingeno humano y se ha incriminado por mutagenicidad en ratas y como neurotoxina humana,
su presencia en los alimentos ha recibido poca atencin ya que no se ha informado de migracin
insignificante del material de envasado de plstico [3 - 5] . El cuadro entero fue cambiado despus
del anuncio hecho en 2002 por la administracin sueca de la comida nacional [6], que divulg niveles
extremadamente altos de la acrilamida en los productos que se consumen sobre una base regular en
cantidades bastante grandes tales como patatas fritas, patatas asadas, desayuno cereales y
productos de panadera. Desde entonces, varios artculos se publicaron tratando de postular el
mecanismo a travs del cual se forma acrilamida [7 - 10]. La conclusin hasta la fecha fue que la
acrilamida se forma durante la coccin, frer y hornear a temperaturas superiores a 120 C de
alimentos ricos en grasas, carbohidratos y asparagina como producto de la reaccin asparagina-
glucosa (reaccin de Maillard) [8-10] o por descomposicin de triglicridos.

Un requisito urgente es el desarrollo y validacin de mtodos analticos sensibles, robustos y

econmicos que pueden cuantificar la acrilamida en diferentes matrices de alimentos hasta el bajo
nivel de g / kg [6, 10, 11]. De hecho, se han desarrollado numerosos mtodos en los ltimos aos
para determinar el monmero de acrilamida, especialmente en agua, fluidos biolgicos y alimentos.
La mayora de ellos se basan en lquido o cromatografa de gases tcnicas [12 - 27]. Sin embargo,
estos mtodos como tales, no bastan para el anlisis de acrilamida en alimentos procesados /
cocinados a niveles bajos. En particular, carecen de selectividad y del grado adicional de certeza del
analito necesario para confirmar la presencia de una molcula pequea tal como acrilamida en una
matriz alimentaria compleja.

Hasta la fecha, se han publicado varios mtodos analticos sobre el anlisis de la acrilamida en los
alimentos cocinados. Estos mtodos se basan principalmente en la espectrometra de masas (MS)
como la tcnica determinante, junto con un paso cromatogrfico ya sea por LC [18-20] o GC [21-25],
generalmente despus de la derivatizacin del analito. De hecho, el Grupo de Trabajo de Expertos
sobre Mtodos Analticos convocado durante la reciente reunin del JIFSAN sobre acrilamida [10]
concluy que la mayora de los laboratorios utilizan GC-MS o LC-MS, siendo la ventaja de los mtodos
basados en LC-MS que la acrilamida puede analizarse sin derivatizacin previa (por ejemplo,
bromacin), lo que simplifica y agiliza considerablemente el anlisis. Debido a la baja masa molecular
de la acrilamida (71 g / mol) y, por tanto, tambin a sus iones de fragmentos de baja masa, la
confirmacin del analito se puede conseguir con un espectrmetro de masas de dos etapas
(monitorizacin de ms de una transicin de masa caracterstica) -24]. Sin embargo, la acrilamida es
una molcula muy polar con mala retencin en LC convencional de fase inversa sorbentes [22], y a
pesar del uso de la espectrometra de masas en tndem mayor esfuerzo puede ser necesario colocar
en la limpieza eficiente pasos para evitar la interferencia de co-extractives .

Normal fase de separacin cromatogrfica ha sido descuidado, aunque hay algunos documentos que
fomentan tal enfoque [26, 27]. Especialmente en el trabajo apoyado por Dionex [26], la
cromatografa inica con deteccin UV a 202 nm se utiliz con xito para la determinacin de
acrilamida a condicin de que un paso de limpieza a fondo haba precedido al anlisis. Los resultados
obtenidos se encontraron similares a los obtenidos con la deteccin de EM incluso a un nivel de 0,1
mg / kg. Por lo tanto, la deteccin UV puede ser utilizada para la determinacin de las
concentraciones reportadas de acrilamida, que para los productos alimenticios inspeccionados oscila
entre 0,040 y 0,050 mg / kg para el caf y la masa, hasta 2 y 3 mg / kg para las patatas fritas. Estos
lmites de deteccin pueden reducirse an ms mediante una limpieza adecuada.

En el presente trabajo, se propone el uso de NP-HPLC como un mtodo eficaz para la deteccin y
cuantificacin de la acrilamida. La misma metodologa es tambin aplicable para la determinacin de
su producto metilado metacrilamida, aunque no hay aplicaciones de muestra reales. El mtodo se
basa en la separacin de estos analitos en una columna de HPLC polar (Aminex HPX-87H) usando
cido sulfrico 0,01 M como eluyente. Bajo estas condiciones, los analitos se convierten en sus
productos de amonio cationizados, protonados. Los picos de acrilamida y metacrilamida estn bien
resueltos no slo uno del otro sino tambin de otros compuestos, puesto que ambos analitos
aparecen mucho ms tarde que cualquier otro en el cromatograma. Con el fin de confirmar nuestros
resultados evitando MS, ambos analitos se hidrolizaron y se convirtieron a sus respectivos cidos y se
determinaron como tales. La resolucin de los picos de cido (acrlico y metacrlico) revel la
posibilidad de que la acrilamida y la metacrilamida se analizaran en estas formas. El aumento del
rendimiento y la reduccin en los tiempos de anlisis se consigui adicionalmente mediante la
introduccin de un gradiente de acetonitrilo al 20% en la fase mvil.

2. Experimental

2.1. Aparatos y software

El cromatgrafo lquido consisti en una serie Shimadzu 10AD para HPLC equipada con un detector
de longitud de onda variable UV-vis (Shimadzu) ajustado a 200 nm. Para todas las separaciones se
utiliz una columna Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm) para anlisis de cidos orgnicos
suministrada por Bio-Rad y termostatizada a 30 C en un horno CTO-10A de columna Shimadzu. La
recopilacin y manipulacin de datos se realiz mediante un software automatizado CLASS-VP
Shimadzu para cromatografa. Se utiliz un mezclador Vortex Velp Scientifica para mezclar bien las
soluciones. Se us una centrifugadora refrigerada de Sorvall RC-5B (Du Pont Instruments) para
separaciones centifugales. Se utiliz un bao termostatizado mantenido a las temperaturas deseadas
para experimentos de calentamiento.

2.2. Reactivos

Todos los reactivos eran de calidad analtica o de grado ms alto disponible. La acrilamida y
metacrilamida junto con sus respectivos cidos se obtuvieron de Sigma Aldrich Chemical Company
(EE.UU.). Se disolvieron cantidades adecuadas de cada compuesto en 100 ml de agua destilada para
preparar 1 mg de soluciones madre de L-1. Las soluciones de trabajo de cada compuesto se
prepararon diariamente mediante diluciones apropiadas de las soluciones patrn. El agua y el
acetonitrilo (Merck, Darmstadt, Alemania) utilizados para la separacin cromatogrfica fueron de
grado HPLC.

2.3. Muestras

Todas las muestras (pollo crudo, patatas, galletas de chocolate, cacao y caf griego) se compraron en
un supermercado local. Las patatas se cortaron en trozos redondos y se hornearon en un horno a
250C durante 1 h o se frieron en aceite de oliva (T = 180C) durante aprox. 25 min.

2.4. Procedimiento general

2.4.1. Preparacin de la muestra

La extraccin de acrilamida a partir de muestras reales se realiz con agua como extractante, segn
una combinacin de las condiciones ptimas citadas en la literatura [25]. Cinco gramos de cada
muestra de alimento se trituraron en una mezcladora Waring durante 3 min y se homogeneizaron a
fondo con 5 ml de agua destilada. Se a~nadieron otros 10 ml de agua y los homogeneizados se
dejaron reposar en un bao de agua termostatizado ajustado a 70 C bajo agitacin. Despus de 30
min, los homogeneizados se centrifugaron (12000 rpm, 20 min, 4C) para permitir la precipitacin y
se filtraron dos veces a travs de papel de filtro Whatman No. 2. Los filtrados se transfirieron a
matraces volumtricos de 10 ml y se diluyeron con agua destilada hasta marcar. Antes del anlisis, se
aadieron hexano (tres porciones de 3 ml) a 1 ml de la solucin de muestra para extraer los cidos
grasos de cadena larga restantes que podran crear problemas en el anlisis cromatogrfico dando
picos que se solapan con los analitos diana o bloquean la columna polar. La mezcla se agit
vigorosamente y la capa de hexano superior se retir con una pipeta Pasteur. Se tomaron 20 l con
una jeringa de Hamilton directamente de la capa acuosa inferior y se inyectaron en la HPLC para
analizarla para acrilamida y metacrilamida.

Alternativamente, despus de la centrifugacin se aadieron 5 ml de una solucin de NaOH 4 M al

sobrenadante que luego se calent a 70C durante 1 h para que las amidas se convirtieran en los
derivados de carboxilato respectivos y la solucin final se convirti de nuevo en 10 ml con una
solucin tampn fosfato 2 M (pH 2). Los restos lipfilos se extrajeron de nuevo con hexano y se
inyectaron 20 l de la capa acuosa en la columna de HPLC para determinar la acrilamida y la
metacrilamida como sus cidos derivados.
2.5. Condiciones cromatogrficas para la separacin de acrilamida, metacrilamida, cido acrlico y
cido metacrlico

Se adopt un patrn de elucin isocrtico para la separacin de los analitos diana. Se utiliz solucin
de cido sulfrico 0,01 M durante todo el anlisis. Alternativamente, se us una mezcla de cido
sulfrico al 20-80% de acetonitrilo-0,01 M para acortar el tiempo de anlisis y aumentar la
detectabilidad. En todos los casos la temperatura de la columna se fij a 30C, el caudal se mantuvo
a 0,6 mL min-1 mientras que la deteccin se realiz a 200 nm.

3. Resultados y discusin

3.1. Determinacin directa de NP-HPLC de acrilamida y metacrilamida

El primer objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones ptimas para obtener picos
mximos y bien resueltos. Basndose en el hecho de que el concepto del mtodo se aproxim a la
interaccin cido-base de los analitos diana con la columna polar, es decir, que tanto la acrilamida
como la metacrilamida se separaran a travs de sus valores pKa (protonados) o pKb (amida) , se
ensayaron soluciones cidas acuosas para decidir sobre el eluyente ptimo. Entre los cidos
inorgnicos comunes probados (HNO3, HCl, HClO4 y H2SO4), el cido sulfrico, tambin
recomendado para la separacin de cidos orgnicos, dio los resultados ptimos. Una solucin de
cido sulfrico 0,01 M dio los picos ms altos y aunque los eluyentes ms cidos (figura 1a) dieron
lugar a tiempos de retencin ms cortos de 1 a 3 min, finalmente se seleccion la solucin 0,01 M
para obtener los lmites de deteccin ms bajos posibles.

El efecto de los valores de la velocidad de flujo tambin se evalu dentro del intervalo de 0,1 - 1,0 ml
min - 1. Se encontr que 0,6 mL min-1 era el valor ptimo, ya que aunque mayores velocidades de
flujo redujeron el tiempo de ejecucin en casi 10 min para las amidas, perjudicaron la resolucin
mientras se reducan los valores de rea de pico obtenidos (Figura 1b). Las velocidades de flujo
superiores a 1,0 ml min-1 dieron como resultado una elucin pobre y dos picos de los analitos diana.

La variacin de la temperatura de la columna tambin se evalu dado que el aumento de las

temperaturas da lugar a tiempos de retencin ms cortos. De hecho, los tiempos de retencin se
redujeron ligeramente pero con un coste en la intensidad de la seal (Figura 1c). Por lo tanto, la
temperatura ptima se seleccion para que fuera 30C.

Bajo las condiciones anteriores se construyeron curvas de calibracin tanto para acrilamida como
para metacrilamida. Como puede verse en la Tabla 1, ambos analitos pueden ser detectados y
cuantificados en el nivel de g L-1 y, por lo tanto, el mtodo propuesto puede aplicarse fcilmente a
los productos objetivo descritos en la introduccin.

3.2. Determinacin por NP-HPLC de acrilamida y metacrilamida como sus productos de hidrlisis:
cido acrlico y cido metacrlico

Es sabido que las amidas pueden transformarse en sus precursores cidos carboxlicos (o aniones
carboxilato) mediante hidrlisis catalizada por cidos o bases. Puesto que se recomienda la columna
de HPLC utilizada para la separacin de estos cidos, se intent convertir acrilamida y metacrilamida
en cido acrlico y metacrlico y, en consecuencia, determinarlos como tales. El calentamiento (70 C)
de ambos analitos durante 6 h en cido sulfrico 5 M o durante 1 h en NaOH 4 M dio como resultado
la desaparicin completa de los picos de amida mientras emergan dos nuevos picos
correspondientes a los cidos respectivos. No sorprende que estos picos tuvieran tiempos de
retencin 18-21 min ms cortos que los de las amidas (Figura 2) ya que los cidos tienen valores de
pKa de varios rdenes de magnitud mayores que las amidas protonadas.

En las condiciones optimizadas anteriormente mencionadas para las amidas, sus cidos precursores
proporcionaron curvas de calibracin idnticas (Tabla 1), mientras que la ganancia global de este
enfoque no slo fue una reduccin sustancial en el tiempo de anlisis y los residuos de disolventes
sino -ms importante- una verificacin de los hallazgos de amida . Es decir, despus del anlisis
directo, la muestra podra ser hidrolizada y reanalisada para el cido acrlico y metacrlico para
confirmacin.

Despus de todo, un objetivo principal de este trabajo fue confirmar que un mtodo NP-HPLC podra
separar los analitos objetivo de manera efectiva y reproducible. Un primer enfoque fue comprobar la
reproducibilidad intra e inter da del mtodo propuesto comparando los tiempos de retencin y las
reas de los picos obtenidos de un patrn que contena 200 g L-1 de cada compuesto. Despus de
10 inyecciones consecutivas y durante un perodo de 1 semana, se demostr que los tiempos de
retencin obtenidos (Tabla 1), tenan una RSD por debajo del 1,0%, ya que variaban en el segundo
dgito decimal. Por lo tanto, no se confirm de ningn modo la hiptesis inicial de que la HPLC no
puede tenerse en cuenta para la determinacin fiable de acrilamida por tiempos de retencin.

Los inconvenientes de este enfoque pueden derivarse del hecho de que el cido acrlico y 15 de sus
steres son monmeros usados para fabricar polmeros, destinados a entrar en contacto con
alimentos. Por lo tanto, estos steres pueden migrar a alimentos que generan cido acrlico libre.
Aunque este hecho puede parecer una fuente importante de interferencia, no es el caso de la
metodologa propuesta porque la acrilamida puede diferenciarse incluso en este caso ya que el cido
acrlico se cuantificara en la primera corrida para la acrilamida, mientras que la presencia de
acrilamida podra ser verificada despus de la hidrlisis por un aumento en el pico de cido acrlico.

3.3. Efecto del acetonitrilo en la separacin cromatogrfica y determinacin de acrilamida / cido

acrlico y metacrilamida / cido metacrlico

En otro enfoque de optimizacin, se usaron otros disolventes de HPLC para examinar la posibilidad
de resolucin y mejora de la seal junto con una reduccin adicional en la duracin de la ejecucin
cromatogrfica.

La longitud de onda de deteccin (200 nm) es un factor limitante ya que la mayora de los disolventes
de HPLC tienen un corte de longitud de onda muy por encima de la misma. Se encontr que la
introduccin de acetonitrilo no slo mejor la seal sino que tambin disminuy los tiempos de
retencin obtenidos suprimiendo los de los cidos orgnicos al comienzo del cromatograma. La
optimizacin del gradiente de acetonitrilo con vistas a mejores picos y tiempos de retencin ms
cortos revel un rendimiento ptimo para un contenido de acetonitrilo al 20%. Como puede
observarse en la Tabla 1, los lmites de deteccin y cuantificacin se reducen a 0,5 y 2 g L-1
respectivamente, mientras que el uso de acetonitrilo mejora la linealidad de las curvas de calibracin
obtenidas dando un coeficiente de correlacin (R2) 0,9999-1 que es probablemente la razn para el
rendimiento mejorado.

3.4. Experimentos de recuperacin y anlisis de muestras de alimentos picantes y comerciales

Despus de haber completado tres series de condiciones experimentales principalmente para la
determinacin tanto de acrilamida como de metacrilamida, la validacin de su desempeo se abord
mediante una muestra de carne cruda de pollo con los analitos objetivo y realizando pruebas de
recuperacin con los tres mtodos propuestos. Ms especficamente, se extrajo el extracto obtenido
despus del procedimiento, descrito en la preparacin de la muestra, con cantidades conocidas de
solucin concentrada de acrilamida y metacrilamida y se someti a anlisis siguiendo todos los
enfoques propuestos. Los resultados, mostrados en las Tablas 2 y 3, muestran que las recuperaciones
en el intervalo del 95-105% que se aproximan al 100% en la regin de baja concentracin
recomiendan NP-HPLC para ser vlidas para la determinacin sensible de acrilamida y metacrilamida,
mientras que el acuerdo entre la amida y el hallazgo cido respectivo sugiere que este enfoque
puede ofrecer una alternativa barata al uso de la deteccin selectiva de masas. El procedimiento de
extraccin aplicado junto con el desgrasado del extracto dio cromatogramas claros sin que
aparecieran picos interferentes (Figura 3) a los tiempos de retencin deseados. Las concentraciones
de acrilamida determinadas en todas las muestras analizadas estn en buen acuerdo con los valores
medios reportados en la literatura mientras que la metacrilamida no fue detectada en ninguna de las
muestras.

4. Conclusiones

Se proponen dos enfoques para la determinacin de acrilamida y metacrilamida con NP-HPLC, siendo
la acrilamida la principal diana debido a su genotoxicidad y su mayor presencia en alimentos de alto
consumo. Los lmites de deteccin en el bajo nivel de g L-1 junto con una mayor linealidad y alta
precisin sugieren que stos pueden aplicarse como alternativas rentables de los mtodos de EM
aplicados hasta ahora sin la implicacin de un paso de brominacin demorado y peligroso. La
intensificacin adicional de la seal y el confinamiento del recorrido cromatogrfico a aprox. 15 min
permite un anlisis rpido y fiable de la acrilamida. Finalmente, aunque la metacrilamida no se
determin en ninguna muestra real, su comportamiento similar puede encontrar una aplicacin
potencial en experimentos de extraccin ya que su ausencia de muestras reales permite su uso como
un patrn interno.

Expresiones de gratitud