Las enzimas difieren de los catalizadores qumicos en los siguientes aspectos:

Mayor velocidad de reaccin: La velocidad de una reaccin catalizada por

enzimas es 106 a 1012 veces mayor que la de una no catalizada y varios
rdenes de magnitud mayor que la reaccin correspondiente catalizada qumicamente.

Condiciones de reaccin suaves: Las reacciones catalizadas enzimticamente

ocurren a temperaturas bajo los 100C, presin atmosfrica y pH cercano a la
neutralidad. En contraste, las catalizadas qumicamente requieren temperatura
y presin elevadas y pH extremos.

Gran especificidad de reaccin: Las enzimas tienen una mucho mayor

especificidad que las reacciones catalizadas qumicamente respecto de los
sustratos y sus productos. En las reacciones enzimticas no hay productos
secundarios.

Capacidad de regulacin: La actividad cataltica de muchas enzimas vara en

respuesta a sustancias diferentes del sustrato.
La catlisis enzimtica de las reacciones qumicas que ocurren en las clulas
es indispensable para los organismos vivos.

Ya que, en condiciones fisiolgicas:

- La mayora de las reacciones qumicas tienden a ser muy lentas.

- La mayora de las molculas orgnicas son muy estables a pH neutro, a la

temperatura de los organismos vivos, y en el ambiente acuoso de las clulas.

- Muchas de las reacciones bioqumicas ms comunes involucran eventos

qumicos desfavorables energticamente o muy improbables en el ambiente
celular.

- Es decir, estas reacciones no ocurren a la velocidad requerida si no son

catalizadas.
Considerando estas propiedades catalticas tan
destacadas, surge una pregunta central:

Cmo funcionan las enzimas?

 A + B C + D

- Un equilibrio favorable no significa que la reaccin sea rpida.

- Un G negativo significa que el equilibrio favorece la
formacin de los productos, pero no que la reaccin ocurra
en forma espontnea.
- Se debe traspasar una barrera energtica.
 Velocidad = Frecuencia Colisin x Factor Energa x Factor Probabilidad

Colisin.
Para que ocurra una reaccin qumica, la colisin entre las molculas
reaccionantes es un evento crtico y necesario.
El nmero de colisiones es tan grande que slo una fraccin de ellas
son efectivas para producir la reaccin qumica.

Energa:
La velocidad de una reaccin qumica depende del contenido calrico, H,
necesario para efectuar la conversin del reactante en producto.
Todas las reacciones qumicas deben pasar a travs de un estado de
transicin inestable de alta energa.
El estado de transicin es el punto de mxima de energa, donde el
estado de los sustratos o productos es igualmente probable.
 El estado de transicin no es una especie qumica con una estabilidad
significativa. Es una especie fugaz y no un intermediario de la reaccin.
La diferencia en el contenido calrico entre el estado de transicin y el
contenido calrico de los reactantes se llama calor de activacin, H*.
Una aproximacin para comprender como las enzimas aumentan la velocidad de reaccin es
suponiendo que el estado de transicin (S) y el sustrato (S) estn en equilibrio.

En donde K es la constante de equilibrio para la formacin de S, y v es la velocidad de formacin

del producto a partir de S.
La velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de S.

Ya que solo S puede convertirse en producto. La concentracin de S se relaciona con la

diferencia de energa libre entre S y S, ya que se supone que estas especies estn en
equilibrio.
Ya que la velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de S, y la concentracin de S
depende de G, la velocidad de reaccin V depende de G. Especficamente,

k es la constante de Boltzmann, y h es la constante de Planck.

Probabilidad
Refleja el cambio en el orden (o desorden) del sistema de reaccin.
Este factor puede ser representado en forma mas precisa y
cuantitativa por la funcin termodinmica, entropa.

S* = S* - Sr S* = Entropa estado de transicin

Sr = Entropa reaccionantes

Tomando en cuenta tanto H y S, se puede definir la Energa de Activacin

como:

G = H - TS G = Energa de
Activacin
H = Calor de Activacin
S = Entropa
 E + S ES EP E + P

Teora del Estado de Transicin

Teora de la llave - cerradura . Complementariedad de la enzima con el sustrato.

Mayor afinidad de la enzima por el estado de transicin que por el o los
sustratos
Las interacciones ptimas se obtienen en el estado de transicin.
Compuestos semejantes al estado de transicin se unen varios rdenes de
magnitud mas fuerte que los sustratos.
Compuestos no relacionados qumicamente, pero que tienen en comn una
semejanza estructural, son potentes inhibidores.

La teora supone:

- La velocidad de la reaccin est determinada por la descomposicin del complejo

en el estado de transicin.
- El estado de transicin se encuentre en equilibrio con los sustratos.
Inhibicin por anlogos del Estado de Transicin. (A) La isomerizacin de l-prolina a d-prolina
por prolina racemasa, una enzima bacterial, procede a travs de un estado de transicin plano
en el cual el carbono a es trigonalal mas que tetrahedrico. (B) Pyrrole 2-carboxylate, un anlogo
del estado de transicin es un potente inhibidor por su geometra trigonal.
Sitio Activo
Enzimas

- Eficientes
Reacciones qumicas energticamente favorables
- Especficas
Un sustrato una reaccin
- Regulables
Actividad
Masa

Sitio Activo

- Es una porcin relativamente pequea de la molcula completa.

- Residuos de aminocidos participan en la unin del sustrato y
en la catlisis propiamente tal.

Aminocidos

- Unin de sustrato
- Catlisis
- Mantencin de integridad estructural
Clasificacin de las Reacciones Catalizadas por Enzimas.

1. Desplazamiento o sustitucin, donde una base o un nucleofilo

reemplaza a otro.

2. Adicin, en la cual un reactivo se agrega a un doble enlace.

3. Eliminacin, se remueve un grupo creando un doble enlace. Este

tipo es la reaccin reversa de las reacciones de adicin.
Nombre y Clasificacin de las Enzimas.

Clase 1.
Oxido-reductasas. Catalizan reacciones de oxidacin y reduccin.
Incluyen a las deshidrogenasas, oxidasas, reductasas, peroxidasas,
oxigenasas, hidrolasas, hidroxilasas y catalasas.

Clase 2.
Transferasas. Transfieren grupos qumicos de una molcula a otra, o
dentro de una molcula.
Incluyen a las amino, acil, metil, glucosil, y fosforil transferasas, quinasas,
fosfomutasas, transaldolasa y transcetolasa.

Clase 3.
Hidrolasas. Usan el agua para romper una molcula en dos molculas.
Incluyen a las esterasas, glicosidasas, peptidasas, tiolasas, fosfolipasas,
amidasas, ribonucleasas y dexoiribonucleasa.
Nombre y Clasificacin de las Enzimas.

Clase 4.
Liasas. Rompen molculas en un proceso no hidroltico, produciendo dobles
enlaces, o alternativamente, agregando grupos al doble enlace.
Incluyen a decarboxilasas, aldolasas, hidratasas, deshidratasas y sintetasas.

Clase 5.
Isomerasas. Convierten estructuras isomricas por rearreglos intramoleculares.
Incluyen a las isomerasas, transferasas intramoleculares (mutasas), y liasas
intermoleculares.

Clase 6.
Ligasas. Unen dos molculas separadas por la formacin de un nuevo enlace
qumico a expensas de la hidrlisis de ATP.
Incluyen a las enzimas que forman enlaces C-O, C-S, C-N, y C-C. Sintetasas y
ligasas.
Coenzimas.

Muchas enzimas requieren la presencia de coenzimas para llevar a cabo su actividad

cataltica. Las coenzimas pueden actuar como transportadores: aceptando o donando
grupos, tomos de hidrgeno, o electrones.

Las coenzimas se pueden agrupar en tres diferentes categoras:

1. Compuestos con grupos con alto potencial de transferencia tales como ATP y GTP,
que participan en el metabolismo energtico en las clulas.

2. Compuestos, generalmente derivados de las vitaminas, unidas en el sitio activo

que reaccionan con el sustrato alterando su estructura de ma nera que la nueva
forma del sustrato es mas reactivo y por lo tanto la reaccin ocurre mas fcilmente.

3. Coenzimas oxidativas tales como NAD, NADP, FAD, que tienen estructuras que
le permiten participar en reacciones de oxido reduccin, donde actan como
transportadores de tomos de hidrgeno o electrones.
Sitio Activo de la Lisosima
Modificacin de Aminocidos

- A nivel de protena
- A nivel gnico

Mutagnesis Sitio dirigida

- Rol de aminocidos en actividad enzimtica

- Producir enzimas con caractersticas especiales
Estudio de aminocidos del sitio activo:

- Mapeo mediante mtodos qumicos tradicionales

- Medicin de constante de unin de inhibidores y derivados
- Alteracin de estructura del sustrato
Modificacin qumica de protenas.

- Las cadenas laterales de los aminocidos reaccionan con una gran cantidad
de reactivos qumicos formando enlaces covalentes.

- Los reactivos son inespecficos y reaccionan con cualquier residuo que se

encuentre accesible.

- La modificacin puede llevar a una prdida irreversible de la actividad:

- Si se bloquea un residuo catalticamente esencial.
- Si se impide estricamente la unin del sustrato.
- Si se distorsiona la protena.
- Si se impide su movilidad.

El objetivo de la modificacin qumica de las protenas es:

- Obtener informacin respecto del mecanismo de reaccin.

- Modificar su actividad.
Modificacin de Aminocidos

Intermediario enzima-sustrato estable: Unin covalente

Estabilizar intermediario: Reduccin base de Schift
Utilizar cuasi sustratos (Sus-X)
Modificacin en presencia de sustrato o inhibidor competitivo
 100
X5
X 5o

o Contenido de Aminocido
% Actividad Remanente

X2
X 2o

X1
X1o
X4
X 4o

A
Ao
10
Tiempo de Reaccin
Desventajas de la modificacin

Inespecificidad

Condiciones de marcacin extremas

Grupos no accesibles
Inhibidores irreversibles

Dirigidos hacia el sitio activo.

El inhibidor es un compuesto qumico que se parece al sustrato de la enzima,
se une especficamente al sitio activo y forma enlaces covalente con los
residuos de la protena.

Algunas de las caractersticas de la inhibicin irreversible son:

- La velocidad de inactivacin es inhibida por inhibidores reversibles o

sustratos de la enzima.

- La velocidad de inhibicin es funcin del pH, con una curva similar a la

observada con la velocidad de una reaccin enzimtica.

- La enzima inactivada tiene 1 mol de inhibidor unido por mol de sitios activos.

- La inhibicin sigue una cintica de saturacin.

Inhibicin por Diisopropylphosphofluoridate (DIPF), un reactivo grupo-especfico. DIPF
Puede inhibir la enzima modificando covalentemente un residuo de serina clave.
Inactivacin de la enzima por Iodoacetamide, un reactivo grupo-especfico.
Iodoacetamide puede inactiva la enzima reacionando con un residuo de ciste na clave.
Marcacin por Afinidad. (A) Tosyl-l-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) es un reactivo
Anlogo al sustrato normal de la quimotripsina. (B) TPCK se une al sitio activo de la enzima
y modifica un residuo de histidina esencial.
Bromoacetol Phosphate , un marcador por afinidad de la Triosa Fosfato Isomerasa (TIM).
Bromoacetol phosphate , un anlogo de dihidroxiacetona fosfato, se une al sitio activo de
la enzima y modifica covalentemente un residuo de cido glutmico necesario para la
actividad de la enzima.
Inhibidores irreversibles

Activados por enzimas.

Hay mucho inters en la generacin de inhibidores irreversibles de enzimas por el

gran potencial teraputico que tienen. Su selectividad se logra por unin al sitio
activo de la enzima blanco.

Adems de utilizar la unin especfica a su enzima blanco, utiliza especficamente

su aparato cataltico para su activacin qumica.

Un inhibidor normalmente inocuo se convierte en un potente inhibidor irreversible.

Estos inhibidores que no son reactivos en ausencia de la enzima blanco, son

llamados inhibidores suicidas: las enzimas se suicidan al activar al inhibidor.

Un inhibidor suicida efectivo debe tener las siguientes caractersticas:

1. Debe ser no reactivo qumicamente en ausencia de la enzima.
2. Debe ser activado especficamente por su enzima blanco.
3. Debe reaccionar, en su forma activada, ms rpido con su enzima blanco que
disociarse de ella.
Inhibicin basada en el mecanismo de reaccin. Monoamino oxidasa, una enzima importante para la
Sntesis de neurotransmisor, requiere del cofactor FAD (flavin adenin dinucleotido).
N,N-Dimetilpropargilamina inhibe la monoamino oxidasa por modificacin covalente del grupo prosttico
flavina solo despus que el inhibidor es oxidado. El aducto N-5 flavina se estabiliza por la adicin de un
protn.
Mutagnesis Sitio - dirigida

- Tcnicas que cambien especficamente algn aminocido resultar en protenas con

propiedades diferentes a las de las protenas nativas, lo cual puede ser de inters en
su aplicacin industrial.

- Determinar cual aminocido debe ser cambiado para obtener el cambio deseado en
las propiedades es fcil si se conoce la estructura tridimensional de la protena
(anlisis por cristalografa de rayos X u otras tcnicas analticas).

- Para la mayora de las protenas no se dispone de esta informacin detallada, por lo

tanto la mutagnesis dirigida es una estrategia de prueba y error, en la cual se
introducen modificaciones en aquellos nucletidos que probablemente producen un
cambio en una propiedad especfica de la protena.
La mutagnesis sitio - dirigida ha sido utilizada para producir enzimas, para uso
industrial o teraputico, cuyas propiedades sean mejores que las enzimas naturales.

1. La modificacin de la Km y de la Vmax, produce un aumento de la eficiencia cataltica

(Vmax/Km).

2. Cambio de la estabilidad trmica o de pH de la enzima, permite que sta sea utilizada

en condiciones de pH y temperatura que inactivaran la forma nativa.

3. La modificacin de la reactividad de una enzima en solventes orgnicos, permite que

sta sea usada en condiciones no fisiolgicas.

4. La modificacin del sitio de unin de sustrato para aumentar su especificidad, puede

disminuir reacciones secundarias no deseadas.

5. La alteracin de la regulacin alostrica de una enzima, disminuye la inhibicin

feedback y por consiguiente aumenta la produccin de ciertos metabolitos.
Para producir la mutagnesis sitio - dirigida es necesario:

1) Saber que aminocido es el que debe ser cambiado.

2) Conocer la secuencia de nucletidos en la regin del DNA que codifica

el codn del mRNA que se desea cambiar.
Cmo se hace?

El mtodo mas comn es introducir el gen clonado en

un vector de doble hebra.

La simple hebra del vector recombinante se asla y

se mezcla con un oligonucletido sinttico.

El oligonucletido tiene, a excepcin de un

nucletido, la secuencia complementaria exacta del
segmento del gen clonado.

El nucletido cambiado coincide con el nucletido del

codn del mRNA que codifica para el aminocido que
se quiere cambiar.

El oligonucletido hibridar y el extremo 3 actuar

como primer para la sntesis de DNA.

Las molculas completas de doble hebra que

contienen, ahora, los nucletidos cambiados se
introducen a clulas de E. coli por transformacin.

Ya que el DNA se replica semiconservativamente, la

mitad de las clulas contiene el gen nativo y la otra
mitad tiene el gen mutado (con el nucletido
cambiado)
Mutagnesis sitio -dirigida de Subtilisin. Residuos de la triada cataltica fueron cambiados por Ala y se midi
la actividad de la enzima mutada. La mutacin de cualquier componente produce un dramtico cambio en la
actividad enzimtica. S: serina, H: histidina, D: Asprtico. La actividad est en escala logartmica.
 Aumento del nmero de enlaces S-S

Aminocidos
Enzima 3 9 21 54 97 142 164 N de S- Actividad T
S (%) (C)

wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9

A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7
B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3
C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9
D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6
E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9
F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3 0 65.5
 Reemplazo de un aminocido por otro

Aminocidos
Enzima 14 78 Vida Media (min)

Wt Asn Asn 13
A Asn Thr 17
B Asn Ile 16
C Thr Ile 25
D Asp Asn 11
 Tyr + ATP Tyr-A + PPi

Tyr-A + tRNATyr Tyr-tRNA + AMP

Enzima kcat (s-1) Km (mM) kcat / Km (s-1 M-1)

Thr-51 4.7 2.5 1,860

Ala-51 4.0 1.2 3,200
Pro-51 1.8 0.019 95,800
Proteasa Subtilisin.

Especificidad: X-Ala-Pro-Phe-, P4=X es un residuo hidrofbico

El principal determinante de la especificidad de esta enzima radica en el subsitio S1 el

cual es hidrofbico y une la cadena lateral del residuo P1 del sustrato.

La actividad mas alta de esta enzima es hacia un sustrato que tenga tirosina en P1,
siendo menos activa con fenilalanina, metionina y alanina.

Gly-166 se encuentra en parte de atrs de donde se une P1.

Al aumentar el tamao de la cadena lateral del residuo 166, disminuye la actividad hacia
tirosina en P1.
La actividad hacia residuos ms pequeos en P1 aumentan.
Proteasa Subtilisin.

En S4 se encuentra un residuo hidrofbico voluminoso, Ile-107. Esto permite reconocer

sustratos que tengan en P4 grupos hidrofbicos.
La velocidad cataltica es similar para cualquier residuo hidrofbico en P4.

La mutacin de Ile por Gly-107 aumenta el tamao del bolsillo.

Produce una disminucin de 200 veces en la velocidad cataltica para Ala.
Solo tiene pequeos efectos para Phe, Ile o Leu.
Las cadenas ms grandes complementan la lesin causada introduciendo una cavidad en
la protena.
Los mecanismos catalticos se pueden clasificar en:

Catlisis Acido Base

Catlisis Covalente

Catlisis por ion metlico

Catlisis Electrosttica

Catlisis por Efectos de proximidad y Orientacin

Catlisis por Unin preferente al complejo del estado de transicin

Catlisis Acida General

La transferencia parcial de un protn desde un cido de Bronsted

(especie capaz de donar un protn) baja la energa libre del estado
de transicin de la reaccin.

Catlisis Bsica General

Se aumenta la velocidad de la reaccin por la captacin de un protn

por una base de Bronsted (especie que puede combinar un protn).

Catlisis Acido-Base General

Se combinan ambos procesos.

Mecanismos de la Catlisis.
Ya que la velocidad de una reaccin es funcin de la energa libre, lo que hace un
catalizador es bajar esta barrera energtica; esto es estabilizar el estado de transicin.

Lo que hace a las enzimas poderosos catalizadores son dos propiedades relacionadas:
su especificidad de unin del sustrato combinada con una ptima orientacin de los
grupos catalticos.

1. Catlisis cido base.

La catlisis cido general es un proceso en el cual la transferencia parcial de un

protn desde un cido disminuye la energa de activacin del estado de transicin.

Tambin la reaccin se puede acelerar por la captacin de un protn por una base.

Algunas reacciones pueden estar sometidas a ambos procesos simultneamente:

catlisis cido - base general concertada.
Entre los muchos tipos de reacciones bioqumicas que son susceptibles de
catlisis cido y/o base se incluyen:

- Hidrlisis de pptidos y steres

- Reaccin de grupos fosfatos
- Adiciones al grupo carbonilo

Las cadenas laterales de los aminocidos

Glu, Asp, Lys, Arg, Cys, His, Ser,Tyr

tienen pKs en el rango de pH fisiolgico, lo cual les permite actuar como

catalizadores cido o bsicos, en analoga con los mecanismos orgnicos
conocidos.
Catlisis Acido-Base:
Reaccin catalizada por la ribonucleasa.

En el sitio activo hay dos His: His12 e

His119

La reaccin ocurre en dos etapas:

1. His12 acta como una base general,

atrae un protn desde el grupo 2 OH del
RNA, promoviendo el ataque nucleoflico
al tomo de P adyacente.
His119 acta como cido general,
promueve el rompimiento del enlace
protonando al grupo saliente.

2. El intermediario 2,3 es hidrolizado

haciendo esencialmente el camino
inverso del paso 1 en el cual el agua
reemplaza al grupo saliente. As, His12
acta como cido general e His119
como base general produciendo el RNA
hidrolizado y dejando a la enzima en su
estado original.
2. Catlisis Covalente.

Este tipo de catlisis involucra el aumento de la velocidad a travs de la formacin

(transiente) de un enlace covalente entre el catalizador y el sustrato.

La catlisis covalente conceptualmente se puede descomponer en tres etapas:

1. Reaccin nucleoflica entre el catalizador y el sustrato para formar el enlace

covalente.

2. El retiro de los electrones desde el centro de reaccin.

3. La eliminacin del catalizador, una reaccin esencialmente inversa a la etapa 1.

Mientras mas estable sea el enlace covalente formado, se descompone menos
fcilmente en las ltimas etapas de la reaccin.

Un buen catalizador covalente debe combinar dos propiedades aparentemente

contradictorias:

- Una alta nucleofilicidad y

- La capacidad de formar un buen grupo saliente,

es decir, que la formacin del enlace covalente sea fcilmente reversible.

La nucleofilicidad de una sustancia est estrechamente relacionada con su

basicidad.

Si la formacin el enlace covalente es la etapa limitante de la reaccin catalizada

covalentemente, la velocidad de reaccin tiende a aumentar con la basicidad del
catalizador.
Decarboxilacin de acetoacetato catalizado qumicamente por aminas primarias.
La amina ataca nucleoflicamente el grupo carbonilo del acetoacetato para formar una
base de Schiff (enlace imino).
El tomo de nitrgeno protonado del intermediario covalente acta como un resumidero
de electrones, reduciendo la alta energa que de otra forma tiene el enolato en el estado
de transicin.
Catlisis Covalente

- Ser195 ataca nucleoflicamente el grupo

carbonilo del enlace peptdico que se va a
romper, formando un complejo conocido como
intermediario tetrahdrico.

- Estudios de rayos X muestran que Ser 195 est

en una posicin ideal para llevar a cabo este
ataque (proximidad y orientacin)

- El anillo imidazol de His57 capta el protn

liberado, formando un ion imidazolium (catlisis
general bsica).

- Este proceso es facilitado por el efecto

polarizante carboxilato del Asp102, el cual forma
un enlace de H con His57 (catlisis
electrosttica).

- Si se cambia Asp102 por Asn, no cambia Km

pero la kcat se reduce a menos del 0,05% de su
valor original.

- El intermediario tetrahdrico se descompone al

intermediario acil-enzima dirigido por la cesin de
un protn de N3 de His57 (catlisis general
cida).
El intermediario acil-enzima es
deacilado por reacciones
reversas de los pasos anteriores.
3. Catlisis por iones metlicos.
De acuerdo a la fuerza con que se une el metal, las enzimas se clasifican en:

Metaloenzimas. El ion metlico se encuentra unido fuertemente y son iones

tales como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, o Co2+.

Enzimas activadas por metales. Unen metal libremente de la solucin y son

del tipo Na+, K+, Mg2+ o Ca2+.

Los iones metlicos participan en el proceso cataltico principalmente de tres

maneras:

- Unindose al sustrato de manera de orientarlo apropiadamente.

- Mediando reacciones de oxido-reduccin a travs de cambios reversibles
en el estado de oxidacin del ion metlico.
- Estabilizando o enmascarando electrostticamente cargas negativas.
4. Catlisis electrosttica.

La unin del sustrato generalmente excluye al agua del sitio activo.

La constante dielctrica local se parece a un solvente orgnico,
donde las interacciones electrostticas son mucho mas fuertes
que en solucin acuosa.
5. Catlisis a travs de efectos de proximidad y orientacin.

Aunque las enzimas utilizan mecanismos que se parecen a reacciones orgnicas

modelos, ellas son catalticamente mas eficientes que esos modelos.

Esta eficiencia puede surgir de condiciones fsicas especficas en el sitio cataltico

de la enzima que promueve la reaccin qumica correspondiente.

Los efectos mas obvios son:

- Proximidad
- Orientacin

Los reaccionantes deben estar juntos y en la disposicin espacial correcta para que
ocurra la reaccin.
Efectos de Proximidad y Orientacin.
Reacciones con cada vez menos grados de libertad.
 Ataque de un cido carboxlico sobre un ster en un anillo aromtico.

Si ambos grupos estn en la misma molcula, es decir R1 y R2 se encuentran juntos.

(Ar = methoxyphenyl group.)
Efectos de Proximidad y Orientacin.
Efectos de Proximidad y Orientacin.

OH O O
+ H2O

COOH

OH
COOH

CH3 CH3 CH3

B
6. Catlisis por unin preferente al estado de transicin.

El aumento de la velocidad enzimtica es a menudo mucho mayor que lo que

pueden explicar los mecanismos descritos.

El factor mas importante de la catlisis enzimtica es la unin al estado de

transicin con mayor afinidad que los correspondientes sustratos y productos.

La unin al estado de transicin produce una tensin a sus sustratos para que
adopten la geometra de ste en un sitio donde no encaja el sustrato no
distorsionado.

Esto se basa en las evidencias que existen respecto del rol de la tensin en
reacciones orgnicas.
El reactivo tensado se parece mas al estado de transicin de la reaccin que
el correspondiente reactivo no tensado.

Si una enzima une preferentemente su estado de transicin, anlogos de ste

se comportan como potentes inhibidores de la enzima.
Inhibidor anlogo al estado de transicin
En resumen, las enzimas ejercen su poder cataltico:

1. Manteniendo los sustratos juntos y en la orientacin adecuada.

2. Proveyendo los grupos cidos y bsicos en la orientacin apropiada

para promover la transferencia de protones dentro del sustrato.

3. Los grupos en la enzima (especialmente los grupos nucleoflicos)

pueden formar enlaces covalentes con el sustrato para formar
estructuras que son mas reactivas que las originales.

4. La enzima es capaz de introducir torsin en los sustratos, quizs

acompaada con cambios conformacionales de la protena.
Inmunoglobulinas o Anticuerpos:

Protenas grandes (150.000 daltons),

Formadas por cuatro cadenas polipeptdicas:
dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas
Contienen regiones variables
Altamente especficos
Anticuerpos Catalticos: Abzymes

Aprovechando la gran especificidad de unin por el antgeno que tienen los

anticuerpos, se han desarrollado estrategias experimentales para producir
anticuerpos que catalizan reacciones qumicas.

Estos anticuerpos catalticos, o abzymes, se seleccionan desde

anticuerpos monoclonales generados por inmunizacin de ratones con
haptenos que semejan el estado de transicin de la reaccin catalizada por
la enzima.
Estrategias para generar anticuerpos con actividad cataltica:

i) Usar los anticuerpos para estabilizar estados de transicin,

ii) Usar anticuerpos como trampas entrpicas,
iii) Generar anticuerpos con grupos catalticos o cofactores.
Por ejemplo, abzyme 28B4 cataliza la oxidacin por periodato de p-nitrotoluen-metil sulfuro
a sulfoxido, donde los electrones del tomo de S se transfieren al oxigeno.

La velocidad de esta reaccin es acelerada por enzimas que estabilizan el estado de

transicin de la reaccin.

Para generar abzymes complementarias en estructura al estado de transicin, los

ratones son inmunizados con un hapteno cuya estructura es un espejo de la estructura
y propiedades electrostticas del estado de transicin.

De los anticuerpos monoclonales generados con este hapteno, se encontraron muchos

que catalizan la oxidacin del sulfuro, pero con un rango de afinidad de unin y
eficiencia cataltica muy amplio.

Abzyme 28B4 une el hapteno con alta afinidad (Kd = 52 nM) y tiene una alta eficiencia
cataltica (k3/KM = 190,000 M-1s-1).
 Las enzimas aumentan la velocidad de una reaccin qumica
a travs de mecanismos catalticos concertados:

- Efectos de proximidad y orientacin,

- Catlisis covalente
- Catlisis cido-base general.

Introduccin de Grupos Catalticos:

- Introduciendo modificaciones al antgeno es posible generar grupos

catalticos en los sitios de unin del anticuerpo.

- Uso de la mutagnesis sitio dirigida. Es posible introducir aminocidos

especficos para aumentar la capacidad cataltica del anticuerpo.

- Modificacin qumica
Las enzimas inmovilizadas pueden ser clasificadas en las siguientes
cuatro categoras:

i) Absorbidas fuertemente a soportes insolubles

ii) Unidas covalentemente a un soporte slido
iii) Atrapadas en una matriz (geles)
iv) Microencapsuladas.
Unin a un soporte slido: la enzima se une a un soporte insoluble.

- Adsorcin fsica
- Unin inica
- Unin covalente

Enzimas atrapadas en matriz: se incorpora la enzima

en la trama de un gel semipermeable o se encierra
la enzima en una membrana semipermeable.

Entrecruzamiento de molculas de enzimas por reactivos bi o

multifuncionales.
Adsorcin Fsica

Este mtodo se basa en la adsorcin fsica de la enzima sobre la superficie de un

soporte insoluble. Por eso, el mtodo provoca poco o ningn cambio conformacional de
la enzima o destruccin de su sitio activo. Si se encuentra el soporte adecuado, este
mtodo es simple y econmico.

Desventaja: La enzima adsorbida se puede soltar durante su uso debido a lo dbil que
son los enlaces de unin entre la enzima y el soporte.
Debido a los enlaces dbiles involucrados, la desorcin de la protena es provocada
por cambios de temperatura, pH, fuerza inica o an la presencia de sustrato.

Ventajas: Generalmente no requiere de reactivos y slo de un mnimo de

etapas de activacin.
La adsorcin tiende a ser menos disruptiva de la enzima que los medios qumicos de
unin ya que la unin es principalmente por enlaces de hidrgeno, enlaces
electrostticos, etc .
El mtodo de la unin inica se basa en la interaccin inica de la enzima con grupos
de intercambio inico en el soporte insoluble.

Polisacridos y polmeros sintticos que tienen grupos de intercambio inico son los mas
usados como soportes.

La unin se lleva a cabo fcilmente y las condiciones son mucho mas suaves que las
necesarias para la unin covalente.

Este mtodo de unin provoca pocos cambios en la conformacin y sitio activo de la

enzima.

Las enzimas inmovilizadas con este mtodo tienen alta actividad.

La enzima se puede soltar desde el soporte en condiciones de alta fuerza inica o

variaciones de pH, porque las fuerzas de unin entre las protenas y el soporte son
dbiles.

La principal diferencia entre la unin inica y adsorcin fsica es que la unin de la

enzima al soporte es mucho mas fuerte en la unin inica aunque mas dbil que la
unin covalente.
La unin covalente se basa en la unin de la enzima a soportes insolubles a travs de
enlaces covalentes.
Los grupos funcionales que pueden participar de esta unin son:

Amino, Carboxilo, Sulfidrilo, Hidroxilo, Imidazol, Fenlico, Tiol, Treonina, Indol

- Las condiciones de inmovilizacin por enlaces covalentes son mucho mas complejas y
mas drsticas que en el caso de la adsorcin fsica y unin inica.
- La unin covalente puede alterar la conformacin y sitio activo de la enzima, resultando
en una mayor prdida de la actividad y/o cambios de afinidad por el sustrato.
- La unin entre la enzima y el soporte es tan fuerte que la enzima no se suelta an en
presencia de sustrato o de soluciones de alta fuerza inica.
 Aminocido Grupo N Reacciones Porcentaje

Lisina -amino 27 7,0

Cistena Sulfihidrilo 31 3,4
Asprtico Carboxilo 4 4,8
Glutmico Carboxilo 4 4,8
Tirosina Fenol 16 3,4
Arginina Guanidinio 6 3,8
Histidina Imidazol 13 2,2
Triptofano Indol 7 1,2
Metionina Tioester 7 1,6
Serina Hidroxilo 0 7,8
Metionina Hidroxilo 7 1,6
Inmovilizacin en diferentes soportes slidos.

Al momento de seleccionar el soporte es importante considerar los

siguientes factores:

1. Propiedades mecnicas: rigidez y durabilidad.

2. Forma fsica: grnulos, lminas, pared interna de un tubo.

3. Resistencia a ataque qumico o microbiano.

4. Hidrofilicidad, manifestada por la capacidad de incorporar agua en su estructura.

5. Permeabilidad.

6. Capacidad para ser derivatizada sin modificar sus caractersticas.

7. Precio y disponibilidad.
 Reactor Tanque con agitacin

Un reactor en un tanque con agitacin es el tipo mas simple

de reactor. Se compone de un reactor y de un mezclador, agitador.

Este reactor es til para soluciones de sustratos de alta viscosidad

y para enzimas inmovilizadas con relativamente baja actividad.

Sin embargo, las enzimas Inmovilizadas tienden a inactivarse con la

agitacin. Este sistema es utilizable para la produccin de pequeas
cantidades de reactivos.

Una modificacin es un reactor en tanque continuo con agitacin,

el cual es mas eficiente que el anterior, pero el equipamiento es
levemente mas complicada.
Reactor en columna

Son los reactores mas ampliamente usado para las enzimas inmovilizadas.
Se debe considerar la velocidad de flujo y el efecto de las dimensiones de la
columna en la velocidad de la reaccin.

Este tipo de reactores puede ser del tipo:

1. Flujo hacia abajo
2. Flujo hacia arriba
3. Reciclaje
Hidrlisis de Lactosa: Una importante aplicacin de las enzimas inmovilizadas

El objetivo es convertir el disacrido lactosa, va hidrlisis, en sus componentes: glucosa y galactosa.

Lactosa est normalmente en la leche humana y de vaca y es muy usada en frmulas lcteas infantiles.
Un gran problema con la lactosa es que muchas personas son intolerantes a la lactosa, es decir el
organismo es incapaz de digerirla.

Se estima que anualmente se acumulan 1.2 millones de toneladas de lactosa por el procesamiento
de la leche para producir diversos productos lcteos, como en el suero generado en la elaboracin
de quesos.
La conversin de lactosa en glucosa y galactosa representa una manera de agregar valor al suero y
sus productos. Para la hidrlisis enzimtica de la lactosa se han descrito varias -glicosidasas,
alguna de las cuales ya se encuentran en el mercado.
Independiente de la tcnica utilizada para generar un sistema de
enzima inmovilizada, es importante tener en cuenta lo siguiente:

a) Enzima cargada
b) Comportamiento cintico
c) Estabilidad
d) Configuracin del reactor.

Aplicaciones.

- Estudios Bioqumicos.
- Biotecnologa.