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MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA

ANO LECTIVO 2010/2011

Avaliao da amplificao do gene HER2,


determinada por FISH e SISH, em casos
com score 0/1+ por imunohistoqumica

Carlos Alberto da Silva Lopes Joo Filipe Cruz Correia Pinto


Professor Catedrtico ICBAS Universidade do Porto
ICBAS Universidade do Porto joao.pinto@live.com.pt
calopes@icbas.up.pt
Abstract: HER2 is an important tumor marker in breast cancer management and it is essential that
clinical assays have the ability to correctly determine HER2 amplification status. A new method,
silver in situ hybridization (SISH), combines the accuracy of fluorescence in situ hybridization
(FISH) with the use of light opaque silver, instead of fluorescent spot-like signals, thus allowing the
use of ordinary light microscopy, which enables pathologists to evaluate slides within the context of
tissue morphology. This study evaluates the frequency of amplification of HER2, with SISH and
FISH assays, in 74 cases whose score from immunohistochemistry (IHC) was considered negative
(score 0 or 1+). Furthermore, the overall concordance between FISH and SISH was also evaluated.
All 74 cases (100%) were reported as non-amplified with SISH using the American Society of
Clinical Oncology/College of American Pathologists (ASCO/CAP) guidelines. The concordance
between the two in situ hybridization assays was evaluated in 15 cases and the overall agreement
was 100%, as the 15 cases were reported as non-amplified with both techniques. In conclusion, IHC
has a low rate of false negative cases and should remain as a first-line test for screening of HER2
status in breast cancer. SISH is a novel approach for the determination of HER2 status with an
excellent concordance with FISH, suggesting it is equally reliable. Because SISH combines bright
field microscopy with molecular analysis and full automation, it appears to be particularly suited for
routine application in Pathology.

Palavras-chave: HER2, silver in situ hybridization, SISH, fluorescence in situ hybridization, FISH,
breast carcinoma, immunohistochemistry

Introduo (Schechter et al., 1984; Harari et al., 2000).


A amplificao do gene HER2 encontrada
O cancro da mama a segunda causa em 15% a 20% dos carcinomas invasivos da
oncolgica de morte em mulheres na Europa, mama em mulheres, segundo Slamon et al.
com aproximadamente 421 000 novos casos (1989), e correlaciona-se clinicamente com
desta neoplasia maligna diagnosticados em um comportamento mais agressivo da
cada ano e 129 000 mortes anuais causadas neoplasia: metastizao precoce (Makar et al.,
por esta doena (Ferlay et al. 2010). Em 1990; Tiwari et al. 1992), maior mortalidade
Portugal, estima-se que sejam diagnosticados (Seshadri et al., 1994), progresso mais rpida
4500 novos casos todos os anos com uma e maior risco de recidiva (Descotes et al.,
mortalidade anual de 1500 pessoas. 1993; Slamon et al., 1994). Segundo
Zeillinger et al. (1989), a amplificao do
Apenas cerca de metade dos casos so gene HER2 correlaciona-se ainda com nveis
curados por tratamento local segundo reduzidos de receptores de estrognio e
observaes de McGuire (1987) e, portanto, a progesterona e actividade proliferativa
existncia de indicadores que sugerem um significativamente aumentada. Determinar o
comportamento mais agressivo da neoplasia status de HER2 de grande importncia na
de grande importncia na abordagem destes previso da resposta quimioterapia com
doentes. O proto-oncogene ERBB2 (HER2), antraciclinas e ao tratamento com anticorpo
localizado no CHR17q21, codifica um monoclonal humanizado, trastuzumab
receptor transmembranar da tirosina cinase, (Herceptin), uma teraputica dirigida ao
estrutural e funcionalmente semelhante ao alvo, que inibe a actividade da tirosina cinase
receptor do factor de crescimento epidrmico, (Baselga et al., 1998; Konecny e Slamon,
envolvido na traduo de sinais para o 2002). Alm disso, os custos desta teraputica
crescimento e desenvolvimento celular anti-HER2 esto estimados entre 25000 e
35000. Portanto, essencial que mtodos Material e Mtodos
precisos, fiveis e reprodutveis sejam usados
para a determinao do status de HER2 em Setenta e quatro casos de carcinoma
doentes com cancro da mama. invasivo da mama, com status de HER2 de
score 0 e 1+ na IHQ, diagnosticados entre os
Na prtica clnica corrente, so usadas anos de 2009 e 2010 no Hospital de Santo
duas metodologias para avaliar o status de Antnio foram seleccionados para este
HER2: imunohistoqumica (IHQ) para estudo. Os blocos de parafina avaliados eram
detectar sobre-expresso da protena p185 e resultantes de produtos de microbipsia,
hibridizao in situ por fluorescncia (FISH) mastectomia ou tumorectomia. Foi realizada
para avaliar a amplificao do gene HER2. A uma reviso das lminas de hematoxilina e
IHQ fcil de realizar e relativamente pouco eosina (H&E) por um nico patologista. Os
dispendiosa; utilizada como um primeiro diagnsticos e caractersticas do tumor esto
teste para detectar casos de status de HER2 descritas na Tabela 1.
negativo (Score 0 e 1+) e fortemente positivo Todos os intervalos de confiana
(Score 3+ , expresso intensa em mais de descritos so Intervalos de Confiana de
30% das clulas). A tcnica de FISH Wilson a 95% (2-sided)
actualmente aceite como a referncia para a O estudo foi aprovado pela Comisso
avaliao do status de HER2, mas por ser de tica do Hospital de Santo Antnio.
uma tcnica laboriosa utilizada em 2 linha
nos casos em que o resultado por IHQ Tabela I. Caractersticas clinicopatolgicas da
borderline (Score 2+, moderadamente amostra do estudo
positivo), por ser uma tcnica mais fivel. Por Dados Clinicopatolgicos Numero de doentes
ser uma tcnica dficil, dispendiosa e que Histologia
requer profissionais e equipamento CDIS 5
especializados, no est prontamente Ductal invasivo 57
disponvel na grande maioria dos laboratrios. Lobular invasivo 7
Tubular 1
Ductal/Lobular (misto) 2
A tcnica de hibridizao in situ por Neuroendcrino 1
prata (SISH) um mtodo disponvel Cribriforme 1
recentemente, baseado na metalografia Classificao pT
enzimtica e deposio de prata, que permite PTis 5
pT1 32
a quantificao dos sinais especficos de pT2 22
HER2 recorrendo a um micrscopio pT3 4
convencional de fundo claro, a que todos os pT4 8
histopatologistas esto familiarizados, ao N/D 3
invs de um microscpio de fluorescncia Classificao pN
pN0 36
como utilizado com a tcnica FISH. Alm pN1 20
disso um mtodo que se pode automatizar, o pN2 1
que garante a consistncia de resultados e pN3 4
permite a avaliao da amplificao de HER2 N/D 13
ao fim de 6 horas. Grau Histolgico
G1 8
G2 44
Os objectivos deste trabalho so: G3 22
1) Avaliar a frequncia de amplificao de
HER2 em casos classificados por IHQ com Mdia Idade (DP) 60,4 (14,1)
score 0 e 1+ ; Tipo de Produto
Microbipsia 44
2) Avaliar a concordncia entre as tcnicas de Tumorectomia 17
FISH e SISH na amplificao do gene HER2 Mastectomia 13
no carcinoma invasivo da mama. Localizao Patologia
Mama direita 32
Mama esquerda 42
FISH

Para a realizao da tcnica de FISH,


foram realizados cortes de 4 m dos mesmos
blocos de parafina usados em IHQ e SISH. A
montagem foi feita em lminas SuperFrost
Plus. Foi usado o sistema automtico para
hibridizao in situ Ventana Benchmark
Staining System com sonda INFORMTM
HER2. Procedeu-se digesto com protease 3
durante 40 minutos a 37C. As sondas foram
hibridizadas durante 16 horas a 60-90C. O Figura 1. Esquema ilustrativo do princpio bsico da
contraste nuclear foi realizado com soluo de hibridizao in situ por prata. Deteco da sonda com
iodeto de propdeo (Vectashield Mounting um anticorpo primrio anti-hapteno, seguido de um
Medium). anticorpo secundrio marcado com uma peroxidase. A
deposio de prata metlica no alvo ocorre por
catalizao enzimtica a partir de uma soluo de
acetato de prata (Imagem original em trabalho de
SISH Powell et al, 2007).

A tcnica de SISH foi realizada no


IPATIMUP, aps envio dos blocos de parafina
dos casos seleccionados, utilizando o sistema
informtico BenchMark XT e a sonda A interpretao dos resultados segue
INFORMTM HER2 SISH marcada com os seguintes critrios (Guidelines ASCO/CAP,
dinitrofenol, comercializados pela Ventana 2007) aps contagem de no mnimo 40
Medical Systems. A incubao da sonda ncleos de clulas neoplsicas, em pelo
HER2 foi feita com desnaturao a 95C menos 2 reas distintas da neoplasia invasiva:
durante 12 minutos, seguida de hibridizao < 4 cpias do gene HER2 ausncia de
durante 6 horas a 52C com posterior lavagem amplificao (negativo); 4 a 6 cpias do gene
adstringente com 2X SSC a 72C (trs HER2 borderline; > 6 cpias do gene HER2
lavagens). As sondas foram depois incubadas amplificao (positivo). Quando da
com o anticorpo anti-DNP durante 20 minutos utilizao de dupla marcao com o
a 37C. A metalografia enzimtica realizada cromossoma 17, os critrios utilizados so os
com a subsequente adio de Silver A (acetato seguintes: rcio HER2:Cr17 < 1,8 ausncia
de prata), Silver B (hidroquinona) e Silver C de amplificao (negativo); rcio HER2:Cr17
(perxido de hidrognio). A reduo dos ies entre 1,8 e 2,2 borderline; rcio HER2:Cr17
de prata realizada pela hidroquinona. A > 2,2 amplificao (positivo).
prata precipitada deposita-se no ncleo,
visualizando-se assim uma cpia do gene
HER2 como um ponto negro (Figura 1)
Resultados

A deteco do nmero de cpias do Os doentes da amostra seleccionada


gene HER2/neu feita pela tcnica tm uma mdia de idade de 60,4 anos. 44 dos
automatizada de SISH, com controlos casos seleccionados (59,4%) resultam de
positivos (carcinoma da mama com produtos de microbipsia, 17 de
amplificao do gene HER2) e negativos tumorectomia (23,0%) e 13 peas de
(controlo interno do parnquima normal mastectomia (17,6%); destes, 32 provm de
adjacente e/ou clulas linfides patologia da mama direita (43,2%) e 42
perineoplsicas) a atestarem a fidelidade das localizam-se na mama esquerda (56,8%)
reaces. [Tabela 1]. As caractersticas
clinicopatolgicas da amostra esto descritas
na Tabela 1.
identificao morfolgica de biomarcadores
Dos 74 casos includos neste estudo, o em tecidos, para aplicao de teraputicas
resultado da avaliao por IHQ foi: score 0 dirigidas ao alvo uma ferramenta importante
em 43 casos e score 1+ em 31. Em todos na medicina, em crescente evoluo, que leva
estes, a aplicao da tcnica de SISH a um tratamento cada vez mais personalizado.
demonstrou ausncia de amplificao do gene Este estudo procura determinar a proporo
HER2 (100% casos negativos, com Intervalo de casos falsos negativos do mtodo usado na
de Confiana 95,1 - 100 a 95%) [Tabela 2]. rotina diria, bem como comparar a nova
metodologia SISH, com o gold-standard
imperfeito, FISH.
Comparao entre HER2 SISH e HER2 FISH
Actualmente, os mtodos mais
Dos 15 casos que foram submetidos frequentemente utilizados neste contexto so
simultaneamente anlise de amplificao a IHQ, para detectar sobre-expresso da
por FISH e SISH, todos revelaram ausncia protena na membrana celular das clulas
de amplificao do gene HER2 (79,6% neoplsicas, de FISH, para detectar
100% com Intervalo de Confiana 95%) amplificao do gene HER2. A deteco da
[Tabela 2 e 3]. protena HER2 por IHQ pode ser afectada por
vrios factores, incluindo fenmenos de
autlise, variaes na fixao, variedade de
sensibilidade dos reagentes, que condicionam
resultados falso-positivos e falso-negativos e
Tabela II. Relao entre imunohistoqumica HER2
variabilidade inter e intra-observador na
(IHQ), hibridizao in situ por prata (SISH) e
hibridizao in situ por fluorescncia (FISH). interpretao da intensidade da colorao. O
ensaio FISH mais dispendioso (40 a 50
IHQ SISH+ / n FISH+ / n por cada ensaio, contra os cerca de 7 que so
casos casos gastos em cada marcao por IHQ), laborioso
0 0 / 43 0 / 12 e requer equipamento e profissionais
1+ 0 / 31 0/3 especializados, tornando o seu uso pouco
Total 0 / 74 0 / 15 prtico como teste de primeira linha. De
facto, este teste actualmente utilizado
quando o resultado por IHQ duvidoso,
sendo ento necessrio clarificar o status a
Tabela III. Resultado da avaliao do status HER2, nvel genmico. Contudo esta abordagem
simultaneamente por tcnica de FISH e SISH. consome tempo. Apesar dos maiores gastos,
as tcnicas de hibridizao in situ so
FISH consideradas vantajosas por serem bastante
Com Sem
SISH mais fiveis na determinao do status HER2,
amplificao amplificao
algo de extrema importncia clnica. Por
Com
0 0 apresentarem melhores resultados, mtodos
amplificao
Sem de hibridizao in situ (ISH) de campo claro
0 15
amplificao foram desenvolvidos, permitindo a deteco
de cpias de genes usando um micrscopio de
fundo claro convencional, permitindo
teoricamente que esta avaliao faa parte do
Discusso trabalho dirio do patologista, como sendo
mais uma lmina para observar juntamente
Um mtodo rpido, preciso e com as convencionais em H&E. Estudos
reprodutvel, para determinar o status de anteriores verificaram boa correlao entre
HER2 essencial na identificao dos tcnicas de ISH cromognico (CISH) e FISH.
doentes com cancro, candidatos a tratamento Um trabalho por Hanna e Kwok (2006),
com anticorpo monoclonal trastuzumab. A revelou que a concordncia entre estas duas
tcnicas de ISH era de 97% e 98%, nos SISH de 96% nos 99 casos estudados;
grupos com score 0/1+ e 3+, respectivamente. Papouchado et al. (2010), descreve uma
Contudo, a tcnica CISH no foi bem aceite concordncia de 95% entre as tcnicas,
para a rotina de trabalho por ser uma tcnica utilizadando os mesmos critrios ASCO/CAP
demorada e ser necessrio o processamento usados no presente estudo. Neste trabalho de
manual. Papouchado et al., que utilizou uma amostra
maior, tambm possvel verificar que 94,7%
Neste trabalho, foi adoptada a recente (82,7-98,5% com IC 95%) dos casos
tcnica SISH, que ultrapassa muitas das classificados como amplificados por FISH,
desvantagens j discutidas e o nico mtodo so igualmente classificados com a tcnica de
de ISH de campo claro cujo processamento SISH.
completamente automtico.
Assim, deve a IHQ continuar a ser
O primeiro objectivo era determinar a usada como teste de primeira linha, relegando
proporo de falsos negativos da IHQ, por se as tcnicas de ISH para casos com score 2+?
tratar de uma tcnica algo subjectiva. Neste Nenhum teste para o status de HER2
estudo, os 74 casos considerados negativos perfeito, pelo que a resposta depende do nvel
pela IHQ, revelaram ausncia de amplificao de incerteza que se est disposto a aceitar.
pela tcnica de SISH. A amostra estudada Como j discutido, se uma proporo de 2 a
pequena, o que poder ser um vis de 8% de casos falsos negativos for aceitvel, as
amostragem, mas observaes de Sauter et al. guidelines actuais devem-se manter. Por outro
(2009), 2-8% dos carcinomas da mama que lado, se se pretender diminuir o nmero de
imunohistoquimicamente so classificados falsos negativos para menos de 1%, isto
como 0/1+ so, na verdade, falsos negativos e implica o uso de tcnicas de ISH como teste
respondem a teraputica com trastuzumab. Se de primeira linha. Um estudo recente de
uma proporo de falsos negativos desta Dendukuri et al. (2007), revela que a
ordem for considerada aceitvel, ento a estratgia com melhor custo-eficcia a
tcnica de IHQ adequada como um teste aplicao de IHQ como screening, em casos
primrio, numa abordagem inicial, pelo seu diagnosticados de carcinoma da mama, com
baixo custo (cerca de 7, por oposio aos aplicao de tcnicas de ISH, quando o score
40 a 60 das diferentes tcnicas de ISH), 2+ ou 3+, algo que tambm apoiado por
fiabilidade e boa caracterizao de grande Cuadros et al. (2009), devido discrepncia
parte dos casos. IHQ-ISH nestes casos. Isto permitiria a
diminuio de casos falso-positivos, evitando
Como segundo objectivo, comparou- assim toxicidade miocrdica (e outros efeitos
se os resultados de FISH e SISH nos mesmos laterais) da teraputica anti-HER2, bem como
casos de score negativo por IHQ. Um dos pr- gastos elevados num tratamento que no seria
requisitos para que esta nova tcnica seja benfico. Alm disso, dados descritos por
globalmente aceite, passa por ter uma elevada Arnould et al. (2007), indicam que o nvel de
concordncia com o gold-standard actual, amplificao do gene HER2 poder estar
FISH. Nos 15 casos que foram avaliadas correlacionado com a taxa de resposta
simultaneamente por FISH e SISH, todos completa teraputica com transtuzumab.
foram classificados com ausncia de Com isto, de equacionar a aplicao da
amplificao por ambas as tcnicas. Perante tcnica de SISH em casos de score 3+, para
uma proporo baixa de falsos negativos de avaliar a magnitude da amplificao e melhor
IHQ, como descrito na literatura, este prever a resposta referida teraputica anti-
resultado no surpreende perante uma HER2.
amostra muito pequena. Contudo, um bom
indicador, que revela excelente concordncia Resumindo, este trabalho demonstra
entre as tcnicas tal como havia sido apontado que IHQ dever continuar a ser o teste de
noutros estudos semelhantes: Dietel et al. primeira linha na avaliao do status HER2.
(2007) relata uma concordncia entre FISH e Os resultados com tcnica SISH so
semelhantes aos do gold-standard FISH, com carcinoma according to the guidelines of the American
Society of Clinical Oncology and the College of American
a vantagem de ser apenas necessrio um Pathologists. Virchows Arch 2007; 451:19-25
comum microscpio de luz. Este mtodo
permite facilitar e acelerar o diagnstico Ferlay J, Shin H, Bray F, et al. Estimates of worldwide
burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer
contribuindo para a evoluo deste processo 2010; 127:2893-2917
nesta rea da Patologia.
Hanna WM, Kwok K. Chromogenic in-situ hybridization: a
viable alternative to fluorescence in-situ hybridization in the
HER2 testing algorithm. Mod Pathol. 2006; 19:481e7
Agradecimentos
Harari D, Yarden Y. Molecular mechanisms underlying
ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene.
Ao Prof.Dr. Carlos Lopes, por me ter 2000;19:61026114.
proposto este desafio, concedendo-me todo o
Konecny G, Slamon DJ. HER2 testing and correlation with
apoio, disponibilidade e colaborao na efficacy of trastuzumab therapy. Oncology (Huntingt).
realizao deste trabalho. 2002;16:1576-1578

Makar AP, Desmedt EJ, DePotter CR, et al. Neu (c-erbB-2)


Ao Prof.Dr. Fernando Schmitt, do IPATIMUP, oncogene in breast cancer and its possible association with
pela anlise de todos os casos submetidos a the risk of distant metastases. A retrospective study and
SISH e por ceder a metodologia aplicada. review of literature. Acta Oncol. 1990; 29:931

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