PRACTICA 2

ENZIMAS (Cintica Enzimtica)

INTRODUCCION
Todos los organismos vivos dependen de las enzimas para el
desempeo normal de sus actividades; por lo tanto, es necesario conocer cmo
trabajan las enzimas. El rasgo cintico ms importante que distingue a las
enzimas de las reacciones no catalizadas es que ellas muestran saturacin.
Como ya hemos visto en la parte terica, casi todas las reacciones catalizadas
por enzimas muestran una tasa de velocidad de primer orden con respecto al
sustrato a bajas concentraciones, pero en vez de incrementar su velocidad
indefinidamente, como la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad se
aproxima a un lmite, en el cual ya no depende de la concentracin de sustrato
y, por lo tanto, la reaccin llega a ser de cero orden con respecto al sustrato.
Tengamos en cuenta que las enzimas son protenas que tienen la
capacidad de acelerar la transformacin de sustrato en producto, sin modificar
el valor de la constante de equilibrio de la reaccin. Actan en condiciones
compatibles con la vida y su accin especfica es disminuir la energa de
activacin necesaria para que ocurra la reaccin.
Algunas enzimas dependen solo de su estructura proteica para su
actividad ; en cambio hay otras que adems del componente proteico requiere
de otros ( grupo prosttico, coenzima) para poder mostrar su actividad
cataltica, participando estos cofactores directamente en el curso de la
reaccin.
La actividad de una enzima (velocidad de la reaccin enzimtica) se
determina cuantificando el sustrato consumido o el producto formado durante
cierto tiempo. La concentracin de sustrato utilizada para estudios cinticos
debe ser como mnimo igual a 10 Kms para garantizar quien el proceso ocurra
en condiciones adecuadas para medir la velocidad (velocidad inicial).

Parmetro usados en la medida de la actividad enzimtica

Unidades Internacionales.- Es la cantidad de la enzima que cataliza la
formacin de un micromol de producto o la transformacin de un
micromol de sustrato por minuto en condiciones definidas de
temperatura y pH. En ocasiones la enzima est presente en una
solucin impura y la actividad puede referirse como unidades de
actividad por mililitro o litro.
Actividad Especfica.- Es el nmero de unidades de actividad enzimtica
por miligramo de protena. Este proceso resulta muy til para el
monitoraje del proceso de purificacin de una enzima ya que debe ir
aumentando conforme avanza el proceso de purificacin
Factores que modifican la velocidad de las reacciones enzimticas
Estudiar la cintica de una enzima corresponde a verificar el
efecto que tienen diversos factores sobre la reaccin que cataliza dicha
enzima. En este sentido, la concentracin de sustrato, la temperatura, el pH y
la concentracin de la enzima son los factores ms estudiados.
La velocidad de una reaccin enzimtica se incrementa conforme
aumenta la concentracin del sustrato hasta alcanzar cierta velocidad
(velocidad mxima), la misma que ya no puede ser superada por ms que se
siga aumentando la concentracin del sustrato. Debemos entender que en esta
situacin todos los centros activos de la enzima estn ocupados por las
molculas del sustrato y esto explica porque al hacer el grfico que relaciona la
concentracin del sustrato con la velocidad de la reaccin enzimtica se
obtenga en la mayora de casos una hiprbola rectangular.
Existe una concentracin de sustrato con la cual se alcanza la
mitad de la velocidad mxima y es denominada comla constante de Michaelis-
Menten (Km), su determinacin resulta muy importante ya que es una medida
de la afinidad de le enzima por el sustrato. Cuando existe gran afinidad de la
enzima por el sustrato la Km es pequea; en tanto que cuando la afinidad es
pobre, la Km alcanza valores altos. Esto se explica en razn a que en el primer
caso la mitad de los centros activos de la enzima se ocuparon por el sustrato
con una concentracin relativamente pequea de este; en cambio en el
segundo caso se requiere de concentraciones mayores para ocupar la mitad de
dichos centros activos.
Se entiende que conociendo la Km de una enzima para los
diferentes sustratos que puede transformar, se puede indicar cual es el
preferencial. Este corresponder a aquel por el cual la enzima exhibe la menor
Km.
La ecuacin de Michaelis-Menten que nos permite encontrar las
velocidades de la reaccin enzimtica a diferentes concentraciones de sustrato,
es la siguiente:
Vmax (S)
vi = ---------------
Km + (S)
Donde vi es la velocidad inicial de la reaccin, Vmax es la
velocidad mxima. Km la constante michaeliana y (S) la concentracin de
sustrato con la cual se obtiene la vi.

Existen otras enzimas que al estudiar el efecto de la

concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin que catalizan
producen una grfica que no corresponde a la hiprbola rectangular sino mas
bien a una curva sigmoidal, estas se denominan enzimas alostricas a
diferencia de las otras que podemos llamarlas michaelianas.

En esta prctica estudiaremos el efecto de la concentracin de

sustrato, de la temperatura, del pH y de la concentracin de la enzima sobre la
velocidad de la reaccin. Para tal efecto se proporcionarn resultados que se
utilizarn para hacer las grficas correspondientes y para la interpretacin de
cada experimento.

OBJETIVOS
1) Caracterizar los factores que afectan la velocidad inicial de las
reacciones enzimticas, tales como la concentracin de sustrato, la
temperatura, el pH y la concentracin de la enzima.
2) Interpretar las curvas cinticas obtenidas con cada uno de los
factores mencionados

RELACION DE EXPERIMENTOS
1. Influencia de la concentracin de sustrato sobre la velocidad inicial.
2. Influencia de la temperatura sobre la velocidad inicial.
3. Influencia del pH sobre la velocidad inicial.
4. Influencia de la concentracin de la enzima sobre la velocidad
inicial.

EXPERIMENTO 1
INFLUENCIA DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD INICIAL
En este experimento se realiza simultneamente la reaccin enzimtica
en varios tubos de ensayo y bajo las mismas condiciones (temperatura, pH,
concentracin de la enzima y tiempo de la reaccin), excepto que la
concentracin de sustrato vara de tubo a tubo. Concluida la reaccin se
determina la cantidad de producto formado (en moles/minuto) para cada
concentracin de sustrato.
Resultados
En un experimento realizado con anterioridad se obtuvieron los
siguientes resultados:

Concentracin de Velocidad inicial 1/(S) 1/vi

sustrato (mM) moles / minuto
0.5 71.43
1.0 111.11
2.0 153.25 *
4.0 190.48 *
8.0 216.21 *
15.0 230.77 *
100.0 246.91 *
1000.0 249.69
 En base a los datos que figuran en la Tabla hacer los siguientes clculos:
1. Cul es la velocidad mxima de la reaccin?
Respuesta ___________
2. Cul es el valor de la Km?
Respuesta ___________
3. Cul es la velocidad de la reaccin cuando la concentracin de sustrato
es 5.0 mM ?
Respuesta _________
4. Cul es la velocidad inicial a 2000 mM de concentracin de sustrato?
Respuesta ____________
5. Cual es la velocidad de la reaccin enzimtica cuando la concentracin
de sustrato es 5.0 mM y la concentracin de la enzima se duplica?
Respuesta ____________
Expresin de Resultados
1) Completar la Tabla anterior calculando los valores inversos de las
concentraciones y de las velocidades iniciales, correspondientes.
2) Con los datos de la Tabla y utilizando papel milimetrado construya la
grfica que relacione las concentraciones de sustrato (eje horizontal) con
las velocidades iniciales (eje vertical). Esta grfica debe ser pegada en
el lugar correspondiente (Grafica 1). Usando la curva obtenida haga la
estimativa de la velocidad mxima y de la Km.
3) Con los datos de la Tabla y en papel milimetrado haga el grfico que
relacione los inversos de las concentraciones de sustrato con los
inversos de las velocidades iniciales. Ploteo de Lineweaver-Burk. Esta
grfica debe ser pegada en el lugar correspondiente (Grfica 2).
Utilizando la curva obtenida haga la estimativa de la velocidad mxima y
de la Km.
4) Queda a su criterio el graficar otros ploteos.
5) Completar la siguiente Tabla:

Velocidad mxima Km
a) Mediante los datos de la tabla
b) Mediante el ploteo Michaeliano
c) Mediante el ploteo 1/(S) vs 1/vi
d) Mediante otros ploteos
Grfica 1.- Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad inicial

Grfica 2.- Efecto de los inversos de las concentraciones de sustrato sobre los inversos
de las velociades iniciales ( Ploteo de Lineweaver-Burk)

EXPERIMENTO 2
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCION
ENZIMATICA.
En este experimento se realiza simultneamente la reaccin enzimtica
en varios tubos de ensayo y bajo las mismas condiciones (concentracin de
sustrato, pH, concentracin de la enzima y tiempo de la reaccin), excepto la
temperatura que vara de tubo a tubo. Concluida la reaccin se determina la
cantidad de producto formado ( en moles/minuto) para cada concentracin de
sustrato.
Resultados
 En un experimento realizado con anterioridad se obtuvieron los
siguientes resultados:

TEMPERATURA OO C. 15o C 27o C 37o C 50o C 90o C.

VELOCIDAD 00 108 215 250 60 50
INICIAL
Expresin de Resultados
1) Haga el grfico que relacione la temperatura (eje horizontal) con la
velocidad de la reaccin enzimtica ( eje vertical) usando los valores de
la Tabla anterior. El grfico debe ser hecho en papel milimetrado y
pegado en el lugar asignado ( Grfica 3)

Grfica 3.- Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica

2) Estimar la temperatura ptima y el Q10 (27- 37o C.)
Temperatura ptima ____________ Q 10 _______
3) Con el uso de la siguiente frmula estime la energa de activacin para
la reaccin estudiada.

4.57 log Q
Ea = -----------------
1/T1 - 1/T2

_________________________

Donde Ea es la energa de activacin, T 1 y T2 son las temperaturas en

grados absolutos, por ejemplo 27o C y 37o C. y Q es la relacin entre las
constantes de las velocidades a las temperaturas estudiadas.
Como se hace el estudio a concentraciones altas de sustrato, estas
reacciones tendrn una cintica de orden cero y por lo tanto Q ser igual a
la relacin de las velocidades de la reaccin a la temperatura 2 y a la
temperatura 1.
 El valor que se encuentra para Ea corresponder a la cantidad de
energa en caloras, requerida para que todas las molculas de un mol de
reaccionante (a una temperatura dada) alcancen el estado activado.

EXPERIMENTO 3
EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCION ENZIMATICA
En este experimento se realiza simultneamente la reaccin enzimtica
en varios tubos de ensayo y bajo las mismas condiciones ( concentracin de
sustrato, temperatura, concentracin de la enzima y tiempo de la reaccin),
excepto el pH que vara de tubo a tubo. Concluida la reaccin se determina la
cantidad de producto formado ( en moles/minuto) para cada pH utilizado..
Resultados
En un experimento realizado con anterioridad se obtuvieron los
siguientes resultados:

pH 5.8 6.2 6.6 7.O 7.4 7.8 8.2

Velocidad de la 45 75 120 245 250 75 32
reaccin
Expresin de Resultados
1) Construya el grfico (Grafico 4) que relacione las
variaciones de pH (eje horizontal) con las variaciones en la
velocidad ( eje vertical). Haga el grafico en papel milimetrado y
pguelo en el espacio correspondiente.
2) Estime el pH ptimo

EXPERIMENTO 4
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD
DE LA REACCION ENZIMATICA.
En este experimento se realiza simultneamente la reaccin enzimtica
en varios tubos de ensayo y bajo las mismas condiciones ( concentracin de
sustrato, temperatura, pH y tiempo de la reaccin), excepto la concentracin
de enzima que vara de tubo a tubo. Concluida la reaccin se determina la
cantidad de producto formado ( en moles/minuto) para cada concentracin de
enzima utilizada.

Resultados
En un experimento realizado con anterioridad se obtuvieron los
siguientes resultados:

Concentracin de la 6 ug 12 ug 18 ug 24 ug 30 ug
enzima
Velocidad de la reaccin 65 132 196 258 323

Expresin de Resultados
1. Construya en papel milimetrado el grfico (Grafico 5) que relaciones la
concentracin de la enzima ( eje horizontal) con la velocidad de la reaccin
enzimtica ( eje vertical). Pegue el grfico en el espacio correspondiente.

Grafico 4.- Efecto del pH sobre la velocidad de la reaccin enzimtica

Grfico 5.- Efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin

enzimtica

Cuestionario
1. Calcular el porcentaje de la velocidad mxima que se alcanza cuando la
concentracin de sustrato es :
a) (S) = Km Respuesta .-
b) (S) = 1/10 Km a) __________
c) (S) = 1/100 Km b)__________
d) (S) = 10 Km c) __________
e) (S)= 100 Km d) __________
e) __________
2. La hexoquinasa cerebral puede actuar sobre varias hexosas, catalizando
su conversin a hexosas 6 fosfato, con la participacin del ATP. Si los
valores de Km son de 8 X 10-6 M, 5 X 10-6 M, 1 X 10-4 M y 1,6 X 10-3 M
para glucosa, manosa, galactosa y fructosa, respectivamente, indique
cul es el sustrato preferencial y justifique su respuesta.
Respuesta _____________________
Justificacin: