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Expresin y purificacin de la protena recombinante DHFR

Primera seccin

Material de avance inicial para obtener colonias nicas de bacterias

1.- Preparacin de la ampicilina

La ampicilina es provista como reactivo liofilizado, por lo cual es necesario disolverlos

completamente.

Utilizar una pipeta estril para adicionar 600 L de agua estril directamente en el vial
para rehidratar el antibitico, realizando una solucin de 50 mg/mL

2.- Preparacin de LB/ampicilina agar

Disolver 8 gr de medio LB agar en 200 ml de agua destilada y posteriormente esterilizar

el medio a 121C durante 15 min.

Posteriormente, dejar enfriar el LB/agar a 55 C antes de adicionar la ampicilina.

Adicionar 200 L de ampicilina a una concentracin de 50 mg/mL, mezclar muy bien por
agitacin y vaciar en 20 cajas de Petri. Nota: Se espera a que cada uno de los diferentes
medios de cultivo solidifiquen, y posteriormente se colocan a 37C por al menos 24 hrs.
Despus de esto las cajas con el medio de cultivo pueden ser almacenadas a 4C, hasta
el momento en que estas deban ser utilizadas.
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3.- Preparacin de medio LB broth

Disolver 5 capsulas de medio LB broth en 250 ml de agua destilada y posteriormente

esterilizar el medio a 121C durante 15 min. Nota: Preparar con 48hrs de anticipacin y
almacenar a 4 C hasta su uso.

4. Rehidratacin de la cepa E. coli BL21 (DE3)

Las bacterias previamente liofilizadas de E. coli BL21 (DE3) que contienen el plsmido
DHRF, debern ser rehidratadas con 250 L de medio LB broth directamente en el vial
y dejar rehidratar por lo menos 10 min y almacenar a 4 C hasta su uso.

Segunda seccin

Material de avance para el cultivo celular de toda una noche

5. Preparacin de medio LB broth

Adicionar 500 L de ampicilina a una concentracin de 50 mg/mL al resto del medio del
paso 3 para obtener el medio LB/ampicilina broth y almacenar a 4 C hasta su uso.

6. Dilucin del IPTG

Adicionar 900 L de agua estril a 100 L de 1M IPTG y almacenar a -20 C hasta su

uso.

7.-Alicuotas de LB/ampicilina broth.

Colocar 3 mL de LB/ampicilina broth en un tubo estril de 50 mL. Un tubo por equipo.

Colocar 11 mL de LB/ampicilina broth en un tubo estril de 50 mL. Un tubo por
equipo.Colocar 2 mL de LB/ampicilina broth en un tubo estril de 2 mL. Un tubo por
equipo. Almacenar dichas soluciones a 4 C hasta su uso.

Tercera seccin
Materiales de avance para el subcultivo e induccin de la expresin de DHRF

8. Determinar el tiempo de induccin de la expresin del gen de inters. (4 hrs de

induccin podra proveer buenos resultados).

9. Asegurarse que la incubadora (shaker) para el cultivo celular se encuentre a 37 C.

10. Asegurase de precalentar a37 C, los tubos que contienen 11 mL de LB/ampicilina

broth.

11. Asegurase de encender el espectrofotmetro 30 min antes de la medicin de la

turbidez bacterial. Ajustar el equipo a 600 nm para medir la absorbancia de la muestra.

12. Alicuotar 25 L de 100 mM IPTG en tubos epppendorf de 2 mL. Un tubo por equipo.
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13. Alicuotar 1 mL de amortiguador Laemli en tubos epppendorf de 2 mL. Un tubo por

equipo.
Cuarta seccin
Materiales de avance para la preparacin de lisis celular

1. Preparacin de 2x PBS

Para preparar 20 ml de 2x PBS, diluir 4 ml de 10x PBS en 16 mL de agua y agitar muy

bien y almacenar a temperatura ambiente.

2. Preparacin de la lisozima

A no ms de 24 hrs de avance, rehidratar la lisozima adicionando 500 L de agua estril

a 25 mg de reactivo, para obtener una solucin de 50 mg/mL. Mantener el vial hasta su
uso en refrigeracin.

3. Preparacin del amortiguador de lisis 1

Para preparar 20 mL de amortiguador de lisis, adicionar 200 L de lisozima (50 mg/mL)

a 20 mL de 2x PBS, agitar muy bien y almacenar a 4 C hasta su uso.
Preparar alcuotas de 500 L en un tubo de 2 mL para cada equipo.

4. Preparacin del amortiguador de lisis 2/ amortiguador de lavado

Para preparar 50 mL de esta solucin, combinar 38 mL de agua destilada, 10 ml de 10x

PBS y 2 mL de la solucin de imidazol y mezclar fuertemente. Almacenar esta solucin
a 4 C hasta su uso.

Quinta seccin
Separacin de la fraccin soluble e insoluble de los cultivos inducidos y
preparacin de las muestras para el SDS-PAGE

5. Las clulas lisadas podrn almacenarse a -20 C hasta su uso. Antes de iniciar a
trabajar con ellas, las muestras debern ser descongeladas a temperatura ambiente.

Sexta seccin
Materiales de avance para la preparacin de afinidad cromatgrafica
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1. Preparacin del amortiguador de equilibrio

Para preparar 20 mL de amortiguador,combinar 15.6 mL de agua destilada, 4 mL de 10x

PBS y 0.4 mL de la solucin de imidazol y mezclar muy bien. Almacenar dicha solucin
a 4 C hasta su uso.
Realizar alcuotas de 500 L en tubos de 2 mL para cada equipo.

2. Preparacin del amortiguador de lisis 2/ amortiguador de lavado (misma sol,

cuarta seccin 4 paso)

Alicuotar 600 L del amortiguador en un tubo de 2 mL para cada equipo.

3. Preparacin del amortiguador de elucin

La solucin stock de imidazol podra servir amortiguador de elucin.

Realizar alcuotas de 400 L en tubos de 2 mL para cada equipo.

4. Realizar alcuotas de 250 L de Profinity IMAC resina cargada de Ni en tubos de 2

mL para cada equipo.
5. Realizar alcuotas de 250 L de agua estril en tubos de 2 mL para cada equipo.

Pagina 66 mat/equipo

Material de avance para la electroforesis SDS-PAGE

1. Amortiguador de corrida TRIS/GLYCINA/SDS (TGS)

Para preparar 5 L del amortiguador,mezclar 500 ml de 10x TGS con 4.5 l de gua
destilada y alcenar a temperatura ambiente.

2. Realizar alcuotas de 10 L de Precision Protein dual color (marcador de peso

molecular) en tubos de 2 mL para cada equipo.

Cultivo celular e induccin de la expresin del gen DHRF

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1. Condiciones de cultivo de la cepa E. coli BL21 (DE3)

Los integrantes de cada equipo debern plaquear la cepa de E. coli BL21 (DE3), en cada
una de las cajas que contienen nicamente el medio LB/amp agar, utilizando un ngulos
de 45 para rastrillar y ganar una mayor superficie en el medio, como se muestra en la
siguiente figura.

Posteriormente, colocar las cajas en una incubadora a 37C toda la noche, o a temperatura
ambiente durante 2-3 das.

Las mejores colonias de E. coli (de 1-2) con 1 mm de dimetro debern ser seleccionadas
y almacendas en una bolsa sellada a 4 C hasta su uso.

Para el cultivo celular noche completa

1. Marcar los tubos de 50 mL que contienen 3 mL de LB/amp broth con el nombre

del equipo.
2. Adicionar 150 L de glucosa esteril al 20% a los 3 mL de LB/amp broth.
3. Picar una colonia de la caja de Petri utilizando una micropipeta con una punta
esteril o un asa de siembra e inocular la solucin de 3 mL de LB/amp broth con glucosa.
4. Incuabar a 37 C en una incubadora con rotacin a 250 rpm por 12-18 hrs.
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Preparacin de la muestra sin induccin para el SDS-PAGE

1. Alicuotar 100 L del cultivo de toda la noche en un tubo de 1.5 mL, etiquetar el tubo
con -induccin y marcar con el nombre del equipo.
2. Centrifugar el tubo a 16,000 x g por 2 min.
3. Descartar el sobrenadante sin tocar el pellet.
4. Adicionar 100 L del amortiguador de Laemli al pellet y resuspender por pipeteo.
5. Calentar el tubo a 95 C por 5 min.
6. Marcar esta muestra con el nombre del equipo y almacenar a -20 C hasta su uso para
el SDS-PAGE.

Determinacin de la densidad celular del cultivo de toda la noche

1. Preparar una dilucin 1:10 del cultivo, mezclando 900 L de LB/amp broth con
100 L del cultivo de toda la noche en un tubo y agitar muy bien por inversin.
2. Leer la obsorvancia a 600 nm. Utilizar como blanco 1 ml de LB/amp broth.

OD600 de la dilucin 1:10 del cultivo de toda la noche:_____________________

OD600 del cultivo de toda la noche= OD600 de la dilucin 1:10 x

10:_____________________________

Preparar un subcultivo con una densidad OD600 de 0.3

Preparar un cultivo de 11 mL con OD de 0.3 a travs de la combinacin de volmenes

correctos del cultivo de toda la noche y LB/amp broth entibiado previamente a 37 C
dela siguiente manera:

X mL del cultivo toda la noche= 11 mL x 0.3/ OD600 del cultivo toda la noche

1. Calcular la cantidad del cultivo de toda la noche que podran necesitar para
preparar un subcultivo con OD600 de 0.3 y registrar el valor:

________________________ mL del cultivo de toda la noche.

2. Recuperar el tubo de 11 mL entibiado previamente a 37 C y marcar con el nombre

del equipo.
3. Remover y descartar el volumen de LB/amp broth, equivalente a el volumen
calculado en el paso 1, utilizando una micropipeta.
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4. Agitar el cultivo de toda la noche para resuspender todas las clulas y adicionar el
volumen calculado en el paso 1 hacia el tubo de 50 mL con LB/amp broth.
5. Incubar las bacterias en una incubadora con agitacin a 37 C durante 1 hora.
6. Registrar el tiempo de inicio del cultivo:____________________
7. Registrar el tiempo en que se detuvo el cultivo:____________________

Determinacin de la absorbancia a OD600 del subcultivo e induccin de la

expresin de GST-DHFR-HIS

1. Despuesde una hora de incubacin medir la absorbancia a OD600 de tu subcultivo.

Utilizar como blanco 1 mL de LB/amp broth.
2. Preparar una dilucin 1:3 de tu subcultivo combinando 600 L de LB/amp broth con
300 L del subcultivo en tubo limpio y agitar muy bien.
3. Medir la absorbancia de la dilucin y registrar el resultado

OD600 de la dilucin 1:3 del subcultivo:_____________________

OD600 del subcultivo total= OD600 de la dilucin 1:3 del subcultivo x

3:_____________________

4. Adicionar 25 L de IPTG hacia el subcultivo y continuar con la incubacin de las

bacterias en una incubadara con agitacin a 37 C durante por 4-24 horas. Durante
este periodo las bacterias podran producir la protena recombinante GST-DHFR-HIS.

5. Registrar el tiempo del inicio del cultivo:_____________________

Colecta y lisis celular

Preparacin de la muestra con induccin para el SDS-PAGE

1. Alicuotar 100 L del cultivo de toda la noche en un tubo de 1.5 mL, etiquetar el
tubo con + induccin y marcar el tubo con el nombre del equipo.
2. Centrifugar el tubo a 16,000 x g por 2 min.
3. Descartar el sobrenadante sin tocar el pellet.
4. Adicionar 100 L del amortiguador de Laemli al pellet y resuspender por pipeteo.
5. Calentar el tubo a 95 C por 5 min.
6. Marcar esta muestra con el nombre del equipo y almacenar a -20 C hasta su uso
para el SDS-PAGE.

Recuperacion del pellet celular de las clulas inducidas

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1. Marcar 2 tubos de 2 mL con + induccin pellet y aliquotarlos con 2 mL del cultivo

celular bajo condiciones de induccin. Centrifugar el tubo a 16,000 x g por 2 min.
Descartar el sobrenadante de ambos tubos sin tocar el pellet.
2. Alicuotar 2 mL ms del cultivo en induccin en el mismo tubo del paso 1 y
centrifugar nuevamente a 16,000 x g por 2 min. Descartar el sobrenadante y repetir
este paso hasta que todo el cultivo haya sido centrifugado. Almacenar el pellet
celular a -20 C o continuar con el lisado celular.

Lisis de las clulas bajo condiciones de induccin

1. Adcionar 250 L de amortiguador de lisis 1 en cada uno de los tubos marcados

como + induccin pellet y resuspender muy por pipeteo o agitar fuertemente
en vortex.
2. Marcar dos tubos de 2 mL nuevos con Celulas lisadas y el nombre del equipo.
Combinar las dos fracciones celulares lisadas para obtener un volumen
aproximado de 500 L.
3. Colocar el tubo con las clulas lisadas a -80 C toda lo noche y luego
descongelar completamente cuando las vraciones solubles e insolubles se
hayan formado.
4. Adicionar 500 L de amortiguador de lisis 2 y agiatr fuertemente en un vortex.
5. Las clulas lisadas pueden ser almacenadas a -20 C hasta su uso en la
purificacin.

Separacin de las fracciones solubles e insolubles de las clulas inducidas y

preparacin de las muestras para el SDS-PAGE

1. Asegurarse que el volumen de las muestras se encuentre igual entre todos los
estudiantes, si no es as completar con agua.
2. Separar la fraccin soluble e insoluble del lisado celular por centrifugacin a
16,000 x g por 20 min.
3. Verter cuidadosamente el sobrenandante de las clulas lisadas en tubo nuevo
y marcar como fraccin soluble y el nombre del equipo.
4. Remarcar el tubo de las cluas lisadas con fraccin insoluble.
5. Adicionar 1 mL de amortiguador de lisis 2 en la fraccin insoluble y
resuspender el pellet utilizando una jeringa de 3 mL.
6. Remover 50 L de la fraccin soluble y colocarlo en un tubo limpio de 1.5
mL y marcar como Soluble PAGE. Adicionar 50 L de amortiguador Laemli
y agitar fuertemente.
7. Remover 50 L de la fraccin insoluble y colocarlo en un tubo limpio de 1.5
mL y marcar como Insoluble PAGE. Adicionar 50 L de amortiguador
Laemli y agitar fuertemente.
8. Calentar ambas muestras a 95 C por 5 minutos y almacenar a -20 C hasta su
anlisis por SDS PAGE.
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9. Almacenar la fraccin soluble e insoluble a -20 C hasta su uso para la

purifiicacion de la fraccin soluble.

Purificacion de la protena GST-DHRF-HIS por tamao de exclusin y

afinidad

1. Marcar la columna Micro-Bio spin con el nombre del equipo y colocarlo en un

tubo de 2 mL.
2. Resuspender fuertemente la resina Proafinity imac y pipetear 200 L lentamente
en la columna.
3. Centrifugar a 1000 x g durante 2 min y descartar el amortiguador que se ha
depositado en el tubo de 2 mL.
4. Lavar la columna adicionando cuidadosamente en la pared del tubo 200 L de
agua. Centrifugar a 1000 x g durante 2 min y descartar el agua y colacar la
columna nuevamente en el tubo.
5. Equilibrar la columna adicionando 500 L de amortiguador de equilibrio y
centrifugar a 1000 x g durante 2 min para remover el amortiguador y descarte el
tubo.
6. Adherir una punta amarilla a la columna.
7. Adicionar 600 L de la fraccin soluble del lisado celular hacia la columna y tape
la columna.
8. Mezclar cuidadosamente la columna por 20 min a temperatura ambiente.
9. Cuidaosamente girar y remover la punta amarilla del fondo de la columna y
colocar la columna en un tubo nuevo de 2 mL, marcado previamente con
Flowthough.
10. Remover la tapa de la columna y centrifugar a 1000 x g durante 2 min para colectar
la fraccin del flujo a travs de la columna.
11. Almacenar esta fraccin y guardar la columna para los siguientes pasos.

Lavado de la columna

1. Marcar un tubo de 2 mL como sigue: Fraccin de lavado.

2. Colocar la columna en el tubo marcado.
3. Adicionar cuidadosamente 600 L de amortiguador de lavado en la columna
y centrifugar por 2 min a 1000 x g para colectar la fraccin del flujo de lavado.
4. Tapar la columna y almacenar la fraccin de lavado. Guardar la columna para
los siguientes pasos.
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Elucin de la protena GST-DHRF-HIS de la columna

1. Marcar un tubo de 2 mL como sigue: Eluido.

2. Colocar la columna en el tubo marcado.
3. Adicionar cuidadosamente 400 L de amortiguador de elucin en la columna y
centrifugar por 2 min a 1000 x g para colectar la fraccin eluida.
4. Almacenar la fraccin eluida y descartar la columna.

Desalado de la protena GST-DHRF-HIS (fraccin eluida) para eliminar el

imidazol

1. Invertir la columna de desalar fuertemente varias veces para resuspender el

gel colocado y remover las burbujas. La resina debera colocarse en la
columna y no debera permanecer en la tapa.
2. Eliminar la parte inferior de la columna y colocar la columna en un tubo limpio
de 2 mL.
3. Remover la tapa verde de la columna para iniciar el flujo.
4. Permitir que el exceso del amortiguador drene por gravedad y luego colocar
la columna en otro tubo nuevo de 2 mL.
5. centrifugar por 2 min a 1000 x g para remover el resto del amortiguador.
Descartar el amortiguador y el tubo. Almacenar la columna para los siguientes
pasos.
6. Marcar un tubo de 2 mL como sigue: Eluido desalado. Y marcar con el
nombre del equipo.
7. Colocar la columna en el tubo y cuidadosamente aplicar 75 L de la fraccin
eluida directamente hacia el centro de la columna.
8. Despus de cargar la muestra, centrifugar la columna por 4 min a 1000 x g.
9. Aplicar nuevamente 75 L de la fraccin eluida directamente hacia el centro
de la columna y centrifugar la columna por 4 min a 1000 x g.
10. Se debera tener alrededor de 150 L del eluido desalado en el tubo marcado.
11. Almacenar la muestra a 4 C y descartar la columna.

Preparacin de las muestras para el SDS-PAGE

1. En un tubo de 1.5 mL, mezclar 50 L de laemli con 50 L de la fraccin

flowthrough y marcar el tubo como FLOWTHROUGH PAGE.
2. En un tubo de 1.5 mL, mezclar 50 L de laemli con 50 L de la fraccin de
lavado y marcar el tubo como LAVADO PAGE.
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3. En un tubo de 1.5 mL, mezclar 50 L de laemli con 50 L de la fraccin de eluido

y marcar el tubo como ELUIDO PAGE.
4. En un tubo de 1.5 mL, mezclar 50 L de laemli con 50 L de la fraccin de eluido
desalado y marcar el tubo como DESALADO PAGE.
5. Calentar las cuatro muestras a 95 C por 5 min.
6. Todas estas muestras pueden ser almacenadas a -20 C hasta su uso.

NOTA: Las fracciones flowthrough, de lavado, de eluido y desalado, deberan

almacenarse a 4 C hasta que las pruebas enzimticas sean realizadas.

SDS electroforesis para analizar la expresin y pureza de la protena DHRF.

1. Recalentar las muestras SDS PAGE a 95 C por 5 min y centrifugar por 2 min a
1600 x g.
2. Colocar los geles y ensamblar el equipo.
3. Cargar los geles utilizando una punta limpia cada vez cargando los siguientes
volmenes de cada muestra como sigue:

Carril Volumen (L) Muestras

1 10 Precision plus
2 7.5 -induccin
3 15 +induccin
4 10 fraccin soluble
5 10 fraccin insoluble
6 10 flowthrough
7 20 de lavado
8 20 de eluido
9 20 desalado
10 10 Amortiguador Laemli

4. Correr el gel 200 V por 30-60 min.

5. Despus de la corrida, remover el gel y colocarlo en un recipiente para su tincin.
6. Lavar el gel con 50 mL de agua destilada por 5 min cada vez.
7. Teir el gel con 50 mL de Bio-safe coomasie por una hora.
8. Descartar el Bio-safe coomasie, adicionar 100 mL de agua destilada y desteir el
gel durante toda la noche.
9. Fotografiar el gel.