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COLORAO DE GRAM

MTODO DE COLORAO DE GRAM

1) Objetivos

a- Aprender a preparar esfregao de bactrias;


b- Realizar a tcnica de Colorao de Gram;
c- Aprender o fundamento do mtodo de colorao de Gram;
d- Comparar a estrutura da parede celular das bactrias Gram-positivas e Gram-
negativas;
e- Permitir a observao da morfologia bacteriana e fornecer informaes a respeito
do comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.

2) Interpretao

O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular,


sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e
cido teicico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual
se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e
lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com lcool-acetona
extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da
parede celular das bactrias Gram-negativas.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactrias Gram-
negativas so descoradas. A parede celular das bactrias gram-positivas, em virtude de
sua composio diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com lcool-
acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CVI no pode
ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois
grupos de bactrias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI retido na parede aps
tratamento pelo lcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuio do
dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular.
A parede das bactrias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente
grande, mesmo depois do tratamento com lcool acetona, possibilitando a extrao do
complexo CV-l.
3) Procedimentos:

a- Preparar esfregaos a partir de culturas de bactrias.


b- Corar os esfregaos pelo mtodo de colorao de Gram.
c- Observar ao microscpio ptico, sob imerso e identificar a morfologia
deste microrganismos e sua reao frente ao mtodo de Gram.

4) Preparo do esfregao:

a- Pegar uma lmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do


bico de Bunsen;
b- Identificar o lado da lmina onde ser feito o esfregao;
c- Flambar a ala bacteriolgica deix-la esfriar e colocar na lmina uma gota
de soluo salina fisiolgica;
d- Flambar a agulha bacteriolgica, deixar esfriar prximo a chama, abrir a placa com
a cultura teste e tocar a colnia escolhida para retirada da amostra,
e- Esfregar o material com movimentos de rotao da ala bacteriolgica, para
se obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme;
f- Deixar secar nas proximidades da chama;
g- Fixar o esfregao passando a lmina (lado oposto ao esfregao) 5 vezes na chama
do bico de Bunsen (rapidamente).

5) Mtodo de Colorao de Gram:

1) Cobrir toda a lmina com soluo cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;
2) Lavar rapidamente em gua destilada ou escorrer o corante;
3) Cobrir a lmina com soluo de Iugol (mordente) por um minuto;
4) Lavar em gua destilada ou escorrer o lugol;
5) Inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona ou lcool absoluto (cerca de 30 segundos).
Lavar a lmina rapidamente em gua corrente ou escorrer o lcool;
6) Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
7) Lavar a lmina em gua destilada e secar (sem esfregar);
8) Colocar uma gota de leo de imerso sobre a lmina e observar em objetiva de
imerso (100X).

RESULTADO: bactrias Gram-positivas: roxo


bactrias Gram-negativas: rosa/vermelho

6) Observaes:

O descoramento para mais ou para menos resultante da incorreta diferenciao pelo


lcool-acetona.
A idade da cultura bacteriana tem Importncia fundamental na colorao de Gram. Em
culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tomam Gram-negativas.
Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da
cultura, uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas
bacterianas conhecidas como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-
negativas, tal como Escherichia coli, como controles.

7) Resumo

Solues em ordem de Reao do aspecto das Reao do aspecto das


aplicao bactrias Gram-positivas bactrias Gram-negativas
Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
Formao do complexo CV-I Formao do complexo CV-I no
Soluo de Iugol no interior da clula, que interior da clula, que
permanece violeta permanece violeta
Desidratao da parede
celular, diminuio da
Extrao dos lipdeos da parede
porosidade e da
celular, aumento da porosidade;
lcool-acetona permeabilidade; o
o complexo CV-I removido da
complexo CV-I no pode sair
clula
da clula, que permanece
violeta
A clula no afetada, A clula adquire o corante,
Fucsina ou safranina
permanece violeta tornando-se vermelha

8) Bibliografia

Ribeiro, M. C.; Soares, M. M. S. R.; Microbiologia prtica: roteiro e manual; Atheneu;


1993; 5-8pp.
Pelczar Jr, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R.; Microbiology: concepts and
applications; McGrawHill; 1993; 75-76 pp.