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INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA

DO RN
CAMPUS CURRAIS NOVOS

Disciplina: Microbiologia de alimentos


Professora: Me Dayana do Nascimento

Prticas 5 e 6 - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIVEIS EM PLACA


MTODOS SPREAD PLATE E POUR PLATE

INTRODUO
Existem vrias condies em que conveniente quantificar a populao
microbiana de uma determinada amostra. Na anlise da eficincia de agentes
antimicrobianos ou a eficcia de prticas higinico-sanitrias comum determinar a
populao sobrevivente ao tratamento. Tambm, em determinadas condies clnicas,
como em infeces do trato urinrio, quando o nmero de um determinado organismo
superior a 100 mil/ml considera-se que esse organismo o agente da infeco. Tambm
comum empregar tcnicas para quantificar a populao de microrganismos da gua e
alimentos para avaliar a qualidade microbiolgica dos mesmos.
Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se
microscopicamente o nmero de clulas presentes num determinado material ou
superfcie, ou indiretamente, efetuando-se anlises da turbidez, determinao do peso
seco, concentrao de substncias qumicas (protenas, pesquisa de determinada enzima
ou produto final de uma via metablica, DNA, RNA) ou atravs da contagem do
nmero de microrganismos viveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa
possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na gua, em
alimentos como leite, carnes, vegetais, superfcies, ar ou at mesmo em culturas puras.
Para efetuar a contagem total de bactrias numa determinada suspenso da
amostra faz-se diluies decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela
tcnica de pour plate ou disseminao com ala de Drigalsky (Spread Plate), em
meios de cultura apropriados. Aps o perodo de incubao em condies de
temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do nmero de colnias. preciso,
no entanto, tomar determinadas medidas para evitar interpretaes errneas, tais como
perodo em que colhida a amostra, transporte apropriado, tempo transcorrido entre a
coleta e a anlise, dentre outros. Nesse mtodo conveniente preparar as amostras no
mais curto intervalo de tempo para evitar a multiplicao dos microrganismos. Por ser
este ltimo mtodo o mais empregado na rotina o que demonstraremos na prtica.

MATERIAL E MTODOS

Homogeneizao e diluio seriada da amostra


Para cada 25g de amostra adicionado 225 mL de soluo salina de 0,85% (p/v)
fisiolgica estril (diluio 10-1) sendo a amostra hidratada e em seguida colocada sob
agitao. Aps esse perodo, uma alquota de 1,0 mL da amostra retirada e transferida
para 9,0 mL de soluo salina (diluio 10-2). Este procedimento repetido
sucessivamente, visando obteno de diferentes diluies (10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7),
as quais sero inoculadas nos meios de cultivo apropriados utilizando a tcnica de
semeadura Pour-Plate (derramamento na placa) ou Spread-Plate (espalhamento na
placa) (FIGURA 1).

FIGURA 1 Diluies seriadas

Mtodo Pour Plate (Plaqueamento em profundidade)

A partir de cada diluio utiliza-se 1,0 ml como inculo, em duplicata, e


distribui-se nas placas previamente esterilizadas. Em seguida, pega-se o meio fundido e
esfriado a 45oC (em Banho-Maria) e verte-se sobre a placa de Petri contendo a
suspenso diluda da amostra. O material homogeneizado realizando movimentos
circulares, na placa, no sentido horrio e anti-horrio ou efetuando-se movimento
descrevendo-se o nmero oito. Esses movimentos so efetuados por cerca de 10 vezes.
Aps a solidificao do meio, as placas tampadas so invertidas e incubadas em estufas
na temperatura e atmosfera apropriadas. Ao final da incubao, usualmente 48 horas, as
colnias so contadas e o resultado mdio de cada diluio registrado e multiplicado
pelo fator da diluio, que a recproca da diluio. As placas adequadas para contagem
devem ter entre 30 a 300 colnias. Exemplo, 100 colnias na diluio 1/100, o resultado
10.000 UFC/ml ou grama da amostra. Usualmente o resultado final registrado em
UFC que significa unidades formadoras de colnias isto porque em algumas situaes
no uma nica clula que d origem a uma colnia, mas um agregado de clulas
(FIGURA 2).

Mtodo Spread Plate (Plaqueamento em superfcie)


Consiste em espalhar o material (suspenso de clulas) com o auxlio de uma ala de
Drigalski (para obteno de colnias isoladas aps diluio), fazendo a semeadura por
toda a superfcie da placa de Petri. Deve-se ter o cuidado de garantir que toda a
superfcie da placa seja semeada, evitando regies sem semeadura.
Faa a semeadura em placas de Petri, pipetando 0,1 mL de cada diluio, espalhando o
inculo com ala de Drigalsky (plaqueamento em superfcie) em placa de Petri
contendo meio de cultura adequado. Incuba-se por 24-48h a 37 C (para bactrias) ou 3-
5 dias a 25 C (para fungos e leveduras) (FIGURA 2)

FIGURA 2 Mtodos Spread Plate e Pour Plate