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13/10/2017 Protein Purification

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Purificao de protenas
Caroline Ritchie (caroline dot ritchie103 no gmail dot com)
Iowa State University, Estados Unidos
DOI //dx.doi.org/10.13070/mm.en.2.134
Encontro ltima modificao: 2016-11-02; verso original: 2012-11-17
Cite como MATER METHODS 2012; 2: 134

Abstrato
Uma reviso aprofundada da cromatografia em coluna para purificao de protenas e
resultados de pesquisa de 305 publicaes formais.

So necessrias protenas purificadas para muitas aplicaes experimentais, incluindo estudos


estruturais e ensaios bioqumicos in vitro. As protenas podem ser obtidas a partir de tecidos ou, mais
frequentemente, por sua sobre-expresso em um organismo modelo, como bactrias, leveduras ou
clulas de mamferos em cultura. A purificao de protenas envolve o isolamento de protenas da
fonte, com base nas diferenas em suas propriedades fsicas. O objetivo de um esquema de
purificao de protenas reter a maior quantidade de protenas funcionais com o menor nmero de
contaminantes. O esquema de purificao de uma protena deve ser otimizado para completar este
processo no menor nmero de etapas.

O artigo analisa quatro tipos de cromatografia


em coluna que so comumente usados na
purificao de protenas, e discute as
vantagens, desvantagens e potenciais
problemas de cada um. Este artigo tambm
relata uma pesquisa Labome em 98
publicaes. A pesquisa indica que a Figura 1. Uma soluo tamponada com Tris contm base
de Tris e seu cido conjugado. O pK de Tris a 25 C
cromatografia em coluna de afinidade, a
8.06, indicando que a pH = 8.06, 50% do Tris protonado
principalmente baseada nas tags HIS , GST e (na sua forma cida) e 50% desprotonado (na sua forma
FLAG , e a cromatografia de excluso de bsica).
tamanho so os principais mtodos citados
nas publicaes. A GE Healthcare o principal fornecedor de reagentes e instrumentos utilizados na
purificao de protenas.

Desenvolvimento de um esquema de purificao de protenas

A considerao mais importante no desenvolvimento de um esquema de purificao de protenas a


aplicao a jusante da protena purificada. Tanto a quantidade quanto a pureza da protena devem ser
suficientes para a anlise experimental. Alm disso, as informaes sobre o comportamento da
protena devem ser levadas em considerao, assim como a protena dobrada e funcional
necessria para estudos a jusante. Durante a purificao e posterior armazenamento, podem ocorrer
muitos processos que afetam a qualidade da protena: desdobramento de protenas, agregao,
degradao e perda de funo. O planejamento cuidadoso para purificar a protena o mais rpido
possvel e nas condies mais estabilizadoras maximizar a chance de um esquema de purificao
bem sucedido.

Componente de buffer

As condies de soluo de uma protena em cada passo do esquema de


purificao so essenciais na manuteno da estabilidade e funo da
protena. As protenas devem ser mantidas em um ambiente bem preservado
para evitar mudanas sbitas no pH que possam afetar irreversivelmente sua
dobra, solubilidade e funo.

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Figura 2. Um sistema
Aktaprime plus para a Um tampo uma soluo contendo um conjugado cido / par de bases. A
separao
gama de um tampo de pH baseia-se no seu pK , definido como o pH ao
cromatogrfica um
automatizada de
qual 50% das molculas so, na sua forma cida e 50% esto na sua forma
protenas. Da GE.
de base (figura 1). Uma regra geral em relao aos buffers que o pH da
soluo tampo deve estar dentro de 1,0 unidade de pH do pK para fornecer
a
a capacidade de buffer apropriada. Isto assegura que no h uma quantidade suficiente da molcula
+ -
em ambas as suas formas cida e bsica para neutralizar a soluo no caso de H ou OH afluxo.
Assim, os tampes impedem mudanas de pH que possam afetar negativamente a estabilidade da
protena.

Um bom buffer deve exibir as seguintes


caractersticas [ 1 ]:
1. Solubilidade em gua

2. Estabilidade qumica

3. Alta capacidade de buffer ao pH desejado

4. Compatibilidade com aplicaes analticas e


experimentais

5. Compatibilidade com outros componentes da


soluo Figura 3. Ligando de Ni-NTA unido covalentemente a uma
matriz de agarose reticulada para a purificao seletiva de
protenas marcadas com polihistidina. Os resduos de
Muitos componentes podem servir como 2+
buffers biolgicos. Os componentes histidina podem se coordenar com o on Ni substituindo
as molculas de gua ligadas (indicadas por setas
tamponantes mais vulgarmente utilizados tm vermelhas). O imidazol ou a histidina livre podem ento ser
um pKa prximo do neutro , como eles utilizados para eluir a protena, atravs da sua capacidade
um 2+
de coordenar com o on Ni e deslocar a protena ligada.
podem ser usados a um pH fisiolgico. Quatro
De BioKe.
dos tampes biolgicos mais comuns esto
listados na Tabela 1, juntamente com a faixa
de pH em que podem ser utilizados e vantagens e desvantagens que podem afetar seu uso na
purificao de protenas. Tipicamente, esses tampes so usados em concentraes acima de 25mM
para garantir uma capacidade de buffer adequada.

Aditivos de Soluo
Amortecedor faixa Vantagens e desvantagens
de pH
Alm de um sistema de
buffer apropriado, as
O pH no depende da temperatura solues usadas durante a

Barato purificao de protenas da


Fosfato 5.8-8.0
lise ao armazenamento
Transparente na faixa UV
geralmente contm muitos
No pode ser usado com caties outros componentes que
divalentes desempenham um papel na
facilitao da pureza,
No pode ser autoclavado estabilidade e funo da
O pH um pouco dependente da protena.
MOPS 6.5-7.9 temperatura
Alta capacidade de armazenamento em Os inibidores de protease
so frequentemente
pH fisiolgico
adicionados ao tampo de
lise e em passos iniciais do
No pode ser autoclavado
esquema de purificao para
O pH um pouco dependente da evitar a degradao da
HEPES 6.8-8.2 temperatura protena alvo por proteases
Pode formar radicais sob certas endgenas. Estes
condies [ 2 ] geralmente no so
necessrios para fases
Tris 7.5-9.0
O pH depende da temperatura e da posteriores da purificao,

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diluio uma vez que a maioria ou


Barato todas as proteases
contaminantes foram
Pode interferir com a atividade de
separadas da protena de
algumas enzimas [ 3 ], [ 4 ]
interesse. Os reagentes
Transparente na faixa UV
quelantes de metais, como
EDTA ou EGTA, so
Tabela 1 . Os tampes biolgicos mais utilizados para a purificao de
protenas. Os buffers mantm a capacidade de amortecimento dentro de um frequentemente adicionados
intervalo de pH especfico e as caractersticas de alguns componentes tampo ao buffer de
podem interferir com procedimentos ou anlises cromatogrficas particulares.
Resumido da Promega, Sigma-Aldrich, Applichem, Embl.de. armazenamento. Estes
quelantes metlicos ligam-se
2+
a Mg e, assim, impedem
a clivagem da protena purificada pela contaminao de metaloproteases. Outros aditivos so
frequentemente utilizados para proteger as protenas contra danos e aumentar a sua solubilidade.

Tipo Funo Reagentes comumente usados

2-mercaptoetanol (BME)
Agentes
Proteger contra danos oxidativos Dithiothreiotol (DTT)
redutores
Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)

Leupeptina (inibidor de serina e cistena


protease)
Inibidores da Inibir proteases endgenas de protenas
Protease degradantes Pepstatina A (inibidor de protease de cido
asprtico)
PMSF (inibidor de serina protease)

Chelating de EDTA
Inativar metaloproteases
metal
EGTA

Glicerol

Osmolytes
Estabilize a estrutura protica e melhore Detergentes (por exemplo, CHAPS , NP-
a solubilidade
40, Triton X-100 )
Acares (por exemplo, glicose, sacarose)

Estabilizadores Sais (por exemplo, NaCl, KCl, (NH ) SO


Melhore a solubilidade 4 2 4
inicos

Tabela 2 . Aditivos comumente usados em tampes de purificao de protenas para aumentar a estabilidade das
protenas. Resumido de Thermo Fisher Pierce e Embl.de.

Os aditivos s devem ser utilizados se necessrio. O teste e o erro so muitas vezes necessrios para
determinar os aditivos especficos que so benficos para um determinado esquema de purificao de
protenas.

Outros fatores a serem considerados

Outros fatores tambm contribuem para a estabilidade da protena durante um esquema de


purificao. A menor manipulao de uma protena durante sua purificao sempre a melhor. O
projeto de um esquema de purificao que usa o nmero mnimo de etapas no menor perodo de
tempo garante o maior rendimento de protena funcional. Alm disso, muitas vezes melhor manter a
protena fria durante a purificao. Normalmente, a purificao realizada a 4 C, uma vez que esta
temperatura mais baixa retarda a taxa de protelise (no caso de proteases contaminantes) e promove
a integridade estrutural das protenas.

Impacto do sistema de expresso na purificao de protenas

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Antes de poder proceder purificao da protena de interesse, deve ser preparada uma amostra
bruta inicial. A primeira considerao, que ocorre bem antes de realizar a purificao real, a fonte da
protena de interesse. Esta poderia ser uma fonte nativa, como fgado, msculo ou tecido cerebral,
embora na rea ps-genmica seja relativamente raro que os investigadores purifiquem protenas de
fontes nativas. No entanto, ainda existe a necessidade, se o investigador deseja ligar uma atividade
cataltica a uma seqncia de protena especfica.

Atualmente, muito mais comum que as protenas sejam purificadas a partir de fontes recombinantes.
As decises importantes devem ser feitas com antecedncia para otimizar a purificao subseqente.
O investigador precisa considerar o uso final da protena (por exemplo, ensaio enzimtico, estudos
estruturais, gerao de anticorpos), pois isso ditar as quantidades e a pureza necessria para a
preparao final da protena. Uma considerao importante a escolha do sistema de expresso (ver
artigo de Labome Expresso proteica recombinante: Vector-Host Systems) para uma discusso dos
sistemas de expresso mais amplamente utilizados com base em uma pesquisa imparcial da literatura.
Embora uma discusso detalhada sobre a expresso da protena esteja fora do escopo deste artigo,
alguns pontos bsicos valem a pena considerar neste momento, pois eles afetam diretamente a
posterior purificao da protena.

Qual sistema de expresso dar o mais alto nvel de expresso? Como regra geral, quanto maior o
nvel de expresso, mais fcil ser obter grandes quantidades de protena altamente purificada.

Se optar pela expresso de E. coli, o objetivo final expresso solvel ou expresso insolvel na
forma de organismos de incluso? A isolao de corpos de incluso pode, por si s, constituir um
passo de purificao significativo devido alta abundncia da protena recombinante dentro dos
corpos de incluso; isso deve ser equilibrado contra a facilidade / dificuldade de solubilizao e
posterior reenvio da protena alvo dos corpos de incluso e o rendimento final da protena solvel [ 5 ].
Muito trabalho foi feito para otimizar os rendimentos das protenas funcionais dos corpos de incluso [
6 ].

Outra considerao se alvejar a expresso intracelular ou extracelular (segregada). A expresso


intracelular requer que a protena seja purificada a partir de um grande nmero de protenas celulares
hospedeiras. Em contraste, a secreo eficiente da protena alvo pode resultar na purificao da
protena de um pequeno nmero de protenas hospedeiras segregadas, especialmente se as clulas
hospedeiras crescerem sob condies isentas de soro [ 7 ].
Preparao inicial da amostra

Independentemente da fonte da protena alvo, a preparao inicial de uma amostra bruta como ponto
de partida para a purificao importante e precisa ser considerada ao mesmo tempo que pensa
sobre as estratgias de expresso e purificao.

A secreo extracelular da protena alvo pode permitir a utilizao de um protocolo de purificao de


afinidade simples e rpida [ 7 ]; a nica preparao de amostra necessria pode ser a decantao de
meios condicionados a partir de clulas aderentes ou a centrifugao a baixa velocidade para remover
clulas em suspenso. Claro, pode ser necessrio adicionar inibidores de protease ou ajustar o pH em
preparao para o primeiro passo cromatogrfico, mas estes so passos simples a serem realizados.
No entanto, se a troca de ons for realizada como o primeiro passo de purificao, a amostra pode
primeiro ser dessalinizada. Isso pode ser tecnicamente desafiador se grandes volumes de meio
condicionado forem processados; A dilise ou a filtrao de fluxo cruzado so freqentemente usadas,
dependendo do volume do meio a ser dessalinizado.

Se a protena alvo expressa intracelularmente as clulas primeiro precisam ser colhidas por
centrifugao antes de serem ressuspensas em um tampo de lise apropriado. Conforme discutido
acima, o tampo de lise precisa conter um tampo apropriado e outros aditivos para garantir a mxima
estabilidade da protena alvo. A composio do tampo de lise / lise tambm precisa ser compatvel
com o (s) passo (s) de purificao subseqente (s) se o investigador for evitar tempos de troca de
buffer que consumam tempo antes da cromatografia em coluna.

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Em seguida, um mtodo eficiente necessrio para lysing as clulas. Vrios mtodos foram descritos
na literatura. As clulas E.coli podem ser lisadas pela imprensa francesa (embora este mtodo no
seja facilmente escalvel), sonicao ou lise baseada em detergente (muitos reagentes comerciais de
lise esto disponveis). A eficincia da lise baseada em detergente pode ser melhorada pela adio de
lisozima ao tampo de lise. A lise baseada em detergente muito leve e no resulta em corte
significativo de DNA bacteriano. Assim, a incluso de preparaes de ADNase (preparaes altamente
puras esto comercialmente disponveis) geralmente necessria para reduzir a viscosidade da
amostra e produzir uma amostra com boas caractersticas de fluxo [ 8 ].

As clulas de mamferos e insetos tambm podem ser lisadas por mtodos de sonicao ou baseados
em detergentes. O tratamento com DNAase pode ser necessrio para reduzir a viscosidade da
amostra se houver lise significativa da membrana nuclear [ 8 ].

Uma vez que as clulas (microbiana / inseto / mamfero) tenham sido lisadas, geralmente necessrio
remover detritos celulares por centrifugao (tipicamente 15 000 xg durante 15 minutos a 4 C para
evitar o entupimento de colunas de cromatografia [ 8 ]. O sobrenadante resultante o ponto de partida
para purificao cromatogrfica em coluna da protena alvo.

Introduo Cromatografia em Colunas


Equipamento para cromatografia em coluna

O princpio da cromatografia em coluna separar um grande grupo de protenas em muitos grupos


menores, alguns dos quais so enriquecidos na protena de interesse. Enquanto equipamentos caros
e especializados esto disponveis para cromatografia em coluna, apenas necessrio um
equipamento bsico.

Equipamento bsico para cromatografia em coluna:


1. Fase estacionria: uma matriz inerte, muitas vezes com um grupo
funcional anexado para facilitar a interao protica, usado para
separar as protenas. A escolha da fase estacionria e do grupo
funcional depende do tipo de cromatografia que est sendo
realizada e do mtodo pelo qual ela ser realizada.

2. Coluna: um reservatrio cilndrico de vidro disponvel em vrios


comprimentos e dimetros. As colunas podem ser compradas pr-
embaladas com uma fase estacionria e prontas para anexar a
sistemas de cromatografia automatizada (discutidos na Parte 2
desta seo) ou podem ser comprados vazios para embalagem
manual. So necessrios diferentes tipos de colunas para a
cromatografia de fluxo automatizada versus gravidade.
3. Solventes: tampes contendo aditivos utilizados para equilibrar,
lavar e eluir protenas da fase estacionria. Diferentes tipos de
cromatografia requerem diferentes condies de solvente.

4. Tubos de recolha: vasos para recolha de amostras de eluio. So


necessrios tubos especiais para coletores de frao
automatizados; No entanto, qualquer tubo ou recipiente apropriado
para a coleta de fraes manual.
Figura 4. Esquema da purificao por 5. Ensaio para medir a pureza: uma abordagem para determinar a
afinidade usando Protena A, G ou LA quantidade relativa de uma protena especfica para a protena total
Anticorpos contm vrias regies de em uma amostra. As fraces contendo a protena de interesse
interesse: Fc (fragmento, constante) que devem ser determinadas aps cada passo antes de prosseguir para
o mesmo para todas as protenas da o prximo passo no esquema de purificao. Alguns mtodos
mesma classe, Fv (fragmento, varivel) comuns de anlise de pureza sero discutidos em uma seo
que oferece especificidade para cada posterior.
anticorpo e Fab (fragmento, ligao ao
antignio) que realmente contatam o
antgeno especfico. B. Classes Sistemas para cromatografia em coluna
especficas de anticorpos podem ser
purificadas de forma no selectiva por A cromatografia em coluna pode ser realizada com sistemas
purificao por afinidade, em que o automatizados (Figura 2), que utilizam uma bomba para
ligando (Protena A, G ou L) conjugado
com uma matriz. C. Protena A, G ou L forar o solvente sobre uma coluna embalada com um caudal
tambm podem ser usadas para purificar ajustado ou pode ser executada por fluxo gravitacional.
protenas especficas. Neste caso, o
anticorpo servir como um ligando Ambos os sistemas automatizados e de fluxo gravitacional
intermedirio que proporciona podem ser acoplados a sistemas de coleta automtica de
selectividade para o seu antignio.
frao. Existem vantagens e desvantagens para cada
sistema. O sistema GE Healthcare AKTA FPLC uma
escolha muito comum [ 9 - 18 ].

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Tipo de Vantagens Desvantagens


sistema

Pode deixar funcionar sozinho


Muitas vezes acoplado a um
detector de absorvncia Requer equipamentos especficos e
Pode programar os passos de dispendiosos
Automatizado
equilbrio e lavagem A taxa de fluxo mxima depende do limite
Fcil de configurar um gradiente de presso da coluna
de eluio
Muito reprodutvel

Menos caro
Fluxo de O usurio tem mais controle Mais trabalho intensivo
gravidade
Pode fazer ajustes durante a O fluxo limitado pela gravidade
execuo

Tabela 3 . Sistemas para a separao cromatogrfica de protenas. Resumido da GE.

Tipos de cromatografia em coluna

Os quatro principais tipos de cromatografia em coluna incluem cromatografia de afinidade,


cromatografia de permuta inica (IEX), cromatografia de interao hidrofbica (HIC) e cromatografia
de excluso de tamanho (SEC). A maioria dos esquemas de purificao requer o uso de mais de um
desses tipos de procedimentos cromatogrficos para produzir a pureza necessria para aplicaes a
jusante. A escolha do (s) mtodo (s) cromatogrfico (s) mais apropriado (s) e a ordem desses mtodos
so essenciais para otimizar um esquema de purificao de protenas.

Tipo de Separa Ligar com Elute com


Cromatografia Protenas Por

Nenhum
Uma interao Ligando o ligando (especfico); condies que perturbam as
Afinidade competidor
especfica interaes protena / protena (no especficas)
ligando

Carga de
Fora inica Alta fora inica; Aumento (troca de caties) ou diminuio
Ion Exchange superfcie
baixa (troca de anies) pH
lquida

Interao Alta fora


Hidrofobia Fora inica baixa
hidrofbica inica

Excluso de Raio
tamanho hidrodinmico

Tabela 4 . Os quatro tipos mais comuns de cromatografia em coluna utilizados na purificao de protenas.

Ao analisar a sequncia de uma protena, podem ser identificadas caractersticas nicas que podem
ajudar na sua purificao. O tamanho e a carga de uma protena (a um pH especfico) podem ser
determinados, juntamente com a identificao de grandes extenses de resduos hidrofbicos.

Cromatografia de afinidade

A cromatografia de afinidade baseia-se na ligao especfica e reversvel de uma protena a um


ligando ligado a matriz. O ligando pode se ligar diretamente protena de interesse ou a uma etiqueta
que est covalentemente ligada protena. A cromatografia de afinidade muitas vezes o
procedimento de purificao mais robusto e normalmente usado em estgios iniciais do esquema de
purificao. Dependendo da aplicao a jusante, a purificao por afinidade pode ser o nico passo
cromatogrfico necessrio para obter uma pureza adequada.

A fase estacionria para cromatografia de afinidade feita de uma matriz inerte ligada covalentemente
a um ligando que se liga especificamente a uma protena ou grupo de protenas. A matriz inerte

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tipicamente composta de agarose reticulada


ou poliacrilamida. As protenas podem ser
purificadas por cromatografia de afinidade de
uma forma selectiva ou no selectiva. Na
cromatografia de afinidade selectiva,
utilizado um ligando especfico para uma
protena ou uma etiqueta anexada
covalentemente. Na cromatografia de
afinidade no selectiva tal como Protena A,
Figura 5. A carga lquida sobre uma protena influenciada
G, L para imunoglobulina ou heparina para pelo pH do seu solvente. A pH = pI, a protena tem carga
protenas de ligao ao ADN, ou lectina para lquida zero e, portanto, no se liga a uma troca de caties
ou a uma fase estacionria de permuta aninica. Ajustar o
glicoprotenas, o ligando liga-se a um grupo pH acima ou abaixo do pI da protena levar a uma carga
de protenas com capacidades de ligao lquida, e a ligao de protenas a uma troca de anies
(pH> pI) ou a uma fase estacionria de troca de caties (pH
semelhantes. <pI).

Em ambos os tipos de cromatografia de afinidade, as protenas so carregadas na coluna sob


condies que influenciam a ligao entre a protena (ou marca) e o seu ligando. A protena ligada
lavada em condies que no perturbam a interao especfica, mas isso pode interromper quaisquer
interaes no especficas entre as protenas contaminantes e a fase estacionria. A protena ligada
ento eluda com um tampo contendo uma molcula concorrente ou condies que perturbam todas
as interaes protena / protena. As molculas concorrentes se ligam ao ligando, deslocando a
protena de interesse. Esta molcula concorrente tipicamente removida da protena de interesse
quer atravs de outro procedimento cromatogrfico ou dilise. Os mtodos para eluir protenas da fase
estacionria interrompendo todas as interaes protena / protena incluem ajustar o pH ou a fora
inica do tampo. Estes mtodos podem afectar a estabilidade da protena, e sugere-se que a
protena eluida seja imediatamente neutralizada ou diluda para minimizar os danos causados pelas
protenas. Para algumas formas de cromatografia de afinidade, condies de eluio alternativas
foram descritas para maximizar o rendimento da protena funcional [19 , 20 ].

Na concepo de um
Protena para Purificar Ligando Elute com plasmdeo para a
Anticorpo (especfico do expresso da protena, as
Pptido antignico Ppito livre
antgeno) etiquetas de afinidade
Protena marcada com 2+ 2+ Imidazol ou histidina podem ser inseridas nos
polihistidina Ni ou Co livre terminais N ou C (ou em
Protena marcada com Anticorpo especfico de Pptido FLAG ou pH casos raros, em laos
FLAG FLAG baixo flexveis de protenas com
Protena marcada com estruturas conhecidas)
Reduo de glutationa Glutationa livre
GST para auxiliar na
Anticorpo especfico de purificao. Consulte o
Protena marcada com Myc PH baixo
Myc levantamento de Labome
Anticorpo (especfico da em tags protena / protide
Protena A, G ou L Extremos em pH
classe) para obter uma lista de
Protena de ligao ao DNA Heparina Alta fora inica tags comuns e discusses
relacionadas a etiquetas.
Tabela 5 . Exemplos de formas seletivas e no seletivas de cromatografia de
afinidade com o grupo funcional (ligando) usado para especificidade e condies
de eluio tpicas. Resumido de Thermo Fisher Pierce e GE. Veja abaixo os Os anticorpos so
fornecedores comuns para diferentes tipos de colunas com base em uma pesquisa frequentemente
Labome de mais de 200 publicaes.
purificados com base na
interao altamente
especfica que ocorre entre um anticorpo e seu antgeno (a sequncia reconhecida pelo anticorpo).
Um pptido contendo o antignio pode ser acoplado a uma matriz para ligao especfica do
anticorpo. A reduo do pH do tampo de eluio interrompe a interaco anticorpo / pptido para
libertar o anticorpo ligado. Este mtodo frequentemente utilizado comercialmente no isolamento de
anticorpos do soro bruto.

As protenas tambm podem ser purificadas por afinidade de uma maneira no seletiva. Na
purificao no selectiva, o ligando ligado fase estacionria liga-se a um grupo de protenas com

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parceiros de ligao semelhantes. Um exemplo de


purificao de afinidade no selectiva est na purificao
de protenas de ligao a ADN. A heparina imita o DNA
tanto na sua estrutura como na sua carga, e pode ser
usado como o ligando para a purificao por afinidade das
protenas de ligao ao DNA. Embora todas as protenas
de ligao a DNA possam teoricamente se ligar a esta fase
estacionria, a maioria das outras protenas fluir sem
ligao, levando a enriquecimento suficiente da protena de
interesse. Outro exemplo o enriquecimento de anticorpos
pela ligao de sua regio constante (Fc) s colunas de
afinidade da protena A, Protena A, G ou L. GE Healthcare
so uma escolha comum [ 21- 23 ], assim como a protena

Figura 6. Cromatografia de permuta inica.


G [ 24 ].
As protenas so ligadas a uma fase
estacionria carregada com baixa fora
Utilizando um modo de ligao semelhante (um anticorpo
inica. As protenas ligadas podem ser
eludas, quer por aumento da fora inica do ligado a um ligando de Protena A, G ou L), a regio de
tampo, quer pelo ajuste do pH. ligao ao antignio (Fab) do anticorpo ainda est
disponvel para ligao ao seu antignio especfico. Assim,
protenas especficas podem ser purificadas com base na interaco especfica entre o ligando /
anticorpo acoplado e o anticorpo / antignio.

Problemas comuns e resoluo de problemas esto listados na Tabela 6.

Problema Causa Soluo

Tag no foi traduzido ou no est Verifique a seqncia do plasmdeo ou mova a


acessvel tag para um local diferente

As condies de encadernao no
Protena no se liga Ajuste as condies do buffer
so apropriadas

No foi permitido tempo suficiente Diminua a taxa de fluxo ou a coluna de parada


para a ligao para permitir a incubao

Aumentar a concentrao do competidor


A afinidade entre o ligando e a
(especfico) ou rigor das condies (no
etiqueta muito alta
Protena no eluda especficas)

Ajuste as condies do buffer para uma maior


Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

A taxa de fluxo muito rpida ou


Ajustar a taxa de fluxo
muito lenta

Lavar com tampo de severidade maior; Fase


A coluna no foi lavada o suficiente
estacionria limpa de acordo com o fabricante
Baixa resoluo Ajuste as condies do buffer para uma maior
Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

Aumentar a concentrao do competidor


As condies de eluio no so
(especfico) ou ajustar as condies (no
suficientemente rigorosas
especficas)

A protena desdobrada ou Ajuste as condies do buffer para uma maior


agregada estabilidade da protena
Protena perde atividade
durante o procedimento Um cofator necessrio para a
atividade foi removido durante a Adicionar cofactor
purificao

Tabela 6 . Soluo de problemas de cromatografia de afinidade. Resumido da GE.

Cromatografia de troca de ies (IEX)

A cromatografia de permuta de ons (IEX) separa as protenas com base na carga de superfcie
lquida, atravs de interaes eletrostticas que ocorrem entre as protenas e uma fase estacionada
carregada. Existem dois tipos de IEX: (1) troca de anies (fase estacionria carregada positivamente
que se liga a protenas carregadas negativamente); e (2) troca de caties (fase estacionria carregada

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negativamente que se liga a protenas carregadas positivamente). A cromatografia de permuta de ies


comumente utilizada como um passo intermedirio num esquema de purificao de protenas; no
entanto, pode produzir alta resoluo para algumas protenas quando usadas anteriormente ou mais
tarde durante a purificao.

Todas as protenas exibem uma carga lquida que depende da composio de aminocidos da
protena e de quaisquer modificaes covalentemente anexadas. A carga lquida de uma protena
influenciada pelo pH do solvente em que dissolvido, pois os solventes trocam ies de hidrognio
com protenas. O ponto isoeltrico (pI) de uma protena o pH ao qual a protena no tem carga
lquida. A um pH acima do pI, uma protena ter uma carga negativa lquida, enquanto um pH abaixo
do pI levar a uma carga positiva lquida. Assim, o pH do solvente pode ser ajustado para facilitar a
ligao ao IEX ou para promover a eluio de uma protena ligada.

Teoricamente, todas as protenas podem se ligar troca de


caties e troca de anies se o pH do tampo for ajustado
em conformidade. No entanto, para a purificao de
protenas, a estabilidade da protena a considerao
mais importante na escolha das condies de purificao
e, portanto, a coluna mais apropriada para a ligao das
protenas. Portanto, necessrio determinar se as
condies necessrias para a ligao a qualquer das
formas de cromatografia de permuta inica afetam a
estabilidade e a funo da protena. Normalmente, as
condies para se ligar a um tipo de permuta inica so
mais adequadas para uma protena especfica do que a
outra.
Figura 7. Cromatografia de interao
hidrfoba. Com alta fora inica, as
O conhecimento do ponto isoeltrico de uma protena pode protenas so parcialmente desolvatadas,
fazendo com que adotem conformaes
auxiliar na determinao do tipo de cromatografia de alternativas nas quais os resduos
permuta inica mais adequada. Ferramentas on-line esto hidrofbicos normalmente enterrados esto
mais expostos. Estes resduos podem ento
disponveis para calcular o pI terico de uma EXPASE DE formar interaes hidrofbicas com os
PROTEO . Estes clculos so baseados inteiramente na grupos funcionais hidrofbicos conjugados
com uma matriz. Reduzir a fora inica faz
sequncia de aminocidos de uma protena e no com que a protena retorne na sua
consideram a estrutura tridimensional da protena. Em seu conformao nativa, enterrando seus
resduos hidrofbicos. Isso diminui as
estado nativo, alguns resduos de uma protena esto mais interaes hidrofbicas entre a protena e a
expostos do que outros e, portanto, a carga real da fase estacionria, facilitando a eluio
protica.
superfcie e da superfcie lquida por vezes diferente
daqueles determinados teoricamente [ 25 ]. A distribuio
de aminocidos um em relao ao outro tambm pode afetar o pI de uma protena [ 26], e isso no
levado em considerao com os clculos tericos da pI. Algumas tcnicas permitem a determinao
experimental da pI de uma protena em seu estado nativo, incluindo focagem isoeltrica eletrofortica [
27 ], focagem isoeltrica capilar [ 28 ] e uma abordagem mais recente baseada em luminescncia de
alto rendimento [ 29 ].

Normalmente, a ligao de uma protena ao IEX deve ser determinada por tentativa e erro, usando
solventes com uma gama de valores de pH, para determinar o pH ideal para a reteno de protenas.
Um pH de solvente que cerca de uma unidade de pH longe do pI geralmente suficiente para a
ligao de protenas [ 30 ]; no entanto, em alguns casos necessrio um pH mais do pI [ 31 ].

A fase estacionria do IEX composta por uma matriz inerte base de agarose ou polimrica com um
grupo carregado covalentemente ligado. As partculas da matriz esto disponveis em vrios tamanhos
e podem ser no porosas ou podem conter poros de tamanho varivel. A escolha da matriz depende
da capacidade de ligao desejada, resoluo e taxa de fluxo. Os tamanhos de partculas menores
oferecem maior resoluo, mas requer taxas de fluxo mais baixas e demoram mais para serem
executadas. As matrizes porosas oferecem uma maior capacidade de ligao do que as matrizes no
porosas. Numa matriz no porosa, as protenas no podem entrar na resina e, assim, oferecem uma
maior recuperao da amostra, maior resoluo e tempos de execuo mais curtos do que as matrizes
porosas. Um estudo mostrou que, para a maioria das protenas, a resoluo e a recuperao so

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semelhantes quando separadas por uma matriz porosa versus no porosa; no entanto, para protenas
maiores,32 ].

Os quatro grupos funcionais carregados mais


comumente usados no IEX so mostrados abaixo.
Estes so classificados como trocadores fortes ou
fracos, com permutadores fortes sendo ionizados em
uma faixa de pH mais ampla do que trocadores
fracos.

Troca de anies (fase estacionria carregada


positivamente):
1. Amnio quaternrio (Q) - permutador de anies forte

2. Dietilaminoetilo (DEAE) - permutador de anies fraco

Figura 8. Protena eluda de uma coluna de


interao hidrofbica com um gradiente
Troca de caties (fase estacionria carregada
decrescente de sal (sulfato de amnio). As fraes negativamente):
foram analisadas quanto ao teor de protena total e
atividade especfica para a protena de interesse. 1. sulfonato de metilo (S) - permutador de caties forte
O pico centrado na frao 45 contm a protena de
interesse, como indicado pela atividade protica. 2. permutador de caties de carboximetilo (CM) - fraco
De http://www.insectscience.org/9.04/.
Os trocadores fortes devem ser usados quando o pH
necessrio para a ligao muito cido ou bsico (assumindo que este pH tambm apropriado para
manter a estabilidade da protena), pois os grupos funcionais permanecem carregados em uma faixa
de pH maior [ 33 ]. Os trocadores fracos demonstraram fornecer menos reteno de algumas
protenas, permitindo sua eluio em fora inica inferior [ 34 ]. Uma vez que a alta fora inica pode
afetar a estabilidade de algumas protenas [ 35 ], trocadores fracos podem ser mais adequados para
protenas que no requerem um pH extremo para a ligao.

Na cromatografia de permuta inica, a fase estacionria primeiro equilibrada com um tampo de


fora inica baixa. A amostra de protena ento carregada na fase estacionria no mesmo tampo
de fora inica baixa usado para equilbrio. A protena ligada lavada extensivamente antes da
eluio com um tampo de fora inica mais elevado ou, em alguns casos, um tampo com pH
alterado (Figura 6). Os contornos no buffer de eluio interagem com a fase estacionada carregada,
deslocando a protena ligada. Certos sais so mais eficientes para uso em cromatografia de permuta
inica do que outros, devido sua capacidade de deslocar as protenas ligadas e seus efeitos sobre a
+
estabilidade da protena [ 36 ]. Tipicamente NaCl ou KCl utilizado para eluio, com Na ou K
+
servindo como contra-indicao na cromatografia de permuta catinica e Cl- servindo como contra-
anio na cromatografia de permuta aninica. Alternativamente, o pH do tampo pode ser alterado para
reduzir a carga da protena e interromper sua interao com a fase estacionria. Para as protenas
ligadas a uma fase estacionria de troca de caties, o aumento do pH do tampo conduzir a uma
menor carga positiva sobre a protena e subsequente eluio da coluna. Para as protenas ligadas a
uma fase estacionria de permuta aninica, diminuir o pH do tampo levar a uma menor carga
negativa sobre a protena e subsequente eluio da coluna.

Alternativamente, o pH do tampo pode ser


ajustado de modo que a protena de interesse
no se liga fase estacionria de permuta
inica enquanto as protenas contaminantes o
fazem. Neste caso, a protena de interesse
coletada no fluxo, enquanto algumas
protenas contaminantes so removidas pela
sua ligao fase estacionria.

Tal como acontece com outros mtodos Figura 9. Uma mistura de trs protenas de raio
cromatogrficos, a cromatografia de permuta hidrodinmico varivel carregada em uma coluna de
excluso de tamanho. As protenas grandes eluem
inica pode exigir uma soluo de problemas primeiro, uma vez que no conseguem entrar nos poros da
matriz e tm um caminho direto atravs da coluna. As
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para determinar as condies ideais para protenas mais pequenas podem entrar nos poros, ter um
caminho mais complicado e, assim, levar mais tempo para
ligao de protenas, eluio de protenas e percorrer a matriz e eluir da coluna.
resoluo adequada.

Problema Causa Soluo

Execute mais buffer de equilbrio atravs da


A coluna no estava equilibrada
coluna e recarregue a protena

A fora inica do buffer de ligao


Protena no se liga Fora inica inferior do tampo
muito alta

O pH no est suficientemente longe Ajustar o pH do buffer (menor para troca de


do pI caties, maior para troca de anies)

A fora inica do buffer de eluio


Aumente a fora inica
muito baixa
Protena no eluda
Ajuste as condies do buffer para uma maior
Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

A taxa de fluxo muito rpida ou


Ajustar a taxa de fluxo
muito lenta

Lavar com um tampo de fora inica superior;


Baixa resoluo A coluna no foi lavada o suficiente Fase estacionria limpa de acordo com o
fabricante

Ajuste as condies do buffer para uma maior


Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

A protena desdobrada ou Ajuste as condies do buffer para uma maior


Protena perde agregada estabilidade da protena
atividade durante o Um cofator necessrio para a
procedimento atividade foi removido durante a Adicionar cofactor
purificao

Tabela 7 . Resoluo de problemas de cromatografia de permuta inica. Resumido da GE.

Cromatografia de Interao Hidrofbica (HIC)

A cromatografia de interao hidrofbica (HIC) separa as protenas com base na sua hidrofobicidade e
freqentemente usada como um passo intermedirio em um esquema de purificao. As protenas
so ligadas a uma fase estacionria em um tampo de alta fora inica e, portanto, a HIC pode
tipicamente ser realizada imediatamente aps cromatografia de permuta inica sem troca de tampo
ou diluio requerida. HIC tambm comumente realizada aps uma precipitao de sulfato de
amnio, um procedimento que pode ser usado para remover rapidamente protenas, precipitando
algumas, mas no todas, protenas com sal. HIC s vezes aplicvel em etapas iniciais de um
esquema de purificao ou como um passo final na remoo de vestgios de impurezas da protena de
interesse.

A presena de ons sal em soluo pode levar ao desdobramento parcial de uma protena e
exposio de resduos hidrofbicos normalmente enterrados. As protenas que se ligam fase
estacionria adotam sua conformao nativa medida que o tampo com uma fora inica inferior
adicionado. Isso diminui a exposio de resduos hidrofbicos que podem interagir com a fase
estacionria e facilita a eluio da coluna. Para as protenas que podem redobrar espontaneamente
atravs de uma diminuio da fora inica, o HIC pode ser um mtodo cromatogrfico valioso para a
purificao.

Tipicamente, a fora inica do tampo de ligao deve ser to baixa quanto possvel para ligar a
protena de interesse, evitando a sua precipitao. Se a fora inica necessria para a ligao
protena alta e provoca a precipitao da protena de interesse, pode ser utilizada uma fora inica
inferior. Neste caso, o procedimento de cromatografia pode ser usado para separar todas as protenas
de ligao da protena de interesse que flui sem ligao.

Antes de carregar a amostra na coluna, a fase estacionria deve ser equilibrada com o tampo de alta
fora inica (o mesmo tampo em que a amostra de protena ser aplicada). A amostra ento

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carregada na coluna, a coluna lavada extensivamente e a protena eluda com um tampo de fora
inica baixa (Figuras 7 e 8).

A fase estacionria utilizada na cromatografia de interao hidrofbica composta por uma matriz
base de agarose reticulada ou um copolmero sinttico. Um ligando de alquilo ou arilo ento
conjugado com a matriz de base, proporcionando especificidade para molculas hidrofbicas.

Tipos de grupos funcionais:


1. Alquilo - uma cadeia hidrocarbonada de vrios tamanhos; frequentemente utilizado um grupo butilo ou octilo. A
capacidade de ligao da fase estacionria aumentada com o aumento do comprimento da cadeia de alquilo [ 37 ].
Os grupos funcionais se ligam a protenas inteiramente baseadas na hidrofobia da protena
2. Arilo - um grupo funcional derivado de um anel aromtico; frequentemente um grupo fenilo. Os grupos arilo oferecem
especificidade crescente, pois as protenas tambm podem interagir com o grupo funcional atravs de interaes de
empilhamento de bases.

O tipo e a concentrao de sal utilizados para ligao e eluio devem ser determinados
empiricamente para cada protena. Alm disso, o redoblemento e a funo da protena devem ser
assegurados aps sua eluio.

Como outras formas de cromatografia em coluna, um timo procedimento HIC pode exigir uma grande
soluo de problemas. necessrio ajustar as condies do buffer e a fase estacionria para cada
protena para assegurar a separao ideal.

Problema Causa Soluo

Execute mais buffer de equilbrio atravs da coluna e


A coluna no estava equilibrada
recarregue a protena

A fora inica do buffer de ligao


Protena no se liga Aumente a fora inica do buffer
muito baixa

Protena agregada fora inica Diminua a fora inica do buffer ou experimente um


utilizada sal diferente

A fora inica do buffer de eluio


Diminua a fora inica
muito alta

Ajuste as condies do buffer para uma maior


Protena no eluda Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

Experimente uma fase estacionria diferente que


A reteno muito alta
oferea menos reteno

A taxa de fluxo muito rpida ou


Ajustar a taxa de fluxo
muito lenta

A coluna no foi lavada o Lavar com um tampo de fora inica inferior; Fase
suficiente estacionria limpa de acordo com o fabricante
Baixa resoluo
Ajuste as condies do buffer para uma maior
Protena agregada na coluna
estabilidade da protena

Experimente uma fase estacionria diferente que


Pobre reteno na coluna
oferea maior reteno

A protena desdobrada ou Ajuste as condies do buffer para uma maior


agregada estabilidade da protena

Tente ligar com um sal diferente ou com uma fora


Protena perde A protena no retornou sua
inica inferior; Incluir aditivos para a estabilidade da
atividade durante o conformao nativa
protena
procedimento
Um cofator necessrio para a
atividade foi removido durante a Adicionar cofactor
purificao

Tabela 8 . Soluo de problemas de cromatografia de interao hidrofbica. Resumido da GE.

Cromatografia de excluso de tamanho (SEC)

A cromatografia de excluso de tamanho separa as protenas pelo seu raio hidrodinmico, uma
propriedade determinada pelo tamanho e forma da molcula. Ao contrrio dos outros procedimentos
cromatogrficos descritos anteriormente, as protenas no se ligam a uma fase estacionria na SEC.

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Em vez disso, as protenas so separadas pela velocidade na qual eles navegam atravs de uma fase
estacionria inerte (Figura 9).

SEC um mtodo valioso usado com mais freqncia nas etapas finais de um esquema de
purificao devido sua capacidade de diferenciar entre diferentes espcies de uma protena. As
espcies oligomricas [ 38 ], as molculas de protenas desdobradas [ 39 ] e as espcies truncadas [
40 ] podem ser separadas da protena nativa, enquanto simultaneamente trocam os componentes do
tampo. Muitas vezes, o SEC usado como um mtodo de troca de buffer mais rpido e confivel do
que a dilise, pois compatvel com mais solventes e requer menos buffer. Um nico solvente usado
em todo o procedimento SEC completo, e as fases estacionrias da SEC comercialmente disponveis
so compatveis com os componentes do buffer mais comumente usados.

O tipo de fase estacionria utilizada eo comprimento da coluna desempenham papis crticos na


influncia da resoluo de protenas separadas pela SEC. Vrios tipos de fases estacionrias esto
comercialmente disponveis e a melhor opo depende tanto do peso molecular das protenas que
requerem separao quanto das condies sob as quais a separao ser realizada.

Tipo de fase Matriz Caractersticas


estacionria

Oferece troca rpida de buffer e separao


grupal
Funciona bem para a determinao do peso
molecular
Sephadex Dextrano reticulado e epicloridrina Autoclavvel
Matriz pode encolher em certos solventes
Tipos especficos de sephadex esto
disponveis para uso com solventes
orgnicos

Separa molculas em um grande intervalo de


peso molecular
O dextrano de alilo reticulado e a bis-
Sephacryl
acrilamida de N, N-metileno
Autoclavvel
Funciona com solventes aquosos e orgnicos
Alta recuperao

Separa molculas em um grande intervalo de


peso molecular
Sepharose Agarose reticulada
Alta recuperao
No pode ser autoclavado

Funciona com solventes aquosos e orgnicos


Autoclavvel
Superose Agarose altamente reticulada As interaes hidrofbicas entre protenas e
matriz so possveis
Compatvel com solventes viscosa

Funciona com solventes aquosos e orgnicos


Autoclavvel
Superdex Agarose e dextrano reticulado
Alta resoluo
Alta recuperao

Tabela 9 . Tipos de fases estacionrias comercialmente disponveis para cromatografia de excluso de tamanho e
caractersticas de cada uma. Resumido da GE e da Simga-Aldrich.

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O Superdex muitas vezes a melhor opo para os procedimentos tpicos da SEC, pois compatvel
com a maioria dos solventes e oferece a maior resoluo de todas as fases estacionrias disponveis.

Tal como acontece com outros mtodos cromatogrficos, existem vantagens e desvantagens para a
SEC, e a deciso de usar este mtodo depende da protena e da sua aplicao a jusante.

Vantagens da SEC:
1. Fornece troca de buffer e dessalinizao.

2. Permite a separao de espcies semelhantes (por exemplo, truncamentos e oligmeros) que podem no ser
separados com outras tcnicas de purificao.
3. compatvel com muitos solventes.

4. No depende de nenhuma propriedade protica especfica para reteno e eluio.

Desvantagens da SEC:
1. O desempenho muito sensvel embalagem de colunas.

2. Pode ter interaes inespecficas entre protena e resina, o que diminui a resoluo.
3. Oferece baixa resoluo para misturas de protenas complexas.

4. A amostra deve ser carregada em um pequeno volume para uma resoluo adequada. Isso pode ser problemtico
para protenas que precipitam em altas concentraes.

Otimizar as condies da SEC para alcanar a mxima resoluo muitas vezes demorado, mas
certos fatores podem ter um enorme impacto na resoluo.

Condies que aumentam a resoluo de protenas com SEC:


1. Minimize o volume da amostra. Quanto menor o volume, menos difundiro as fraes eludas.

2. Adicione sal ao buffer. Uma pequena quantidade de sal ajudar a prevenir interaes inespecficas entre a protena e
a fase estacionria. Isso permitir que todas as molculas de protena funcionem consistentemente ao longo da
extenso da coluna.

3. Use uma taxa de fluxo moderada. Executar uma coluna com muita rapidez no permitir tempo para que as
molculas pequenas entrem nos poros da matriz, enquanto uma taxa de fluxo que muito lenta permite mais tempo
para a difuso da amostra.
4. Certifique-se de que a amostra e as viscosidades do solvente sejam semelhantes. Ajuste as condies da amostra
para coincidir aproximadamente com a do buffer em execuo.

5. Ajuste o comprimento da coluna. Uma coluna que muito curta no permitir a separao adequada de protenas.
Alternativamente, uma coluna que muito longa levar difuso da amostra de protena.
6. Re-empacota a coluna. A embalagem da coluna pode ter um efeito enorme na resoluo da protena.

Se as partculas no esto bem dispersas ou se as bolhas de ar estiverem presas na coluna, a


navegao atravs da fase estacionria no ocorrer corretamente. Alm disso, se a coluna estiver
seca, ela deve ser reembalada. A m embalagem das colunas muitas vezes culpada por uma baixa
resoluo inexplicada.

Como a SEC no separa as protenas com base em interaes com um grupo funcional, todas as
protenas so eludas nas mesmas condies e, portanto, a resoluo s pode ser obtida para
protenas de raio hidrodinmico muito diferente. Portanto, SEC no um mtodo cromatogrfico
apropriado para estgios iniciais de um esquema de purificao quando h muitas protenas
contaminantes. A SEC, no entanto, oferece um mtodo rpido e confivel para remover sais ou
molculas pequenas de uma amostra entre estgios iniciais ou intermedirios da purificao. Nos
estgios finais da purificao, quando existem apenas vestgios de contaminantes, o SEC um
mtodo valioso para isolamento e troca de protenas em buffer de armazenamento.

Eluo e Anlise de Protenas


Mtodos de Eluio de Protenas

As protenas que se ligam a uma fase estacionria so eludas com condies de solvente que
perturbam as interaes de ligao. Estas condies de eluio variam tanto pelo tipo de
cromatografia quanto pelas propriedades da protena de interesse. Existem trs mtodos gerais de
eluio protica: eluio em lotes, eluio gradual e eluio gradiente linear. O melhor mtodo a
escolher depende do tipo de cromatografia em execuo e da resoluo requerida.
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1. Por lotes - uma nica condio de eluio desloca todas as protenas ligadas em uma nica etapa. Este mecanismo
funciona melhor para procedimentos cromatogrficos baseados em uma interao muito especfica (ou seja,
cromatografia de afinidade). A elution em lote no oferece nenhuma resoluo, mas ideal para se livrar de
contaminantes muito rapidamente. Requer conhecimento prvio das condies de amortecimento necessrias para o
deslocamento da protena de interesse.
2. Stepwise - mltiplas elues em lotes so realizadas sequencialmente, com condies mais rigorosas em cada
etapa. Na eluio gradual, o nmero de fraces recolhidas depende do nmero de condies de eluio
sequenciais. A eluio progressiva proporciona uma resoluo melhor do que a eluio em lotes, mas uma resoluo
mais fraca do que a eluio gradiente linear.
3. Gradiente linear - mltiplas fraces consecutivas so recolhidas enquanto as condies de eluio so ajustadas de
forma linear. Um gradiente linear oferece a resoluo mais alta para cromatografia de permuta inica e cromatografia
de interao hidrofbica. Normalmente, um grande nmero de fraes consecutivas so coletadas.

A cromatografia de excluso de tamanho no requer nenhum destes mtodos de eluio, uma vez que
no ocorrem interaces entre a protena e a fase estacionria. A protena carregada na coluna, e
um grande nmero de fraes so coletadas at que todas as protenas sejam eludas, sem alterar as
condies do buffer durante todo o procedimento.

Idealmente, o tampo de eluio de uma coluna compatvel com a coluna subseqente, eliminando
a necessidade de troca de buffer ou dilise entre as etapas de purificao.

Mtodos de cromatografia menos comuns

A hidroxiapatita (fosfato de clcio hidroxilado) uma tcnica de purificao de protenas descrita


originalmente em meados da dcada de 1950 [ 41 ]. A disponibilidade comercial de hidroxiapatita
esfrica tornou a cromatografia em coluna de hidroxiapatita uma tcnica acessvel [ 42 ]. Os
mecanismos subjacentes interao de protenas com colunas de hidroxiapatita so complexos. As
protenas so mais comumente eludas com gradientes de fosfato. (veja [ 42 ] para uma discusso). A
hidroxiapatita tem diferentes propriedades de seletividade para outras tcnicas de cromatografia e,
portanto, pode proporcionar uma adio til purificao de protenas difceis de purificar ou como um
passo final de "polimento". A cromatografia de hidroxiapatita foi utilizada com sucesso na purificao
de anticorpos de grau teraputico [43 ].

Cromatofocusing um mtodo de cromatografia em coluna que separa protenas com base em seu pI.
As protenas so ligadas a meios especializados de permuta inica e eluram com um gradiente de pH
[ 44 ]. A seletividade da cromatofoculao diferente da de outras tcnicas e, portanto, til como um
passo final de "polimento" [ 45 ].

Anlise da Pureza da Frao

Aps cada separao cromatogrfica, as fraes devem ser analisadas para determinar as fraes
que contm a protena de interesse e a pureza relativa de cada uma dessas fraes. Esta anlise
necessria aps cada passo para decidir quais as fraes devem ser agrupadas para uso posterior.
Para determinar a pureza, necessrio um ensaio que pode medir a quantidade de uma protena
especfica em relao quantidade de protena total. Os seguintes ensaios so rotineiramente
utilizados para anlise de pureza:

1. Electroforese em gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sdio (SDS-PAGE) - um gel


desnaturante que separa as protenas com base no tamanho. As manchas comercialmente
disponveis permitem uma representao visual de todas as protenas na amostra, oferecendo
uma avaliao qualitativa da pureza da protena (Figura 10). O SDS-PAGE no ideal para
anlise de fraes de alto rendimento e pode demorar vrias horas; no entanto, usado com
mais freqncia porque fcil, barato e adequado para qualquer protena.

2. Espectroscopia - um mtodo para analisar as propriedades pticas das protenas. Esta tcnica para analisar a
pureza da protena adequada para protenas, como o citocromo P450, que possuem uma caracterstica
espectroscpica nica. As protenas desta famlia absorvem a luz em um comprimento de onda onde outras
protenas no (cerca de 420 nanmetros [ 46 ]), de modo que uma comparao de absorvncia em 420 nanmetros
contra 280 nanmetros (o comprimento de onda em que todas as protenas absorvem) pode fornecer uma medida
quantitativa de pureza da protena. Este mtodo rpido e de alto rendimento, mas apenas adequado para algumas
protenas.
3. Atividade protica - um teste enzimtico que depende da protena de interesse. Este mtodo de avaliao da pureza
da protena frequentemente acoplado a outra forma de determinao da concentrao de protena para calcular a
atividade em relao concentrao total de protena. Os ensaios de atividade so apenas adequados para
protenas com atividade do que podem ser facilmente monitorados em um formato de alto rendimento, como
proteases. Para algumas protenas, os ensaios de atividade fornecem um mtodo rpido e confivel para a deteco

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de protenas. A medida da atividade muitas vezes ideal para
enzimas, porque a protena que perdeu atividade pode ser
excluda do uso subseqente.

Figura 10. SDS-PAGE de amostras


coletadas durante um esquema de
purificao de protena. O gel corado para
a visualizao de todas as protenas. De
http://www.omicsonline.org/.

Armazenamento Proteico Purificado


Quando as protenas so consideradas puras o suficiente para uso em estudos experimentais, elas
devem ser armazenadas adequadamente. A seleo de um buffer de armazenamento final to
importante quanto a seleo de buffers usados durante o esquema de purificao e deve depender da
estabilidade da protena e das condies necessrias para a aplicao a jusante da protena
purificada. Muitas vezes, a cromatografia de excluso de tamanho selecionada como um passo final
no esquema de purificao, uma vez que o tampo de armazenamento pode ser usado neste passo
cromatogrfico para trocar efetivamente o tampo. As fraes puras podem ser agrupadas para
armazenamento imediato. Alternativamente, as fraes agrupadas finais podem ser dialisadas no
buffer selecionado antes do armazenamento.

As condies de armazenamento de protenas dependem da protena de interesse e devem ser


otimizadas para que a protena mantenha a estabilidade estrutural e funcional em longos perodos de
armazenamento. Os aditivos so freqentemente includos no buffer de armazenamento para melhorar
a vida til das protenas purificadas em condies de armazenamento, e muitas vezes necessrio
testar e erro para determinar as condies ideais, uma vez que todas as protenas se comportam de
forma diferente.

Purificao de protena de alto rendimento

Nesta era ps-genmica, h muito interesse na purificao de protenas de alto rendimento tanto para
determinao estrutural quanto para descoberta de drogas / rastreio de compostos. Para exibir uma
ampla gama de construes e selecionar o (s) timo (s) para o uso final desejado, os pesquisadores
utilizaram uma srie de sistemas automatizados / robotizados comercialmente disponveis que
permitem a purificao rpida, paralela (semi-) automatizada de etiquetas de afinidade protenas [ 47 ,
48 ]. Os princpios bsicos da protena ainda se aplicam; A robtica de manuseio de lquidos /
plataformas automatizadas simplesmente usada para facilitar a agilizao e acelerar o processo de
purificao.

Protenas de membrana

Cerca de 20 a 30% das protenas produzidas por clulas so protenas de membrana integrais e cerca
de 50% de drogas de molculas pequenas atuam sobre protenas de membrana [ 49 ]. Assim, existe
um grande interesse em resolver a estrutura das protenas da membrana. Um passo crucial na
purificao das protenas da membrana integral a sua solubilizao a partir da bicamada lipdica,
mantendo a sua integridade funcional. A abordagem tpica envolve o isolamento de membranas
intracelulares por centrifugao seguida de solubilizao de detergente de protenas de membrana
integral e centrifugao de alta velocidade para remover resduos de membrana insolveis [ 50 - 52 ].
Uma ampla gama de detergentes foi empregada para a solubilizao da protena da membrana [ 53 -
55] e, na ausncia de literatura ou precedente de laboratrio, o investigador precisar determinar
empiricamente o melhor detergente para sua protena particular. A protena de membrana solubilizada

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pode ento ser purificada por cromatografia em coluna essencialmente da mesma maneira que para
protenas solveis. No entanto, os tampes de purificao precisaro conter detergentes para manter
a protena em estado solvel [ 56 , 57 ]. A purificao das protenas da membrana muitas vezes
extremamente desafiadora devido perda da integridade funcional da protena e da agregao aps a
remoo inicial da bicamada lipdica e atravs das vrias etapas de purificao. No entanto, vrios
grupos purificaram com sucesso as protenas de membrana em quantidades suficientes para a
determinao da estrutura (ver, por exemplo, Consrcio de Genmica Estrutural ). Recentemente, os
nanodiscos foram empregados com sucesso na purificao por afinidade de um GPCR da Famlia B
(ver artigo de Labome sobre nanodiscos ) [ 58 ].

Pesquisa Labome de literatura citando purificao de protenas

Labome pesquisou aleatoriamente 305 publicaes citando mtodos de purificao de protenas. A


Tabela 10 lista os principais fornecedores e mtodos de purificao. Os mtodos de afinidade e
excluso de tamanho so abordagens mais comumente usadas na literatura. A GE Healthcare o
fornecedor predominante para todos os mtodos e a Qiagen o fornecedor significativo de purificao
de protenas com base em etiquetas HIS e Sigma Aldrich, da marca baseada em FLAG.

tipo fornecedor principal marca num referncias


afinidade

Qiagen Ni-NTA agarose 58 [ 11 , 15 , 22 , 59 - 113 ]

Ni Sepharose, HisTrap
GE Healthcare 32 [ 10 , 14 , 16 , 18 , 73 , 91 , 114 - 139 ]
FF / HP
DELE Afinidade de metal
Clontech 20 [ 10 , 140 - 158 ]
TALON

Thermo Fisher /
HisPur Cobalt resin 7 [ 159 - 165 ]
Invitrogen

[ 13 - 15 , 59 - 62 , 65 , 68 , 71 , 73 , 76 , 77 , 81 , 83 ,
glutationa Sepharose 98 , 107 , 109 , 111 , 119 , 125 , 130 , 144 , 160 , 166 -
GE Healthcare 63
GST 4B 204 ]

Sigma-Aldrich glutationa agarose 3 [ 101 , 205 , 206 ]

BANDEIRA Sigma-Aldrich Afinidade de FLAG M2 17 [ 65 , 120 , 159 , 195 , 207 - 219 ]

Protena
de ligao GE Healthcare heparina 15 [ 14 , 68 , 107 , 115 , 122 , 195 , 219 - 227 ]
ao DNA

protena de
ligao a New England Biolabs resina de amilose 8 [ 101 , 122 , 221 , 228 - 232 ]
maltose

Outros sistemas de purificao de protena base de afinidade citados incluem Vector Laboratories agarose-bound jacalina
para 0-ligados glicoprotenas [ 149 ], Roche anti-protea de matriz C afinidade [ 120 ], os sistemas baseados em strepbiotin da
Thermo Fisher Pierce [ 157 , 233 - 235 ] , de EMD Millipore [ 161 , 236 ], de Qiagen [ 127 ], de IBA [ 66 ] e de Sigma-Aldrich [
233 ], resina de imunoafinidade Sigma-Aldrich Myc [ 213 ], para protenas de ligao a ies metlicos, GE Healthcare
Chelating Sepharose Fast Flow [ 225 ] e GE Healthcare HiTrap IMAC coluna HP [ 137], GE Healthcare Life Sciences HiTrap
Protein A [ 22 ], GE Healthcare IgG Sepharose [ 237 ], GE Healthcare poly (A) -Sepharose 4B [ 14 ], Thermo Scientific
SulfoLink resin [ 238 ], BioRad Affi-Gel 10 resin [ 238 ], RepliGen protena A agarose [ 238 ] e Sigma V5-agarose [ 173 ], Bio-
Rad Affigel [ 238 - 240 ].
excluso de tamanho

[ 9 , 11 , 14 - 17 , 22 , 63 , 66 , 68 , 73 , 76 , 83 , 84 ,
88 , 91 - 93 , 98 , 100 , 102 , 104 , 107 , 108 , 110 ,
Superdex / Superose / 111 , 114 - 117 , 121 , 122 , 124, 127 , 129 , 131 , 133
GE-Healthcare 91
Sephacryl - 135 , 137 - 140 , 144 , 148 , 151 , 155 , 159 , 165 ,
169 , 182 , 186 , 195 , 199 , 219 , 224 , 225 , 227 ,
239 , 241 - 272 ]

permuta inica

anio GE Healthcare Coluna MonoQ 9 [ 85 , 88 , 97 , 110 , 111 , 125 , 159 , 262 , 273 ]

GE Healthcare HiTrap Q 6 [ 73 , 87 , 88 , 113 , 135 , 247 ]

GE Healthcare Fonte 15Q 2 [ 101 , 155 ]

GE Healthcare Q-Sepharose 1 [ 83 ]

Que homem Resina de troca de 1 [ 223 ]


anies DE52
https://www.labome.com/method/Protein-Purification.html 17/27
13/10/2017 Protein Purification

catio GE Healthcare Coluna Mono S 6 [ 15 , 67 , 83 , 111 , 127 , 270 ]

interao hidrofbica

Cuidados de sade da
fenil sepharose CL-4B 1 [ 109 ]
GE

Sigma-Aldrich fenil sepharose 1 [ 83 ]

Tabela 10 . Estatsticas do levantamento de Labome de 305 publicaes citando sistemas de purificao de protenas. Nmero:
nmero de publicaes.

Entre a literatura pesquisada, as amostras de protenas foram preparadas atravs do disruptor celular
EMD Millipore BugBuster [ 134 ], [ 236 ], [ 274 ] ou AVESTIN EmulsiFlex C-3 [ 97 , 275 ], e foram
comparadas atravs de concentradores EMD Millipore Amicon Ultra [ 14 , 78 , 135 , 149 , 213 , 223 ,
235 , 248 , 250 ], Thermo Fisher Sartorius colunas de rotao [ 276 ] ou atravs de concentradores
Vivaspin [ 115 , 116 , 134 ,145 , 146 , 182 , 247 , 248 , 271 , 277 , 278 ].

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