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Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

TCNICAS PARA O ESTUDO DE SISTEMAS BIOLGICOS

ESPECTROSCOPIA DE ABSORO UV-VISVEL

ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCNCIA

Para melhor compreender as tcnicas espectroscpicas utilizadas para o estudo de


sistemas biolgicos, apresentam-se inicialmente algumas propriedades da radiao
electromagntica.
Em seguida, desenvolvem-se os princpios em que se baseiam as tcnicas
espectroscpicas de absoro UV-Visvel e de fluorescncia.

1 Radiao Electromagntica

1.1 Natureza da radiao electromagntica

A radiao electromagntica uma forma de energia que se propaga no espao com


uma velocidade de 3108 m/s. Apresenta, ao mesmo tempo, caractersticas ondulatrias e
corpusculares. Muitos fenmenos pticos tais como a interferncia, a reflexo, a refraco, a
difraco e a polarizao so descritos considerando a radiao como um movimento
ondulatrio. No entanto, este modelo ondulatrio apresentou falhas importantes na
interpretao da absoro e emisso da energia radiante, e da a necessidade de estudar a
teoria corpuscular, onde se admite que a radiao electromagntica constituda por
partculas discretas de energia.

1.2 Propriedades ondulatrias

Uma onda electromagntica constituda por um campo elctrico alternado no


r
espao, associado a um campo magntico. A onda comporta um vector campo elctrico E e
r
um vector campo magntico B . Os dois vectores so sinusoidais e oscilam em planos
perpendiculares um ao outro e perpendicularmente direco de propagao da onda (fig.
1).

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Figura 1 - Campos elctrico e magntico de uma onda electromagntica.

O movimento ondulatrio caracterizado pelos seguintes parmetros: perodo,


frequncia, velocidade e amplitude. Perodo, T, o intervalo de tempo necessrio para dar
passagem a dois mximos sucessivos atravs de um ponto fixo no espao. A frequncia, ,
o nmero de oscilaes do campo por segundo e corresponde ao inverso do perodo; a
unidade da frequncia o Hertz, Hz, ou ciclo por segundo. O comprimento de onda, , a
distncia linear entre dois mximos ou mnimos da onda e habitualmente expresso em
micrmetros (m), nanmetros (nm) ou em metros (m). Ao contrrio da frequncia, o
comprimento de onda depende do meio em que se propaga a radiao.
A velocidade, v, de propagao da radiao num meio corresponde ao produto da
frequncia pelo comprimento de onda,
v= (1)

No vcuo, a velocidade de uma onda torna-se independente da frequncia e atinge o


seu valor mximo. A velocidade no vcuo (geralmente representada por c) 2,9972 108
m/s.
Em qualquer meio material, o valor da velocidade da radiao menor do que no
vcuo. Uma vez que a frequncia invariante, o comprimento de onda diminui quando a
radiao passa para um meio material. O factor segundo o qual a velocidade reduzida
chama-se ndice de refraco, n, e definido por

c
n= (2)
v

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1.3 Propriedades corpusculares

A descrio quantitativa de algumas interaces da radiao com o meio material


implicou considerar que a radiao constituda por partculas de energia, fotes ou quanta
de luz. A energia, E, de um foto depende da frequncia da radiao, , e dada por
hc
E = h = (3)

em que h a constante de Planck (= 6,625610-34 J.s). Um foto de alta frequncia (baixo


comprimento de onda) mais energtico do que um de baixa frequncia (comprimento de
onda elevado).

1.4 Espectro electromagntico

O espectro electromagntico o conjunto ordenado das radiaes conforme os seus


comprimentos de onda. O espectro foi dividido em vrias regies, de acordo com a origem
das radiaes, as fontes para a sua produo e os detectores apropriados para detect-las.
Um fenmeno interessante a sensibilidade dos nossos olhos para uma determinada
onda. O olho humano mais sensvel radiao com comprimento de onda de 555 nm
(onda que provoca a sensao de luz amarela), conforme mostra o grfico da curva tpica de
sensibilidade espectral do olho (fig. 2).

Figura 2 Curva de sensibilidade do olho a radiaes monocromticas.

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A curva de sensibilidade do olho humano demonstra que radiaes de menor


comprimento de onda (violeta e azul) geram uma maior intensidade de sensao luminosa
quando h pouca luz, por exemplo: crepsculo, noite, etc., enquanto as radiaes de maior
comprimento de onda (laranja e vermelho) se comportam ao contrrio.
A tabela 1 apresenta as faixas de comprimento de onda e de frequncia,
correspondentes s diferentes cores do espectro visvel. A regio ultravioleta abrange
comprimentos de onda menores do que 400 nm. A faixa de 400 nm a 300 nm corresponde
ao ultravioleta prximo. Por outro lado, a regio do infravermelho corresponde a
comprimentos de onda superiores a 750 nm.

Cores do espectro visvel


Cor Comprimento de onda Frequncia
Infravermelho > 750 nm
Vermelho ~ 625-740 nm ~ 480-405 THz
Laranja ~ 590-625 nm ~ 510-480 THz
Amarelo ~ 565-590 nm ~ 530-510 THz
Verde ~ 500-565 nm ~ 600-530 THz
Ciano ~ 485-500 nm ~ 620-600 THz
Azul ~ 440-485 nm ~ 680-620 THz
Violeta ~ 380-440 nm ~ 790-680 THz
Ultravioleta < 380 nm

Tabela 1 Faixas de comprimentos de onda e frequncias das diferentes cores.

1.5 - Absoro de radiao electromagntica

A absoro da radiao por um meio material uma interaco quantificada, que


depende da estrutura das espcies atmicas ou moleculares envolvidas. Quando um feixe de
radiao atravessa um meio material (slido, lquido ou gasoso), certas frequncias podem
ser selectivamente absorvidas. A energia dos fotes absorvida fixada por tomos ou
molculas que, consequentemente, sofrem excitao, passando do seu estado energtico
fundamental para estados energticos superiores.

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Os tomos, as molculas e os ies possuem um nmero limitado de nveis


energticos quantificados. Para que possa ocorrer absoro, o foto deve possuir uma
determinada energia (h), igual ou superior diferena de energia, E, entre o estado
fundamental e o estado excitado. Assim, nas transies entre dois nveis qunticos de
energia como, por exemplo, de E0 (estado fundamental) para E1 (primeiro estado excitado), a
quantidade de energia absorvida determinada pela equao de Bohr

hc
E = E1 - E0 = h = (4)

onde c a velocidade da luz no vcuo, h a constante de Planck, a frequncia e o


comprimento de onda da radiao absorvida.
O tempo de vida de um estado electrnico excitado singleto geralmente muito
pequeno, da ordem de grandeza de 10-9 segundos. Aps a absoro, as substncias retornam
ao seu estado fundamental atravs de diferentes processos e, geralmente, a energia da
radiao absorvida convertida em energia trmica, em energia radiante, ou ainda em
energia qumica.

2 Espectroscopia de Absoro no UV-Visvel

2.1 - Absoro molecular

A energia total de uma molcula compreende trs tipos diferentes de energia:


rotacional, vibracional e electrnica. A energia rotacional est associada rotao da
molcula em torno do seu centro de gravidade. A energia vibracional est relacionada com a
vibrao dos tomos ou grupos de tomos dentro da molcula e, por fim, a energia
electrnica est relacionada com a distribuio dos electres em torno dos ncleos dos
tomos. Estes trs tipos de energia contribuem para a energia total da molcula e esto
quantificados, de modo que, para cada estado electrnico, existe um conjunto de nveis
vibracionais e rotacionais, como se pode observar na figura 3.

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Nveis rotacionais

Energia

Nveis vibracionais

Estado electrnico excitado

Nveis rotacionais

Nveis vibracionais

Estado electrnico fundamental

Figura 3 - Representao esquemtica do sistema de nveis de energia de uma molcula.

2.2 - Transies electrnicas

A absoro de radiao na regio do ultravioleta e visvel d origem a uma transio


electrnica, desde o estado electrnico fundamental para um estado de energia superior,
designado estado excitado.
temperatura ambiente, a maioria das molculas encontram-se no nvel de energia
vibracional mais baixo do estado electrnico fundamental, por isso as transies para o
estado excitado do-se a partir deste nvel. Uma vez que as diferentes transies
correspondem a intervalos de energia diferentes iro obter-se picos de absoro de diferentes
comprimentos de onda.1-4 Estes comprimentos de onda correspondem absoro de
radiao na regio do ultravioleta e vsivel.2,5-6
As transies electrnicas que ocorrem numa molcula esto relacionadas com a
existncia de orbitais moleculares ligantes (, ), antiligantes (*, *) e de orbitais no
ligantes (n), sendo a relao entre as suas energias a seguinte:
E anti-ligantes > E no ligantes > E ligantes .

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As orbitais moleculares associadas a ligaes simples so designadas orbitais


(sigma) e a distribuio da densidade electrnica rotacionalmente simtrica em relao ao
eixo da ligao. Neste caso, a densidade mdia da carga negativa que surge do movimento
dos dois electres volta dos dois ncleos positivos indicada pelo grau de sombreamento
(fig. 4).

Figura 4 Densidade electrnica numa orbital ligante .

As orbitais (pi) so formadas pela sobreposio paralela de orbitais atmicas p. A


sua distribuio electrnica caracterizada por um plano nodal (regio de densidade
electrnica baixa) ao longo do eixo da ligao e densidade mxima em regies acima e
abaixo do plano (fig. 5).

Figura 5 Densidade electrnica numa orbital ligante .

Na figura seguinte (fig. 6) so tambm ilustradas as distribuies de densidade


electrnica para orbitais antiligantes sigma e pi, respectivamente * e *.

Figura 6 Densidade electrnica nas orbitais antiligantes * e *.

Algumas das transies possveis entre orbitais encontram-se representadas pelas


setas verticais na figura 7.

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* (anti-ligante)

* (anti-ligante)
*
Energia * n
n*
n (no ligante)

*

(ligante)
*
(ligante)

Figura 7 - Transies electrnicas entre orbitais moleculares.

Transies *: Neste caso, um electro numa orbital ligante de uma molcula


excitado orbital antiligante correspondente, pela absoro de radiao. Em relao a
outras transies possveis, a energia necessria para induzir uma transio * elevada
(fig. 7), correspondendo a frequncias na regio do ultravioleta de vcuo, no sendo
observada na regio ultravioleta normalmente acessvel.

Transies n*: Compostos saturados contendo tomos com pares de electres


no compartilhados (electres no ligantes) so capazes de sofrer transies n*. Em
geral, estas transies requerem menos energia que as do tipo * e podem ser produzidas
por radiao na regio entre 150 e 250 nm, aparecendo a maior parte dos picos abaixo de
200 nm. Contudo, o nmero de grupos funcionais orgnicos que apresenta com picos n*
na regio ultravioleta normalmente acessvel relativamente pequeno.

Transies n* e *: A maioria das aplicaes da espectroscopia de absoro


a compostos orgnicos baseia-se em transies de electres n ou para o estado excitado *.
As energias necessrias para estas transies situam-se numa regio espectral
experimentalmente conveniente (200 a 700 nm). Os picos associados a transies n* so
geralmente deslocados para comprimentos de onda menores (deslocamento hipsocrmico ou
deslocamento para o azul) ao aumentar a polaridade do solvente. Normalmente, uma
tendncia oposta (deslocamento batocrmico ou deslocamento para o vermelho) observada
para transies *. O efeito hipsocrmico devido maior solvatao do par de
electres na orbital no-ligante n, o que baixa a energia desta orbital.

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A intensidade da banda de absoro encontra-se relacionada com a probabilidade de


ocorrncia de uma determinada transio. Quanto maior a probabilidade da transio, mais
intensa a banda, o que revela uma transio permitida. Se a transio for proibida, a
probabilidade de ocorrncia baixa e a banda correspondente ser pouco intensa.5
A intensidade de uma banda de absoro e, logo, a ocorrncia de uma determinada
transio electrnica, permitida ou proibida, depende de factores como o spin electrnico, a
simetria orbital, a paridade e o momento (estes dois ltimos factores no foram falados nas
aulas).
A alterao do spin do electro produz uma variao na multiplicidade dos estados,
sendo as transies que envolvem variaes de spin proibidas. No estado electrnico de
energia mais baixa, o somatrio dos spins dos electres zero, pelo que a molcula se
encontra no estado fundamental singleto, S0 (estado de multiplicidade 1). Se o processo de
absoro conduzir o electro para uma orbital com a mesma orientao de spin do estado
fundamental, a molcula fica num estado excitado singleto, ocorrendo uma transio
permitida do tipo singleto-singleto (figura 8).
Se durante a absoro, o electro mudar a sua configurao de spin, a multiplicidade
do estado final ser 3 e a molcula estar num estado tripleto, T (fig. 8). A formao de um
estado tripleto por absoro directa de um foto, quando a molcula se encontra em S0,
uma transio proibida por spin, pois neste estado os electres esto emparelhados com
spins paralelos.

Estado singleto Estado singleto Estado tripleto


fundamental excitado excitado

Figura 8 - Representao dos estados electrnicos singleto e tripleto e suas transies.

As propriedades de uma molcula excitada no estado tripleto diferem


significativamente de uma no estado singleto excitado: uma molcula paramagntica no

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estado tripleto e diamagntica no singleto. Os estados tripleto apresentam menor energia em


relao aos estados singleto excitados.

Em relao simetria orbital, a banda de absoro ser tanto mais intensa, quanto
maior for o grau de sobreposio espacial das duas orbitais envolvidas na transio. Devido
a este facto, as transies * so permitidas por simetria, ao passo que as transies
n* so proibidas.6
temperatura ambiente, a maioria das molculas esto no nvel de energia vibracional
mais baixo do estado electrnico fundamental e, por isso, as transies para o estado
excitado do-se a partir deste nvel. Uma vez que as vrias transies correspondem a
intervalos de energia diferentes, iro obter-se picos de absoro de diferentes comprimentos
de onda.

2.3 - Tcnica experimental

A intensidade de um feixe luminoso diminui, ao atravessar qualquer meio absorvente,


de acordo com uma lei exponencial geral,

I ( ) = I 0 exp( b ) (5)

em que I0 e I so, respectivamente, as intensidades do feixe incidente e do feixe transmitido,

o coeficiente de absoro (cm-1) e b o comprimento do meio absorvente (cm).

Define-se transmitncia como

I
T = , (6)
I0

e absorvncia, A , ou densidade ptica (DO), como

A = log 10 T (7)

Quando o meio absorvente uma soluo, com uma dada concentrao, C, de


espcies absorventes, interessa relacionar com a concentrao, sendo

= 2.303 C (8)

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em que o coeficiente de extino molar ou absortividade molar, que uma medida da

intensidade da banda de absoro. Se a concentrao for expressa em M (mol.dm-3), vir


em M-1 cm-1 ou mol-1 dm3 cm-1.
Usando as relaes anteriores, pode ento escrever-se

A = b C (9)

que a forma habitual da lei de Beer. Esta lei prev uma proporcionalidade directa entre a
absorvncia e a concentrao, para solues diludas e em que exista apenas uma espcie
absorvente.
importante descontar a absorvncia do meio em que se encontram as espcies cuja
absoro se pretende estudar. Para tal, basta utilizar, em vez de 0, a intensidade da radiao
monocromtica que se obtm depois de atravessar o meio em que as espcies se encontram,
mas sem estas estarem presentes (branco):


(A A branco ) = log I 0 log I0 I
= log branco (10)
I I branco I

2.4 - Constituio de um espectrofotmetro

Os instrumentos que permitem obter espectros de absoro, denominados


espectrofotmetros, podem ser de dois tipos: feixe simples ou feixe duplo.
Nos instrumentos de feixe simples, necessrio realizar medidas sequenciais da
intensidade do feixe incidente e transmitido, usando, respectivamente, uma clula com
solvente e uma clula com a amostra.
Neste trabalho, foi utilizado um equipamento de feixe duplo. Este tipo de aparelho
utiliza dois feixes de luz, um que incide numa clula com a amostra e outro numa clula
contendo solvente, permitindo medir directamente a absorvncia ou a transmitncia (figura
9).

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Lmpada Monocromador Divisor do


feixe de luz
Clula 1
(amostra)
Espelho
Fotomultiplicador Rotativo

Clula 2
(branco)

Clculo de

A= log branco

Figura 9 - Representao esquemtica de um espectrofotmetro de feixe duplo.

3 Espectroscopia de Fluorescncia

O processo de absoro resulta na transio de um electro para um estado de energia


mais elevado, ficando a molcula no estado excitado. Para que as molculas percam esse
excesso de energia, voltando o electro ao estado fundamental, existem essencialmente dois
tipos de processos, intramoleculares e intermoleculares.

3.1. Processos intramoleculares de desexcitao:

a) Processos radiativos, onde a energia perdida devido emisso de radiao;

b) Processos no radiativos, em que a perda de energia no devida emisso de


radiao.

3.2. Processos intermoleculares de desexcitao:

a) Processos de inibio de fluorescncia, tais como a transferncia directa de


energia electrnica, a transferncia electrnica, etc.

3.1 - Processos intramoleculares de desexcitao

Na figura seguinte apresenta-se um diagrama de nveis de energia (diagrama de


Jablonski) com indicao dos processos de excitao e desexcitao.

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4 5
S2

4
7 S1
6
4
8
T1
2 1 3
9
4 4

So So

Figura 10 - Processos fotofsicos intramoleculares.


Transies radiativas; Transies no radiativas.

1 - Absoro de S0 para S1; 2 - Absoro de S0 para S2; 3 - Fluorescncia;


4 - Relaxao vibracional; 5 - Converso interna de S2 para S1;
6 - Converso intersistemas de S1 para T1; 7 - Converso interna de S1 para S0;
8 - Converso intersistemas de T1 para S0; 9 - Fosforescncia.

Como se observa na figura 10, uma molcula excitada pode voltar ao seu estado
fundamental atravs da combinao de mecanismos de vrias etapas. Duas dessas etapas,
fluorescncia (processo 3) e fosforescncia (processo 9), envolvem a emisso de um foto
de radiao. Os outros processos de desexcitao so processos no radiativos. A trajectria
favorecida para o estado fundamental aquela que minimiza o tempo de vida do estado
excitado. Assim, se a desactivao por fluorescncia for mais rpida que os processos no
radiativos, ser observada a emisso.

(a) Processos intramoleculares no radiativos

Uma molcula pode ser levada a qualquer um de vrios nveis vibracionais, durante o
processo de excitao electrnica. Em soluo, no entanto, a energia vibracional em excesso
perdida imediatamente como consequncia de colises entre as molculas da espcie
excitada e as do solvente; o resultado uma transferncia de energia para o solvente e um

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aumento da sua temperatura. Este processo de relaxao vibracional (processo 4 fig. 10)
to eficiente que o tempo de vida mdio de uma molcula excitada vibracionalmente de
10-12 segundos ou menos, um perodo significativamente menor que o tempo de vida mdio
de um estado excitado electronicamente. Como consequncia, a fluorescncia (ou
fosforescncia), quando ocorre, envolve uma transio a partir do nvel vibracional mais
baixo de um estado electrnico excitado.
Uma consequncia da eficincia da relaxao vibracional que a banda de
fluorescncia para uma dada transio electrnica est deslocada para frequncias mais
baixas ou comprimentos de onda maiores em relao banda de absoro.
Na converso interna (processos 5 e 7 fig. 10), ocorre a transferncia de um estado
electrnico para outro estado electrnico da mesma multiplicidade, num processo
isoenergtico. A velocidade da converso interna entre estados singletos excitados muito
alta. Consequentemente, os tempos de vida dos estados excitados mais elevados so
extremamente curtos (10-11 a 10-13 s).
Se o processo de converso (ou cruzamento) intersistemas, d-se uma transio para
estados electrnicos de diferente multiplicidade. O processo de converso intersistemas mais
importante S1T1 (figura 10 - n 6). Normalmente, a transio ocorre para um nvel
vibracional de T1 em que a molcula tem a mesma geometria de S1. Como envolve uma
proibio de spin, a transio lenta (10-2 a 10-8 s).
Do mesmo modo que para os estados singleto, os tempos de vida dos estados tripleto
mais elevados so, geralmente, demasiado curtos para permitir que ocorram transies
radiativas a partir destes estados.2
Quanto maior for a energia de separao entre os nveis vibracionais mais baixos dos
estados envolvidos na transio, mais lenta a taxa de decaimento dos processos de
converso interna e de converso intersistemas. De facto, uma grande energia de separao
entre os nveis vibracionais mais baixos dos estados S1 e S0 e dos estados T1 e S0 contribui
para uma menor eficincia dos processos de converso interna S1S0 (figura 10 n 7) e
converso intersistemas T1S0 (figura 10 n 8). As escalas de tempo em que estes
processos ocorrem so 10-7 a 10-9 segundos para a converso interna S1 S0, e cerca de 10-3
segundos para a converso intersistemas T1S0.

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(b) Processos intramoleculares radiativos

A transio radiativa entre dois estados electrnicos proibida por spin se ocorre entre
estados de diferente multiplicidade.2, 7, 8
Uma molcula no estado excitado pode perder energia por emisso de radiao,
atravs de um processo de luminescncia. Neste processo, h emisso de fotes na regio do
ultravioleta, visvel ou infravermelho, a partir dos estados electrnicos excitados mais
baixos.
Existem dois tipos de luminescncia:

a) Fluorescncia, quando a transio radiativa permitida e ocorre entre dois


estados da mesma multiplicidade (em geral, S1 S0, figura 10 n 3).

b) Fosforescncia, quando a transio proibida, pois ocorre entre estados de


diferente multiplicidade (T1 S0, figura 10 n 9), sendo necessrio haver
uma inverso de spin.

A figura 11 (na pgina seguinte) esquematiza a relao entre os processos de


absoro, fluorescncia e fosforescncia para uma molcula.

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Intensidade de absoro ou emisso

Fluorescncia Fosforescncia
Absoro

Comprimento de onda (nm)

Figura 11 - Relao entre os espectros de absoro, fluorescncia e fosforescncia.7

Mesmo que, na absoro de radiao, a molcula seja excitada para nveis electrnicos
mais elevados do que o primeiro estado excitado singleto, ir terminar quase sempre neste
estado, devido eficincia da converso interna SiS1. Alm disso, o excesso de energia
vibracional rapidamente perdido por colises e, em soluo, as molculas excitadas
conseguem atingir o equilbrio trmico com o meio. Assim, a fluorescncia resulta de uma
transio radiativa entre o nvel vibracional mais baixo do primeiro estado electrnico
excitado, e os vrios nveis vibracionais do estado fundamental, S0. Se a separao
energtica dos nveis vibracionais do estado fundamental for semelhante dos nveis
vibracionais do estado excitado, os espectros de absoro e fluorescncia so como uma
imagem no espelho.2 Porm, esta semelhana nem sempre acontece.

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Verifica-se, tambm, que nem sempre as transies 00 da absoro e da


fluorescncia coincidem energeticamente. A banda 00 que resulta da emisso pode
aparecer ligeiramente deslocada para maior comprimento de onda (figura 12).

Figura 12: Efeito do equilbrio soluto-solvente na energia dos estados electrnicos.2

Se o estado electrnico excitado S1 tem um estado de solvatao de equilbrio


diferente do estado fundamental, S0, haver uma reorientao do solvente depois da
excitao ocorrer, formando-se um estado excitado mais estvel de equilbrio. A emisso de
fluorescncia a partir deste estado corresponde a uma transio para um estado fundamental
de no equilbrio, de energia mais elevada. Isto provoca uma transio 00 para a
fluorescncia de menor energia do que a respectiva transio de absoro original.2
A eficincia do processo de emisso medida pelo rendimento quntico de
fluorescncia, F, sendo

N de fotes emitidos
F = (11)
N de fotes absorvidos

O rendimento quntico de fluorescncia independente da intensidade da luz de


excitao, e constante para uma dada temperatura, na ausncia de processos
intermoleculares.9

Na ausncia de inibidores de fluorescncia (quenchers), o rendimento quntico de


fluorescncia dado por:8,9

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kF
0F = (12)
k F + k IC + k ISC

em que kF a constante de velocidade do processo de fluorescncia, kIC a constante de

velocidade do processo de converso interna e kISC a constante de velocidade do processo


de converso intersistemas. O superscrito 0 significa ausncia de inibidores.

A fosforescncia resulta da transio radiativa a partir do nvel vibracional mais baixo


de T1 para os vrios nveis vibracionais de S0. Como a energia do estado electrnico tripleto
T1 mais baixa do que a do estado excitado singleto S1, a fosforescncia ocorre a maiores
comprimentos de onda (figura 11) que a fluorescncia.2, 7, 8
O espectro de fosforescncia de fraca intensidade, porque resulta de transies
proibidas por spin, que ocorrem entre estados de diferente multiplicidade. Ao contrrio, a
fluorescncia mais intensa, pois corresponde a transies entre estados com a mesma
multiplicidade.2

3.2 - Processos intermoleculares de desexcitao

Existem vrios processos intermoleculares de desexcitao. Podem ocorrer vrios


processos de inibio (quenching) de fluorescncia, devido presena de oxignio,
tomos pesados e inibidores externos presentes na amostra. Os processos fotofsicos de
transferncia de energia electrnica e transferncia electrnica tambm contribuem para
inibir ou suprimir a emisso de fluorescncia.
A presena de impurezas e oxignio na soluo do fluorforo pode levar inibio da
emisso de fluorescncia. As espcies inibidoras so conhecidas como quenchers e
podem inibir total ou parcialmente a luminescncia das amostras. O quenching (reversvel
ou irreversvel) pode ocorrer durante as vrias interaces entre a amostra e o inibidor.
Na presena de inibidores, a expresso do rendimento quntico de fluorescncia toma
a forma:
kF
F = (13)
k F + k IC + k ISC + k q [Q]

em que kq a constante de velocidade do processo de inibio de fluorescncia e [Q] a


concentrao da espcie inibidora.

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Na transferncia directa de energia electrnica, um doador excitado (D*) transfere


energia para um aceitante (A), observando-se depois a emisso do aceitante.

h
D
a
D*+ A
D + A *
A + h F (A *)

A eficincia deste processo depende da sobreposio entre o espectro de emisso de


D* e o espectro de absoro de A. Depende tambm da distncia entre D* e A, podendo
ocorrer at distncias de ~ 80 .7, 10
O estudo deste processo permite determinar distncias entre molculas (rgua
molecular), ou distncias entre resduos diferentes de uma mesma macromolcula.11
Na transferncia electrnica fotoinduzida, ocorre a transferncia de um electro entre
a espcie excitada e um doador ou aceitante. Este processo favorecido no estado excitado,
dado que os estados excitados so melhores aceitantes e doadores electrnicos que o estado
fundamental.2, 10

3.3 - Tcnica experimental

Os vrios componentes dos instrumentos para registo de espectros de fluorescncia,


designados por espectrofluormetros, so similares aos usados nos espectrofotmetros. Em
geral, todos os espectrofluormetros empregam ptica de duplo feixe, para compensar as
flutuaes da intensidade da fonte de radiao.

b
Monocromador

Fonte de luz contnua


fluorescncia
Intensidade de
fluorescncia

Monocromador

Detector
(fotomultiplicador )
(nm)

Figura 13: Representao esquemtica de um espectrofluormetro.

Elisabete M. S. Castanheira Coutinho 19


Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

A fonte de radiao mais usada a lmpada de arco de xnon. O feixe proveniente da


fonte passa atravs de um monocromador de excitao, dirigindo-se, em seguida, para um
divisor de feixe, onde dividido em dois. Um deles incide na clula que contm a amostra,
de modo a excitar a substncia fluorescente. A radiao emitida pela amostra passa atravs
de um segundo monocromador (monocromador de emisso), sendo depois detectada por um
fotomultiplicador.3 O segundo feixe dirige-se a um fotododo ou a uma clula de referncia
contendo uma soluo que funciona como contador quntico (sistema que apresenta um
rendimento quntico de fluorescncia constante numa larga gama espectral).
Nalguns espectrofluormetros, um dos monocromadores (ou ambos) duplo, contendo
dois sistemas dispersantes, o que permite uma reduo drstica da luz parasita.
A intensidade de fluorescncia, IF, obtida num espectrofluormetro depende de muitos
factores, sendo

I F = I 0 1 10 ( )
exc b c
F F( em ) d( em ) (14)

em que I0 a intensidade da radiao incidente; 1 10 ( exc ) b c representa a fraco de


radiao absorvida; F o rendimento quntico de fluorescncia (fraco de molculas
excitadas que fluorescem); F( em ) representa a fraco da luz emitida cujo comprimento

de onda em; e d ( em ) representa a fraco da luz de =em que detectada (factor

instrumental).
Para baixas concentraes de fluorforo (tais que bc < 0.1), a equao anterior pode
ser aproximada por

I F I 0 2.303( exc ) bc F F( em ) d ( em ) , (15)

em que, na expanso em srie da funo exponencial, se consideraram apenas os dois


primeiros termos (1 + 2.303 ( exc ) bc ) .

3.4. Informao contida nos espectros em estado estacionrio

As medidas dos espectros informam sobre a diferena de energia entre o estado


fundamental e o estado excitado e, consequentemente, das contribuies que surjam devido
aos vrios movimentos vibracionais ou rotacionais da molcula.12

Elisabete M. S. Castanheira Coutinho 20


Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

O valor da energia que surge nos espectros de absoro e emisso inclui a energia de
excitao electrnica, Ee, a diferena de energia vibracional dos ncleos de todos os tomos
constituintes da molcula, Ev, e a diferena de energia rotacional da molcula, Er. Quando
em soluo, para alm das contribuies referidas, verificam-se interaces com o solvente,
que dependem da temperatura.12,13
O espectro de excitao como um espectro de absoro, mas distorcido ou
transformado em relao eficincia da fluorescncia. Este tipo de espectro obtm-se
seleccionando um comprimento de onda do espectro de emisso, mantido fixo, enquanto se
faz o varrimento dos comprimentos de onda de excitao.
O espectro de fluorescncia surge a menores energias que o espectro de absoro,
podendo os dois espectros sobrepr-se parcialmente. As suas formas podem ser imagens no
espelho um do outro.
O espectro de fosforescncia semelhante na forma ao espectro de fluorescncia, mas
experimenta um desvio para o vermelho (o nvel de energia tripleto possui energia mais
baixa que o singleto correspondente).
Tendo em conta a figura 5, pode afirmar-se que os espaos entre os picos no espectro
de absoro so iguais diferena de energia entre os nveis vibracionais do estado excitado,
enquanto que os espaos entre os picos no espectro de fluorescncia so iguais diferena
de energia entre os nveis vibracionais do estado fundamental.2

3.5. Absoro versus Fluorescncia

Uma das vantagens da emisso em relao absoro baseia-se no facto de a primeira


medir directamente a luz emitida, enquanto que, na ltima, as medies so relativas. De
facto, na absoro comparam-se duas intensidades de luz que, no limite de baixa
concentrao, so muito prximas. Nas tcnicas de emisso, a luz emitida monitorizada
atravs de um dispositivo que apresenta elevada sensibilidade.
Como os espectros de emisso so sensveis aos efeitos do meio, as molculas de
compostos fluorescentes e fosforescentes podem ser usadas para o estudo do ambiente
molecular.
As medies de fluorescncia e fosforescncia so extremamente sensveis, o que lhes
confere numerosas aplicaes. Alguns exemplos so a monitorizao da presena de

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Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

elementos nos leos, extractos de solos, sangue e urina, de drogas no sangue, de poluentes
na atmosfera, etc.11, 12
A principal vantagem da fluorescncia relativamente a outros mtodos deve-se
combinao da sua elevadssima sensibilidade e do seu excelente tempo de resoluo.13

4 - Cintica de estados excitados

A evoluo no tempo da concentrao de molculas excitadas vai depender de todos os


processos, radiativos e no radiativos, que ocorrem nas molculas.
Para a evoluo da concentrao no tempo, contribuem todos os processos possveis
(absoro, fluorescncia, converso interna, converso intersistemas, inibio de
fluorescncia).

Absoro:

S0 Iabs *S1

em que S0 representa a molcula no estado fundamental, *S1 representa a molcula no

primeiro estado electrnico excitado S1, e Iabs a intensidade da radiao absorvida.

Fluorescncia:

kF
*S1 S0 + hF
em que hF a energia da radiao emitida e kF a constante cintica (ou constante de
velocidade) do processo de fluorescncia.

Converso interna:

*S1 kIC S0
em que kIC a constante cintica do processo de converso interna.

Converso intersistemas:

*S1 kISC *T1

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Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

em que kISC a constante cintica do processo de converso intersistemas.

Inibio de fluorescncia por um inibidor, Q:

kQ
*S1+ Q produtos

em que kQ a constante cintica de inibio ("quenching") de fluorescncia.

Evoluo temporal de *S1

Para a variao da concentrao de molculas excitadas no tempo, cada processo envolvido


contribui com uma quantidade dada pela constante cintica multiplicada pela concentrao
dos reagentes. Essa contribuio ser positiva se houver uma produo da espcie e negativa
se houver um consumo.

Estado transiente:
Consideremos as molculas excitadas com um pulso instantneo de luz (pulso de durao
desprezvel). A variao da sua concentrao no tempo ser dada por:

[ ] = (k
d *S1
) [*S1]
F + k IC + k ISC + k q [Q]
dt
Integrando obtm-se:

[*S1]= [*S1](t =0)e(k )


F + k IC + k ISC + k q [Q ] t

sendo *
[ S1]( t =0) a concentrao inicial da espcie no estado S , formada pela radiao
1

absorvida.

A equao anterior equivalente a:

[*S1]= [*S1]( t =0) e t F

em que
1
F =
(k F + k IC + k ISC + k q [Q] )

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A quantidade F chamada tempo de vida do estado excitado.

Estado estacionrio:

Consideremos agora as molculas a serem excitadas com um pulso contnuo de luz. Neste
caso, a variao da sua concentrao no tempo dada pela equao:

[ ] =I
d * S1
( ) [*S1]
abs k F + k IC + k ISC + k q [Q]
dt

Em estado estacionrio, a concentrao de *S1 constante (no varia no tempo), pelo que a
sua derivada nula:

[ ] =I
d * S1 1 *
[ ]
abs S1 = 0
dt F

Daqui obtm-se: [*S1] = IabsF


A velocidade do processo de fluorescncia corresponde variao no tempo da energia da
radiao emitida (de frequncia F):

d [h F ]
dt
[ ]
= k F * S1 = k F F I abs

A razo entre a velocidade de um processo e a velocidade de absoro de fotes o


rendimento quntico desse processo, . Para o processo de fluorescncia, tem-se:

velocidade da fluorescncia k F F I abs


F = =
velocidade de absoro de fotes I abs
logo

kF
F = k F F =
k F + k IC + k ISC + k q [Q]

De modo anlogo, para a converso interna, tem-se: IC = k IC F , e para a converso

intersistemas, T = ISC = k ISC F , em que T o rendimento quntico de formao de

estado tripleto.

Elisabete M. S. Castanheira Coutinho 24


Tcnicas para o Estudo de Sistemas Biolgicos

Na ausncia de inibidores de fluorescncia:


F + ISC + IC = 1

Bibliografia

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[13] E.L. Wehry, Modern Fluorescence Spectroscopy, Ed. E.L. Wehry, London, 1976.

Elisabete M. S. Castanheira Coutinho 25