2014

BIOSEGURIDADA EN EL LABORATORIO

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARRREAL

FACULTAD DE INGENIERIA GEOGRAFICA, AMBIENTAL Y ECOTURISMO

PROFESORA: Elena Canda

TEMA: BIOSEGURIDAD, ESTERILIZACION Y COLORACION GRAM

CICLO: 6

AULA: TURNO: MA

INTEGRANTES:

Bautista Baygorrea, Michael

Inoue Velarde ,Jos Hitoshi
 RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREVENCIN DEL RIESGO EN LAS
PRCTICAS DE LABORATORIO

Las prcticas que se realizan en los laboratorios pueden presentar una serie de riesgos de
origen y consecuencias muy variadas relacionadas con las propias instalaciones de los
laboratorios, con los productos qumicos que se manejan y con las operaciones que con ellos
se realizan.
El objeto de estas recomendaciones que presentamos es que conozcamos estos riesgos y la
formade evitarlos, de manera que tengamos presente la prevencin desde el primer momento
en que iniciemos las prcticas en los laboratorios cumpliendo una serie de normas bsicas
importantes para su seguridad y salud.

1. HBITOS PERSONALES

1. Debemos mantener las batas y los vestidos abrochados, ya que nos van a ofrecer
proteccin frente a salpicaduras y derrames de sustancias qumicas.
2. En el laboratorio siempre es recomendable llevar recogidos los cabellos, ya que el pelo
largo puedeengancharse en los montajes y equipos y tambin es ms fcil que se
contamine con los productosqumicos que vais a utilizar.
3. No se deben dejar objetos personales (abrigos, mochilas, carpetas, etc.) en mesas de
trabajo o poyatas, ya que pueden entorpecer las prcticas que vais a realizar y ser la
causa de posibles accidentes.
4. No se debe comer ni beber dentro del laboratorio, tampoco es aconsejable mascar
chicle mientras serealicen las prcticas, ya que los alimentos o bebidas pueden
contaminarse con productos qumicos.
5. Est prohibido fumar dentro de los laboratorios, ya que son zonas donde hay
bastantes productosqumicos inflamables y por tanto el riesgo de que se produzca un
incendio es alto.
6. No llevar pulseras, colgantes o mangas anchas que puedan engancharse en los
montajes.
7. Es aconsejable lavarse las manos siempre que se tenga contacto con algn producto
qumico y antesde salir del laboratorio.
8. Se evitar llevar lentes de contacto, ya que el efecto de los productos qumicos es
mucho mayor si seintroducen entre la lentilla y la crnea.
9. Para el trabajo habitual dentro del laboratorio debern llevarse gafas de seguridad
normalizadas, ya que protegen los ojos frente a salpicaduras de productos qumicos.
10. Las gafas graduadas no protegensuficientemente, existe un tipo especial de gafas
protectoras para poner encima de las gafas graduadas.
11. Cuando se trabaja en el laboratorio es aconsejable no llevar: pantaln corto, faldas
cortas, sandalias, zapatos abiertos, etc., es decir zonas descubiertas de piel que
queden expuestas a posibles salpicadurasde productos qumicos.
12. Deben utilizarse guantes cuando se vayan a manipular productos qumicos que pueden
absorberse a travs de la piel.

2. HBITOS DE TRABAJO

Para el desarrollo de las prcticas que vamos a realizar, cada alumno debe tener para
su uso personal losmateriales que los profesores le indiquen, adems de la bata blanca
y las gafas de seguridad.
 Tener en cuenta que siempre, antes de iniciar un experimento en el laboratorio, se
debe conocer yanalizar todo su contenido, con el fin de entender el por qu de todo
lo que se va a realizarposteriormente. Por eso es importante que si alguien no sabe
algo, no recuerda algo, o tiene algunaduda, pregunte a su profesor.
No deben realizarse experiencias sin la autorizacin expresa del profesor.
El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio porque el orden y la limpieza evitan
que seproduzcan accidentes.
Los tubos de ensayo no deben llenarse nunca ms de dos o tres centmetros, para
evitar, si hay queagitarlos o calentarlos, que se produzca derrame del liquido que
contienen.
Nunca se debe trabajar solo en el laboratorio.
Cuando se calienten los tubos de ensayo debe hacerse utilizando pinzas y por la parte
ms alta a dondellegue el liquido, inclinando el tubo y nunca por el fondo del mismo,
ya que de no hacerlo as, el lquidopodra proyectarse por la boca del tubo de ensayo.
Debemos tener cuidado de no dirigir la boca del tubo de ensayo hacia nuestra cara ni
hacia la de nuestroscompaeros de laboratorio.
No deben calentarse lquidos en recipientes de vidrio no resistentes al calor como
probetas, matracesaforados, frascos, etc., ya que pueden romperse.
Nunca deben llevarse los tubos de ensayo ni los productos qumicos en los bolsillos, ya
que si se rompeny se derraman pueden producir accidentes.
Los productos qumicos nunca deben olerse colocando la nariz sobre la boca del
recipiente que loscontiene, sino que se abanicar con la mano, dirigiendo el vapor
suavemente hacia la nariz, de estaforma se evita el que se produzca irritacin de las
vas respiratorias.
No tocar nunca con las manos ni probar los productos qumicos.
Nunca se deben pipetear con la boca los productos qumicos, sino con una pera de
goma, porque, deno hacerlo as, se puede producir irritacin o quemaduras en la boca.
No se debe trabajar alejado de la mesa o poyata, sino siempre sobre ellas, de forma
que ofrezcan unapoyo slido al material que estemos utilizando.
Utilizar la vitrina siempre cuando se trabaje con sustancias que desprendan vapores
nocivos (txicoso irritantes) y cuando se realiza una operacin en la que se formen
vapores o humos peligrosos.
En las cabinas de laboratorio el aire se renueva por medio de un extractor y de esta
forma los vaporesnocivos se succionan hacia el exterior del edificio a travs del tiro de
la vitrina.
Cuando haya que diluir un cido, nunca se aade el agua sobre el cido, sino al
contrario, se aade elcido sobre el agua, poco a poco y con agitacin.
Si no se hace as, se produce una gran cantidad de calor que puede proyectar el cido
hacia el exteriore incluso romper el recipiente.
Al terminar una tarea u operacin la mesa debe quedar limpia, los reactivos utilizados
ordenados, losequipos desenchufados y las llaves del agua y del gas cerrado.

PRACTICA N02: ESTERILIZACION

La esterilizacin consiste en la destruccin completa de todos los microorganismos, incluidas

las formas resistentes como esporas bacterianas, virus sin envoltura (no lipdicos) y hongos. Se
puede dar mediante la esterilizacin fsica, qumica o filtracin.

De acuerdo a efecto de los esterilizadores tenemos:

a) Provocan prdida de la viabilidad en los microorganismos

a.1. Fsicos (calor, radiaciones)
a.2. Qumicos (xido de etileno, formaldehdo, agentes oxidantes, soluciones antispticas.)

b) Provocan una separacin de los microorganismos de la sustancia lquida.

b.1. Filtracin (se eliminan los microorganismos presentes en un fluido).

1. Esterilizacin Fsica

1.1. Calor

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor
provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o
procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos.

La efectividad del calor como mtodo de esterilizacin depende de:

Temperatura
Tiempo de exposicin

1.1.1. Calor Hmedo

El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben

principalmente a dos razones:

El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA,
RNA, protenas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto,
reacciones inversas podran daar a la clula a causa de la produccin de productos
txicos. Adems, las estructuras secundarias y terciarias de las protenas se estabilizan
mediante uniones puente de hidrgeno intermoleculares que pueden ser
reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.

El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado

que el aire. Por lo que, los materiales hmedos conducen el calor mucho ms
rpidamente que los materiales secos debido a la energa liberada durante la
condensacin.

El autoclave es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar

cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a
temperaturas mayores a 100 C. Una temperatura de 121 C (una atmsfera de sobrepresin)
con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores
de esporas.

Ventajas

Rpido calentamiento y penetracin

Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No deja residuos txicos
Hay un bajo deterioro del material expuesto
Econmico
Desventajas

No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos

1.1.2. Calor Seco

El calor seco produce desecacin de la clula, efectos txicos por niveles elevados de
electrolitos, procesos oxidativos y fusin de membranas. Estos efectos se deben a la
transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con
stos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra ms lentamente que el
vapor de agua en materiales porosos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos
requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es
baja. Esto se debe a que las protenas se estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno
intermolecular que son ms difciles de romper por el calor seco.

La estufa de esterilizacin es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor
seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposicin que la autoclave. La temperatura
vara entre 120 y 180C, requirindose distintos tiempos de exposicin. A 140C se necesitan
por lo menos 5 horas de exposicin, mientras que a 160C se requieren al menos 2 horas de
exposicin.

Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodn no pueden ser esterilizados a ms
de 160C.

Ventajas

No es corrosivo para metales e instrumentos.

Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas
no voltiles.

Desventajas

Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja

penetracin del calor.

Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La incineracin se utiliza
para destruir material descartable contaminado. La accin directa de la llama elimina a los
microorganismos cuando se lleva al rojo el material de metal como ansas, lancetas, agujas de
diseccin.

1.2. Radiaciones

Su accin depende de:

Tipo de radiacin
Tiempo de exposicin
Dosis
1.2.1. Ionizantes

Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras
proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.

Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolbiles

(termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus
costos.

No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de

los componentes.

1.2.2. Ultravioletas

Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dmeros de
pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicacin y por lo tanto la prdida de la
viabilidad de las clulas. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

2. Esterilizacin Qumica

Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes

y antispticos. La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan.

Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma

concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos
microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por

lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

PH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El aumento de pH por
encima de 7 incrementa la carga negativa de los microorganismos afectando la concentracin
del agente sobre la clula. El pH determina el grado de disociacin y la efectividad del agente
qumico, pues a menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.

2.1. Antispticos

2.1.1. Alcoholes

Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan protenas celulares.

Desorganizan la estructura fosfolipdica.

No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta
tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga.

Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.

2.1.2. Iodo
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos.
Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar tambin
grupos amino, ndoles, etc.

Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio
2% en alcohol), aunque es irritante.

2.1.3. Agentes inicos y anfteros

Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposicin de
las protenas y de los fosfolpidos, por lo que se liberan metabolitos desde la clula, se
interfiere con el metabolismo energtico y el transporte activo.

No son esporicidas ni tubercolicidas an en altas concentraciones. Sus principales ventajas se

hallan en que son inodoros, no tien, no son corrosivos de metales, estables, no txicos y
baratos.

Catinicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram +
son ms susceptibles.

Aninicos: Jabones y cidos grasos. Tienen mayor actividad a pH cido y son eficaces contra
Gram +.

Anfteros: Actan como catinicos o aninicos segn el pH.

PRACTICA N 03: COLORACION GRAM

Objetivos:

1. Reconocer especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la

tincin de Gram.
2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e
identificacin de las bacterias.

Introduccin:

La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre

varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos
principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la
tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos
de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas
pero no tiene efecto sobre las clulas que aun retienen el colorante primario.

La tincin propuesta por el medico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos
de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas.

Bacteria Gram positiva

Tiene una capa gruesa de peptidoglucano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido
lipoteitoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglucano y unido a la
membrana citoplasmtica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une solo
a la capa de peptidoglucano. El cido teicoico es el responsable del determinante antgeno del
organismo.

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglucano (mureina) unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacarido.

La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso
molecular bajo. Entre la membrana citoplasmtica y la pared celular hay un espacio
periplasmico con enzimas hidroliticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de
transporte.

Materiales e instrumentos

- Porta objetos -Alcohol-acetona

- Hisopo esterilizado - Safranina

- Mechero bunsen -Puente de coloracin

- Cristal violeta -Microscopio

-Lugol -Aceite de inmersin

Procedimiento

1. Con la ayuda de un hisopo esterilizado obtener muestra de bacterias procedentes de la

boca y luego extenderla en un porta objetos. Imaginariamente dividir el porta objetos en
tres partes y en la parte central de preferencia se extender.
2. Fijar la muestra con calor utilizando un mechero bunsen.
3. Aadir 2 gotas de cristal violeta a la preparacin hasta que se cubra por completo. Dejar
actuar el colorante durante un minuto.
4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparacin con agua.
5. Agregar 2 gotas de lugol a la preparacin y dejar actuar por un minuto. Transcurrido el
tiempo, lavar.
6. Con cuidado, aadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparacin durante 10
segundos.
7. Aadir el colorante de contraste, safranina (2 gotas) y dejar actuar durante un minuto.
Lavar con agua.
8. Dejar secar al aire y observar al microscopio. Enfocar las bacterias, utilizando primero el
lente objetivo de 10x.
9. Una vez enfocado a las bacterias, observar con el objetivo de 100x y utilizando una gota
de aceite de inmersin.
10. Identificar las bacterias (cocos, diplococos, estreptococos, estafilococos, bacilos, etc.) y
graficar lo identificado.