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Universidade Federal de Viosa

Centro de Cincias Agrrias


Departamento de Fitopatologia

FIP 301 - Fitopatologia II

BACTERIOLOGIA DE PLANTAS

NOTAS DE AULAS PRTICAS

Prof. Jos Rogrio de Oliveira

Viosa, MG
Junho de 2014
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OBSERVAO DE EXSUDAO BACTERIANA

Nesta aula tem-se por objetivo discutir alguns aspectos relacionados diagnose de doenas de plantas
causadas por bactrias, com nfase na importncia da observao da exsudao bacteriana em tecidos de plantas
doentes, de forma a familiarizar os estudantes com os testes utilizados para esta finalidade.

DIAGNOSE

Frequentemente Fitopatologistas, Engenheiros Agnomos e Estudantes de Agronomia, so questionados


por parentes, amigos e outros sobre o problemas relacionados a sade das plantas. Duas perguntas so rotineiras:
(1) O que est errado com a(s) minha(s) planta(s)? (2) O que eu devo fazer para resolver o problema?
Na maioria das vezes pode ser muito tarde para resolver o problema da(s) planta(s) especfica(s) quando
os questionamentos so realizados. Entretanto, a diagnose correta deve ser realizada, pois a determinao da causa do
problema ser de grande importncia para prevenir o problema em outras plantas ou para prevenir o problema em
plantios futuros. Devemos ter sempre em mente que a diagnose um fator chave para o manejo de doenas de
plantas.
A diagnose de doenas bacterianas de plantas consiste em se determinar a identidade da bactria que est
causando uma determinada enfermidade. Este o passo inicial para se conhecer uma doena, de forma que medidas
adequadas de controle possam ser adotadas. S se controla adequadamente uma doena aps conhec-la bem e
entender as interaes de seu agente causal com o hospedeiro e o ambiente.
A diagnose de doenas bacterianas de plantas pode envolver diversas etapas: obteno de informaes
sobre o hospedeiro e a doena, observao dos sintomas, observao de exsudao bacteriana, isolamento da bactria
em cultura pura, testes de patogenicidade e identificao da fitobactria isolada. A obteno de informaes sobre o
hospedeiro e a doena e as observaes dos sintomas e de exsudao bacteriana podem ser realizadas no campo,
permitindo, em muitos casos, uma diagnose rpida e segura. As demais etapas requerem, para sua realizao, a infra-
estrutura de laboratrios especializados e so necessrias para a diagnose definitiva, particularmente em situaes de
ocorrncia de um novo patgeno ou hospedeiro. O isolamento da bactria em cultura pura e o teste de patogenicidade
para reproduo dos sintomas so critrios estabelecidos nos postulados de Koch e necessrios antes de se proceder
indentificao da fitobactria.

COLETA E TRANSPORTE DE MATERIAL PARA DIAGNOSE

Nem sempre possvel examinar plantas doentes no campo. As condies em que o material embalado e
transportado podem afetar o sucesso da diagnose, principalmente o isolamento do agente causal.
Plantas, ou partes de plantas, devem ser selecionadas de forma a refletir os sintomas que ocorrem na
cultura, mas no em estgio avanado da doena.
O transporte do material doente para o laboratrio deve ser feito o mais rapidamente possvel. O material
deve ser acondicionado preferencialmente em sacos de papel, embalado em uma caixa de papelo e no deve ser
exposto luz solar direta. Espcimes apresentando podrido mole devem ser envolvidos em papel absorvente. Sacos
plsticos devem ser evitados, pois criam um ambiente mido favorvel multiplicao de organismos saprfitas.
A secagem de materiais vegetais com manchas e queimas foliares, em prensa botnica, permite a sua
utilizao como material herborizado para isolamento, alm de constiturem uma fonte de referncia.

OBTENO DE INFORMAES SOBRE O HOSPEDEIRO E A DOENA

Identificar corretamente a planta doente (nomes comum e cientfico e a cultivar), bem como obter
informaes sobre a idade, porte, etc. importante, tambm, conhecer a distribuio dos sintomas (planta e rea);
prticas culturais; clima; histrico de ocupao da rea; etc.

Prof. Jos Rogrio de Oliveira, DFP/UFV.


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OBSERVAO DOS SINTOMAS

Uma etapa importante para uma diagnose correta a observao e o relato completo dos sintomas de uma
doena, os quais podem ser confrontados com os sintomas de doenas descritos para a espcie hospedeira,
utilizando-se literatura pertinente. Os sintomas mais comuns causados por bactrias em plantas incluem: manchas em
folhas, caules e frutos; cancros; morte das pontas; murchas vasculares; podrides moles; hiperplasias. O sintoma
mais caracterstico de doena bacteriana aparecem durante a fase inicial de desenvolvimento da doena. Nesta fase
os tecidos atacados se apresentam, normalmente, com aspecto de encharcamento, sintoma este que recebe o nome de
anasarca.
conveniente lembrar que a diagnose baseada apenas em sintomas precisa ser feita com bastante cautela,
pois exige grande experincia de campo e longa vivncia em diagnose por parte do Emgenheiro Agrnomo ou
Fitopatologista. Sintomas similares podem ser causados por diferentes fatores biticos ou abiticos. Ocorrem, por
exemplo, podrides moles bacterianas e fngicas, galhas causadas por bactrias, nematides e insetos, murchas
bacterianas e fngicas. Podrides moles bacterianas podem ser causadas por espcies de Pectobacterium ou de
Pseudomonas. H que se considerar, tambm, que alguns patgenos podem incitar diferentes tipos de sintomas em
um mesmo hospedeiro. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, em tomateiro, pode causar murcha, cancro,
leses em frutos e queima de bordos foliares.

OBSERVAO DE EXSUDAO BACTERIANA

Para a confirmao da etiologia bacteriana de uma enfermidade e antes de qualquer tentativa de


isolamento do agente causal, o espcime doente deve ser examinado para observao de sinais de infeco
bacteriana. A presena de um grande nmero de clulas bacterianas no tecido infectado, aliada ausncia de sinais
de outros patgenos, pressupe o envolvimento de um patgeno bacteriano. Exsudao de pus bacteriano pode, sob
determinadas condies, ser observado na superfcie de leses, em folhas, caules e pecolos. Na maioria das vezes
faz-se necessrio visualizar a e exsudao bacteriana ao microscpio, realizando-se o teste de exsudao em gota.
Para a diagnose da murcha bacteriana das solanceas, incitada por Ralstonia solanacearum, usado rotineiramente o
teste do copo.

A. Teste de exsudao em gota

Para se confirmar a etiologia de enfermidades bacterianas de plantas utilizado o teste de exsudao em


gota, o qual requer apenas lmina de barbear, lmina e lamnula para microscopia, gua e um microscpio ptico.

Os passos bsicos para a execuo do teste so dados a seguir:


1) Retirar do material a ser examinado um pequeno fragmento, do limite entre tecido doente e sadio.
2) Depositar o fragmento numa gota de gua sobre uma lmina de microscopia e cobrir com uma lamnula.
3) Examinar a margem do fragmento de tecido ao microscpio, sob o menor aumento e com o condensador abaixado
ao mximo.
4) No caso da infeco ser de natureza bacteriana ser visualizada uma massa de bactrias saindo do interior do
tecido.

Normalmente a ausncia de exsudao bacteriana no tecido observado indica que a doena no causada
por bactria ou que est sendo examinado local errado do espcime. O teste de exsudao em gota permite afirmar
com segurana se uma determinada enfermidade causada por uma bactria ou no e pode ser utilizado no caso de
qualquer planta, qualquer bactria e qualquer rgo vegetal.

B. Teste do copo

Sintomas de murcha exibidos por plantas, podem ser decorrentes de diferentes causas, tanto biticas
quanto abiticas. Em plantas como batata e tomate, a ocorrncia de murcha acompanhada de descolorao vascular
mostra a existncia de infeco sistmica, normalmente causada por fungos (Fusarium oxysporum e Verticillium sp.)
ou bactria (Ralstonia solanacearum). A diferenciao baseada em sintomas difcil, pois essas murchas exibem
sintomatologia semelhante. Entretanto, o diagnstico pode ser feito de modo prtico e simples, em condies de
campo, por meio do teste do copo. Esse teste usado rotineiramente para a diagnose da murcha bacteriana das
solanceas, incitada por Ralstonia solanacearum, pois nesse caso o pus bacteriano est concentrado nos vasos e a
exsudao pode ser observada a olho nu.

Prof. Jos Rogrio de Oliveira, DFP/UFV.


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Para a realizao do teste proceder como se segue:


1) Cortar uma poro do caule, prximo base e lav-la bem.
2) Mergulhar o pedao do caule em um copo transparente, contendo gua limpa.
3) No caso de murcha bacteriana, em poucos minutos ser observado um corrimento na forma de filetes de um
lquido leitoso, que escorre da extremidade do caule em direo ao fundo do copo, constitudo pelo pus
bacteriano. Nas murchas fngicas esse fluxo leitoso no observado.

REFERNCIAS TEIS

AGRIOS, G. N. Plant pathology. 5. ed. New York, Academic Press, 2001. 922p.

FAHY, P.C & PERSLEY, G.J. Plant bacterial diseases - a diagnostic guide. Sidney, Academic Press, 1983. 393p.

INFORME AGROPECURIO. Doenas de hortalias I, II e III. Belo Horizonte, EPAMIG 1995/1996.

INFORME AGROPECURIO. Doenas de plantas I, II e III. Belo Horizonte, EPAMIG 1985.

KIMATI, H.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A.; REZENDE, J.A.M. Manual de
Fitopatologia - Volume 2: doenas das plantas cultivadas. 4a ed. So Paulo, Ceres, 2005. 663p..

LELLIOTT,R.A. & STEAD, D.E. Methods for the diagnosis of bacterial plant disease. Oxford, Blakwell
Scientific Publications, 1987. 216p.

LOPES, C.A.; QUEZADO-SOARES, A.M. Doenas bacterianas das hortalias diagnose e controle. Braslia,
EMBRAPA, 1997. 70p.

MARIANO, R. L. R. & SILVEIRA, EB (eds.). Manual de prticas em fitobacteriologia. 2a ed. Recife, Editora
Universitria - UFRP, 2005. 184p.

ROMEIRO, R. S. Bactrias Fitopatognicas. 2a ed. Viosa, Imprensa Universitria-UFV, 2005. 417p.

ROMEIRO, R. S. Diagnose de enfermidades de plantas incitadas por bactrias. Viosa, Editora UFV, 2001. 67p.
(Caderno Didtico 78).

ROMEIRO, R. S. Mtodos em bacteriologia de plantas. Viosa, Editora UFV, 2001. 279p.

SCHAAD, N.W.; JONES, J.B. & CHUN, W. (ed). Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria. 3. ed. St. Paul, APS Press, 2001. 398p.

VALE,F.X.R. do & ZAMBOLIM, L. (Eds.). Controle de doenas de plantas - grandes culturas. Visconde do Rio
Branco, Suprema Grfica e Editora Ltda., 1997. 1132 p.

Prof. Jos Rogrio de Oliveira, DFP/UFV.


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REAO DE HIPERSENSIBILIDADE
INDUZIDA POR BACTRIAS FITOPATOGNICAS

O objetivo, nesta aula, discutir a importncia do isolamento e da realizao de testes de patogenicidade na


diagnose de fitobacterioses, alm de familiarizar os estudantes com a realizao do teste de hipersensibilidade (HR).

1. ISOLAMENTO DE BACTRIAS FITOPATOGNICAS

O isolamento de fitobactrias para obteno de culturas puras o segundo dos postulados de Koch e,
portanto, uma condio "sine qua non" em bacteriologia de plantas. Qualquer caracterizao posterior ou
confirmao da diagnose depende da existncia de culturas bacterianas puras. O isolamento de bactrias
fitopatognicas envolve cuidados de assepsia, pois bactrias saprfitas esto quase sempre presentes no tecido
doente, principalmente em leses mais velhas.

2. TESTES DE PATOGENICIDADE

A mais importante propriedade de fitobactrias a sua patogenicidade. Normalmente, no meio de cultura


utilizado para isolamento crescem tanto a bactria fitopatognica quanto bactrias saprfitas e, obviamente, apenas
os isolados patognicos sero caracterizados ou utilizados para confirmao da diagnose. A patogenicidade de
isolados bacterianos pode ser comprovada por meio de procedimentos de inoculao artificial que simulem a
infeco natural, para que haja reproduo dos sintomas (terceiro postulado de Koch).
A patogenicidade de isolados pode ser, tambm, rpida e facilmente comprovada por meio da utilizao de
um teste que se baseia na reao de hipersensibilidade em plantas. Nos casos em que a utilizao da reao de
hipersensibilidade no permite a comprovao da fitopatogenicidade de um isolado bacteriano, a inoculao artificial
do hospedeiro (mesma espcie e cultivar do qual foi obtido o isolado) faz-se necessria.

3. REAO DE HIPERSENSIBILIDADE

A reao de hipersensibilidade (HR) uma reao de defesa das plantas contra fitopatgenos, que ocorre em
uma interao incompatvel patgeno-planta.

3.1. Interaes bactria-planta


A reao esperada em uma planta, quando inoculada com uma bactria, funo do tipo de interao
bactria-planta (Quadro 1). Em uma interao compatvel ocorre a reproduo dos sintomas tpicos da doena. Em
uma interao incompatvel pode ocorrer uma rpida necrose, tpica de uma reao de hipersensibilidade. Bactrias
saprfitas no interagem patogenicamente com plantas e, portanto, no h ocorrncia de qualquer tipo de sintoma.

Quadro 1. Reao da planta em funo da interao bactria-planta.


REAO ESPERADA
TIPO DE
BACTRIA PLANTA SINTOMA TPICO
INTERAO HR
DA DOENA
Patognica Suscetvel Compatvel - +
Patognica No suscetvel Incompatvel + -
Saprfita Qualquer - - -
Adaptado de KIRLY et al., 1974.

A reao de hipersensibilidade difere da reao de suscetibilidade em diversos aspectos,


caracterizando-se por ser rpida (ocorre em 24 horas ou menos), localizada (restrita ao stio de penetrao da
fitobactria) e se expressar sempre como uma necrose.

Prof. Jos Rogrio de Oliveira, DFP/UFV.


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3.2. A induo de HR por fitobactrias


Em bacteriologia de plantas a HR utilizada rotineiramente para a confirmao da fitopatogenicidade de
isolados. A maioria, mas nem todas as bactrias fitopatognicas so capazes de induzir uma necrose hipersensvel em
associaes incompatveis. Por exemplo, as bactrias pertencentes ao gnero Pseudomonas so, normalmente,
excelentes indutoras de HR. Algumas espcies de Erwinia induzem HR, ao passo que outras no. Espcies de
Xanthomonas e bactrias corineformes geralmente necessitam de condies especiais para induzirem HR. As
espcies de Agrobacterium normalmente no induzem resposta hipersensvel em plantas.
Considerando que apenas bactrias fitopatognicas so capazes de induzir HR, pode-se utilizar esta reao
para comprovar a patogenicidade de isolados bacterianos. Em termos prticos, a reao de hipersensibilidade
utilizada rotineiramente em um laboratrio de Bacteriologia de Plantas como um teste rpido de patogenicidade.

3.3. Procedimento para realizao do teste de HR

1) Utilizar como planta-teste uma espcie no-hospedeira do


isolado em estudo. recomendvel a utilizao de
diferentes plantas-teste.
2) Trabalhar com culturas em meio slido, na fase
exponencial de crescimento. Preparar uma suspenso de a b
clulas bacterianas por adio de gua de torneira ao tubo
Figura 1. Posio da agulha durante a infiltrao
contendo a cultura. Aps a adio da gua agitar o tubo e
por injeo na folha: a) correta;
certificar-se de que a suspenso obtida est nitidamente
b) incorreta (KIRLY et al., 1974).
turva.
3) Com uma seringa hipodrmica, injetar lentamente a suspenso bacteriana na folha da planta-teste. O corte em
bisel da agulha deve estar voltado para baixo (Figura 1). A inoculao feita tangenciando as nervuras,
preferencialmente na face inferior da folha.
4) Aps o trmino da operao identificar adequadamente a folha inoculada, anotando: data, hora, bactria
inoculada e nome do operador.
5) Manter as plantas temperatura ambiente, no laboratrio ou casa de vegetao. Caso ocorra uma resposta
hipersensvel, ela ser exibida com 24 horas ou menos. Portanto, fazer observaes, quando possvel, com 12 e
24 horas, para acompanhar a evoluo dos sintomas.

4. REFERNCIAS

GOODMAN, R.N., KIRLY, Z.; WOOD, K.R. The biochemistry and physiology of plant disease. Columbia,
University of Missouri Press, 1986. 433p.

KIRLY, Z.; KLEMENT, Z.; SOLYMOSY, E.; VRS, J. Methods in plant pathology. Budapest, Akadmiai
Kiad, 1970. 509p.

KLEMENT, Z. Rapid detection of the pathogenicity of phytopatogenic pseudomonads. Nature, 199:299-300, 1963.

KLEMENT, Z. & GOODMAN, R.N. The hypersensitive reaction to infection by bacterial plant pathogens. Annual
Review of Phytopathology, 5:17-44, 1967.

KLEMENT, Z.; RUDOLPH, K.; SANDS, D.C. (eds.). Methods in phytobacteriology. Budapest, Akadmiai Kiad,
1990. 568p.

LELLIOTT, R.A. & STEAD, D.E. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Oxford, Blackwell
Scientific, 1987. 216p.

MISAGHI, I.J. Physiology and biochemistry of plant-pathogen interactions. New York, Plenum Press, 1982.
287p.

ROMEIRO, R.S. Reao de hipersensibilidade induzida por bactrias fitopatognicas. Seiva, 33:13-40, 1973.

ROMEIRO, R.S. Fundamentos de fisiologia do parasitismo em fitopatologia. Viosa, MG, UFV, Imp. Univ.,
1987. 31p.

Prof. Jos Rogrio de Oliveira, DFP/UFV.

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