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Biologia Celular e Molecular II

Professora Doutora Isabel Barahona

1 Ano 2 Semestre

Aula 1 Transporte de ies e pequenas molculas atravs das membranas biolgicas

Membrana biolgica

Funciona como barreira para prevenir que o contedo da clula escape ou se misture com o meio
circundante.
Quando a clula cresce ou muda de forma, a membrana acompanha.
Se a membrana for perfurada, rapidamente reparada.
As bactrias mais simples tm uma nica membrana membrana plasmtica.
Os eucariotas contm vrias membranas internas que envolvem compartimentos intracelulares e
funcionam como barreiras entre espaos contendo coleces distintas de macromolculas (membrana
plasmtica, mitocndria, vescula, RE, ncleo, peroxisoma, lisossoma, aparelho de Golgi)
As membranas de cada organelo permitem dot-lo de caractersticas distintas.
A sntese de nova membrana d-se no retculo endoplasmtico.

Constituio

Lpidos
o Dupla camada lipdica constituda por fosfolpidos, molculas anfipticas, com cabea
hidroflica e cauda hidrofbica.
o Esterides como o colesterol fornecem fluidez membrana.
o Fornecem impermeabilidade membrana, bem como fluidez.
o No caso de rompimento de membrana, os lpidos actuam de modo a reparar a mesma.
Protenas
o Desempenham mais funes que o transporte de nutrientes, metabolitos ou ies.
o Algumas ancoram a membrana a macromolculas de ambos os lados.
o Algumas funcionam como receptores que detectam sinais qumicos no meio ambiente da
clula e transmitem ao interior.
o Actuam como coenzimas que catalizam reaces qumicas.
o H 2 modos como se podem associar membrana celular:
Intrnsecas (transmembranar) tm regies hidrofbicas e hidroflicas.
As hidroflicas so expostas ao meio aquoso em ambos os lados da membrana.
Em gua agregam-se pela zona hidrofbica.
No se tornam solveis. Tm de se usar detergentes.
Perifricas Localizadas fora da bicamada ligadas ou a lpidos ou a outras protenas de
membrana.
Solveis em gua
Podem ser libertadas da membrana e deixam a bicamada lipdica intacta.
Acares
o Sempre na camada externa da membrana.
o A maioria das protenas tem cadeias curtas de acares denominados oligossacardeos
(glicoprotenas).
o Outras protenas das membranas tm uma ou mais cadeias longas de polissacardeos ligadas
a elas proteoglicans.
o No lado no-citoslico formam uma cobertura de acar chamada glicoclice.
Ajuda a proteger a superfcie celular de leses mecnicas e qumicas.
Os oligossacardoes e os polissacardeos no glicoclice absorvem gua e conferem
clula uma superfcie lisa, auxiliando clulas mveis como os leuccitos a abrir caminho
e impedindo as clulas sanguneas de se juntaram umas s outras ou s paredes dos
vasos sanguneos.
o Tm um papel importante no reconhecimento clula clula e na adeso.
o Algumas protenas como as lectinas so especializadas em reconhecer cadeias laterais
particulares de oligossacardeos e ligar-se a elas.
o Os oligossacridos esto ainda envolvidos na resposta inflamatria.

Movimentao da dupla camada fosfolipdica

As molculas tm liberdade de movimento.


Os fosfolpidos executam trs tipos de movimentos:
o Desfavorveis
Flip-Flop passagem de um fosfolpido de uma camada para outra
o Favorveis
Rotao
Lateralidade
Quanto mais prximo e mais regular for o emparelhamento das camadas, mais viscosa e menos fluida
a bicamada ser.
Nas clulas animais, a fluidez da membrana controlada pelo colesterol que preenche os espaos
entre as molculas de fosfolpidos, enrijecendo a camada e tornando-a menos fluida e menos
permevel.

Permeabilidade de uma camada pura de fosfolpidos

o Permevel a:
Pequenas molculas hidrofbicas
Pequenas molculas polares no carregadas
o Ligeiramente permevel a:
gua
Ureia
o Impermevel a:
Ies
Grandes molculas polares

Molculas com menos de 30 Carbonos ou menos de 1000Da Pequenas molculas

Molculas com mais de 30 Carbonos ou mais de 1000Da Grandes molculas

Protenas de Transporte

3 Tipos de acordo com a velocidade de transporte


o ATPases ou bombas (mais lentos)
Vo contra o gradiente de concentrao.
ATPases porque hidrolisam ATP que favorece energia ao transporte.
A energia do ATP altera a conformao da protena e permite a passagem de ies.
o Canais inicos (mais rpidos)
Posio aberta / fechada
Abertura de canais
Canais sempre abertos ex. canais de K+
Canais que respondem a estmulos
o Transportadores
Uniporte S possui uma substncia a favor do gradiente
Simporte Possui duas substncias para o mesmo lado.
Antiporte (cotransporte) uma substncia para cada lado, uma a favor, outra contra o
gradiente de concentrao.
As protenas contra o gradiente precisam de energia. A energia provm do potencial de membrana.
Potencial de membrana Tem a ver com a energia acumulada na membrana resultante da diferena
de concentraes e carga entre o meio intra e o meio extracelular.

Mecanismos de Transporte

Passivo a favor do gradiente, liberta energia


o Difuso simples no precisa de protenas
O2, CO2, hormonas esterides
o Difuso facilitada precisa de protenas (canais inicos, uniporte)
Glucose e aminocidos (uniporte), ies e gua (canais inicos)
Activo contra o gradiente, gasta energia
o Transporte Activo Primrio bombas ou ATPases
Ies, lpidos, molculas hidrofbicas pequenas
o Transporte Activo Secundrio Simporte, Antiporte
Glucose, aminocidos (simporte), ies e sacarose (antiporte)

Difuso Simples

H leis que permitem calcular o nmero de molculas que entram,


Processo pouco especfico. Entra tudo o que lipossolvel.
Lei de Fick depende da solubilidade das molculas em meio lipdico, rea a atravessar e diferente
concentrao de um lado e do outro. Mede a velocidade de passagem das molculas
O K da lei de Fick mede a afinidade da substncia para a fase lipdica, quanto maior o K, maior a
afinidade.
O P mede o coeficiente de permeabilidade, isto , medida de afinidade de uma molcula relativamente
a uma fase aquosa ou lipdica.
A difuso atravs de uma membrana a favor do gradiente liberta uma grande quantidade de energia.

Difuso Facilitada

Processo muito especfico


Taxa de transporte muito superior prevista pela lei de Fick.
Taxa de entrada de uma substncia no aumenta linearmente com o aumento da concentrao da
substncia rege-se pela equao de Michaelis-Menten.
o Quanto maior o Km, menor a afinidade.
o A Glut tem muita afinidade para a D-Glucose, a L-Glucose no passa.
o A protena Glut separada do resto por detergentes.
Famlia de Genes Glut (famlia de genes codifica protenas semelhantes, mas no iguais)
o H 12 genes, 12 protenas em clulas humanas.
o Protenas com 12 hlices
o Glut 1 na maior parte das clulas eritrcitos (Km mais baixo que a Glut2)
o Glut2 nos hepatcitos (fgado) e clulas do pncreas.
o Glut4 nas clulas musculares e adiposas
o Glut5 transporta frutose

Hepatcitos armazenam glucose.


O armazenamento feito quando h excesso de glucose.
No h reserva enquanto as outras clulas do organismo no tiverem glucose.
GLUT1 funciona frequentemente; GLUT2 s no armazenamento.
o Est relacionado com o Km
Quando se atinge um patamar, tem a ver com a saturao de protena, deixa de haver protenas
disponveis para transporte.
A glucose liga-se protena, altera a conformao e faz a sua passagem, voltando a protena sua
conformao inicial.
As protenas no reconhecem os ismeros L, s os D, como a D-glucose com um Km menor.
A especificidade no total, no entanto h outras que conseguem passar, embora com um Km menor.

Bombas (ATPases Transporte Activo)

Existem 4 tipos:
o P
o V
o F
o ABC

Protenas P

Bactrias a nvel da membrana plasmtica


Na membrana citoplasmtica, a mais representada a bomba de sdio K+, mas tambm a de
clcio.
Protenas com vrias subunidades
So P porque vo ficar fosforiladas.
Quando h hidrlise de ATP, o grupo fosfato liga-se protena, permitindo a passagem.
Est na membrana plasmtica de todas as clulas eucariotas (bomba de clcio) e retculo
endoplasmtico das clulas musculares.
Est na membrana apical do estmago dos mamferos (H+/K+ bomba)

Protenas V

Tem a ver com vacolos.


Nas clulas animais, essencialmente em lisossomas e vesculas.
o Vacolos clulas vegetais, regulao da P osmtica
o Vesculas clulas animais, no tem a ver com a P osmtica.
Associadas ao transporte de H+.
Tm mais subunidades que as P
Gastam ATP e no ficam fosforiladas
Como transportam H+ regulam o pH.
Lisossomas tm pH de 5 e citoplasma 7. A protena mantm as diferenas de pH
Transporte contra o gradiente
Encontra-se na membrana plasmtica dos osteoclastos e algumas clulas dos tbulos dos rins.

Protenas F

Tambm transportam H+.


Membranas internas da mitocndria e tilacide.
ATPase hidrolisa ATP, mas quando falamos dela estamos a identificar o papel de transportadora.
Ao mesmo tempo um ATPsintase que faz a sntese de ATP.
Duas subunidades: F0 e F1.
A favor do gradiente de concentrao. Liberta energia que favorece a reaco.
Membrana das bactrias, membrana tilacide dos cloroplastos.
O movimento d-se para dentro da matriz, a favor do gradiente de concentrao, porque na
membrana h a cadeia transportadora de electres
Esta bomba, na mitocndria, funciona ao contrrio. Em condies ideais pode fazer o transporte
contra o gradiente.
Funciona nos dois sentidos, mas em condies fisiolgicas faz a favor do gradiente.

Protenas ABC

Contra o gradiente de concentrao.


Nas clulas eucariotas identificadas associadas resistncia a drogas (no incio eram MDR).
Identificadas em clulas cancerosas.
4 Subunidads. 2 No citosol e 2 na membrana.
Tambm na membrana de bactrias, no transporte de aminocidos, acar
Nos mamferos, transporte de substncias lipossolveis (frmacos)
Permeases bacterianas so protenas ABC que transportam uma variedade grande de nutrientes para
dentro das clulas
Flipase de lpidos de E. coli numa protena ABC homloga MDR1 dos mamferos
o A protena com forma de V faz uma cmara na bicamada onde se supe que os substratos
sejam flipados atravs da membrana.
o Cada subunidade desta protena tem um domnio transmembranar com seis hlices e um
domnio citoslico onde o ATP se liga.
Os mamferos tm 50 bombas ABC.
o Adrenoleucodistrofia, ALD, ligada ao cromossoma X doena associada ao peroxisoma,
protena ABCD1.
o Doena de Tangier associada ao transporte de lpidos e colesterol protena ABCA1.
o Fibrose qustica protena CFTR, semelhante MDR1, faz reabsoro de Cl-.
Grande parte da energia usada para manter constante a concentrao de ies.
As protenas esto adaptadas a determinada concentrao inica para que possam funcionar.

Modelo operacional da ATPase Ca2+ das membranas do retculo sarcoplsmico de clulas do msculo
estriado

Bomba P tem uma subunidade para ligao de ATP, aspartato e domnio actuador.
O clcio extracelular entra e o ATP liga-se.
D-se a fosforilao do grupo aspartato e sada de ADP.
Mudana conformacional.
Libertao de clcio no citosol.
Desfosforilao.
Nova mudana conformacional para a conformao inicial.

Modelo operacional de um ATPase de classe P de Na+/K+ na membrana plasmtica

Bomba P com subunidade para ligao de ATP, aspartato e domnio actuador.


Entrada de Na+ do meio extracelular e ligao do ATP
Fosforilao do aspartato e sada de ADP.
Entrada de potssio intracelular na bomba.
Libertao de Na+ para o meio intracelular.
Desfosforilao e mudana de conformao.
Libertao de K+.

ATPase H+ da classe V

Se um organelo intracelular contm somente bombas da classe V, o bombeamento de protes gera


um potencial elctrico na membrana com cargas positivas no lmen da membrana, mas sem
mudanas de pH na zona intraluminal.
Se o organelo contiver tambm canais de cloro, os anies seguem passivamente os protes,
resultando na acumulao de ies H+ (pH luminal baixo), mas no h potencial elctrico na
membrana.

Modelo de transporte das protenas ABP

A parte hidrofbica da molcula substrato vai-se ligar face citoslica da membrana plasmtica, com a
ponta carregada mantendo-se no citosol.
O substrato difunde lateralmente at encontrar o stio de ligao na protena MDR1 na bicamada.
A protena flipa o substrato carregado para a face exoplasmtica, uma reaco desfavorvel com
gasto de ATP que provm do domnio citoslico.
J na face exoplasmtica, o substrato pode difundir lateralmente na membrana e move-se para a fase
aquosa do exterior da clula.

Canais inicos (transporte passivo)

Canais inicos abertos (K+) e criam um potencial de membrana (que aparece porque as protenas
deixam passar ies de forma diferente, porque a membrana permevel)
o Uma membrana impermevel a solutos, no os deixa passar e portanto no registado
qualquer potencial de membrana.
o Numa membrana permevel somente ao sdio, cria-se um potencial de membrana j que fica
mais carga positiva num lado e menos dentro da clula. Potencial negativo.
Calculado pela equao de Nernst
o Numa membrana permevel ao potssio, cria-se tambm potencial de membrana, j que fica
mais carga negativa de um lado. Potencial positivo.
Movimento selectivo de ies gera potencial de membrana.
O potencial elctrico das membranas depende dos canais de potssio abertos.
Canais inicos tm filtros selectivos formados por domnios transmembranares conservados, hlices
e segmentos P.
Todos os canais inicos so tetrmeros.
H interaces mais directas com o canal de K+ do que com o de Na+, porque o io de Na+ mais
pequeno.
medida que os ies de K+ e Na+ passam pelo canal inico perdem as suas molculas de gua. Os
ies K+ conseguem relacionar-se perfeitamente com os oxignios, mas os de Na+ no porque so
demasiado pequenos.
Mostra os ies K+ a passar pelo canal inico. Dentro deste, cada io K+ interage com oito oxignios
A entrada de Na+ em clulas de um mamfero tem G negativo.
As duas foras que influenciam o movimento dos ies K+, Cl- e Na+ atravs de uma membrana so:
o Potencial elctrico da membrana
o Gradiente de concentrao inica.

Co-transporte

Protenas simporte e antiporte com passagem de duas molculas.


Protenas ligadas entrada de Na2+ so importantes para a entrada de aminocidos e glucose contra
o gradiente de concentrao.

Clulas do epitlio do intestino passam nutrientes para a corrente sangunea.


o So polarizadas, ou seja, tm funes diferentes numa mesma membrana, devido s
diferentes protenas existentes na membrana.
Zona apical absorve
Zona basolateral liberta
o Tight-junctions servem de barreira
No deixa misturar as protenas libertadas nem absorvidas. Separam a zona apical da
zona basolateral.
o Necessita de:
Bomba de sdio-potssio (ATPase) gera gradientes de concentrao entre o sangue
e o citosol, nomeadamente tirando o Na+ do citosol para o sangue.
Simporte de sdio-glucose transporte glucose e Na+ do lmen para o citosol para que
a glucose seja transportada pelo GLUT2 e que o sdio seja transportado pela ATPase.
Tight junctions
GLUT2 (uniporte) do mais concentrado para o menos concentrado

Clulas musculares

Especializao contraco e relaxamento


Quando h clcio, h contraco, quando no h clcio, no h contraco.
O clcio no msculo cardaco mantido por uma protena antiporte Na+/Ca2+.
Quando h ataques cardacos usa-se um inibidor da bomba sdio-potssio, a ouabana.
o Diminui a sada de Na+ provocada pela bomba de Na+/K+
o Aumenta a concentrao intracelular de Na+
o Diminui a actividade antiporte Na+/Ca2+
o Diminui a sada de Ca2+
o Aumenta a concentrao intracelular de Ca2+
o Provoca contraces cardacas mais fortes

O pH das clulas dos mamferos regulado por co-transportadores.


o Dentro das clulas, o pH neutro.
o O nico local onde cido nos lisossomas.
Os co-transportadores que controlam o pH em clulas de mamferos so:
o Na+/H+ antiporte
Actividade mxima em meio cido
o Na+HCO3-/Cl- antiporte
Actividade mxima perto do neutro.
o Cl-/HCO3- antiporte
Actividade mxima em meio bsico.
Os ies bicarbonato reagem com os protes e diminuem a concentrao de protes dentro da clula
diminui a acidez da clula.

Eritrcito

Funo transporte de gases


A funo das protenas depende se o eritrcito est nos capilares ou pulmes.
Os glbulos vermelhos dependem da hemoglobina e das protenas de transporte.
o Banda 3 protena antiporte que s existe no eritrcito entrada de Cl-
O CO2 entra por difuso passiva
o Os H+ reagem com o grupo heme e liberta-se oxignio.
Nos eritrcitos dos capilares sistmicos, diminuio de O2 e aumento de CO2 o bicarbonato tem de
ser eliminado
Nos eritrcitos dos capilares pulmes, diminuio de CO2 e aumento de O2 h entrada de
bicarbonato que reage com os ies e libertada gua.
Os eritrcitos no so clulas polarizadas porque esto no sangue, rodeadas exactamente pelo
mesmo meio aquoso (no h zonas diferentes com protenas diferentes) e porque a nvel estrutural
no tm tight junctions.

Vacolos

Reserva onde se acumulam molculas e sais.


Armazenamento.
Tal como nos lisossomas tambm h pH cido.
Elevada concentrao de protes.
A membrana do vacolo tem dois tipos de bombas de protes, a ATPase de classe V e uma bomba de
protes fosfato-hidrolisados exclusiva das plantas.
Estas bombas geram pH baixo no lmen, bem como um potencial elctrico positivo ao longo da
membrana do vacolo.
O potencial positivo interno faz mover Cl- e NO3- do citosol por canais de ies.
Bombas de protes antiporte acumulam Na+ e Ca2+ e sacarose no vacolo com gradiente de H+.

Movimento de gua

Presso osmtica
o A gua passa do meio mais concentrado para o meio menos concentrado.
Apesar de serem molculas polarizadas, tambm podem passar pela zona lipdica da membrana por
difuso simples.
As protenas de transporte so importantes para acumulao de metabolitos e ies nos vacolos.
o Vacolos tm pH devido bomba de H+ que sai, com entrada de Na+, Ca2+ e sacarose.

Aquaporina

Famlia de genes vrios genes que codificam protenas parecidas.


Protenas formadas por vrias subunidades, entre as quais a gua passa.
Estas aquaporinas passam pela membrana transportando gua.
A aquaporina 1 expressa-se nos eritrcitos.
Aquaporina 2 expressa-se nas clulas dos rins (reabsorvem gua da urina)
Mutaes em ambos os alelos da aquaporina 2 provoca diabetes insipidus, excreo de grandes
quantidades de urina diluda.
Transporte transepitelial

Quando temos um epitlio (em monocamada, pousado numa lmina basal h transporte a nvel das
membranas pelas tight-junctions, junes aderentes, GAP junctions e desmossomas.
Junes aderentes Actina e miosina capacidade de contraco
Desmossomas dispersos por vrias zonas da membrana.
Barreira passagem por entre as clulas do ponto de vista estrutural morfologia em rede.
Existem vrios tipos de epitlio, entre eles simples (cbico, cilndrico, simples) ou estratificado
(queratinizado ou no) e de transio.
o Tem superfcie apical e baso-lateral, apoiadas numa lmina basal e num tecido conector.
A superfcie basal est apoiada na lmina basal enquanto que a superfcie apical pode ter
microvilosidades que projectam o lmen intestinal. Logo abaixo das microvilosidades existem tight
junctions que evitam a difuso de substncias entre o lmen intestinal e o sangue. As Gap junctions
permitem movimentos de pequenas molculas e ies entre os citosis de clulas adjacentes. Os
restantes trs tipos (aderentes, desmossomas e hemidesmossomas) so crticas para a adeso
celular e sinalizao

Especializaes membranares

Tight Junction

Evitam a difuso de macromolculas e de pequenas molculas solveis em gua e ies pelo epitlio e
pelos espaos entre as clulas.
Mantm a polaridade das clulas epiteliais prevenindo a difuso de protenas de membrana e
glicolpidos entre a membrana apical e a basolateral assegurando que estas regies contm
componentes diferentes na membrana.
As duas principais protenas encontradas nas tight junctions so a ocludina e a claudina.
Nas preparaes por criofractura, as tight junctions aparecem como uma rede que liga as clulas.
As duas principais protenas integrais das tight junctions so as ocludinas e as claudinas. Mais
recentemente foram descobertas as JAM que contribuem para a adeso hemoflica.
Estas molculas pertencem a famlia das IgCAMS.
O tratamento do epitlio com protease tripsina destri estas tight junctions.
Diferenas de permeabilidade das tight junctions podem controlar a passagem de pequenas molculas
atravs do epitlio.
o Hipomagnesiemia familiar mutaes no gene que codifica a protena claudina 14, alterando o
fluxo paracelular normal de Mg atravs das tight junctions do rim. Resulta numa concentrao
muito baixa de Mg no sangue, que pode provocar convulses.

GAP junction

A funo oposta das tight junctions


Permite que haja passagem de molculas de um lado para o outro
Quando se faz um corte transversal tem forma de rosetas.
Conexinas formam-se em grupos de 6 e formam um canal.
O que regula a sua abertura e fecho a concentrao de clcio.
o Um pequeno aumento de clcio fecha as GAP.

Desmossomas

Mantm uma certa rigidez ao nvel do tecido.


H uma distncia fixa entre membranas, que garantida pelos desmossomas.
As CAMs presentes so da famlia das caderinas (desmogleina, desmocolina)
Pemphigus Vulgaris
o Doena de pele
o Doena auto-imune, em que h sntese de anticorpos que se ligam s protenas normais do
organismo.
o Anticorpo predominante anti-caderina desmoglena
o Aparecem bolhas na pele e h disrupo da adeso entre clulas.
Clera
o Relacionada com a pemphigus vulgaris
o H produo de uma toxina, h movimento de gua (sada) desidratao em reaco ao
desequilbrio inico.
o Alm de se fornecer gua tambm se fornece ies e acar, para que depois possa haver
entrada de gua.

Clulas do estmago

Clulas parietais acidificam o estmago mas mantm o pH do citosol neutro.


Funo de produzir HCl (cido forte que destri a maior parte das molculas orgnicas)
S se forma ao nvel do estmago.
O CO2 reage com o H2O formando-se H+ que fica dentro das clulas activando a bomba H+/K+
(antiporte), que faz a entrada do Cl (que se acumula dentro da clula) e quando sai, sai a favor do
gradiente de concentrao.
Os H+ entram para a clula contra o gradiente de concentrao.

Tipos de tecido

Tecido Epitelial
Tecido Conjuntivo
Tecido muscular
Tecido nervoso
Sangue
o O custo de manter tecidos e rgos grande mas confere uma vantagem adaptativa s
variaes de ambientes.
H um espao fora das clulas que importante, definido pela presena de protenas da membrana
que mantm o espao entre as clulas (matriz celular).
o Protenas CAM transmitem informao transduo de sinal.
Interaces homoflicas
Caderinas
Ig (NCAMs)
Interaces heteroflicas
Integrinas
Selectinas
o Os domnios citoslicos das CAMs recrutam protenas adaptadoras multifuncionais. Estas
protenas adaptadoras interagem, directa ou indirectamente, com o citoesqueleto (forma) ou via
de sinalizao (funo).
As molculas de adeso celular ligam-se entre si e a protenas intracelulares.
A formao de adeses entra as clulas d-se por constante aproximao das protenas que se vo
unir tipo zipper.
Matriz extracelular
o Proteoglicanos
Grande parte da molcula so glcidos
o Colagnio
Est fora da membrana no est directamente ligado membrana
H diferentes tipos de colagnio onde predominam a glicina e a prolina.
Tecido conjuntivo dos tendes. Cartilagens, ossos
Substituies de glicina doenas letais osteogenesis imperfecta e sndrome de
Ehlers-Dantos.
No colagnio existem molculas que controlam a diferenciao e morfognese.
o Protenas multiadesivas (fibronectina)
A associao entre as clulas e o proteoglicano da matriz extracelular mediada por uma integrina e
por uma fibronectina
Funes da matriz extracelular
o Adeso indirecta entre as clulas atravs das ligaes, receptores membranares e protenas
da matriz.
o Suporte mecnico dos tecidos
Fora nos tendes, dentes e ossos
Acolchoamento nas cartilagens
Adeso na maior parte dos tecidos
o Indicadora para a clula sobre a sua localizao e qual a funo que deve desempenhar.
o Reservatrio de muitas molculas sinalizadoras extracelulares, que controlam a diferenciao
e morfognese.

Aula 2 Movimento de protenas para organitos e membranas. Aquisio de estrutura D e localizao


correctas

Todos os mRNAs codificados no ncleo so traduzidos nos ribossomas citoslicos e podem seguir
duas vias distintas:
o Caso tenham uma sequncia sinal para o RE seguir a via secretora. Aps o final da traduo
no RE as protenas movem-se atravs de vesculas de transporte para o complexo de Golgi.
No fim, so transportadas ou para a membrana plasmtica ou para os lisossomas.
o Caso no tenham uma sequncia sinal para o RE seguem uma via no secretria, a sntese de
protenas completada nos ribossomas livres e as protenas so libertadas no citosol. As que
tm uma sequncia de direccionamento so, depois de libertadas no citosol, importadas para
dentro das mitocndrias, dos cloroplastos, dos peroxisomas ou do ncleo.
As protenas mitocndriais e dos cloroplastos passam normalmente as membranas
interna e externa para entrar na matriz ou no espao do estroma.
As protenas externas so distribudas para outros subcompartimentos desses
organelos em outras etapas de distribuio.
As protenas nucleares entram atravs dos poros nucleares.
Se houver um engano e a protena for para um lugar incorrecto na clula, a protena vai ser degradada
com custo energtico.
Ribossomas livres e ligados no tm diferenas estruturais.
As clulas humanas tm 10000 protenas diferentes.

Vias de secreo

O que so protenas de secreo?


o Protenas que saem para fora da clula
Classificao
o Secretadas continuamente
Protenas do soro
Albumina
Transferrina
Lipoprotenas
Imunoglobulinas
Da matriz extracelular (sintetizadas nos fibroblastos)
Colagnio
Fibronectina
Proteglicanos
o Secretadas com regulao
Hormonas peptdicas
Insulina
Glucagina
Endorfinas
Encefalinas
ACTH
Enzimas digestivas
Tripsinognio
Quimiotripsinognio
Amilase
Protenas do leite
Casena
Albumina do leite
Qual o percurso que seguem as protenas de secreo dentro da clula?
o Via de secreo
Sntese da protena nos ribossomas ligados e transporte para dentro do RE
Movimento para o aparelho de Golgi
Passagem pelas vesculas do Golgi
Secreo vs Lisossoma
Secreo Face exoplasmtica (exterior)
Lisossoma Reciclagem de protenas

Experincia

Marcao de protenas secretoras


o Anticorpos associados a fluorocromos
o Radioactividade
Fornecendo os precursores (aminocidos) radioactivos s protenas durante um curto
perodo de tempo
Experincia de Pulse Chase
o Todas as protenas das clulas vo ficar marcadas radioactivamente e depois so visualizadas
ao microscpio electrnico e emitem radiao (pontos negros)
o As protenas secretoras so visualizadas associadas ao RE. Mais tarde passam para o
aparelho de Golgi, depois para as vesculas e, no final, j se consegue visualizar fora das
clulas.

Em que tipo de ribossomas so sintetizadas?

o Ribossomas livres
o Ribossomas ligados
So separados por fraccionamento celular, que permite separar organitos.
o Ruptura da membrana suspenso
o Centrifugao em gradiente de densidade
o Pellet tem ribossomas livres
o Suspenso tem ribossomas ligados (banda a meio)
Tm densidades diferentes porque os ribossomas ligados a membranas esto com lpidos.
Ribossomas das mitocndrias
o Sintetizam todas as protenas de DNA mitocondrial
Ribossomas dos cloroplastos
o Sintetizam todas as protenas de DNA do cloroplasto.
Ribossomas livres ou citoslicos
o Protenas do citoesqueleto
o Protenas ligadas s membranas por lpidos ou outros
o Protenas do cloroplasto e mitocndria mas de DNA nuclear.
o Protenas do peroxissoma
o Protenas nucleares
Ribossomas ligados s membranas
o Protenas intrnsecas das membranas
o Protenas de secreo
o Protenas do lisossoma
o Protenas do RER
o Enzimas do complexo de Golgi

Aps a sntese nos ribossomas ligados, para onde vo as protenas de secreo?

Microssomas (vesculas que se obtm aps a manipulao e que representam o retculo


endoplasmtico)
o Detergente que destri a membrana e permite a aco das proteases sobre as protenas.
As protenas existem no lmen do retculo e no no citosol, seno na experincia sem tratamento de
detergente as protenas seriam degradas por proteases.
Qual o sinal que faz com que as protenas de secreo se dirijam para o RER?

As protenas entram para dentro do RER por sinal, a sequncia sinal permite a entrada de protenas,
mas isso no chega.
Cauda hidrfoba na extremidade N-terminal.
Experincias in vitro mostram que preciso adicionar mRNA e microssomas dentro do tubo do ensaio
tudo ao mesmo tempo para que a entrada seja feita ao mesmo tempo que ocorre a traduo.
Tm de ser produzidos mais aminocidos para que os primeiros saiam do ribossoma e sejam
detectados pela partcula reconhecedora de sinal
Protenas G activadas unidas a GTP. Protenas G inactivadas unidas a GDP.
A translocao iniciada por duas protenas G e co-traducional.
o Uma vez que a sequncia sinal emerge do ribossoma, h uma partcula reconhecedora de
sinal (SRP) que se liga ao sinal.
o A SRP vai ligar o ribossoma com o polipptido nascente ao receptor SRP na membrana do
retculo. A interaco feita com a ligao do GTP tanto ao SRP como ao receptor.
o A transferncia do complexo polipptido nascente/ribossoma leva abertura do canal de
translocao e insero da sequncia sinal no poro central. Tanto o SRP como o receptor de
SRP, depois de dissociados do translocador hidrolisam o GTP em GDP + Pi e esto prontos
para iniciar a insero de outra cadeia polipeptdica.
o Enquanto a cadeia polipptidica sofre elongao, passa pelo canal do translocador para dentro
do RE onde a sequncia sinal depois clivada por uma protease e este rapidamente
degradado.
o O polipptido continua a crescer para dentro do RE
o Assim que a traduo esteja completa, o ribossoma libertado, a protena libertada para
dentro do lmen do RE e o transloco fecha. A protena adquire a sua conformao nativa.
A SRP constituda por seis polipptidos ligados a uma cadeia de RNA
o P54 Liga o sinal ao RE
o P19
o P68/P72 Necessria para a translocao da protena
o P9/P14 Interage com os ribossomas
A SRP vai inibir a traduo na ausncia de receptor para a SRP
Experincias de traduo in vitro
o Os ribossomas livres produzem sequncias sinal, mas s in vitro.

Translocao

por onde passam protenas, porque h interaco entre os aminocidos da protena que entra com
os aminocidos do transloco.
Protenas BIP mantm a protena desenrolada. A ligao faz-se por zonas hidrfobas, que vo ficar
no interior.
o da famlia das chaperons.
o Associam-se a outras protenas e enrolam ou desenrolam-nas, de modo a ficarem funcionais.
o Tambm puxa a protena, ao nvel do transloco.
o A protena BIP mantm a protena desenrolada e permite que outras protenas se liguem a
elas.
o A levedura fcil de comparar com as protenas humanas porque h muitas semelhanas.
A Sec61 um componente do transloco que contacta com as protenas nascentes enquanto elas
passam pelo transloco. Fornece um codo de terminao da cadeia para que possa ser libertada do
ribossoma.
Na transcrio ps-traducional, a hidrlise de ATP muito importante
o O mecanismo comum na levedura
o A protena BIP ligada ao ADP liga-se ao polipptido nascente, medida que este vai saindo do
transloco impedindo que a cadeia adquira a conformao nativa antes de estar completa.

Insero de protenas intrnsecas nas membranas


H 4 tipos de protenas membranais integrais sintetizadas no RER, bem como um quinto tipo
ancorado membrana por uma ncora fosfolipdica.
As protenas de membrana so classificadas pela sua orientao na membrana e os tipos de sinais
que as levaram l.
Nos tipos I a IV, os segmentos hidrofbicos formam hlices embebidas na membrana. As regies
exteriores so hidroflicas e tomam vrias conformaes.
Todas as tipo IV tm vrios domnios hidrofbicos.
o Tipo I receptor LDL, receptor insulina
o Tipo II receptor transferritina
o Tipo III Citocromo P450
o Tipo IV Receptores protenas G, transportadores de glucose, bombas ABC
Insero de protenas tipo I
o Depois do complexo ribossoma/protena nascente se associar ao transloco da membrana do
RE, a sequncia sinal na zona N-terminal clivada. O processo o mesmo das outras
protenas secretrias.
o A cadeia elongada at ser sintetizada a cadeia hidrofbica de stop e entrar no transloco,
onde impede a cadeia de se mover mais para dentro do lmen.
o A cadeia de stop ancorada move-se lateralmente entre as subunidades do transloco e fica
ancorada na bicamada fosfolipdica. Ao mesmo tempo o transloco fecha.
o medida que a sntese continua, a cadeia vai aumentando para o lado citoslico.
o Quando a sntese se encontra completa, as subunidades ribossomais so libertadas para o
citosol e a protena fica na membrana.
Insero de protenas tipo II
o Depois da sequncia ancorada ser sintetizada no ribossoma citoslico, ligada a um SRP que
vai levar o complexo para a membrana do retculo
o A sequncia sinal hidrofbica no est localizada na zona N-terminal e no clivada.
o A cadeia nascente orientada no transloco e passa a ser formada em direco ao citosol
devido aco da sequncia sinal-ancoradora.
o medida que a cadeia elongada, expelida para o lmen e a sequncia sinal-ancoradora
move-se lateralmente para fora do transloco e fica ancorada na membrana.
o Assim que a sntese est completa, a parte C-terminal libertada para o lmen e as
subunidades ribossmicas so libertadas para o citosol.
Insero de protenas tipo IV
o Se a protena atravessar muitas vezes a membrana, tem vrias sequncias ancoradoras.
As sequncias topognicas determinam a orientao das protenas de membrana do RE
o As protenas tipo I contm uma sequncia sinal na extremidade N-terminal e um STA (internal
stop-transfer anchor sequence)
o As protenas tipo II tm um SA-II (internal signal-anchor sequence)
o As protenas tipo III tm um SA-III (internal signal-anchor sequence)
o As protenas tipo IV-A contm SA-II e STA
o As protenas tipo IV-B contm SA-III, SA-II e STA
A separar as regies topognicas esto zonas hidroflicas que se alternam entre o lmen e o citosol.
Insero de protenas atravs de uma ncora fosfolipdica
o O GPI da levedura. A poro hidrofbica tem uma cadeia de cidos gordos, enquanto a polar
tem hidratos de carbono e grupos fosfato.
o A formao de protenas ancoradas a GPI feita da seguinte forma:
A protena sintetizada e inicialmente inserida na membrana do RE.
Uma transamidase especfica cliva a protena perto da sequncia stop e transfere o
grupo carboxilo do novo C-terminal para o grupo terminal amina da ncora GPI.
Perfis de hidropatia permitem determinar a topologia de protenas intrnsecas.
o Para baixo hidrfilo, para cima hidrfobo.
o Para cima est no centro. Tipo IV tm vrias partes no centro.
o Tipo I tm no incio em cima a sequncia sinal e mais frente a sequncia ancoradora.

Via secretria e endoctica


o Secretria
A sntese de protenas em ribossomas ligados e transporte co-traducional de protenas
pela membrana do RE
Algumas protenas ficam na membrana do RE, outras seguem a via de secreo.
As que seguem a via so incorporadas em vesculas que se vo fundir com a cisterna
cis do Golgi.
As que so para ficar no retculo voltam para trs atravs de transporte retrgrado por
vesculas.
Cada vescula cis, com o seu contedo em protenas move-se fisicamente de uma zona
cis para uma zona mdia e depois trans por um processo no vesicular chamado
maturao de cisternas.
As vesculas de transporte retrgrado movem protenas residentes do Golgi para a
cisterna correcta
Em todas as clulas, determinadas protenas solveis movem-se para a superfcie da
clula em vesculas de transporte e so secretadas continuamente.
Em certos tipos de clulas, algumas protenas solveis so armazenadas em vesculas
e libertadas aps a clula receber um determinado estmulo.
As protenas para a membrana do lisossoma movem-se primeiro para o endossoma e
depois para o lisossoma.
o A via endoctica
Protenas extracelulares e de membrana so captadas em vesculas que se formam da
membrana plasmtica e podem-se mover para o lisossoma atravs do endossoma.

Modificaes ps-traducionais e controlo de qualidade no RER

No retculo, as protenas sofrem modificaes que so importantes para que fiquem funcionais.
Sofrem
o Clivagem da sequncia sinal
o Glicosilao
Adio de um acar protena nascente no RER.
O acar tem uma regio conservada e outra varivel.
A glicosilao pode ser de tipo N (aminocido asparagina) ou tipo O (com
menos acares)
Os acares que se vo ligar a aminocidos esto no citosol associados a
nucletidos (tm fosfato, os nuclesidos que no)
Biossntese de precursores de oligossacridos tipo N
Dolichol fosfato um lpido que se encontra na membrana do RER. Duas
GlcNAc e cinco resduos de manose so adicionados, uma de cada vez, ao
dolichol fosfato na face citoslica do RER
Tunicamicina bloqueia a primeira enzima desta etapa.
Quando h cinco manoses, o lpido inverte e vai para o lmen da membrana
(flip-flop atravs de flipases)
Adio e processamento dos oligossacridos tipo N no RER
Depois do precursor estar formado, transferido para um resduo de asparagina
numa protena nascente.
Em reaces sequenciais os resduos de glucose e depois um de manose so
removidos.
Pode-se dar novamente a ligao de um resduo de glucose de forma a enrolar
correctamente algumas protenas.
A enzima oligossacaride protein transferase liga a asparagina da protena
nascente ao resduo oligossacrido.
Adio Sequencial de Acares
Ramificao ainda maior, quando os acares so adicionados a outros
acares.
o Formao de ligaes persulfuretos (S S)
Enxofre.
Glutationa formao de ligao persulfureto est no estado oxidado, vai interagir
com a protena que est no estado reduzido.
S na metionina e na cistena.
No RER h uma enzima PDI (que pode variar entre o estado reduzido e o estado
oxidado)
medida que a protena entra, as cistenas vo-se unindo. necessria a aco de
uma isomerase que vai refazer a protena de acordo com a sua estrutura
Ligaes S so ligaes covalentes, que estabilizam as estruturas tercirias.
A Ero1 vai transformar a PDI reduzida a oxidada.
Aplicao bioctecnolgica
Criao de um meio favorvel. Produzir a protena em clulas eucariotas.
Produo de:
o Activador de plasminognio anticoagulante
o Eritropoietina hormona que estimula a produo de clulas do sangue
o Aquisio de estrutura quaternria
A BIP liga-se protena impedindo um mau arranjo da mesma. Liberta-se por hidrlise
de ATP.
H protenas no retculo que facilitam a aquisio de estrutura quaternria
Chaperoninas como a BIP
PDI
Lecinas (Calreticulina, Calnexina)
Resposta presena de protenas desenroladoras
Ire1, uma protena transmembranar do retculo tem um local de ligao para a
BIP no domnio luminal e tem uma endonuclease na parte citoslica.
Protenas desenroladas acumulam-se na parte luminal ligadas a BIP libertando-
as da Ire1, activando a parte endonuclease.
O mRNA com o factor de transcrio Hac1 clivado pela Ire1 e os dois exes
so unidos para formar Hac1 funcional
Hac1 transcrita para protena que vai depois para o ncleo activar a
transcrio de genes.
Enfisema problemas respiratrios
o Doena resulta do mau enrolamento das protenas
o Mutao no gene 1-antitripsina
o Deixa de haver inibio das proteases, tripsina e elastase, que destroem
o tecido pulmonar.

Degradao das protenas mal-formadas do RER

Se as protenas no se juntarem, no so reconhecidas e so eliminadas.


As protenas que no adquirem a estrutura quaternria so degradadas no interior do lisossoma e,
actualmente descobriu-se o proteossoma (agregado de protenas no citosol onde as protenas so
degradadas de uma forma muito especfica),
Ubiquitina protena que est em todo o lado, sobretudo ao nvel do citosol. As protenas mal-
formadas ligam-se s ubiquitinas sinal para que as protenas interajam com os proteossomas,
havendo degradao de protenas. S faz marcao.

Controlo de qualidade no RER

Como que o Golgi se divide?


o H a ideia de que o Golgi vai avanando em direco membrana e as vesculas fundem-se e
formam cisternas sucesso de fuso das vesculas
As vesculas que transportam protenas do RER para a poro cis do Golgi so as COP II.
Na membrana da poro cis do Golgi existe um receptor KDEL
As vesculas que transportam protenas do Golgi para o RER so as COP I
H glicosilao no RER
o Cis-Golgi
Se no forem retirados resduos de manose Protena com oligossacrido com muita
manose
o Medial-Golgi
Se no for acrescentado um UDP - Protena com oligossacrido com muita manose
Se no for removida uma manose associao de GDP, UDP, CMP em pequenas
quantidades protena com um oligossacrido hbrido (Trans exterior)
Caso seja removida uma manose associao de GDP, UDP, CMP em grandes
quantidades protena com um oligossacrido complexo
Via
o Protena Secretria
RER Cis Golgi Trans Golgi Exterior (exocitose)
o Protena Lisossomal
Fosforilao Receptor manose-6-fosfato associao a uma vescula claritina
Dissociao da claritina Dissociao da manose-6-fosfato da protena
o Reciclagem da manose-6-fosfato vescula de claritina
o Remoo do fosfato Lisossoma

Aula 3 Trfego vesicular. Secreo e endocitose

Via secretria e endoctica

Secretria
o A sntese de protenas em ribossomas ligados e transporte co-traducional de protenas pela
membrana do RE
o Algumas protenas ficam na membrana do RE, outras seguem a via de secreo.
o As que seguem a via so incorporadas em vesculas que se vo fundir com a cisterna cis do
Golgi.
o As que so para ficar no retculo voltam para trs atravs de transporte retrgrado por
vesculas.
o Cada vescula cis, com o seu contedo em protenas move-se fisicamente de uma zona cis
para uma zona mdia e depois trans por um processo no vesicular chamado maturao de
cisternas.
o As vesculas de transporte retrgrado movem protenas residentes do Golgi para a cisterna
correcta
o Em todas as clulas, determinadas protenas solveis movem-se para a superfcie da clula
em vesculas de transporte e so secretadas continuamente.
o Em certos tipos de clulas, algumas protenas solveis so armazenadas em vesculas e
libertadas aps a clula receber um determinado estmulo.
o As protenas para a membrana do lisossoma movem-se primeiro para o endossoma e depois
para o lisossoma.
A via endoctica
o Protenas extracelulares e de membrana so captadas em vesculas que se formam da
membrana plasmtica e podem-se mover para o lisossoma atravs do endossoma.

Fentipos dos mutantes sec das leveduras que identificam as fases da via secretora

As leveduras podem ser utilizadas porque a organizao da via secretora e os componentes do


trfego intracelular so conservados entre os eucariotas.
Inicialmente foram identificadas muitas leveduras mutantes que secretavam protenas a uma
determinada temperatura mas a temperaturas mais altas no secretavam, porque estas eram
armazenadas.
Foram ento organizadas de acordo com o local onde armazenam as protenas.
o Nas A ficavam acumuladas no citosol, j que no passavam para o transporte no RE
o Nas B, acumulavam-se no RER porque no eram formadas vesculas a partir deste.
o Nas C, acumulavam-se nas vesculas de transporte, j que a fuso das vesculas do RER com
o Golgi no era possvel.
o Nas D, acumulavam-se no Golgi, pois no havia transporte do Golgi para as vesculas
secretoras.
o Nas E, acumulavam-se nas vesculas secretoras, pois no havia transporte das vesculas
secretoras para a superfcie celular.
Gemulao e fuso de vesculas

Protuberncia que se cria e vai dar origem s vesculas.


Ocorre devido estrutura malevel da membrana.
Formao de vescula com franja
o A ligao de protenas da franja (coat) permite a formao de vesculas e selecciona as
protenas (cargo) a transportar.
o A formao de vesculas iniciada pelo recrutamento de uma protena ligadora de GTP.
Depois, complexos de protenas de revestimento no citosol ligam-se ao domnio citoslico das
protenas cargo da membrana, algumas das quais tambm actuam como receptores que se
ligam s protenas solveis no lmen, recrutando assim as protenas luminais para dentro da
vescula.
o As v-SNARE vo ser fundamentais fuso da vescula com a membrana-alvo correcta.
o As vesculas com protena COP II vo do retculo para o Golgi
o As vesculas com protena COP I vo do Golgi para o retculo.
o As vesculas com protena claritina vo da membrana plasmtica e rede do Golgi para os
endossomas tardios.
o As vesculas formam-se todas a partir da protena G (Sar, por exemplo), normalmente inactiva
e ligada a GDP (pertencem famlia das GTPases)
Fica activada ligando-se a GTP e comea a formar-se a franja
Depois as protenas da franja dissociam-se e fica uma vescula nua.
o Coat protena volta das vesculas recm-formadas.
Fuso das vesculas j sem franja
o Aps a libertao e dissociao do revestimento, a vescula funde-se com a membrana-alvo
num processo que envolve as protenas SNARE correspondentes.
Modelo da funo da Sar1 na formao e dissociao das capas de COP II
o A interaco do GDP solvel ligado Sar1 com o factor de alterao Sec12, uma protena de
membrana integrada no RE, catalisa a troca de GTP por GDP, na Sar1. Na forma de Sar1
ligada ao GTP, o seu domnio N-terminal hidrofbico projecta-se para fora da superfcie da
protena, fixando a Sar1 membrana do RE.
o A Sar1 fixada membrana actua como um stio de ligao para o complexo de revestimento
Sec23/Sec24. As protenas de carga so trazidas para a vescula em formao pela ligao de
pequenas sequncias especficas (sinais de classificao), presentes nas suas regies
citoslicas, com os stios do complexo Sec23/Sec24. O revestimento ou capa completado
pela formao de um segundo tipo de complexo de revestimento composto por Sec13 e Sec31.
o Aps a capa estar completa, a subunidade Sec23 promove a hidrlise do GTP pela Sar1
o A libertao do complexo Sar1-GDP da membrana da vescula provoca a dissociao do
revestimento.
Modelo para a fixao e fuso das vesculas de transporte com as suas membranas-alvo
o Uma protena Rab, fixada por uma ncora lipdica vescula secretora, liga-se a um complexo
efector da protena presente na membrana plasmtica fixando, assim, a vescula de transporte
na membrana-alvo adequada.
Famlia das protenas Rab
Permitem a aproximao e interaco das protenas SNARE
Aproximam a vescula da membrana
o Uma protena v-SNARE (neste caso a VAMP) interage com os domnios citoslicos das t-
SNAREs correspondentes (no caso, a sintaxina e a SNAP-25). Os complexos super-helicoidais
muito estveis que so formados mantm a vescula prxima membrana-alvo.
o A fuso das duas membranas ocorre imediatamente aps a formao dos complexos SNARE,
mas no se sabe exactamente como.
o Aps a fuso das membranas, a NSF junto com a protena -SNAP liga-se aos complexos
SNARE.
o A hidrlise do ATP catalisada pela NSF efectua a dissociao dos complexos SNARE,
libertando essas protenas para voltar a fazer fuso vesicular.
A fuso entre membranas envolve mudanas conformacionais de protenas de fuso
o Exemplo da hemaglutinina
Protena de fuso
Especfica da membrana do vrus da gripe
Trimrica adquire a conformao no retculo
Induz o processo de fuso porque para que haja entrada de vrus na clula, tem de
haver interaco entre protenas, com ajuda de pH.
Inicialmente, o pH 7, depois encontra cido e muda de conformao.
o Em pH = 7
Parte de cada subunidade H forma um domnio globular na ponta da espcula (verde).
Estes domnios ligam-se aos resduos de cido silico na membrana plasmtica da
clula hospedeira, iniciando a entrada do vrus.
Cada subunidade HA2 contm um pptido de fuso na extremidade N-terminal.
o Em pH = 5 (lisossoma)
A ligao do pptido de fuso aos outros segmentos de HA2 interrompida, induzindo
a um rearranjo estrutural da protena.
Primeiro, os trs domnios globulares de H so separados mas permanecem unidos
s subunidades HA2 pelas ligaes dissulfureto na base da molcula.
O segmento de ala de cada HA2 reorganizado.
Os pptidos de fuso encontram-se na ponta da estrutura helicoidal e podem ser
inseridos na membrana lisossomal.
Modelo de fuso das membranas pela hemaglutinina (H)
o Vrias espculas de H activadas pelo pH baixo formam uma estrutura que conecta uma
pequena regio do envelope viral e a membrana endossomal.
o Por mecanismos desconhecidos, os folhetos exoplasmticos das duas membranas fundem-se
e a seguir os folhetos citoslicos fundem-se, formando um poro que se vai expandir at que as
duas membranas estejam completamente unidas.
o Uma interaco semelhante pode ocorrer mediada pelas SNAREs.

Percurso inicial das protenas de secreo

Trfego de protenas entre o RE e o cis-Golgi mediado por vesculas


o O transporte directo (para a frente, anterrgrado) mediado por vesculas COP II, formadas
pela polimerizao de complexos de protenas de revestimento COP II solveis na membrana
do RE.
o As v-SNAREs e outras protenas de carga na membrana do RE so incorporadas na vescula
pela interaco com as protenas de revestimento.
o As protenas de carga solveis so recrutadas pela ligao aos receptores apropriados na
membrana das vesculas em formao.
o A dissociao da capa liberta deixa disponvel dos complexos de revestimento e expe as
protenas v-SNAREs na superfcie da vescula.
o Aps a fixao da vescula sem revestimento membrana do Golgi, em processo mediado
pelo Rab, o pareamento entre as v-SNAREs e as t-SNAREs na membrana permite a fuso
vesicular, libertando o seu contedo dentro do compartimento do Golgi.
o O transporte reverso, no sentido retrgrado, meadiado por vesculas revestidas com COP I,
recicla a bicamada da membrana e determinadas protenas, como as v-SNAREs e das
protenas que residem no RE e que foram erroneamente transportadas para o cis-Golgi.
Complexo composto por protenas de revestimento COP II, Sec 23 e Sec 24 e Sar1-GTP.
o No incio da formao da capa de COP II, os complexos Sec23/Sec24 so recrutados para a
membrana do RE pela Sar1 na forma ligada ao GTP.
Funo do receptor KDEL
o As protenas luminais do RE podem ser passivamente incorporadas nas vesculas de COP II e
transportadas para o Golgi.
o Vrias delas possuem uma sequncia C-terminal KDEL que permite a sua recuperao.
o O receptor KDEL localizado na rede cis-Golgi e em ambas as vesculas de COP I e COP II,
liga-se s protenas que contm o gene de classificao KDEL e tr-las de volta para o RE.
o Este sistema de recuperao evita o esgotamento de protenas luminais do RE como as
necessrias para o enrolamento correcto das protenas secretoras recm-produzidas.
o A afinidade da ligao do receptor KDEL muito sensvel ao pH. A pequena diferena de pH
entre o RE e o Golgi favorece a ligao das protenas contendo KDEL ao receptor nas
vesculas derivadas do Golgi e a sua libertao no RE.
Formao de vescula no cis-Golgi sem clatrina
o As protenas ARF1 (que fosforilam o ADP em ATP) ligam-se ao receptor ARF da membrana.
o As protenas integrais esto incorporadas em vesculas.
o O revestimento (coatomer) vai-se ligar e envolver a vescula nascente, formando-se uma
vescula sem clatrina.

o Forma-se uma eminncia (bud) no cis-Golgi


o Coatomer, ARF e outros factores proteicos vo formar as vesculas de transporte sem clatrina.
o Estas vo para uma zona especfica do Golgi (no caso medial Golgi)
o D-se o desempacotamento pela Rab e outras protenas e finalmente a fuso (SNAPs, NSF e
outros factores)
Fuso
A protena Rab na vescula secretora, liga-se ao complexo efector da protena
presente na membrana plasmtica fixando uma vescula de transporte na
membrana-alvo adequada.
A VAMP (v-SNARE) interage com os domnios citoslicos das t-SNARES
(sintaxina).
A fuso das membranas ocorre logo aps a formao destes complexos.
Aps a fuso das membranas, a NSF junto com a -SNAP liga-se aos
complexos SNARE.
A hidrlise do ATP catalisada pela NSF efectua a disposio dos complexos
SNARE, libertando as protenas para voltar a fazer fuso vesicular.
Distribuio das protenas Rab pela via de secreo
o Rab 2, Rab 1 Do RER para o cis-Golgi
o Rab 6 Do cis-Golgi para o medial-Golgi
o Rab 10 Do medial-Golgi para o trans-Golgi
o Rab 3 Do trans-Golgi para o exterior
o Rab 4, Rab 5 Do endossoma inicial para o endossoma tardio
o Rab 7 Do endossoma tardio para o lisossoma
o Rab 9 Do trans-Golgi para o lisossoma

Modificaes ps-traducionais no aparelho de Golgi

Ocorrem reaces diferentes em cada tipo de cisterna


Modificaes
o Glicosilaes
o Fosforilaes
o Metilaes
o Acetilaes

Glicosilaes
o Aps a remoo de trs resduos de manose no cis-Golgi, a protena move-se por maturao
de cisterna para a medial-Golgi.
o Na medial-Golgi os resduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) so adicionados
o O processamento fica completo nas trans-Golgi pela adio de trs resduos de galactose e
finalmente pela adio de cido N-acetilneuraminico a cada resduo de galactose.
A uridina difosfato perde o acar para a protena, actua uma fosfatase e depois uma protena anti-
porte.
As protenas so glicosiladas, entram para o Golgi e so fosforiladas
No aparelho de Golgi
o onde as protenas sofrem marcao e vo fazer com que se encaminhem para o lisossoma.
Transporte mediado por vesculas no domnio trans-Golgi
o As vesculas com COP I medeiam o transporte retrgrado para o trans-Golgi.
o Protenas que funcionam no lmen ou na membrana do lisossoma so transportadas do trans-
Golgi via vescula com clatrina.
o Aps perderem a franja, estas vesculas fundem-se com os endossomas tardios que vo deitar
o seu contedo nos lisossomas. A franja nas vesculas com clatrina contm protenas
adicionais como os complexos AP.
o Algumas vesculas do trans-Golgi que contm cargo so directamente enviadas para o
lisossoma. Estas vesculas contm uma franja com complexos AP. No se sabe se contm
clatrina.
o As vesculas que transportam elementos constitutivos e para o exterior ainda no esto
caracterizadas.
Envolvimento dos trs principais tipos de protenas de revestimento no trfego vesicular nas vias
secretora e endoctica
o Aps a formao de vesculas a partir da membrana dadora, as capas so despolimerizadas
nas suas subunidades que so reutilizadas formando outras vesculas de transporte.
o As vesculas de COP II promovem o transporte anterrgrado do RE para o cis-Golgi. As
vesculas COP I promovem o transporte retrgrado do cis-Golgi de volta para o retculo.
o As protenas de revestimento que envolvem as protenas secretoras ainda no foram
caracterizadas.
o As vesculas revestidas com clatrina saem da rede trans-Golgi da membrana e aps a remoo
do revestimento, fundem-se com os endossomas tardios.
o As protenas secretoras movem-se do cis para o trans sem recorrer a vesculas, por maturao
das cisternas.
Estrutura das capas de clatrina
o Clatrinas
Uma molcula de clatrina, chamada trikelion, composta por 3 cadeias pesadas e 3
cadeias leves.
Apresenta uma curvatura intrnseca devido s cadeias pesadas.
O revestimento fibroso da clatrina em volta da vescula constitudo por 36 trikelions.
Os complexos AP2 tambm ajudam na formao da rede.
Formam uma estrutura em rede que d rigidez
Ao microscpio electrnico de varrimento so visveis os hexgonos de clatrina.
As vesculas perdem as clatrinas atravs da interveno de protenas chaperons.
o A dinamina essencial para a separao de vesculas
A hidrlise de GTP mediada pela dinamina vai libertar a vescula.

O que acontece s protenas que vo para os lisossomas?

Formao de resduos de manose-6-fosfato que direccional as enzimas solveis para os lisossomas.


o Os resduos de M6P que direccionam protenas para os lisossomas so produzidos no cis-
Golgi por duas enzimas residentes. Como as enzimas lisossomais contm sequncias que so
reconhecidas e ligadas por uma enzima, os grupos GlcNAc fosforilados so adicionados
especificamente s enzimas lisossomais.
o Aps a libertao de uma protena modificada pela fosfotransferase, uma fosfodiesterase
remove o grupo GlcNAc resultando num resduo de manose fosforilada na enzima lisossomal.
Trfico de enzimas lisossomais solveis do trans-Golgi e superfcie da clula para os lisossomas
o Enzimas lisossomais produzidas no RER adquirem resduos M6P no cis-Golgi.
o No trans-Golgi, as protenas que reconhecem o sinal M6P interagem com os receptores M6P e
so direccionadas para vesculas clatrina/AP1.
o A franja que envolve as vesculas rapidamente despolimerizada e as vesculas sem franja
fundem-se com os endossomas tardios
o Depois das enzimas fosforiladas se dissociarem dos receptores M6P e se desfosforilarem, os
endossomas tardios fundem-se com o lisossoma.
o As protenas da franja e os receptores M6P so reciclados e alguns receptores (M6P) so
devolvidos superfcie celular.
o As enzimas lisossomais fosforiladas so, por vezes, libertadas do trans-Golgi para a superfcie
da clula e secretadas. Podem depois entrar pelo receptor M6P por endocitose, formando na
mesma a vescula com clatrina, depois h a despolimerizao da franja e a vescula une-se
com o endossoma tardio que se vai depois fundir com o lisossoma.
Doena da clula I
o Doena de armazenamento lisossomal
o Falta de enzimas lisossomais
o Falta de N-acetil glucosamina transferase
o O que acontece s protenas lisossomais?
Acumulam-se nos lisossomas dos fibroblastos formando grandes incluses.
o O que acontece s clulas?
Morrem.
o Nos hepatcitos dos doentes no h incluses nos lisossomas. Como explica?
Porque pode haver outra marcao, sem ser ao nvel da M6P. A marcao dos
fibroblastos diferente dos hepatcitos.
o A nvel digestivo ou endovenoso a protena reconhecida como antignio e degradada.
Algumas protenas sofrem protelise aps o Golgi.

Vesculas de secreo constitutiva e regulada


o O processamento da proalbumina tpico da via de secreo constitutiva.
A endopeptidase furina actua no precursor de protenas de secreo constitutiva.
o O processamento da proinsulina tpico da via de secreo regulada.
Duas endopeptidases PC2 e PC3 actuam nos precursores de protenas de secreo
regulada.
O processamento final feito por uma carboxipeptidase que remove dois aminocidos
bsicos da extremidade C-terminal.
o A agregao de protenas pode funcionar como sinal de secreo.
o Vesculas de secreo controlada ou regulada na clula do pncreas
A glucose entra pelo GLUT2 e passada a piruvato.
O ATP formado vai fosforilar uma ATPase que vai fazer sair protes K+.
Canais de clcio dependentes da voltagem so activados permitindo a entrada de
clcio que vai actuar na vescula secretria provocando a secreo de insulina.
Secreo pela zona basolateral ou apical de clulas polarizadas
o Quando uma cultura de clulas MDCK infectada simultaneamente com o vrus influenza e
VSV, a glicoprotena G do VSV encontrada apenas na membrana basolateral e a
glicoprotena H do influenza encontrada apenas na membrana apical.
o Algumas protenas celulares, especialmente as que tm ncora GPI, tambm so distribudas
da mesma forma, directamente para a membrana apical e outras para a membrana basolateral
atravs de vesculas de transporte que saem da rede trans-Golgi.
o Nalgumas clulas polarizadas, algumas protenas apicais e basolaterais so transportadas
juntas at superfcie basolateral e as apicais movem-se selectivamente por endocitose e
transcitose at membrana apical.

Endocitose

Todas as clulas endocitam substncias continuamente.


Mecanismo que envolve a invaginao da membrana plasmtica.
A vescula que se forma endossoma movimenta-se para o interior da clula. Vai-se fundir com os
lisossomas onde o material degradado.
Vantagem da entrada do material
o Porque uma via que as clulas tm de obter macromolculas para depois formar os seus
prprios constituintes.
o LDL colesterol
LDL contm:
ApoB-100
Colesterol no esterificado
steres de colesterol
Bicamada de fosfolpidos
o Transferritina ferro
o Glucose ou manose-terminal glicoprotenas removem agentes prejudiciais da circulao
(macrfagos)
o Insulina Alterar o metabolismo celular. O ligando e o receptor so frequentemente
degradados aps a endocitose.
Via endoctica para a LDL
o Os receptores celulares para a LDL reconhecem a ApoB100 e ligam-se a ela.
o Interaces entre o sinal citoslico do receptor e a AP2 incorporam o receptor e a LDL numa
vescula.
o A vescula nascente com clatrina. A vescula forma-se e perde a franja, tornando-se num
endossoma recm-formado.
o Depois, funde-se com o endossoma tardio que tem pH 5. O cido vai provocar uma
modificao conformacional no receptor da LDL libertando a partcula.
o O endossoma tardio vai-se fundir com o lisossoma e as protenas e lpidos da LDL vo ser
degradados por enzimas do lisossoma.
o O receptor LDL reciclado para a superfcie celular para se poder ligar a outra partcula LDL.
Hipercolesterolmia familiar mutao no receptor LDL ou AP2.
Receptor LDL
o Contm uma sequncia NPXY que comunica o sinal, tem um domnio e um brao ligante que
se vai ligar ApoB100.
o A pH5 a superfcie do domnio torna-se mais carregada positivamente e liga-se ao brao
ligante.
Via endoctica para a transferritina
o A transferritina liga-se ao receptor
o Forma-se vescula com claritina
o O endossoma recm-formado funde-se com o endossoma tardio e o pH cido (5) mantido
pela bomba ATPase (ies H+).
o O pH baixo causa a libertao de ferro do ligando formando-se apotransferritina que vai ser
reciclada para a superfcie celular sendo libertada no exterior novamente.
o Num pH 7, a apotransferritina dissocia-se do receptor.
Vesculas especializadas transportam os componentes celulares para o lisossoma
o O peroxisoma forma sua volta uma vescula autofgica (via autofgica) que vai ser depois
incorporada pelo lisossoma. O peroxisoma degradado.
o O endossoma recm-formado, bem como a vescula de transporte fundem-se no endossoma
tardio que se vai depois fundir com o lisossoma para a degradao. (via endossomal
multivesicular).
Sada do HIV de uma clula
o Processo semelhante formao de endossomas multivesiculares
Na formao endossomal, a Hrs ubiquitinada na membrana endossomal direcciona o
carregamento das protenas cargo de membrana especficas em botes vesiculares e
de seguida recruta complexos ESCRT citoslicos at membrana.
Ambas as Hrs e as protenas cargo recrutadas so marcadas com ubiquitina
Aps o conjunto de complexos ESCRT ligados promovem a fuso das membranas e o
desprendimento da vescula completa, so dissociados pelas ATPases da Vsp4 e
voltam ao citosol.
o A formao de partculas de HIV das clulas infectadas com o vrus ocorre por um mecanismo
semelhante usando a protena Gag codificada pelo vrus, os complexos ESCRT celulares e o
Vsp4.
o A Gag ubiquitinizada, prximo partcula em formao, actua como Hrs.
Transcitose de imunoglobulinas maternas IgG atravs das clulas epiteliais intestinais de
camundongos recm-nascidos
o Este movimento transcelular de um ligante envolve endocitose e exocitose.
o O movimento unidireccional do ligante do lmen intestinal ate corrente sangunea depende
da afinidade diferencial do receptor Fc pelo anticorpo em pH 6 (ligao forte) e em pH 7
(ligao fraca).
o A transcitose na direco oposta devolve o receptor de Fc vazio para a membrana do lmen.
Vesculas sinpticas

As protenas fibrosas ajudam na localizao de vesculas sinpticas na zona activa das terminaes
do axnio.
As vesculas em direco ao centro esto em recarregamento com NT.
Libertao dos NT e reciclagem das vesculas sinpticas
o As vesculas sinpticas carregadas com o NT movem-se para a zona activa e fixam-se em
stios definidos da membrana plasmtica da clula pr-sinptica.
o A sinaptotagmina impede a fuso da membrana e a libertao do NT.
o A toxina botulnica impede a exocitose pela clivagem proteoltica de VAMP, a protena v-
SNARE presente nas vesculas
o Em resposta a um estmulo nervoso (PA) os canais de clcio voltagem-dependentes abrem
permitindo o influxo de clcio do meio extracelular.
o A alterao conformacional da sinaptotagmina induzida pelo clcio provoca a fuso das
vesculas ancoradas na membrana plasmtica e a libertao de NT na fenda sinptica.
o Aps a formao de vesculas claritrina/AP contendo v-SNARE, NT e protenas
transportadoras e depois do seu desprendimento num processo mediado por dinamina, as
vesculas perdem o revestimento.
o As mutaes na dinamina bloqueiam a reformulao destas vesculas sinpticas causando
paralisia.
o As vesculas sem revestimento importam NT do citosol produzindo vesculas sinpticas
totalmente reconstitudas completando o ciclo.

Fagocitose diferente de endocitose

Endocitose
o H invaginao porque puxada pela clatrina.
Fagocitose
o O destino tambm vai ser o lisossoma
o Aqui a membrana emite prolongamentos pseudpedes
A entrada especfica porque a membrana tem receptores aos quais se ligam. A entrada de vrus
especfica

Pinocitose diferente de endocitose

Pinocitose est associada entrada de material inespecificamente. No mediada por receptores.


Endocitose mediada por receptores

Aula 4 Mitocndria, Cloroplasto, Peroxisoma, Ncleo

Mitocndria

So organelos grandes, com 1 a 2m, visveis ao microscpio ptico.


O DNA mitocondrial encontra-se na matriz. Na maioria dos organismos, o DNA mitocondrial
replicado durante a interfase.
Na mitose, cada clula filha recebe aproximadamente o mesmo nmero de mitocndrias, mas como
no h um mecanismo prprio de diviso, algumas contm mais DNA do que outras.
A quantidade de DNA mitocondrial numa clula depende do nmero de mitocndrias, do tamanho do
DNA mitocondrial e nmero de molculas de DNA mitocondrial por mitocndria.
H por volta de 100 mitocndrias em cada clula.
O DNA nos mamferos passa de me para filho, no se rege pelas Leis de Mendel.
A molcula de DNA circular, no entanto tem na mesma dupla hlice.
O DNA mitocondrial tem genes que codificam informao para a produo de protenas e genes que
no codificam para protenas mas sim para RNA ribossomais e RNA de transferncia.
Quanto mais evoludo o organismo, menor o nmero de genes no mtDNA.
A estrutura interna da mitocndria:
o As cristas formam lminas e tubos por invaginao da membrana interna e conectam-se
membrana interna por junes da crista.
o O espao intermembranar parece contnuo com o lmen de cada crista.
o A matriz contm o DNA mitocondrial, os ribossomas e os grnulos.
Origem evolucionria dos cloroplastos e mitocndrias hiptese endossimbitica
o A endocitose de uma bactria por uma clula eucaritica ancestral geraria um organelo com
duas membranas, a membrana externa, derivada da membrana citoplasmtica eucaritica e a
membrana interna, derivada da membrana bacteriana - mitocndria
o A endocitose de uma bactria com capacidade de fotossntese. A membrana bacteriana
passaria a ser a membrana interna e a membrana adquirida pela invaginao seria a
membrana externa. A membrana interna originaria membranas tilacides para o interior.
Orientao da membrana e direco do movimento de protes durante a sntese em mitocndrias
o Durante o transporte de electres, os protes so sempre bombeados da face citoslica para a
face exoplasmtica, criando um gradiente de concentrao de protes e um potencial elctrico.
o Durante a sntese acoplada de ATP, os protes fluem na direco inversa por meio da ATP
sintase (F0F1 complexo) que se projecta da face citoslica.
Resumo da oxidao aerbica do piruvato e dos cidos gordos nas mitocndrias
o A membrana externa livremente permevel a todos os metabolitos, mas as protenas de
transporte especficas, na membrana interna, so necessrias para importar o piruvato, o ADP
e o Pi para dentro da matriz e para exportar o ATP.
o O NADH gerado no citosol no directamente transportado para a matriz porque a membrana
interna permevel ao NAD+ e ao NADH. Ao contrrio, um sistema de transporte rpido
transporta o NADH citoslico para o NAD+ da matriz.
o O oxignio difunde para dentro da matriz e o CO2 para fora.
o cidos Gordos originam Acil Gordos CoA que so transportados a partir de um transportador.
o O piruvato convertido a acetil-CoA com formao de NADH e os cidos gordos (com CoA)
tambm so convertidos a acetil-CoA com formao de NADH e FADH.
o A oxidao de acetil-CoA no cido ctrico gera NADH e FADH2.
o A seguir, os electres dessas coenzimas reduzidas so transferidos, via complexos de
transporte de electres para o O2 concomitantemente com o transporte de ies H+ da matriz
para o espao intermembranar, gerando a cadeia de transporte de electres.
o Os electres do NADH fluem directamente do complexo I para o complexo III, evitando o II.
o Por fim, a ATP sintase, o complexo F0F1 aproveita a fora da cadeia transportadora de
electres para sintetizar ATP.
Herana citoplasmtica de mutao petite em mitocndrias de levedura
o As mitocndrias petite apresentam defeitos na fosforilao oxidativa devido a uma deleco
no mtDNA
o Clulas haplides sofrem fuso, produzindo uma clula diplide que sofre meiose, durante a
qual ocorre a segregao aleatria dos cromossomas e mitocndrias com mtDNA.
o Como uma levedura contm cerca de 50 molculas de mtDNA por clula, todos os produtos da
meiose, normalmente, contm mtDNA e o petite e so capazes de realizar a respirao.
o medida que essas clulas haplides crescem e se dividem por mitose, o citoplasma
(incluindo as mitocndrias) distribudo aleatoriamente para as clulas-filhas.
o Eventualmente, uma clula que contm apenas mtDNA petite produzida e forma uma colnia
petite. A formao dessas clulas petite independente de qualquer marcador gentico
nuclear.
Capacidade codificante do DNA mitocondrial humano
o As protenas e os RNAs codificados em cada uma das duas fitas so mostrados
separadamente.
o A transcrio da fita externa ocorre no sentido horrio e a da fita interna no sentido contrrio.
o Os genes do mtDNA dos mamferos no contm intres, apesar de existirem DNAs
intercalados entre alguns genes.
o Tem 16569 pares de bases.
Protenas mitocondriais sintetizadas no citosol
o Matriz
F1 ATPase
RNA polimerase
DNA polimerase
o Membrana interna
ADP-ATP antiporte
Termogenina
o Espao intermembranar
Citocromo c
Citocromo c peroxidase
o Membrana externa
Porina mitocondrial
Transcrio do DNA mitocondrial
o As protenas mitocondriais so normalmente complexas, com vrias subunidades e,
normalmente, para a produo de certas protenas, uma parte da informao encontra-se no
DNA mitocondrial e outra no DNA nuclear. As protenas tm origem mista.
o A replicao do DNA mitocondrial feita pela DNA polimerase especfica gama.
o Para a transcrio existem uma RNA polimerase na mitocndria que especfica para a sua
transcrio. Esta, faz a transcrio do DNA de forma caracterstica em que h uma zona que
vai ser transcrita em grandes quantidades, formando-se o transcrito primrio de pequenas
dimenses.
o A enzima tambm produz um transcrito primrio 2, de maiores dimenses e que comea no
mesmo local do primeiro.
o No transcrito primrio 1 esto os genes que codificam para o RNA ribossomal 12-s e 16-s.
o A mitocndria necessita de muitos ribossomas, logo de grande quantidade de RNA ribossomal,
logo, em vez de ter multiplicado os genes, os genes associados ao transcrito primrio so
transcritos muito mais vezes.
o Existem 2 RNAs de transferncia.
o O transcrito primrio possui 4 genes (transcrito policisternico das clulas procariotas).
o Na mitocndria, depois da produo do transcrito primrio, d-se a separao dos RNAs
ribossomas e dos RNAs de transferncia.
o No transcrito primrio 2, temos um RNA de grandes dimenses que vai sofrer clivagem de
forma a produzir RNAs de transferncia d RNAs mensageiros que vo ser traduzidos nos
ribossomas da mitocndria.
o Estes mRNAs possuem uma cauda poli-A caracterstica das clulas eucariotas, sendo uma
modificao ps-transcricional que ocorre somente nas eucariotas e no nas bactrias.
Subunidades dos ribossomas da mitocndria
o Subunidade 50S
23S
5S
o Subunidade 30S
16S
Cdigo gentico Tabela com 3 entradas, com todas as combinaes de 3 nucletidos que originam
um determinado aminocido.
Gene definido como uma sequncia completa de um cido nucleico necessria sntese de um
produto funcional (protena ou RNA)
Antibiticos Substncias que vo afectar uma das etapas da expresso gentica, seja a transcrio
ou a traduo.
o Clorofenicol bloqueia a sntese das protenas em bactrias
o Ciclohexamida s inibe a sntese de protenas nos ribossomas livres e ligados
Existem inibidores especficos para as bactrias e inibidores especficos para as clulas eucariotas,
tendo em ateno que os inibidores especficos para as bactrias afectam parte do funcionamento das
clulas eucariotas.
Doenas genticas mitocondriais:
o Neuropatia ptica hereditria de Leber
Degenerescncia do nervo ptico, cegueira progressiva
Mutao na subunidade 4 da NADH-CoQ redutase
o Oftalmoplagia externa crnica progressiva
Problemas nos olhos
Deleces grandes no DNA mitocondrial
o Sndrome de Kearns-Sayre
Problemas nos olhos, batimento anormal do corao e degenerescncia do SNC e
movimentos descoordenados
Mutao no gene que codifica para o tRNA da lisina.
Numa mesma clula podemos ter mitocndrias com genes normais e outras com genes alterados,
variando as doenas em termos de gravidade consoante o nmero de mitocndrias afectadas.
As doenas mitocondriais tm transmisso materna, Mendeliana e combinao de ambas.
Fentipos diferentes ou sobrepostos (diferentes mutaes provocam fentipos semelhantes e
mutaes iguais provocam fentipos diferentes)
Mutaes por substituio de bases ou rearranjos
Geralmente aparecem tardiamente e tm evoluo progressiva, o que implica uma predisposio e um
factor relacionado com a idade.
Substituies sem sentido
o Afectam 13 genes que codificam protenas e os genes que codificam para o rRNA e tRNA
o LHON Leber Hereditary Optic Neuropathy G13359A no gene ND6 (NADH desidrogenase 6
do complexo I) Ala-Val
Doena que aparece tardiamente, causa cegueira repentina por morte do nervo ptico.
o Distonia G13359A no gene ND6 (NADH desidrogenase 6 do complexo I)
Aparece na infncia, movimentos descoordenados, dificuldade na fala, atraso mental,
estatura baixa e frequentemente com degenerao dos gnglios basais do crebro.
o Doena de Leigh T8993G no gene ATP6
o Mutaes heteroplsmicas
o <75% Fraqueza muscular neuragnica, ataxia e retinite pigmentosa
o >95% Doena letal, ataxia, hipotonia, atrasos no desenvolvimento, atrofia ptica,
oftalmoplagiaspasticity
Mutaes nos genes mitocondriais responsveis pela sntese proteica
o Mutaes heteroplsmicas
o Encefalopatias mitocondriais
Anomalias no SNC (perda de audio, epilepsia, episdios de stroke e demncia
progressiva)
Miopatias mitocondriais com ragged-red fibers (cardiomiopatias, acidose lctica,
doenas endcrinas incluindo diabetes)
Gene tRNAlys Epilepsia mioclnica
Gene tRNAleu Tromboses, miopatias mitocondriais, diabetes e surdez
o Mutaes homoplsmicas
Gene tRNAGln Aparecimento tardio de Alzheimer
Mutaes nos genes mitocondriais por rearranjo do DNA
o Chronic Progressive External Ophthalmoplegia Syndrome CPEO
o Kearns-Sayre Syndrome KSS
o Diabetes mellitus de origem maternal
o Surdez
o Sndrome de Pearson medulla e pncreas (fatal)
Mutaes em genes nucleares que codificam protenas envolvidas na fosforilao oxidativa

Captao ps-traducional de protenas precursores para dentro das mitocndrias

A protena importada deve conter uma sequncia sinal.


A captao requer tambm ATP e um extracto citoslico contendo chaperoninas que mantm as
protenas precursoras numa conformao no-dobrada.
A captao ocorre apenas com mitocndrias energizadas (em processo de respirao) as quais
possuem um gradiente electroqumico de protes ao longo da membrana interna.
A tripsina no degrada protenas j dentro da mitocndria.
No entanto, degrada as protenas se no estiverem dentro da mitocndria.

Importao de protenas para o interior da matriz mitocondrial

As protenas precursoras sintetizadas nos ribossomas citoslicos so mantidas num estado no-
dobrado pelas chaperoninas como a Hsc70.
Depois de uma protena se ligar ao receptor de importao prximo do local de contacto com a
membrana interna, transferida para dentro do poro principal de importao.
A protena atravessa ento esse canal e um canal adjacente na membrana interna.
O transporte ocorre em locais de contacto raros, onde as membranas interna e externa parecem que
tocam.
A ligao da protena transportada pela chaperonina Hsc70 da matriz e a hidrlise de ATP ajudam a
direccionar a importao para dentro da matriz.
Uma vez que a sequncia sinal seja removida pela protease da matriz e a Hsc70 seja libertada, a
protena dobra-se na sua conformao madura e torna-se activa dentro da matriz.

Experincias

Ao adicionarmos uma qualquer sequncia aps a sequncia sinal, ela vai tambm entrar para a
mitocndria em conjunto com a protena.
O metotrexato inibe a passagem pois dobra a protena. Se a sequncia espaadora comprida o
suficiente para se estender atravs dos canais de transporte, um intermedirio estvel de
translocao, com a sequncia sinal clivada, gerado na presena de metotrexato.
A extremidade C-terminal do intermedirio de translocao pode ser detectada incubando a
mitocndria com anticorpos que se ligam ao segmento da protena seguido por partculas de ouro.

Mais explicao sobre importao de protena para a matriz

A protena precursora liga-se a chaperoninas no citosol com gasto de ATP que a mantm desenrolada.
Passa pelo canal ISP42 e ao sair na matriz vai-se ligar a chaperoninas da matriz que a mantm
desenrolada.
Estas vo prevenir que a protena se ligue prematuramente de forma errnea.
H depois chaperoninas que vo ajudar no enrolamento como as Hsp60 e no fim clivada a
sequncia sinal.

Vrias sequncias sinal

As protenas podem ter sequenciais sinais para a matriz, membrana interna e membrana externa.
H 3 vias para transportar as protenas do citosol para a membrana interna.
As protenas com diferentes sequncias sinal so encaminhadas para a membrana interna por vias
diferentes. Nas 3 vias, as protenas cruzam a membrana externa pelo poro Tom40.
o A protena contm uma sequncia stop na sua sequncia. A via A contm uma sequncia sinal
para a matriz na extremidade N-terminal que reconhecida pelo receptor de importao
Tom20/22 na membrana externa. Passa atravs do canal Tom40, vai para o espao
intermembranar e directamente para o Tim23/17 na membrana interna. Pela aco do Tim44
deslocada lateralmente e fica a.
o A protena da via B tem duas sequncias reconhecidas pela Oxa1. Passa atravs do Tom40 e
vai directamente para Tim23/17 ligando-se Chaperonina Hsc70. Sai da membrana e depois
de clivada a sequncia sinal reconhecida pela Oxa1 fixa-se membrana.
o A protena da via C tem vrias sequncias reconhecidas pelo Tom70 e pelo complexo Tim22. O
Tom70 vai reconhecer e permitir a passagem pelo canal Tom40. A Tim9/10 vai impedir o
enrolamento e lev-la at ao complexo Tim22 que est associada Tim54. A Tim54 vai
deslocar a protena lateralmente na membrana, ficando a ancorada.
H 2 vias para transportar as protenas do citosol para o espao intermembranar mitocondrial
o Na via A, a principal via para o espao intermembranar, a sequncia reconhecida pelo
complexo Tom20/Tom22 que vai permitir a entrada no canal Tom40. Passa depois pelo canal
Tim23/17, a sequncia sinal reconhecida por uma protease e a Tim44 desloca a protena na
membrana. depois clivada e libertada, dobrando-se e ligando-se ao co-factor heme dentro do
espao intermembranar.
o Na via B, feito o encaminhamento directo para o espao intermembranar atravs do canal
Tom40.
Sntese da histidina
o sintetizado o mRNA 1, aco da tRNA sintetase citoslica da histidina
o sintetizado o mRNA 2, aco da tRNA sintetase mitocondrial da histidina
o Como a que a clula decide para onde a protena vai?
No gene j h esta indicao.
ao nvel da transcrio que fica definido para onde a protena vai.
Para ir para a mitocndria tem de ter um sinal especfico que depois removido.

Cloroplasto

Desenvolvimento do cloroplasto
o Comea como um pr-plastdeo com membrana interna e externa
o Com o estmulo da luz, a membrana interna comea a formar vesculas
o Depois forma tilacides.
o Agrupados, formam grana.
o volta dos grana est o estroma.
Um etioplasto um cloroplasto que ainda no sofreu exposio solar.
o mais pequeno que um cloroplasto.
o Ainda no tem tilacides nem grana definidos.
o A luz ainda no desencadeou a formao de vesculas.
Um proplastdeo pode dar origem a
o Cloroplasto convertem a luz solar a glucose. Utilizam a clorofila e outros pigmentos para
produzir glucose. O ATP formado na fase clara e gasto na fase escura.
A fotossntese s ocorre nos cloroplastos porque tm os pigmentos e enzimas
necessrias ao Ciclo de Calvin.
o Etioplasto
o Amiloplasto armazenam amido
o Elaioplasto armazenam lpidos
o Cromoplasto cores, principalmente nas flores
Funcionamento no cloroplasto
o A luz entra, O NADP+ passa a NADH, o H2O a O2 e entra um H+ para dentro da membrana do
tilacide.
o O complexo F0F1 faz sair um H+ com gasto de ATP.
A sequncia sinal dos cloroplastos est no N-terminal e removida.
DNA no cloroplasto
o Molcula circular
o Codifica rRNA, tRNA e algumas protenas envolvidas no transporte de electres fotossintticos
e sntese de ATP.
o As evidncias mostram que houve troca de genes entre o cloroplasto e o ncleo.
Duas vias para transportar as protenas do citosol para o lmen do tilacide
o Os precursores no dobrados so encaminhados para o estroma atravs das mesmas
protenas da membrana externa que importam as protenas localizadas no estroma.
o A hidrlise da sequncia sinal para o estroma na extremidade N-terminal por proteases
revelam a sequncia de direccionamento para os tilacides. Surgem duas vias
A plastocianina e outras protenas similares so mantidas no dobradas no espao do
estroma por um grupo de chaperoninas e encaminhadas pela sequncia sinal para os
tilacides ligadas s protenas que esto relacionadas SRP bacteriana, ao receptor da
SRP e ao transloco SecY, os quais medeiam o movimento para o lmen. Depois da
sequncia sinal ser removida, no lmen do tilacide por uma endoprotease, a protena
dobra-se na sua conformao madura.
Na via dependente de pH, as protenas ligam-se aos metais e dobram-se no estroma e
os co-factores redox complexos so adicionados. So necessrios dois resduos de
arginina na extremidade N-terminal da sequncia sinal para os tilacides e um
gradiente de pH atravs da membrana interna para a translocao da protena dobrada
para o lmen do tilacide. O transloco da membrana tilacide composto, no mnimo,
por 4 protenas relacionadas com as potenas da membrana interna bacteriana.

Peroxissoma
Degradam lpidos complexos (com caudas hidrfobas muito grandes) por oxidao, enquanto nos
lisossomas por hidrlise.
Na mitocndria, os electres so captados por NAD e FAD, que depois vo ser usados na cadeia
respiratria. O H2O2 tem de ser convertido em O2 e H2O pela catalase, que existe nos peroxissomas
em grande quantidade.
Oxidaao de cidos gordos na mitocndria e no peroxissoma
o Em ambas as oxidaes, quatro reaces idnticas ocorrem que convertem o acetil-CoA e um
acil-CoA gordo de cadeia curta.
o Uma molcula de NAD+ reduzida a NADH e uma de FAD a FADH2
o O ciclo repetido com acil-CoA at que os cidos gordos com um nmero par de tomos de
carbono so completamente convertidos a acetil-CoA.
o Nas mitocndrias, os electres do FADH2 e do NADH entram na cadeia respiratria e no final
so utilizados para produzir ATP. O acetil-CoA gerado reduzido no ciclo de Krebs resultando
na sntese de mais ATP.
o Como os peroxissomas no possuem os complexos de transporte de electres da cadeia
respiratria e as enzimas do ciclo de Krebs, a oxidao dos cidos gordos no produz ATP.
A sequncia sinal para o peroxissoma , na maior parte das vezes, C-terminal e no clivada.
Importao de protenas da matriz peroxissomal direccionada pela sequncia de direccionamento
PTS1
o A catalase e a maioria das protenas da matriz do peroxissoma contm uma sequncia sinal
PTS1 que se liga ao receptor citoslico Pex5.
o O Pex5 com a protena ligada interage com o receptor Pex14 na membrana do peroxissoma.
o O complexo transferido para um grupo de protenas de membrana (Pex10, Pex12 e Pex2)
que so necessrias translocao para dentro da matriz do peroxissoma, por um mecanismo
desconhecido.
o Durante a translocao ou no lmen, Pex5 dissocia-se da protena de matriz e volta ao citosol
num processo que envolve o complexo Pex2/10/12 e protenas de membrana e citoslicas
adicionais.
o As protenas dobradas no podem ser importadas para os peroxissomas e a sequncia sinal
no removida.
Doenas peroxissomais
o Sndrome de Zellweger 20 genes diferentes envolvidos
o ALD adrenoleucodistrofia ligada ao X mutao no gene do transportador ABCD1 presente
nas membranas do peroxissoma. Afecta o transporte de fosfolpidos mais longos para o
peroxissoma.
Colorao com anticorpos fluorescentes de mutantes da biognese dos peroxissomas revela vias
diferentes para a incorporao de protenas de membrana e da matriz.
o As clulas foram marcadas com anticorpos contra PMP70, uma protena da membrana do
peroxissoma, ou com anticorpos contra catalase, uma protena da matriz e ento observadas
ao microscpio de fluorescncia.
o Nas clulas tipo selvagem, tanto as protenas da membrana como as dos peroxissomas so
visveis como focos claros em numerosos corpos peroxissomais.
o Nas clulas dos pacientes com deficincia em Pex12, a catalase est distribuda
uniformemente pelo citosol, enquanto a PMP70 est normalmente nos corpos peroxissomais.
o Nas clulas de pacientes deficientes em Pex3, as membranas do peroxissoma no podem ser
montadas e, em consequncia, os corpos peroxissomais no se formam.
Modelo para a biognese e diviso do peroxissoma
o A primeira etapa na formao de novos peroxissomas a incorporao de protenas de
membrana nos precursores de membrana.
o A Pex19 actua como receptor das sequncias sinal e a Pex3 e a Pex16 so necessrias
insero apropriada das protenas na membrana do peroxissoma em formao.
o A insero de todas as protenas produz um peroxissoma fantasma, que capaz de importar
protenas direccionadas para a matriz.
o As vias para importao de protenas para a matriz com PTS1 e PTS2 diferem na identidade
dos receptores citoslicos, Pex5 e Pex7 respectivamente, que se ligam sequncia sinal.
o A incorporao completa das protenas da matriz gera um peroxissoma maduro.
o A proliferao dos peroxissomas requer a diviso dos mesmos com ajuda da Pex11.

Transporte do ncleo para o citoplasma

Transporte de macromolculas atravs da membrana nuclear


o Complexo do poro nuclear nucleoporina (30x maior que um ribossoma)
Tem morfologia octogonal.
H poros que furam o envelope nuclear. Cada poro formado a partir de uma estrutura
denominada complexo do poro nuclear (NPC).
Um NPC formado por multiplicas cpias de protenas chamadas nucleoporinas.
Os ies, pequenos metabolitos e protenas at 60KDa podem atravessar o complexo do
poro nuclear. As protenas grandes e os complexos ribonucleoproteicos no podem
difundir para dentro ou fora do ncleo. So selectivamente transportadas para dentro e
para fora com a ajuda de protenas transportadoras solveis que se ligam a
macromolculas e que tambm interagem com nucleoporinas especficas.
o A fuso de um sinal de posicionamento nuclear (NLS) com uma protena citoplasmtica faz
com que esta penetre no ncleo.
A piruvato quinase est no citoplasma. Esta protena citoslica muito grande para
passar o poro nuclear
Tratou-se uma piruvato quinase com NLS do SV40 na sua extremidade N-terminal e
viu-se que se posicionou no ncleo.
o Mecanismo de importao nuclear de cargo com NLS
No citosol, uma importina livre liga-se NLS de uma protena cargo, formando um
complexo. Este complexo vai interagir com o NTF-2 (Ran-GDP) e vai passar pelo NPC
com interaces sucessivas com as FG-nucleoporinas.
A Ran-GDP sofre a aco de um factor de troca de nucleotdeo guanina (GEF) que
provoca a libertao do GDP e a religao do GTP formando-se assim Ran-GTP.
Esta Ran-GTP vai dissociar o complexo cargo-NLS importina, separando a protena
cargo com o NLS que fica no ncleo e associando-se importina.
O complexo Ran-GTP sai do ncleo associado a uma importina.
No citosol, sofre a aco de uma protena aceleradora de GTPase (GAP) associada aos
filamentos citoplasmticos do NPC que estimula a Ran a hidrolisar o seu GTP,
formando Ran-GDP e libertando importina que se vai ligar novamente a uma protena
cargo.
o Mecanismo de exportao nuclear de cargo com NES
O sinal NES rico em leucina.
No nucleoplasma, a protena exportina 1 liga-se ao NES de uma protena cargo a ser
transportada e Ran-GTP, formando o complexo cargo.
Aps o complexo cargo se ter difundido atravs do NPC via interaces temporrias
com as repeties FG das FG-nucleoporinas, a GAP estimula a converso da Ran-GTP
em Ran-GDP.
Alterao conformacional na Ran leva dissociao do complexo, separando-se a
protena cargo da exportina 1 e da Ran-GDP.
A exportina 1 e a Ran-GDP so novamente transportadas para o ncleo atravs de
NPC. A Ran-GDP transportada com interaco do NTF2 e a seguir, no nucleoplasma,
a GEF estimula a converso de Ran-GDP em Ran-GTP.
o Regulao da entrada e sada no ncleo de factores de transcrio
Atravs de importinas e exportinas (carioferinas)
Clivagens por proteases especficas
Fosforilaes, etc
o Mecanismo de transporte do mRNP do ncleo via mRNA-exportador
A subunidade grande de um mRNA exportador contm trs domnios importantes, um
central, um carboxil (que se liga s FG nucleoporinas) e uma regio N-terminal que tem
uma fraca actividade de ligao ao RNA.
A ligao com os mRNPs requer a ligao com outras protenas hnRNP especficas.
A subunidade menor liga-se ao domnio central da subunidade grande e contribui para a
ligao com as repeties FG.
O mRNA exportador muito menor que o complexo do poro nuclear.
O mRNA difunde por meio de interaces temporrias com as FG-nucleoporinas
adjacentes medida que progride atravs do poro.
o Diferentes tipos de protenas exportadoras
Protenas SR tambm associadas a reconhecimento de exes
Protenas nucleares de ligao ao CAP tambm associadas proteco do mRNA
Protenas de ligao ao poli-A tambm associadas estabilidade
o Formao de partculas ribonucleoproteicas heterogneas (hnRNPs) e exportao dos mRNPs
do ncleo
Os transcritos nascentes de RNA produzidos a partir de DNA molde rapidamente se
associam a protenas, formando hnRNPs
O aumento gradual do tamanho dos hnRNPs reflecte o comprimento crescente dos
transcritos de RNA a maiores distncias do stio de iniciao da transcrio.
Aps o processamento do mRNA, a partcula resultante chama-se mRNP.
Os mRNPs curvados desenrolam-se medida que atravessam os poros nucleares.
Ao penetrar no citoplasma, o mRNA associa-se com ribossomas, indicando que a
extremidade 5 precede a passagem.

Aula 5 Microfilamentos

Protenas do citoesqueleto: so feitas nos ribossomas ligados, no tm de atravessar a membrana e


so fibras (funo de estrutura e movimento).
O citoesqueleto define a forma da clula e no a membrana, porque esta fluida.
O citoesqueleto comum a todas as clulas eucariotas, no existe nas bactrias e formado por trs
tipos de filamentos:
o Filamentos de actina ou microfilamentos (5nm)
Estrutura em colar de prolas de filamento de actina (protena globular pequena) que
mostra as suas subunidades.
o Filamentos intermedirios (7 a 10nm)
As subunidades organizam-se em cordas nas quais as subunidades individuais ficam
difceis de distinguir.
Fibras com orientao radial
o Microtbulos (25nm)
As paredes so formadas por subunidades de protofilamentos de tubulina
Fibras com orientao radial (do centro para a periferia)
No so visveis ao microscpio ptico, mas podem ser vistos por marcao no de fluorescncia.
Os microtbulos podem ser marcados com anticorpo e mostrados com fluorescncia. Os centros
organizadores de microtbulos (MTOC) tambm podem ser marcados.
Um macrfago tem filamentos intermedirios e nas pontas adeses celulares, vimentina e actina.
Os filamentos intermedirios formam uma rede que cruza a clula do ncleo at membrana
plasmtica. Na membrana, os filamentos so ligados por protenas adaptadoras a dois tipos de
junes de ancoramento, os desmossomas e os hemidesmossomas.
A distribuio dos fillamentos do citoesqueleto nas clulas eucariotas e bacterianas
o Nas clulas de absoro intestinais, os filamentos de actina esto concentrados na regio
apical e numa estreita faixa da egio basolateral.
o Os microtbulos esto orientados de acordo com o longo eixo da clula e os filamentos
intermedirios esto concentrados perto da periferia celular, principalmente nas junes
especializadas com as clulas vizinhas e a revestir a membrana nuclear.
o Nas clulas bacterianas, os filamentos de MreB, um homlogo da atina formam um anel na
clula constringindo a sua largura. O homlogo da tubulina, FtsZ forma filamentos nos locais
de diviso celular.
Citoesqueleto sustenta a membrana palsmtica nos eritrcitos humanos
o Os filamentos do citoesqueleto esto organizados em feixes e as redes so os arranjos mais
comuns.
o Nos feixes os filamentos esto agrupados formando arranjos paralelos. Em rede, os filamentos
cruzam-se, frequentemente em ngulo recto e so empacotados.
o As redes so divididas em dois tipos, o primeiro forma uma rede e o segundo confere uma
propriedade semelhante gelatina.
o A forma distinta de cada clula depende da organizao dos filamentos de actina e das
protenas que conectam os microfilamentos membrana. Essas protenas so protenas de
ligao dos microfilamentos membrana e actuam como pontos que prendem a rede do
citoesqueleto de actina membrana.
o As mais comuns so as ligaes complexas que ligam os filamentos de actina s protenas
integradas na membrana por meio de protenas perifricas de membrana que actuam como
protenas adaptadoras.
o Os eritrcitos tm de se esgueirar atravs de finos capilares sanguneos sem romper a
membrana. A resistncia e a flexibilidade depende da densa rede do citoesqueleto. O principal
componente do citoesqueleto dos eritrcitos a espectrina, uma protena fibrosa. O
citoesqueleto est em rede radial. Cada raio composto por uma nica molcula de estende
de dois centros ligando-os. Cada centro tem um filamento de actina, mais aducina,
tropomiosina e tropomodulina. As duas ltimas fortalecem a rede.
o Para assegurar que os eritrcitos mantm a sua forma, o citoesqueleto de actina-espectrina
fortemente ligado por duas protenas perifricas de membrana, a anquirina e a protena band
4.1

Microfilamentos

Estrutura da actina G monomrica e do filamento de actina F


o A actina existe como um monmero globular chamado atina G e como um polmero filamentoso
chamado actina F, que uma cadeia linear de subunidades de actina G.
o A actina G monomrica tem quatro subdomnios unidos ao centro por uma fenda onde se liga o
ATP com magnsio.
o O final do filamento com uma fenda de ligao exposta a extremidade (-) e a outra a
extremidade (+).
Polaridade dos fragmentos de actina
o A extremidade (-) pontiaguda e a extremidade (+) farpada.
As plaquetas alteram o seu formato durante a coagulao.
As clulas em repouso tm uma forma discide, quando expostas a agentes de coagulao
acomodam-se sobre o substrato, estendem filopdios e expandem-se. As alteraes na morfologia
resultam de rearranjos no citoesqueleto de actina.
Os microfilamentos esto relacionados com o movimento.
Emitem prolongamentos
Quando agrupados por fimbrina, uma protena curta, os filamentos de actina ficam juntos formando um
feixe.
As protenas de interligao longa como as filaminas, so flexveis e podem interligar filamentos de
actina numa rede.
As microvilosidades cobrem a superfcie apical das clulas intestinais.
o Um feixe de microfilamentos estabiliza estas estruturas.
o A membrana plasmtica que circunda a microvilosidade est ligada aos microfilamentos.
o Os feixes estendem-se para o interior das clulas interligados por reforos diagonais de fibras
conectoras compostas por uma isoforma de uma espectrina intestinal.
o A base das razes ligada por filamentos intermedirios de queratina.
Componentes do citoesqueleto e sua funo
o Dinmica de actina Extenso da membrana
o Redes de filamentos Estrutura da clula
o Miosina motora Contractilidade e transporte de vesculas
o Feixes de actina e filamentos intermedirios Adeso celular
o Rede de lmina Estrutura nuclear.
Prolongamentos
o Filipdia Alongados
o Lamelipdia Arredondados
o Resultam da alterao da disposio de microfilamentos e da polimerizao ou
despolimerizao da actina
Citoesqueleto de actina de uma clula em movimento
o Duas estruturas contendo actina trabalham juntas para gerar movimento. Uma rede de
filamentos de actina na parte anterior da clula empurra a membrana para a frente.
o Enquanto isso, o corpo da clula puxado por uma banda de miosina e de actina.
o Este arranjo de actina e miosina comum nas clulas que se movimentam.

Dinmica de polimerizao da actina

No lado (-), o microfilamento no aumenta e, no lado (+) mais rpida a associao e a dissociao.
Pode prever-se se o microfilamento aumenta ou diminui, depende da concentrao de actina
presente.
A concentrao de actina G determina a formao de filamentos
o A concentrao crtica a concentrao de monmeros de actina G em equilbrio com os
filamentos de actina. Em concentraes superiores, os filamentos so montados at que a
concentrao atinja o Cc.
o Quando acima de CC+ , o filamento aumenta.
A polimerizao da actina G in vitro ocorre em 3 fases
o Na fase de nucleao inicial, os monmeros de actina G-ATP formam complexos estveis de
actina. Estes ncleos so rapidamente alongados, na segunda fase, pela adio de
subunidades a ambas as extremidades do filamento.
o Na terceira fase, as extremidades dos filamentos esto em estado de equilbrio com a actina G-
ATP monomrica. Aps a incorporao no filamento, as subunidades lentamente hidrolisam o
ATP e tornam-se activas F-ADP estveis.
o A linha de tempo de polimerizao in vitro revela o perodo de adaptao (lag) inicial. Se alguns
fragmentos de filamentos de actina forem adicionados no incio, para actuarem como ncleos,
no h fase de adaptao.
As duas extremidades de actina tm velocidades de crescimento desiguais
o Os monmeros de actina so adicionados muito mais rapidamente na extremidade (+) do que
na (-).
o O bloqueio das extremidades (+) ou (-) de um filamento com protenas bloqueadoras de actina
permite o crescimento apenas da extremidade oposta.
Em concentraes de actina G intermdias os valores de Cc para as extremidades (-) e (+) podem
viajar ao longo dos filamentos, ligando-se preferencialmente extremidade (+) e dissociando-se
preferencialmente da extremidade (-). As subunidades mais antigas localizam-se na extremidade (-).
Toxinas que afectam os microfilamentos
o Citocalasina D alcalide produzido por um fungo, despolimeriza.
o Latrunculina produzido por espongirios, liga-se G-actina e impede a polimerizao.
o Jasplakolinodio produzido por outros espongirios, polimeriza
o Faloidina produzida por amanita phalloides, o anjo da morte, cogumelo. Impede a
polimerizao de microfilamentos.
In vitro
o Polimerizao induzida pela adio de sais necessria uma concentrao salina constante.
Nas clulas o ambiente favorvel polimerizao.
o Despolimerizao induzida pela diluio de F-actina.
o 40% Da actina na forma de G-actina.
o Protenas Capping ligam-se s extremidades impedindo a polimerizao e despolimerizao.
o Protenas severing vo cortar
o Timosina 4 Inibe a polimerizao, porque sequestra a actina ligada ao ATP.
o Profilina Protena que interage com a actina, transformando ADP em ATP, com consumo de
ATP. Estimula a polimerizao.
o Quando a actina entra tem de estar associada ao ATP.
o Gelsolina Est na rede de microfilamentos. Pode ser destruda quando h um aumento
grande da concentrao de clcio. Quando o clcio aumenta, a gelsolina liga-se aos
microfilamentos, cortando-os e destruindo a rede.
Papel da profilina da timosina na regulao da polimerizao da actina G
o As subunidades da actina complexadas com a timosina dissociam-se e adicionam-se
extremidade do filamento.
o No filamento, o ATP hidrolisado para ADP, a subunidade associada ao ADP eventualmente
dissocia-se na extremidade oposta do filamento.
o A actina G-ADP forma um complexo com profilina e o ATP permutado com ADP para formar
actina G-ATP.
o A profilina liberta os monmeros de actina para a extremidade (+) dos filamentos de actina ou a
timosina sequestra a actina G-ATP para o conjunto de subunidades prontas para a
polimerizao.
O PIP2, um lpido da membrana liga-se profilina, cofilina e gelsolina.
Sarcmeros no msculo-esqueltico com protenas bloqueadoras de actina
o A CapZ bloqueia as extremidades (+) dos filamentos finos da actina que esto localizados no
disco Z, separando os sarcmeros adjacentes.
o A tropomodulina bloqueia as extremidades (-) dos filamentos finos, localizados na direco do
centro de um sarcmero.
o A presena das duas protenas em extremidades opostas impede que as subunidades se
dissociem durante a contraco muscular.
Uma extensa rede de filamentos de actina preenche o citoplasma. Em cad ponto de ramificao situa-
se um complexo Arp2/3 que estimula a montagem da actina in vitro.
Movimentos intracelulares e alteraes na morfologia da clula
o Nos fibroblastos infectados com Listeria monocytogenes, visvel um rasto de actina. As
clulas bacterianas movem-se dentro do citosol.
o A bactria produz uma substncia qumica que estimula a formao de microfilamentos que
vo empurrar a bactria da periferia para o centro.
Alteraes na morfologia da clula
o As plaquetas podem ter vrias formas.
o Quando h uma fuga de sangue, h emisso de substncias qumicas que chamam as
plaquetas, que alteram a sua forma esfrica, aderindo zona onde houve ruptura com emisso
de filopdia e que depois ficam espalmadas servindo de tampo.
o Nas plaquetas, uma rede tridimensional de filamentos de actina est ligada ao complexo de
glicoprotenas da membrana, pela filamina.
o O Gpd1-IX tambm se liga com as protenas em cogulo fora da plaqueta.
o As plaquetas apresentam uma rede cortical bidimensional de actina e espectrina semelhante
do eritrcito.
o Debaixo da membrana plasmtica da plaqueta existe uma rede de filamentos interligados com
espectrina.
o A filamina organiza os filamentos formando crtex da clula.
o A rede de feixes de filamentos forma adeses ao substrato adjacente.
o A forma de disco da clula mantida por um anel de microtbulos na periferia da clula.
Movimentos celulares com protenas motoras
o Conjuntos de protenas que se associam s fibras do citoesqueleto e nelas se movimentam,
consumindo ATP.
o Miosina uma famlia de genes com 9 elementos
Associao de protenas motoras a microfilamentos.
1 parte globular, 1 pescoo e uma cauda alongada que liga a membranas.
Cabea, pescoo (com cadeias leves reguladoras e essenciais) e cauda (com cadeias
pesadas)
Transporte de vesculas para dentro das clulas
Miosina tipo II Associadas umas s outras formando fibras.
Tratada com quimiotripsina, a miosina parte-se pela cauda. Tratada com papain separa
o pescoo
o A miosina I e a miosina V ficam localizadas nas membranas por stios indeterminados nos seus
domnios da cauda.
o Como resultado, essas miosinas esto associadas com vesculas de membrana intracelular ou
com a face citoslica da membrana plasmtica.
o Em contraste, os domnios da cauda em super-hlice das molculas de miosina II agrupam-se
lado a lado formando um filamento grosso do qual as cabeas se projectam. No msculo-
esqueltico o filamento grosso bipolar. As cabeas so as extremidades e so separadas por
uma zona lisa, que consiste em caudas dispostas lado a lado.
A cabea da miosina usa ATP para se ligar ao filamento de actina
o A cabea da miosina, ligada ao filamento curto, tem um local de ligao do ATP.
o O ATP vai-se ligar cabea da miosina e a cabea dissocia-se da actina.
o D-se a hidrlise do ATP e sai um Pi ficando o ADP na cabea da miosina.
o A cabea da miosina volta-se a ligar actina mas desta vez num local mais atrs porque o
filamento de actina se desloca para a direita, fazendo a actina se mover para a esquerda.
o O ADP liberta-se e a miosina fica presa.
Detectar o movimento gerado pela miosina
o Na presena de ATP as cabeas da miosina caminham na direco da extremidade (+)

Movimento de vesculas

H microfilamentos fixos, com miosinas (I, V, VI) livres para se movimentarem.


o I associada a membranas e vacolos contrcteis na amiba
o V associada ao aparelho de golgi e secreo na levedura
o VI associada a vesculas e transmisso sinptica
O movimento dos organitos dentro das clulas ocorre devido existncia de protenas motoras.
Actina e Miosina II feixes contrcteis em clulas no musculares localizados por baixo da membrana
formando baixas ou folhas
o Miosina II organiza-se em feixes, existe em todas as clulas eucariotas e tambm intervm
na contraco muscular (h em maior quantidade nas clulas musculares mas tambm existe
noutras clulas)
o Fibroblasto Clula de tecido conjunto que se movimenta devido ao deslizar sobre os
microfilamentos fibras de stress.
Fibras de Stress Feixes de microfilamentos que se projectam do interior para os
pontos onde a clula contacta com o substrato.
o O deslizamento pode ser influenciado por factores externos (ex. concentrao de clcio)
o A miosina II tambm muito importante para a citocinese reorganizao das fibras de
miosina para o estrangulamento e separao das clulas.
Se retirarmos a miosina II no ocorre citocinese, fica uma mega-clula, unicelular e
multinucleada.

Clulas do tecido muscular

Liso e estriado (cardaco e esqueltico).


o Liso e estriado cardaco involuntrio
o Estriado esqueltico voluntrio
o Liso existe na camada a seguir s clulas epiteliais, ao longo do tubo digestivo.
Clulas do tecido muscular esqueltico
o Miofibrilhas, cilndricas, de 1 a 40mm e 10 a 50 m.
o Cerca de 100 ncleos j sofreram especializao para a contraco muscular.
o Muitas mitocndrias a clula precisa de mais energia
o Retculo sarcoplsmico as clulas precisam de muito clcio que se encontra aqui
armazenado.
o Sarcmero uma subunidade da microfibrilha. Est delimitado por uma banda escura, disco
Z.
O msculo um conjunto de miofibrilhas. Cada miofibrilha tem membrana plasmtica, sarcmero,
ncleo.
O sarcmero tem a banda I(com disco Z no meio), a banda A com a linha M no meio e nova banda I
com novo disco Z no meio.
Estrutura de um sarcmero
o De cada lado dos discos Z esto as bandas I, levemente coradas, compostas inteiramente de
filamentos de actina. Estes filamentos estendem-se de ambos os lados interligam-se com os
filamentos grossos da miosina da banda A.
o As extremidades (+) dos filamentos de actina esto ligadas aos discos Z
o Os filamentos grossos da miosina e os finos da actina interligam-se em intervalos regulares.
O sarcmero diminui de tamanho quando h contraco muscular. Os microfilamentos deslizam e
aproximam-se. necessrio ATP e clcio.
Tambm h um impulso nervoso que liberta acetilcolina e que indica protena que tem de abrir um
canal de clcio (difuso facilitada, segundo o gradiente de concentrao). O clcio sai do retculo
contra o gradiente atravs de uma ATPase.
Modelo do filamento deslizante na contraco do msculo estriado
o A disposio dos filamentos grossos de miosina e dos finos de actina no estado relaxado. Na
presena de ATP e clcio, as cabeas da miosina que se salientam a partir dos filamentos
grossos andam em direco s extremidades (+) dos filamentos finos.
o Como os filamentos finos esto ancorados no disco Z, os movimentos da miosina puxam os
filamentos de actina para o centro do sarcmero encurtando o comprimento no estado
contrado.
Receptor da acetilcolina
o Tem quatro subunidades.
Nas clulas do msculo liso no h troponina e, para que as clulas se contraiam tem de ser
fosforiladas por cinases (que s esto activas na presena de clcio).
o No h retculo sarcoplsmico e o clcio tem de vir do exterior.
Clulas do tecido muscular liso
o Dimenses entre 20 - 500m
o Fuseiformes
o Um nico ncleo
o Sem estrias
o Feixes de actina/miosina fixos em alguns pontos focal densities que se encontram na
membrana celular e funcionam como junes aderentes.
Para que esteja no estado de repouso tem de haver fosfatases que inibem as cinases.
A miosina vai permitir o movimento dos microfilamentos.

Locomoo celular

O movimento inicia-se com a emisso de um ou mais lamelipdios.


Alguns lamelipdios aderem ao substrato por adeso focal.
Em seguida, grande parte do citoplasma no corpo celular flui para a frente.
A margem de deslocamento da clula permanece aderida ao substrato at que a cauda finalmente se
desligue e retraia para dentro do corpo da clula.

Polimerizao formando uma rede com ramificaes

Os filamentos de actina so montados numa rede ramificada na qual as extremidades dos filamentos
alcanam a membrana plasmtica num ngulo agudo,
A actina G-ATP adicionada extremidade do filamento e empurra a membrana para diante.
O complexo Arp2/3 liga-se s laterais dos filamentos e forma uma ramificao a partir do filamento. As
extremidades so bloqueadas pela protena bloqueadora.
As subunidades de actina G-ATP convertem-se em subunidades actina G-ADP e dissociam-se do
filamento pela aco de protenas cortadoras como a cofilina e gelsolina.
As subunidades libertadas formam complexos com a profilina de forma a passarem a G-ATP.
A elongao de microfilamentos provoca tenses.
o A rede de filamentos de actina suporta o alongamento dos filamentos e gerao de foras que
os empurram. Um filamento de actina rgido mas pode curvar-se devido a flutuaes
trmicas.
o O curvamento dos filamentos na margem de direco onde as extremidades (+) fazem
contacto com a membrana cria espaos na membrana para que as subunidades se liguem s
extremidades dos filamentos.
o A fora elstica dos recuos empurra a membrana para diante.
As foras contrcteis so geradas por uma clula em movimento
o A rede de filamentos de actina est na parte anterior da clula, enquanto a miosina II est na
parte posterior da clula.
o Ambas esto numa banda que atravessa a clula anterior ao ncleo.
o A contraco dessa banda puxa o corpo celular para a frente.
o Uma clula em movimento exerce fora de traco sobre o substrato.
o Um querancito colocado sobre uma membrana de silicone exerce foras laterais que fazem
com que a membrana se curve.
Funes das vias de transduo do sinal na locomoo das clulas e organizao do citoesqueleto
o Os sinais extracelulares so transmitidos atravs da membrana plasmtica por receptores
especficos para diferentes factores.
o Um grupo de factores de crescimento induz a polimerizao de actina na margem de direco
atravs de uma via dependente de Rac e Cdc42.
o Um outro grupo de factores actua atravs de uma via dependente de Rho, para induzir a
montagem de adeses focais e contraco cortical.
o A adeso de uma clula matriz extracelular acciona uma via de sinalizao paralela que
induz a activao de profilina, da cofilina e da geisolina. Isto activa a fosfolipase C (PLC) que
hidrolisa o PIP2 da membrana.
o O aumento de clcio citoslico estimula a renovao de actina.
Os receptores de cAMP esto distribudos uniformemente. Assim o gradiente interno deve ser
estabelecido por um outro componente da via de sinalizao.
Como os receptores de cAMP sinalizam por meio de protenas G estas foram marcadas e viu-se que
activavam as vias que vo aumentar o clcio citoslico como a Arp2/3.

Aula 6 Microtbulos

H MT estveis e MT instveis
o Estveis axnios, clios, flagelos. 1 Vez formados, mantm-se
o Instveis Fibras do citoesqueleto e do fuso mittico.
Tem volta de 25nm
o So formados por fiadas de tubulina protofilamentos quando so 13 formam um cilindro.
o Fibras com orientao radial (do centro para a periferia)
No so visveis ao MO mas podem ser vistos por marcao no MO de fluorescncia.
Os MT podem ser marcados com anticorpo e mostrados com fluorescncia. Os centros organizadores
de microtbulos (MTOC) tambm podem ser marcados.
o Centro organizador de MT (MTOC) de onde eles partem para a periferia. So mais evidentes
durante a diviso celular, porque constituem os plos.
O centrossoma, que funciona como um centro de organizao do MT, contm um par de centrolos
ortogonais, na maioria das clulas animais.
o Os centrolos organizam-se em ngulo recto. sua volta encontra-se uma nvoa de material, a
matriz pericentriolar que contm -tubulina e pericentrina. As extremidades (-) dos MT esto
embebidas no MTOC mas sem estarem em contacto com os centrolos.
Na interfase das clulas animais, a extremidade (-) da maioria dos MT est prxima do MTOC. De
maneira semelhante, os MT nos flagelos e clios tm a sua extremidade (-) contnua com o corpo
basal, que actua como MTOC para estas estruturas.
Assim que entram em mitose, a rede de MT arranja-se formando o fuso mittico. As extremidades (-)
de todos os fusos mitticos apontam na direco de um dos MTOCs, ou plos, como so chamados
nas clulas em mitose.
Componente do citoesqueleto e funo
o MTOC Organizar a polaridade da clula
o Arranjos de MT Movimentos dos cromossomas
o Motores de cinesina Transporte de vesculas e cromossomas dirigidas pela extremidade (+).
o Motores de dinena Montagem do fuso atravs do transporte de vesculas dirigido pela
extremidade (-).
Os clios, contendo MT impedem o movimento do vulo pelo oviduto.
Nas clulas nervosas, a extremidade (-) de todos os MT dos axnios esto orientadas para a base do
mesmo, mas os MT dendrticos tm polaridades misturadas.
O axnio tem MT e filamentos intermedirios
Numa clula em mitose, formam-se MT temporrios que vo montar-se no incio da mitose e
desmontar-se no final e que transportam os cromossomas para os plos.
As clulas vegetais no tm centrolos, mas tm fuso acromtico, logo tm MTOC.
Na fase S h duplicao dos MTOCs.
Tubulina a unidade estrutural do protofilamento
o O GTP associado ao mnomero de -tubulina no permutvel, enquanto o GDP associado
ao monmero de -tubulina pode ser permutado em GTP.
o O taxol estabiliza a estrutura do dmero.
o A organizao das subunidades de tubulina num MT.
As subunidades esto alinhadas extremidade com extremidade, em protofilamentos que
se dispem lado a lado para formar um MT. Alternncia entre -tubulina com GTP e -
tubulina com GDP.
o Os protofilamentos podem estar organizados simples, duplos ou triplos
O MT simples tem 13 protofilamentos
O MT duplo tem mais 10 protofilamentos: 23.
Clio, flagelo
O MT triplo tem mais 10 protofilamentos: 33.
Corpos basais, centrolos

Polimerizao e Despolimerizao

A adio de fragmentos de MT demonstra a polaridade da polimerizao da tubulina


o Os fragmentos de MT do flagelo actuam como ncleos para a adio in vitro de -tubulina.
o O fragmento nucleador do flagelo pode ser distinguido ao ME dos MT recm-formados a partir
das extremidades do fragmento de flagelo.
o O comprimento maior do MT numa extremidade indica que as subunidades de tubulina so
adicionadas, preferencialmente, a essa extremidade.
Estgios da montagem de MT
o Os dmeros livres de -tubulina associam-se longitudinalmente para formar protofilamentos
curtos.
o Esses protofilamentos so estveis e associam-se em folhetos curvos mais estveis.
o O folheto enrola-se formando um MT com 13 protofilamentos. O MT cresce pela adio de
subunidades s extremidades que compem a parede dos MT
o Os dmeros livres de tubulina tm GTP ligado ao stio de ligao de nucletidos permutveis no
monmero de -tubulina. Aps a incorporao de uma substncia dimrica num MT, o GTP da
-tubulina hidrolisado a GDP.
o Se a velocidade de polimerizao mais rpida do que a velocidade de hidrlise do GTP,
gerado um bloqueio de subunidades ligadas ao GTP na extremidade (+) embora o centro da -
tubulina do MT contenha GDP.
o A velocidade de polimerizao duas vezes mais rpida na extremdade (+) que na (-).
A Microscopia Electrnica permite ver MT desmontados
o Os MT que se esto a montar ou desmontar podem ser congelados em etanol lquido e
observados ao microscpio crioelectrnico.
o As extremidades dos MT so lisas, ocasionalmente observa-se um protofilamento a estender-
se a partir de uma extremidade.
o Em condies de desmontagem, os protofilamentos espalham-se pelas extremidades dos MT
dando s extremidades uma aparncia desalinhada.
o A perda de MT nas extremidades leva diminuio de tamanho.
A concentrao normal de tubulina varia entre 10 a 20M.
o Concentrao acima da Cc os dmeros polimerizam em MT
o Concentrao abaixo da Cc os MT despolimerizam.

Modelo da instabilidade dinmica

A velocidade de crescimento de MT in vitro mais lenta que a de encurtamento.


O encurtamento muito mais rpido do que o crescimento.
As transies bruscas entre o estado de contraco (catstrofe) e o estado de alongamento (resgate)
so evidentes.
O frio estimula a despolimerizao e o calor estimula a polimerizao.
Modelo
o As subunidades de -tubulina ligadas ao GTP so adicionadas preferencialmente
extremidade (+) de um MT pr-existente.
o Aps a incorporao, o GTP da -tubulina hidrolisado a GDP.
o Apenas os MT cujas extremidades (+) esto associadas a GTP so estveis e podem servir
como iniciadores para a polimerizao de tubulina adicional.
o Os MT com tubulina-GDP so rapidamente despolimerizados e podem desaparecer logo. Em
altas concentraes de tubulina GTP, a velocidade de adio da tubulina maior que a
velocidade de hidrlise do GTP ligado nos MT ou do que a velocidade de dissociao da
tubulina GTP das extremidades. Desta forma, o MT cresce.
o Em baixas concentraes de tubulina-GTP, a velocidade de adio da tubulina diminuda, a
velocidade de hidrlise do GTP excede a velocidade de adio de subunidades de tubulina e
gerado um bloqueio de GDP.
o Como o bloqueio de GDP instvel, desfaz-se para libertar as subunidades da tubulina.
Dinmica dos MT e a ligao a diferentes estruturas est ligada a vrias protenas
o Protenas MAPs estabilizadoras de ligao a estruturas (membranas), controladoras do
espao entre MT e destabilizadoras.
o O espaamento dos MT depende do comprimento do domnio de projeco de protenas
associadas aos MT ligados.
A protena MAP2 de braos longos ou a protena Tau de braos curtos, promovem o
crescimento de longas protuberncias similares a axnios.
O espaamento entre os MT nas clulas que contm MAP2 maior do que o das que
contm Tau.
Ambos os tipos de clulas contm o mesmo nmero de MT mas o feito de MAP2
aumentar o calibre da protuberncia.
Drogas que alteram a dinmica dos MTs
o Colchicina gotas e outras doenas de junes e pele
o Taxol alguns cancros
MTs organizam alguns organitos nas clulas
o Caso do RE, por exemplo.

Protenas Motoras

Cinesina da extremidade (-) para a (+)


Dinena da extremidade (+) para a (-)

A velocidade de transporte das protenas no axnio pode ser determinada pela marcao radioactiva e
electroforese em gel.

Todas as protenas motoras precisam de ATP para o seu movimento.


Movimento de vescula dentro de uma clula nervosa
o O domnio da cabea da cinesina, protena motora dos axnios, liga-se aos MTs e ao ATP e
responsvel pela actividade motora da cinesina. O domnio da cauda responsvel pela
ligao com as vesculas da membrana.
o O movimento de vesculas depende da cinesina e pode ser seguido por ensaios in vitro.
o Na presena de ATP as vesculas movem-se numa direco especfica, da extremidade (-)
para a (+), isto , sentido anterrgrado.
O transporte de neurofilamentos marcados com GFP ao longo das axnios exibe pausas peridicas.
o Um segmento de um axnio visualizado depois de uma protena de neurofilamento ser
expressa numa clula neuronal em cultura.
o Os feixes de neurofilamentos so separados por espaos dentro do axnio
o Pode-se observar o neurofilamento atravessar um espao vazio.
o Um grfico da distncia percorrida, dependente do tempo mostra pausas no transporte de
neurofilamentos. A velocidade mdia mais baixa que o transporte axnico, embora o pico de
velocidade seja similar.
Estrutura da cinesina
o Duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada cabea est ligada a uma regio -
helicoidal do pescoo que forma um dmero em super-hlice. Os MT vo-se associar a.
Modelo de transporte de vesculas catalisado pelo cinesina
o As molculas de cinesina ligadas a receptores na superfcie da vescula transportam as
vesculas da extremidade (-) para a extremidade (+) de um microtbulo estacionrio.
o O ATP necessrio ao movimento.
o A maior parte das cinesinas dirige-se para a extremidade (+).
o A maior parte das dinenas dirige-se para a extremidade (-).
Vrias protenas motoras movimentam a mesma macromolcula
o O conjunto dos MT com as suas extremidades (+) a apontar para a periferia das clulas
irradiada a partir do MTOC.
o O transporte anterrgrado depende da cinesina que conduz as mitocndrias, os lisossomas e
outras vesculas para o RE ou para a periferia da clula
o O transporte retrgrado depende da dinena citoslica que conduz as mitocndrias, os
elementos do RE e os endossomas tardios para o centro da clula.
Cooperao da miosina e da citosina no crtex da clula
o Os MT aproximam-se da membrana rica em actina da clula.
o Consequentemente, algumas cargas so transportadas para a periferia das clulas pelas
protenas motoras da cinesina nos MT, mas completam a jornada nos microfilamentos sob a
impulso das protenas motoras de miosina.

Clios e flagelos

Ocorre por mecanismos de protenas motoras.


H dois mecanismos de movimentao:
o Polimerizao / Despolimerizao
o Protenas motoras
H ligao da dinena entre os pares perifricos.
Espermatozides
o H dois tipos de braadas, uma efectiva e uma de recuperao. A efectiva afasta a gua e
empurra o microrganismo, enquanto a de recuperao prepara-o para uma nova braada
efectiva.
o O batimento do flagelo empurra as clulas para a frente e o batimento dos clios arrasta os
materiais pelos tecidos.
Axonema Feixe central de MT. (flagelo)
o Os braos de dinena e os raios com cabeas aderidas circundam um par central de MT
simples.
o Nexina protena que une duplas de MT adjacentes.
As dinenas do axonema que so maiores e mais complexas que as citoslicas, esto
permanentemente ligadas aos MT duplos nos axonemas. Os braos de dineina com as suas
pequenas cabeas globulares projectam-se em direco ao par adjacente.
O avano dos braos de dinena que s estende de um par em direco extremidade (-) do par
vizinho gera fora para o deslizamento no axonema.

Mitose e Microtbulos

Estgios da mitose e citocinese numa clula animal


o Interfase (G2): replicao do DNA e do centrossoma. Depois da replicao do DNA, durante a
fase S os cromossomas de cada um contendo um cromatdeo igual so descondensados. Em
G2, os centrolos replicam-se para formar os centrossomas filhos.
o Na profase d-se a migrao dos centrossomas. Os centrossomas, cada um com um centrolo-
filho, comeam a mover-se na direco dos plos opostos da clula. Comeam a condensar
parecendo longos filamentos.
o Na pr-metafase d-se a formao do fuso. O envelope nuclear fragmenta-se em pequenas
vesculas e os MT do fuso invadem a regio do ncleo. A condensao do centrossoma
completada. Cada cromossoma visvel composto por dois cromatdeos unidos pelos
centrmeros.
o Na metfase, d-se o alinhamento dos cromossomas que se movem em direco ao equador
da clula, alinhando-se no plano equatorial.
o Na anafase, d-se a separao dos cromossomas. Os dois cromatdeos irmos separam-se
em cromossomas independentes.
o Na telofase e citocinese, as membranas do ncleo formam-se novamente e os cromossomas
descondensam. O fuso desaparece, medida que os MT despolimerizam e a clivagem da
clula continua.
o Volta-se interfase.
Mitose Mecanismo de diviso do ncleo que passa por vrias etapas, onde os microtbulos tm um
papel importante.
Todas as clulas passam pela mitose, excepto as formadas pelos gmetas.
As bactrias no se dividem por mitose, pois no h garantia que as clulas filhas tenham a mesma
informao gentica.
MPF factor promotor da mitose
o Promove a fosforilao da miosina, que no funciona durante a mitose porque est fosforilada.
Profase A membrana nuclear deixa de ser visvel porque os constituintes das membranas
organizam-se em pequenas vesculas, que deixam de ser visveis ao MO. Os cromossomas ficam
visveis e forma-se o fuso acromtico, estrutura formada por MT.
Centrossomas (sob a forma de centrolos) ou MTOCs
o Vo para os plos, formando MT que se organizam e originam o fuso.
Cromatina Na interfase, quando h um ncleo individualizado.
Cromossomas s durante a mitose
Metafase Os cromossomas esto todos na placa equatorial
Anafase Ascenso de cromatdeos
Telofase reorganizao do ncleo. Desaparecem os cromossomas e o fuso e ficam apenas as fibras
radiais.
Citocinese diviso do citoplasma mediada por microfilamentos.

Fibras astrais ou ster (MT)


Fibras polares fazem o fuso
Fibras do citocoro ligam-se aos cromossomas. Tm 2 fases mais densas, que so onde se ligam aos
centrmeros dos cromossomas.

As protenas do cinetocoro medeiam a ligao dos cromossomas aos MT

o Nas clulas animais, o cinetocoro consiste numa camada interna que contm protenas que se
ligam ao DNA centromrico e uma camada externa ligada s extremidades (+) dos MT dos
cinetocoros.
o Os MT encaixados na camada externa estendem-se na direco de um dos dois plos da
clula.
o A camada externa e a coroa fibrosa em volta das extremidades dos MT contm protenas que
se ligam aos MT e s protenas motoras, entre as quais a CLIP170, a dinena citoslica, as
cinesinas e a CENP-E e MCAK.
Relao da duplicao dos centrossomas com o ciclo celular
o Depois do par de centrolos paternos se separarem, um centrolo filho emerge a partir de cada
um e se elonga. Em G2, o aparecimento dos centrolos filhos est completo.
o No incio da mitose, o centrossoma divide-se e cada par de centrolos migra para as
extremidades opostas da clula.
Modelo para a participao de protenas motoras dos MT nos movimentos do centrossoma na profase.
o Na profase, os MT polares crescem a partir de plos opostos e so alinhados com o auxlio de
motores orientados para a extremidade (-).
o Depois, a cinesina mittica orientada para a extremidade (+) gera foras que empurram e
separam os plos.
o Alm disso, uma fora orientada para a extremidade (-) exercida pela dinena citoslica
localizada no crtex pode traccionar os steres na direco dos plos.
A dinena citoslica participa na formao e estabilizao dos plos.
Na metfase quando ocorre a ligao das fibras cinetocoro aos cromossomas.
o H uma espcie de paragem, para posicionar os cromossomas.
o Treadmilling nmero de tubulinas que entra igual ao que sai. O tamanho da fibra mantm-
se
Anafase A Por despolimerizao. As proteases actuam nos centrmeros.
o As fibras do cinetocoro tornam-se mais pequenas e puxam o centrmero para o centrossoma.
Anafase B H polimerizao do cinetocoro, h sobreposio das fibras e depois as protenas
motoras terminam com esta sobreposio.
As fibras astrais determinam o estrangulamento na citocinese.

Filamentos Intermedirios

Queratina e iamina fornecem suporte mecnico


FI no esto associados a movimento nem a protenas motoras.
Clulas vegetais e fungos no tm FI.
FI nos neurnios so 10x mais abundantes do que MT e MF.
Os FI tm uma cabea (N-terminal), um corpo e uma cauda (C-terminal)
Montagem de filamentos intermedirios
o As protenas FI formam dmeros paralelos com um domnio nuclear em super-hlice altamente
conservado e caudas e cabeas globulares, que variam em comprimento e em sequncia.
o Um tetrmero formado pela agregao antiparalela em zig-zag de dois dmeros idnticos
lado a lado.
o Tetrmeros agregam-se entre si extremidade com extremidade e lateralmente numa
protofibrilha. Um filamento maduro tem quatro protofibrilhas.
A queratina de tipo I est no citoesqueleto de FI.
A plectina uma protena da famlia das plaquinas que liga os FI com os MT e com os filamentos de
actina. Tambm interage com outras protenas do citoesqueleto, incluindo a espectrina, as protenas
associadas a microtbulos e a lmina B.
No msculo, os filamentos de desmina (filamentos intermedirios tipo III) circundam o disco Z e fazem
conexes com os discos Z vizinhos. O alinhamento dos filamentos de desmina com o sarcmero do
msculo mantido no lugar por um colar de heteropolmeros de desmina/sinemina.

Aula 7 Ciclo Celular

O ciclo celular compreende uma srie ordenada de acontecimentos que levam diviso celular e
produo de duas clulas-filhas.
Controlo da diviso celular vital para todos os seres vivos (unicelulares e pluricelulares)
A perda de controlo do ciclo celular pode levar ao cancro, uma doena que mata cada vez mais
pessoas.
A replicao de cada clula tem de ser controlada finalmente, ocorre na altura certa, com mecanismos
fidedignos e reprodutveis de modo a cumprir o programa de desenvolvimento de cada organismo.
Mecanismos de vigilncia atravs de check-points (2 acontecimentos-chave)
o Replicao de cromossomas
Ocorre na fase S do ciclo celular
Cada cromossoma filho resultante distribudo clula filha na mitose.
o Segregao de cromossomas
necessrio assegurar que a segregao feita correctamente.
Mecanismos de controlo muito semelhantes em todas as clulas eucariotas
Nmero limitado de controladores principais
Conservados evolutivamente.
o feita por protenas quinases heterodimricas que contm uma subunidade reguladora
(ciclina) e uma cataltica (quinase dependente de ciclina), que regulam a actividade de
protenas envolvidas na replicao do DNA e na mitose por meio da sua fosforilao em stios
regulatrios especficos e tambm por cyclin dependent kinases CDK.
o A degradao regulada por protenas.
Eventos principais do ciclo celular dos eucariotas e destino do cromossoma da clula-me
o Nas clulas em proliferao, G1 o perodo entre o nascimento de uma clula aps a mitose
e a sntese de DNA, o que marca o incio da fase S.
o O cromossoma replicado consiste em duas molculas de DNA filhas e de protenas
cromossomais associadas.
o Cada uma das molculas de DNA filhas e suas protenas cromossomais tomam o nome de
cromatdeo-irmo.
o O final de G2 marcado pelo estabelecimento da mitose, durante a qual o fuso mittico se
forma e separa as cromatdeas-irms, seguindo-se a diviso do citoplasma (citocinese) para
gerar duas clulas filhas.
o As fases G1, S, G2 tomam o nome de interfase, que o perodo entre uma mitose e a prxima.
o As clulas que no esto a ser replicadas entram numa fase G0 podendo dar-se a sua morte
ou ento a continuao para G2.
Fases da mitose e citocinese
o Na interfase d-se ento a replicao do DNA formando-se duas molculas filhas de DNA que
com as suas protenas cromossomais tomam o nome de cromatdeo-irmo.
o Na mitose, na profase d-se a migrao dos centrossomas. Os centrossomas comeam a
condensar, d-se a desagregao do ncleo a formao do fuso j numa pr-metafase.
o O cinetocoro medeia a ligao de protenas ao fuso.
o Na metfase, d-se o alinhamento dos cromossomas e a sua disposio no plo equatorial.
o Na anafase d-se a separao dos cromossomas. Cada cromossoma ligado a um MT de
cinetocoro move-se para um plo.
o Na telofase e citocinese as membranas do ncleo formam-se novamente e os MT
despolimerizam. D-se a clivagem das clulas e as clulas-filhas entram em G1 novamente.
O DNA associado a protenas forma cordas com 11nm que associadas formam fibras de 30nm com
nucleossomas agregados.
Um cromossoma em metfase encontra-se altamente condensado, com protenas scaffold a ajudar no
enrolamento. Na interfase encontra-se mais descondensado.
Um cromossoma em metfase tem no centro um centrmero, os braos so os cromatdeos e na
ponta dos braos encontra-se o telmero.

Controlo do ciclo celular

Depende
o Fosforilao regulada de protenas
Fosforilao por cyclin dependent kinases, CDK
Heterodmeros formados por uma ciclina (unidade reguladora) e uma quinase
(unidade cataltica)
Trs classes de ciclinas
G1
S
M
o Degradao especfica de protenas
Degradao especfica em proteossomas
2 Tipos de ubiquitina ligases
o SCF
o APC/C Anaphase Promoting Complex
Viso geral do modelo de regulao do ciclo celular dos eucariotas
o A progresso no ciclo controlada pelos complexos ciclina G1, S e M.
o Esses complexos tm unidade reguladora e unidade cataltica quinase dependente de ciclina
(CDK). CDKs no funcionam sem ciclinas.
o Dois complexos ubiquitina ligase, SCF e APC vo actuar em substratos especficos que
incluem os inibidores da fase S, as securinas e as ciclinas M marcando os substratos para
degradao nos proteossomas.
o A protelise do inibidor da fase S activa os complexos ciclina da fase S-CDK, levando
replicao dos cromossomas.
o A protelise da securina resulta na degradao de complexos proteicos que conectam os
cromatdeos-irmos na metfase iniciando assim a anafase.
o A reduo da actividade dos complexos ciclina M-CDK como consequncia da protelise das
ciclinas M permite que aconteam eventos tardios da mitose e citocinese.
o Estas clivagens proteolticas impedem o ciclo de tomar o sentido contrrio.
Clulas estimuladas para replicar
o Incio da fase G1
H expresso dos complexos ciclina G1-CDK, que aps atingirem determinada
quantidade:
Activam os factores de transcrio para expresso dos genes:
o Que codificam enzimas para a replicao do DNA
o Que codificam as ciclinas da fase S.
Fosforilao de Cdh1, inactivando-o, permitindo acumulao de ciclinas S e M.
o No final da fase G1
Induzem a degradao dos inbidores da fase S fosforilando-os e induzindo a sua
poliubiquitinao pela ligase SCF da ubiquitina.
Activao dos complexos ciclina-S-CDK.
o Fase S
Complexos ciclina S-CDK activos
Fosforilam protenas que fazem parte dos complexos de pr-replicao do DNA,
ligadas s origens de replicao em G1
o Inicia-se a replicao do DNA
o Inibe a formao de novos complexos de pr-replicao.
Sntese de complexos ciclina M CDK que, esto inibidos, por fosforilao, at ao final
da fase S.
o Complexos ciclina M CDK
Activados por desfosforilao
Fosforilam vrias protenas que:
Promovem condensao de cromossomas
Retraco da membrana nuclear
Formao do fuso acromtico
Alinhamento dos cromossomas na placa equatorial
o APC Anaphase Promoting Complex
APC um complexo multiproteico com actividade ubiquitina quinase.
Poliubiquitina especifica protenas que vo ser degradadas.
Poliubiquitina Securina inibidor da degradao de protenas de cross-linking do
centrmero. S depois da metfase
Degradao das protenas de cross-linking e separao dos cromatdeos
Poliubiquitina s ciclinas M
Activa fosfatases que desfosforilam protenas permitindo:
Reformao da membrana nuclear
Reformao do aparelho de Golgi
Induo de citocinese
Desfosforilao das protenas do complexo de pr-replicao, activando-as.
o 3 Pontos regulados por ubiquitina ligases:
G1 S
Metafase Anafase
Anafase Telofase e citocinese
Pontos irreversveis pois resultam da degradao de protenas (Sic1, Securina,
Ciclinas mitticas do tipo B)
Restriction Point
o Pontos de Regulao Crticos
Iniciao da fase S
Iniciao da mitose
Separao dos cromatdeos na anafase
Sistemas experimentais para identificar protenas que regulam o ciclo celular

Fuso de clulas de mamfero em fase M e G1


o Existem factores solveis que regulam o ciclo celular
Ciclina M CDK
Ciclina S CDK
Mutaes em cdc
o Mutaes na cdc28 Pram antes da formao de gmulas
o Mutaes na cdc7 Pram antes da citocinese.
Preparao de um banco genmico
o Tratar um vector com enzimas de restrio, bem como os diferentes pedaos de DNA e inseri-
los nos vectores.
o Seleco dos fragmentos de DNA com genes que revertem o fentipo, neste caso sensveis
temperatura. Adiciona-se marcador e s as que queremos que crescem
Mecanismos de incio da fase M
o Estudos em ocitos de xenopus isolamento da ciclina tipo B ou mittica
Maturao meitica estimulada pela progesterona.
Meiose I
Pra na meiose II fecundao.
Pr-ncleo masculino + Pr-ncleo feminino
Primeira diviso
o Maturao meitica de ocitos estimulada pelo factor citoslico solvel, MPF
Ocito em metfase II
Transfere-se o citoplasma para um ocito em G2 e injecta-se MPF.
Meiose I
Ovo fica preso na meiose II
o Faz-se isolamento da MPF e estuda-se a sua actividade.
Actividade da MPF aumenta quando a clula entra em mitose ou meiose.
o A quantidade de ciclina desce sempre que h diviso celular.
Isolamento da ciclina mittica de xenopus
o Rastreio de um banco, utilizando a sonda de DNA heterloga para
o Produo de anticorpos, utilizando a protena expressa em E. coli para
o Confirmao de que a ciclina M se encontra nas mesmas fraces que a actividade MPF.
Aps obteno de fago positivo
o Preparao do DNA do fago
o Sequenciao do fragmento de DNA
o Anlise do fragmento (identificao da regio codificante, confirmao de fase de leitura
aberta, codo stop)
o Comparao da sequncia de aa da ciclina de ourio com ciclina de xenopus, para ver grau de
homologia.
Aps confirmao de que o fago contm ORF de ciclina
o Transferir sequncia ORF para um vector de expresso em E. coli
o Produo em grande quantidade da protena correspondente
o Produo de anticorpos especficos, policlonais ou monoclonais.

Experincias para estudar funo da ciclina B no controlo da actividade de MPF

Utilizao de extractos de ocitos de Xenopus (sem ncleo) contm todo o material necessrio para
as primeiras 12 divises, aps a fertilizao.
Formao da blstula em Xenopus
o Fertilizao do ovo
o 12 Divises sincronizadas, em que as fases G1 e G2 so muito pequenas.
o As primeiras 12 divises no necessitam da presena de ncleo, ou seja, todos os elementos
necessrios sntese de DNA (fase S) e diviso celular (fase M), encontram-se no citoplasma
do ovo no fertilizado.
Localizao da MPF e ciclina B nas diferentes fraces obtidas em tempos sequenciais aps
fertilizao
o Alta actividade cinsica da MPF resulta na entrada em mitose
o Baixa actividade cinsica de MPF necessria para sair da mitose.
MPF e ciclina B esto nas mesmas condies
o A actividade MPF e a mitose dependem da sntese e degradao de ciclina B em Xenopus.
Funes da ciclina B
o Para haver alternncia entre as fases S e M, nas primeiras 12 divises em Xenopus
necessria:
A presena de mRNA (codifica ciclina B)
A sntese proteica para entrada em mitose (dispensvel para entrada em fase S)
A ciclina B a nica protena sintetizada nestas condies (nos extractos)
A ciclina B precisa de ser sintetizada para iniciar a fase M
A ciclina B regula a actividade de MPF
A ciclina B precisa de ser degradada para terminar a fase M.
Ciclinas M em vertebrados
o H 3 protenas com a mesma funo da ciclina B de Xenopus, Ciclina B, B1 e A
o As ciclinas M so degradas no final da anafase nos proteossomas aps poliubiquitinao pelo
APC (Anaphase promoting complex)
Regulao da quantidade de ciclina B em clulas embrionrias
o Na anafase tardia, o complexo promotor da anafase (APC) poliubiquitina as ciclinas B.
o medida que as ciclinas so degradas pelos proteossomas, a actividade cinsica do MPF
diminui, determinando o incio da telofase.
o A actividade do APC est relacionada com as ciclinas mitticas (B) pela aco de um factor
especfico, Cdh1, que fosforilado e assim inactivado por complexos ciclina G1 CDK.
o Uma fosfatase especfica chamada Cdc14 remove o fosfato regulador do factor de
especificidade na anafase tardia.
o Assim que o factor inibido em G1, a concentrao de ciclina M aumenta de forma a permitir
nova entrada na mitose.
Identificao de subunidade cataltica da cinase, CDK, numa levedura
o Mutantes doc maiores que as normais
o Mutantes wee menores do que as normais
o Nas leveduras a membrana nuclear no se dissocia.
o Cdc2 uma protena homolgada com as cinases eucariotas
Reguladora da entrada na mitose.
o Cdc13 codifica uma ciclina semelhante ciclina B da xenopus.
o Cdc13 + Cdc2 = MPF
o Complexo MPF
altamente conservado da levedura s clulas humanas.
Em xenopus e ourio-do-mar, formado por uma ciclina B (subunidade reguladora) e
uma cinase (cataltica).
Em S. Pombae formado por Cdc13 (ciclina) e Cdc2 (CDK)
Fosforilao da cinase (CDK) activa MPF.
o Reguladoras da actividade de CDK em S. Pombae
Wee1
Cdc25

Mecanismos moleculares de regulao da mitose

Actividade dos complexos ciclina-CDK


Actividade de ligases de ubiquitina especficas

Incio da mitose

Actividade de MPF (Fosforilao)


o Desagregao da membrana nuclear
o Provoca condensao de cromossomas
o Formao do fuso mittico
A lmina nuclear despolimerizada
o O invlucro nuclear uma dupla membrana com extenso para o RE contendo vrios poros
nucleares.
o A camada lipdica da membrana interna suportada pela lmina nuclear. As trs lminas
nucleares (A, B, C) nos vertebrados pertencem classe das protenas do citoesqueleto.
o Assim que o MPF activado no fim da G2 vai fosforilar resduos de serina das trs lminas
nucleares. Isto causa desfosforilao das lminas dos filamentos intermedirios.
o A despolimerizao das lminas nucleares leva desintegrao da membrana nuclear.
o Mutaes no gene lmina A/C
Sndrome Hutchington-Guilford doentes com taxas de envelhecimento muito elevadas.
Doenas no tecido muscular estriado
Doenas das clulas adiposas
Doenas das clulas do tecido nervoso perifrico.
o Desagregao da membrana nuclear
Associada fosforilao de protenas pelo complexo MPF
Despolimerizao das lminas
Dissociao dos complexos que formam os poros nucleares
Enfraquecimento das ligaes entre a membrana interna do ncleo e a
cromatina.
o Condensao dos cromossomas
Protenas SMC necessrias segregao de cromossomas
Fazem parte do complexo condensina
Condensina fosforilada liga-se ao DNA e superenrola-o.
Condensina fosforilada durante a fase M por MPF ou por uma cinase controlada pelo
MPF.
o Substratos de MPF
Alm da lmina, protenas SMC e MAPs.
o Formao do fuso acromtico
Provvel fosforilao de MAPs, pelo MPF, para possibilitar a formao de fuso mittico.
Fosforilao de protenas do aparelho de Golgi e do RER, alterando o trfego de
vesculas durante a profase.
o Anafase
Separao dos cromatdeos
Poliubiquitinao da ciclina M pelo APC (anaphase promoting complex) que tem
actividade de ubiquitina cinase, necessria para
Descondensao de cromossomas
Segregao de cromatdeos
o Em xenopus, a degradao da ciclina B necessria para a descondensao do cromossoma,
mas no para a segregao.
o Para que a segregao seja normal, necessria a degradao de protenas que no a ciclina
B Coesinas.
Modelo de ligao pela coesina dos cromatdeos
o Pensa-se que a coesina seja circular.
o No se sabe se necessrio um anel de coesina para ligar dois cromatdeos filhos, ou se so
necessrios dois, um volta de cada cromatdeo-irmo.
o A passagem do garfo de replicao pelas coesinas liga os cromatdeos-irmos.
o Nos vertebrados, as coesinas so libertadas dos braos do cromossoma durante a profase e
incio da metfase e no fim da metfase esto retidas s pela regio do centrmero.
Clivagem de coesinas
o Separase, uma protease que cliva pequenas subunidades das coesinas inibida antes da
anafase pela ligao de uma securina.
o Quanto todos os cinetocoros tiverem ligados aos MT, a Cdc20 associa-se ao APC/C e
direcciona-os para a securina polibiquitinizadora.
o A securina ento degradada pelos proteossomas e o libertado vai clivar as coesinas
permitindo que os cromatdeos se separem.
Modelo de reagregao da membrana nuclear
o Degradao das ciclinas M
o Aco das fosfatases
Nas protenas de membrana Interna do ncleo
Nas protenas do poro
Nas lminas
o Formao dos carimeros
o Fuso de carimeros
A MPF inibe as fosfatases permitindo a formao de citoesqueleto.

Mecanismos de controlo de incio de fase S

Estudos em S. cerevisae
o Ciclinas G1 Cln1, 2, 3
o Ciclinas M Clb 5, 6, 3, 4, 1, 2
o Ubiquitinas cinases SCF e APC
Depois do ponto START (G1 S) as clulas ficam irreversivelmente commited
o As clulas filhas nascem mais pequenas que as mes e tm de crescer em G1 antes que esto
grandes o suficiente para entrarem em fase S.
o Aqui, o invlucro nuclear tambm no se quebra durante a mitose (caso da S. cerevisae)
o Os cromossomas no condensam o suficiente para serem visveis ao MO.
Mutantes em cdc28 em G1 antes do START, crescem mas no entram em mitose
o Clulas em G1 depois de START dividem-se
Mutantes em cdc7 Pram antes da citocinese
Mutantes em cdc
o Cdc28 mutantes de protena, que uma cinase, CDK em s. cerevisae
Semelhante ao cdc2 em s. pombae
o Ambas as leveduras s tm uma CDK.
o Cdc28 necessrio para entrar em fase S e M
o Cdc2 necessrio para entrar na fase M e tambm na S.
o CDKs necessrios para entrar na fase M e S.
Estratgia de isolamento da ciclina G1 de S. cerevisae
o MPF ciclina M + CDK
o SPF ciclina G1 + CDK
Identificao de ciclina G1, por supresso de mutantes cdc28 temperatura sensveis.
o Ciclina M em S. pombae corresponde ao gene cdc13+ e homloga s protenas ciclina B
em Xenopus e ourio-do-mar que associadas a CDK formam MPF (que fosforila a histona-11)
Sem ciclinas G1 as clulas no passam para a fase S e G2.
Ciclina G1 Cln3
o Protena durante todo o ciclo celular
o Protena muito instvel
o Traduo regulada pela disponibilidade de nutrientes (traduo inibida por uma ORF, do
prprio mRNA quando h pouca disponibilidade de nutrientes).
o Cln3-CDK activa factores transcrio SBF e MBF que estimulam:
Expresso dos genes CLN1 e CLN2
Subunidades da DNA polimerase
Subunidades de RPA (ssDNA binding proteins)
DNA ligase
Enzimas necessrias para a sntese de desoxirribonucletidos
o Cln1/Cln2-CDKs fosforilam cdh1, inactivando-o, impedindo a degradao das ciclinas mitticas
que se vo formar.
Factor de transcrio MBF
o Activa genes CLB5 e CLB6 produzem
o Protenas Clb5 e Clb6 do tipo ciclina B mas que codificam ciclinas da fase S durante a fase
S.
o Complexos Ciclina S CDK so essenciais para o incio da fase S ou seja para a sntese de
DNA.
o Complexos Ciclina S- CDK s ficam activos na fase S, depois da degradao do inibidor
especfico Sic1.

Degradao do inibidor do complexo ciclina S CDK

O complexo ciclina S CDK comea-se a acumular em G1 mas inibido pelo Sic1.


A inibio impede a iniciao da replicao do DNA at que a clula esteja preparada.
O complexo ciclina G1 CDK formados no final de G1 fosforilam a Sic1 em vrios locais especficos,
preparando-a para poliubiquitinao pela SCF ubiquitina cinase e subsequente degradao pelo
proteossomas.
A ciclina S CDK activa desencadeia o incio da sntese de DNA fosforilando os componentes de pr-
iniciao da replicao de DNA originados no incio de G1 que esto ligados s origens de replicao
A protena Sic1 especfica para as ciclinas do tipo B, clb.

As ciclinas actuam durante vrias fases do ciclo celular.


As ciclinas mitticas fazem segregao de cromossomas e diviso nuclear.
As ciclinas da fase S tardia e incio da fase M fazem a formao do fuso acromtico.
As ciclinas da fase S fazem a sntese de DNA.
As ciclinas do incio da fase S activam as origens de replicao.
Activao da fosfatase Cdc14 promove o fim da mitose. A activao d-se no fim da anafase.
o A Cdc14 aumenta a expresso de Sic1, que inactiva todas as ciclinas do tipo B, ciclina M
CDK.

A replicao, em cada origem, s se inicia uma vez por ciclo celular.

o Devido presena alternada de ciclinas tipo B, baixa em G1, alta em S, G2 e M.

Fase de iniciao

Onde comea a replicao do DNA?


o Origem de replicao, bolha e garfo de replicao.
Assimilao e Regulao de complexos de pr-replicao
o Durante o incio de G1, factores iniciadores de replicao no fosforilados assimilam-se no
complexo de reconhecimento das origens (ORC) ligado a uma origem de replicao para gerar
um complexo de pr-replicao.
o Na fase S, complexos ciclina S CDK e DDK fosforilam componentes da complexo de pr-
replicao.
o Isto leva ligao de Cdc45, activao do MCM que abre as cadeias de DNA e liberta o Cdc6
fosforilado e Cdt1 (factores de iniciao). O RPA liga-se cadeia nica resultante do DNA.
o Inicia-se a sntese de DNA pela DNA polimerase -primase.
o Outros componentes necessrios ao movimento do garfo de replicao so recrutados. O ORC
liga-se sequncia de origem no DNA filho mas os factores de iniciao fosforilados no se
conseguem associar ao complexo de pr-replicao.
o Ciclina B CDK mantm os factores de iniciao fosforilados durante a fase S e G2 e incio da
anafase.
o Estes factores no se conseguem associar a novos complexos de pr-replicao at serem
desfosforilados pelo Cdc14 fosfatase e as ciclinas B serem degradadas pela ubiquinizao por
APC/C na anafase tardia.

Controlo do ciclo celular em clulas de mamferos

Regulado por vrios sinais exteriores e interiores que definem:


o Tipo de clulas vizinhas
o Nmero de clulas vizinhas
o Tamanho da clula
o Programa de diferenciao
H um restriction point no ciclo. Clulas irreversivelmente commited no precisam de ciclina D para
entrar em fase S.
O ponto de restrio equivale ao START das leveduras.
Ciclina D essencial para passar o ponto de restrio
H vrias ciclinas e CDKs envolvidos na regulao do ciclo celular em mamferos
o CDKs e ciclinas clonados por complementao em levedura
o Ciclinas so protenas cuja quantidade oscila ao longo do ciclo celular.
Duas classes de genes regulam a reentrada das clulas de mamfero no ciclo celular
Genes precoces factores de transcrio c-fos, c-jun
Genes tardios factores de transcrio ciclinas D e E, CDK2, CDK4, CDK6

Regulao da reentrada em G1

Presena de ciclinas D (G1) e nutrientes


Genes precoces
o Transcritos (mRNA) aparecem alguns minutos aps a adio de factores de crescimento
No so inibidos por inibidores da traduo
Factores de transcrio presentes em G0 so activados por fosforilao ou por
degradao de inibidores especficos
Activam vrios genes.
Genes tardios
o No so expressos na presena de inibidores da traduo porque
o Necessitam das protenas codificadas pelos genes precoces
o Necessitam de concentraes elevadas de factores de crescimento, at passarem o ponto de
restrio
o Incluem a ciclina D (= Cln3 em S. cerevisae) que resulta da activao da via IP3 cinase que
activa o factor de traduo elF4 que estimula a traduo da ciclina D e de outros mRNA,
acabando por estimular a proliferao celular.
o Incluem os factores E2F (= SBF e MBF de S. cerevisae), factores de transcrio que activam
genes envolvidos na sntese de DNA, ciclina E, A e CDK2.
o Complexo E2F + Rb funciona como repressor da transcrio, uma vez que Rb se liga a
complexos com desacetilases, e a cromatina desacetilada fica mais condensada e inactiva.
o Rb protena supressora de tumores, que inibe a progresso ao longo do ciclo celular.
Passagem atravs do ponto de restrio
o Depende da fosforilao de Rb
Regulao da actividade de Rb e E2F no final de G1
Protena Rb inibe inicialmente E2F.
Quando o sinal dos mitognios suficiente, o resultado ciclina D CDK4/6
comea a fosforilar a protena Rb libertando E2F que estimula a transcrio dos
genes, codificando a ciclina E, CDK2 e a si prpria.
A ciclina E CDK2 vai fosforilar mais tarde a Rb resultando num feedback
positivo que leva rpida expresso e actividade da E2F e ciclina E CDK2
medida que a clula se aproxima da fase G1 S.
Rb precisa de ser fosforilada para a clula ultrapassar o ponto de restrio e
entrar na fase S.
Rb permanece fosforilado at ao final da mitose, quando activada uma
fosfatase.
Retinoblastoma Hereditrio
o Nas crianas Rb+/Rb -, um dos alelos que codifica uma protena Rb est mutado produzindo
uma protena no funcional.
o Se a Rb+ sofrer mutao, essa clula tem grande probabilidade de se tornar cancerosa.
o As clulas mais susceptveis so as da retina.
o Muitas clulas cancerosas tm mutaes no gene RB por isso foi classificado como gene
supressor de tumor.
Fase S
o Necessria a actividade do complexo ciclina A CDK2.
o Sntese de ciclina A (= ciclina S de S. cerevisae), induzida pelo E2F para:
Induzir a sntese de DNA por activao do complexo de pr-replicao.
o Ciclina A CDK2, que durante a G1 inbido por 3 factores
P27 KIP1
P57 KIP2
p21 CIP
o Fosforilao pelo P27 KIP1, pelo complexo ciclina E CDK2, induz a sua poliubiquitinizao
pelo complexo SCF e induz a degradao no proteossoma.
o Activao do complexo ciclina A/CDK2 por desfosforilao induzida pela fosfatase Cdc25A
(activada no final de G1)
Sntese de DNA por activao de factores de replicao (fosforilao)
Impede a reutilizao das origens, de replicao, juntamente com o GEMININA.
Fase M
o Necessita da actividade do complexo ciclina A/B CDK1 (semelhante M-Cdc2 S. pombae)
o Activao do complexo mittico depende tambm da entrada de ciclina para o ncleo
o Ciclinas A/B so poliubiquitinizadas no final da anafase, pelo APC.
Inibidores de complexos ciclina CDK
o Ciclina A CDK2 inibida por 3 inibidores
P27 KIP1
P57 KIP2
p21 CIP importante para a resposta celular s alteraes no DNA
o CDK 4/6 inibidas por inibidores INK4 (p16)
No h formao de complexos ciclina D CDK4/6
No h fosforilao de Rb
No h actividade de E2F, nem entrada em fase S
o P16 (uma das protenas INK4) uma protena supressora de tumores.

Pontos de controlo na regulao do ciclo celular

Garantia que todos os cromossomas esto intactos


Garantia que cada fase do ciclo no comea antes da fase anterior estar completa.
Sndrome de Down Trissomia 21
o Fenmeno da no disjuno durante a meiose que produz o vulo
A presena de DNA no replicado impede a entrada em mitose
o As cinases ATR e Chk1 inibem a entrada em mitose
Quando ATR se liga ao DNA do garfo de replicao fica activada
ATR fosforila e activa Chk1
Chk1 fosforila e inactiva CDC25C, impedindo a activao de CDK1 que actuam na mitose.
Ligao incorrecta do fuso mittico impede o incio da anafase
o A anafase inibida se apenas um cinetocore estiver ligado ao fuso
o A protena Mad2, associa-se aos cinetocores que no esto ligados aos MT, interagindo e inibindo
cdc20.
o Protenas que regulam a actividade de cdc20
Aps a segregao correcta dos cromossomas comea a telofase em que MPF inactivado por degradao das
ciclinas mitticas
o Protenas de sada da mitose-GTPase, incluindo Tem1.
Paragem no ciclo celular devido presena de DNA mutado:
o Depende da aco de protenas supressores de tumores ATM, Chk2 e p53.
o Paragem em G1 e S impede a fixao de mutaes no genoma.
o Replicao de DNA mutado promove rearranjos que podem induzir cancro.
o Paragem em G2 permite a reparao do DNA mutado.

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