SEMINAR PROPOSAL PENELITIAN SKRIPSI

Judul Penelitian : Potensi Khamir Asal Buah Lobi-Lobi (Flacourtia inermis

Roxb.) Dalam Menghambat Pertumbuhan Kapang
Aspergillus flavus Penghasil Aflatoksin Pada Pakan Ayam
Ternak

Nama : Faradila Nurmayanti

No Registrasi : 3425131061

Program Studi : Biologi

Pembimbing : Dr. Dalia Sukmawati, M.Si

Dr. Tri Handayani Kurniati, M.Si

Hari/Tanggal :

Waktu :

Tempat :

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
2017
 POTENSI KHAMIR ASAL BUAH LOBI-LOBI
(Flacourtia inermis Roxb.) DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN
KAPANG Aspergillus flavus PENGHASIL AFLATOKSIN PADA PAKAN
AYAM TERNAK

Faradila Nurmayanti1), Dalia Sukmawati2), Tri Handayani Kurniati2)

ABSTRAK RENCANA PENELITIAN

Aspergillus flavus merupakan kapang penghasil aflatoksin yang dapat mengkontaminasi

bahan pakan yang berasal dari produk pertanian. Kontaminasi aflatoksin pada bahan pakan dapat
berdampak pada kesehatan dan produktifitas ternak. Penanggulangan kontaminasi pada pakan
ternak dapat dilakukan dengan memanfaatkan khamir antagonis. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui potensi khamir asal buah lobi-lobi (Flacourtia inermis Roxb.) dalam menghambat
pertumbuhan kapang A. flavus penghasil aflatoksin pada pakan ayam ternak. Penelitian
menggunakan metode deskriptif pada tahap identifikasi khamir dan metode eksperimen dengan
Rancangan Acak Lengkap (RAL) pada tahap uji antagonis dan deteksi kandungan aflatoksin
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Tahapan penelitian yang akan dilakuakan yaitu:
isolasi khamir asal buah lobi-lobi, uji antagonisme khamir, pengamatan morfologi khamir secara
makroskopis dan mikroskopis, uji reduksi aflatoksin pada pakan ayam oleh khamir antagonis
potensial, dan identifikasi khamir secara molekular berdasarkan data DNA dari sekuens daerah
D1/D2 rDNA. Teknik pengumpulan data pada uji antagonisme dilakukan dengan menghitung
lebar zona hambat antara khamir dan kapang A. flavus positif aflatoksin pada media Coconut Agar
(CA). Sedangkan untuk uji reduksi aflatoksin dilakukan dengan menghitung kandungan aflatoksin
menggunakan KLT. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F melalui ANAVA dua arah,
jika signifikan dilanjutkan dengan uji Duncan 5%.

Kata kunci: A. flavus, Aflatoksin, Khamir Antagonis, KLT, Daerah D1/D2.

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Keamanan pakan merupakan syarat suatu pakan untuk dapat dikonsumsi. Salah satu
penyebab pencemaran pakan adalah terkontaminasinya bahan baku pakan oleh kapang Aspergillus
flavus. Kapang tersebut dapat menghasilkan senyawa toksin yaitu aflatoksin (Lai et al., 2014).
Kontaminasi aflatoksin pada unggas dapat menyebabkan menurunnya bobot badan (Yunus
et al., 2011), cacat tulang kaki (Komalasari, 2010), menurunnya sistem imun (Yunus et al., 2011)
hingga kematian (Bbosa et al., 2013). Amirkhizi et al. (2015), meneliti kontaminasi aflatoksin B1
pada hati dan telur ayam di supermarket Tabriz, Iran dan didapatkan 72% sample hati dan 58%
sample telur yang diteliti mengandung aflatoksin sebesar 0.30-16.36 g kg-1. Penelitian Herzallah
(2013), membuktikan bahwa ayam yang diberi diet aflatoksin memiliki residu aflatoksin pada
telur, hati, ginjal, dan otot. Diperkirakan lebih dari 5 milyar penduduk dunia terkontaminasi
aflatoksin yang berasal dari makanan yang dikonsumsi dan lebih dari 4 milyar mengalami kanker
hati terutama hepatocelluler carcinoma (Liu et al., 2012).
Berdasarkan hal tersebut maka dibutuhkan suatu cara untuk menghambat atau mereduksi
kontaminasi aflatoksin dalam bahan pakan. Salah satu cara yang dapat digunakan adalah dengan
menggunakan khamir antagonis. Berdasarkan beberapa penelitian khamir asal buah-buahan
memiliki kemampuan antagonis (Chanchaichaovivat et al., 2007; Hejri, 2013). Isolat khamir
1 Mahasiswa Program Studi Biologi. FMIPA UNJ. Email: faradila.ny@gmail.com
2 Staf Pengajar Program Studi Biologi. FMIPA UNJ. Jl. Pemuda No.10 Rawamangun. Jakarta 13220
Pseudozyma fusiformata yang di isolasi dari daun dan buah pistachio dapat menurunkan produksi
spora A. flavus sebesar 84,6% dan menghambat produksi aflatoksin B1 sebesar 89,1% (Hejri,
2013), sehingga dalam penelitian ini digunakan khamir asal buah lobi-lobi (Flacourtia inermis
Roxb.).
Kemampuan khamir antagonis dalam mereduksi kadar aflatoksin dapat divalidasi dan
dikuantifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (Hussain, 2011; Dahab et al., 2016).
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode pemisahan komponen menggunakan fase
diam berupa plat dengan fase gerak berupa pelarut.
Data yang akurat mengenai jenis khamir asal buah lobi-lobi yang potensi menghambat
pertumbuhan A. flavus penghasil aflatoksin sangat diperlukan dalam pengembangan pengendali A.
flavus penghasil aflatoksin pada pakan ayam berbasis mikroba. Identifikasi khamir secara akurat
dapat dilakukan dengan teknik molekuler. Identifikasi dapat diketahui berdasarkan data sekuns
daerah D1/D2 dari ribosom DNA (rDNA).

Manfaat Penelitian
1. Mendapatkan isolat khamir asal buah lobi-lobi yang potensial menghambat pertumbuhan
kapang A. flavus penghasil aflatoksin.
2. Memberikan informasi mengenai keanekaragaman khamir asal buah lobi-lobi yang memiliki
aktivitas potensial menghambat pertumbuhan kapang A. flavus penghasil aflatoksin.
3. Memberikan informasi jumlah reduksi aflatoksin oleh isolat khamir potensial asal buah lobi-
lobi.

Hipotesis Penelitian
1. Isolat khamir yang potensial antagonis terhadap pertumbuhan A. flavus dapat diperoleh dari
buah lobi-lobi.
2. Identifikasi khamir penghambat pertumbuhan A. flavus dapat diketahui berdasarkan analisis
data sekuens daerah D1/D2.
3. Kadar reduksi aflatoksin oleh isolat khamir potensial dapat dianalisis menggunakan
kromatografi lapis tipis.

METODOLOGI PENELITIAN
Tempat dan Waktu
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Februari 2017 sampai dengan bulan Juni 2017,
di Laboratorium Mikrobiologi dan Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Jakarta.

Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah peralatan kaca, mikropipet (Eppendorf), mikrotip (Axygen),
Kertas pH (Merck), jangka sorong analitik, neraca analitik, vortex, shaker, mikroskop kompon,
mikroskop digital stereo, PCR Thermal Cycler Dice TaKaRa, elfor (Mupid-exU), UV
transluminator, kromatografi, mikro siring, dan pelat alumunium G 60F254 silika gel.
Bahan-bahan yang digunakan adalah buah lobi-lobi, isolat kapang A. flavus positif aflatoksin
koleksi Seameo Biotrop Bogor, HCL 10%, akuades, medium YMA (Yeast Malt Agar), medium
YMB (Yeast Malt Broth), medium PDA (Potato Dextrose Agar), medium CA (Coconut Agar),
medium YEPD cair (Yeast Extract Peptone Dextrose), aquades steril, alkohol 70%, go taq green
mastermix (Promega), DNA polymerase (AmpliTaq), nuclease free water (Promega), buffer B
(KAPPA), dNTP (Promega), primer (NL1 dan NL4), gel agarose (1st Base), loading dye
(Geneaid), TAE 50X (BioRad), pakan ayam konvensional, larutan metanol, NaCl, larutan heksana,
larutan kloroform, larutan aseton dan larutan standar aflatoksin.

Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen. Desain penelitian
menggunakan RAL (Rancangan Acak Lengkap) untuk percobaan uji antagonisme khamir dengan
kapang A.flavus dan percobaan pengukuran kadar aflatoksin dan kadar reduksi aflatoksin. Metode
deskriptif digunakan untuk identifikasi morfologi khamir.

1. Isolasi Khamir Asal Buah Lobi-Lobi

Buah lobi-lobi yang telah masak diperoleh dari tiga pohon yang berbeda di Taman Kridaloka
Senayan. Isolasi khamir dari buah menggunakan metode Khattab et al. (2016). Sebanyak 5 gr
daging buah lobi-lobi ditimbang dan dihaluskan secara aseptis, dimasukkan kedalam 50 ml media
YMB dengan pH 3.0, kemudian dihomogenisasi menggunakan vortex dan diinkubasi selama 48
jam pada suhu 28C. Sampel yang telah diinkubasi dilakukan pengenceran dengan faktor
pengenceran 10-1, 10-3 dan 10-5. Sampel pada setiap pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml
dimasukkan kedalam cawan petri yang telah berisi medium YMA dengan pH 3.0, dilakukan
duplo. Sample diratakan menggunakan spatel Drygalski, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 28oC
(Chanchaichaovivat et al., 2007).

2. Uji Antagonisme Khamir Terhadap Kapang A. flavus

Metode pengujian antagonisme khamir menggunakan metode kultur ganda mengacu pada
Suciatmih et al. (2014). Sebanyak 20 l suspensi khamir diteteskan sepanjang garis (6 cm)
kedalam media CA, kapang A. flavus diinokulasi sejajar dengan khamir dengan jarak 1 cm,
diinkubasi selama 5 hari pada suhu 280C. Kontrol adalah medium CA yang diinokulasikan kapang
dan medium CA yang diinokulasikan suspensi khamir. Pengujian dilakukan dengan tiga kali
pengulangan untuk setiap perlakuan.

Tabel 1. Rancangan percobaan hasil pengukuran jarak zona hambat antar khamir dan kapang
Diameter kapang A. flavus
Isolat khamir
P C
1
s/d 15
Keterangan:C = diameter kapang kontrol; P = diameter kapang perlakuan.

Gambar 1. Ilustrasi uji antagonisme metode kultur ganda

Pengamatan dilakukan pada hari ke 6 dengan mengukur besar zona hambat antara khamir
dengan kapang A.flavus menggunakan jangka sorong digital dengan empat kali pengulangan.
Persentase zona hambat dihitung dengan persamaan berikut (Suciatmih et al., 2014).

Keterangan:
P = Hambatan (%)
C = Diameter miselium kapang kontrol (mm)
T = Diameter miselium kapang perlakuan (mm)
3. Pengamatan Morfologi Khamir
Pengamatan morfologi khamir dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis berdasarkan
metode Kurtzman & Fell (1998). Pengamatan makroskopis meliputi : warna, tekstur, tepi koloni,
dan permukaan koloni. Karakter mikroskopis yang diamati meliputi bentuk sel, ukuran sel, tipe
reproduksi aseksual dan spora khamir.

4. Identifikasi Khamir Secara Molekuler

Isolasi DNA genom khamir dilakukan menggunakan metode Sukmawati et al. (2015). Isolasi
DNA genom khamir dilakukan denga menggunakan kit geneid. Amplifkasi daerah D1/D2
menggunakan primer forward NL 1 (5GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3) dan primer
reverse NL 4 (5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3). Reaksi PCR menggunakan Go Taq Green
Mastermix (Promega) dengan volume akhir 25 l. Kondisi PCR digunakan mengacu pada
Sukmawati, (2014) yaitu: pra denaturasi 95oC selama 2 menit, denaturasi 95oC selama 15 detik,
annealing 58,5oC selama 30 detik, elongation 68oC selama 1 menit, final elongation 68oC selama
10 menit dan pendinginan 4oC selama 10 menit. Produk PCR divisualisasikan menggunakan
elektroforesis dan sekuensing dikirim ke jasa pelayanan. Hasil sekuensing akan dianalisis dengan
BLAST di http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ dan http://www.mycobank.com.

5. Deteksi Kadar Reduksi Aflatoksin Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Terdapat 5 perlakuan uji reduksi pertumbuhan kapang A. flavus pada pakan ayam yaitu : 1)
khamir potensial, suspensi kapang A. flavus dan pakan ayam, 2) khamir potensial dan pakan
ayam, 3) kapang A. flavus dan pakan ayam, 4) akuades steril dan pakan ayam, 5) aflatoksin
standar B1 dan pakan ayam. Konsentrasi khamir yang diinokulasikan sebanyak 1 x 10 -8 sel/mL,
sedangkan suspensi kapang A. flavus yang digunakan sebanyak 1 x 10-7 sel/mL . pakan ayam yang
digunakan untuk setiap perlakuan sebanyak 50 gr. Setiap perlakuan dihomogenkan menggunakan
shaker dan diinkubasi selama 54 jam. Setiap perlakuan dilakukan ulangan sebanyak 3 kali
pengulangan.
Hasil uji reduksi selanjutnya diekstraksi mengacu pada Official Methods of Analysis of the
A.O.A.C 970. 45/49. 2.09. (2005) dengan modifikasi. Hasil ekstraksi dianalisis kadar aflatoksin
yang terkandung dengan menggunakan KLT. Hasil ekstraksi dan standar aflatoksin ditotolkan
kedalam pelat alumunium G60 silika gel seperti gambar 2. Larutan standar aflatoksin B1ditotolkan
sebanyak 2,5 L dan 10 L serta sampel sebanyak 2,5 L dan 10 L.

Gambar 2. Ilustrasi penotolan pada pelat alumunium gel silika

Uji kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu tambat (Rf) bercak sampel dan standar
(0,50), sedangkan uji kuantitatif dilakukan dengan membandingkan intensitas perpendaran
(fluoresens) sampel dan standar. Apabila intensitas perpendaran terlalu rendah untuk diamati,
ekstrak sampel diuapkan kembali sampai kering dan dilakukan penotolan ulang. Kandungan
aflatoksin dihitung berdasarkan rumus berikut :
Keterangan :
C : Kandungan aflatoksin (g/kg)
S : Volume standart aflatoksin (L) yang memberikan perpendaran setara dengan Z (L)
sampel
Y : Kosentrasi standar aflatoksin (g/mL)
W : Bobot sampel yang diekstrak (g)
Z : Volume ekstrak sampel (L) yang dibutuhkan untuk memberi
perpendaran, setara dengan S (L) standar aflatoksin
V : Volume pelarut yang dibutuhkan untuk melarutkan ekstrak sampel (L)

Tabel 2. Rancangan percobaan hasil pengukuran harga waktu rambat (Rf)

Harga waktu rambat (Rf)
Perlakuan
P 2,5 L P 10 L C 2,5 L C 10 L
1
s/d 5
Keterangan: C, Rf kontrol; P, Rf perlakuan.

Teknik Analisis Data

Analisis hasil pengujian antagonisme dilakukan dengan mengukur jarak zona hambat
antara khamir dengan kapang A. flavus. Kadar aflatoksin dan kadar reduksi aflatoksin didapatkan
dengan mengukur nilai Rf (Retardation factor). Data dianalisis dengan ANAVA dua arah melalui
uji F. Jika signifikan dilanjutkan uji signifikasi dengan uji Duncan pada 0,05. Data disebut
signifikan bila 0,05. Data morfologi koloni khamir dianalisis secara deskriptif.

DAFTAR PUSTAKA

Amirkhizi, B., Nemati, M., Rafie, S. A., & Ansarin, M. 2015. Aflatoxin B1 in eggs and chiken
liver by dispersive liquid-liquid microextraction and HPLC. Food. Addit. Contam: Part B,
8(4):245-249
Bbosa, G. S., Kitya, D., Lubega, A., Ogwal J. O., Anokbonggo, W. W., & Kyegombe B. D. 2013.
Review of Biological and Health Effects of Aflatoxin on Body Organs and Body Systems.
Di dalam Mehdi Razzaghi-Abyaneh (ed.), Aflatoxins- Recent Advances and Future
Prospects. InTech.
Chanchaichaovivat, A., Ruenwongsa, P., & Panijpan, B. 2007. Screening and indentification of
yeast strains from fruits and vegetables: Potential for biological control of postharvest chilli
antracnose (Colletotrichum capsici). BioControl, 42:326-335.
Gizachew, D., Szonyi, B., Tegegne, A., Hanson, J., Grace, D. 2016. Aflatoxin contamination of
milk and dairy feeds in the Greater Addis Ababa milk sshed, Ethiopia. Food. Control,
59:773-779.
Hejri, A. L. 2013. Saprophytic yeasts: Effective biocontrol agents against Aspergillus flavus. Int.
F. Res. Journal, 20(6):3403-3409.
Herzallah, S. M. 2009. Determination of Aflatoxins in Egg, Milk, and Meet Products Using HPLC
Fluorescent and UV Detectors. Food Chem, 114:1141-1146.
Herzallah, S. M. 2013. Aflatoxin B1 Residu in Eggs And Flesh Of Laying Hens Fed Aflatoxin B1
Contaminated Diet. Am J. Agr. Biol. Sci., 8(2):156-161.
Hussain, I. 2011. Aflatoxin Measurement and Analysis. Di dalam: Ireno Torres-Pacheco (eds.),
Aflatoxin-Detection, Measurement and Control. InTech.
Khattab, S. M., Abdel-hadi, A. M., Abo-dahab, N. F., & Atta, O. M. 2016. Isolation,
Characterization, and Identification of Yeasts Associated with Foods from Assiut City,
Egypt. Br. Microbiol. Res. J., 13(1):110.
Komalasari. Y. 2010. Performa Ayam Broiler yang Diberi Ransum Mengandung Aflatoksin
dengan Level Berbeda. [Skripsi]. Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.
Kurtzman, C. P. & Fell. 1998. The yeast, a taxonomic study. Amsterdam: Elsevier.
Lai, X., Zhang, H., Liu, R., & Liu, C. 2015. Potential for aflatoxin B1 and B2 production by
Aspergillus flavus strains isolated from rice samples. Saudi. J. Biol. Sci., 22(2):176180.
Liu, Y., Chang, C. H., Marsh, G. M., & Wu, F. 2012. Population attributable risk of aflatoxin-
related liver cancer: Systematic review and meta-analysis. Eur. J. Cancer., 48:2125
2136.
Suciatmih, S. Antonius, I. Hidayat, & T.R Sulistiyani. 2014. Isolasi, Identifikasi Dan Evaluasi
Antagonisme Terhadap Fusarium oxysporum f.sp. cubense (Foc) Secara In Vitro Dari
Jamur Endofit Tanaman Pisang. Berita Biologi, 13(1):71-83.
Sukmawati, D. 2014. Khamir asal tumbuhan saeh (Broussonetia papyrifera (L.) L'Hr. ex Vent.)
dan potensinya sebagai agens biokontrol kapang pada buah tomat pascapanen. [Disertasi].
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia. Depok.
Sukmawati, D., Ariyanti, O., Dian, H., Mega, A., & Wellyzar, S. 2015. Identification of
phylloplane yeasts from paper mulberry (Broussonetia papyrifera (L.) L'Hr. ex Vent.) in
Java, Indonesia. Mal. J. Microbiol., 11(4):324-240.