observacin de los microorganismos a travs del microscopio
riana con carga negativa. Los colorantes bsicos, en tre los que
se encuen tran el violeta de genciana, el azul de m etileno, el
verde de m alaquita y la safranina, se utilizan con ms frecuen
cia que los colorantes cidos. Estos ltimos no son atrados
por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superfi
cie bacteriana con carga negativa repele ios iones negativos
del colorante, de modo que este ti e el fondo en lugar de la
estructura bacteriana. Los preparados bacterianos incoloros
contra u n fondo coloreado se denom ina tincin negativa,
una tcnica valiosa para la observacin de las formas genera
les, los tam aos y las cpsulas celulares porque las clulas
resultan muy visibles co n tra un fondo oscuro que contrasta
(vase fig. 3,13a). Las distorsiones del tam ao y la forma de
las clulas se dism inuyen al m nim o porque no se requiere
fijacin y las clulas no captan el colorante. S on ejemplos de
colorantes cidos la eosina, la fucsina cida y la nigrosina.
Para aplicar los colorantes cidos o bsicos los m icrobilo
gos em plean tres clases de tcnicas de tincin: simple, diie-
rencial y especial.
TINCIONES SIMPLES
/ OBJETIVO DE APRENDIZAJE
\ Explicar el propsito de b tincin simple.
U na tincin simple es uria solucin acuosa o alcohlica de un
colorante bsico nico. A unque los diferentes colorantes se
unen de forma especfica a las distintas partes de las clulas,
el propsito principal de una tin ci n simple es destacar el
m icroorganismo com pleto para que se vean las formas y las
estructuras celulares bsicas. El colorante se aplica al extendi
do fijado durante un tiem po determ inado y luego se lava; a
continuacin el portaobjetos se seca y se exam ina. E n ocasio
nes se agrega una sustancia qum ica a la solucin para in te n
sificar la coloracin; este aditivo se denom ina mordiente.
U na de las funciones de un m ordiente es aum entar la afini
dad de una m uestra biolgica por un colorante; otra es cubrir
una estructura (com o u n flagelo) para darle mayor espesor y
facilitar la observacin despus del teido. A lgunas de las tin
ciones simples utilizadas con frecuencia en el laboratorio son
el azul de m etileno, la carbolfucsina, el violeta de genciana
(cristal violeta) y la safranina.
TINCIONES DIFERENCIALES
I OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
I Mencionar los posos de la preparacin de una tincin de
I Gram y describir el aspecto de las clulas grompositivas y
I gramnegotivas despus de cada paso.
I Comparar la tincin de Gram y la tincin de cido-alcohol
I resistencia.
A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferen
ciales reaccionan de m odo diferente con las distintas clases
de bacterias y por lo tan to pueden ser empleadas para estable
CAPITULO 3
cer una distincin entre ellas. Las tinciones diferenciales u ti
lizadas co n ms frecuencia para las bacterias son la tin c i n de
G ram y la tin ci n de cido-alcohol resistencia.
TINCIN DE GRAM
La tin ci n de G ram fue desarrollada por el bacterilogo dans
Llans C h ristian G ram en 1884 y es uno de los procedim ien
tos de tin ci n ms tiles porque perm ite clasificar las b a c te
rias en dos grandes grupos: grampositivas y gram negativas.
En este procedim iento (fig. 3.11a)
U n extendido fijado con calor se cubre con un colorante
violeta bsico, por lo general violeta de genciana. C om o
el colorante violeta im parte su color a todas las clulas, se
lo denom ina colorante primario.
Despus de un breve lapso, se escurre el colorante v io le
ta, se lava el extendido y se lo cubre con yodo, un m or
diente. C uando se lava el yodo, tan to las bacterias gram
positivas como las gramnegativas aparecen de color vio
leta oscuro o prpura.
A continuacin se lava el portaobjetos con alcohol o con
una solucin de alcohol-acetona. Esta solucin es un
agente decolorante que elim ina el color violeta de las
clulas de algunas especies pero no de otras.
Se elim ina el alcohol con agua y se ti e el portaobjetos
con safranina, u n colorante bsico. Luego se vuelve a
lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y se lo
exam ina con el microscopio.
El colorante violeta y el yodo se com binan en el cittjplas-
ma de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o p rp u
ra. Las bacterias que conservan este color despus de haberles
agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican com o
grampositivas; las bacterias que pierden el color violeta oscu
ro despus de la decoloracin se clasifican como gram negati-
vas (fig. 3.11b). C om o las bacterias gramnegativas son in co
loras despus del lavado con alcohol, dejan de ser visibles. Por
ese m otivo se les aplica el colorante bsico safranina, que las
convierte en rosadas. Los colorantes com o la safranina que
tienen u n color que contrasta con el colorante prim ario se
denom inan colorantes de contraste. Dado que las bacterias
grampositivas conservan el colorante violeta original, n o son
afectadas por el colorante de contraste safranina.
C om o se ver en el captulo 4, las diferentes clases de bac
terias reaccionan d m odo distinto frente a la tin c i n de
Gram porque las diferencias estructurales en sus paredes
determ inan la retencin o el escape de una com binacin de
violeta de genciana y de yodo, denom inada complejo v io le
ta-yodo (C V -I). E ntre otras diferencias las bacterias gram po
sitivas tien.en un peptidoglucano (disacridos y am inocidos)
en su pared celular ms grueso que las bacterias gram negati
vas. A dem s, las bacterias gramnegativas contienen u n a capa
de lipopolisacrido (lpidos y polisacridos) como parte de su
pared celular (vase fig. 4-13). C uando se los aplica ta n to a
clulas grampositivas como a clulas gramnegativas el violeta
de genciana y luego el yodo ingresan con facilidad en las clu
las, en cuyo interior se com binan para formar C V I. Este
com plejo es ms grande que la m olcula de violeta de gencia-
70 PARTE U N O Bases de ia
, i Aplicacin de Aplicacin de
violeta de genciana yodo (mordiente)
(a) (coiorante violeta)
n a que ingres en las clulas y, por su tam ao, no puede ser
elim inado por el agregado de alcohol de la capa de peptido-
glucano in tacta de las clulas grampositivas. Por consiguien
te, las clulas grampositivas retienen el color del colorante
violeta de genciana. En cam bio, en las clulas gramnegativas
el alcohol altera la capa externa de lipopolisacrido y el com
plejo CV-^I se elim ina de la capa delgada de peptidoglucano.
C om o consecuencia, las clulas gram negativas son incoloras
hasta que se agrega el colorante de contraste safranina, des
pus de lo cual aparecen de color rosado.
En sntesis, las clulas grampositivas retienen el colorante
y perm anecen de color violeta. Las clulas gram negativas no
retienen el colorante; son incoloras hasta que se las tie con
un colorante de contraste rojo.
El m todo de G ram es u na de las tcnicas de tincicSn ms
im portantes en m icrobiologa m dica pero sus resultados no
pueden aplicarse de modo universal porque algunas clulas
bacterianas se ti en de m odo deficiente o no se tien. Los
resultados de la tin ci n de G ram son ms uniformes cuando
se la utiliza en bacterias jvenes, en etapa de crecim iento.
La coloracin de una bacteria m ediante la tincin de Gram
puede proporcionar inform acin valiosa para el tratam iento
de ciertas enfemedades. Las bacterias grampositivas suelen ser
_ Violeta
H de genciana
H Yodo
I I Alcohol
U Safranina
Lavado con alcohol Aplicacin de safranina
(decoloracin) (colorante de contraste)
F IG U R A 3.11 Tincin de Gram. a) Procedimiento.
(b) M icrofotogrofa de bacterias teidas con Gram.
Los bacilos y los cocos (de color violeta) son grampositivos
y los vibriones (de color rosado) son gramnegativos.
Por qu es til la reaccin de Gram para recetar un tratam iento
antibitico?
destruidas con facilidad por las penicilinas y las cefalospori-
nas. Las bacterias gram negativas por lo general son ms resis
tentes porque los antibiticos no pueden atravesar la capa de
lipopolisacrido. Parte de la resistencia a estos antibiticos
entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se debe a la
inactivacin bacteriana de los antibiticos.
/
TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA
O tra tincin diferencial im portante (que diferencia bacterias
en grupos distintivos) es la tincin de cido-alcohol resisten
cia, que se fija de m odo firme slo a las bacterias que poseen
ceras en las paredes de sus clulas. Los microbilogos utilizan
esta tin ci n para identificar a todas las bacterias del gnero
M ycobacterium , que com prende dos patgenos im portantes;
M ycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis,
y M ycobacterium leprae, el agente causal de la lepra. Esta tin
cin tam bin se utiliza para identificar las cepas patgenas del
gnero hJocardia.
En el procedim iento de tincin de cido-alcohol resisten
cia se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un extendido
fijado y se calienta suavem ente el portaobjetos durante varios
minutos. (El calentam iento aum enta la penetracin y la