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HEMOGLOBINAS ELETROFORESES E OUTRAS METODOLOGIAS

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE

CATÓLICA DE GOIÁS

CBB-BIOMEDICINA Prof.Luiz Murilo Martins de Araújo

PERFIL DAS HEMOGLOBINAS MAIS COMUNS

Hb

A

-

Hb

A 2 -

Hb

F

-

α 2

β 2

α 2

Δ 2

α 2

ץ 2

% ADULTO

96 - 98

ATÉ 3.5-4.0

TRAÇOS

% FETO

TRAÇOS

TRAÇOS

99

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES

Hb

S

-

α 2

β 2 (6: GLU VAL)

Hb

C

-

α 2

β 2 (6: GLU LIS)

D Los Angeles-Punjab

Hb

- α 2

β 2 (121: GLU GLN)

Hb M BOSTON - α 2 (58:HIS TIR) β 2 (Metahemoglobina)

Hb

H

-

β 4

Hb BARTS - ץ 4

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQÜENTES

Hb Lepore - Pareamento não homologo entre os genes ץ e β (Híbrido ץ-β, sendo

a parte inicial, amino terminal semelhante a gama e a terminal, carboxila,

semelhante a beta)

Hemoglobinas Instáveis:

Hb Torino - α 2 (43:PHE VAL)

β 2

Hb Koln

- α 2

β 2 (98:VAL MET)

Diversidade das Hemoglobinas

anormais

• Variantes – 920

Talassemia 300

• Outras – 150

Fonte: http\\www.globin.cse.psu.edu

OUTRAS HEMOGLOBINAS ANORMAIS

Hb E -

Hb J Baltimore - α 2 β 2 (16: GLY ASP)

Hb N Baltimore - α 2 β 2 (95: LYS GLU)

Hb O Arábica

Hb Porto Alegre- α 2 β 2 (9: SER CIS)

Hb K Woolwich - α 2

β 2 (26: GLU LYS)

α 2

β 2 (121: GLU LYS)

α 2

-

β 2 (132: LYS GLN)

OUTRAS HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS

Hb Rio Claro

Hb Zurich

Hb Santa Ana

Hb Niteroi

HB Koln

Hb Camperdown - α 2 β 2 (104: ARG MET)

β 2 (34: VAL MET)

β 2 (63: HIS ARG)

β 2 (88: LEU PRO)

β 2 (42-44:PHE/GLU/SER 0)

β 2 (98: VAL MET)

- α 2 - α 2 - α 2 - α 2 - α 2

OUTRAS HEMOGLOBINAS

VARIANTES

Hb G Philadelphia

Hb I

Hb J Oxford

Hb J Rovigo

Hb Constant Spring - α 2 142: STOP GLN β 2

α 2 68: ASN LIS β 2

α 2 16: LYS GLU β 2

-

-

- α 2 15: GLY ASP β 2

- α 2 53: ALA ASP β 2

OUTRAS HEMOGLOBINAS INSTÁVEIS

Hb Hasharon

Hb Stanleyville II - α 2 78: ASN LIS β 2

Hb G Pest

Hb Kurosaki

Hb Westmead

Hb Campinas

α 2 47: ASP HIS β 2

-

α 2 74: ASP ASN β 2

α 2 7 : LYS GLU β 2

α 2 122: HIS GLN β 2

α 2 26: ALA VAL β 2

-

-

-

-

Prevalência de hemoglobinopatias em 238 amostras

coletadas para estudo eletroforético de hemoglobinas no

Laboratório lâmina-Rj, no ano de 2000.

61 FITAS(25,6%) APRESENTARAM HEMOGLOBINAS

ANÔMALAS:

Talassemia Alf

a

:

6/61

10%

Talassemia Beta

:

23/61

-

38 %

Hemoglobinopatia AS:

 

22/61

36%

Hemoglobinopatia AC:

3/61

5%

Hemoglobinopatia AD:

1/61

1.5%

Hemoglobinopatia SS:

1/61

-

1.5%

Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal:

5/61

-

8%

DOS TALASSÊMICOS:

 

Talassemia Minor

:

19/23

-

82%

Talassemia Intermedia :

4/ 23

-

18%

Ricardo P. Ducatti

LEPAH-CBB-UCG

ELETROFORESE EM PH ALCALINO

ELETROFORESE

É definido como sendo a migração de

espécies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada.

Esta técnica de separação foi desenvolvida pelo químico Arne Tiselius para o estudo de proteínas em soro e por este trabalho ele ganhou o prêmio Nobel em 1948.

SEQUÊNCIA BÁSICA DA ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM pH alcalino

(-)

BÁSICA DA ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM pH alcalino (-) (+) • A 2 G S K

(+)

A 2 G S K C

D

O

R

L

E

B

u

F

A B H J I

A

R

T

s

E

DLos Angeles-Punjab

Lepore

ELETROFORESE DE Hb BART’S E Hb H

ELETROFORESE DE Hb BART’S E Hb H
SC AA
SC
AA

A2

A2 Hemoglobina Lepore (10 %) D LEPORE

Hemoglobina Lepore (10 %)

D

LEPORE

ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA QUÍMICA DA MOLÉCULA POR TROCA DE AMINOÁCIDOS

Hb A- pI 6.8

HbS - pI 6.85 HbG - pI 6.90

HbC - pI 6.95

Hb A- pI 6.8 HbS - pI 6.85 HbG - pI 6.90 HbC - pI 6.95

Hb S: Glu (-) Val (o): pI 6.85

Hb G: Asn (o) Lis (+): pI 6.90 Hb C: Glu (-) Lis (+): pI 6.95

P.C.NAOUM, 2001

PERFÍS ELETROFORÉTICOS

A

A - S : Traço Falciforme (Banda A e S)

S - S : Anemia Falciforme (Banda S)

S - C : Falciforme/ Hb C (Banda S e C)

S - β Tal : Micro-Drepanocitose (Banda S e aumento de A 2 e F)

- α Tal : Banda

A : NORMAL

-

S

S

e Hb

H

A

- C

: Hetereozigoto para Hemoglobina C

C

- C

: Homozigoto para Hemoglobina C

ELETROFORESE EM pH ALCALINO, COM HEMOLISADO COM SAPONINA

ELETROFORESE EM PH ACIDO

ELETROFORESE ÁGAR-ÁCIDO

ELETROFORESE ÁGAR-ÁCIDO

ELETROFORESE ÁGAR-

ÁCIDO

ELETROFORESE ÁGAR- ÁCIDO

ELETROFORESE COM

ISOFOCALIZAÇÃO

ELETROFORESE CAPILAR

ELETROFORESE MICROCAPILAR

ELETROFORESE CAPILAR

Técnica que foi introduzida em 1981, por

Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método analítico. Em sua forma mais simples é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius, porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, conforme o próprio nome sugere.

Pode ser usada na determinação de hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas

hidro e lipossolúveis, aminoácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos,

catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos, etc.

Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (Universidade Estadual de Campinas,

Instituto de Química),

http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm

Uma característica é a sua capacidade

única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas. No projeto Genoma Humano foi necessário distinguir os diversos polinucleotídeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre si por um único nucleotídeo.

Somente a EC tem resolução suficiente

para este tipo de separação. Além disso, o DNA humano contém cerca de 3 bilhões de nucleotídeos e as altas velocidades de análises, obtidas pela EC, permitiram que milhares de nucleotídeos fossem seqüenciados em um único dia

O funcionamento do equipamento

envolve a aplicação de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de diâmetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O uso do capilar apresenta várias vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule.

A alta resistência elétrica do capilar

permite a aplicação de campos elétricos altos pois gera um aquecimento mínimo.

Além disso o formato de capilar propicia uma dissipação eficiente do calor gerado.

O uso de campos elétricos altos resulta em tempo de análise curto, alta eficiência e resolução.

O capilar é preenchido com uma solução

tampão e suas extremidades são mergulhadas em recipientes, que contém a solução tampão, e onde é aplicado um campo elétrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos são feitos de um material inerte, tal como, platina, e são também mergulhados na solução para fechar o circuito.

O capilar passa através de um detector, usualmente um detector espectrofotométrico de absorção no UV/Vis

VANTAGENS

Rapidez

Versatilidade

Baixo custo por análise

Alto poder se separação (resolução)

Consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes.

Possibilidade de automação e detecção

on-line.

DESVANTAGENS

Não é adequada para a determinação de compostos voláteis, não-polares e de massa molar baixa, os quais são melhores determinados por cromatografia gasosa.

Também não é muito adequada para a análise de polímeros não iônicos de massa molar alta

Não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta performace

HPLC

Metodologia automatizada que a partir da cromatografia por

troca iônica permite separar e definir a porcentagem de diferentes hemoglobinas de uma forma precisa e rápida.

GEL CENTRIFUGAÇÃO PARA Hb S ID FALCIFORME, DIAMED®

• TESTE DE FALCIZAÇÃO

TESTE DE FALCIZAÇÃO

SOLUBILIDADE

DA

HEMOGLOBINA

EM TUBO E PAPEL

AMPLIFICAÇÃO GÊNICA PELA PCR

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Bio-Rad®