A Leptospira Major Proteína de Membrana Externa LipL32

26/7/2010 The Leptospiral Major Outer Membrane…
Lista de Jornal > Infect Immun > v.68 (4), abril 2000
Infect Immun. Abril de 2000, 68(4): 2276-2285. PMCID: PMC97414
Copyright © 2000, Sociedade Americana de Microbiologia
A leptospira Major proteína de membrana externa LipL32 é

uma lipoproteína Expresso durante infecção de mamíferos
David A. Haake,1,2* Garlo Chao,um Richard L. Zuerner,3 Jeanne K.

Barnett,quatro Dean Barnett,quatro Mazel Mary,uma Matsunaga James,1,2
Paul N. Levett,5 e Carole A. Bolin3
Divisão de Doenças Infecciosas, dos Assuntos dos Veteranos Greater Los Angeles Healthcare
System, em Los Angeles, Califórnia, 900731 , Departamento de Medicina, Faculdade de
Medicina da UCLA, em Los Angeles, Califórnia 900952 ; Animal Disease Center Nacional,
Agricultural Research Service, E.U. Ministério da Agricultura, Ames, Iowa 500103 Departamento
de Biologia, da Universidade de Indiana do Sul, Evansville, Indiana 477124 ; e Universidade das
Índias Ocidentais Faculdade de Medicina Clínica e Pesquisa, Barbados 5
Editor: Orndorff PE
*Autor para correspondência. Endereço para correspondência: Divisão de Doenças Infecciosas,
111F, VA LA Maior Healthcare System, Los Angeles, CA 90073. Telefone: (310) 478-3711,
x40267. Fax: (310) 268-4928. E-mail: dhaake@ucla.edu.
Recebido 02 de setembro de 1999; revisões solicitadas 03 de novembro de 1999; Aceito 04 de

janeiro de 2000.
Este artigo foi citado por outros artigos em PMC.
RESUMO
Nós relatamos a clonagem do gene que codifica a lipoproteína de 32 kDa, denominada

LipL32, a proteína mais importante no perfil de proteínas de leptospira. Obtivemos o
terminal de aminoácidos-N de um V8 staphylococcal proteolítica de digerir fragmento de
design de uma sonda de oligonucleotídeos. A Lambda-Zap biblioteca contendo II EcoRI
fragmentos de Leptospira kirschneri DNA foi exibido, e um fragmento de DNA kb-5.0,
que continha toda a estrutura LipL32 gene foi identificado. Diversas linhas de evidência
indicam que LipL32 é lipídico modificado de forma similar ao de outras lipoproteínas
procaryotic. A seqüência de ácido aminado deduzida da LipL32 que codifica um
polipeptídeo ácido-amino-272 com um peptídeo sinal amino-ácido-19, seguido por uma
lipoproteína de clivagem site peptidase do sinal. LipL32 é intrinsecamente marcado
durante a incubação de L. kirschneri em meios contendo [3H] palmitato. A ligação de
palmitato ea cisteína amino-terminal de LipL32 é instável ácido. LipL32 é completamente
solubilizado por Triton X-114 de extração de L. kirschneria separação das fases dos
resultados; no particionamento de LipL32 exclusivamente na fase de detergente,
hidrofóbico, o que indica que ele é um componente da membrana externa de leptospira.
CaCl2 (20 mM) devem estar presentes durante a separação de fases para a
www.ncbi.nlm.nih.gov/…/PMC97414/ 1/19
recuperação da LipL32. LipL32 é expressa não só durante o cultivo, mas também
durante a infecção de mamíferos. A imunohistoquímica demonstrou reatividade LipL32
intenso com L. kirschneri infectando túbulos proximais de rim de hamster. LipL32 é
também um imunógeno proeminente durante leptospirose humana. A seqüência ea
expressão da LipL32 é altamente conservada entre patogenicidade Leptospira espécies.
Estes resultados indicam que LipL32 pode ser importante na patogênese, diagnóstico e
prevenção da leptospirose.
A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida no mundo (Centers for Disease

Control, http://www .cdc.gov / ncidod / dbmd / leptospirosis_t.htm diseaseinfo, , 1998).
Infecção renal tubular com patogênico Leptospira espécie tem sido documentado para
uma grande variedade de animais domésticos e selvagens. As infecções são
geralmente transmitidas aos seres humanos através do contato com água ou solo
contaminados com a urina de animais infectados. É provável que a ampla distribuição
da Leptospira espécies reflete a capacidade de sobreviver em diferentes condições
ambientais com a adaptação genética, que se reflete na plasticidade do genoma da
leptospira (40). Patogênicas de Leptospira espécies são capazes de sobreviver como
de vida livre de bactérias por longos períodos de tempo após o derramamento urinária. -
Vacinas de células inteiras inativadas de leptospira têm sido utilizadas há muitos anos
em um esforço para controlar a doença em animais e exposição dos seres humanos
(35). No entanto, leptospirose vacinas disponíveis atualmente são ineficazes na
prevenção ou outra doença ou infecção dos bovinos (5-7), e produzir somente
imunidade a curto prazo de outros animais (35). A imunidade conferida por essas
vacinas se baseia o lipopolissacarídeo (LPS) de carboidratos determinante sorotipo,
existe pouca proteção cruzada contra infecção com mais de 250 sorovares diferentes
que são conhecidos de existir (AF Kaufmann et al. http:/ / www.pasteur.fr recherche /
Leptospira / Strains.html, 1999).
Por causa das deficiências de vacinas baseadas LPS, os componentes da proteína de

membrana externa de leptospira representar uma estratégia importante para o
desenvolvimento de estratégias alternativas imunoproteção. Estudos sugerem que a
membrana externa de leptospira é uma proteína relativamente complexo perfil (10, 18,
25, 41). Até à data, apenas a poucos leptospiral proteínas da membrana externa têm
sido caracterizados em detalhe, incluindo uma porina, OmpL1 (15, 29) e duas
lipoproteínas, LipL36 (16) e LipL41 (31). A banda mais proeminente no perfil protéico total
leptospirose é uma proteína com massa molecular de aproximadamente 32 kDa.
Zuerner et al. têm mostrado que essa proteína da membrana externa principal (MOMP)
poderiam ser dissolvidos por extracção da membrana externa com os detergentes não-
iônico Triton X-100 e Triton X-114 e foi o destaque do antígeno mais identificado por uma
infecção derivada soros suínos no X Triton -114 fase de detergente (41).
Muitas das proteínas mais abundantes em espiroquetas são lipoproteínas, incluindo

TpN47 de Treponema pallidum (12, 13), OspA de Borrelia burgdorferi (4, 8), as proteínas
Vmp do surto Borrelia febre (11, 30), e SmpA de Brachyspira hyodysenteriae (37). Neste
relatório nós descrevemos LipL32, a MOMP de patogenicidade Leptospira spp. A
evidência é apresentada que LipL32 é uma lipoproteína covalentemente vez na sua
cisteína amino-terminal de ácido graxo (s). Foram analisados também o tecido do rim de
hamster infectados e soros de leptospirose em fornecer a documentação que LipL32 é
expressa não só durante o cultivo, mas também durante a infecção de mamíferos.
(Partes deste trabalho foram apresentados na 99a Reunião Geral da Sociedade

Americana de Microbiologia, em Chicago, Illinois, 30 de maio a 3 de junho de 1999.)
MATERIAIS E MÉTODOS
estirpes bacterianas, mídia e plasmídeos.

Leptospira kirschneri RM52 (36) e outras cepas de leptospira foram obtidos a partir da
Leptospirose Centro Nacional de Referência (National Animal Disease Center,
Agricultural Research Service, E.U. Ministério da Agricultura, Ames, Iowa). A maioria das
cepas de leptospira utilizados nesta publicação são descritas em um estudo recente de
DNA parentesco (9). Leptospiras foram cultivadas em Johnson-Harris Tween soro
albumina bovina 80 médio (PLM-5 Bovuminar microbiológica Media; Intergen) (21).
Escherichia coli DH5α [supE44 ΔlacU169 ( 80 lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1] foi usado como o host tensão para as transformações do DNA
recombinante. E. coli F-PLK (recA lac MCRA MCRB hsdR gal Supe [F ' ProAB
LacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]) foi usado como o host tensão para a infecção com o Zap II
vetor Lambda (Stratagene). E. coli PLK-F "eo phage do ajudante ExAssist foram
utilizados na excisão vivo do phagemid pBLUESCRIPT (Stratagene). E. coli SOLR
(E14-[MCRA], Δ [mcrCB-hsdSMR MRR-)171 SBCC recB RecJ umuC: Tn5[Kanr] uvrC
endA1 lac gyrA96 relA1 thi-1 λr F [' ProAB LacIqZΔM15], Su- [] nonsuppressing) foi
usado como o host estirpe de replicação do pBLUESCRIPT extirpado phagemid da Zap
II vetor Lambda (Stratagene). E. coli BLR (DE3) / pLysS [F- ompT HSDSB (rBm B) DCM
gal Δ (srl-recA)306:: Tn10(TCR) (DE3) pLysS (CMR)] (Novagen) foi utilizado como a
tensão de host para o vetor de expressão pRSET (Invitrogen). O lysogen DE3 de E. coli
JM109 (Promega) foi utilizado como sede a tensão para o PET-15B (Novagen). E. coli
células foram rotineiramente cultivadas em caldo Luria-Bertani ou em ágar Luria Bertani,
salvo indicação em contrário (27).
eletroforese em gel e immunoblotting.

Amostras de sódio dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) foram solubilizados
em tampão de amostra final (FSB), composto de 62,5 mM Tris cloridrato (pH 6,8),
glicerol 10%, 5% 2-mercaptoetanol, SDS e 2%. As proteínas foram separadas em um
gel 12%, com um sistema de tampão descontínuo (22) e corados com Coomassie azul
brilhante ou foram transferidas para nitrocelulose (Schleicher & Schull) para
immunoblotting. Para a detecção antigênica em immunoblots, a nitrocelulose foi
bloqueado com 5% de leite desnatado seco em tampão fosfato 0,1 M salina (PBS, pH
7,4) -0,1% Tween 20 (PBS-T), incubados por 1h com anti-soro diluído 1:5.000 ( salvo
indicação em contrário) em PBS-T, e testados com anti-soro de coelho burro conjugado
com peroxidase (Amersham). Amostras contendo E. coli expressando LipL32 de longa-
metragem foram separados em 10% Tris tricine-gel (28), e as proteínas foram
transferidas para Immobilon-P (Millipore Corp, Bedford, Massachussets) para
immunoblotting (realizada como descrito acima, exceto que o anticorpo secundário foi
conjugado com peroxidase-anti-soro de coelho anti obtidos Kirkegaard and Perry
Laboratories, Gaithersburg, Maryland). Antígeno-anticorpo foi detectado por
quimioluminescência com o Enhanced System (ECL, Amersham). Borrões foram
incubadas em reagentes ECL por 1 min e expostos à XAR-5 filme (Kodak).
Amino ácido seqüenciamento de um fragmento polipeptídico interno.

kirschneri L. linhagem de células RM52 (4 × 1011 ) foram lavados duas vezes em PBS e
ressuspendidas em 30 ml de gelado TENP buffer (50 mM Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM, 100
mM NaCl, 0,1 mM [Fluoreto de Fenilmetilsulfonil PMSF]). As células foram rompidas por
sonicação ponta. A fração de membrana foi recuperado por centrifugação por 20 min a
12.000 × g e lavado em tampão TENP. As proteínas da membrana foram separados em
gel PAGE-SDS 12,5%. A tira de teste foi corado com Coomassie azul brilhante, a fim de
localizar a banda kDa 32, que foi cortado do restante do gel e carregados num gel SDS-
PAGE em segundo lugar na presença de protease V8 estafilocócicas em uma
concentração de 100 mg ml-1 Sigma (). As proteínas foram autorizados a migrar para o
gel de empilhamento por eletroforese, ea corrente foi desligada por 45 minutos, seguido
de realização de eletroforese. Os fragmentos de proteínas foram submetidas a SDS-
PAGE, transferidos para a Trans-Blot seqüência da proteína de membrana PVDF (Bio-
Rad, Richmond, Califórnia) e submetidos à proteína UCLA Microsequencing Facility. N-
terminal seqüência de análise de aminoácidos foi realizada em 1090-E sequenator fase
gasosa com Porton on-line de detecção de PTH aminoácidos.
Southern blot.
L. kirschneri DNA foi preparado pelo método de Yelton e Charon (39). Leptospira DNA foi
digerido com EcoRI e eletroforese em gel de agarose 1,0%. Após depurinação
desnaturação, e neutralização, o DNA foi transferido para um filtro de nylon (Zeta-Probe,
Bio-Rad) pelo método do Sul (27). Filtros foram prehybridized por 3 ha 37 ° C, em
tampão contendo 6 × SSC (1 × SSC é de 0,15 M de NaCl com 0,015 citrato de sódio M)
× Denhardt a solução 1, de 0,05% de sódio PPi, 0,5% SDS e 100 mg de DNA de
esperma de salmão desnaturado, por ml. Dois oligonucleotídeos degenerados, 32A e
32A-1-2, foram projetadas com base nos oito primeiros e últimos oito aminoácidos,
respectivamente, de uma seqüência de ácido-amino-32 de um fragmento proteolítica da
LipL32. A seqüência de oligonucleotídeos 32A-1 foi GDCAYAAYAARTAYAAYWSYYT. A
seqüência de oligonucleotídeos 32A-2 foi AARAAYATHGAYACNAARAARYT.
Oligonucleotides 32A e 32A-1-2 foram preparadas comercialmente (Gibco Life
Technologies) e utilizados para amplificar a região intermediária da LipL32 gene. O
produto de amplificação bp-96 foi radiolabeled por PCR na presença de [32] P dCTP. Os
filtros foram então hibridizado overnight a 42 ° C com sonda radiolabeled. Após a
hibridização, os filtros foram lavados a 42 ° C em 2 × 0,5% SDS-SSC.
Clonagem e sequenciamento do LipL32 gene.

DNA recombinante Standard procedimentos foram realizados conforme descrito
anteriormente (27). digere endonuclease de restrição foram realizadas conforme
recomendado pelos fornecedores (New England Biolabs e Promega). EcoRI fragmentos
de L. kirschneri DNA genômico foram ligados ao vetor Zap II-Lambda (Stratagene). O
DNA foi ligado embalados com embalagem Gigapack II Gold extrato (Stratagene) e
armazenados em clorofórmio, 0,3% a 4 ° C. O título da chapa foi determinada por
infectar E. coli F PLK (Stratagene). Placas foram semeadas, transferidos para filtros em
duplicado, e processadas como descrito anteriormente (15). Os filtros foram testados
com os 96 pb amplificado LipL32 fragmento do gene descrito acima utilizando a mesma
hibridação e lavagem condições no hybridization do sul. pBLUESCRIPT (SK -) clones
recombinantes foram recuperadas a partir de phage produzindo placas positiva na
excisão vivo de acordo com o fabricante. Após o mapeamento de restrição, os
fragmentos de DNA foram devidamente subclonados KS pBLUESCRIPT e seqüenciado
no Core UCLA DNA Sequencing mecanismo pelo método de terminação da cadeia
dideoxy marcado com fluoresceína nucleotídeos dideoxy (Applied Biosystems).
A LipL32 genes de L. borgpetersenii sorovar hardjo cepa 203, L. interrogans sorovar

pomona tensão RZ11, L. noguchii serovar fortbragg tensão Fort Bragg, e L. santarosai
serovar CA299 tensão tropica foram amplificados por PCR com primers P662 (5'-CTA-
AGT-TCA-TAC-CGT-GAT-TT-3 '), a partir 39 pb a montante da LipL32 códon de
iniciação e P663 (5'- ATT-ACT-TAG, TCG-CGT-CAG-AA-3 '), com início em 1 pp a partir
do final de terminação códon na cadeia complementar de DNA. Amplificação foi feita
com TTH polimerase (Clontech, Palo Alto, Califórnia) como segue: 94 ° C por 2 s, 60 ° C
por 1,5 min para 40 ciclos, e, em seguida, 67 ° C por 1 h. O amplificado LipL32 genes de
L. santarosai serovar tropica CA299 tensão e L. borgpetersenii sorovar hardjo linhagem
203 foram seqüenciados diretamente, enquanto o ampliado LipL32 genes de L.
interrogans sorovar pomona tensão RZ11 e L. noguchii serovar fortbragg tensão Fort
Bragg foram clonados em pCRII (Invitrogen, La Jolla, Califórnia) antes de
seqüenciamento. seqüenciamento de DNA foi realizada utilizando terminação da cadeia
de reações corante separados em um Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems,
Foster City, Califórnia) no Estado de Iowa Ácido Nucleico Facility. Os dados da
seqüência foram analisados usando a versão 4.0.2 Sequencher (Genecodes, Ann Arbor,
Michigan). As seqüências foram alinhadas utilizando Clustal_X (37).
Anti-soros.
Anti-soros para OmpL1 e LipL41 foram preparadas como descrito anteriormente (15,
31). Resumidamente, coelhos Nova Zelândia Branco foram imunizados com purificada
Suaseis proteínas de fusão, expressa por E. coli JM109 (Invitrogen) transformada com o
plasmídeo pRSET (Invitrogen), contendo tanto o ompL1 gene ou lipL41 gene (15, 31).
Antissoro preparado para a 2% exterior X-114 Triton membrana extrato de L. interrogans
sorovar pomona tensão RZ11 foi utilizado na análise de immunoblot E. coli pRZ1132K
guarida.
Anti-soro para LipL32 foi preparado como se segue. A PCR foi utilizada para amplificar a
porção da LipL32 gene que codifica a proteína madura começa com o resíduo após a
primeira terminal amino-cisteína. O "oligonucleotídeo 5 contido na seqüência de
nucleotídeos que codificam para os seis aminoácidos na sequência da cisteína amino-
terminal de LipL32 maduro, incluindo um Xhoendonuclease de restrição site I
(sublinhado): 5'-TTA CCG CTC GAG GTG CTT TCG TGC GTG GTC-3 . 3 'O
oligonucleotídeo continha a seqüência de nucleotídeos que codificam para as cinco
carboxi-terminal de aminoácidos e LipL32 códon de parada, incluindo um
Smaendonuclease de restrição site I (sublinhado): 5'-TGT TAA GGG CCC TTA CTT AGT
CGC GTC AGA-3 ' . L. kirschneri DNA genômico foi utilizado como modelo. Os 782 pb
amplificado LipL32 gene foi digerido com XhoI e SmaI e ligados em pRSETc (Invitrogen)
digerido com XhoI e PvuII. O resultado construir, pRSETc-LipL32, foi transformado em
E. coli BLR (DE3) / pLysS (Novagen). Expressão da proteína LipL32 fusão His6 foi
atingido por β-isopropil-Dthiogalactopyranoside (IPTG; Sigma) por indução. A
Suaseis proteína de fusão LipL32 foi solubilizada em 6 M de guanidina e purificado por
cromatografia de afinidade com Ni2 +, ácido nitrilotriacético agarose (Qiagen) e dialisada
em PBS contendo glicerol a 10%, 0,3% Triton X-100 e 0,025% de sódio azida. A
purificada Suaseis proteína de fusão LipL32 foi carregada num gel de poliacrilamida. Após
a eletroforese, o seu6 LipL32 banda, contendo aproximadamente 150 mg de proteína foi
cortada do gel de acrilamida, desidratado, moídos, misturada com adjuvante completo
de Freund, e inoculados por via subcutânea e intramuscular em um Zelândia macho
White Rabbit Novo. imunizações adicionais com cerca de 150 microgramas de
seus seis fusão proteína LipL32 em adjuvante incompleto de Freund foi dado em 4 e 8
semanas após a imunização primária. O coelho foi sangrado 10 semanas após a
imunização primária.
[3] H palmitato radiomarcação e imunoprecipitação de LipL32 nativa.

A cultura de 35 ml contendo 5 × 107 L. kirschneri células por ml na fase log de
crescimento era intrinsecamente marcado por adição de [9,10 (n) -3] H palmitato (250
μCi, 60 Ci / mmol, Amersham), seguido por incubação adicional em uma incubadora
shaker a 30 ° C por 48 h até a concentração de bactérias atingiu 109/ ml. Organismos
foram lavados em 5 mM MgCl2 em PBS. A amostra para imunoprecipitação contendo 8
× 109 L. kirschneri células foi ressuspenso em 1,25 ml de 10 mM Tris HCl (pH 8,0) -10
mM EDTA, 1 mM PMSF. Para esta suspensão foi adicionado 12,5 μl de 10% de proteína
série Triton X-100 (Calbiochem), seguido por agitação suave por 30 min a 4 ° C. O
material insolúvel foi removido por centrifugação a 16.000 × g por 10 min. Para o
sobrenadante foi adicionado 0,2 ml de soro de coelho LipL32 e 0,2 ml de uma
suspensão aquosa de proteína estafilocócica. A-Sepharose CL-4B (Sepharose SpA)
(Sigma). A suspensão foi ligeiramente agitados por 1 h. A-SPA-complexos antígeno-
anticorpo Sepharose foram lavadas duas vezes em 0,1% Triton X-100, em 10 mM Tris
HCl (pH 8,0) -20 mM CaCl2-150 mM NaCl e, em seguida ressuspenso em FSB. Depois
de SDS-PAGE, géis foram preparados para autoradiografia por imersão em Amplify
(Amersham), secos e expostos ao trítio filme (Amersham). Em alguns casos, os géis
foram corados com Coomassie azul brilhante e destained em 10% de ácido acético
45% de metanol antes de ser embebidos em Amplify (Amersham), secos e expostos ao
trítio filme (Amersham).
Triton X-114 de extração de L. kirschneri.

kirschneri L. foi extraída com 1% Triton X-114 por uma modificação do método descrito
anteriormente (18). Em suma, a cultura atenuada L. kirschneri células foram lavadas em
PBS 5 mM, MgCl2 e, em seguida, extraído na presença de 1% de proteína série Triton X-
114 (Calbiochem) -150 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8) -1 mM EDTA a 4 ° C. O material
insolúvel foi removido por centrifugação a 17.000 × g por 10 min. Após a centrifugação,
20 mM CaCl2 foi adicionado à metade do sobrenadante. separação de fases foi
realizada por aquecimento do sobrenadante a 37 ° C e submetê-la a centrifugação por
10 min a 1.000 × g. O detergente e fase aquosa foram separadas e precipitação com
acetona.
Expressão da LipL32 completo em E. coli.

A LipL32 amplicon foi gerado com P662 e P663 primers usando ADN a partir da estirpe
RZ11 e clonado no plasmídeo vetor pCRII (Invitrogen), resultando em pRZ1132K
plasmid. Em pRZ1132K, LipL32 é orientada a jusante do lacZ promotor. E. coli INV?
células que abrigam pRZ1132K ou pCRII foram cultivadas a fase estacionária em caldo
DYT (24). As células foram colhidas por centrifugação e de membrana citoplasmática e
suas frações foram preparadas de acordo com o método de Weigel et al. (38).
Imuno-histoquímica.
Os métodos utilizados para a realização da imunohistoquímica e para obter L.
kirschneride rim de hamster tecido infectado, têm sido descritos previamente (3). Em
breve, a 5 semanas de idade Golden hamsters sírios (Harlan Sprague-Dawley), em
grupos de três, foram inoculados intraperitonealmente com 105 virulenta L. kirschneri
RM52. moribundos hamsters foram sacrificados, o fígado e rim foram retirados, fixados
em formalina e incluído em parafina. Hamsters sobreviver 28 dias após o desafio foram
sacrificados e os tecidos hepáticos e renais foram removidas, fixadas em formalina e
incluído em parafina. Os tecidos foram corados com hematoxilina-eosina e coloração de
prata pela técnica de Steiner e Steiner (32).
Serial-cortes de 5 μm de rim, 10 e 28 dias após a infecção com L. kirschneri foram

cortadas. Os tecidos foram colocados on-Bond slides Pro Plus. Parafina foi removido de
seções com xileno e etanol, utilizando os procedimentos padrão. Os tecidos foram pré-
tratados com tripsina 0,1% em 0,1 M Tris HCl (pH 7,6) com 0,1% de CaCl2 por 5 min a
37 ° C. Coloração inespecífica de cortes de tecido foi bloqueado usando 10% de soro
normal de cabra com incubação em temperatura ambiente por 20 min antes da
incubação overnight a 4 ° C com o anticorpo primário. Anti-soro anti-LipL32 foi utilizado
na diluição 1:6,000. Controles incluídos "primário" de anticorpos negativos, soro de
coelho normal e soro hiperimune em secções de rim de hamsters infectados. Unbound
anticorpo primário foi removido, e os tecidos foram incubados em temperatura ambiente
por 30 min com imunoglobulina biotinilada anti-coelho de cabra (Vector). Após serem
lavados, os cortes foram incubados por 20 min em temperatura ambiente com a
fosfatase alcalina-estreptavidina supersensível (Biogenex). reações enzimáticas foram
desenvolvidos utilizando fucsina nova (Biogenex). Todas as lâminas foram contra
hematoxilina antes de desidratação em álcoois e PROPAR (substituto xileno), e, em
seguida, as lamínulas foram montadas. Esfregaços de organismos de crescer
activamente culturas foram tratados como seções do tecido sem a remoção da
parafina.
ELISA.
soros de convalescentes de cinco pacientes com infecção comprovada por cultura de L.
kirschneri bim sorovar foram usados para comparar o de imunoadsorção enzimática
(ELISA) reatividade com cinco leptospiral Suaseis proteínas de fusão. placas de
microtitulação Immulon (Dynatech) foram revestidas a 37 ° C durante a noite com 125
ng de DNA purificado Suaseis proteínas de fusão de 0,05 M tampão carbonato de sódio
(pH 9,6). As placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% Tween 20,
seguido pela adição de 200 mL de tampão de bloqueio (PBS contendo 0,05% Tween 20
e 1% de leite em pó desnatado), e foram então incubadas a 37 ° C por 1 h . Após a
remoção do tampão de bloqueio, 100 l de soros diluídos 1:100 com tampão de bloqueio
foi adicionado, e as placas foram incubadas a 37 ° C por 2 h. Depois de lavar as placas
três vezes, 100 l de 1:5.000 diluído ovelha anti-imunoglobulina G humana conjugado com
peroxidase (Amersham) foi adicionado, e as placas foram incubadas a 37 ° C por 2 h.
Após três lavagens mais 100 l de 3,3 ','-substrato tetrametilbenzidina 5,5 foi adicionado,
e as placas foram incubadas a 37 ° C por 20 min em um agitador orbital. Em seguida,
100 l de uma solução 1 M de ácido sulfúrico foi adicionado para parar a reação. A
absorbância foi lida em um comprimento de onda de 450 nm com um leitor de
microplaca (modelo 550; Bio-Rad). Cada amostra de soro foi testado quatro vezes
separadas. As leituras de absorvância foram normalizados, subtraindo o valor obtido a
partir de poços de controlo negativo-antígeno. A análise estatística foi realizada por meio
de dois-Student's t teste para amostras com variâncias desiguais.
adesão números de seqüência de nucleotídeos.

A seqüência de nucleotídeos do LipL32 gene de L. kirschneri sorovar grippotyphosa
RM52 estirpe tenha sido depositado no GenBank sob o número de acesso AF121192.
As seqüências de nucleotídeos do LipL32 genes de L. interrogans sorovar pomona
tensão RZ11, L. borgpetersenii sorovar hardjo cepa 203, L. santarosai serovar tropica
CA299 tensão, e L. noguchii serovar fortbragg tensão Fort Bragg foram depositados no
GenBank, sob os números de adesão AF181553, AF181554, AF181555e AF181556,
respectivamente. A seqüência de nucleotídeos do LipL32 gene de L. interrogans sorovar
Lai haviam sido depositados no banco de dados GenBank com o número de adesão
LIU89708.
RESULTADOS
Clonagem e análise da seqüência do LipL32 gene.

Estafilocócica digestão protease V8 de LipL32 resultou em dois fragmentos que
comigrated por SDS-PAGE com uma massa molecular aparente de 20 kDa. Como os
dois fragmentos estão presentes em quantidades desiguais, N-terminal seqüência
análise de aminoácidos da banda 20 kDa revelou duas seqüências: AFKAATPEEKSM e
RHNKYNSLTRIKIPNPPKSFDDLKNIDTKKLL. A PCR-amplificado-sonda de 96 pb com
base na seqüência mais vinculado a um 5,0-kb única banda no EcoRI digere genômico
total de L. kirschneri sorovar grippotyphosa DNA RM52 tensão. Restrição de
mapeamento, Southern blot e seqüenciamento de DNA revelou que todo o LipL32 gene é
codificado pelo 5,0-kb EcoRI fragmento (Fig. 1). Uma pesquisa BLAST do banco de
dados GenBank revelou 99% de genes idênticos cerca de L. interrogans sorovar Lai
(número de acesso GenBank LIU89708) (1; BLAST Sequence Similarity Procurando,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, 1998). O L. interrogans LipL32 homólogo foi isolado
e seqüenciado por Kim et al. em um fragmento de DNA contendo o sphH gene
sphingomyelinase pela triagem de uma biblioteca de fragmentos de DNA de leptospira
através da leptospirose sphA gene como uma sonda (MJ Kim et al. Meet. Int.
Leptospirose Soc., 1996). Além sphH, dois outros genes foram encontrados nas
proximidades LipL32. A BP aberto leitura frame-398 (ORF), ORF-1, está localizado a
232 pb a montante da LipL32. Embora a ORF-1 e LipL32 estão na mesma orientação,
ORF-1 é seguido por uma repetição invertida-bp 15 que pode funcionar como um
independente de transcrição terminator-rho, sugerindo que a ORF-1 e LipL32 não são
cotranscribed. No entanto, E. coli ς70 consenso -35 e -10 regiões promotoras não foram
encontrados a montante da LipL32. Montante da ORF-1 e orientada no sentido oposto é
um gene que é altamente homólogo ao S-adenosilmetionina sintetase genes de uma
variedade de negativas e bactérias gram-positivas grama.
FIG. 1
Seqüência de nucleotídeos e amino ácido seqüência deduzida da LipL32.
O ribossomo-binding site putativo (RBS) é mostrado. O suposto local de
clivagem peptidase sinal é indicado por uma seta. As seqüências de
aminoácidos obtidos a partir da protease V8 estafilocócicas (mais ...)
A LipL32 gene estrutural composto de 816 bases que codificam uma proteína de 272
aminoácidos. Um consenso de ligação local ribossomo (AAGGA) está presente a
montante do códon de iniciação. Uma repetição invertida localizado a 30 pb a jusante do
códon de terminação pode funcionar como um independente de transcrição terminator-
ro. Esta repetição invertida é seguido por uma região de reiterou elementos: a seqüência
bp-12 (AGTTCCCACATT) é repetido quatro vezes após a L. LipL32 kirschneri gene e
seis vezes após a L. interrogans LipL32 gene, assim como perto do L. interrogans
operon de choque térmico (número de acesso GenBank AF007813) e dentro da L.
interrogans elemento de inserção IS1501a (número de acesso GenBank AF038933).
A LipL32 seqüência é altamente conservada entre Leptospira espécies. Além da LipL32

genes de L. kirschneri sorovar grippotyphosa e RM52 cepa L. interrogans sorovar Lai, o
LipL32 genes entre quatro linhagens foram seqüenciados adicionais: L. interrogans
sorovar pomona tensão RZ11, L. noguchii serovar fortbragg tensão Fort Bragg, L.
borgpetersenii sorovar hardjo estirpe 203 e L. santarosai serovar tropica. Comparação
da LipL32 seqüências de DNA de seis cepas de leptospira, o que representa cinco das
sete espécies patogênicas, revela um alto grau de conservação da sequência, com uma
seqüência de DNA identidade média de 96,4% (variação, 93,5-99,6%) (alinhamento
disponíveis mediante solicitação ). A maior parte da seqüência de polimorfismos
detectados (50 de 73) ficaram em silêncio, sugerindo que existe uma pressão evolutiva
para manter a seqüência primária desta proteína. Comparação das sequências de
aminoácidos deduzidas dos seis variantes LipL32 revela uma seqüência de ácido amino
identidade média de 97,8% (variação, 95,2-99,6%) (alinhamento disponíveis mediante
pedido). Os seis LipL32 seqüências de DNA foram utilizados para realizar análises
filogenéticas (Fig. 2). O padrão de segregação encontrado usando LipL32 seqüências é
muito semelhante à que resulta da análise do 16S RNA, que determinou que a
leptospirose patógenos formados três grupos: grupo I foi representado por L. interrogans
e L. kirschneri espécies, o grupo II incluiu L. borgpetersenii e L. santarosai, enquanto o
grupo III consistiu em L. noguchii e L. meyeri (20). A semelhança da LipL32 DNA e 16S
rDNA árvores filogenéticas indicam que as diferenças observadas são seqüência um
resultado de deriva genética.
FIG. 2
Filogenética árvore baseada em LipL32 diferenças seqüência de
nucleotídeos. L. k irschneri sorovar grippotyphosa, L. interrogans sorovar
pomona e L. interrogans sorovar Lai formou um grupo monofilético; um
segundo grupo era formado por L. borgpetersenii sorovar (mais ...)
Como era esperado para uma lipoproteína, o ácido amino seqüência deduzida começa
com um resíduo de peptídeo de sinal 19, representado pelo pico de terminal N de 2,8 a
Doolittle hidrofobicidade-enredo Kyte (dados não mostrados). A seqüência LipL32 em
conformidade com as regras estabelecidas para os peptídeos de sinal de lipoproteína
procaryotic (19, 26). O peptídeo sinal LipL32 tem uma região amino-terminal de base
(incluindo lysines nas posições 2 e 3), um núcleo hidrofóbico (aminoácidos de 4 a 19), e
uma carboxi-terminal sinal ITAC peptidase clivagem II, que é semelhante ao LTAC
lipoproteína sinal de clivagem peptidase de LipL36. Um isoleucina na posição -3 em
relação à cisteína é menos comum que em sinal de leucina peptidase II sítios de
clivagem, mas existem pelo menos oito outros exemplos de isoleucina ocorrendo nessa
posição nas lipoproteínas bacterianas, incluindo OspE, OSPF, ERPG, BBA59 e BBA60
de B. burgdorferi, os ENVC e ExcC de E. colie Lpp20 de Helicobacter pylori (disponível
mediante pedido de alinhamento). Quando a LipL32 é expressa em E. coli, o
processamento é incompleta, e os LipL32 recombinante é igualmente distribuída entre a
membrana citoplasmática e frações da E. coli (dados não mostrados). Este resultado
sugere que a secreção ou LipL32 foi ineficiente no E. coli, que o nível de síntese LipL32
usando pRZ1132K tinha oprimido a E. coli aparato secretor, ou houve uma combinação
de ambos os efeitos.
Após a clivagem do peptídeo sinal amino-ácido, 19 por leptospirose sinal peptidase II, o
polipeptídeo madura teria uma previsão de massa molecular de 27,6 kDa. Estafilocócica
protease V8 é conhecido por unir peptídeos seguintes aminoácidos ácidos. A previsão
de seqüências de aminoácidos aspartato seguintes resíduos 115 e 173 resíduos de
glutamato são idênticos aos obtidos a partir de terminal amino ácido N-seqüenciamento
de fragmentos proteolítica da proteína nativa. Começando no resíduo 161 há um
conjunto incomun de sete resíduos de aspartato em um período de oito aminoácidos,
uma reminiscência conclusão do-aspartato cluster seis LipL36 (16). A estrutura
secundária de LipL32 é previsto para ser de 24% de alfa-hélice e 24% de folhas beta
usando o GOR a predição da estrutura secundária método versão IV (14, PB-I.,
Lyonnais, GOR estrutura secundária IV, http://pbil .ibcp.fr / cgi-bin / NPSA-automat.pl?
page = gor4.html, 1999). A quantia relativamente baixa de estrutura alfa-helicoidal é
consistente com a conclusão de apenas 10 potenciais hélice de estabilização pontes de
sal em conformidade com o "N 4 regra" (23). Isto está em contraste com a LipL41, que
tem 22 pontes de sal potencial e está previsto para ser de 60% de alfa-hélice (31).
Expressão da LipL32 em Leptospira espécies.

o nível ea distribuição da LipL32 expressão immunoblot, análise de endereço To foi
executada em um painel de Leptospira espécie, utilizando antissoro de coelho
imunizado com purificada dele6-LipL32 (Fig. 3). O anti-soro LipL32 é reativa com uma
única banda com massa molecular de 32 kDa, demonstrando a especificidade do anti-
soro LipL32. A massa molecular ea quantidade de LipL32 expresso entre os sete
patogênicos Leptospira espécie é altamente conservadas. LipL32 é expressa
relativamente mesma quantidade de todos os patógenos testados leptospirose. Houve
correlação positiva entre a patogenicidade leptospirose e reatividade com anti-LipL32.
Nenhum LipL32 foi detectado no nonpathogenic Leptospira espécies L. biflexa, L.
meyerie L. wolbachii ou no nonpathogen relacionados L. Illini.
FIG. 3
Immunoblot de um painel de Leptospira espécies obtidas usando anti-
soro LipL32. antissoro LipL32 detectada uma única banda em cada uma
das faixas contendo patogênicos Leptospira espécies. expressão LipL32
é altamente conservada entre os patogênicos Leptospira (mais ...)
Comportamento de LipL32 durante Triton X-114 de extração e separação de

fase.
Analisamos o comportamento de L. kirschneri LipL32 na detergente não-iônico Triton X-
114 (Fig. 4). Descobrimos que a extração da membrana externa de leptospira com
Triton X-114 resultou na solubilização completa da LipL32. Nenhum LipL32 foi visto no
pellet insolúvel em detergente. Quando 20 mM CaCl2 foi adicionado ao dissolvidos,
material em detergente antes da fase de particionamento, LipL32 foi encontrada a
partição exclusivamente para a fase de detergente. Lipoproteínas partição
caracteristicamente no X-114 Triton detergente fase devido à hidrofobicidade dos ácidos
graxos. Em contraste com a LipL41, LipL32 foi encontrado para ser completamente
ausente da fase de detergente em fase de separação foi realizada sem a adição de
CaCl2 . Comparação do azul brilhante de Coomassie gel colorido (Fig. 4A) com o
immunoblot sondada com LipL32 e LipL41 soros (Fig. 4B) demonstra que LipL32 é a
proteína mais importante no perfil de proteínas de leptospira. Os resultados aqui
apresentados por L. kirschneri LipL32 espelho aqueles encontrados com as descritas
anteriormente L. interrogans 31 kDa MOMP, fortemente indicando que eles são a
mesma proteína (41).
FIG. 4
Comportamento de proteínas LipL32 e leptospirose outros Triton X-114.
Triton X-114 frações de L. k irschneri organismos foram separados por
SDS-PAGE e coradas com Coomassie azul brilhante (A) ou sondados
com uma combinação de ambos LipL32 e LipL41 soros (mais ...)
Especificidade do anti-soro LipL32.

A especificidade do anti-soro LipL32 foi demonstrada tanto por unidimensional (Fig. 3) e
bidimensionais (dados não mostrados) immunoblots. Preimmune soro (antes da
imunização de coelhos com proteína recombinante, proteína purificada) foi testado e não
ser reativo com qualquer antígenos (dados não mostrados). O anti-soro LipL32 foi
elaborado pelo mesmo método e com o adjuvante mesma que a utilizada na preparação
de soros específicos para leptospirose várias outras proteínas da membrana externa,
incluindo OmpL1 (15) e as lipoproteínas LipL36 (16) e LipL41 (31). Nossos estudos
anteriores mostram que cada um destes soros reagir apenas com a única proteína
utilizada na imunização e não com o antígeno 32 kDa identificada pelo anti-soro LipL32.
imunoprecipitação experiências prévias mostraram que LipL36 e LipL41 soros
seletivamente immunoprecipitate proteínas da massa molecular correta, em qualquer
dos casos, imunoprecipitação de uma proteína, 32 kDa ocorrer (17, 31). Além disso,
estudos imuno-histoquímica com L. kirschnerisecções de rim de hamster infectados,
demonstraram reatividade diferencial; OmpL1 e LipL41 soros foram positivos, enquanto
soro LipL36 foi negativo (3). Estes resultados confirmam a especificidade do anti-soro
utilizado em nosso imunoprecipitação e ensaios imuno-histoquímica.
L. kirschneri LipL32 acylates.

Intrínseca rotulagem de L. kirschneri com [3] H palmitato resultou na incorporação de
etiqueta em LipL32 leptospiral immunoprecipitated com anti-LipL32 (Fig. 5, pista 1).
Quando um gel de poliacrilamida contendo o mesmo material foi corado com
Coomassie azul brilhante em uma solução contendo 10% de ácido acético, o
immunoprecipitated LipL32 pode ser visualizado (Fig. 5, travessa 3), mas já não era
rotulado (Fig. 5, pista 2), indicando que a ligação química entre [3] H palmitato eo N-
terminal da cisteína LipL32 é instável ácido. Este experimento demonstra também que a
rotulagem intrínseca da LipL32 leptospira com [3] H palmitato não envolve a
incorporação de trítio em vias biossintéticas de aminoácidos.
FIG. 5
LipL32 é acilado por L. k irschneri. LipL32 foi isolado de L. k irschneri
organismos intrinsecamente marcada com [3] H palmitato de extração
com Triton X-100 e imunoprecipitação com anti-LipL32. Lanes 1, de auto-
radiografia immunoprecipitated (mais ...)
Imuno-histoquímica com anti-soro específico para LipL32.

Leptospiras nos túbulos renais proximais dos pontos obtidos 10 e 28 dias após a
infecção virulenta L. kirschneri corados com anti-soro positivo LipL32.
Immunohistochemical visualização de organismos distintos é possível em 10 dias após
a infecção (Fig. 6A). Marcação foi mais intensa aos 28 dias do que em 10 dias, em
correlação com a maior carga de organismos presentes no ponto mais tarde (3). Aos 28
dias após a infecção, os organismos aderentes foram detectados como uma borda
contínua do revestimento de coloração intensa na superfície luminal das células
epiteliais tubulares (Fig. 6B). Em contraste com a distribuição de LPS leptospirose ou
OmpL1 (3), o antígeno LipL32 pouco foi observada nos locais de infiltrado intersticial de
células inflamatórias. Em experimentos de controle, soro de coelho normal não
apresentaram reatividade ao rim seções hamster infectado. secções de rim de hamster
não infectados foram utilizados como controle em um estudo anterior, utilizando soros
de três proteínas de leptospira outros (OmpL1, LipL36 e LipL41), nenhum dos quais
apresentaram qualquer coloração de rim não infectados (3).
FIG. 6
Imuno-histoquímica do tecido renal obtido em 10 dias (A) e 28 dias (B)
postinfection com virulenta L. k irschneri usando anti-soro LipL32.
Antígeno foi detectado no leptospiras dentro do lúmen tubular renal em
ambos os períodos. O aumento de reatividade (mais ...)
A resposta imune humoral às proteínas de leptospira em pacientes com

leptospirose.
soros de convalescentes de cinco pacientes com infecção comprovada por cultura de L.
kirschneri bim sorovar foram usados para comparar a reatividade ELISA com cinco
leptospiral Suaseis proteínas de fusão. Como mostrado na figura. 7, LipL32 e OmpL1
porin foram encontrados para ser mais forte durante a leptospirose imunógenos naturais
de infecção do que os três lipoproteínas leptospiral outros LipL36, LipL41, LipL46 ou (P
<0,05). experimentos de controle com 62 soros humanos normais não encontrou
reatividade ELISA significativa com LipL32 (A. Ko, comunicação pessoal).
FIG. 7
FIG. 7
Anticorpos para L. k irschneri proteínas de membrana externa (PMEs) em
seres humanos com leptospirose. ELISA leituras média de proteínas de
membrana externa de leptospira em soros de convalescentes de cinco
pacientes com leptospirose a partir de Barbados são mostrados. leituras
de controle são (mais ...)
DISCUSSÃO
Neste estudo foram caracterizados LipL32, a proteína mais importante na leptospirose

perfil protéico total, e as principais Triton-114 detergente-proteína de fase X. Extração de
L. kirschneri com os detergentes não-iônico Triton X-100 ou Triton X-114 solubiliza a
leptospirose membrana externa, incluindo o LPS, o porin OmpL1, e as lipoproteínas
LipL36 e Lip41 (15, 16, 18, 31). A especificidade da Triton extração de detergente para a
membrana externa foi avaliada através da demonstração de que a parede celular
leptospirose e morfologia permanecem intactas após a extração e que o controle
endoflagella proteínas, proteínas de ligação à penicilina, e GroEL não extraível nessas
condições. A conclusão de que LipL32 é a leptospirose MOMP é consistente com
achados anteriores de uma banda de destaque de aproximadamente a mesma massa
molecular nos perfis de proteína de membrana externa de leptospira frações isoladas
utilizando a técnica de Auran et al. (2, 10, 25).
Os resultados dos estudos aqui apresentados diferem de forma significativa a partir de

relatórios publicados anteriormente analisar as proteínas da membrana externa de
leptospira pela extração de detergente. Embora, em um estudo anterior, a principal
proteína kDa 32 foi evidente no perfil protéico total de L. kirschneri, que estava ausente
da fase de X-114 detergente Triton porque CaCl2 não foi incluído durante o passo de
particionamento de fase (18). Em um estudo publicado em aproximadamente o mesmo
tempo no organismo intimamente relacionada L. interrogans, Zuerner et al. demonstrado
que CaCl2, ZnCldois ou CuCldois devem estar presentes durante a fase de
particionamento passo para evitar a perda de LipL32 do X-114 fase detergente Triton
(41). No presente estudo, demonstramos que essas são propriedades de LipL32 usando
anti-soro específico para esta proteína (Fig. 4), que foi possível graças ao isolamento da
LipL32 gene ea produção de proteína recombinante purificada utilizada para imunizar
coelhos.
O CaCl2 requisito para a estabilidade da LipL32 não é compreendida. Zuerner et al.

propõe que a perda de LipL32 durante Triton 114 particionamento-X é devido à
degradação por uma protease endógena (41). Neste estudo, verificou-se que CaCl2 não
é necessário até que a temperatura é elevada a 37 ° C para separar o Triton X-114 em
extrato aquoso e detergente fases. Nem a temperatura nem o Triton X-114 são
suficientes apenas para degradar LipL32. Presumivelmente, a combinação de calor e de
resultado detergente em desnaturação da LipL32, que por sua vez, expõe sítios
sensíveis à degradação proteolítica. Não foi possível determinar se foi ou não LipL32
autocatalítico, uma vez que as tentativas de reproduzir a degradação LipL32, usando um
de síntese de proteínas in vitro foram infrutíferas. O efeito protetor do CaCl2 pode
funcionar de várias maneiras. É possível que o Ca2 + ligação é necessária para a
estabilidade conformacional da LipL32. Por outro lado, a constatação de que vários
Triton-114-detergente proteínas de fase X diferente LipL32 também estão parcialmente
ou totalmente perdido do Triton X-114 durante o particionamento extrato fase sem CaCl2
(Fig. 4) sugere que o mecanismo de Ca2 + estabilização é indireta. Por exemplo, tanto a
protease putativa é inibida por Ca2 + ou fosfolipídios leptospirose e / ou LPS associado
com as proteínas da membrana externa de leptospira exigir CaCl2 para a sua
estabilidade. Esta última explicação seria coerente com o papel de cátions divalentes na
manutenção da integridade do E. coli membrana externa. Baseado nesta idéia, seria
esperado que os quelantes de cálcio, tais como EDTA, desestabilizaria a membrana
externa de leptospira. Estudos para elucidar o mecanismo de proteção de CaCl2 seria
esclarecer leptospiral estrutura da membrana exterior ea interação de proteínas da
membrana externa de leptospira com outros componentes da membrana externa.
Outro aspecto importante do método descrito aqui é a inclusão de 150 mM de NaCl no

tampão utilizado na extração inicial de 4 ° C com Triton X-114. Estudos anteriores que
não incluem 150 mM NaCl no tampão de extração descobriu que detergente Triton
extração de proteínas, como OmpL1 e LipL41 foi incompleta (15, 16, 31). NaCl é
provavelmente importante na solubilidade destes e de outros potencialmente leptospiral
proteínas da membrana externa. Com base nas conclusões do presente estudo,
acreditamos que o método de Triton X-114 de extração e separação de fase descrita
aqui e no estudo de Zuerner et al. (41) resulta em isolamento de frações que mais
representam com precisão os componentes da membrana externa de leptospira. Nós
não excluiu a possibilidade de que algumas proteínas da membrana citoplasmática são
extraíveis sob essas condições. Confirmação dos 114 Triton X-solubilização e
abordagem de particionamento de fase exigirá o desenvolvimento de melhores
marcadores da membrana citoplasmática e abordagens independentes para a
separação de membrana citoplasmática da membrana externa.
Neste estudo, nós apresentamos várias linhas de evidência para apoiar a conclusão de
que LipL32 é uma lipoproteína, covalentemente modificadas por ácidos graxos (s) em
seu terminal amino de resíduos de cisteína. O sinal de lipoproteína atípico clivagem
peptidase de LipL32 e LipL32 de clivagem ineficiente expressa em E. coli (dados não
mostrados) são consistentes com a idéia de que a leptospirose peptidase de sinal de
lipoproteína e / ou outros componentes da leptospirose exportação via proteína de
membrana diferem em sua especificidade dos de E. coli (DA Haake, submetido para
publicação). Mesmo que as duas outras lipoproteínas que têm sido descritas em
Leptospira espécies, LipL36 e LipL41, têm um sinal de lipoproteína LXYC clivagem
peptidase, eles também são tratados de forma ineficiente em E. coli menos entre os
aminoácidos leucina e cisteína são alterados em conformidade com aqueles
encontrados no E. coli mureína lipoproteína (17). Como LipL36 e LipL41, LipL32 é
marcado pela rotulagem intrínseca de L. kirschneri por [3] H palmitato. Anterior [3] H
palmitato rotulagem estudos de lipoproteínas de leptospirose foram submetidos à crítica
de que o rótulo de trítio poderiam ter sido incorporado em aminoácidos através da beta-
3
oxidação de [ ] H palmitato. Neste estudo, nós mostramos que, no processo de
coloração LipL32 com Coomassie azul brilhante eo tratamento com ácido acético 10%,
o rótulo de trítio é perdida. Isto é consistente com um ácido-lábil vínculo entre palmitato
eo N-terminal da cisteína, um padrão encontrado em outras lipoproteínas espiroquetas
(8, 33). Outra forma de demonstrar que LipL32 é uma lipoproteína é o seu
comportamento durante a fase de particionamento Triton 114-X. LipL32 partições nativas
seletivamente para a fase de detergente hidrofóbico, um resultado consistente com a
modificação introduzida pelos ácidos graxos hidrofóbicas, enquanto que a recombinação
Suaseis fusão proteína LipL32-terminal sem divisórias lipidation-N para a fase aquosa
hidrófila (dados não mostrados).
Embora haja uma discrepância de> 4 kDa entre a mobilidade observada de LipL32 e sua
massa molecular calculada de 27,6 kDa, acreditamos que a LipL32 dados da seqüência
apresentamos estão corretas. Os 99% de identidade entre a seqüência de nucleotídeos
L. kirschneri LipL32 e outras versões do LipL32 tornam improvável que houve exclusões
interno durante o processo de clonagem. A localização do códon TAA é confirmado pela
repetição invertida localizado a 23 pb a jusante. Uma explicação provável para o mais
lento do que o previsto mobilidade eletroforética de LipL32 é a elevada percentagem de
resíduos de ácido (34 a 253 [13,4%]), o que poderia reduzir SDS vinculativa. Leptospira
LipL41 (31) e T. pallidum TpN34 lipoproteína (34) são dois outros exemplos de
lipoproteínas com altas porcentagens de resíduos de ácido associado com
discrepâncias entre os mobilidade eletroforética observada ea massa molecular
calculada.
Nossos resultados indicam que LipL32 é expresso em níveis elevados, tanto durante o
cultivo e durante a infecção. Algumas proteínas encontradas nos organismos cultivados
em condições de cultura de leptospira não são expressos durante a infecção. Por
exemplo, LipL36 é expresso em níveis elevados por cultivada L. kirschneri , mas não é
detectável quer no interior dos rins hamster infectados por imunohistoquímica ou por
soro de hamsters infectados com derivados de organismos hospedeiros (3, 16). Em
contrapartida, OmpL1 e LipL41 foram detectadas tanto por imuno-histoquímica e por
immunoblot (3). Os resultados aqui apresentados imunoistoquímica indicam que, como
OmpL1 e LipL41, LipL32 é expresso por L. kirschneri dentro dos túbulos renais (Fig. 6).
Além disso, soros de pessoas com leptospirose tinham uma resposta mais forte ao
anticorpo LipL32 do que os quatro membrana leptospirose de outras proteínas (Fig. 7).
Estes resultados sugerem que LipL32 pode ser útil no desenvolvimento de novas
abordagens para o diagnóstico sorológico da leptospirose. Mais estudos são
necessários para definir o tempo de resposta imune humoral a de LipL32 durante o
curso de leptospirose. A pesquisa sobre proteínas da membrana exterior, expresso por
Leptospira spp. durante a infecção é essencial tanto para a compreensão da
patogênese da leptospirose e de desenvolvimento de vacinas. Prevê-se que os
reagentes e os resultados desenvolvidos durante o curso desta investigação, será
possível para elucidar o papel da LipL32 na interação patogênica Leptospira spp. com os
mamíferos.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho foi suportado por um financiamento de um Serviço de Saúde Pública

conceder AI-34431 (para DAH).
Agradecemos Tonia McNunn e Annette Olson para a assistência técnica excelente.
REFERÊNCIAS
1. SF Altschul, TL Madden, AA Schaffer, J Zhang, Zhang Z, W Miller, J. Lipman D BLAST Gapped e PSI-
BLAST: uma nova geração de programas de pesquisa de banco de dados de proteínas. ácidos
nucleicos Res . 1997;25: 3389 - 3402. [PMC livre artigo] [PubMed]
2. Auran NE, Johnson RC, Ritzi D M. isolamento da bainha externa da Leptospira e suas propriedades
imunogênicas em hamsters. Infect Immun. 1972;5:968-975. [PMC livre artigo] [PubMed]
3. Barnett JK, Barnett D, Bolin CA, Summers TA, Wagar EA, cheville NF, Hartskeerl RA, Haake D A.
Expressão e distribuição da leptospirose exterior componentes da membrana durante a infecção renal
de hams ters . Infect Immun. 1999;67: 853 - 861. [PMC livre artigo] [PubMed]
4. Bergs trom S, Bundoc VG, G. Barbour A análise molecular do plasmídeo linear codificado proteínas
principais de superfície, OspA e OSPB, da doença de Lyme espiroqueta Borrelia b urgdorferi. Mol
Microbiol. 1989;3:479-486. [PubMed]
5. Bolin CA, Cassells JA, Zuerner RL, Trueba G. Efeito da vacinação com a vacina monovalente
Leptospira interrogans sorovar hardjo tipo hardjo-bovis vacina do tipo hardjo-bovis infecção do gado. Am
J Vet Res . 1991;52:1639-1643 . [PubMed]
6. Bolin CA, AB Thiermann, Handsaker AL, Foley J W. Efeito da vacinação com a vacina pentavalente
leptos pirose em Leptospira interrogans sorovar hardjo tipo hardjo-bovis infecção de vacas prenhes. Am J
Vet Res . 1989,50:161-165. [PubMed]
7. Bolin CA, Zuerner RL, Trueba G. Efeito da vacinação com a vacina pentavalente com leptospirose
Leptospira interrogans sorovar hardjo tipo hardjo-bovis do tipo hardjo-bovis infecção do gado. Am J Vet
Res. 1989;50:2004-2008. [PubMed]
8. Brandt ME, Riley BS, Radolf JD, Norgard M V. imunogênicas proteínas integrais da membrana de
Borrelia burgdorferi são lipoproteínas. Infect Immun. 1990,58:983-991. [PMC livre artigo] [PubMed]
9. DJ Brenner, Kaufmann AF, Sulzer KR, Steigerwalt AG, Rogers FC, Weyant R S. Além disso
determinação de parentesco entre os sorogrupos DNA e sorovares da família Leptospiraceae com uma
proposta de Leptospira sp alexanderi. novembro e quatro novos Leptospira genomospecies. Int J Syst
Bacteriol. 1999;49(Pt 2.) :839-858. [PubMed]
10. Brown JA, Lefebvre RB, M J. Pan proteínas e os perfis de antígeno de sorotipos prevalentes de
Leptospira interrogans. Infect Immun. 1991;59:1772-1777. [PMC livre artigo] [PubMed]
11. Burman N, Bergstrom S, Restrepo B I, Barbour A G. The variable antigens Vmp7 and Vmp21 of the
relapsing fever bacterium Borrelia hermsii are structurally analogous to the VSG proteins of the African
trypanosome. Mol Microbiol. 1990;4:1715–1726. [PubMed]
12. Chamberlain N R, Brandt M E, Erwin A L, Radolf J D, Norgard M V. Major integral membrane protein
immunogens of Treponema pallidum are proteolipids. Infect Immun. 1989;57:2872–2877.
[PMC free article] [PubMed]
13. Chamberlain N R, DeOgny L, Slaughter C, Radolf J D, Norgard M V. Acylation of the 47-kilodalton
major membrane immunogen of Treponema pallidum determines its hydrophobicity. Infect Immun.
1989;57:2878–2885. [PMC free article] [PubMed]
14. Garnier J, Gibrat J-F, Robson B. GOR secondary structure prediction method version IV. Methods
Enzymol. 1996;266:540–553. [PubMed]
15. Haake D A, Champion C I, Martinich C, Shang E S, Blanco D R, Miller J N, Lovett M A. Molecular

cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein
of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 1993;175:4225–4234. [PMC free article] [PubMed]
16. Haake D A, Martinich C, Summers T A, Shang E S, Pruetz J D, McCoy A M, Mazel M K, Bolin C A.

Characterization of leptospiral outer membrane lipoprotein LipL36: downregulation associated with late-
log-phas e growth and mammalian infection. Infect Immun. 1998;66:1579–1587. [PMC free article]
[PubMed]
17. Haake D A, Mazel M K, McCoy A M, Milward F, Chao G, Matsunaga J, Wagar E A. Leptospiral outer
membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infect Immun.
18. Haake D A, Walker E M, Blanco D R, Bolin C A, Miller M N, Lovett M A. Changes in the surface of
Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 1991;59:1131–
1140. [PMC free article] [PubMed]
19. Hayas hi S, Wu H C. Lipoproteins in bacteria. J Bioenerg Biomembr. 1990;22:451–471. [PubMed]
20. Hookey J V, Bryden J, Gatehouse L. The use of 16S rDNA sequence analysis to investigate the
phylogeny of Leptospiaceae and related spirochaetes. J Gen Microbiol. 1993;139(Pt. 11):2585–2590.
[PubMed]
21. Johnson R C, Harris V G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low
temperatures. J Bacteriol. 1967;94:27–31. [PMC free article] [PubMed]
22. Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature (London). 1970;227:680–685. [PubMed]
23. Marqus ee S, Baldwin R L. Helix stabilization by Glu−…Lys+ salt bridges in short peptides of de novo
des ign. Proc Natl Acad Sci USA. 1987;84:8898–8902. [PMC free article] [PubMed]
24. Miller J H. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli
and related bacteria. Plainview, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1992.
25. Nunes-Edwards P L, Thiermann A B, Bassford P J, Jr, Stamm L V. Identification and characterization

of the protein antigens of Leptospira interrogans serovar hardjo. Infect Immun. 1985;48:492–497.
26. Pugs ley A P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev.
27. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring
Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory; 1989.
28. Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the
separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987;166:368–379. [PubMed]
29. Shang E S, Exner M M, Summers T A, Martinich C, Champion C I, Hancock R E W, Haake D A. The rare
outer membrane protein, OmpL1, of pathogenic Leptospira species is a heat-modifiable porin. Infect
Immun. 1995;63:3174–3181. [PMC free article] [PubMed]
30. Shang E S, Skare J T, Exner M M, Blanco D R, Kagan B L, Miller J N, Lovett M A. Isolation and
characterization of the outer membrane of Borrelia hermsii. Infect Immun. 1998;66:1082–1091.
31. Shang E S, Summers T A, Haake D A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding
LipL41, a s urface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 1996;64:2322–
2330. [PMC free article] [PubMed]
32. Steiner G, Steiner G. New simple silver stain for demonstration of bacteria, spirochetes, and fungi in
sections of paraffin-embedded tissue blocks. J Lab Clin Med. 1944;29:868–871.
33. Swancutt M A, Radolf J D, Norgard M V. The 34-kilodalton membrane immunogen of Treponema

pallidum is a lipoprotein. Infect Immun. 1990;58:384–392. [PMC free article] [PubMed]
34. Swancutt M A, Riley B S, Radolf J D, Norgard M V. Molecular characterization of the pathogen-specific,

34-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum. Infect Immun. 1989;57:3314–3323.
35. Thiermann A B. Leptospirosis: current developments and trends. J Am Vet Med Assoc. 1984;184:722–
725. [PubMed]
36. Thiermann A B, McClellan R D, Hill H T. Improved techniques for the isolation of leptospires from
swine abortion cases. Ann Proc Am Assoc Vet Lab Diagn. 1984;27:233–244.
37. Thomas W, Sellwood R. Molecular cloning, expression, and DNA sequence analysis of the gene that
encodes the 16-kilodalton outer membrane lipoprotein of Serpulina hyodysenteriae. Infect Immun.
37a. Thomps on J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins D G. The CLUSTAL_X windows

interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids
Res. 1997;25:4876–4882. [PMC free article] [PubMed]
38. Weigel L M, Belisle J T, Radolf J D, Norgard M V. Digoxigenin-ampicillin conjugate for detection of

penicillin-binding proteins by chemiluminescence. Antimicrob Agents Chemother. 1994;38:330–336.
39. Yelton D B, Charon N W. Cloning of a gene required for tryptophan biosynthesis from Leptospira
biflexa serovar patoc into Escherichia coli. Gene. 1984;28:147–152. [PubMed]
40. Zuerner R L, Herrmann J L, Saint Girons I. Comparison of genetic maps for two Leptospira
interrogans serovars provides evidence for two chromosomes and intraspecies heterogeneity. J Bacteriol.
41. Zuerner R L, Knudtson W, Bolin C A, Trueba G. Characterization of outer membrane and secreted
proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 1991;10:311–322. [PubMed]
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A Leptospira Major Proteína de Membrana Externa LipL32

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A Leptospira Major Proteína de Membrana Externa LipL32

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26/7/2010 The Leptospiral Major Outer Membrane…

Copyright © 2000, Sociedade Americana de Microbiologia

A leptospira Major proteína de membrana externa LipL32 é

David A. Haake,1,2* Garlo Chao,um Richard L. Zuerner,3 Jeanne K.

Recebido 02 de setembro de 1999; revisões solicitadas 03 de novembro de 1999; Aceito 04 de

Este artigo foi citado por outros artigos em PMC.

Nós relatamos a clonagem do gene que codifica a lipoproteína de 32 kDa, denominada

A leptospirose é considerada a zoonose mais difundida no mundo (Centers for Disease

Por causa das deficiências de vacinas baseadas LPS, os componentes da proteína de

Muitas das proteínas mais abundantes em espiroquetas são lipoproteínas, incluindo

(Partes deste trabalho foram apresentados na 99a Reunião Geral da Sociedade

estirpes bacterianas, mídia e plasmídeos.

eletroforese em gel e immunoblotting.

Amino ácido seqüenciamento de um fragmento polipeptídico interno.

Clonagem e sequenciamento do LipL32 gene.

A LipL32 genes de L. borgpetersenii sorovar hardjo cepa 203, L. interrogans sorovar

[3] H palmitato radiomarcação e imunoprecipitação de LipL32 nativa.

Triton X-114 de extração de L. kirschneri.

Expressão da LipL32 completo em E. coli.

Serial-cortes de 5 μm de rim, 10 e 28 dias após a infecção com L. kirschneri foram

adesão números de seqüência de nucleotídeos.

Clonagem e análise da seqüência do LipL32 gene.

A LipL32 seqüência é altamente conservada entre Leptospira espécies. Além da LipL32

Expressão da LipL32 em Leptospira espécies.

Comportamento de LipL32 durante Triton X-114 de extração e separação de

Especificidade do anti-soro LipL32.

L. kirschneri LipL32 acylates.

Imuno-histoquímica com anti-soro específico para LipL32.

A resposta imune humoral às proteínas de leptospira em pacientes com

Neste estudo foram caracterizados LipL32, a proteína mais importante na leptospirose

Os resultados dos estudos aqui apresentados diferem de forma significativa a partir de

O CaCl2 requisito para a estabilidade da LipL32 não é compreendida. Zuerner et al.

Outro aspecto importante do método descrito aqui é a inclusão de 150 mM de NaCl no

Este trabalho foi suportado por um financiamento de um Serviço de Saúde Pública

Agradecemos Tonia McNunn e Annette Olson para a assistência técnica excelente.

15. Haake D A, Champion C I, Martinich C, Shang E S, Blanco D R, Miller J N, Lovett M A. Molecular

16. Haake D A, Martinich C, Summers T A, Shang E S, Pruetz J D, McCoy A M, Mazel M K, Bolin C A.

19. Hayas hi S, Wu H C. Lipoproteins in bacteria. J Bioenerg Biomembr. 1990;22:451–471. [PubMed]

25. Nunes-Edwards P L, Thiermann A B, Bassford P J, Jr, Stamm L V. Identification and characterization

33. Swancutt M A, Radolf J D, Norgard M V. The 34-kilodalton membrane immunogen of Treponema

34. Swancutt M A, Riley B S, Radolf J D, Norgard M V. Molecular characterization of the pathogen-specific,

37a. Thomps on J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins D G. The CLUSTAL_X windows

38. Weigel L M, Belisle J T, Radolf J D, Norgard M V. Digoxigenin-ampicillin conjugate for detection of

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