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BIIO
OLLO
OGGIIC
CAA IIII

Laboratorio N 1
Tema: EVALUACIN DEL EFECTO DEL FLUORURO COMO
INHIBIDOR DE LA GLUCLISIS ANAERBICA

Contenidos conceptuales: Gluclisis. Etapas. Gluclisis en condiciones

anaerbicas. Inhibidores.

Contenidos procedimentales: Toma de muestra de sangre por venipuntura.

Determinacin enzimtica de glucosa en suero y plasma por mtodos colorimtricos,
con y sin inhibidor de gluclisis a diferentes tiempos.

Contenidos actitudinales: Integracin en trabajo grupal. Predisposicin para la

resolucin de problemas con espritu crtico y rigor cientfico. Bioseguridad en el
laboratorio. Autoconfianza. Precisin, sistematizacin y coherencia en los
planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas.

Objetivos:
Adquirir destreza en venipunturas.
Verificar el efecto del inhibidor F en la va glucoltica.
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FACENA, UNNE 2013

Fundamentos Tericos
El uso de inhibidores enzimticos ha posibilitado el estudio de secuencias
especficas y de metabolitos intermedios. Cuando una enzima es inhibida, se
establece un bloqueo o interrupcin de una va metablica, se acumula el sustrato
correspondiente de esa enzima, y eventualmente otros intermediarios que preceden a
la reaccin bloqueada. Adems, puede ocurrir con frecuencia la falta de sntesis final
de compuestos vitales para las clulas (Ej. ATP), lo que en ltima instancia conduce a
la muerte celular.
MECANISMO DE
ENZIMA INHIBIDOR
INHIBICIN
Compuestos sulfhidrilos,
Hexoquinasa (HK) fenilalanina
EDTA, citrato, oxalato Complejacin
Glucoquinasa (GK) EDTA, citrato, oxalato Complejacin
ATP, cidos grasos de Condiciones energticas
Fosfofructoquinasa I (PFK I) cadena larga, fenilalanina elevadas
Citrato Complejacin

Proceso fosfoltico inhibido

Metales pesados (arsnico,
por arseniato que compite
Gliceraldehdo-3-fosfato- mercurio)
con el fosfato inorgnico
deshidrogenasa (G3PD)
Agentes alquilantes
Bloqueo del sitio activo
(yodoacetato)
Formacin del complejo
Enolasa Fluoruro
fluorfosfato de magnesio
Formacin de un complejo
Calcio inactivo por competencia
2+ 2+
con Mg y Mn
ATP, AG de cadena larga, Condiciones energticas
Piruvatoquinasa PK heptica alanina, acetilCoA elevadas
(PK)
Citrato Complejacin

Glucagn y adrenalina Fosforilacin

PK muscular Fenilalanina

Piruvato en altas
Lactato deshidrogenasa (LDH)
concentraciones

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Esquema de la va glucoltica:

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El uso de inhibidores naturales de tipo metablico o artificiales con reacciones

espontneas no enzimticas puede constituir una herramienta para el estudio de los
metabolismos celulares.
Nota: La glucemia disminuye un 30% por hora sino se conserva la muestra con
inhibidor, debido a que los eritrocitos consumen glucosa.

Materiales y mtodos Gradillas

Guantes descartables Marcador
Jeringas de 5 ml y agujas para Centrfuga
venipuntura de 23/8 (estriles,
descartables) Bao a 37 C

Lazo de goma Micropipeta automtica de 10

l
Alcohol y algodn
Pipetas de vidrio de 1 ml
Anticoagulante EDTA-F-
Propipetas
Anticoagulante Heparina
Kit de reactivos para
Descartador de agujas determinacin de glucemia
Lavandina Reloj o timer
Tubos de hemlisis Espectrofotmetro

Precauciones:
Las muestras se tomarn siguiendo las normas de bioseguridad; con guantes,
jeringas y agujas descartables bajo la supervisin de los docentes.
Las muestras de sangre se recogern con anticoagulante heparina, EDTA-F
comercial y sin anticoagulante. Esta se colocar en bao a 37 C hasta
retraccin del cogulo; luego se centrifugar 5 minutos a 1000 rpm, y por ltimo
se separar la mitad del suero en otro tubo, dejando el resto con el paquete
globular.
A. Tubo 1: Suero
B. Tubo 2: Suero + Paquete globular
C. Tubo 3: Plasma con Heparina + Paquete globular. Proporcin: 50 l de
Heparina para un mximo de 5 ml de sangre
D. Tubo 4: Plasma con EDTA-F + Paquete globular. Proporcin: 20 l de
EDTA-F- para un mximo de 2,5 ml de sangre, o 50 l de EDTA-F- para
un mximo de 7 ml de sangre.
Cada comisin realizar los pipeteos utilizando la misma micropipeta, con el
mismo tipo de tip (punta de pipeta), y si es posible debe ser llevada a cabo por
el mismo operador.
Cada comisin realizar las diferentes incubaciones en el mismo bao de
agua.
Cada comisin llevar a cabo las lecturas en el mismo espectrofotmetro y
utilizando la misma celda.

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Mtodo
Determinacin de glucemia (mtodo enzimtico)

Fundamento:
GOD
Glucosa + O2 + H2O c. glucnico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinonimina roja + 4 H2O

Ref.: GOD: Glucosa-oxidasa; 4-AF: 4-amino-fenazona; POD: peroxidasa

Procedimiento:

B S D
Estndar - 10 ul -
Muestra - - 10 ul
Reactivo 1 ml 1 ml 1 ml

Incubar 5 minutos en bao de agua a 37 C o 25 minutos a 15-25 C. Luego leer en

espectrofotmetro a 505 nm o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm),
llevando el aparato a cero con el blanco.

Estabilidad de la mezcla de reaccin final:

El color de reaccin final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser
leda dentro de este lapso.

Clculo de los resultados:

[Glc] (g/l) = AD x [S] [S] = 1.00 g/l

AS Ref.: Glc: Glucosa; D: Muestra; S: Estndar

Valores de referencia de glucemia en ayunas para el mtodo enzimtico: 0,7-1,1g/l.

Experiencia:
Determinar glucemia basal en todas las muestras.
Determinar glucemia a la hora y 2 horas de realizada la extraccin en todas las
muestras.

Informe
Basal (Hora: : ) 1hora (Hora: : ) 2 horas (Hora: : )
Absorbancia Concentracin Absorbancia Concentracin Absorbancia Concentracin
S
1
2
3
4

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Conclusiones:
1) Qu diferencia espera de la absorbancia entre las muestras con y sin agregado del
inhibidor?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
2) Se confirman los resultados esperados? Analice las posibles causas de error.
Tubo 1: .............................................................................................................................
Tubo 2: .............................................................................................................................
Tubo 3:..............................................................................................................................
Tubo 4:..............................................................................................................................

3) Calcule el porcentaje de variacin de la glucemia en las muestras a diferentes

tiempos y complete la siguiente tabla, eligiendo la Condicin de acuerdo a la validez y
comparabilidad de las lecturas para los diferentes tubos en dos tiempos, p. ej. [(Basal-
2da hora)/Basal] x 100, o [(Basal-1ra hora)/Basal] x 100.

Tubo n Condicin % de variacin

Bibliografa:

- Bioqumica de Harper. Murray R. B. 17ma edicin. Editorial Manual Moderno. 2007.

- Bioqumica. Roscoski. Ed. Mc. Graw Hill. 3ra edicin. 2000. Captulo 25.
- Qumica Biolgica. Blanco A. 9na edicin. Editorial El Ateneo. 2011.

Alumno: .......................................... Comisin N: ...... Grupo: ...... Fecha: ..../..../....