PRACTICA N5

DEGRADACION Y SINTESIS DE NUCLEICOS

OBJETIVOS:

Degradar los cidos nucleicos presentes en el DNA.

Determinar a qu pH se ve afectado el DNA y el RNA.

MARCO TEORICO:

Hay dos soluciones tampn muy usadas para separacin de fragmentos de ADN mediante
electroforesis, son el buffer TBE y buffer TAE, que slo se diferencian en un compuesto, cido
brico y cido actico respectivamente.
COMPONENTES:

Tris (Tris-(hidroximetil)-aminometano): Molcula responsable del tamponamiento.

Regulacin del pH.
cido Brico/cido Actico : contribuye a ajustar el pH deseado e igual que el
anterior, a mantenerlo.
EDTA (cido Etilendiaminotetraactico): quelante de cationes divalentes, cuya
funcin es secuestrar Mg2+, con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes
degraden el ADN de la muestra, ya que la mayora de las nucleasas requieren de Mg2+
como cofactor.

DIFERENCIAS ENTRE EL BUFFER TBE Y TAE:

Migracin: El TAE es mejor para el anlisis electrofortico de fragmentos grandes de

ADN (900 2000bp) ya que corren ms rpido y tiene mayor capacidad de
discriminacin en un gel de agarosa a 0.8%. Mientras que en TBE para fragmentos
pequeos de ADN (100 500bp) corren ms rpido y tiene mayor capacidad de
discriminacin en gel de agarosa al 2%.
Capacidad tamponante: el TBE es ms estable y tiene una capacidad tampn ms alta
que el TAE.
Reciclaje: el TAE no aguanta ms de 3 corridas de electroforesis seguidas sin alterar
sus propiedades, mientras que el TBE dura 3 o 4 das independientemente de las
corridas de electroforesis realizadas.
Recuperacin del ADN: el TBE tiene una interaccin pegajosa con la agarosa, lo que
provoca una recuperacin baja del ADN.

FACTORES QUE DETERMINAN LA ESTRUCTURA DEL DNA

La estructura helicoidal del DNA se mantiene gracias a interacciones no covalentes. Por un lado, el
apilamiento entre las bases adyacentes de una misma hebra favorece interacciones
hidrofbicas entre stas, y por otro lado, cada base est unida a su pareja mediante puentes de
hidrgeno. La energa libre de las interacciones no covalentes que mantienen la estructura helicoidal
del DNA no es muy superior a la energa de los movimientos trmicos a temperatura ambiente, por lo
que es posible desestabilizar la estructura tridimensional del DNA mediante un simple aumento de la
temperatura.
Cuando se calienta un DNA de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de unin entre las dos hebras
y acaban por separarse. Por tanto, el DNA desnaturalizado es de una sola hebra. La transicin entre el estado
nativo y el desnaturalizado se conoce como desnaturalizacin. En determinadas condiciones, una disolucin
de DNA monocatenario (desnaturalizado), puede volver a formar el DNA nativo (de doble hebra). Este proceso
recibe el nombre de renaturalizacin del DNA. Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de molculas
de DNA de distinto origen, o entre una molcula de DNA y otra de RNA, la renaturalizacin se conoce
como hibridacin

DESNATURALIZACIN DEL ADN

La desnaturalizacin del ADN consiste en la separacin de las dos hebras que puede lograrse
mediante el calor.

Cuando una solucin de ADN doble helicoidal se calienta por encima de una temperatura
determinada, las dos cadenas se separan y las propiedades del ADN se alteran, este proceso se
conoce como desnaturalizacin del ADN; de esas propiedades, la ms til para seguir el
desarrollo del proceso es la absorcin de luz ultravioleta.

Los anillos aromticos absorben la luz ultravioleta con menor intensidad cuando estn apilados
en la doble hlice que cuando estn libres en disolucin; ese aumento de absorcin luminosa,
que puede llegar a ser hasta de 40 % en todas las longitudes de onda, recibe el nombre de efecto
hipercrmico.

De acuerdo con la estructura de la doble hlice, la alteracin de un sector de la molcula

potencializa la desestabilizacin de un sector mayor, o sea, el proceso de desnaturalizacin tiene
un carcter cooperativo; esto se evidencia porque el efecto hipercrmico ocurre en un rango
estrecho de temperatura (Fig. 11.14).

Fig. 11.14. Desnaturalizacin del ADN. Una doble hebra de ADN se calienta, y los pares de
bases comienzan a separarse de forma cooperativa. Al final, las dos hebras estn totalmente
separadas. En eso consiste la desnaturalizacin del ADN.
Este fenmeno puede describirse como la fusin de un slido monodimensional, las grficas
obtenidas del proceso se refieren como curvas de fusin y la temperatura de su punto medio se
conoce como temperatura de fusin, que se simboliza por T m. La estabilidad del ADN y, por
tanto, su Tm dependen de varios factores como la naturaleza del solvente, el tipo y concentracin
de los iones, as como el valor del pH. Si estos factores se mantienen constantes y solo se vara
el ADN, entonces Tmes una funcin lineal creciente del contenido de pares GC, lo que indica la
mayor estabilidad de estos, unidos por tres puentes de hidrgeno, que de los pares AT unidos
solo por dos.

Una vez que el ADN ha sido desnaturalizado se hace descender lentamente la temperatura hasta
casi 25 oC por debajo de Tm, las dos cadenas vuelven a unirse por completo; este fenmeno
recibe el nombre de renaturalizacin.

Este proceso de desnaturalizacin-renaturalizacin es el fundamento de las tcnicas de

hibridacin, que permiten identificar secuencias especficas en el ADN, para ello se procede de
la forma siguiente:

1. Se obtiene un polinucletido marcado de forma radiactiva (usualmente con 32P) que

contiene la secuencia de bases especfica de nuestro inters.
2. Se desnaturaliza el ADN problema y cuando las dos hebras estn separadas se aade el
polinucletido que sirve de sonda.
3. Se procede entonces a la renaturalizacin; si el ADN contiene una secuencia de bases
complementaria a la sonda se aparear con esta y la doble cadena podr identificarse
por la presencia del 32P.
4. Pueden emplearse tambin como sonda, polirribonucletidos; si la sonda es pequea
(100 nucletidos) solo se aparear a un sector estrictamente complementario, pero si es
muy grande pueden aparearse cadenas, sin que exista la complementaridad perfecta.
Estas sondas son tiles en la localizacin de secuencias de ADN parecidas (no
exactamente iguales) a la sonda. La importancia de este procedimiento se ver ms
adelante.

MATERIALES Y METODOS

Experimento 1

Degradacion y sintesis de Ac. Nucleicos

Para la elaboracin de pHs en 3 beakers medir la cantidad de 10 ml de suero fisiolgico el cual

se encuentra a un pH de 7, en nuestro caso utilizaremos pHs de 1 de 7 y de 10 para lo cual
usaremos el HCl para acidificarlo y el NaOH para que llegue a un pH alcalino.
Luego en un tubo eppendorf colocar 10 ml del DNA con 10 ml del pH y dejar reposar por 15
minutos

Una vez que haya pasado este tiempo tomar 10 l de DNA y mesclar con 1 ml de PBS sobre
una parafina seguidamente colocarlo en el pocillo del gel de agarosa para su respectiva corrida.
Finalmente llevas el gel de agarosa a la luz UV

RESULTADOS

La mejor lectura de corrida se visualiz en ph 10 por lo que podemos concluir que el DNA se
degrada mejor en este ph .

DISCUSIN

Porque al usar el buffer TBE no se logr visualizar bien la corrida a diferencia de otros
grupos en los que si se logr visualizar

Al utilizar sybr Green que es otro tipo de colorante que se puede utilizar para la electroforesis y
la cuantificacin de DNA este al parecer no funciono de igual manera que el utilizamos en
prcticas anteriores

Los diferentes colorantes reveladores y Ph que utilizamos afectaran la visualizacin de la

corrida de electroforesis

CONCLUSIONES
 El pH que afecta ms al DNA es el pH acido de 1, debido a que hace que se rompan el
enlace glucosidico de este mismo; mientras que para el ARN es ms resistente que el
DNA en este pH.
En el pH de neutro (7) el DNA no se ve afectado; el ARN solo se afecta un poco.
En el ph de 11 la molecula de DNA es mas resistente a la hidrolisis; caso contrario lo
que sucede con el ARN el cual se hidroliza totalmente.

BIBLIOGRAFIA:

http://www.fcnym.unlp.edu.ar/aabra/Actas2009/Hidalgo%20et%20al..pdf

https://antoniogomezmartin.wordpress.com/2012/03/08/preparacion-tbe-tae/

http://www.ehu.eus/biomoleculas/an/an42.htm

http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0prelicin--00-0----0-10-0---0---
0direct-10---4-------0-1l--11-es-50---20-help---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-8-
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