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Manual Bsico de

Tcnicas Fitopatolgicas
Laboratrio de Fitopatologia
Embrapa Mandioca e Fruticultura

Eliane Mazzoni Carollo


Hermes Peixoto Santos Filho
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Mandioca e Fruticultura
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Manual Bsico de
Tcnicas Fitopatolgicas
Laboratrio de Fitopatologia
Embrapa Mandioca e Fruticultura

Eliane Mazzoni Carollo


Hermes Peixoto Santos Filho

Embrapa
Braslia, DF
2016
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:

Embrapa Mandioca e Fruticultura


Rua Embrapa - s/n, Caixa Postal 007
44380-000, Cruz das Almas, Ba
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Embrapa Mandioca e Fruticultura

Comit de publicaes da Embrapa Mandioca e Fruticultura


Presidente: Francisco Ferraz Laranjeira Barbosa
Secretria-executiva: Lucidalva Ribeiro Gonalves Pinheiro
Membro: urea Fabiana Apolinrio Albuquerque
Clvis Oliveira de Almeida
Eliseth de Souza Viana
Tullio Raphael Pereira de Pdua
Cicero Cartaxo de Lucena
Jacqueline Camolese de Arajo
Leandro de Souza Rocha
Fabiana Fumi Cerqueira Sasaki
Reviso de texto: Aldo Vilar Trindade
Normalizao bibliogrfica: Lucidalva Ribeiro Gonalves Pinheiro
Projeto grfico e Editorao eletrnica: Anapaula Rosrio Lopes
Tratamento de imagem: Victor Pereira Brito
Foto da 1 capa: Leandro Rocha
Foto da 4 capa: Hermes Peixoto Santos Filho

1a edio
On-line (2016)

Todos os direitos reservados


A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Embrapa Mandioca e Fruticultura
Carollo, Eliane Mazzoni.
Manual bsico de tcnicas fitopatolgicas / Eliane Mazzoni Carollo, Hermes Peixoto
Santos Filho. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura BA, 2016.
109 f. il. ; 9,50 cm x 13,0 cm.

1. Fitopatologia. 2. Doena de plannta. Santos Filho, Hermes Peixoto. II. Ttulo.

CDD: 632.3
Embrapa 2016
Autores
Eliane Mazzoni Carollo
Engenheira Qumica, DSc. em Qumica, analista da
Embrapa Agrobiologia, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Hermes Peixoto Santos Filho


Engenheiro-agrnomo, mestre em Microbiologia
Agrcola, pesquisador da Embrapa Mandioca e
Fruticultura, Cruz das Almas, BA, Brasil.
Apresentao
Muitas vezes o conhecimento tcito, de alta valia
para os trabalhos de rotina de um laboratrio, se
perde por absoluta falta de um simples registro.
Aquela dica que poderia significar sucesso
ou insucesso de um experimento, conhecida
somente por pessoas do ramo e com larga
experincia no dia a dia, raramente repassada
junto com protocolos simplificados existente,
principalmente, nos artigos cientficos. Essa
publicao vem de certa forma cumprir esse
papel, detalhando os procedimentos de rotina
de um laboratrio de fitopatologia, desde
daqueles conceitos bsicos sobre o tema at
o uso de equipamentos. Tudo com o intuito de
dar ao leitor a exata ideia de como lidar com as
metodologias prticas da fitopatologia.
Desejamos a todos uma boa leitura, certos
que propiciar muito sucesso nos trabalhos
laboratoriais.
Alberto Duarte Vilarinhos
Chefe-geral da Embrapa Mandioca e Fruticultura
Sumrio
Introduo................................................................... 11
Princpios e Conceitos Bsicos
sobre doenas de plantas........................................... 12
Conceitos bsicos da fitopatologia................................... 12
Sintomatologia......................................................................... 14
Sintomas mais comuns associados
s doenas de plantas........................................................................ 14
Tipologia de danos em plantas........................................... 18
Dano Potencial......................................................................................... 19
Dano Real................................................................................................... 19
Dano Real Direto.................................................................................. 19
Dano Real Indireto............................................................................... 20
Caractersticas funcionais do
Laboratrio de Fitopatologia..................................... 21
O Laboratrio............................................................................ 21
Gesto em Laboratrio.......................................................... 22
Biossegurana, rotinas, manuteno bsica
de equipamentos e instrumentos e
verificao de registros.......................................................... 24
Biossegurana....................................................................................... 24
Tarefas de rotinas para a manuteno do Laboratrio.......... 28
Verificao de registros..................................................................... 31
Fatores de riscos segurana,
inerentes ao Laboratrio....................................................... 32
Produtos qumicos.............................................................................. 32
Produtos biolgicos............................................................................ 33
Tcnicas Fitopatolgicas..............................................36
Desinfeco e esterilizao ................................................. 36
Conceitos...............................................................................................36
Tcnica de esterilizao por calor....................................... 37
Flambagem.......................................................................................... 37
Esterilizao a calor mido (Autoclave)..................................... 41
Cuidados com a Autoclave............................................................. 44
Procedimento de operao da Autoclave................................ 45
Esterilizao a calor seco (forno Pasteur).................................. 46
Procedimento de operao do forno Pasteur......................... 47
Zona de esterilidade (cmara de fluxo laminar)........... 50
Procedimento de operao
da cmara de fluxo laminar.................................................. 52
Fatores associados ao cultivo de micro-organismos .... 54
Luz........................................................................................................... 55
Temperatura........................................................................................ 57
Aerao................................................................................................. 58
Ph............................................................................................................ 59
Nutrio................................................................................................ 59
Incubao dos micro-organismos
(estufa de germinao tipo B.O.D.).................................... 61
Procedimento de operao da
estufa de germinao tipo B.O.D........................................ 63
Meios de cultura ....................................................................... 64
Classificao dos meios de cultura.............................................. 66
Procedimento de preparo de meio de cultura ....................... 69
Diagnose de doenas de plantas ........................................ 72
Diagnstico de doenas desconhecidas................................... 74
Postulados de Koch ou Regras
de prova de patogenicidade........................................................... 74
Isolamento de micro-organismos fitopatognicos ...... 76
Aspectos Gerais.................................................................................. 76
Mtodos bsicos de isolamento................................................... 77
Isolamento direto...............................................................................77
Vantagens do isolamento direto....................................................78
Procedimento para o isolamento direto..................................................78
Isolamento indireto.................................................................................... 79
Procedimento para o isolamento indireto............................................ 81
Mtodos de inoculao de
micro-organismos fitopatognicos ............................................85
Propsito da inoculao artificial..........................................................86
Mtodos de inoculao.............................................................................86
Esporos a seco como inculo................................................................... 87
Suspenso de esporos ou de miclio triturado como inculo............ 87
Para fungos no cultivveis em meios de cultura.............................. 88
Para fungos cultivveis em meios de cultura....................................... 88
Procedimento de inoculao de fungos fitopatognicos............89
Clculo da concentrao do inculo....................................................92
Suspenso de inculo injetada no caule............................................95
Inoculao com cilindros ou cubos de
cultivos artificiais contendo miclio do patgeno..........................96
Infestao de solo e inoculao de razes..........................................97
Exame microscpico ........................................................................99
Procedimento de operao de microscpio.................................. 101
Referncias........................................................................ 105
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 11
Introduo
Este manual foi elaborado com o objetivo
de servir como uma fonte de consulta a ser
utilizada para auxiliar e orientar funcionrios,
estagirios, bolsistas e outros usurios e clien-
tes que se interessem pelo aprendizado de
tcnicas em anlises fitopatolgicas, envolvi-
das no desenvolvimento de metodologias de
identificao dos agentes causais de doenas
em plantas, das condies ambientais neces-
srias para o seu desenvolvimento e tambm,
do manuseio de materiais e equipamentos
envolvidos na marcha analtica.

O texto foi construdo a partir de consultas a


documentos, livros, trabalhos cientficos e pro-
cedimentos operacionais padro do Labora-
trio de Fitopatologia da Embrapa Mandioca
e Fruticultura. A publicao est dividida em
trs captulos. O primeiro apresenta os princ-
pios e conceitos bsicos sobre as doenas de
plantas; no segundo captulo so abordadas
as caractersticas funcionais do laboratrio,
12
incluindo biossegurana e manuteno bsi-
ca de equipamentos; e no terceiro, so des-
critas as tcnicas fitopatolgicas adotadas
para isolamento, identificao e diagnstico
de patgenos.

Princpios e Conceitos Bsicos


sobre as doenas de plantas
Conceitos bsicos da fitopatologia
O termo fitopatologia originrio de trs
palavras gregas (Phyton = planta, vegetal),
(Pathos = doena) e (Logos = estudo, tratado),
podendo ser definida como a cincia que es-
tuda a interao entre planta, doena e meio
ambiente, estabelecendo deste modo os m-
todos de preveno e controle. Portanto, Fito-
patologia a cincia que estuda as doenas
de plantas, abrangendo todos os seus aspec-
tos, desde a diagnose, sintomatologia, etiolo-
gia, epidemiologia, at o seu controle.

Segundo Whetzel citado por Kimati e


Bergamim Filho (1995), doena em planta
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 13
consiste de uma atividade fisiolgica injuriosa,
causada pela irritao contnua provocada
por fator causal primrio, exibida atravs de
atividade celular anormal e expressa atravs
de condies patolgicas caractersticas,
chamadas sintomas. Portanto um processo
dinmico no qual o hospedeiro (planta) e
o agente causal, denominado de patgeno
(fungos, bactrias, vrus, etc.), em ntima
relao com o ambiente, se influenciam
mutuamente, resultando modificaes
morfolgicas e fisiolgicas.

No novo texto da Conveno Internacional


para Proteo de Plantas (CIPP 2006)
pragas e doenas devem ser consideradas,
conjuntamente, como pragas. O conceito
oficial de praga ento estabelecido fica
sendo: qualquer espcie, raa ou bitipo de
vegetais, animais ou agentes patognicos,
nocivos aos vegetais ou produtos vegetais,
compreendendo animais (insetos, caros e
nematoides) e doenas (causadas por fungos,
bactrias, vrus e viroides).
14
Sintomatologia
a parte da fitopatologia que estuda os
sintomas e sinais que caracterizam uma de-
terminada doena na planta. Sintomas: so
reaes da planta (hospedeiro) ante qualquer
manifestao de agentes nocivos. Sinais: so
estruturas do patgeno quando exterioriza-
das no tecido doente (BERGAMIN FILHO apud
SALGADO; AMORIM, 1995).
Sintomas mais comuns
associados s doenas de plantas
Anasarca extravasamento de contedo
celular, que resulta em reas de aspecto
encharcado;
Cancro leses necrticas, formando de-
presses nos tecidos corticais dos caules,
tubrculos e razes;
Clorose ausncia parcial ou total da co-
lorao verde normal. Os rgos afetados
podem se tornar verde-amarelado, ama-
relados ou mesmo esbranquiados;
Galha desenvolvimento anormal de
tecidos resultantes da hipertrofia (super-
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 15
crescimento de clulas) e, ou, hiperplasia
(multiplicao excessiva de clulas);
Gomose exsudao de goma a par-
tir de leses, principalmente em caules
ou frutos;
Mancha as manchas so mais comuns em
folhas, mas tambm podem ocorrer em flo-
res, frutos ou ramos. O sintoma resulta da
morte dos tecidos que se tornam secos e
pardos. Dependendo da doena, as man-
chas foliares tm formas variadas, podendo
ser irregulares, angulares, circulares, etc;
Mosaico reas clorticas intercaladas
com reas de verde mais escuro, observa-
das principalmente em folhas;
Murcha perda de turgescncia de folhas,
pecolos e hastes suculentas, decorrente
da obstruo do sistema vascular ou
destruio do sistema radicular;
Necrose escurecimento de tecido resul-
tante da morte/ desintegrao de clulas;
Podrido morte e desintegrao de te-
cidos, decorrente da atividade enzimtica
de fitopatgenos; as podrides podem
16
ser adjetivadas como: midas, secas, fir-
mes, brancas, marrons, etc.;
Pstula pequena mancha necrtica
(geralmente menor do que 1,0 cm), com
elevao da epiderme, que se rompe
por fora da produo e exposio de
esporos fngicos;
Requeima ou crestamento necrose re-
pentina de rgos areos (folhas, flores
e brotaes);
Tombamento (ou damping-off ) tom-
bamento ou morte de mudas, resultante
da podrido dos tecidos tenros da base
de seu caulculo. Se a podrido ocorrer
antes da emergncia da planta, haven-
do reduo no estande de semeadu-
ra, diz-se que houve tombamento em
pr-emergncia;
Verrugose crescimento excessivo de te-
cidos epidrmicos e corticais, geralmente
modificados pela ruptura e suberificao
das paredes celulares, originando leses
salientes e speras, em frutos, tubrculos
e folhas.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 17
A interao dos fatores patgeno, hospe-
deiro e ambiente essencial para a ocorrncia
de doenas em plantas. Entretanto, a severi-
dade das doenas infecciosas pode ser maior
ou menor, dependendo de outros fatores que
compem os vrtices do tringulo, represen-
tados na Figura 1 A. Na agricultura moderna o
homem um fator to importante no manejo
das doenas que os autores propem a figu-
ra de um tetraedro, ao invs de um tringulo,
para melhor representar as interaes entre
fatores predisponentes ocorrncia de uma
doena (Figura 1 B) (AGRIOS, 2005).

A B Homem
Patgeno
Hospedeiro
Tempo
Doena
Patgeno
Ambiente Hospedeiro Ambiente

Figura 1. Diagrama esquemtico das inter-relaes


dos fatores envolvidos em epidemias de doenas de
plantas: Tringulo epidemiolgico (A); Tetraedro de
doena de plantas ou pirmide de doenas (B).
18
Tipologia de danos em plantas
Os danos causados pelos patgenos s
plantas podem gerar efeitos dos mais diversos
e significativos. Segundo Zadoks e Schein,
citados por Bergamin Filho e Kimati, (1995)
a tipologia de danos ajuda a identificar e
delimitar os tipos e variedades de plantas que
podem desenvolver doenas em determinada
rea geogrfica, minimizar o impacto
agronmico imediato e no comprometer a
capacidade futura de produo. A tipologia
de danos causados por patgenos inclui
danos potenciais e danos reais (Figura 2).

Dano Potencial Dano Real

Ausncia Medidas
Danos Indiretos Danos Diretos

Danos Primrios Danos Secundrios

Figura 2. Esquema da tipologia de


danos causados por doenas de plantas.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 19
Dano Potencial
Dano que pode ocorrer na ausncia de
medidas de controle
Dano Real
o dano que j ocorreu ou que ainda est
ocorrendo.

O Dano Real divide-se em dois grupos:


Dano real direto e Dano real indireto:
Dano Real Direto
Afeta a quantidade ou qualidade do
produto ou ainda a capacidade futura
de produo. Divide-se em dois grupos:
dano real direto primrio e dano real direto
secundrio.
Dano real direto primrio o dano cau-
sado na pr-colheita e ps-colheita de
produtos vegetais devidos s doenas de
plantas. Eles ocorrem desde a estocagem
das sementes, passando pela germinao,
crescimento da planta, colheita, manu-
seio e estocagem do produto colhido.
20
Dano real direto secundrio o dano
cuja causa o patgeno veiculado pelo
solo ou disseminado por rgos de pro-
pagao vegetativa (sementes, tubrcu-
los, ext.) de seu hospedeiro. Incluem-se
aqui tambm os patgenos que debili-
tam, usualmente, pela desfolha prematu-
ra de seus hospedeiros.
A tipologia de danos entre o causador do
dano (patgeno) e quem sofreu o dano
(planta) envolve um efeito direto que afeta
o produtor e o consumidor do produto.
de extrema relevncia, avaliar o efeito dos
possveis danos para gerar produtos em
quantidades desejveis e com qualidade.

Dano Real Indireto


Compreende os efeitos econmicos e so-
ciais das doenas de plantas que esto
alm do impacto agronmico imediato,
podendo ocasionar danos no mbito do
produtor, da comunidade rural, do consu-
midor, do Estado e do ambiente.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 21
Caractersticas funcionais do
Laboratrio de Fitopatologia
O Laboratrio
O Laboratrio de Fitopatologia da Embra-
pa Mandioca e Fruticultura est instalado em
ambiente amplo, claro e arejado, destinado,
prioritariamente, a realizar pesquisas refe-
rentes ao manejo integrado de doenas de
mandioca e das fruteiras prioritrias abacaxi,
banana, citros, mamo e maracuj. O labora-
trio tambm realiza prestao de servios a
clientes externos e internos por meio de uma
clnica fitopatolgica instituda para tal e cre-
denciada junto ao MAPA pela Portaria 267, de
07/06/2010 (DOU n108 de 09/06/2010, Se-
o 1, pgina 3) para anlises de diagnstico
fitossanitrio de doenas de plantas.

O laboratrio ocupa uma rea de 204 m2


e possui vrios ambientes, nos quais se en-
contram uma sala para o recebimento de
amostras, sala do supervisor tcnico, sala do
22
responsvel pela qualidade, sala de bolsistas/
estagirios e uma minibiblioteca contendo
livros especficos e peridicos sobre fitopato-
logia; sala de isolamento com duas cmaras
de fluxo laminar, salo de experimentao
com arquivos de material herbarizado, sala de
balanas material didtico sala de micros-
copia, sala de esterilizao de vidrarias e sala
de descarte de resduos; sala de geladeiras e
estufas de germinao tipo B.O.D. e sala de
distribuio de material necessrio aos proce-
dimentos de pesquisa desenvolvidos e acom-
panhados no laboratrio de fitopatologia. Em
apoio aos trabalhos de laboratrio, a Embrapa
Mandioca e Fruticultura dispe tambm de
uma casa de vegetao.

Gesto em Laboratrio
Em trabalhos de pesquisa e principalmente
em condies de laboratrio, os cuidados e
a ateno devem ser contnuos. Para isto, os
usurios devem conhecer os riscos sade,
a segurana relacionada com o manuseio de
produtos qumicos e os riscos envolvendo
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 23
equipamentos e rea de circulao de modo
que se use das disposies, procedimentos
que minimizem os riscos e se tenha cincia
das aes emergenciais eficientes.

Antes do uso de qualquer tcnica emprega-


da no laboratrio e da manipulao de qual-
quer equipamento, o operador deve ser capaz
de identificar os pontos crticos da operao,
que estaro disponveis nos procedimentos
operacionais tcnicos do laboratrio.

O supervisor tcnico (ST), o responsvel da


qualidade (RQ) do laboratrio ou qualquer
outro funcionrio credenciado para tal, deve
transmitir orientaes e treinar os usurios
do laboratrio de fitopatologia em todas as
atividades realizadas, inclusive as medidas de
segurana aplicveis ao ambiente para evitar
retrabalho e prevenir acidentes.

A instituio da qual o laboratrio faz par-


te tem a obrigao de contribuir para a ma-
nuteno das instalaes em conformidade
com as regras de segurana e a manuteno,
24
reviso e calibrao dos equipamentos em con-
dies ideais para a execuo dos trabalhos,
promover treinamentos e capacitao de pes-
soas que realizam os ensaios e o uso de equi-
pamentos; alm de garantir o funcionamento
do laboratrio e a segurana dos usurios com
os equipamentos de proteo individual (EPIs)
e os equipamentos de proteo coletiva (EPCs).

Biossegurana, tarefas de
rotina, manuteno bsica de
equipamentos e instrumentos
e verificao de registros
Biossegurana
Neste caso, entenda-se biossegurana
como sendo o conjunto de aes voltadas
para a preveno, proteo do usurio (prtica
padro) e minimizao de riscos inerentes s
atividades e prestao de servios. Este foco
de ateno retorna ao ambiente ocupacional
e amplia-se para a proteo ambiental e a
qualidade. No centrado em tcnicas de
DNA recombinante, se baseia em tcnicas
para ensaios microbiolgicos que levem
identificao das doenas de plantas com
segurana e sem contaminaes ao usurio e
ao material identificado.

A seguir esto relacionadas algumas prticas


padro que regulamentam o procedimento do
usurio no laboratrio de fitopatologia levan-
do-se em considerao a biossegurana se-
gundo o Ministrio da Sade. Vide documento
Normas e Manuais tcnicos do MS, 2004.

O uso do jaleco indispensvel e deve ser


utilizado somente dentro do ambiente do
laboratrio e nunca fora dele;
Usar somente calado fechado e vestu-
rio que no oferea risco, tipo: vestidos e
saias esvoaantes;
Manter presos os cabelos compridos;
No usar bon, anis, pulseiras, brincos,
relgios e/ou qualquer adereo que seja
um meio de contaminao, principalmen-
te, quando usar a cmara de fluxo laminar;
26
No usar aparelhos sonoros e eletrni-
cos pessoais no laboratrio como celular,
rdio, notebook entre outros;
No guardar alimentos e bebidas em re-
frigerador, armrio, gaveta ou qualquer
compartimento que esteja no interior
do laboratrio;
No comer ou beber no interior do labo-
ratrio;
Evitar apoiar-se na bancada do laborat-
rio. Sempre haver risco de presena de
resduos qumicos ou contaminantes bio-
lgicos;
Limpar o laboratrio, uma vez que qual-
quer matria estranha pode ser uma
fonte de contaminao. Deve-se prestar
ateno para evitar a contaminao cru-
zada provocada por diferentes itens utili-
zados no laboratrio, como por exemplo:
troca de material com outros usurios, vi-
draria que no esteja corretamente limpa
e esterilizada;
necessrio manter sempre os equipa-
mentos limpos e desligados aps o uso;
No manuseio de micro-ondas vetado o
uso de material que contenha papel alu-
mnio ou metais;
No tocar a mucosa bucal, nasal ou ocular
durante as atividades prticas;
No pipetar com a boca; utilizar sempre
pipetador ou dispositivos similares;
No utilizar vidraria quebrada ou trincada;
Ter cuidado com o manuseio de bisturi,
principalmente, na troca de sua lmina.
Colocar a lmina descartada em recipien-
te prprio de descarte na bancada do la-
boratrio;
Manter os resduos gerados no labora-
trio de fitopatologia na sala de resdu-
os para evitar contaminaes cruzadas.
Quando o recipiente de resduos estiver
com 75% de seu volume ocupado, este
deve ser vedado, identificado de acordo
com POP 014.2.4.00.3.001 de rotulagem,
28
colocar na sada de descarte de resduos e
solicitar sua retirada ao SGL (Setor de Ges-
to de Laboratrios) (EMBRAPA, 2010a);
manipular com cuidado vidraria, algodo
e outros embebidos em lquido e que es-
tejam prximos chama;
Manipular os EPIs sempre de acordo com
as recomendaes do laboratrio de fito-
patologia, contidas em POPs ou em ou-
tros documentos;
No tocar em maanetas para abrir ou
fechar portas, no atender telefone e no
manipular reas do corpo com luvas que
estejam sendo utilizadas nos ensaios;
Fazer, obrigatoriamente, a assepsia das
mos antes e aps as atividades.

Tarefas de Rotina para a


manuteno do laboratrio
Separar previamente o material neces-
srio para cada experimento, evitando
maiores transtornos e perda de tempo;
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 29
Etiquetar ou anotar com caneta retro-
projetor todo material separado para
o ensaio;
Identificar sempre com data de realiza-
o, nome do usurio e o tipo de material
em estudo;
Limpar a rea da bancada a ser utilizada
com lcool ou desinfetante neutro;
Rotular adequadamente os frascos
com solues de acordo com POP
014.2.4.00.3.001 (EMBRAPA MANDIOCA E
FRUTICULTURA, 2010A);
Armazenar os produtos qumicos e as
substncias txicas em condies de se-
gurana e o seu manuseio feito sempre
com luva prpria e outros EPIs exigidos
para a atividade;
Ao trmino das atividades: seguir as reco-
mendaes abaixo:
Vidrarias, como placas de Petri: deixar
de molho por 1 hora em soluo com
sabo em p ou detergente e com o
auxlio de uma escova de limpeza ou
30
esponja de ao, retirar o excesso de res-
duos; enxaguar em gua corrente vrias
vezes, e depois em gua deionizada. As
demais vidrarias, lavar com o auxlio de
escova prpria, detergente, enxaguar e
colocar para secar em estufa;
Vidraria de difcil limpeza como pi-
petas e lminas manchadas de corante:
deixar por mais tempo submersa em
gua ligeiramente acidificada (soluo
de cido clordrico, 0,5%) e depois pro-
ceder lavagem e esterilizao quan-
do necessria;
Aps limpeza e esterilizao, cobrir com
papel alumnio a abertura da vidraria;
Lavar a pia aps us-la; evitar jogar ma-
terial usado na pia e os resduos embru-
lhar em papel jornal e colocar no cesto
de lixo especfico;
Lavar, secar e repor, no seu devido lugar,
o material empregado no ensaio;
Manter o laboratrio sempre limpo e
organizado.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 31
Verificao de Registros
O uso de cada equipamento deve ser
registrado em ficha prpria conforme Figura 3,
que deve ficar ao lado do equipamento a ser
usado, para as devidas anotaes, (Figura 4).

Os registros dos resultados analticos devem


ser anotados em caderno prprio ou, no caso
da Clnica Fitopatolgica, na ficha de entrada
de amostra e na ficha de acompanhamento
do POP do ensaio que se faa necessrio para
a identificao do patgeno e o diagnstico
final da doena, que acompanha o laudo.

Figura 3. Modelo de ficha prpria para


balana semianaltica.
32

Foto: Leandro Rocha


Figura 4. Disposio da
ficha, prpria para anotao
de uso e documento do
Procedimento Operacional
Padro (POP) para uso da
balana semianaltica,
prximo ao equipamento.

Fatores de riscos segurana,


inerentes ao Laboratrio
Produtos qumicos
O preparo e manuseio de algumas solues
e substncias txicas sem a observncia dos
procedimentos adequados podem causar
consequncias graves. Antes do manuseio de
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 33
qualquer substncia qumica imprescindvel
a leitura da Ficha de Informaes de Segurana
de Produtos Qumicos (FISPQ). Qualquer
substncia txica deve ser controlada a fim
de prevenir a inalao de vapores, gases e
partculas (fumaas, poeiras e aerossis). Essas
substncias devem ser manipuladas sempre
com EPIs e EPCs apropriados.
Produtos biolgicos
Embora a maioria dos fitopatgenos no
seja patognica ao homem, alguns micro-
-organismos oportunistas podem ser aciden-
talmente dispersados. Os colaboradores que
apresentem alguma condio ou enfermida-
de relacionada ao comprometimento imuno-
lgico ter sua permanncia em atividades de
bancada condicionada avaliao mdica.

sempre bom lembrar que no laboratrio


de fitopatologia so recebidos tecidos ve-
getais sintomticos para diagnose sem ter,
muitas vezes, o conhecimento prvio se o ma-
terial foi pulverizado com defensivos qumi-
cos ou se o possvel agente causal, at ento
34
desconhecido, pode ocasionar leses ou aler-
gias ao manipulador, devendo-se sempre pre-
ferir o seu manuseio usando EPIs apropriados,
como luvas e mscaras.

A estrutura fsica do laboratrio de fitopato-


logia adequada para trabalhos com produtos
biolgicos com classificao de risco 1, de acor-
do com classificao da Organizao Mundial
da Sade (MANUAL, 2004), o que permite o
baixo risco individual e coletivo dos seus usu-
rios, ante micro-organismos infecciosos.

Tabela 1. Classificao de micro-organismos


infecciosos por grupo de risco segundo a OMS.
Grupo de Risco 1 (nenhum ou baixo risco individual
e coletivo)
Um micro-organismo que provavel-
mente no pode causar doena no
homem ou num animal.

Grupo de Risco 2 (risco individual moderado, risco


coletivo baixo)
Um agente patognico que pode
causar uma doena no homem ou
no animal, mas que improvvel
continua...
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 35
...continuao.
que constitua um perigo grave para
o pessoal de laboratrios, a comuni-
dade, aos animais ou ao ambiente. A
exposio a agentes infecciosos no
laboratrio pode causar uma infeco
grave, mas existe um tratamento efi-
caz e medidas de preveno e o risco
de propagao de infeco limitado.

Grupo de Risco 3 (alto risco individual, baixo risco


coletivo)
Um agente patognico que causa
geralmente uma doena grave no
homem ou no animal, mas que no se
propaga habitualmente de uma pes-
soa a outra. Existe um tratamento efi-
caz, bem como medidas de preveno

Grupo de Risco 4 (alto risco individual e coletivo)


Um agente patognico que causa
geralmente uma doena grave no ho-
mem ou no animal e que se pode trans-
mitir facilmente de uma pessoa para
outra, direta ou indiretamente. Nem
sempre est disponvel um tratamento
eficaz ou medidas de preveno

Esta condio fiscalizada, acompanhada


e consolidada juntamente com a Comisso
Interna de Preveno de Acidentes (CIPA) da
Embrapa Mandioca e Fruticultura.
36
Tcnicas Fitopatolgicas
Desinfeco e esterilizao
A desinfeco e a esterilizao fazem parte
da marcha analtica e a especificidade da des-
contaminao depender do tipo de procedi-
mento que desenvolvido no laboratrio e o
agente infeccioso manipulado.

Conceitos
Desinfeco a eliminao dos germes
patognicos sem que haja necessaria-
mente a destruio de todos os micro-
organismos por meios fsicos ou qumicos.
Esterilizao do material consiste num
processo utilizado para destruir todos os
micro-organismos nele existente.
Antissepsia (anti-contra, septse-putre-
fao) o uso de substncias capazes
de impedir a proliferao de micro-
organismos.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 37
Assepsia o conjunto de meios emprega-
dos para impedir proliferao de micro-or-
ganismos em local que no os contenha.

No tratamento prvio para fins de desin-


feco e antissepsia, em geral, faz-se uso de
produtos qumicos. No laboratrio de Fitopa-
tologia do CNPMF utilizado hipoclorito de
sdio (NaClO) 0,5 % por 5 minutos, em segui-
da lcool etlico (CH3CH2OH) a 70% por mais
5 minutos e, por fim, gua estril.

As tcnicas de esterilizao podem utilizar


mtodos fsicos ou mtodos qumicos. Os m-
todos fsicos envolvem a tcnica de esteriliza-
o por calor, que pode ser seco ou mido e
flambagem; e os mtodos qumicos utilizam
reagentes qumicos como lcoois, sais de ha-
lognios e xidos. A esterilizao pelo calor
o mais eficaz agente esterilizante e pode ser
empregado por diferentes formas:
38
Tcnica de esterilizao por calor
Flambagem
Flambagem o meio mais simples de se
esterilizar um instrumento metlico ou de
vidro (pina, estilete, ala de platina, placa
de Petri e outros) passando-o vrias vezes
pela chama de um bico de Bunsen (ZAUZA
et al, 2007).

Flambagem em Ala de platina


Tanto a ala de platina quanto o fio de
platina devem ser flambados antes e depois
de qualquer operao de semeadura ou
inoculao de micro-organismos. Para
tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a
parte inferior do cabo deve ser passada
na chama 2 a 3 vezes e sempre molhando
no lcool PA. A posio correta para a
flambagem da ala mant-la a um ngulo
de 45 em relao mesa de trabalho,
incidindo a parte a ser esterilizada no cone
interno da chama do bico de Bunsen (Figura
5). Para retirar o material, seja para fazer um
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 39

Foto: Leandro Rocha


Figura 5. Posio correta
para a flambagem da
ala de platina.

esfregao ou para uma semeadura, esfriar


previamente a ala de platina.

Flambagem de placas de Petri ou tubos


Toda vez que fizer uma semeadura ou ino-
culao de micro-organismos utilizando
tubos de ensaio, tubos de rosca ou frascos
do tipo erlenmeyer ou placa de Petri (Figura
6) deve-se flambar a abertura dos mesmos
imediatamente aps a retirada da tampa
(ou tampo de algodo ou a tampa de vidro
da placa). A tampa deve ser mantida segu-
ra pelo dedo mnimo da mo e deixada na
40
posio entreaberta. Caso esteja repicando
a cultura para outro tubo ou placa de Petri,
o mesmo procedimento deve ser feito, com
este outro tubo, antes da inoculao dos
micro-organismos. Inclinar sempre e aproxi-
madamente 30. No caso de tubo, este deve
ficar de preferncia na horizontal. Aps a re-
tirada do material com ala ou pipeta, flam-
bar novamente a boca do tubo ou da placa
de Petri, vrias vezes, colocar o tampo no
tubo, a tampa na placa de Petri e fechar ime-
diatamente com fita de policloreto de vinila
(PVC).
Foto: Leandro Rocha

Figura 6. Posio
correta para flambagem
de placa de Petri.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 41
Esterilizao a calor mido (Autoclave)
A autoclave um equipamento muito efi-
ciente para a esterilizao de diversos mate-
riais como vidrarias, plsticos autoclavveis,
meios de cultura e tambm para a destrui-
o de micro-organismos antes de procedi-
mento de descarte. (Figura 7).
Foto: Leandro Rocha

Figura 7.
Autoclave vertical.
42
A esterilizao a calor mido consiste no
tratamento trmico mido ou via vapor
saturado cuja funo , mediante o con-
trole da presso de vapor da gua, favo-
recer temperaturas superiores a 100 C,
ou de forma inversa, controlando a tem-
peratura, favorecer presses superio-
res atmosfrica; o seu poder de pene-
trao muito grande e faz com que o
micro-organismo sofra coagulao das
protenas levando-o morte (ZAUZA
et al., 2007)

A presso utilizada de um (1) atm (1 kgf/cm2)


em geral, a 121C por 15 minutos ou mais.
O tempo mnimo para a esterilizao
adequada de lquidos de 15 minutos para
50 mL; 20 min para 75 mL; 25 min para
250 mL; 30 min para 500 mL; 35 min para
1000 mL e 45 min para 1500 mL ou mais.
Se permanecer o lquido a ser esterilizado
na autoclave por tempo excessivo, conten-
do meio com gar, o gar hidrolisado,
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 43
resultando um meio espesso por vezes ini-
bidor. Os materiais difceis de serem aque-
cidos (leo, solo, semente e p) devem ser
esterilizados em pequenas quantidades,
durante perodos mais longos. O perodo
de tempo deve ser aumentado tambm
no caso de materiais altamente contamina-
dos. Como exemplos de uso da autoclave,
tm-se a esterilizao de placas de Petri,
tubos de ensaio, microtubos, ponteiras,
meios de cultura, papis toalha, pipetas
manuais, etc. No entanto, como medida
de segurana ou para evitar estragos com
os materiais e meios de cultura a serem es-
terilizados, alguns cuidados devem ser se-
guidos com o manuseio do equipamento.
Para tal, consultar sempre que necessrio
o procedimento operacional padro da Au-
toclave vertical, POP 014.2.4.06.4.003, que
se encontra no laboratrio de fitopatologia
(EMBRAPA, 2012b).
44
Cuidados com a Autoclave
O
material a ser autoclavado deve ser co-
locado no cesto de forma a no encher
demais a autoclave (evitar preencher o
cesto acima de 2/3 de sua capacidade);
no colocar fita de PVC em vidraria; fe-
char os frascos com algodo ou com pa-
pel alumnio.
O
s resduos gerados em placas de Petri
ou em outro tipo de material devem ser
esterilizados antes do seu descarte e pos-
terior lavagem. Mas, antes retirar a fita
de PVC de toda a vidraria, colocar tudo
em saco plstico prprio, fechar o saco e
identific-lo com nome e o tipo de res-
duo para autoclavagem.
A
ps a esterilizao do resduo gerado,
preferencialmente quente, retirar o mes-
mo com a ajuda de uma esptula de pls-
tico, colocar em uma folha de jornal e des-
cartar no lixo convencional e, caso haja no
meio de cultura alguma substncia con-
siderada txica, o resduo ser colocado
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 45
no prprio saco plstico da esterilizao e
descartado em um recipiente prprio na
sala de descarte.

Procedimento de operao da Autoclave


Verificar o nvel recomendado de gua
dentro do equipamento antes de colocar
qualquer material;
Colocar a cesta de inox com o mate-
rial a ser esterilizado no interior do vaso
de presso;
Fechar a tampa da autoclave, colocar as
travas na posio recomendada e fech
las, duas a duas, em posio diagonal;
Abrir a vlvula de alvio de presso, que
fica no conjunto de vlvulas, girando
sempre no sentido anti-horrio;
Ligar a autoclave girando a chave seleto-
ra at a posio mxima (MX);
Ligar o sistema de exausto do ambiente;
Fechar a vlvula de alvio, sempre que
ocorrer a sada de vapor intermitente,
46
sempre utilizando EPIs (luvas de raspa de
coco e culos de proteo);
Aguardar alguns minutos at a presso
e a temperatura atingirem os valores de-
sejados para a esterilizao, indicado no
manmetro, girando a chave seletora
para a posio mdia (MED);
Desligar a autoclave aps decorrer o tem-
po estipulado para a esterilizao.
Esterilizao a calor seco (Forno Pasteur)
O equipamento denominado de Forno
Pasteur (Figura 8) utiliza um processo de
esterilizao com calor a seco, e muito
empregado ao esterilizar materiais como
instrumentos metlicos e vidrarias, que
muitas vezes no podem ser submetidos
ao calor mido.

Em geral, as temperaturas necessrias para


a esterilizao so maiores (em torno de
120 C e 180 C), assim como, os tempos
de exposio (a partir de uma hora),
diferentemente dos tempos empregados
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 47
na autoclave, uma vez que o poder de
penetrao do calor seco menor que
o do calor mido e o maior tempo de
exposio leva os micro-organismos
morte por oxidao, ou seja, um processo
de desidratao dos seus ncleos celulares
(ZAUZA et al, 2007).

Cuidados devem ser seguidos com o


manuseio do equipamento, para tal,
consultar sempre que necessrio o
procedimento operacional padro do Forno
Pasteur que se encontra no laboratrio
de fitopatologia ao lado do equipamento
(EMBRAPA, 2011a).
Procedimento de operao
do Forno Pasteur
Organizar no interior da cesta o material
que deve ser esterilizado, como vidrarias
(placas de Petri), envolto em papel jor-
nal afastado das paredes do mesmo, de
modo a permitir a circulao do ar pelo
equipamento, antes de ligar o equipa-
mento;
48
Fechar o equipamento com a tampa, co-
locar o termmetro calibrado na abertu-
ra especfica, abrir a janela de ventilao,
afim de possibilitar a sada do ar frio do
seu interior;
Ligar o disjuntor e logo aps ligar o equi-
pamento, girando a chave seletora, posi-
cionando a parte mais fina na posio alta
(HIGH);
Aguardar a temperatura atingir 120 C, fe-
char a janela de ventilao com o empre-
go de luvas, pois a tampa giratria est
com a mesma temperatura indicada no
termmetro;
Aguardar a temperatura atingir 180 C, gi-
rar a chave seletora, posicionando a parte
mais fina na posio mdia (MED). Manter
por 2 horas nesta temperatura;
Girar a chave seletora, posicionando a
parte mais fina na posio baixa (LOW),
aps as 2 horas de operao a 180 C;
Girar a chave seletora, posicionando a
parte mais fina na posio OFF, quando
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 49
a temperatura estiver abaixo de 100 C,
desligando assim o equipamento;
Desligar o disjuntor aps resfriamento do
equipamento;
Lembrar que os materiais no interior do
equipamento ainda estaro quentes, de-
vendo-se, aguardar o resfriamento destes
ou usar luvas de raspas de couro para reti-
rar o material estril.
Foto: Leandro Rocha

Figura 8.
Forno Pasteur.
50
Zona de esterilidade
(Cmara de Fluxo Laminar)
A cmara de fluxo laminar ou capela micro-
biolgica (Figura 9) um equipamento des-
tinado a controlar as micropartculas areas,
associadas ao manuseio de materiais biolgi-
cos infeciosos ou txicos, por meio de uso de
ventilao apropriada, existente no seu inte-
rior, tornando o ambiente estril para fins de
proteo ao usurio e amostra manipulada
(MANUAL, 2005).

As manipulaes devem ser realizadas den-


tro da cmara. Para trabalhos de fitopatolo-
gia a cmara deve ser horizontal, para evitar
o fluxo unidirecional com grande turbulncia
encontrado nas cmaras de fluxo vertical.

O fluxo uma circulao de ar que visa


manter o ambiente estril dentro da c-
mara, onde a manipulao dos materiais
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 51
deve ser feita, junto da chama de uma fon-
te de calor, de forma a garantir o estabe-
lecimento de uma zona de esterilidade.
somente nesta zona estril que os tubos,
placas de Petri e recipientes com meios
de cultura devem ser abertos e o material
biolgico a ser inoculado deve ser manipula-
do. Qualquer outro material estril (ex: caixa
de ponteiras, seringas, placas de Petri, caixa
com microtubos, etc.) utilizado nos procedi-
mentos de ensaio, tambm devem ser abertos
nesta rea para ser preservada a sua condio.

Os cuidados que devem ser seguidos com


o manuseio do equipamento esto dispo-
nibilizados no procedimento operacional
padro da cmara de fluxo laminar, POP
014.2.4.06.4.005, que se encontra no labora-
trio de fitopatologia ao lado do equipamen-
to (EMBRAPA, 2012c).
52

Foto: Leandro Rocha


Figura 9. Cmara de Fluxo
Laminar, com ficha de registro
de uso e POP especfico,
afixado no equipamento.

Procedimento de operao
da Cmara de Fluxo Laminar
Ligar a cmara pressionando uma vez o
boto verde;
Ligar a iluminao acionando-se a chave
metlica para a posio luz;
Limpar as paredes, a superfcie da rea de
trabalho, grelhas frontal e posterior e as
laterais da cmara, com algodo embebi-
do em lcool 70% ou qualquer outra solu-
o desinfetante;
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 53
Deixar a cmara ligada pelo menos 30 mi-
nutos antes de iniciar os trabalhos, a fim
de remover qualquer partcula de mate-
rial que possa estar na face do filtro ou
que venha na grelha de proteo;
Esterilizar ou desinfestar superficialmente
com lcool PA, todo equipamento ou ma-
terial que se introduza na rea de traba-
lho da cmara inclusive, os utenslios que
contm as amostras biolgicas a serem ali
manipuladas;
No colocar materiais desnecessrios ao
procedimento na rea de trabalho est-
ril, porque podem obstruir o fluxo de ar e
criar turbulncias que podem causar con-
taminaes cruzada ou aspirao de ar
para dentro da rea de trabalho;
Antes de iniciar os trabalhos, lavar as
mos e os punhos, assim como, todas as
vezes que tiver contato com material no
estril externo rea de trabalho.
Imediatamente aps o trmino do servi-
o, limpar as grelhas frontal e posterior e
54
as laterais da cmara, com algodo em-
bebido em lcool PA ou qualquer soluo
desinfectante; em seguida desligar a c-
mara (boto vermelho);
Desligar a iluminao (chave metlica);
Manter, sempre que possvel, a cmara
em funcionamento a maior parte do
tempo, pois a presso positiva gera-
da dentro da rea de trabalho ajudar
a manter as condies de limpeza da
mesma;
Realizar testes e troca dos filtros absolu-
tos (HEPA) sempre por pessoal tcnico
qualificado, contratado para tal.

Fatores associados ao cultivo de


micro-organismos
Os micro-organismos necessitam de condi-
es ambientais adequadas para se desenvol-
verem e esporularem, tais como luz, tempera-
tura, aerao, pH, etc. No entanto, no existe
um conjunto de condies nicas para todas
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 55
as culturas de fungos patognicos e preciso
que aquelas, sejam pr-estabelecidas;

importante saber quais as melhores condi-


es para o crescimento vegetativo e esporu-
lao dos micro-organismos, o que pode acon-
tecer at em condies extremas adversas ao
micro-organismo, mas normalmente nessas
condies ou quando estas so excedidas, o
crescimento pode ser retardado ou mesmo
no haver crescimento ou esporulao.
Luz
As fontes de luz empregadas so:
Luz visvel (380 750 nm) as lmpadas
fluorescentes so boas fontes de luz, j as
lmpadas incandescentes com filamento
de tungstnio emitem muito calor e
isto pode causar problemas cultura de
micro-organismos.

A radiao UV formada por faixas de


radiao com caractersticas e aplicaes
prticas especficas.
56
UV prximo (NUV) (300 380 nm);
UV-A conhecida como UV de onda longa
ou luz negra (310 420 nm), representa a
maior parte dos raios;
UV emitidos pelo sol;
A UV distante ou UV-C ou faixa UV ger-
micida, compreende a faixa de 200 a
300 nm. O comprimento de onda da ra-
diao UV-C que inativa o DNA/RNA,
material gentico dos microrganismos,
situa-se entre 250 e 270 nm.

A luz pode estimular a reproduo sexuada


e assexuada em quase todos os fungos.
Normalmente, os comprimentos de onda UV
inferiores a 340 nm induzem esporulao.

A esporulao de fungos pela luz deve seguir


as seguintes recomendaes:
Usar lmpadas fluorescentes que emitam
radiao na faixa de (320 420 nm), ou
seja, UVN;
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 57
Usar duas lmpadas de 40 Watts cada,
na posio horizontal, afastadas 20,0 cm,
acima da placa com a cultura;
Usar um ciclo alternado luz - escuro de
12h (tambm chamado de fotoperodo
de 12h);
Usar tubos ou placas que permitam a
passagem da luz NUV.

Temperatura
A temperatura favorece a regulao e a dis-
tribuio das espcies em toda uma regio.
O conhecimento da temperatura funda-
mental para a otimizao do cultivo in vitro.
Os efeitos deste fator sobre o crescimento de
uma espcie pode ser determinado, avalian-
do-se inicialmente a temperatura a intervalos
mais amplos, de aproximadamente 5 C (Ex.:
25 C, 30 C e 35 C), podendo variar de no m-
nimo cinco pontos, para construir uma curva
tpica de crescimento e determinar as tempe-
raturas mnima e mxima de crescimento.
58
Em fungo
Embora cada fungo tenha uma
temperatura tima de desenvolvimento,
normalmente a maioria desenvolve-
se bem temperatura ambiente
(20 25 C). A temperatura pode ser
controlada em incubadoras ou em
banho-maria.

Em bactria
A temperatura o fator externo de
maior importncia para a reproduo de
bactrias. As bactrias fitopatognicas
encontram-se temperatura tima para
o seu desenvolvimento entre 25 C e
30 C. As mesmas param de se repro-
duzir entre 33 C e 40 C.
Aerao
O oxignio (O2) assim como o dixido de
carbono (CO2) influencia no crescimento de
micro-organismos. O gs carbnico muito
embora faa parte de algumas reaes
qumicas existentes nas clulas, seu excesso
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 59
no meio de cultura pode inibir o crescimento
e a esporulao de alguns micro-organismos.
pH
O pH timo para o crescimento vegetativo
pode no ser o mesmo que induz esporu-
lao. Enquanto fungos crescem numa faixa
ampla de pH, as bactrias geralmente so sen-
sveis ao meio cido. Sendo assim, em alguns
trabalhos de rotina o pH do meio ajustado
usando-se cido actico, cido clordrico, ci-
do ltico, hidrxido de potssio ou hidrxido
de sdio antes ou depois de autoclavar, se
necessrio. importante verificar se o meio
que contm gar no solidifica em pH abaixo
de 4,0. E autoclavar o meio pode alterar o pH,
portanto, preciso ajust-lo antes e conferir
depois de acordo com os objetivos do estudo.
Nutrio
Os elementos minerais quando requeridos
pela planta e seu fornecimento sendo ade-
quado, fornecem planta uma maior resistn-
cia doena. Portanto, importante manter o
60
balano nutricional nas plantas, principal-
mente, de nitrognio, fsforo e potssio,
porm, nada em excesso. Como controle nu-
tricional preventivo das plantas usam-se, na
maioria dos casos, os fertilizantes. E, como
meio nutritivo para o crescimento dos micro-
-organismos em laboratrio temos os meios
de cultura (BEDENDO,1995).

Quando no se conhece os micro-organis-


mos que esto sendo cultivados como no
caso do estudo da microbiota de determi-
nado local, normalmente devem ser isola-
dos, incubados e a cultura pura identificada
e diagnosticada.

A estufa de germinao tipo B.O.D. um


equipamento muito usado no laboratrio
de fitopatologia cujas condies pr-esta-
belecidas de incubao e meio de cultura
apropriado permite que um determinado
micro-organismo possa ser isolado para
posterior identificao.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 61
Incubao de micro-organismos
(Estufa de germinao tipo B.O.D.)
O perodo que decorre aps o isolamento
de um micro-organismo (bactrias, fungos,
leveduras, etc.) em cmara de fluxo laminar
at o momento em que ele apresenta estru-
turas que permitam a obteno de uma cultu-
ra pura denominada de incubao. Para os
micro-organismos aerbios, a incubao em
placas de Petri ou tubos contendo inculo
normalmente feita em estufas bacteriolgicas
ou estufa de germinao tipo B.O.D. (Figura
10). O controle de temperatura importante,
tanto em condies aerbias como anaer-
bias, pois um fator a ser considerado para
o cultivo dos micro-organismos. Enquanto
muitos micro-organismos crescem em tem-
peratura ambiente, outros crescem em con-
dies extremas, podendo chegar at 37 C.
E, para tal, os micro-organismos devem ser
mantidos em estufas de germinao com
a temperatura regulada e quando necess-
rio, em presena de luz, tambm controlada.
62
Para tal a estufa de germinao deve possuir
nvel de fotoperodo. Todas as operaes e
manuseio do equipamento devem ser feitas
aps consultar o procedimento operacional
padro da estufa de germinao tipo B.O.D.,
POP 014.2.4.06.4.002, que se encontra no la-
boratrio de fitopatologia (EMBRAPA, 2012d).

Foto: Leandro Rocha


Figura 10. Estufa de
germinao tipo B.O.D.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 63
Procedimento de operao da
Estufa de germinao tipo B.O.D.
Ligar a tomada do aparelho na fonte
de energia;
Ligar o aparelho na chave Liga/Desliga;
Regular a temperatura, girando a chave
seletora do termostato e conferir a tem-
peratura com auxlio de um termmetro,
colocado no interior do equipamento;
Aguardar a temperatura atingir o valor
desejado; aferir a temperatura seleciona-
da no termostato do aparelho, com a indi-
cada no termmetro;
Dispor de forma ordenada as placas de
Petri ou tubos de ensaio, contendo o
meio de cultura com o isolado das amos-
tras para crescimento dos fitopatgenos,
aps o ajuste da temperatura;
Desligar o equipamento na chave Liga/
Desliga e retirar a tomada da fonte de
energia. Retirar a gua acumulada na
bandeja e periodicamente, limpar com
64
auxlio de esponja, gua e detergente,
sempre que seja concretizado o encerra-
mento do ensaio (avaliaes, crescimento
e a identificao do fitopatgeno);
Rotular todo e qualquer material intro-
duzido na estufa de germinao com as
seguintes informaes: identificao do
material, responsvel pelo trabalho e data
de preparo;
Descartar sumariamente todo e qualquer
material introduzido na estufa de germi-
nao que no possua a rotulao indica-
da no item anterior;
Limpar a estufa de germinao tipo B.O.D.
com hipoclorito 2% a cada trs meses e/
ou quando necessrio e, somente utilizar
depois de 24 horas.

Meios de cultura
Os meios de cultura so substncias ou
solues que podem ser usados na sele-
o e crescimento de um determinado
micro-organismo ou clula vegetal para a
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 65
identificao de uma espcie em particular
(ZAUZA et al, 2007).

Entre os principais componentes de um


meio de cultura adequado ao desenvolvi-
mento de fitopatgenos, esto as fontes
de carbono e energia como os acares, as
fontes de nitrognio, fsforo, e sais minerais.
Outros componentes que podem ser encon-
trados em um meio especfico para um de-
terminado organismo (meio seletivo), so os
fatores de crescimento como as vitaminas,
aminocidos, etc. Por outro lado podemos
ter num meio, agentes / constituintes que ini-
bam o crescimento de determinados micro-
organismos, sendo estes tambm conside-
rados meios seletivos. Alm dos meios sele-
tivos existem tambm os meios que permi-
tem diferenciar os micro-organismos (meios
diferenciadores ou diferenciais) e o exemplo
mais simples a existncia de um indicador
de pH, que permite verificar se, por exem-
plo, um acar presente no meio metabo-
lizado, pois ao ser, implica na produo de
66
metablitos que acidificam o meio, alterando
o seu pH e consequentemente alterando a
cor do indicador de pH (BRASIL, 1954).

Classificao dos meios de cultura


Os meios de cultura segundo Zauza et al.
(2007) encontram-se nas seguintes categorias:
Sinttico
Os meios de cultura sintticos so cons-
titudos de ingredientes ou substncias
cuja composio e concentraes qumi-
cas so conhecidas.

Semissinttico
Os meios de cultura semissintticos
que so amplamente utilizados na
microbiologia, assemelham-se aos meios
sintticos quanto ao possurem um
conjunto conhecido de ingredientes ou
substncias. Porm, o meio semissinttico
contm uma fonte natural de acar,
podendo ser a batata, milho, extrato de
carne ou de malte.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 67
Natural
Os meios de cultura naturais so compos-
tos parcial ou integralmente de produtos
naturais, como parte das plantas (folhas,
brotos, razes, sementes, frutos, etc.) ou
de infuses ou de extratos de materiais de
origem vegetal ou animal. Um pedao de
batata um meio de cultura natural, as-
sim como um pedao de po ou de carne.

Seletivo
O meio de cultura seletivo favorece ao
desenvolvimento de uma cultura pura ou
inibi culturas indesejveis, e para isto, so
utilizadas substncias como: antibiticos,
vitaminas ou fungicidas, adicionados ao
meio de cultura j preparado.

O emprego do meio de cultura possibilita


o isolamento de micro-organismos que
podero ser diagnosticados como agentes
causais de doenas, aps o cumprimento
dos postulados de Koch (BRASIL,1954).
68
Para o isolamento de um fitopatgeno
utiliza-se gar nutritivo (AN) para bactrias,
e gar-gua (AA) ou batata dextrose gar
(BDA) para fungos, considerado um meio
de cultura universal. Para fitopatgenos
desconhecidos necessrio fechar os
postulados de Koch para possibilitar a
certeza de sua patogenia.

Outros meios mais especficos tambm


podem ser usados tanto para fungos
como para bactrias, porm, todos devem
ser esterilizados antes de seu uso.

A identificao de um tecido infectado


atravs de uma avaliao feita por micros-
copia permite dizer que tipo de patgeno
est envolvido na doena da planta e qual
o meio de cultura mais indicado.

Cuidados devem ser seguidos com o pre-


paro do meio de cultura. Para tal, consul-
tar sempre que necessrio o procedimen-
to operacional padro, intitulado Preparo
de meio de cultura em batata dextrose
e gar, POP 014.2.4.06.3.004, que se en-
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 69
contra no laboratrio de fitopatologia
(EMBRAPA, 2010B) ou consultar os re-
gistros da qualidade do laboratrio de
fitopatologia (REQLFITO 012) onde se en-
contram os meios de cultura mais empre-
gados no laboratrio.
Procedimento de preparo
de meio de cultura
Pesar cada substncia em um bquer,
com identificao de cada uma e o peso a
ser pesado (para minimizar erros), tampar
com papel alumnio cada bquer at que
termine a pesagem;
Antes de adicionar as substncias do
bquer no erlenmeyer ou vidro mbar,
certificar-se que o volume do erlenmeyer
ou do vidro mbar est correto (medir
com uma proveta de volume prximo ao
que se deseja preparar o meio de cultura,
inserir na vidraria e fazer uma marcao
com caneta prpria); a seguir passar gua
destilada na vidraria, colocar um volume
de gua destilada no fundo do vidro que
corresponda a trs centmetros de altura
70
e levar ao agitador magntico com uma
barra magntica e proceder adio de
cada substncia;
Levar o meio j homogeneizado, no vidro
mbar, com a tampa entreaberta, e se for
no erlenmeyer, coberto com papel alu-
mnio, para a autoclave, sob presso de
1 kgf/cm2 (1 atm), temperatura regulada
para 120 C e deixar por 20 minutos
Terminada a dissoluo do meio de cul-
tura, deixar esfriar at aproximadamente
50 C (temperatura mxima para se se-
gurar o frasco na mo), verter cuidado-
samente para as placas de Petri em uma
cmara de fluxo laminar (Figura 11A) e
deix-las semiabertas (Figura 11B) at
que esfrie (em mdia uns 20 min).
OBS: Quando usar antibitico no meio de
cultura, proceder s etapas anteriores at a dis-
soluo do meio, deixar esfriar at aproxima-
damente 50 C (temperatura mxima para se
segurar o frasco na mo), adicionar o antibiti-
co (previamente diludo em aproximadamen-
te 1 mL de gua deionizada, autoclavada em
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 71
ambiente assptico) e colocar na mesa agitado-
ra por 3 minutos. Em seguida, verter para pla-
cas de Petri em cmara de fluxo laminar, esfriar
e quando necessrio, armazenar em geladeira.

B
Fotos: Leandro Rocha

Figura 11. Distribuio de


meio de cultura em cmara
de fluxo laminar (A) e
Placa de Petri semi-aberta
com meio de cultura em
fase de polimerizao (B).
72
Diagnose de doenas de plantas
O diagnstico de doenas em plantas deve
ser verificado, inicialmente, pelos sinais dos pa-
tgenos presentes ou por fatores ambientais.
A descrio sintomatolgica das doenas de
plantas e suas causas especficas, podem ser
verificadas atravs de numerosas chaves de
identificao publicadas em livros, compn-
dios, relatrios, etc., que ajudam a diagnosticar
uma determinada doena (AGRIOS, 2007).

Algumas vezes, o sintoma na planta no


caracterstico de nenhuma doena em parti-
cular e torna-se difcil de ser diagnosticado.
A importncia de um exame mais detalhado
sobre a doena encontrada na planta ajuda
a identific-la, necessitando do conhecimen-
to de outras informaes, que possibilitem
um melhor conhecimento da relao planta/
hospedeiro/ambiente como: estgio de de-
senvolvimento em que se encontra a cultura
e qual a prtica cultural que foi empregada
na plantao, sendo uma delas, o uso de de-
fensivos agrcolas, podas e conhecimento
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 73
sobre as condies climticas que a cultura
esteve submetida.

As informaes observadas do material do-


ente, com ajuda de um microscpio estereos-
cpico, orienta a busca da estrutura do pat-
geno (sinais) para um diagnstico afirmativo
e preciso.

Na fitopatologia, ao encontrar-se uma plan-


ta infectada, cujos sintomas so desconheci-
dos ou no caractersticos, o primeiro passo
tentar isolar o organismo causador da enfer-
midade, tanto para fins de identificao como
para determinao das caractersticas de de-
senvolvimento ou para estudos adicionais.

A importncia para o sucesso do isola-


mento depende da seleo adequada do
material vegetal infectado e, normalmente,
a sua rpida utilizao. Se o material infecta-
do no for utilizado de imediato, este deve
ser mantido sob refrigerao, armazenando-
-o a fim de conserv-lo por um tempo m-
ximo de 30 dias. No isolamento de material
74
recentemente obtido, as primeiras 12 72 ho-
ras so especialmente crticas e, durante esse
perodo, no se deve deixar de examinar as
culturas em espaos no superiores a 15 horas.
Diagnstico de doenas desconhecidas
Para estabelecer a relao causal entre uma
doena e um micro-organismo deve-se con-
firmar o diagnstico com os Postulados de
Koch ou Regras de Prova da Patogenicidade.
Postulado descrito por Robert Koch, em 1881,
para patgenos humanos que foi adaptado
fitopatologia e, at os dias atuais, ampla-
mente empregado como um mtodo clssico
de comprovao para a diagnose de doenas
de plantas (AMORIM; SALGADO, 1995).
Postulados de Koch ou
Regras de prova da patogenicidade
A Associao constante Patgeno/Hospe-
deiro para um determinado micro-organis-
mo deve estar presente em todas as plantas
de uma mesma espcie que apresentam o
mesmo sintoma. Em outras palavras, deve-se
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 75
poder associar sempre um determinado sinto-
ma a um patgeno particular. No entanto, se
o organismo encontrado parece ser o agente
causal da doena, sem haver relatos anterio-
res que o confirmem, necessrio observar
os passos abaixo para verificar a hiptese de
que o patgeno isolado realmente o agente
causal da enfermidade.
Associao constante o patgeno tem
que ser encontrado associado s plantas
doentes examinadas, ou seja, ele avalia-
do e identificado e caso no o seja de ime-
diato, so realizadas as etapas a seguir;
Isolamento do patgeno o patgeno
deve ser isolado e cultivado em cultura
pura;
Inoculao do patgeno e reproduo dos
sintomas o patgeno da cultura pura,
deve ser inoculado em plantas sadias da
mesma espcie ou da mesma variedade
que apresentou os sintomas iniciais da do-
ena e provocar a mesma sintomatologia
observada anteriormente;
76
Reisolamento do patgeno o patgeno
deve ser isolado em culturas puras sub-
metidas inoculao artificial.

As etapas citadas anteriormente, se forem


todas cumpridas, o micro-organismo isolado
pode ser considerado como o agente patog-
nico e responsvel pelos sintomas observados
na planta doente (AMORIM; SALGADO,1995).

Os postulados de Koch exigem testes rigo-


rosos com plantas adequadas, no inoculadas
e no tratadas. E, em via de regra, necessrio
repetir os experimentos para se estabelecer
sua validade.

Isolamento de micro-organismos
fitopatognicos
Aspectos gerais
essencial que o patgeno que se preten-
de isolar seja colocado em um novo ambiente
que favorea o seu desenvolvimento, supe-
rando seus concorrentes saprfitas. Esta eta-
pa requerida se comprova com a segunda e
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 77
quarta regras dos postulados de Koch. Um iso-
lamento bem sucedido de uma cultura depen-
de, basicamente, da capacidade tcnica em
separar determinado organismo de outros.
Mtodos bsicos de isolamento
Para o isolamento so usadas diferentes tc-
nicas, conforme a natureza do tecido afetado,
o substrato e o estdio de desenvolvimento
do patgeno (vegetativo ou reprodutivo),
bem como do operador. E, segundo Alfenas
et al., (2007), as tcnicas bsicas empregadas
so de isolamento direto e isolamento indireto.

Isolamento direto
O isolamento direto baseia-se na trans-
ferncia direta do rgo infectado do
patgeno com o auxlio de um estile-
te, diretamente para o meio de cultu-
ra. Se a pretenso do trabalho com os
esporos presentes na amostra for esti-
mular a esporulao do fungo, deve-
se manter o material em cma-
ra mida (por um a trs dias) a 25 C.
78
O material exposto luz contnua em c-
mara mida ir favorecer a esporulao.
A cmara mida deve ser montada por
placas de Petri fechadas ou bandejas en-
voltas por saco plstico transparente e
conter papel de filtro ou algodo embe-
bido com gua e o isolado sobre o papel
ou o algodo.

Vantagens do isolamento direto


Obter um organismo puro que esteja
isento de contaminaes de micro-
organismos saprfitas associados ao
tecido infectado.
Obter qual o organismo exato que est
sendo transferido para o meio.
Favorecer etapas de comparaes entre
as estruturas do organismo obtidas na
superfcie do hospedeiro e em cultura.

Procedimento para o isolamento direto


Focalizar as estruturas do patgeno (frag-
mentos) em lupa para ajudar a isolar;
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 79
Flambar a lmina de estilete;
Resfriar a ponta da lmina, tocando-a
levemente no meio de cultura;
Transferir o fragmento desejado para
uma placa com o meio de cultura
Distribuir os fragmentos, sendo um no
centro e trs ao redor dele de forma
equidistante;
Colocar a placa de Petri numa estufa de
germinao tipo B.O.D at o apareci-
mento da colnia desejada;
Repicar a colnia para tubos com BDA
inclinado.

Isolamento indireto
O isolamento indireto baseia-se na tcni-
ca de transferncia para um meio de cul-
tura de pores infectadas de tecido hos-
pedeiro ou amostras de solo e sementes
infestadas em que no exista a evidncia
de estruturas do micro-organismo. Este
mtodo de isolamento indireto de um mi-
cro-organismo varia com o tipo de rgo
80
ou tecido infectado (rgo lenhoso ou
carnoso, no-lenhoso ou no-carnoso) ou
o substrato onde o organismo recupe-
rado. Porm, h casos em que o patgeno
encontra-se internamente nos tecidos da
planta sem produzir frutificaes.

Isolamento de fungos dos tecidos de


rgos lenhosos ou carnosos (tronco,
razes, galhos grossos e frutos)
Os micro-organismos que colonizam
esses tecidos permitem que as suas
estruturas atinjam as camadas de c-
lulas mais profundas, exigindo maior
cuidado na desinfeco dos tecidos e
na retirada das partes mais superficiais
que, geralmente, possuem micro-or-
ganismos contaminantes, permitin-
do a passagem para o meio de cultura
apenas de fragmentos tissulares mais
internos. Fragmentos desses tecidos
so retirados, utilizando-se uma lmina
de estilete previamente flambada, da
regio limite entre o tecido doente e o
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 81
tecido sadio, os quais so depositados
em meios de cultura para crescimento.

Isolamento de fungos dos tecidos de


rgos no-lenhosos ou no-carnosos
(folhas, ramos, finos, radicelas)
No laboratrio de fitopatologia a tcni-
ca mais usada o isolamento indireto.
Essa tcnica encontra-se descrita no
procedimento operacional padro, POP
014.2.4.06.3.012, intitulado Isolamento,
incubao e repicagem de micro-or-
ganismos fitopatognicos (EMBRAPA,
2011b).

Procedimento para o isolamento indireto


Retirar fragmentos de tecidos da regio
limtrofe entre a rea lesionada e a rea
sadia porque ai que o patgeno se en-
contra em maior atividade. reas necr-
ticas, no centro das leses, normalmen-
te contm alta populao de saprfitas
e devem ser evitadas (Figura 12);
82

Fotos: Hermes Peixoto Santos Filho

Figura 12. Leso causada por do-


ena e no detalhe regio limtrofe
da rea lesionada e sadia de onde
devem ser retirados os fragmentos
para isolamento.

Colocar os fragmentos com ajuda de


uma pina em bquer com lcool a 70%
por 2 minutos (Figura 13);
Passar para outro bquer com hipoclorito
de sdio a 0,5% por 2 minutos (Figura 13);
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 83
O prximo passo a lavagem dos frag-
mentos com gua destilada estril por
trs vezes (Figura 13);
Em seguida, transferir o fragmento para
um papel de filtro, dobr-lo e lev-lo para
a cmara de fluxo laminar. Com o auxlio
de uma pina, colocar pelo menos trs
fragmentos em forma de um tringulo
na placa de Petri, previamente pronta
com o meio de cultura BDA (Figura13);

Figura 13. Sequncia das etapas de


preparo de uma amostra, com sintomas
de doenas, para posterior isolamento em
meio de cultura.
Foto: Leandro Rocha
84
Flambar as placas de Petri e fech-las
com filme PVC;
Incubar a(s) placa(s) de Petri com os
fragmentos em uma estufa de germina-
o tipo B.O.D. com fotoperodo de 12
horas, de cinco a sete dias, a 25 C;
Observar se ocorreu a formao de co-
lnias de bactrias ou miclio de fungos
a partir dos fragmentos repicados para
placa de Petri;
Transferir para outra placa de Petri com
meio de cultura BDA e seguir as etapas
subsequentes quinta etapa, descrita
no procedimento de isolamento;
Aps formar uma cultura pura de micro-
organismos fitopatognicos, a mesma
identificada por microscopia tica.
Os antibiticos bactericidas tm sido
empregados no isolamento seletivo de
fungos do solo e de material contami-
nado. A grande maioria das bactrias
sensvel a esses produtos, muito embo-
ra, nenhum antibitico seja eficaz contra
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 85
todas. importante que os antibiticos
sejam solveis e estveis no meio e at-
xico para os organismos a serem desen-
volvidos na cultura.

No isolamento de rotina, normalmente,


usa-se uma mistura de antibiticos, quase
sempre estreptomicina, clorotetraciclina ou
neomicina, embora a presena isolada de
estreptomicina iniba o desenvolvimento da
maioria das espcies de bactrias, sem afetar
a maioria dos fungos. O rosa bengala atua
tambm como inibidor do crescimento de
bactrias e inibe ou retarda o desenvolvimento
de inmeros fungos.

Mtodos de inoculao de
micro-organismos patognicos
A Inoculao permite, artificialmente, tornar
uma planta sadia em uma planta doente.
Este procedimento faz parte da terceira
regra do Postulado de Koch que comprova a
86
patogenicidade de um dado micro-organismo
(ALFENAS; FERREIRA, 2007). Qualquer poro
de patgeno, potencialmente capaz de iniciar
a doena, conhecida como inculo

Propsito da inoculao artificial


Evidenciar a patogenicidade do orga-
nismo isolado em cultura pura com um
determinado patgeno, como sendo o
agente causal da doena;
Verificar a resistncia de uma determina-
da planta doena e quais fatores fsicos
e qumicos que favorecem a infeco;
Estudar o ciclo de vida de determinados
patgenos;
Avaliar concentraes no estudo do pat-
geno quanto ao ndice da doena.

Mtodos de inoculao
Alguns mtodos de inoculao apresenta-
dos so baseados no tipo de inculo usado e
no rgo da planta a ser inoculada (ALFENAS
et al, 2007).
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 87
Esporos a seco como inculo
uma tcnica de inoculao muito em-
pregada em alguns parasitas obrigat-
rios ou biotrficos, como agentes causais
da ferrugem da goiabeira (Puccina psidii)
e da odiose da mangueira (Oidium man-
giferae), que no crescem em meio de
cultura e cujas fontes de inculo devem
consistir de plantas infectadas pelo pr-
prio patgeno. A inoculao destes fun-
gos feita com a atomizao de esporos
a seco ou imersos em gua destilada es-
terilizada, sobre as superfcies a serem
inoculadas.

Suspenso de esporos ou de
miclio triturado como inculo
uma tcnica muito empregada em
inoculaes de folhas, inflorescncias e
frutos. O uso de suspenso de esporos
ou de miclio triturado est ligado ca-
pacidade de esporulao do patgeno
em cultura.
88
Para fungos no cultivveis
em meios de cultura
Realizar a coleta dos esporos nos
rgos do hospedeiro com abundante
esporulao
Passar um pincel sobre as reas esporu-
ladas ou raspar com um escalpelo e reco-
lher os esporos em um bquer com gua
destilada ou, ainda, efetuar a imerso e
agitao das leses esporuladas direta-
mente no bquer com gua e mediante
o uso de um coletor de esporos apropria-
do acoplado a uma bomba de vcuo.

Para fungos cultivveis


em meios de cultura
No emprego da inoculao de parasi-
tas facultativos (cultivveis em meio
de cultura artificial), o inculo deve
consistir de uma suspenso de espo-
ros ou de miclio triturado em gua
destilada e esterilizada. O uso de
suspenso de esporos como inculo deve
permitir a padronizao da quantidade
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 89
de inculo (n de esporos/ mL) com maior
preciso do que a de miclio triturado.

A inoculao requer cuidados que devem


ser seguidos, baseados no procedimen-
to operacional padro, intitulado Inocu-
lao de fungos fitopatognicos, POP
014.2.4.06.3.006, que se encontra no labo-
ratrio de fitopatologia (EMBRAPA, 2009).
Procedimento de Inoculao
de fungos fitopatognicos
Isolar em meio de cultura especfico.
Aps o fungo crescer em meio de cultu-
ra, raspar a superfcie do meio conten-
do esporos e recolher em bquer.
Acrescentar ao bquer aproximada-
mente 20 mL de gua destilada.
Filtrar essa suspenso em funil com ca-
mada dupla de gaze, para reteno dos
fragmentos miceliais e detritos do meio
de cultura ou da folha.
Adicionar 2 gotas de Tween 20 sus-
penso, a fim de evitar o agrupamento
90
de esporos. Homogeneizar bem a sus-
penso antes de efetuar o ajuste da
concentrao de esporos.
Padronizar a suspenso em 10n espo-
ros/mL, de acordo com a especificidade
de cada fungo que se deseja inocular,
depositando uma alquota da suspen-
so homogeneizada na cmara de con-
tagem do Hemacitmetro de Neubauer,
Efetuar a contagem, no microscpio ti-
co, utilizando um aumento de 100 vezes
e registrar, com o auxlio de um contador
manual, o nmero de esporos presentes
nos cinco Quadrados Secundrios (Q.S.)
uniformemente distribudos nos retcu-
los do hemacitmetro (Figura 14).
Ajustar, com gua destilada, a suspen-
so, at obter a concentrao de 10n
esporos/ml de acordo com a especifici-
dade do fungo que se deseja inocular.
Pulverizar a rea a ser inoculada at o
ponto de escorrimento da suspenso
de esporos.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 91
Manter as plantas inoculadas em c-
mara mida por um perodo de 24 ho-
ras, para favorecer a germinao dos
esporos e penetrao do fungo nos
tecidos foliares.

Foto: Leandro Rocha

Figura 14. Cmara de Neubauer


ou Hemacitmetro.
92
Clculo da concentrao do inculo
Segundo Alfenas et al. (2007) o clculo da
concentrao de inculo feito mediante o
nmero de estruturas infectivas por mililitro
(mL) de suspenso e usam-se, geralmente,
as concentraes de 103 a 106 esporos / mL.
A contagem dos esporos usualmente es-
timada com o uso de uma lmina especial,
denominada Hemacitmetro ou cma-
ra de Neubauer (Figura 14) ou por meio
de um contador automtico de esporos.
Consultar o procedimento operacional pa-
dro (POP) 014.2.4.06.3.006 de Inoculao
de fungos fitopatognicos em mamoeiro,
(EMBRAPA, 2009).

O Hemacitmetro possui as seguintes divi-


ses: Dimenses de cada compartimento de
contagem: Q. P. (Quadrado Principal) = 1,0
mm em cada lado. Q. S. (Quadrado Secund-
rio) = 0,2 mm em cada lado. A imagem apre-
senta cinco Q.P. (A, B, C, D e E). O Q.P. central
(E) est subdividido em 25 Q.S.
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 93
A concentrao de esporos por mililitro
(mL) determinada atravs da contagem
dos esporos em cinco Quadrados Secund-
rios (Q.S.) uniformemente distribudos nos
retculos do hemacitmetro tipo Neubauer.
A mdia das cinco contagens aplicada na
frmula abaixo para a obteno da concen-
trao total de esporos na soluo, especi-
ficando-se a concentrao para os esporos
do fungo desejado.
Nmero de esporos totais na soluo = nmero mdio
de esporos no retculo central x 2,5x105

A concentrao da suspenso de esporos


ajustada em gua destilada at a obteno
da concentrao de 106 esporos/mL, utili-
zando-se a frmula:
C1.V1 = C2.V2.
C1 = concentrao inicial de esporos obtidos a partir
da contagem em cmara de Neubauer;
V1 = volume inicial da suspenso de esporos;
C2 = concentrao desejada de esporos;
V2 = volume final a ser adicionado para ajustar a
concentrao desejada.
94
Comparam-se os valores obtidos na conta-
gem dos esporos em cinco subcomparti-
mentos ou quadrados secundrios (Q.S.) do
retculo central do hemacitmetro. A soma
obtida deve ser multiplicada por 50.000.
(Soma de cinco Q.S. x 50.000 = nmero de
esporos/mL). Para a obteno da suspenso
calibrada em 106, essa soma deve atingir o
mnimo de 20 esporos, isto , uma mdia de
quatro esporos por Q.S.

No caso de usar suspenso de miclio


triturado, o inculo deve ser preparado da
seguinte maneira:
Triturar em um homogeneizador do tipo
Polytron ou similar, certa quantidade de
miclio ou certo nmero de colnias do
patgeno em cultura, em um dado volu-
me de gua destilada;
A suspenso de inculo (suspenso de
esporos ou de miclio triturado) deve ser
atomizada sobre o(s) rgo(s) a ser(em)
inoculado(s).
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 95
Suspenso de inculo
injetada no caule
As suspenses de inculo (esporos ou mi-
clio triturado) desejadas, devem ser in-
jetadas no caule de mudas podendo ser
empregado para patgenos que causam
murchas vasculares, como Fusarium oxys-
porum em maracuj. A tcnica bastante
usada para Ceratocystis fimbriata que in-
fecta vrios hospedeiros como a manguei-
ra, a batata-doce, o inhame, entre outros.
Antes de iniciar a inoculao, fazer um
corte transversal no caule (1,0 a 2,0 cm de
comprimento), por onde o inculo deve
ser injetado com o auxlio de uma seringa
ou micropipeta. A rea inoculada reco-
berta com fita adesiva. O sintoma deve ser
expresso de acordo com a agressividade e
virulncia do patgeno e o nvel de resis-
tncia/suscetibilidade do hospedeiro, mas,
em geral, no intervalo de 7 a 30 dias as
plantas inoculadas manifestam sintomas
de murcha e/ou descolorao vascular.
96
Inoculao com cilindros ou cubos de culti-
vos artificiais contendo miclio do patgeno
A tcnica de inoculao com cilindros ba-
seia-se em colocar sobre o rgo da planta
a ser inoculado, cilindros (discos) ou cubos
de cultivo artificial contendo miclio do
patgeno com ou sem estruturas repro-
dutivas. A seguir, a planta toda ou apenas
o rgo inoculado deve ser mantida em
cmara mida. Esta tcnica pode ser usada
para inoculaes de fungos em quaisquer
rgos da planta. No caso de inoculaes
em folhas, inflorescncia e frutos, o pat-
geno deve ser cultivado em meios base
de gar. No caso de inoculaes em rgos
lenhosos (tronco e raiz) o inculo consistir
de cilindros ou cubos de casca ou pedaos
de galhos finos, previamente colonizados
pelo patgeno em laboratrio.

No caso de cilindros ou cubos de culturas


do patgeno, seguir os seguintes passos:
Usar o meio de cultura BDA ou malte-
gar contendo o patgeno a inocular;
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 97
Dois a trs centmetros abaixo do ponto
de inoculao, deve-se colocar uma me-
cha de algodo embebido em gua;
Recobrir toda essa rea com uma ban-
dagem plstica, a fim de oferecer con-
dies de cmara mida favorveis
infeco.
A cmara mida deve ser removida en-
tre 28 e 30 dias aps a inoculao, e
entre 5 a 6 meses da inoculao os re-
sultados devem ser avaliados, devendo-
se medir o comprimento e a largura da le-
so em nvel da casca e do lenho.
Infestao de solo e inoculao de razes
As maneiras bsicas de infestao do solo
com o patgeno so duas:
A suspenso de inculo (esporos, clami-
dsporos, esclerdios, microesclerdios
ou miclio triturado) deve ser vertida so-
bre certa quantidade de solo necessria
para formar camadas superficiais de at
4,0 cm de espessura em sementeiras ou
recipientes. O resultado satisfatrio da
98
inoculao depende da capacidade com-
petitiva do patgeno com a microbiota,
temperatura e umidade do solo ou subs-
trato. Aps verter o inculo, incorporar a
poro de solo e, a seguir, misturar solo-
-inculo e espalhar sobre a sementeira ou
recipiente. Posteriormente, fazer o plan-
tio ou semeadura do hospedeiro.
Verter o inculo em solo que j tenha o
hospedeiro. Em seguida, fazer a escarifica-
o superficial do solo para facilitar a incor-
porao do inculo. Nesse caso, avaliar o
tombamento de ps-emergncia.

A inoculao de razes com suspenso de


inculo pode ser feita tambm de duas
maneiras:
Com a planta no local Retirar o solo
que recobre as razes e verter sobre elas a
suspenso. Em seguida, voltar com o solo,
recobrindo-as.
C
om a planta arrancada As mudas de-
vem ser arrancadas, lavadas em gua cor-
rente e imersas na suspenso de inculo
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 99
dentro de um recipiente durante um tem-
po varivel, a ser determinado por experi-
mentao prvia. Aps imerso, as mudas
devem ser replantadas.

Exame microscpico
O microscpio ptico de luz (Figura 15)
um equipamento cuja finalidade produzir
uma imagem ampliada e detalhada de alta
resoluo de organismos microscpicos que
no possa ser detectada pelo olho humano.
Em certas situaes, em observaes de cor-
tes histolgicos, o equipamento permite a vi-
sualizao de estruturas fngicas no interior
do tecido vegetativo (como hifas vegetativas,
vesculas e outros) de maneira a estudar a in-
terao fungo-planta e identificar os patge-
nos isolados (PEREIRA; PEREIRA, 2007).

O microscpio um equipamento de pre-


ciso, construdo utilizando-se propriedades
fsicas e funciona com um conjunto de lentes
(ocular e objetiva) que ampliam a imagem
100

Foto: Leandro Rocha

Figura 15.
Microscpio ptico

transpassada por um feixe de luz, correspon-


dendo s dimenses da imagem e do objeto,
a distncias existentes entre a lente e o ponto
de onde se forma a imagem e entre a lente e o
ponto de onde se encontra o objeto.

No laboratrio de fitopatologia o uso da


tcnica de microscopia ptica amplamente
utilizada como a etapa final de identificao
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 101
dos micro-organismos patognicos. Para a
utilizao do microscpio ptico, o usurio
deve ser treinado por pessoal capacitado e
somente quando considerado apto, poder
utilizar o mesmo. O manuseio e cuidados com
o microscpio ptico devem ser consultados
no laboratrio em forma de um procedimen-
to operacional padro, POP 014.2.4.06.4.001,
intitulado Procedimento de operao de mi-
croscopia (EMBRAPA, 2011c).
Procedimento de operao de microscpio
A Figura 16 mostra o diagrama do micros-
cpio tico detalhando as suas partes com-
ponentes para auxiliar o usurio na sua
utilizao, de acordo com os itens de proce-
dimento a seguir:
Levantar o tubo com o ajuste macrom-
trico, girando-o em sentido anti-horrio,
at que as objetivas estejam distantes da
platina (base das lminas);

Caso no esteja devidamente colocada


para a primeira observao, colocar a ob-
102
jetiva de 4X na posio de uso (sempre
comear com a lente de menor aumento);
Colocar a lmina com o espcime a ser
observado sobre a platina, de modo que
o espcime localize-se no centro da aber-
tura da platina, fixando-a com a pina
da platina;
Ligar a lmpada do aparelho na chave si-
tuada na parte frontal da base do micros-
cpio e regular a intensidade de luz, com
auxlio do diafragma situado abaixo da
platina. Caso seja necessrio maior inten-
sidade de luz, ligar a lmpada auxiliar na
chave localizada no lado direito da base
do microscpio e, com auxlio do boto
deslizante situado frente da referida
chave, regular a intensidade da luz;
Observando lateralmente, empregar o
ajuste macromtrico para levar a objeti-
va de menor aumento (4X) at cerca de
5,0 mm da lmina;
Olhar pelas duas oculares, com os dois
Manual Bsico de Tcnicas Fitopatolgicas 103
olhos abertos. Vagarosamente, regular
(levantando ou abaixando) o tubo do
microscpio, com auxlio do ajuste ma-
cromtrico, at que o espcime na lmina
entre em foco;
Realizar um ajuste fino do foco, com aux-
lio do ajuste micromtrico;
Movimentar a platina com auxlio dos bo-
tes de deslocamento, at selecionar uma
rea desejvel para estudo detalhado;
Selecionar uma lente objetiva que pos-
sibilite o estudo do espcime, girando a
objetiva, sem pular lentes, e regulando o
foco com o ajuste micromtrico;
Atentar para o fato de que a lente de 100X
uma lente de imerso a leo e, portanto,
no deve ser utilizada sem o referido leo
aplicado sobre a lamnula;
Aps o estudo do espcime, retornar
objetiva de menor aumento (4X) e levan-
tar o tubo do microscpio com o ajuste
macromtrico;
104
Reduzir a intensidade da luz e desligar a
fonte de luz. Retirar a lmina da platina.
Cobrir com as tampas correspondentes as
oculares e a fonte de luz. Retirar a tomada
da fonte de fora e cobrir o equipamento
com a capa protetora.
1 = ocular
2 = objetivas e revlver
3 = platina
4 = charriot
5 = macromtrico
6 = micromtrico
7 = diafragma no
condensador
8 = condensador
9 = boto do
condensador
10 = dois parafusos
centralizadores do
condensador
11 = fonte de luz
12 = controle de
iluminao

Fonte: POP 014.2.4.06.3.012 Figura 16. Microscpio ptico e diagrama


(EMBRAPA MANDIOCA E
FRUTICULTURA. 2011D).
do equipamento.
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Outros lanamentos:
Controle alternativo de doenas
do mamoeiro.
Controle alternativo das doenas
dos Citros.

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