RrPOE - unieTAR.005.Antibiograma Por Disco Difusión (Kirby-Bauer)

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Cdigo:
LABORATORIO DE BACTERIOLOGA FMVZ.UNIETAR.POE.005

Versin: 001
Antibiograma por Disco Difusin
(Kirby-Bauer) Fecha: 17-07-2017
Antibiograma por Disco Difusin (Kirby-Bauer)
El presente documento ofrece una gua que promueva un ambiente de trabajo

adecuado y seguro durante la funcin de actividades que realizan los profesionales,
personal de apoyo y estudiantes, que laboran y/o realizan prcticas dentro de la
UNIETAR.
1 Objetivo
Determinar la resistencia de bacterias a los antibiticos por un mtodo fenotpico.
2 Alcance
Se aplica para todas las muestras de origen agropecuario que sern analizadas en
la UNIETAR.
3 Simbologa y abreviaturas
FMVZ: Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

MP: Manual de Procedimientos
POE: Procedimiento Operativo Estandarizado
UCE: Universidad Central del Ecuador
UNIETAR: Unidad de Investigacin de Enfermedades Transmitidas por Alimentos
y Resistencias a los Antimicrobianos
EUCAST: Comit Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana
Agar MH: Agar Mueller Hinton
CMI: Concentracin mnima inhibitoria
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
S: Sensible
I: Intermedio
Versin: 001
R: Resistente
mm: Milmetro
mL: Mililitro
4 Responsabilidades
Es responsabilidad del Coordinador de la UNIETAR la aplicacin, modificacin y

cumplimiento del presente manual.
5 Definiciones
Mtodo de Kirby-Bauer
Mtodo cualitativo en el cual se utilizan discos de papel absorbente impregnados
con una concentracin conocida de antibitico. Los discos son colocados en un
medio de cultivo slido que previamente ha sido inoculado con la cepa a analizarse.
Mediante este mtodo se puede clasificar a una bacteria como sensible o resistente
a travs de la medicin de la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano (OIE,
2012; Rodrguez, Gamboa, Hernndez, & Garca, 2005).
Resistencia a los antimicrobianos
La resistencia a los antimicrobianos es la capacidad que tienen los microorganismos

para resistir los efectos de los frmacos (CDC, 2017).
Escala de McFarland
En microbiologa los estndares de turbidez de McFarland se usan como referencia

en suspensiones bacteriolgicas para conocer el nmero de bacterias por mililitro.
Una turbidez equivalente al 0.5 de McFarland representa aproximadamente 1.5 x
108 UFC/ml (Pastern & Galas, 2008).
6 Materiales, Reactivos y Equipos

Versin: 001
6.1 Materiales
Asa de platino
Guantes desechables
Tubos de ensayo de 5ml
Gradilla para tubos de cristal
Hisopos
Pinzas estriles
Cajas Petri
6.2 Reactivos
Agar Mueller Hinton
Solucin fisiolgica o agua estril
Escala de McFarland 0.5
Discos para pruebas de sensibilidad (antibiticos)
6.3 Equipos
Mechero bunsen o cmara de bioseguridad
Incubadora a 37C
Agitador tipo vrtex
7 Descripcin del procedimiento
7.1 Procedimiento
Proceso para realizar un antibiograma basado en el EUCAST (2014):
7.2 Preparacin del medio de cultivo:
Preparar el agar MH segn las condiciones del fabricante (Anexo C).
El espesor del medio en cada caja debe ser de 4 mm 0.5 mm (23 mL para una
placa redonda de 85 mm, 31 mL para una placa redonda de 100 mm). Antes
utilizar las cajas, la superficie del agar debe estar seca. El tiempo necesario
depender de las condiciones de almacenamiento y de secado. No secar las
placas en exceso.
7.3 Preparacin del inculo (Mtodo de suspensin directa de colonias):
Versin: 001
Realizar la suspensin a partir de un cultivo sembrado en un medio no selectivo

e incubado durante 18 a 24 horas.
Con un hisopo o asa estril tomar varias colonias de morfologa similar (3-4
colonias) y suspender las colonias en un tubo de ensayo con solucin salina
estril (4-5 ml) (Anexo D). Dicha suspensin debe ser agitada en el vrtex.
Luego con la ayuda del densitmetro, estandarizar la suspensin del inculo a
una densidad de 0,5 de la escala de McFarland (Un inculo ms denso dar
lugar a halos de inhibicin ms pequeos y un inculo ms diluido tendr el
efecto contrario). Como alternativa, la densidad de la suspensin se puede
comparar visualmente con una suspensin estndar de turbidez equivalente al
0,5 de McFarland.
Para ajustar la densidad de la suspensin al 0,5 de McFarland se aade solucin
salina o ms cantidad del microorganismo.
La suspensin deber ser utilizada en los 15 minutos siguientes a su preparacin
y siempre dentro de los 60 minutos.
7.4 Inoculacin de las placas de agar:
Introducir un hisopo estril en la suspensin y retirar el exceso de lquido girando
el hisopo contra las paredes del tubo.
Es importante retirar el exceso de lquido del hisopo para evitar el sobreinculo,
sobre todo en el caso de los microorganismos gramnegativos.
Distribuir el inculo homogneamente sobre toda la superficie del agar MH
inoculndolo en tres direcciones, procurar dispensar hasta los bordes de la caja.
7.5 Aplicacin de los discos de antibiticos e incubacin de las placas
Con una pinza estril colocar los discos firmemente sobre la superficie del agar
ejerciendo una ligera presin.
Colocar los discos de antibiticos dentro de los 15 minutos siguientes a la
inoculacin.
Versin: 001
El nmero de discos que pueden colocarse en una placa debe ser limitado, para
evitar la superposicin de los halos. No se deben colocar ms de 6 discos en
una placa circular de 90mm ni ms de 12 en la placa circular de 150mm.
Una vez que se han colocado los discos las cajas deben incubarse a 371C por
16-20 horas.
Las cajas deben incubarse en forma invertida para evitar que el agua
condensada caiga sobre el agar.
7.6 Control de calidad
Es importante utilizar cepas de control (Ej. cepas ATCC, NCTC, TIAC)
especficas para comprobar el rendimiento de la prueba.
La mayora de las cepas recomendadas son sensibles a los antimicrobianos.
7.7 Medida de los halos e interpretacin de la sensibilidad
La lectura se realiza a travs de la medicin de los halos de inhibicin.
Leer las placas por el reverso contra un fondo negro iluminado con luz reflejada.
Realizar la lectura de los halos con una regla, calibrador o con un lector
automtico de halos.
Figura 1. Izquierda: Lectura de halos con un calibrador; derecha: Los bordes del halo deben ser ledos en el
punto de inhibicin completa.
Interpretar los dimetros de los halos siguiendo las tablas de puntos de corte
establecidos en el manual del CLSI y EUCAST (www.eucast.org/) (Anexo B).
Todo material en contacto con bacterias se debe autoclavar antes de eliminar.
8 Referencias bibliogrficas
CDC. (2017). About Antimicrobial Resistance. Retrieved June 29, 2017, from
Versin: 001
https://www.cdc.gov/drugresistance/about.html
CLSI. (2013). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;
Twenty-Fifth Informational Supplement (M100-S25). Wayne.
EUCAST. (2014). Mtodo de difusin con discos para el estudio de la
sensibilidad a los antimicrobianos. Retrieved June 23, 2017, from
http://coesant-seimc.org/documents/EUCAST-
Guiadelecturadifusioncondiscos_v4.pdf
OIE. (2012). Laboratory methodologies for bacterial antimicrobial susceptibility
testing. In OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals
(7th ed., p. 1314). Francia.
Pastern, F., & Galas, M. (2008). Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los
antimicrobianos en Salmonella, Shigella y E. coli. (WHO-Global Salm Surv,
Ed.).
Rodrguez Cavallini, E., Gamboa Coronado, M. del M., Hernndez Chavarra,
F., & Garca Hidalgo, J. (2005). Bacteriologa General: Principios Y Prcticas
de Laboratorio. Editorial de la Universidad de Costa Rica.
9 Anexo
9.1 Anexo A: Tcnica de siembra para el antibiograma

Versin: 001
9.2 Anexo B: Ejemplo de puntos de corte para Enterobacterias segn el CLSI (2013)
Estndar E. coli ATCC
Antimicrobiano Concentracin Interpretativo (mm) 259222
del disco (ug) R I S intervalo
Penicilinas
Ampicilina 10 13 14-16 17 16-22
Mezlocilina 75 17 18-20 21 23-29
Ticarcilina 75 14 15-19 20 24-30
Piperacilina 100 17 18-20 21 24-30
Betalactmicos
combinados
Amoxicilina/cido
clavulnico 20/10 13 14-17 18 19-25
Ampicilina/sulbactam 10/10 11 12-14 15 20-24
Piperacilina/tazobactam 100/10 17 18-20 21 24-30
Ticarcilina/cido clavulnico 75/10 14 15-19 20 25-29
Cefalosporinas
Cefalotina 30 14 15-17 18 15-21
Cefazolina 30 14 15-17 18 23-29
Cefamadol 30 14 15-17 18 26-31
Cefonicid 30 14 15-17 18 25-29
Cefuroxima (oral) 30 14 15-22 23 20-26
Cefpodoxima 10 17 18-20 21 23-28
Cefixima 5 15 16-18 19 23-27
Cefoxitina 30 14 15-17 18 23-29
Cefotetan 30 12 13-15 16 28-34
Cefmetazol 30 12 13-15 16 26-32
Cefoperazona 75 15 16-20 21 28-34
Cefotaxima 30 14 15-22 23 29-35
Ceftizoxima 30 14 15-19 20 30-36
Ceftriaxona 30 13 14-20 21 25-35
Cefepima 30 14 15-17 18 29-35
Ceftazidima 30 14 15-17 18 25-32
Monobactmico
Aztreonam 30 15 16-21 22 28-36
Versin: 001
9.2 Anexo B: Ejemplo de puntos de corte para Enterobacterias segn el CLSI (2013)
(continuacin)
Estndar E. coli ATCC
Antimicrobiano Concentracin Interpretativo (mm) 259222
del disco (ug) R I S intervalo
Carbapenmicos
Doripenem 10 19 20-22 23 27-35
Ertapenem 10 18 19-21 22 29-36
Imipenem 10 13 14-15 16 26-32
Meropenem 10 13 14-15 16 28-34
Aminoglucsidos
Gentamicina 10 12 13-14 15 19-26
Estreptomicina 10 11 12-14 15 12-20
Amikacina 30 14 15-16 17 19-26
Kanamicina 30 13 14-17 18 17-25
Netilmicina 30 12 13-14 15 22-30
Tobramicina 10 12 13-14 15 18-26
Tetraciclinas
Tetraciclina 30 11 12-14 15 18-25
Doxiciclina 30 10 11-13 14 18-24
Minociclina 30 12 13-15 16 19-25
Fluoroquinolonas
Ciproflaxacino 5 15 16-20 21 30-40
Levofloxacino 5 13 14-15 17 29-37
Ofloxacino 5 12 13-15 16 29-33
Norfloxacino 10 12 13-16 17 28-35
cido Nalidxico 30 13 14-18 19 22-28
Fenicoles
Cloranfenicol 30 12 13-17 32 21-27
Fosfomicinas
Fosfomicina 200 12 13-15 16 22-30
Nitrofuranos
Nitrofurantona 300 14 15-16 17 20-25
Inhibidores de la va del
folato
Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75 10 11-15 16 24-32
Sulfisoxazol 250 o 300 12 13-16 17 15-23
Trimetoprim 5 10 11-15 16 21-28
9.3 Anexo C: Preparacin de Agar Mueller Hinton (DifcoTM BD)

Presentacin: Agar: 500 g Cdigo: 225250
Frmula* del agar por litro de agua purificada

Versin: 001
Extracto de carne bovina 2,0 g

Hidrolizado cido de casena 17,5g
Almidn 1,5g
Agar 17,0g
pH 7,3 +/- 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento
Preparacin
Suspender 38,0 g del polvo en 1 L de agua purificada. Mezclar bien.
Con la ayuda de un horno microondas calentar la mezcla agitando
frecuentemente y dejar que hierva durante aproximadamente un minuto.
Autoclavar la mezcla.
Posterior a ello, esperar a que el medio se enfre (45-50C) y dispensar en cajas
Petri.
Una vez que el medio se ha solidificado, guardar las cajas en bolsas plticas
cerradas hermticamente y almacenarlas en refrigeracin a 4-8C.
9.4 Anexo D: Preparacin de Sodium Chloride, Crystal (J.T. Baker )
Presentacin: Agar: 500 g Cdigo: 3624-19
Frmula* del agar por litro de agua purificada

Ensayo (NaCl) 99.97 %
Materia insoluble 0,002 %
pH de 5 % Solucin en 25 C 6,0
Yoduro (I) 0,0005 %
Bromuro (Br) 0,005 %
Clorato y nitrato (NO3) 0,001 %
Sulfato (SO4) 0,002 %
Bario (Ba) Pasa la prueba
Calcio (Ca) 0,0004 %
Magnesio (Mg) 0,0002 %
Versin: 001
Potasio (K) 0,001 %

Trazas de impurezas (en ppm):
Fosfato (PO) 1,0
Metales pesados (como Pb) 1.0
Hierro (Fe) 0,4
pH 7,3 +/- 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento
Preparacin
Suspender 8,5 gramos en 1 L de agua destilada. Mezclar bien.
Autoclavar la solucin.
Esperar hasta que la solucin de cloruro de sodio al 0.85% se enfre por
completo para luego almacenarla en refrigeracin a 4-8C.
Versin: 001
10 Flujograma
Versin: 001
11 Elaboracin, revisin y aprobacin
Elaborado por: Revisado por:

Cristina Logacho M.V.Z Sofa de Janon M.V.Z.
Revisado por:
Revisado por:
Dra. Mara Ins Baquero Coordinadora del
Dr. Christian Vinueza Coordinador UNIETAR
Laboratorio de Bacteriologa
Aprobado por:
Revisado por:
Dr. Eduardo Aragn Decano de la Facultad de
Dr. Fernando Pazmio Coordinador de la sub
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
comisin de laboratorios FMVZ-UCE
Universidad Central del Ecuador
12 Modificaciones
Fecha de la
Versin
ltima Detalle de la modificacin
Modificada
modificacin

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La resistencia a los antimicrobianos es la capacidad que tienen los microorganismos

En microbiologa los estndares de turbidez de McFarland se usan como referencia

6 Materiales, Reactivos y Equipos

7 Descripcin del procedimiento

Realizar la suspensin a partir de un cultivo sembrado en un medio no selectivo

9.1 Anexo A: Tcnica de siembra para el antibiograma

9.3 Anexo C: Preparacin de Agar Mueller Hinton (DifcoTM BD)

Frmula* del agar por litro de agua purificada

Extracto de carne bovina 2,0 g

Frmula* del agar por litro de agua purificada

Potasio (K) 0,001 %

11 Elaboracin, revisin y aprobacin

Elaborado por: Revisado por:

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