Revista Internacional de

ciencias moleculares

artculo

T RII regula la proliferacin de las metanfrico mesnquima a

travs de clulas in vitro SIX2

Mao Zhaomin , Zhongshi Lyu , Liyuan Huang, Qin Zhou y Yaguang Weng *

El Laboratorio MOE clave de laboratorio de diagnsticos mdicos, la Facultad de Medicina de Laboratorio de la Universidad Mdica
de Chongqing, Chongqing 400 016, China; mao1204086118@163.com (ZM); 284003771@163.com (ZL); lyhuang0603@sina.com
(LH); zhouqin@cqmu.edu.cn (QZ)
* Correspondencia: yaguangweng@126.com; Tel.: + 86-137-0831-6932 Comentarios Estos autores
contribuyeron igualmente a este trabajo.

Editor Acadmico: Gregor Drummen

Recibido: 12 Febrero de 2017 Aceptado: 11 Abril de 2017 Publicado: 18 Abril 2017

Resumen: El factor de crecimiento transformante ( TGF ) las vas de sealizacin de la familia juegan un papel importante en las redes de
regulacin celular y efectos ejercen especficos sobre los programas de desarrollo durante el desarrollo del embrin. Sin embargo, la funcin de
TGF las vas de sealizacin en el desarrollo temprano del rin sigue sin estar clara. En este trabajo, nuestro objetivo es detectar el papel
fundamental de TGF receptor de tipo II (T RII) in vitro, la cual tiene un patrn de expresin similar como el regulador fundamental SIX2 durante
el desarrollo renal temprana. En primer lugar, el 5-etinil-2 r - desoxiuridina (EDU) ensayo mostr derribar de T RII

Disminuy significativamente la relacin de proliferacin de clulas de mesnquima metanfrico (MM). Adems, en tiempo real de reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) y Western blot junto con inmunofluorescencia determin que los niveles de ARNm y de protena de SIX2
disminuyeron despus de T RII derribar. tambin, SIX2
se observ que era capaz de rescatar parcialmente la proliferacin fenotipo la causada por el agotamiento de
T RII. Adems, el anlisis de la bioinformtica y de ensayo de luciferasa indican recursos podran objetivos transcriptionally Smad3 SIX2. Adems,
el ensayo de Comunidades tambin mostr que Smad3 poda rescatar la inhibicin de la proliferacin de la causada por el golpe hacia abajo de T
RII. Tomados en conjunto, opiniones Estos hallazgos delinean la funcin importante del TGF va de sealizacin en el desarrollo temprano de
rin y T RII se demostr que era capaz de promover la expresin de SIX2 a travs de la mediacin de Smad3 regulacin transcripcional y a su
vez activan la proliferacin de clulas de MM.

palabras clave: T RII; SIX2; smad3; el desarrollo del rin; proliferacin

1. introduccin

El factor de crecimiento transformante ( TGF ) vas de sealizacin de la familia estn compuestos de varias protenas estrechamente
relacionadas compartir algunas roomates homologa estructural, sino que tenga receptores separados y participar en diferentes funciones;
por ejemplo, TGF activado ligandos se unen al tipo 2 TGF receptor, el cual es una quinasa, la que recluta, fosforila y activa el receptor de
tipo 1 que fosforila Smads regulados por el receptor de obligar a la co-Smads, actuando como factores transcripcionales [ 1 ]. Esto conduce a
la activacin de diferentes dianas genes aguas abajo que funcionan en muchos procesos celulares, incluyendo la proliferacin, la
diferenciacin, la apoptosis, el crecimiento celular, y otras funciones celulares tanto en embrin y adultos organismo [ 1 , 2 ].

Durante el desarrollo del rin, hay un equilibrio entre el consumo (diferenciacin) y autorrenovacin (proliferacin) de las clulas
mesenquimales de la nefrona positivo progenitoras SIX2 (clulas tapa mesnquima) con el fin de formar el complemento completo de
nefronas y dotacin nefrona. El primero se haban instruido por las interacciones inductivas recprocas de clulas de la yema ureteral [ 3 - 5 ],
El que secretan Wnt9b, la activacin de un Wnt cannica - va de sealizacin catenina en clulas tapa mesnquima [ 6 - 9 ]. La va de Wnt
cannica conduce a la degradacin de la GSK-3 / CK1 / AXIN2 / poliposis adenomatosa coli

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(APC) complejo y la translocacin de citoslica - catenina en el ncleo, la promocin de sus instalaciones para incorporar los genes diana WNT4
y Fgf8. WNT4 y Fgf8 Expresa en las clulas tapa mesnquima entonces Comentarios gatillo su diferenciacin (mesenquimales-a-epitelial de
transicin (MET)) en una estructura-renal epitelial de vesculas [ 10 , 11 ], El que posteriormente da lugar a un nico nefrn. El desarrollo de
nefronas se basa en SIX2, con alta expresin en clulas de mesnquima de cabeza y baja expresin en vesculas renales, y es el regulador
transcripcional crucial para promover la proliferacin de clulas tapa mesnquima y la inhibicin WNT4 y Fgf8- Comentarios Estos
diferenciacin mediada por las clulas. SIX2 ratones knockout muestran diferenciacin ectpico, el agotamiento de clulas mesnquima
metanfrico, e hipoplasia renal y displasia [ 5 , 12 ].

Aunque SIX2 sirve una funcin esencial en la nefrona clulas progenitoras de mantenimiento durante el desarrollo renal temprana, se
sabe poco sobre su regulacin aguas arriba subyacente y vas de sealizacin relacionadas. En este estudio, hemos demostrado que el
TGF receptor de tipo II (T RII) tiene un patrn con SIX2 expresin similar durante el desarrollo del rin, en lnea con el anterior
ARN-secuenciacin trabajo de investigacin [ 13 ] Documentacin que T RII posee una mayor expresin en las clulas tapa mesnquima, y
una menor expresin en vesculas renales. T RII ronda en el mesnquima metanfrico lnea celular (MM) impidi la proliferacin de clulas
mesnquima metanfrico y la fosforilacin de su factor de transcripcin aguas abajo smad3 as como la expresin de SIX2 en los niveles de
ARNm y de protenas. La sobreexpresin de SIX2 fue capaz de rescatar la T RII deplecin de la inhibicin causada de fenotipo de
proliferacin. Adems, el TGF ligandos activa la fosforilacin de Smad3 y ha mejorado la expresin de SIX2, mientras que la inhibicin de
la TGF va de sealizacin por SB431542 Disminucin de la expresin de SIX2 y suprime la proliferacin de clulas MK3. Un anlisis ms
detallado demostr que smad3, activado por TGF

va de sealizacin, regulado transcripcionalmente SIX2 y rescat la proliferacin fenotipo la causada por la cada de T RII. Nuestra
investigacin revel que el efecto funcional de T RII en clulas de mesnquima metanfrico y elaborado en cuanto a su mecanismo
molecular especfico SIX2 regulacin durante el desarrollo del rin.

2. resultados

2.1. T RII promovido la tasa de proliferacin de metanfrico mesnquima clulas (MM)

Para explorar si T RII estuvo involucrado en el desarrollo del rin temprano, el primero en detectar el patrn de expresin de T RII
durante el desarrollo temprano de rin E11.5 a E14.5. Hemos encontrado que
T RII ejerci una expresin relativamente ms alta en E11.5 rin de embrin y una expresin relativamente baja despus de E11.5, que estaba en lnea
con el ARN de las secuencias de datos [ 13 ] Y se indica recursos para un papel importante de

T RII durante el desarrollo renal temprana. A continuacin transfectadas la (control negativo con la secuencia desorganizado; 100 nM)
siCTL y el siRNA de T RII ( SIT RII) (100 nM) en las lneas celulares MK3 [ 14 ]. Luego se realiz el tiempo real de reaccin en cadena de
polimerasa (PCR) para detectar la expresin de
T RII en el nivel de mRNA y se encontr que la T RII se redujo significativamente (Figura 1 B). A continuacin, un anillo de 5-

etinil-2 r - desoxiuridina (EDU) ensayo se llev a cabo para identificar la tasa de proliferacin de las clulas MK3 despus de la transfeccin, y los
resultados mostraron que la tasa de proliferacin se redujo casi a la mitad (Figura 1 C, D). Comentarios Estos recursos indicados de datos que T RII podra
promover la proliferacin de clulas de MM.

2.2. T RII aument la expresin de SIX2

A continuacin, se analiz el posible mecanismo relativo a la proliferacin despus de la cada de

T RII. Con el fin de investigar este problema, se detect por primera vez el patrn de expresin de SIX2, el cual es uno de los reguladores
MM ms clsicos de proliferacin, durante el desarrollo temprano del rin y se encontr que el los datos estaba en lnea con el ARN de las
secuencias de datos que mostraron una mayor expresin de SIX2 y T RII en E11.5 rin de embrin y una menor expresin de ellos en
E12.5 rin de embriones (Figura 2 A). Tras el descubrimiento de la expresin tendencias similares, queramos explorar la interrelacin entre
los datos. Por lo tanto, transfectadas el siRNA (100 nM) MK3 en las clulas, y primero detect la expresin de SIX2 por PCR en tiempo real.
El resultado demostr que el nivel de mRNA de SIX2 Disminuido en ms
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de un 50% (Figura 2 B). Despus del golpe de abajo T RII, el nivel de protena de T RII, SIX2, y p-Smad3 se redujo significativamente,
mientras que la expresin de T RI y Smad3 no mostraron cambio evidente (Figura 2 C). En lnea con los resultados anteriores, la
inmunofluorescencia tambin demostr una notable disminucin despus de que el golpe hacia abajo de T RII en clulas MK3 (Figura 2 D).
Estos datos Comentarios sugiri que T RII podra regular positivamente la expresin de SIX2 tanto a nivel de ARNm y protenas.

Figura 1. TGF tipo II receptor ( T RII) MK3 promueve la proliferacin de las clulas. ( A) El patrn de expresin de T RII en el nivel de mRNA

de rin embrionario de E11.5 a E14.5; ( B) Los niveles de ARNm de T RII en clulas MK3 despus del tratamiento de la SIT RII; ( C) La tasa

de proliferacin MK3 de las clulas despus de la transfeccin de SIT RII; ( D) El histograma muestra el anlisis cuantitativo de la 5-etinil-2 r - desoxiuridina

(EDU) de ensayo. Todos los datos se muestran como medios La desviacin estndar (DE) de tres experimentos independientes,

* p < 0:05, ** p < 0:01.

La Figura 2. T RII aumenta la expresin de SIX2 en clulas MK3. ( A) El patrn de expresin de SIX2 en el nivel de mRNA de rin

embrionario de E11.5 a E14.5; ( B) Los niveles de ARNm de SIX2 en clulas MK3 despus del tratamiento de la SIT RII; ( C) El nivel de protena

de SIX2, p-Smad3, Smad3, y T RI en clulas MK3 despus del tratamiento de la SIT RII; ( D) La inmunofluorescencia de SIX2 despus del

tratamiento de la SIT RII. Todos los datos se muestran como medios SD de tres experimentos independientes, ** p < 0:01, *** p < 0001.
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2.3. La sobreexpresin de SIX2 puede rescatar la proliferacin de las clulas de MM inducida por T RII Deficiencia

Para explorar an ms la funcin importante de SIX2 en la inhibicin de la proliferacin de la causada por la cada de T RII, que
co-transfectadas SIT RII con SIX2 vector de expresin (pcDNA3.1 (+) SIX2) MK3 en las clulas, y posteriormente se realiz un ensayo de
edu. Como se muestra en la figura 3 A, B, en comparacin con las clulas transfectadas con MK3 SIT RII y el vector de control (pcDNA3.1
(+)), co-transfeccin de SIT RII y pcDNA3.1 (+) SIX2 pueden aliviar en parte los niveles de proliferacin inhibidos. Por lo tanto, SIX2
sobreexpresin podra rescatar parcialmente la proliferacin de clulas suprimido la causada por la deficiencia de T RII.

Figura 3. SIX2 rescata el fenotipo de proliferacin. ( A) La tasa de proliferacin MK3 de las clulas despus de la transfeccin de SIT RII y la
co-transfeccin de SIX2; ( B) El histograma muestra el anlisis cuantitativo del ensayo Edu anteriormente. Todos los datos se muestran como
medios SD de tres experimentos independientes,
* p < 0:05.

2.4. Smad3 puede transcripcionalmente SIX2 y parcialmente rescate Regular el fenotipo de proliferacin

Para confirmar an ms la funcin del TGF va de sealizacin hacia SIX2, que estimularon las clulas con TGF MK3 I factor de 24
y 48 h, y los resultados demostraron un aumento gradual de de SIX2 tanto en los niveles de ARNm y de protenas, junto con un aumento
significativo de la fosforilacin es Smad3 (p-Smad3) (Figura 4 A, B). La adicin de p-Smad3 SB431542 inhibidor se muestra a disminuir de
manera significativa la expresin de SIX2 y suprimir la expresin de la mquina de Ki67 proliferacin (Figura 4 C). Comentarios Estos
verificados los datos a la conclusin de que la activacin del TGF va de sealizacin podra promover la expresin de SIX2 tanto en los
niveles de mRNA y protena.

Con el fin de identificar el factor de transcripcin especfico de SIX2, Se analiz la secuencia del promotor de SIX2 ( USSC) y
registraron el factor de transcripcin predicho a travs de la versin 2.0 PROMO (Universitat Polit cnica de Catalunya, Barcelona, Espaa) [ 15
, 16 ]. Nos hemos centrado en el factor predicho smad3
(de - 114 a - 124 pb) (TGTCTGGCGC) con la menor disimilitud (2: 19%) (Figura 4 D). Mientras tanto, se detect el ARNm de smad3 con tres
pares de cebador despus de la cada de T RII y el resultado no mostr significacin estadstica (Figura 4 E). La fuerza de TGF sealizacin
en ausencia de T RII fue evaluada a travs de la expresin de p-Smad3, y el resultado demostr que desmontables de T RII podra
disminuir la expresin de p-Smad3 [ 17 ] Y la adicin de TGF Factor I no dio lugar a un aumento obvio es de p-Smad3 (Figura 4 F). A
continuacin, se realiz el ensayo de luciferasa para identificar si Smad3 podra regular positivamente la actividad de la luciferasa de la SIX2 promotor.

la
resultado mostr que Smad3 podra aumentar notablemente de la actividad del promotor, el cual indica los recursos Smad3 que podran
promover la expresin de SIX2, y la estimulacin de TGF Poda magnificar el cambio veces en comparacin con las clulas transfectadas con
Smad3 pero sin TGF I estimulacin (Figura 4 G). Adems, la sobreexpresin de Smad3 fue capaz de aumentar tanto los niveles de ARNm y de
protena de SIX2 (Figura 4 H, I). Comentarios Estos demostraron que los datos podran regular transcripcionalmente Smad3 SIX2. Para detectar
la
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funcin proliferacin de Smad3, que sobreexpresa Smad3 en las clulas transfectadas con MK3 SIT RII. En comparacin con las clulas
transfectadas con MK3 SIT RII y pcDNA3.1 (+), la co-transfeccin de SIT RII y pcDNA3.1 (+) - Smad3 fue capaz de rescatar parcialmente
el fenotipo de proliferacin (Figura 4 J, K). Todos los datos demostraron que Smad3 puede regular SIX2 transcripcionalmente y parcialmente
aliviar la proliferacin inhibida.

La Figura 4. smad3 regula transcripcionalmente SIX2 y rescata el fenotipo de proliferacin.

(A) Los niveles de ARNm de SIX2 en el marco del curso de tiempo de la estimulacin TGF I (2 ng / ml); ( B) Los niveles de protena de SIX2 y

p-Smad3 en el marco del curso de tiempo de la estimulacin TGF I (2 ng / ml); ( C) El nivel de protena de SIX2 y Ki67 despus del tratamiento de la

fosforilacin de Smad3 (p-Smad3) inhibidor SB431542 (10 M) durante 48 h; ( D) El anlisis promotor de SIX2 a travs de una herramienta de

prediccin de Internet (pgina web:

http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3 ); ( E) La deteccin de los niveles de mRNA de Smad3 mediante tres

pares de cebador en clulas MK3 despus del tratamiento de la SIT RII; ( F) Los niveles de protena de p-Smad3 con o sin la estimulacin de

TGF I (2 ng / ml) durante 48 h despus de la detonacin abajo de T RII; ( G) PRL-SV40 y SIX2 promotor vector indicador de luciferasa junto con

el control o Smad3 bajo la estimulacin de TGF I (2 ng / ml) durante 48 h se transfectaron en clulas HEK293. Despus de 48 h, las clulas se

lisaron y se detectaron y se normaliz a la actividad de Renilla las fluorescencias; ( H) Los niveles de ARNm de SIX2 despus de la

sobreexpresin de Smad3 en clulas MK3; ( I) El nivel de protena de SIX2 despus de la sobreexpresin de Smad3 en clulas MK3; ( J) La tasa

de proliferacin MK3 de las clulas despus de la transfeccin de SIT RII y la co-transfeccin de Smad3; ( K) El histograma muestra el anlisis

cuantitativo de las Comunidades de ensayo anteriores; ( K) La tasa de proliferacin MK3 de las clulas despus de la transfeccin de SIT RII y el

co-transfeccin de Smad3. Todos los datos se muestran como medios SD de tres experimentos independientes.

* p < 0:05, ** p < 0:01, *** p < 0001.

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3. discusiones

El desarrollo de rin debe equilibrar el mantenimiento de las clulas progenitoras renales (cap mesnquima) y su diferenciacin en
componentes maduras de la nefrona, el mecanismo molecular de la que es las acciones opuestas de - catenina y SIX2 en mesnquima
tapa. SIX2, el regulador de clulas renales pluripotentes, juega un papel crucial en el mantenimiento de la auto-renovacin de las clulas
mesenquimales sello, y la supresin de SIX2 perturbar el equilibrio de progenitores de la nefrona entre auto-renovacin y diferenciacin [ 5 , 6
, 18 ]. Comentarios Estos estudios de investigacin a entender que la investigacin de los factores de regulacin aguas arriba hacia SIX2 es
de gran importancia. Segn los informes asociados limitados, la familia miR181 es capaz directamente dirigido a la 3 r UTR de SIX2 y
suprimir su expresin [ 18 , 19 ], La recombinacin seal de la protena de unin para la inmunoglobulina regin kappa J (rbpj) es suficiente
para
el Down-
regulacin de SIX2 [ 20 ], Notch2 puede cerrar el programa progenitora mediada SIX2 para el mantenimiento [ 21 ], Y Pax2 / EYA1 / Hox11
complejo se une al promotor proximal de SIX2 As habl y regula su expresin [ 22 ].

Recientemente, T RII ha demostrado tener un patrn de expresin similar con SIX2, el factor de transcripcin esencial el
mantenimiento de la auto-renovacin de la mesnquima tapa, entre mesnquima tapa (CM) y las vesculas renales (RVs). Para definir el
efecto y el mecanismo subyacente de T RII durante el desarrollo del rin especficamente, que inhibe la expresin de T RII a travs de
siRNA en la lnea celular MK3 y encontr que T RII MK3 promovi la proliferacin de las clulas y SIX2 expresin, el cual puede ser
rescatado por
SIX2 sobreexpresin. Un anlisis ms detallado de la bioinformtica predijo los sitios de unin putativos de smad3 en la regin promotora de SIX2.
Un ensayo de la luciferasa subsiguiente se verific que Smad3 podra transcriptionally objetivos SIX2. Por otra parte, el papel de Smad3 en el
TGF va de sealizacin en las clulas MK3 tambin fue confirmada por el ensayo de rescate de experimento proliferacin clulas MK3.

4. Materiales y Mtodos

4.1. Cultivo de clulas y transfeccin

De rin embrionario humano 293 (HEK293) y MK3 clulas fueron cultivadas en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM)
(Gibco, Carls-malo, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gemini, Shanghai, China), penicilina y estreptomicina
(Gibco) a 37 C, 5% de CO 2 y 100% de humedad. Todos los plsmidos y siRNA (GenePharma, Shanghai, China) (la secuencia se
enumeran en la Tabla S1) fueron transfectadas mediante Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) segn las instrucciones
del fabricante.

4.2. Construccin del plsmido

La secuencia codificante (CDS) de SIX2 se amplific mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc de clulas
MK3 y se clon en el sitio de BamHI y EcoRI para generar pcDNA3.1 (+) - SIX2. Los CDS de Smad3 se amplific mediante PCR a partir de
clulas HEK293 y se clonaron en pcDNA3.1 (+). El promotor de
SIX2 se amplific a partir C57BL / 6 ADN genmico y se inserta en la corriente arriba de la luciferasa secuencias de pcDNA3.1-luciferasa
vector reportero de codificacin. La informacin primaria se proporciona en la Tabla S2.

4.3. Ensayo indicador de luciferasa

Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa como se describe anteriormente [ 18 ].

4.4. Coleccin de rin de embriones

La maana del descubrimiento del tapn vaginal fue considerado como E0.5. Esperamos hasta E11.5, E12.5, E13.5, E14.5 y,
recogido de los riones Comentarios Estos embriones, y los almacen en - 80 C.
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4.5. Tiempo real de reaccin en cadena de polimerasa (PCR)

Total MK3 embrin de rin ARN celular y el ARN se extrajeron con TRIzol (Invitrogen) y el ARN se transcrito de forma inversa
usando el kit First-Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Walham, MA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
reacciones de PCR cuantitativa se realizaron utilizando UltraSYBR Mezcla (CWBIO, Guangzhou, China). Los niveles de expresin de SIX2,
Smad3, y T RII se normalizaron a la de 18 s. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S2.

4.6. Western Blot

Las clulas MK3 se recogieron 48 h despus de la transfeccin. Las protenas se extrajeron siguiendo el procedimiento como se
describe anteriormente [ 18 ]. Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (anti-ratn - Tubulina (dilucin 1: 2000, Cell Signaling
Technology, Beverly, MA, EE.UU.); SIX2 anti-conejo (1: 1000 dilucin, Proteintech, Wuhan, China); de conejo anti-T RII (1: 300 dilucin,
aumentador de presin, Wuhan, China); de conejo anti-T (: Dilucin 500, Proteintech 1); RI conejo anti-Smad3 (Cell Signaling Technology);
de conejo anti-p-Smad3 (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) a 4 C durante la noche. Los anticuerpos secundarios fueron de cabra
anti-inmunoglobulina G de conejo (IgG) y de cabra anti-IgG de ratn (dilucin 1: 5000, Proteintech). Las seales quimioluminiscentes finales
fueron desarrollados por peroxidasa de rbano (HRP) reactivo sustrato (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y se detectaron con XRS
ChemiDoc + (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

4.7. La estimulacin de drogas

Las clulas MK3 y clulas HEK 293 fueron tratados con TGF I Factor (Novoprotein, Shanghai, China) (disuelto en H estril
doblemente destilada 2 O (DDH 2 O)) con la concentracin final de 2 ng / ml durante 24 h o 48 h. Las clulas MK3 fueron tratadas con
SB431542 (MedChem Express, Monmouth Junction, NJ, EE.UU.) (disuelto en estril dimetilsulfxido (DMSO)) con la concentracin final de
10 M durante 48 h.

4.8. inmunofluorescencia

Cuarenta y ocho horas despus de la transfeccin, las clulas MK3 se fijaron con paraformaldehdo al 4% a temperatura ambiente durante 20
min, despus se lavaron con solucin de tampn fosfato (PBS) durante 5 min tres veces y se bloquearon con suero de cabra al 10% con 0,1% de
Triton X -100 en PBS a temperatura ambiente durante 1 h.
Despus, las clulas se incubaron con el anticuerpo primario (anti-conejo SIX2, dilucin 1: 100, Proteintech) a 4 C durante la noche. Las
clulas se lavaron tres veces con PBS durante 5 min y se incubaron con el anticuerpo secundario (de cabra FITC anti-conejo, dilucin 1:
500, Invitrogen) a temperatura ambiente durante 1 h protegido de la luz. A continuacin, se tieron con 4 r, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
durante 10 min a temperatura ambiente. El aglutinante se detect mediante microscopa de fluorescencia.

4.9. Ensayo de proliferacin celular Edu

5-etinil-2 r - desoxiuridina (EDU) de ensayo se llev a cabo para detectar la proliferacin celular. Cuarenta y ocho horas despus de la
transfeccin, el experimento de proliferacin de las clulas MK3 se realiz con Cell-Light Edu Apolo 567 in vitro Kit (RiboBio Co., Ltd,
Guangzhou, China) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. La tasa de proliferacin MK3 final de las clulas se determin
mediante la proporcin de clulas Edu-stainingpositive (rojo) al nmero total de clulas marcada por DAPI (azul).

4.10. Anlisis estadstico

El software de GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE.UU.) se utiliz para analizar todos los datos. Todos los
datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Los resultados se muestran como medios SD con p < 0:05 considerado
estadsticamente significativo.
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5. conclusiones

Tomados en conjunto, nuestra investigacin descrito cuatro hallazgos importantes (Figura 5 ): (1) que desmontables

del T RII podra inhibir la proliferacin de clulas MK3; (2) que la expresin de SIX2 se inhibi despus de la cada de T RII; (3) que T RII
regula la proliferacin de clulas de MM a travs de SIX2; (4) que la activacin de la TGF Aumento de la va de sealizacin de la
expresin de SIX2; ( 5) que T RII SIX2 regulado a travs de la regulacin transcripcional de Smad3. Se observ que este mecanismo en las
clulas MK3, y el papel especfico de T RII en el desarrollo renal temprana in vitro se verific por SIX2. Dado el papel crtico de T RII en el
desarrollo temprano del rin, vamos a seguir para explorar si T RII pueden afectar el desarrollo de rin embrionario in vivo. Los puntos de
vista de los estudios recientes y en curso podra dar lugar a la confirmacin de la funcin especfica de TGF y T RII en el desarrollo renal
temprana.

La Figura 5. Un diagrama esquemtico del mecanismo molecular que T RII promueve la proliferacin de las clulas del mesnquima
metanfrico (MM).

Materiales complementarios: Materiales complementarios pueden encontrarse en www.mdpi.com/1422-0067/18/4/853/s1 ,

Agradecimientos: Este trabajo fue apoyado por la Fundacin Nacional de Ciencias Naturales de China (subvencin 81572076 y 31271563) y la
Fundacin Nacional de Ciencias Naturales de China (concesin no. 31200971).

Contribuciones de los autores: Mao Zhaomin diseado y realizado los experimentos y tambin escribi el documento; Lyu Zhongshi diseado
y realizado los experimentos; Liyuan Huang realiz parte de los experimentos; Qin Zhou leer el peridico; Yaguang Weng concebido, diseado y
escribi el documento.

Los conflictos de inters: Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses.
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referencias

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