Gram Telelab PDF

Ministrio da Sade
Secretaria de Polticas de Sade

Programa Nacional de DST e Aids
Tcnica de
Colorao de GRAM
Braslia 2001
MINISTRIO DA SADE
Jos Serra
Ministro de Estado da Sade
Cludio Duarte
Secretrio de Polticas de Sade
Paulo Roberto Teixeira

Coordenador Nacional de DST/AIDS-MS
Miriam Franchini
Coordenadora de Produo do Projeto TELELAB
Autores:
Cludia Renata Fernandes Martins
Jos Antnio Pinto de S Ferreira
Luiz Fernando de Ges Siqueira
Lus Alberto Peregrino Ferreira
Maria Lusa Bazzo
Miriam Franchini
Oscar Jorge Berro
Slvio Valle
Assessoria Pedaggica:
Maria Lcia Ricciotti Ribinik
Martistela Arantes Marteleto
Tcnica de Coloraao de Gram.

Brasilia: Ministerio da Sade, Programa Nacional
de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS,
1997.
63 p.: iI. (Srie TELELAB)
1. Gram I. Programa Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e AIDS, (Brasil). II. Srie TELELAB
Os responsavis pela implatao do TELELAB
empenharam toda sua capacidade profissional para
tornar este projeto digno da qualidade tcnica e
cientfica e da eficincia que nossa coordenadora
geral sempre imprimiu s realizaes do Programa
Nacional de DST/AIDS do Ministrio da Sade.
Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues,

exemplo de coragem e liderana, dedicamos este
trabalho.
Pedro Chequer
APRESENTAO.........................................................................................................................6
INTRODUO E MODIFICAES AO MTODO DE GRAM.....................................9
PREPARAO DOS CORANTES E TCNICA DE COLORAO DE

GRAM...................................................................................................................................................15
material necessrio para preparar os corantes..................................................................17
preparao da violeta-de-metila....................................................................................18
preparao do lugol e da safranina.................................................................................19
armazenamentos dos corantes.......................................................................................20
tcnica de colorao de Gram......................................................................................20
PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO.................................................................................23
CONTROLE DE QUALIDADE.............................................................................................27
RESULTADOS..........................................................................................................................31
FRMULAS................................................................................................................................37
BIOSSEGURANA........................................................................................................41 - 63
CONSIDERAES FINAIS...................................................................................................57
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de Colorao de Gram

Agora voc faz parte do Sistema de Educao a Distncia para
profissionais da sade envolvidos com o diagnstico laboratorial das
Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids - DST/AIDS - TELELAB.
O TELELAB foi criado para levar at voc cursos com informaes
indispensveis para que seu trabalho seja realizado dentro dos padres de
qualidade estabelecidos pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids, do Ministrio da sade - PN-DST/AIDS-MS.
Assistindo ao programa de vdeo e estudando este manual voc
ter a oportunidade de verificar o que pode ser mudado no seu dia-a-
dia e o que pode ser mantido.
Assim, voc ter mais confiana nos resultados do seu trabalho e
mais tranqilidade no que se refere sua segurana pessoal.
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Certificado Para obter o certificado, voc dever

acertar no minmo 80% do ps-teste.
Depois da correo do seu teste pelo
PN-DST/AIDS, voc receber o certificado.
Ao final deste curso voc ser capaz de:
identificar os procedimentos e tcnicas

recomendados pelo PN-DST/AIDS - MS
para preparao dos corantes e para
a realizao da colorao Gram; e
executar a colorao de Gram,

obedecendo aos critrios tcnicos, critrios
de controle de qualidade e cuidados de
biossegurana recomendados.

11
Introduo
O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o

mtodo de Gram. A bacterioscopia, aps colorao pelo mtodo de
Gram com diagnstico presuntivo, de triagem, ou at mesmo
confirmatrio em alguns casos, constitui pea importante e fundamental
na erradicao e no controle das Doenas Sexualmente Transmissveis
(DST). Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de resoluo,
permitindo o correto diagnstico em cerca de 80% dos pacientes em
carter de pronto atendimento em nvel local.
Os custos com investimento e manuteno so consideravelmente
baixos diante da eficcia alcanada com os resultados imediatos dos
testes. Essa tcnica requer instalao simples, necessitando apenas de
uma sala pequena com disponibilidade de gua e gs, onde dever ser
instalado um balco com pia e um bico de Busen, eventualmente
substitudo por uma lamparina ou espiriteira.
So ainda necessrios: microscpio com objetiva de imerso e
bateria para a colorao de Gram. Os corantes devem ser preparados
pelo prprio laboratrio ou por um laboratrio habitado que assegure a
qualidade do produto.
Finalmente, e mais importante, so necessrios tcnicos de laboratrio
treinados, responsveis e conscientes do valor do seu trabalho.
A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu
descobridor, o mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em
1884, Gram observou que as bactrias adquiriram cores diferentes,
quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em
dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-
positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.
Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modificao
foram feitas. Neste manual, voc vai conhecer a tcnica, os corantes e
os procedimentos para a correta realizao da colorao de Gram,
recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade.
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

12
Quais as modificaes feitas ao mtodo de Gram?
O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um

outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. importante ressaltar que
a soluo de violeta-de-metila, em sua preparao, j contm fixador
qumico. Devido a isso, a fixao do esfregao em chama caiu em
desuso e atualmente contra-indicada.
O diferenciador h 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se
usa apenas o lcool etlico (99,5 Gay Lussac). Este mais seguro do que
o lcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do
operador para que no ocorresse a hiperdescolorao. Alm do que,
no permitia uma boa reprodutibilidade da tcnica.
Entretanto, a modificao mais importante foi a do corante
secundrio, tambm chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada
de Gram foi substituda pela safranina. Foi baseado no espectro de cores
que substituiu a fucsina pela safranina.
A safranina mantm-se mais distante da violeta no espectro de cor,
diferenciado com maior nitidez as bactrias Gram-negativas que se
destacam das Gram-positivas e da colorao de fundo, que assume a
cor vermelho-claro. Veja a figura 1, na pgina seguinte:

13
Fucsina
Safranina
Violeta
Violeta
Figura1: representao, no espectro de cores, da distncia entre a safranina e a fucsina,

em relao violeta.
Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?
SAFRANINA FUCSINA
Corante cido Corante Bsico
Pertencente ao Grupo Pertencente ao Grupo

das Triarilpirazinas dos Triarilmetanos
Solvel em gua Insolvel em gua

PREPARAO DOS CORANTES E TCNICA
DE COLORAO DE GRAM
17
O que preciso para preparar os corantes de Gram?
Para preparar os corantes, voc vai precisar de:
1 bquer de 500 ml;

1 bquer de 1 litro;
1 balana gramatria ou eletrnica;
2 bastes de vidro;
1 proveta de 200 ml;
1 proveta de 500 ml;
1 esptula ou uma colher de caf;
violeta-de-metila;
lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)
lcool metlico (99,5 Gay-Lussac)
axalato de amnia;
iodeto de potssio;
iodo metlico;
safranina; e
gua destilada.

18
Como preparar a violeta-de-metila? (vide Frmulas)
A) Primeira soluo:
Se voc utilizar uma balana gramatria ou eletrnica, coloque o
papel de pasagem no prato e pese o papel. Adicione a este valor 2
gramas de violeta-de-metila. Siga atentamente as instrues contidas no
manual do equipamento. Assegur-se de que sua balana foi certificada
pelo INMETRO.
Transfira a violeta-de-metila para o bquer de 500 ml. Junte 100 ml
de lcool etlico e, em seguida, 100 ml de lcool metlico. Misture
lentamente com o auxlio do basto de vidro. Deixe descansar por alguns
minutos e repita o procedimento de mistura vrias vezes, at conseguir a
completa dissoluo do corante.
B) Segunda soluo:
Pese 4 gramas de oxalato de amnia. No bquer de 1 litro, junte o
oxalato de amnia metade da gua destilada (200 ml). Misture lenta e
constantemente como na 1 soluo, at conseguir a completa dissoluo,
observando se no restaram resduos no fundo do bquer. Voc observar
que o preparo desta soluo vai desencadear uma reao endotrmica,
isto , a soluo ficar ligeiramente gelada. Para acelerar o processo de
dissoluo do sal, voc pode aquecer em banho-Maria a 37 C.
C) Preparo final:
Junte as duas solues (A e B) e utilize o restante da gua destilada
(200 ml) para recuperar os resduos da violeta-de-metila no bquer. Deixe
descansar por 24 horas e filtre em papel de filtro comum, acondicionando
o corante em frasco de vidro escuro, previamente lavado, seco e rotulado.

19
Como preparar o lugol? (vide Frmulas)
Para preparar essa soluo, pese 4,5 gramas de iodeto de

potssio. Transfira o iodeto de potssio para um bquer contendo 450 ml
de gua destilada. Com o auxlio de um basto de vidro, misture at a
completa dissoluo. Em seguida, pese 3 gramas de iodo metlico e
junte soluo de iodeto de potssio. Continue misturando at a
completa dissoluo. Armazene em frasco de vidro escuro, previamente
lavado, seco e rotulado.
Como preparar o lugol diludo para uso?
Em um frasco conta-gotas escuro, junte 2 ml de lugol concentrado

com 38 ml de gua destilada.
Como preparar a safranina? (vide Frmulas)
Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o p em 500 ml de

gua destilada, misturando bem at conseguir a completa dissoluo.
Guarde em frasco escuro previamente lavado, seco e rotulado.
Lembre-se
A boa prtica laboratorial recomenda a identificao de todos os

seus reagentes. Voc deve incluir o nome do corante, a concentrao
e a data de preparao.

20
Como armazenar os corantes?
Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor mbar-

escuro, pois, de forma geral, as substncias corantes sofrem ao da luz,
produzindo alteraes variadas. Os corantes devem ser colocados em
frascos de 1 litro e distribudos em frascos conta-gotas com cerca de 100
ml de capacidade, para uso dirio. Sempre que os frascos conta-gotas
forem reabastecidos, filtre o corante. Este procedimento evitar os
inconvenientes advindos da precipitao do corante.
Como fazer a colorao de Gram?
Antes de iniciar a colorao, assegure-se de que o esfregao esteja

seco. No fixe o esfregao em chama, pois este processo promove a
desidratao brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-
de-metila j contm fixador qumico. Para fazer a colorao, siga os
seguintes passos:

21
1. Cubra o esfregao com

violeta-de-metila e deixe por
aproximadamente 15 segundos;
2. Adicione igual quantidade de

gua sobre a lmina coberta
com violeta-de-metila e deixe
agir por mais 45 segundos;
Figura 1: material para colorao de Gram.
3. Escorra o corante e lave em um filete de gua corrente; Cubra a lmina

com lugol diludo (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
4. Escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente;
5. Adicione lcool etlico (99,5 GL) sobre a lmina; descorando-a, at que
no desprenda mais corante;
6. Lave em um filete de gua corrente;
7. Cubra a lmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30
segundos;
8. Lave em um filete de gua corrente;
9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxlio de um papel
de filtro limpo;
10. Coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao; e
11. Leia em objetiva de imerso (100 X).

25
Como funciona a colorao de Gram?
Desde o trabalho original de Hans Gram, vrios pesquisadores

tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no
mtodo de colorao. Conceitos diversos tm sido apresentados, tais
como:
1. A existncia de um substrato Gram-positivo e especfico;

2. As b a c t r i a s G r a m - p o s i t i v a s e G r a m - n e g a t i v a s possuiriam
diferentes afinidades com o corante primrio cristal de violeta; e
3. A existncia de diferentes graus de permeabilidade na parede dos
microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.
Este ltimo o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare-

de celular, quanto as dimenses dos espaos intersticiais, por exemplo,
dimetro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da
colorao de Gram.
Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares so
cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adio
do lugol, tambm chamado de mordente, ocorre a formao do
completo iodo-pararosanilina. Esta reao tem a propriedade de fixar o
corante primrio nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor
violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como
lcool etlico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou no
perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

26
As bactrias que tm a parede celular composta por murena

(peptdeoglicano - peptdeo de cido n-acetil murmico), durante o proces-
so de descolorao com lcool etlico, retm o corante. J as bactrias
com parede celular composta predominantemente por cidos graxos
(lipopolissacardeos e lipoprotenas) perdem o complexo iodo-pararosanilina,
assumindo a cor do corante de fundo. Veja as figuras 1 e 2.
Gram + Gram -
peptdeoglicano
peptdeoglicano
(MURENA)
(MURENA)
membrana
citoplasmtica
membrana espao
citoplasmtica periplasmtico
membrana externa
lipopolissacardeo
Figura 1. Esquema da Figura 2. Esquema da

parede das bactrias parede das bacterias
Gram-positivas Gram-negativas

29
Como fazer o controle de qualidade do mtodo de

colorao de Gram?
O controle de qualidade uma atividade obrigatria da rotina diria.

Para realizar o controle de qualidade dos corantes e da colorao de Gram,
voc precisa de duas cepas bacterianas: a Gram-positiva dever ser um
Streptococcus pyogenes ATCC - American Type Culture Collection - n 19.615
e a Gram-negativa dever ser a Escherichia coli ATCC n 25.922.
Ateno
Para informao sobre a obteno de cepas-padro,
comunique-se com o:
TELELAB - PN- DST/AIDS- MS
Telefax gratuito: 0800 61-2436
Como fazer a manuteno das cepas-padro?
Para manter as cepas bacterianas do controle de qualidade em

seu laboratrio, voc dever repic-las, a cada 15 dias, em gar nutrien-
te (tubo com gar inclinado). O controle da pureza das cepas bacterianas
dever ser realizado a cada 2 meses. As cepas devero ser repicadas
em placas (mtodo do esgotamento por estrias) e identificadas segundo
procedimentos microbiolgicos tradicionais. Aps confirmao da
pureza das cepas, estas devero voltar a ser estocadas em tubos com
gar nutriente. O mtodo detalhado e os protocolos de estoque
acompanharo as cepas fornecidas por meio do Programa Nacional de
Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids do Ministrio da Sade.

30
Como preparar as lminas de controle de qualidade para uso dirio?
Obedea ao seguinte procedimento.
Prepare uma suspenso de Streptococcus Pyogenes e Escherichia

Coli. Para isso, pipete 2 ml de soluo salina estril em um tubo de ensaio
limpo e estril. Junte uma alada do Streptococcus Pyogenes e outra de
Escherichia Coli. Muita ateno com os procedimentos tcnicos e cuida-
dos de biossegurana durante a execuo. Flambe a ala bacteriolgica
antes e aps a utilizao com cada uma das cepas bacterianas. No se
esquea de esfriar a ala aps a flambagem.
Prepare 30 lminas para utilizar durante 1 ms, pipetando uma

gota da suspenso bacteriana sobre cada uma das lminas de vidro,
limpas, secas e desengurduradas. Deixe as lminas secarem naturalmente.
Estoque-as em um porta-lminas em temperatura ambiente. Lembre-se
de identificar o porta-lminas.
O controle de qualidade dever sempre ser realizado ao trmino

da preparao dos corantes, mesmo que seja uma simples diluio,
como no caso do lugol e todas as vezes que o procedimento de
colorao for realizado.

33
Veja, nas figuras de 1 a 6, alguns resultados que

podem ser obtidos:
Figura1:
Controle de qualidade da colorao de Gram. Cocos Gram-positivos e
bacilos Gram-negativos.
Figura 2:
Leveduras apresentando apenas elementos leveduriformes.
34
Figura 3:
Leveduras apresentando filamentos micelianos e elementos leveduriformes.
Figura 4:
Trichomonas vaginalis coroado pelo Gram.

35
Figura 5:
Diplococos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Neisseria gonorrhoeae.
Figura 6:
Bacilos Gram-negativos intracelulares sugestivos de Haemophilus ducreyi.

Frmulas
39
Violeta-de-metila:
1 Soluo:
Violeta-de-metila............................................................................................................2,0g
lcool etlico (99,5 Gay-Lussac)....................................................................100,0 ml
lcool metlico (99,57 Gay-Lussac)..............................................................100,0 ml
2 Soluo:
Oxalato de amnia..................................................................................................4,0 g
gua destilada......................................................................................................400,0 ml
Misturar as duas solues, deixar em repouso por um perodo de 24

horas, ao abrigo da luz, aps o perodo de repouso, filtrar em papel de filtro
comum e estocar em frasco escuro previamente lavado e seco.
Lugol:
Iodeto de potssio.........................................................................................................4,5g
Iodo metlico...................................................................................................................3,0g
gua destilada.........................................................................................................450,0ml
Misturar o Iodeto de potssio na gua, at a completa dissoluo.

Acrescentar o lodo metlico e continuar misturando at dissolver
completamente. Diluir antes de usar, a uma concentrao de 1/20, com
gua destilada.
Safranina:
Safranina....................................................................................................................................2,5g
gua destilada.........................................................................................................500,0ml
Misturar bem o p na gua at a completa dissoluo.
Ateno:
Identifique cada frasco com o nome do corante e a data do preparo.

43
Para cuidar de sua segurana, da segurana de seus

colegas de trabalho e do meio ambiente, obedea aos
procedimentos bsicos de biossegurana em laboratrios:
Figura 1. Smbolo de risco biolgico
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Biossegurana

44
Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos,

tais como soro, sangue ou secrees, fluidos orgnicos, tecidos etc.
Redobre suas precaues, pois esses materiais so potencialmente
infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes etiolgicos
diferentes do que se est pesquisando, ou ainda desconhecidos. Nunca
pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura.
A inativao do soro em banho-maria a 56C por 30 minutos no
elimina o potencial infectante da amostra.
Lembre-se de que, com a automao, aumentou muito o nmero

de amostras processadas em laboratrio e, conseqentemente, aumen-
tou tambm o risco de contaminao. Como voc sabe, difcil afirmar
que um profissional se contaminou, de fato, em servio. Isso faz com que
as doenas infecto-contagiosas causadas por acidentes de trabalho no
sejam devidamente notificadas; em conseqncia, as medidas de
segurana envolvendo o biorrisco acabam no sendo implementadas.

45
Use sempre Equipamento de Proteo Individual (EPI): avental ou

jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis,
culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for
o caso, protetor facial.
Os EPI so regulamentados pelo Ministrio do Trabalho e seu uso

visa a minimizar a exposio do tcnico aos riscos e evitar possveis
acidentes nos laboratrios. Note que, s vezes, os profissionais de
laboratrio precisam de um tempo para se adaptar ao uso dos
equipamentos na sua rotina. O importante que voc se adapte e
incorpore a utilizao dos EPI sua prtica profissional. O uso indevido
dos EPI, ao invs de proteger, poder ocasionar acidentes.
Figura 2. Ilustrao dos principais Equipamentos de Proteo Individual (EPI)

46
Evite a formao e disperso de aerossis.

Aerossis so micropartculas slidas e lquidas com dimenses
aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham
microorganismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis por
vrias hora.
A pipetagem, flambagem de alas, abertura de frascos e ampolas,
manipulao de seringas, agulhas, lancetas, lminas e outros
assemelhados podem gerar e propagar aerossis.
Abertura de frascos, ampolas, tubos e garrafas de cultura requer

cuidados especiais. Envolva a parte a ser aberta com um pedao de
gaze. Utilize um pedao de gaze para cada material, prevenindo assim
a contaminao cruzada. Descarte-a imediatamente em hipoclorito de
sdio a 2 %.
Centrfugas, agitadores e maceradores, quando manipulados sem
as precaues e abertos antes da total parada ou trmino da operao,
igualmente podem contaminar o ambiente laboratorial.

47
Jamais reencape agulhas. Esse procedimento uma das principais

causas da contaminao de profissionais de sade por microorganismos,
existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos, como por exemplo, o
vrus da hepatite B e o HIV. Aps a coleta, voc deve descartar esse material
diretamente em recipiente de paredes rgidas com tampa, contendo
hipoclorito de sdio a 2 % em volume superior a metade do recipiente.
Lembre-se: Cada mililitro de sangue contaminado com o vrus da

hepatite B contm 100.000.000 de partculas virais, que podem
permanecer viveis por at uma semana. Basta uma dessas partculas
para contaminar a pessoa.
Figura 3. Ilustrao do descarte de agulha em recipiente apropriado

48
Reduza ao mximo o manuseio de resduos, em especial os

perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em recipiente
de paredes rgidas, contendo hipoclorito de sdio a 2 %. Deixe em imerso
total no mnimo por 24 horas e, em seguida, faa a autoclavao desse
material.
Esta uma regra bsica para diminuir os riscos de acidente nos

laboratrios. fundamental que os materiais perfurocortantes sejam
autoclavados depois da imerso em hipoclorito de sdio a 2%. S
ento esses materiais devem ser encaminhados ao lixo hospitalar. O
acondicionamento dos resduos de laboratrio deve seguir a Norma
Brasileira (NBR) 9190 da Associao Brasileira de Normas Tcnicas- ABNT,
que recomenda sacos brancos leitosos para os resduos potencial-
mente infectantes e hospitalares e escuros para o lixo comum.
Os profissionais responsveis pela limpeza e conservao de-
vem ser bem orientados e usar equipamentos de proteo. Todos os
recipientes para descarte devem estar identificados.
Lembre-se de que, pela legislao brasileira, quem gera o
resduo o responsvel pela sua eliminao e controle.
No caso dos materiais reutilizveis, como vidraria e utenslios,
deposite-os em recipiente contendo o desinfetante prprio, pelo tem-
po de contato recomendado e, em seguida, faa a autoclavao.
Depois, lave normalmente esses materiais e guarde-os para uso
posterior.

49
Identifique e sinalize os principais riscos presentes em seu laboratrio.

Produtos e reas que oferecem risco devem ser marcados com os devidos
smbolos internacionais em etiquetas auto-adesivas padro.
Veja, a seguir, os principais smbolos associados aos riscos em

laboratrios.
PERIGO BIOLGICO
Entrada permitida somente para pessoas
autorizadas
Natureza do risco:
Funcionrio responsvel:
Em caso de emergncia, chame por:
Telefone diurno: Telefone residencial:
Figura 4. Smbolo de risco biolgico para entrada de laboratrio.

50
Figura 5. Principais smbolos internacionais associados aos riscos em laboratrios.

51
Verifique sempre as condies de funcionamento dos equipamentos

de Proteo Coletiva (EPC): extintores de incndio, chuveiros de
segurana, lava-olhos, pia para lavagem de mos, caixa de areia e
cabine de segurana biolgica.
Existem trs tipos de cabines de segurana biolgica disponveis no

mercado: as de classe I, classe II e classe III. So recomendadas para o
uso em laboratrios clnicos as de classe II. Veja a figura , na pgina
seguinte.
Procedimentos que devem ser observados na cabine de segurana

biolgica:
Descontamine a superfcie interior, antes e depois do uso, com

gaze estril embebida em desinfetante adequado;
Ligue a cabine e a luz ultravioleta 20 minutos antes e deixe tudo
ligado pelo mesmo tempo ao final de sua utilizao;
Use avental de mangas longas, luvas descartveis e mscara;
No efetue movimentos rpidos ou bruscos dentro da cabine e
evite operaes que causem turbulncia;
No use bico de Bunsen, pois pode acarretar danos ao filtro HEPA
e causar desequilbrio do fluxo de ar. Se necessrio, use
incinerador eltrico ou microqueimador automtico; e
Mantenha as grelhas anteriores e posteriores da cabine
desobstrudas. A cabine no um depsito. Evite guardar equi-
pamentos ou quaisquer outros objetos no seu interior.

52
CLASSE I CLASSE II CLASSE III

Figura 6. Ilustrao das cabines de segurana biolgica - classes I, II e III.
As cabines de classe I e II so consideradas como barreira de

proteo parcial e a de classe III uma barreira de proteo total.

53
Para descontaminao pessoal, de equipamentos e superfcies fixas,

utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos
registrados no Ministrio da Sade.
No existe um desinfetante nico que atenda a todas as necessida-

des. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e sua compati-
bilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao inadequada.
Para a descontaminao de amostras biolgicas na rotina dos
laboratrios clnicos, recomendamos os compostos liberadores de cloro.
O mais comumente utilizado o hipoclorito de sdio a 2 %. Sua forma
mais ativa o cido hipocloroso (HOCI), que formado em solues
com pH entre 5 e 8. A eficcia do cloro decresce com o aumento do pH
e vice-versa. Cabe lembrar que a atividade desse cido diminuda na
presena de matria orgnica, fato que deve ser considerado quando
aplicado em superfcies contendo sangue e outros lquidos corpreos. Os
hipocloritos tm sua estabilidade dependente de fatores como concen-
trao, temperatura, pH, luz, metais e prazo de validade.
Os hipocloritos so corrosivos para metais. Objetos de prata, alumnio
e at mesmo de ao inoxidvel so atingidos, quando imersos em solues
rotineiramente utilizadas em laboratrio. O hipoclorito de sdio txico e
causa irritao na pele e olhos. Se ingerido, provoca corroso das membra-
nas e mucosas e sua inalao causa irritao severa no trato respiratrio.
Jamais misture os hipocloritos com outras substncias qumicas, tais como
desinfetante, lcool, solues germicidas etc.
Aps o tratamento por 24 horas com hipoclorito de sdio a 2%, os
materiais devem ser autoclavados. A autoclavao recomendada
tendo em vista a possibilidade de o hipoclorito no atingir as partes do
material a ser esterilizado. Caso isso no seja possvel, a alternativa o
mtodo de fervura por perodo no inferior a 30 minutos.
54
Observe, na tabela abaixo, a indicao de alguns agentes qumicos e

seu espectro de ao antimicrobiana.
Eficincia antimicrobiana de alguns agentes qumicos desinfetantes frente

a agentes microbianos.
Bactrias Vrus lipoflicos Vrus hidroflos Microbatrias Fungos Esporos bacterianos
Etanol + + _ + _
Formaldedo + + + + + +
Glutaraldedo + + + + + +
Comp. Cloro + + + + + +
Fenis + + _ + + _
Quaternrios de amnia + + + _ + _
Iodforos + + + _ + _
(+) Atividade
( - ) Ausncia de atividade
( V ) Varivel de acordo com o microorganismo

55
Tenha muito cuidado com a manipulao e estocagem de

substncias qumicas. Leia com ateno as informaes contidas nos
rtulos.
A estocagem de matria-prima deve ser feita em armrios apropri-

ados, bem ventilados, ao abrigo da luz solar e calor. importante obser-
var a incompatibilidade entre as diferentes substncias.
Sempre que recomendado pelo fabricante, os agentes qumicos
devem ser manipulados em capelas de exausto qumica devidamente
instaladas. Ateno: No confunda capela de exausto qumica com
cabine de segurana biolgica.
Veja a seguir os riscos relacionados a cada categoria qumica:
Categoria qumica e riscos relacionados
Grupo qumico Risco
cidos Corroso
Bases Corroso
Cianetos e Sulfetos Envenenamento
Lquidos inflamveis Incndio
Slido Inflamvel Incndio

56
Seja sempre consciente da importncia de suas aes na

preservao da biossegurana em seu local de trabalho:
Lave as mos antes e depois de qualquer procedimento

laboratorial;
Nunca pipete com a boca;
Jamais cheire placas de cultura;
Dentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no

prepare refeies;
Quando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso
comum, como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais,
revistas etc;
No guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores
para armazenagem de material biolgico; e
Vacine-se rotineiramente contra a hepatite B.
Seguindo essas recomendaes, voc vai estar contribuindo para a

diminuio de acidentes.
Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratrio, notifique

imediatamente a sua chefia.

57
CONSIDERAES FINAIS
Muitas das atividades aqui descritas j fazem parte do seu

cotidiano. Faa uma reflexo sobre o que acabou de ler e verifique o
que pode ser mantido, modificado e incorporado a seu trabalho e ao
seu laboratrio para que a sua prtica profissional se desenvolva de
acordo com os procedimentos tcnicos e cuidados de biossegurana
recomendados pelo Programa Nacional de Doenas Sexualmente
Transmissveis e Aids, do Ministrio da Sade. As questes colocadas
a seguir facilitaro essa reflexo.

58
Condies gerais do laboratrio
As reas de circulao esto desobstrudas?
Qual a situao geral quanto ao aspecto de limpeza?
Qual o estado de conservao e manuteno de pisos, escadas,

paredes e tetos?
O local de trabalho est adequado para atividades envolvendo o risco
biolgico?
As bancadas e demais mobilirios do laboratrio esto em condies
de uso?
Existem bancadas apropriadas para trabalhos com solventes e demais
substncias qumicas corrosivas?
Existe pia diferenciada para lavagem das mos no laboratrio?
Existem mecanismos de conteno que previnam a entrada de insetos

e roedores?
Existem programas de manuteno preventiva de equipamentos?
Estocagem
Os produtos armazenados e a rea de estocagem esto organizados

com os devidos cuidados de segurana?
Existe o cuidado de se estocar materiais e/ou substncia incompatveis
separadamente?

59
Local de higiene pessoal e de alimentao

O local mantido limpo e em condies de higiene?
Existe gua potvel disponvel?
Existem sabo e toalha em condies de uso?
Existe local para troca de roupa e guarda de objetos pessoais?
Existe rea para alimentao separada da rea de laboratrio?
Existe adequada organizao para coleta de lixo e demais rejeitos
(no-infecciosos)?
Refrigerao e Ventilao
A temperatura de trabalho est entre 20 e 260C?

As janelas esto protegidas contra o excesso de luz solar?
Existe ventilao adequada, especialmente nas salas com ca-
bines de fluxo laminar?
Iluminao
A iluminao geral adequada?

Existe iluminao dirigida nas bancadas de trabalho?
Servios
O laboratrio tem suficiente abastecimento de gua, energia

eltrica e gs?
Existe adequada manuteno de fusveis, lmpadas e cabos
eltricos?
A limpeza e higienizao das caixas d`gua so realizadas com
periodicidade recomendada?
60
Segurana geral
O laboratrio devidamente fechado e seguro quando no est

ocupado?
As portas e janelas so mantidas devidamente fechadas?
Os materiais txicos e equipamentos de risco so estocados em
rea segura?
Preveno de incndio
Existe sistema de alarme?

As passagens pelas portas de emergncia esto desobstrudas?
O sistema de deteco de incndio est em bom funcionamento
e regularmente testado?
Existe sinalizao de emergncia?
Existem extintores de incndio para os diversos tipos de materiais
e em quantidade suficiente?
Os extintores esto dentro do prazo de validade?
Existe sinal de no fumar na rea de laboratrio?
A equipe est treinada em combate a incndio?
Estocagem de lquidos inflamveis
O local est separado do prdio principal?

Existe ventilao suficiente para retirar vapores?
O local est devidamente sinalizado?
Existem lmpadas seladas para proteo contra ignio nos
vapores?
Existe advertncia de no fumar?
61
Risco com eletricidade
As instalaes esto de acordo com os padres estabelecidos

pela ABNT?
Existe fio de terra? Os equipamentos esto devidamente aterrados?
Os equipamentos com potencial de risco de desligamento
esto devidamente ligados a um circuito de emergncia para
os casos de queda ou interrupo de energia?
Os cabos de conexo aos diversos equipamentos esto em
perfeito estado de manuteno?
Cada equipamento est ligado em uma tomada; evita-se o uso
de benjamim?
Todas as tomadas tm sua voltagem identificada?
Voc sabe onde fica o quadro-geral de fora da sua unidade?
Gases e lquidos comprimidos
Os diversos tipos de gases esto devidamente identificados?

Os cilindros possuem vlvulas de segurana?
Existe advertncia de no-utilizao de leo nas vlvulas?
Os cilindros esto devidamente seguros contra quedas?
Existe ventilao suficiente para evitar a formao de bolses de
gases e exploses?
Proteo pessoal
Existem em quantidade suficiente:

Lava-olhos?
Chuveiros de emergncia?
Protees contra radiaes, incluindo os dozmetros?
Mscara contra partculas?
Luvas descartveis?
Pipetadores manuais e/ou automticos?
culos de proteo e outros?
62
Segurana e sade ocupacional
Existe servio de sade ocupacional?

Existe caixa com materiais para primeiros-socorros?
Existem profissionais treinados em primeiros-socorros?
Existem informaes sobre como agir em caso de emergncia,
tais como: telefone de hospitais, pronto-socorros e bombeiros?
Existe um programa de vacinao atualizado?
Existe sinalizao educativa para prevenir o risco?
Equipamento de laboratrio
Os equipamentos esto validados e certificados quanto a seu uso?

Existe procedimento de desinfeco de equipamentos antes de
envi-los manuteno?
As cabines de segurana biolgica e qumica so regularmente
testadas?
As autoclaves esto validadas?
As centrfugas, rotores e frascos tm seus tempos de utilizao
devidamente anotados?
Vidrarias quebradas e trincadas so descartadas?
Existem recipientes adequados para descartar frascos quebrados e
material perfurocortante?
As capelas de exausto para manipulao esto devidamente
sinalizadas?
Suas balanas esto certificadas pelo Inmetro?
Seus congeladores, geladeira, fornos, estufas ou equipamentos
termo-regulavis possuem sinais de controle e registro de
temperatura?
63
Material infeccioso, qumico e radioativo
Os materiais biolgicos so recebidos em condies de

segurana?
Utilizam-se luvas descartveis, quando se est manipulando
material biolgico?
As bancadas so desinfetadas com a devida freqncia?
Existe protocolo de descarte de material contaminado?
Os desinfetantes so apropriados e devidamente validados?
As substncias esto devidamente etiquetadas?
Existe cartaz com os riscos e categorias toxicolgicas das
diversas substncias?
O estoque de radioistopos devidamente controlado?
Existe procedimento de descarte de substncias qumicas e
radioistopos?
Existem procedimentos que visam a evitar contato entre
substncias qumicas incompatveis?
Utilize este manual, junto com o vdeo, como fonte permanente

de consulta. Mantenha este manual sempre ao seu alcance e faa
dele um instrumento a mais de trabalho.
Voc tem comunicao direta e gratuita com o:
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Telefax gratuito: 0800 - 61- 2436

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Ed. American Dociety for Microbiology. Washington, DC, 406 p.
PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de Colorao de

Agradecimentos: s equipes da:
Instituto de Sade Pblica do Distrito Federal - ISDF;
Ao Laboratorio ControlBio, So Paulo; e
ao Hospital Universitrio - Universidade
Federal de Santa Catarina-UFSC.
Projeto Grfico, Diagramao e Arte-final:
Coordenao Nacional de DST e Aids

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Ministrio da Sade

Secretaria de Polticas de Sade

Paulo Roberto Teixeira

Tcnica de Coloraao de Gram.

Dra. Lair Guerra de Macedo Rodrigues,

INTRODUO E MODIFICAES AO MTODO DE GRAM.....................................9

PREPARAO DOS CORANTES E TCNICA DE COLORAO DE

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Vdeo e Assista ao vdeo quantas vezes voc

Ps-teste Faa o ps-teste e responda ao questio-

Certificado Para obter o certificado, voc dever

Ao final deste curso voc ser capaz de:

identificar os procedimentos e tcnicas

executar a colorao de Gram,

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O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Quais as modificaes feitas ao mtodo de Gram?

O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza um

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Figura1: representao, no espectro de cores, da distncia entre a safranina e a fucsina,

Quais as diferenas bioqumicas entre a safranina e a fucsina?

Corante cido Corante Bsico

Pertencente ao Grupo Pertencente ao Grupo

Solvel em gua Insolvel em gua

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

O que preciso para preparar os corantes de Gram?

Para preparar os corantes, voc vai precisar de:

1 bquer de 500 ml;

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Como preparar a violeta-de-metila? (vide Frmulas)

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Como preparar o lugol? (vide Frmulas)

Para preparar essa soluo, pese 4,5 gramas de iodeto de

Como preparar o lugol diludo para uso?

Em um frasco conta-gotas escuro, junte 2 ml de lugol concentrado

Como preparar a safranina? (vide Frmulas)

Pese 2,5 gramas de safranina. Dissolva bem o p em 500 ml de

A boa prtica laboratorial recomenda a identificao de todos os

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Como armazenar os corantes?

Os recipientes utilizados para os corantes devem ser de cor mbar-

Como fazer a colorao de Gram?

Antes de iniciar a colorao, assegure-se de que o esfregao esteja

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

1. Cubra o esfregao com

2. Adicione igual quantidade de

3. Escorra o corante e lave em um filete de gua corrente; Cubra a lmina

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Como funciona a colorao de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, vrios pesquisadores

1. A existncia de um substrato Gram-positivo e especfico;

Este ltimo o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da pare-

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

As bactrias que tm a parede celular composta por murena

Figura 1. Esquema da Figura 2. Esquema da

PN-DST/AIDS/Ministrio da Sade Tcnica de colorao de GRAM

Como fazer o controle de qualidade do mtodo de

O controle de qualidade uma atividade obrigatria da rotina diria.