ESPECTROMETRA Y ESPECTROMETRIA

UV VISIBLE
INTRODUCCIN:

Espectrometra:

Es una radiacin electromagntica se puede describir como un flujo de partculas

llamadas fotones, o bien como una onda propagndose en el espacio

Se basan en la interaccin de la radiacin electromagntica con la materia.

A travs de esta interaccin las molculas pueden pasar de un estado
energtico, m, a otro estado energtico distinto, l, absorbiendo una
cantidad de energa radiante igual a la diferencia energtica existente entre
los dos niveles: El - Em. Para conseguir esto, las molculas absorben un
fotn de una radiacin

Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros que, en
definitiva, no son mas que el registro de las distintas m(o k) a las que se producen
estos trnsitos energticos.

Debido a la existencia de diferentes tipos de energa: de los electrones en si, de

los movimientos vibracionales de las molculas, de la rotacin de las
mismas...etc, las molculas pueden interaccionar con radiaciones
electromagnticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando
lugar a distintos tipos de espectroscopas segn las diferentes regiones. Un
esquema podra ser el siguiente

1
La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y
se basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un
compuesto y su concentracin.

Esta radiacin puede ser emitida por sustancias bajo condiciones de gran
excitacin, como por ejemplo, altas temperaturas o descargas elctricas. La
radiacin electromagntica al incidir sobre la materia puede sufrir los siguientes
procesos:

2
Cuando se hace incidir luz monocromtica (de una sola longitud de onda)
sobre un medio homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el
medio y otra transmitida, como consecuencia de la Intensidad del rayo de luz sea
atenuada desde Io a It, siendo Io la intensidad de la luz incidente y It la intensidad
del rayo de luz Transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede

estar en fase lquida, slida o gaseosa.

En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagntico, la muestra

es generalmente disuelta para formar una solucin.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energa radiante Absorbida, Absorbancia, por la
sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagntico, es decir, a
una determinada longitud de onda de la energa radiante, cada sustancia
absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la que absorbe otro
compuesto

ESPECTOFOTMETRO Consta de los siguientes partes:

Fuente de luz: suele ser una lmpara que emite una luz (por
incandescencia de un filamento) policromtica, es decir que contiene
distintas longitudes de onda con distintas intensidades, I0.
Sistema ptico: a travs de filtros, lentes y redes de difraccin se focaliza
el haz de luz y se selecciona una longitud de onda fija.
Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un
espesor conocido, normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso
ptico, sobre la que se hace incidir el haz de luz monocromtica
Sistema ptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y
selecciona por longitudes de onda

3
 Detector: recibe la seal de la intensidad de la luz transmitida a cada
longitud de onda y la transforma en seal elctrica que un ordenador
pueda procesar.

Las principales ventajas de la espectrofotometra son:

Sensibilidad relativa elevada.

Facilidad para realizar mediciones rpidas.
Grado de especificidad relativamente elevado.

Tipos de espectrometra:

Espectrometra UV/Vis
Espectrometra Infrarojo (IR)
Espectrometra de Absorcin Atmica (AA)

4
ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS.
La absorcin y emisin de energa radiante que realizan las molculas y
los tomos constituye el fundamento de muchos procedimientos en Qumica
Analtica. Los datos obtenidos nos aportan informacin tanto cualitativa como
cuantitativa.

Cualitativamente, porque las posiciones de las lneas o bandas de emisin

o absorcin en el espectro electromagntico indican la presencia de una
sustancia determinada.

Cuantitativamente porque midiendo las intensidades de dichas lneas o

bandas de emisin o de absorcin puede determinarse la concentracin.

En funcin de ello se clasifican fundamentalmente en:

o Mtodos de absorcin: Se basan en la disminucin de la potencia

de un haz de radiacin electromagntica al interaccionar con una
sustancia.
o Mtodos de emisin: Se basan en la radiacin que emite una
sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo
de energa (trmica, elctrica).
o Mtodos de fluorescencia: Se basan en la radiacin que emite la
sustancia cuando es excitada previamente por un haz de radiacin
electromagntica. Otras clasificaciones de los mtodos
espectroscpicos se establecen en funcin de la regin del
espectro electromagntico que interviene en la tcnica. As,
pueden utilizarse regiones como rayos X, ultravioleta, visible,
infrarrojo, microondas, etc. En la Figura 1 pueden verse las
regiones del espectro electromagntico, en funcin de los valores
de la longitud de onda () de cada radiacin:

5
RELACIONES CUANTITATIVAS DE LA ABSORCIN. LEY DE BEER.

Los principios que rigen la absorcin de la radiacin se aplican a todas las

regiones del espectro electromagntico. La absorcin se mide determinando la
disminucin de potencia experimentada por un haz de radiacin como resultado
de las interacciones con las especies absorbentes situadas en la trayectoria de
dicho haz.

La Ley de Beer establece que a una dada, en la que pueda ocurrir

absorcin, al aumentar la concentracin de la disolucin (c) de absorbente,
disminuir la cantidad de luz transmitida:

A = kbc
Donde k (otras veces a ) es la llamada absortividad o coeficiente de extincin.
En el caso de emplear concentraciones molares (c, mol/L) la ley sera:

A = bc
Donde es el coeficiente de extincin molar la absortividad molar.

La constante k, a, , es una medida relativa de la intensidad de absorcin

de un compuesto. Depende del disolvente, de la longitud de onda y de las
condiciones experimentales (pH, T, etc.), pero es independiente de c y de b.

La relacin entre la transmitancia (T) y la absorbancia (A) sera:

A = log 1/T %T = T. 100 T = %T/100

A = log 1/%T/100 = 2 log %T

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Un espectro de absorcin
es una representacin grfica que relaciona las caractersticas de absorcin del
analito con la utilizada en su anlisis.
En el eje de ordenadas se representa generalmente A, logA, T %T, mientras
que en el eje de abscisas se representan unidades de .

Las curvas a, b, c y d de la siguiente figura representan concentraciones

cada vez mayores de una determinada muestra. La A, aumentar evidentemente
al aumentar la c ( b), mientras que el %T disminuye.

En la figura se muestra tambin un ejemplo de una grfica de la ley de Beer: al

representar A frente a las concentraciones a, b, c y d se encuentra una funcin
lineal, tal que predice la ley de beer. La pendiente de la recta ser s b = 1cm.

La ley de Beer se cumple igualmente para disoluciones que contienen ms

de una especie absorbente, siempre que no se produzca interaccin entre dichas
especies. Por tanto para un sistema multicomponente se cumplir:

Atotal = A1 + A2 + ......... + An

Atotal = a1bc1 + a2bc2 + .......... + anbcn

Los subndices se refieren a las especies absorbentes.

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Limitaciones a la ley de Beer.

La relacin lineal entre A y b para c = cte. ocurre generalmente en todos los

casos. Sin embargo, se observan frecuentemente desviaciones de la
proporcionalidad directa entre A y c para b=cte

algunas de estas desviaciones son importantes y representan limitaciones reales

de la ley. Otras desviaciones ocurren como consecuencia de la forma en que se
realizan las medidas de absorbancia ( desviaciones instrumentales), bien como
consecuencia de cambios qumicos asociados con cambios de concentracin
(desviaciones qumicas).

Reales

Limitaciones

Qumicas
Aparentes*
Instrumentales

*Se llaman desviaciones o limitaciones aparentes porque reflejan dificultades

experimentales mas que alguna insuficiencia de la Ley de Beer por s misma.

Limitaciones reales de la ley de Beer.

La ley de Beer es solamente aplicable a disoluciones en las cuales las

interacciones, dependientes de la concentracin, entre molculas o iones
absorbentes sean mnimas. Estas interacciones, que generalmente comienzan
a aparecer a concentraciones superiores a 001M, alteran las absortividades
molares, , y, por tanto, conducen a una relacin no lineal entre A y c.

A =cte a cualquier c< 001M A cte c>001M

tg=b

c<001M

c c

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 Tambin surgen desviaciones reales debido a que la de una sustancia
depende del ndice de refraccin de la disolucin, que a su vez es dependiente
de la concentracin de analito, cuando las concentraciones son mayores de
001M.

Desviaciones qumicas.

Se producen desviaciones aparentes de la Ley de Beer cuando las

especies absorbentes experimentan disociacin, asociacin o reaccin con el
disolvente, originando productos con caractersticas absorbentes distintas de las
del analito. Estos efectos que producen una alteracin del equilibrio qumico
pueden ser debidos al pH, presencia de complejantes, reacciones laterales, etc.

Desviaciones instrumentales.

La ley de Beer es una ley lmite en el sentido de que una linealidad

verdadera entre absorbancia y concentracin requiere la utilizacin de radiacin
monocromtica (una sola ). En la prctica, se producen desviaciones
significativas cuando se mide en una banda de absorcin que no se corresponde
con el mximo de absorbancia en el espectro (ver figura). En estas
circunstancias se originan grandes cambios de absorbancia en funcin de y la
deja de ser constante producindose una curva en vez de una recta al
representar A en funcin de c.

Tambin pueden darse desviaciones instrumentales debido a los efectos de

fatiga de los detectores, falta de linealidad de los amplificadores de seal,
inestabilidad de las fuentes de energa radiante etc. Sin embargo, con los
instrumentos modernos para espectrofotometra estos problemas se han
resuelto en gran parte.

Advertencia: Por muy moderno que sea un espectrofotmetro debemos de

verificar el equipo instrumental antes de suponer que se cumple la Ley de Beer
para un sistema qumico determinado.

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INSTRUMENTACIN.

Los instrumentos que miden la absorbancia o la transmitancia de una

disolucin se componen de cinco elementos bsicos:

1. Fuente estable de energa radiante.

2. Selector de longitudes de onda (para aislar una determinada regin de
longitudes de onda de la fuente)
3. Cubetas transparentes para la muestra.
4. Detector de radiaciones o transductor para convertir la energa
radiante en elctrica.
5. Dispositivo de lectura.

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Fuente de energa radiante Continua Estable. Lmpara de Deuterio Lmpara de Tungsteno o
Wolframio

Lmpara tungsteno-halogeno (AquaMate 7000)

Mide en la regin visible, cerca de 325 a 1100 nm
Vida tpica = 2000 horas (50 semanas a 8 horas por da, 5 das a la semana)
Tiempo de calentamiento de 10 a 30 minutos
Lmpara Flash de Xenon (AquaMate 8000)
Mide en las regiones de UV y UV-Vis Visible de 190 a 1100nm
Vida tpica = 3 a 5 aos.
No REQUIERE tiempo de calentamiento.
Lmpara de Deuterio (No utilizada con AquaMate)
Se utiliza para medir en la regin UV ( nm), por lo general con una lmpara tungsteno-halogeno
en los espectrofotmetros UV-Vis.
Vida tpica = 1000 horas, la lmpara tiene una vida til y se deteriora, incluso cuando est
apagada
Necesita ser reemplazada de una a dos veces al ao con el uso tpico en el laboratorio.

Filtro Filtro (monocromador)

- permite seleccionar una longitud de onda especfica. La luz blanca de la lmpara pasa a
travs de una ranura de entrada e incide sobre una rejilla

La rejilla dispersa la luz en varias componentes de longitud de onda. Una longitud de onda
especfica es seleccionada y pasa a travs de la ranura de salida atravesando la muestra y
continua hasta llegar al detector. Ancho de banda espectral la propagacin de longitudes
de onda que emergen de la ranura de salida del monocromador. Representa la capacidad
del espectrofotmetro para separar dos picos (peaks) que estn muy juntos. AquaMate 7000

11
tiene un ancho de banda espectral de 5 nm. AquaMate 8000 tiene un ancho de banda
espectral de 1,8 nm.

Cubetas:
Caractersticas
Absorcin mnima a la longitud de onda de trabajo
Colocar con caras transparentes perpendiculares a la direccin del haz incidente
Vidrio o plstico Visible
Slice Ultravioleta

Detectores
Su funcin es convertir la respuesta del instrumento en una seal medible
deben responder a un amplio rango de longitudes de onda
deben dar respuesta rpida
deben ser sensibles a bajos niveles de radiacin
deben producir seal elctrica fcilmente amplificable la seal debe ser proporcional a
la potencia radiante
Fototubos Fotomultiplicadores Fotodiodoarray

La naturaleza y complejidad de un equipo de absorcin depende de la

regin de implicada y de cual va a ser el uso principal del instrumento, s para
medidas cualitativas o bien cuantitativas. Sin embargo la funcin de cada
componente es siempre la misma.

La primera etapa que debe realizarse siempre antes de cualquier medida

de absorbancia es el ajuste del medidor de seal. En primer lugar se ajusta el
cero de transmitancia bloqueando la radiacin antes del detector con un
obturador o introduciendo una cubeta opaca (ajuste del 0 % de T).
A continuacin se ajusta el indicador al 100% de T (o cero de absorbancia), este
ajuste se realiza con el disolvente o blanco en la trayectoria del haz incidente.
Para ello, se vara la intensidad de la fuente o bien se altera la amplificacin de
seal del detector. Finalmente, la absorbancia o el %T se puede obtener
directamente sustituyendo el disolvente por la disolucin que contiene en analito.

Fotmetros y espectrofotmetros.

Los componentes descritos anteriormente se pueden combinar de

distintas maneras para fabricar docenas de instrumentos para realizar medidas
de absorcin. El diseo de estos equipos vara desde los ms sencillos a los ms
sofisticados, existiendo notables diferencias en su precio. La seleccin de un
instrumento se debe hacer segn el tipo de trabajo para el que va a ser
destinado.

Fotmetros: Un fotmetro es un instrumento sencillo y relativamente barato para

el anlisis de absorcin. Poseen generalmente una alta resistencia y es fcil de
mantener. Se utiliza principalmente cuando el anlisis no requiere una alta
pureza espectral.

12
 En la figura se muestra un diagrama esquemtico de un fotmetro de un
solo haz y lectura directa. El equipo utiliza una lmpara de filamento de volframio,
lentes para proporcionar un haz paralelo de radiacin, un obturador, un filtro, un
atenuador de haz en forma de cua y un detector. El atenuador se mueve hacia
dentro o hacia fuera del haz para variar su intensidad cuando se hace el ajuste
del 100%T.

Una causa importante de inestabilidad en la medida son las fluctuaciones

en la intensidad de fuente (error instrumental). Por esta razn, la mayora de los
equipos de haz simple requieren algn tipo de estabilizador de corriente.

Los instrumentos de un solo haz son particularmente adecuados para

medidas cuantitativas de absorcin a una nica longitud de onda (medidas
puntuales). Las cubetas que contienen la cubeta y el blanco se sitan
alternativamente en la trayectoria del haz.

Los fotmetros se suministran con diversos filtros, cada uno de los cuales
transmite en una zona del espectro. La seleccin del filtro adecuado determina
en gran parte la sensibilidad de las medidas de absorbancia. Por ejemplo, una
disolucin de color rojo absorbe radiacin verde. (La intensidad de la radiacin
verde absorbida ser funcin de la concentracin) por tanto debemos
seleccionar un filtro verde (o sea que emita verde que es el que absorbe el rojo
ol!).

En general, el filtro mas adecuado para un mtodo fotomtrico ser el del

color complementario a la disolucin a analizar.

Espectrofotmetros: Los espectrofotmetros estn equipados con un

monocromador de prisma o red, que permite la seleccin de cualquier longitud
de onda dentro de la capacidad del instrumento. Un diagrama esquemtico de
un espectrofotmetro de haz simple sera igual al del fotmetro de filtro de la

13
figura anterior siendo la diferencia principal la sustitucin del filtro por el
monocromador.

La siguiente figura representa un espectrofotmetro de doble haz:

La luz procedente del monocromador se divide mecnicamente con un

interruptor giratorio ("chopper"), que dirige alternativamente el haz a travs de la
muestra y del blanco. El detector por tanto recibe una seal intermitente que se
convierte en una seal elctrica que es fcilmente amplificada. Se ha de hacer
todo lo necesario para asegurar que la trayectoria recorrida por la luz a travs de
las dos cubetas sea idntica. Dado que esta comparacin se realiza
simultneamente o casi simultneamente, un aparato de doble haz compensa la
mayora de las fluctuaciones transitorias as como el funcionamiento irregular de
la fuente, detector y transductor.

14
APLICACIONES ANALTICAS.

El proceso de absorcin. Anlisis Cualitativo UV-VIS.

Como todos los seres humanos sabemos, los tomos, iones y

molculas tienen un nmero limitado de niveles discretos de energa
cuantizada. Para que se produzca la absorcin, la energa del fotn debe
coincidir exactamente con la diferencia de energa existente entre el estado
fundamental de la especie absorbente y uno de sus niveles energticos
excitados. Estas diferencias de energa son nicas para cada especie y
originan espectros caractersticos que se utilizan frecuentemente para la
identificacin cualitativa y la determinacin cuantitativa tanto de sustancias
orgnicas como inorgnicas.

La absorcin por molculas poliatmicas es un proceso complejo ya que

el nmero de los posibles estados excitados de energa es muy elevado. La
energa total de una molcula viene dada por:

E = Eelectrnica + Evibracional + Erotacional

Eelectrnica = Energa asociada a los electrones de los orbitales externos de la

molcula

Evibracional = Energa de la molcula, considerada como un todo, debida a las

vibraciones interatmicas

Erotacional = Energa asociada a la rotacin de la molcula alrededor de su centro

de gravedad

La Electrnica es generalmente mayor que las otra dos, y las energas

necesarias para producir transiciones de los electrones externos de una
molcula corresponden a radiaciones en las regiones UV y VISIBLE.

Existen numerosos estados de energa vibracional y rotacional para

cada estado electrnico. Por tanto, para un determinado valor de E electrnica,
existirn valores de E que sern solo ligeramente diferentes debido a
variaciones de la Evibracional y/o rotacional. Por ello, el espectro de absorcin UV
o VISIBLE de una molcula estar formado por bandas de absorcin, como se
muestra en la figura para el vapor de benceno.

15
Absorcin por compuestos orgnicos.

La absorcin de radiacin por molculas orgnicas en la regin de de

180 a 750nm se origina por la interaccin de los fotones y aquellos electrones
que o bien participan directamente en el enlace y estn, por tanto, asociados a
ms de un tomo, o bien estn localizados sobre tomos tales como O, S, N,
X.

La a la que absorbe una molcula orgnica depende de la fuerza con

la que estn unidos sus distintos electrones. As, los electrones compartidos
con enlaces sencillos CC o CH (enlaces) estn unidos tan firmemente, que la
absorcin ocurre solo en la regin del UVvacio <180nm donde tambin
absorben los componentes del aire (esta absorcin se utiliza raras veces con
fines analticos).

Los electrones implicados en dobles o triples enlaces de molculas

orgnicas no estn tan fuertemente retenidos, y son, por tanto, ms fcilmente
excitados por la radiacin. As pues las especies con enlaces mltiples (dobles
o triples) generalmente presentan unos mximos de absorcin tiles. Los
grupos funcionales orgnicos insaturados que absorben en las regiones UV
VIS se denominan cromforos. En la siguiente Tabla se muestran los
cromforos ms comunes y las aproximadas a las que absorben.

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 Los datos de posicin e intensidad del mximo deben servir nicamente como
gua orientativa con fines de identificacin, ya que ambos estn influenciados
por los efectos del disolvente as como por otros detalles estructurales de la
molcula. Adems la conjugacin entre dos o ms cromforos tiende a
provocar desplazamientos de los mximos de los picos a mayores (hacia el
VIS).
Los electrones no compartidos en elementos como S, Br, I, etc., estn
retenidos menos fuertemente que el par de electrones de un enlace saturado.
Como consecuencia de ello, las molculas orgnicas que contienen esos
elementos presentan con frecuencia picos de absorcin tiles en la regin UV.

Absorcin por especies inorgnicas.

En general los iones y complejos de las dos primeras series de

transicin absorben radiacin VIS al menos en uno de sus estados de
oxidacin y son, en consecuencia, coloreados. Aqu, la absorcin supone
transiciones entre orbitales d ocupados y libres. Las diferencias de energa
entre estos orbitales d (y, por tanto, la posicin del correspondiente pico de
absorcin) dependen de la posicin del elemento en el sistema peridico, su
estado de oxidacin y la naturaleza del ligando al que est unido.

La absorcin por transferencia de carga es de gran importancia desde

el punto de vista analtico, ya que las de los mximos de transferencia de
carga se encuentran entre las mayores observadas en espectroscopia
(>10.000). Estas proporcionan por tanto sensibilidades altas. Muchos
complejos presentan este tipo de absorcin y se conocen como complejos de
transferencia de carga. Estos complejos, contienen generalmente un grupo
dador de electrones, y uno aceptor dentro del complejo. La absorcin de
radiacin implica la transicin de un electrn desde el grupo dador al aceptor.
El estado excitado es, por tanto, el resultado de un proceso de oxidacin-
reduccin interno.

Ejemplos comunes son los complejos de tiocianato, el complejo de Fe(II)

con o-fenantrolina y el complejo de ferrocianuro frrico responsable del color
azul Prusia.

17
Anlisis cuantitativo UV-VIS.

La espectroscopa de absorcin en las regiones UV-VIS es una de las

herramientas ms ampliamente utilizadas para el anlisis cuantitativo. Entre las
caractersticas ms importantes del mtodo figuran las siguientes:

1. Gran campo de aplicacin: Numerosas especies inorgnicas y

orgnicas absorben en la regin UV-VIS, y son, por tanto,
susceptibles de ser determinadas cuantitativamente. Adems
muchas especies no absorbentes, mediante un tratamiento qumico
adecuado se las puede transformar en absorbentes.

2. Elevada sensibilidad: Las altas comprendidas entre 5.000 y 40.000,

particularmente en complejos de transferencia de carga, permiten
lmites de deteccin en el intervalo 10-4 a 10-5M.

3. Selectividad entre moderada y alta: El paso previo de separacin se

hace innecesario si se logra encontrar una regin de longitudes de

18
 onda en la que el analito sea la nica especie absorbente en la
muestra.

4. Buena exactitud: El error relativo en una medida espectrofotomtrica

tpica es del orden del 1 al 3%.

5. Facilidad y comodidad: Las medidas espectrofotomtricas con los

modernos equipos son rpidas y cmodas. Adems los mtodos se
prestan frecuentemente a la automatizacin.

Aplicacin a especies absorbentes.

En la Tabla anterior aparecen muchos grupos cromforos comunes. Es,

por tanto, la determinacin espectrofotomtrica factible para compuestos
orgnicos que contienen uno o ms de estos grupos.

Tambin hay algunas especies inorgnicas que absorben como el MnO4

el CrO42 . Muchos iones de metales de transicin tienen color en disolucin y
por tanto se pueden determinar por medidas espectrofotomtricas.

Aplicacin a especies no absorbentes.

Muchos analitos no absorbentes se pueden determinar hacindolos

reaccionar con reactivos cromforos, originando compuestos que absorben
intensamente en las regiones UV-VIS. La aplicacin adecuada de estos
reactivos formadores de color requiere generalmente que su reaccin con el
analito sea completa.

Mtodo analtico.

El primer paso de cualquier anlisis fotomtrico o espectrofotomtrico es

el establecimiento de las condiciones que den como resultado una relacin, a
ser posible lineal entre la absorbancia y la concentracin del analito.

1. Seleccin de la longitud de onda: Para obtener una sensibilidad

mxima, las medidas espectrofotomtricas se realizan a una
correspondiente a un pico de absorcin, porque, como ya pusimos de
manifiesto, la variacin de la absorbancia por unidad de
concentracin es mxima en este punto.

2. Optimizacin de variables que influyen en la absorbancia: Entre las

variables ms comunes se encuentran la naturaleza del disolvente, el
pH, fuerza inica y la presencia de sustancias interferentes. Los

19
 efectos de estas variables se deben estudiar y se deben elegir
aquellas condiciones del anlisis que permitan que la absorbancia no
se vea prcticamente afectada

3. Determinacin entre la A y la concentracin: Los datos de A pueden

manejarse de diferentes modos en anlisis cuantitativo. La escala va
desde 0 a pero la mxima exactitud se obtiene en el intervalo de
01 a 10 por lo tanto las condiciones experimentales se deben elegir
de manera que la absorbancia producida ocurra dentro de dicho
intervalo: las disoluciones que originen A demasiado elevadas se
diluyen y las de A baja se concentran. Normalmente esto se prev
mediante una determinacin preliminar.

Comparacin con un patrn: Las absorbancias de la muestra

desconocida A1, y del patrn A2, se describen mediante la ley de
Beer;

A1 = 1b1c1 A1/A2 = 1b1c1/2b2c2

A2 = 2b2c2 1 = 2 b1 = b 2

A1 / A2 = c1/c2

Los patrones de calibracin para un anlisis fotomtrico o

espectrofotomtrico deben de ser tan semejantes como sea
posible a la composicin de las muestras y deben abarcar un
intervalo razonable de concentraciones del analito. En raras
ocasiones, o casi nunca, se puede suponer que se cumple la ley
de Beer y utilizar un patrn nico para determinar la absortividad
molar. An menos prudente es basar los resultados de un anlisis
en un valor de absortividad molar obtenido en la bibliografa.

Mtodo de adicin de patrn.

Podemos encontrarnos con grandes dificultades, incluso

insuperables, para preparar patrones con una composicin
similar a la muestra a analizar. En estas circunstancias, el
Mtodo de la adicin de patrn puede resultar muy til.

En este mtodo se mide la absorbancia de dos

disoluciones:

- Disolucin A: Contiene una concentracin desconocida de

analito c1
- Disolucin B: Contiene lo mismo que A ms un volumen
conocido de patrn de concentracin c2

20
 Se comparan a continuacin las absorbancias de ambas
disoluciones las cuales vendrn dadas por:

Adisolucin A = bc1

Adisolucin B = b (v1c1+v2c2)/v1+v2 = b (v1c1+v2c2)/vT

v1 = Volumen de la disolucin A en la disolucin B

v2 = Volumen de patrn de concentracin c2

Dividiendo m.a.m. tendr:

AA /AB = c1/(v1c1+v2c2)/vT c1 = AAv2c2/vTAB-v1AA

Anlisis de mezclas.

Como ya se dijo anteriormente la absorbancia total de una

disolucin a cualquier longitud de onda es igual a la suma de
las absorbancias de los componentes individuales de la
disolucin. Esta relacin en principio hace posible determinar
las concentraciones de los componentes individuales de una
muestra incluso si existe solapamiento total de sus espectros
correspondientes. Por ejemplo, la siguiente figura muestra el
espectro de una disolucin que contiene una mezcla de
especies A y B as como los espectros de absorcin de los
componentes individuales (obviamente no existe una a la
que la absorbancia se deba solamente a uno de los
componentes A o B). Para analizar la mezcla se determinan
primero las absortividades molares de A y B a las longitudes
de onda 1 y 2 (con los patrones necesarios para asegurar
que se cumple la ley de Beer en un intervalo de absorbancias
en el que est incluido la absorbancia de la muestra). Ntese
que las seleccionadas para el anlisis son aquellas en las
que los dos espectros difieren significativamente. Las
ecuaciones que se dan pueden escribirse del siguiente modo:

A1 A1 bcA B1 bcB Si b = 1cm y como

1 1

cA1 = cA2 = cA
A1 A1 bcA B1 bcB cB1 = cB2 = cB
1 1

A1 = A1cA + B1cB
A2 = A2cA + B2cB

21
Bibliografa:

Qumica Biolgica I TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA

http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-content/uploads/2010/08/2011-TP-1-
ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

PRCTICA 4
COLORIMETRA. LEY DE LAMBERT-BEER pdf
http://www.uam.es/docencia/qmapcon/QUIMICA_GENERAL/Practica_4_Colorimetria_Ley_de_Lamber
t_Beer.pdf

INTRODUCCION TEORICA FUNDAMENTOS DE ESPECTROFOTOMETRA pdf

http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358005/Fundamentos_de_espectrofotometria.pdf

Prctica de espectrofotometra UV-Visible (Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y anlisis de

mezclas)
http://campus.usal.es/~quimfis/apoyo/Carmen/Practicas/Espectrofotometria.PDF

8. Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica de biomolculas Nieves Abril

Daz1 , J. Antonio Brcena Ruiz1 , Emilio Fernndez Reyes1 , Aurora Galvn Cejudo1 , Jess Jorrn
Novo1 , Jos Peinado Peinado1 , Fermn Toribio Melndez-Valds1 , Isaac Tnez Fiana2 Departamento
de Bioqumica y Biologa Molecular, 1 Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,
14071-Crdoba, 2 Facultad de Medicina, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba.
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf

Anexo I: ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

http://ocw.uc3m.es/ingenieria-quimica/quimica-ii/practicas-1/PR-F-Anexos.pdf

ESPECTROSCOPA ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

http://blocs.xtec.cat/1415quimica2/files/2015/03/1.-UV-VIS.pdf

Espectrofotometria Uv Visible: Aplicaciones en el analisis qumico

https://www.u-
cursos.cl/usuario/2775c7595e300ed228a801eb8341e457/mi_blog/r/Espectrofotometria__Uv___Visible20
12.pdf

Espectrometra. Espectro electromagntico Radiacin electromagntica: energa que se transmite a travs

del espacio en forma de ondas. Amplitud: distancia.
http://slideplayer.es/slide/3409340/

Tema 5: Tcnicas espectroscpicas: Espectrofotometra Rayos (gamma) < 1 pm Rayos X 1 pm- 10 nm

Ultravioleta 10-400 nm Visible 400-800nm Infrarrojo.
Publicada porAna Beln Ojeda Domnguez
http://slideplayer.es/slide/8951316/

LECCIN 14: INTRODUCCIN A LA ESPECTROSCOPA MOLECULAR La radiacin

electromagntica y su interaccin con la materia. Regiones del espectro y tipos de.
http://slideplayer.es/slide/1022609/

INTRODUCCIN 1. Ley de Lambert-Beer 2. Determinaci n de prote nas 1.Absorbancia 280 2.Biuret

3.Lowry 4.Bradford.
Publicada porPaca Chia
http://slideplayer.es/slide/145856/

INSTRUMENTOS PTICOS EN MEDIDAS DE ABSORBANCIA

http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espe
ctroscopia_04.htm

http://www.monografias.com/trabajos106/tecnicas-espectrofotometricas-absorcion-ultravioleta-
visible/tecnicas-espectrofotometricas-absorcion-ultravioleta-visible2.shtml

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TCNICAS BASADAS EN LA ABSORCIN DE RADIACIN_
http://www.rpsqualitas.es/documentacion/dowloads/instrumental/metodos_espectrometricos_de_absorcio
n.pdf

(ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS) PROF. MARLENE MORA 2013 MM 2013

http://docplayer.es/8837254-Espectrofotometria-uv-vis-prof-marlene-mora-2013.html

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