Introducción al ADN: Bases de la Biología Molecular

Curso de
Introduccin a la
Biotecnologa
1) INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR
Bases de biologa molecular
Qu es
el ADN?
INTRODUCCIN Y BASES DE LA BIOLOGA MOLECULAR
La pista del ADN (exp. de Griffith)

El descubrimiento de la sustancia que
puede transmitir caractersticas genticas
de una clula a otra result de los
estudios con neumococos, las bacterias
que causan la neumona. Una cepa de
estas bacterias tiene cpsulas de
polisacridos y otra no. La capacidad para
fabricar cpsulas y causar la enfermedad
es una caracterstica heredada que pasa
de una generacin a otra, cuando las
clulas se dividen.
Algo se haba transferido de las

bacterias muertas a las vivas que las
dotaba de la capacidad de formar
cpsulas y causar la neumona.
Este Algo fue aislado y se encontro que era el ADN.

La pista del ADN (Hershey & Chase)

La pista del ADN (Erwin Chargaff)
Composicin porcentual del DNA en varias especies
Purinas Pirimidinas
Fuente Adenina Guanina Citosina Timina
Ser humano 30.4 19.6 19.9 30.1

Buey 29.0 21.2 21.2 28.6
Espermatozoide 29.7 20.8 20.4 29.1
salmn
Germen de trigo 28.1 21.8 22.7 27.4
E. Coli 24.7 26.0 25.7 23.6
Erizo de mar 32.8 17.7 17.3 32.2
La pista del ADN: Soporte de la informacin gentica
Watson & Crick en 1953,

con uno de sus modelos Modelo del ADN
del ADN. obtenido por
computadora.
Fotografa de difraccin
de rayos X tomada por
Rosalind Franklin.
El material gentico
El material gentico
1 organismo vivo
= la planta.
Grupo de clulas
Grupo de clulas
1 clula y su ncleo
El ncleo Material gentico
ADN
Membrana nuclear
El cromosoma
Doble cadena
enrollada
El ADN
cido
DesoxiriboNucleico
INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR ADN
El ADN: cido desoxirribonucleico

Situacin del ADN dentro de
una clula eucariota
El cido desoxirribonucleico, abreviado

como ADN, es un cido nucleico que
contiene instrucciones genticas usadas en
el desarrollo y funcionamiento de todos los
organismos vivos conocidos y algunos virus,
y es responsable de su transmisin
hereditaria. El papel principal de la
molcula de ADN es el almacenamiento a
largo plazo de informacin.
Dentro de las clulas, el ADN est

organizado en estructuras llamadas
cromosomas que, durante el ciclo celular,
se duplican antes de que la clula se divida.
Los organismos eucariotas almacenan la
mayor parte de su ADN dentro del ncleo
celular y una mnima parte en elementos
celulares (mitocondrias, plastos); Los
organismos procariotas lo almacenan en el
citoplasma de la clula.
Bases moleculares de la vida:
Flujo de la informacin gentica: del gen a la protena
= nucletidos
Gen Cdigo
gentico
3 nucletidos
1 codn
1 aminocido
= Aminocidos
Gen (ADN) RNAm Protena carcter
transcripcin traduccin expresin

INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR DOGMA CENTRAL
El dogma central de la biologa molecular

El dogma central de la biologa molecular es un concepto que ilustra los mecanismos de
transmisin y expresin de la herencia gentica. Propone que existe una uni-
direccionalidad en la expresin de la informacin contenida en los genes de una clula, es
decir, que el ADN es transcrito a ARN mensajero y que ste es traducido a protena.
ADN
ADN
REPLICACIN
ARN
TRANSCRIPCIN
Pre ARNm
Ncleo
Maduracin del ARN
Citoplasma (adicin del CAP, poli-A,
corte de intrones,
ARNm empalme de exones)
procesado Protena
TRADUCCIN
Protena Ribosoma Proceso de las protenas
(plegamiento, ensamblaje y
transporte celular)
INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR DOGMA CENTRAL
Esquema del flujo de

informacin
En eucariotas
En procariotas
El ADN: Soporte de la informacin gentica

1953: J. Watson y F. Crick descubren la estructura del ADN:
la doble hlice.
Watson J. D. and F. H. C. Crick, (1953).- Molecular Structure of Nucleic

Acids - a Structure for Deoxyribose Nucleic Acid.- Nature, 171, 4356,
737-738.
Los componentes del ADN

Los nucleotidos

Los nucleotidos
Unidad estructural del cido nucleico compuesto por una base nitrogenada, un
azcar y un grupo fosfato.
Nuclesido Azcar + Base Nitrogenada


Las 4 bases nitrogenadas
Bases pirimdicas:
cido fosfrico
Su frmula qumica es H3PO4.

El grupo fosfato (PO43-) une el carbono 5'
del azcar de un nuclesido con el carbono 3'
del siguiente.
T: Timina: 2, 4-dioxo, Desoxirribosa

C: Citosina: 2-oxo, 5-metilpirimidina
4-aminopirimidina Monosacrido de 5 tomos de carbono (una
Bases purinas: pentosa) derivado de la ribosa.
G: Guanina: 6-oxo, A: Adenina:

2-aminopurina. 6-aminopurina

Las bases nitrogenadas

Los azucares
desoxirribosa
Enlace del azcar con la base:
N-glucosdico
ribosa

El cido fosfrico
El cido fosfrico es un tri-cido. Dos de las tres funciones

cidos sern esterificadas en los ADN y ARN.
Enlace
Fosfodiester
Estructura fsica del ADN
Cadena "escaln" Cadena

Estructura fsico-qumica del ADN
La molcula de ADN est constituida

de dos cadenas de nucletidos
conectadas mediante puentes de
hidrgeno.
Ambas cadenas son complementarias,
pues la adenina y la guanina de una
cadena se unen, respectivamente, a la
timina y la citosina de la otra. Ambas
cadenas son antiparalelas, pues el
extremo 3 de una se enfrenta al
extremo 5 de la homloga.
Propiedades del ADN

Hibridacin de los cidos nucleicos
-Desnaturalizacin = Fusin
= proceso de separacin de hebras.
Tm = Temperatura de Fusin
Las secuencias de cidos nucleicos

pueden compararse en trminos de
similitud o complementariedad.
- Renaturalizacin permite merdir la

complementariedad.
Cuando los cidos nucleicos implicados

proceden de fuentes diferentes, la
reaccin suele denominarse Hibridacin.
Propiedades del ADN
Los cidos nucleicos

Fundamento de la
reaccin de hibridacin
Propiedades del ADN

Fundamento
de la reaccin
de hibridacin
INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR ADN Y REPLICACIN, GENMICA
Propiedades del ADN

Fundamento de la
reaccin de hibridacin
Esquema del flujo de informacin La informacin fluye del ADN al

Dogma Central ARN y de ste a las protenas.
El dogma central de la biologa molecular es un concepto que
ilustra los mecanismos de transmisin y expresin de la herencia
gentica. Propone que existe una uni-direccionalidad en la
expresin de la informacin contenida en los genes de una
clula, es decir, que el ADN es transcrito a ARN mensajero y
que ste es traducido a protena.
Transcripcin
inversa
La replicacin del ADN

Proceso mediante el cual a partir de una molcula de ADN parental, se sintetizan
dos molculas hijas con secuencias idnticas a la molcula original. Esto permite
el paso de la informacin gentica a la descendencia.
Etapas
-Iniciacin
-Elongacin
-Terminacin
Panorama de la replicacin del ADN
Replicacin en Drosophila melanogaster Replicacin del cromosoma de E. coli

Cundo ocurre la replicacin en procariontes?
E. coli
Fisin binaria
Cundo ocurre la replicacin en eucariontes?
G0
INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULA ARN Y TRANSCRIPCIN
La transcripcin del ARN
ADN
ARN
TRANSCRIPCIN
Pre ARNm
Ncleo
Citoplasma Maduracin del ARN
(adicin del CAP, poli-A,
corte de intrones,
ARNm empalme de exones)
procesado
Protena
TRADUCCIN
transporte celular)
Flujo de la informacin gentica: Expresin del gen
Definicin simple: El gen se define como una estructura formada por ADN que
codifica un ARN, el cual permite a su vez codificar protenas.
Su expresin est controlada por segmentos reguladores (promotores,

potenciadores, silenciadores, terminadores).
La informacin contenida y almacenada en los genes se expresa como

protenas (a excepcin de los genes de ARNr, ARNt, snARN).
La(s) protena(s) codificada(s) por un(os) determinado(s) gen(es)
contribuye(n) a la expresin de un caracter especfico .
Gen (ADN) RNAm Protena caracter
transcripcin traduccin expresin

Estructura bsica de un Gen

Existen tres regiones principales en los genes
Secuencia Secuencia Secuencia de
Promotora Codificante Terminacin
P Sec.Cod. T
Secuencia promotora: determina cuando,

dnde, y en qu medida se obtiene el
producto del gen.
Secuencia codificante: contiene la

informacin gentica necesaria para la
produccin de la protena correspondiente.
Secuencia de terminacin: marca el final del

gen e indica cuando debe terminar la
transcripcin.
La transcripcin del ARN

La transcripcin o sntesis de ARN incluye la separacin de las cadenas del ADN
y la sntesis de una molcula de ARN en la direccin 5' a 3' por la ARN
polimerasa, usando una de las cadenas del ADN como molde..
El ARN: cido ribonucleico
El cido ribonucleico (ARN o RNA) es un Comparativa entre ARN y ADN
cido nucleico formado por una cadena de ARN ADN
ribonucletidos. Est presente tanto en las
Pentosa Ribosa Desoxirribosa
clulas procariotas como en las eucariotas, y
es el nico material gentico de ciertos virus Purinas Adenina y Guanina Adenina y Guanina
(virus ARN). El ARN celular es lineal y de Pirimidinas Citosina y Uracilo Citosina y Timina
hebra sencilla, pero en el genoma de
algunos virus es de doble hebra.
En los organismos celulares desempea

diversas funciones. Es la molcula que dirige
las etapas intermedias de la sntesis
proteica; el ADN no puede actuar solo, y se
vale del ARN para transferir esta
informacin vital durante la sntesis de
protenas (produccin de las protenas que
necesita la clula para sus actividades y su
desarrollo).
Varios tipos de ARN regulan la expresin
gnica, mientras que otros tienen actividad
cataltica. El ARN es, pues, mucho ms
verstil que el ADN.
El ARN: cido ribonucleico

Del ADN a la Protena: El rol del ARN
INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULA PROTENA Y TRADUCCIN
La traduccin del ARN a la Protena
ADN
ARN
TRANSCRIPCIN
Pre ARNm
Ncleo
Citoplasma
ARNm
procesado
Protena
TRADUCCIN
transporte celular)

Protenas
La funcin bsica de las protenas es ejecutar las tareas dirigidas por la informacin
gentica.
Funciones:
- Componentes estructurales de las clulas y tejidos (Colgeno).
- Transporte y almacenamiento de pequeas molculas (Hemoglobina).
- Transmisin de seales entre clulas (hormonas: Adrenalina).
- Defensa frente a infecciones (anticuerpos)
- Catalizacin de reacciones qumicas en los sistemas biolgicos (Polimerasas)
Las protenas dirigen virtualmente casi todas las actividades de las clulas.

Aminocidos
Las protenas estn formadas por

polmeros de aminocidos con secuencias
especficas.
El papel de cada aminocido en la estructura y funcin proteica depender

de las propiedades qumicas de sus cadenas laterales.

Enlaces peptdicos
Los aminocidos estn unidos por enlaces peptdicos entre el grupo amino de
un aminocido y el grupo carboxilo del siguiente.
Cada cadena polipeptdica tiene extremos distintivos, uno terminado por un

grupo amino (extremo amino o N-terminal) y el grupo carboxilo (extremo
carboxi o C-terminal).

Estructura tridimencional
Depende de la secuencia aminoacdica y de las interacciones entre los
aminocidos. Estas formas son cruciales para sus funciones.
INTRODUCIN Y BASES DE
LA BIOLOGA MOLECULAR
El cdigo
gentico
- Universal
- Redundante
64 codones
(tripletes de
nucletidos)
21
Aminocidos
Los Efectores de la traduccin
ARN ribosmicos (ARNr) ARN

mensajero
(ARNm)
ARN de transferencia (ARNt)

Los Efectores de la traduccin

Ribosoma
(ARNr
Cadena + proteinas ribosomales)
polipeptdica
en crecimiento
ARNt
Separacin
del ARNt
Llegada del
ARNm ARNt con aa7
Movimiento
del ribosoma
Protenas y traduccin
Las etapas de la traduccin
La traduccin ocurre tanto en

el citoplasma, donde se encuentran
los ribosomas, como tambin en
el retculo endoplasmtico
rugoso (RER).
El proceso de traduccin convierte

una secuencia de ARNm en una
cadena de aminocidos para formar
una protena.
Tiene cuatro fases: activacin,
iniciacin, elongacin y terminacin.
Localizacin de las protenas en la clula

INTRODUCCIN A LA BIOLOGA MOLECULAR TCNICAS DE ESTUDIO DEL ADN Y ARN
Extraccin de ADN
Proceso de liberacin del material
gentico contenido dentro de una
clula.
Los cidos nucleicos son liberados
o separados de los componentes
celulares as como de protenas
que contienen las clulas.
El ADN puede ser obtenido de cualquier clula o material

biolgico que lo contenga
Extraccin de ADN
Disgregacin o fragmentacion del tejido
Lisis celular
Purificacin
Precipitacin
Conservacin
Mtodos de fragmentacin, lisis celular

para extraccin de ADN
Macerador
Muestra
Tampn
de lisis
Bao-maria
Mtodos de purificacin del ADN

Se base en la
eliminacin
qumica de las
protenas, lpidos
y sales celulares
Separacin por
centrifugacin
Mtodos de precipitacin del ADN

El ADN se
Es realizada en las siguientes condiciones: etanol 2,5 volumenes o
precipita con isopropanol 1 volumen/acetato de ammonio 2,5M o acetato de
etanol fro o sodio 0,3M pH5,2.
isopropanol en El ADN es recuperado precipitado despus de centrifugacin a
presencia de 12000g durante 15-30min. Raramente, centrifugaciones ms largas
sales y a velocidades ms altas o en presencia de entrenadores pueden
ser necesarias cuando la cantidad de ADN es baja (< 15ng) o el
tamao de fragmentos pequeos (< 100 nucletidos).
El sedimento es lavado de sus sales en exceso por el etanol 70% en
el cual las sales son solubles pero no el ADN.
Nota: la resuspensin del ADN precipitado puede ser largo, sobre

todo si el secado del precipitado fue prolongado. Puede ser
necesario colocar la muestra en una rueda (para mezcla la
suspensin) a 4C durante varios das. La resuspensin es a menudo
efectuada en un tampn Tris-HCl 10 mM pH8 EDTA 1mM.
ADN
Centrifugacin precipitado
Mtodos de conservacin y anlisis del ADN

Conservacin y Estimacin de la concentracin del ADN
Las preparaciones de ADN deben ser conservadas de forma puras.

El ADN es ms a menudo conservado a 4C en Tris-HCl 10 mM pH8 EDTA 1mM. Para
una larga conservacin la congelacin a -80C es preferible pero se debe alicotar las
preparaciones debido a que los ciclos de congelacin - descongelacin provocan
rupturas del ADN.
Se realiza a menudo por fotometra,

las bases pricas y pirimdicas adsorben fuertemente a 260nm.
Una unidad de densidad ptica (OD) a 260nm =
a una solucin de ADN doble cadena 50g/mL
a una solucin de ADN simple cadena o ARN 40g/mL
a una solucin de oligonucletido de 33g/mL.
Una contaminacin proteica puede identificarse realizando una lectura a 280nm.

Un ADN puro debe tener una razn DO260/DO280 entre 1,8 y 2,0.
Extraccin de ADN Purificacin de ADN

Preparacin de ADN complementario (ADNc)

Electroforesis
Materiales
Balanza
Agarosa
Fiola
Probeta TAE 1X
Pipeta
Microonda
Puntas de depsito
Protocolo de preparacin
del Gel de Agarosa
Montaje del molde para el gel
Fondo Localizacin de
del las paredes del
molde molde
Localizacin y
alineamiento de las
peinetas
Pesar la agarosa
2 3
1
Mezclar el TAE 1X con
Medir el TAE 1 X
la agarosa
Agarosa Polisacrido
T.A.E Tris
cido Actico
EDTA
4
Calentar hasta que la

agarosa se disuelva Dejar enfriar
completamente algunos minutos
Guantes
5
Aadir el
bromuro
de etidio
6
Cubeta de Colocar en la cubeta y

electroforesis esperar que el gel se
polimerice
Mezclar el ADN con el
tampn de depsito
(Azul de Bromofenol)
7
Muestra
Sacar con cuidado
las paredes y les 8
peinetas del
Colocar con cuidado
molde Las muestras en los pozos
9
Cerrar la cubeta de
electroforesis y encender la
fuente de poder
Clasificacin de los fragmentos
de ADN por tamao
Cadenas largas
(desplazamiento lento)
Grande
Pequeo Cadenas cortas

(desplazamiento rpido)
Determinacin del tamao
Marcadores de peso molecular
Deteccin de los cidos nucleicos
El bromuro de etidio (BET) es un agente intercalante que

fluoresce bajo iluminacin con los ultravioletas. Permite as a
300nm (254-366nm) la deteccin de los cidos nucleicos
sobre los cuales se fijo.
Despus de de la migracin los geles pueden ser incubados

en presencia de BET (solucin que contenga 0.5-1g/mL).
Despus de enjuagar el gel en agua, es llevado al

transilluminador.
Bandas de baja intensidad correspondientes a pocos

nanogramos pueden ser as detectados.
10
Despus de algunos minutos, colocar el gel sobre

un trans-iluminador y observar los resultados

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Curso de

La pista del ADN (exp. de Griffith)

Algo se haba transferido de las

Este Algo fue aislado y se encontro que era el ADN.

La pista del ADN (Hershey & Chase)

La pista del ADN (Erwin Chargaff)

Composicin porcentual del DNA en varias especies

Fuente Adenina Guanina Citosina Timina

Ser humano 30.4 19.6 19.9 30.1

La pista del ADN: Soporte de la informacin gentica

Watson & Crick en 1953,

El ADN: cido desoxirribonucleico

El cido desoxirribonucleico, abreviado

Dentro de las clulas, el ADN est

Gen (ADN) RNAm Protena carcter

transcripcin traduccin expresin

El dogma central de la biologa molecular

Esquema del flujo de

El ADN: Soporte de la informacin gentica

Watson J. D. and F. H. C. Crick, (1953).- Molecular Structure of Nucleic

Los componentes del ADN

Los componentes del ADN

Nuclesido Azcar + Base Nitrogenada

Los componentes del ADN

Su frmula qumica es H3PO4.

T: Timina: 2, 4-dioxo, Desoxirribosa

G: Guanina: 6-oxo, A: Adenina:

Los componentes del ADN

Los componentes del ADN

Los componentes del ADN

El cido fosfrico es un tri-cido. Dos de las tres funciones

Estructura fsica del ADN

Cadena "escaln" Cadena

Estructura fsico-qumica del ADN

La molcula de ADN est constituida

Propiedades del ADN

Las secuencias de cidos nucleicos

- Renaturalizacin permite merdir la

Cuando los cidos nucleicos implicados

Propiedades del ADN

Los cidos nucleicos

Propiedades del ADN

Propiedades del ADN

Esquema del flujo de informacin La informacin fluye del ADN al

La replicacin del ADN

Replicacin en Drosophila melanogaster Replicacin del cromosoma de E. coli

Cundo ocurre la replicacin en procariontes?

Cundo ocurre la replicacin en eucariontes?

La transcripcin del ARN

Flujo de la informacin gentica: Expresin del gen

Su expresin est controlada por segmentos reguladores (promotores,

La informacin contenida y almacenada en los genes se expresa como

Gen (ADN) RNAm Protena caracter

transcripcin traduccin expresin

Estructura bsica de un Gen

Secuencia promotora: determina cuando,

Secuencia codificante: contiene la

Secuencia de terminacin: marca el final del

La transcripcin del ARN

En los organismos celulares desempea

El ARN: cido ribonucleico

La traduccin del ARN a la Protena

La traduccin del ARN a la Protena