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5. TEXTOS GERAIS

5. Textos gerais
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5. TEXTOS GERAIS
5.1. Textos gerais sobre esterilidade 647 5.8. Harmonizao das Farmacopeias 773
5.2. Textos gerais sobre produtos biolgicos 671 5.9. Polimorfismo 777
5.3. Anlise estatstica de resultados de ensaios 5.10. Controlo das impurezas nas substncias para uso
e testes biolgicos 701 farmacutico 781
5.4. Solventes residuais 737 5.11. Caractersticas nas monografias 787
5.5. Tabelas alcoomtricas 747 5.12. Padres de referncia 793
5.6. Aferio dos interferes 759 5.14. Medicamentos de terapia gentica
5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos para uso humano 801
citados na Farmacopeia Portuguesa 765

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 645


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5.1. TEXTOS GERAIS


SOBRE ESTERILIDADE
5.1. Textos gerais sobre esterilidade 649 5.1.5. Aplicao do conceito F0 esterilizao
5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis 649 pelo vapor das preparaes aquosas 656
5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao 651 5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo
5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos 652 da qualidade microbiolgica 656
5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes 5.1.7. Segurana vrica 669
farmacuticas 653

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 647


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5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis

5.1. TEXTOS GERAIS Se a esterilizao final no for possvel, convm recorrer


filtrao usando um filtro que retenha bactrias, ou tcnica
SOBRE ESTERILIDADE assptica; sempre que possvel, aplica-se um tratamento
complementar apropriado (por exemplo, aquecimento) ao
produto no seu recipiente definitivo. Em todos os casos, o
5.1.1. MTODOS DE PREPARAO recipiente e o sistema de fecho mantm a esterilidade do
DE PRODUTOS ESTREIS produto durante todo o tempo de validade.
Nvel de segurana de esterilidade (NSE)
Esterilidade a ausncia de microrganismos vivos. A
realizao de ensaios no suficiente para garantir a Nos casos apropriados, nos mtodos descritos mais adiante
esterilidade de um produto e a garantia da esterilidade faz-se referncia ao conceito de nvel de segurana de
passa igualmente pela aplicao de processos de produo esterilidade ou NSE. Com efeito, no pode garantir-se nem
convenientemente validados. essencial estudar o efeito do verificar em absoluto a esterilidade de todas as unidades
mtodo de esterilizao escolhido sobre o produto (incluindo contidas numa populao que tenha sido objecto de
o recipiente ou a embalagem final) do ponto de vista da esterilizao. A inactivao de microrganismos por processos
eficcia e da manuteno da sua integridade e validar esse fsicos ou qumicos um fenmeno que se rege por uma
mtodo antes de o pr em prtica. Recomenda-se a escolha lei exponencial e, por consequncia, existe sempre uma
de um recipiente que seja compatvel com o mtodo de

5. Textos gerais
certa probabilidade estatstica de um microrganismo
esterilizao aconselhado. A utilizao escrupulosa de um sobreviver esterilizao. Para um determinado processo,
processo validado condio a respeitar, sob pena de obter esta probabilidade de sobrevivncia funo do nmero,
um produto no estril ou deteriorado. De cada vez que se
do tipo e da resistncia dos microrganismos presentes,
fazem mudanas de vulto no processo de esterilizao faz-se
bem como do ambiente em que se desenrola a operao. O
nova validao incluindo no que diz respeito a contaminao
nvel de segurana de esterilidade (NSE) de um processo
microbiana (carga). bvio que as normas de boa prtica de
fabrico (descritas, por exemplo, no guia CEE relativo s boas de esterilizao indica o grau de segurana com o qual
prticas de fabrico) tero que ser observadas, nomeadamente um conjunto de unidades tornado estril pelo processo
no que diz respeito a: utilizado. O NSE para determinada tcnica expresso como
a probabilidade da existncia de uma unidade no estril
emprego de pessoal qualificado e convenientemente treinado, nessa populao. Um NSE de 106, por exemplo, corresponde
utilizao de locais adequados, a uma probabilidade de existir, no mximo, 1 microrganismo
vivel em 106 unidades esterilizadas do produto final. O NSE
utilizao de equipamento de produo adequado, associado a um processo, para um determinado produto,
concebido para poder ser facilmente limpo e esterilizado, estabelecido com base em estudos de validao apropriados.
respeito pelas precaues necessrias para reduzir o
risco de contaminao microbiana (biocarga) antes da
esterilizao, MTODOS E CONDIES DE ESTERILIZAO

utilizao de mtodos validados em todas as etapas crticas A esterilizao pode ser efectuada por um dos mtodos descritos
da produo, a seguir. possvel utilizar variantes ou combinaes destes
vigilncia do ambiente e controlos durante a produo. mtodos, desde que o processo escolhido seja validado quer
no aspecto de eficcia, quer na manuteno da integridade do
As precaues a tomar para limitar a carga microbiana antes produto, incluindo o recipiente ou a embalagem.
da esterilizao incluem a utilizao de compostos que
apresentem um nvel suficientemente baixo de contaminao Qualquer que seja o mtodo de esterilizao utilizado, os
microbiana. Pode ser desejvel executar controlo parmetros crticos so objecto de controlo para confirmar
microbiolgico e estabelecer limites apropriados para que o conjunto do lote sujeito, durante todo o processo
compostos cuja origem, natureza ou modo de preparao de tratamento, s condies de esterilizao previamente
comportem riscos de contaminao. definidas. Esta exigncia vlida em todos os casos, mesmo
Os mtodos descritos neste texto aplicam-se principalmente quando so utilizadas condies padro.
inactivao ou eliminao de bactrias, leveduras e fungos.
Entretanto, para os produtos biolgicos de origem animal ou Esterilizao final
humana, ou quando material de origem animal ou humana
Para a esterilizao final, essencial ter em conta a no
utilizado na produo, necessrio demonstrar, aquando
uniformidade das condies fsicas ou qumicas durante o
da validao, que o processo utilizado permite eliminar ou
inactivar os contaminantes vricos potenciais. Indicaes ciclo de esterilizao. O local menos acessvel ao agente de
a este respeito so fornecidas, por exemplo, nas Notas esterilizao determinado para cada processo de carga e
Explicativas CEE. para cada tipo e forma de recipiente ou de embalagem (por
exemplo, o ponto mais frio de uma autoclave). Convm
Sempre que possvel, conveniente escolher um processo igualmente determinar a dose mnima letal resultante
que permita a esterilizao do produto na embalagem do ciclo de esterilizao e a reprodutibilidade deste, para
definitiva (esterilizao final). Quando se utiliza um processo assegurar que todas as cargas submetidas esterilizao
final (pelo vapor, pelo calor seco ou por radiaes) totalmente recebem o tratamento recomendado.
validado, pode admitir-se, sob reserva de aprovao pela
Autoridade Nacional, que se recorra libertao paramtrica, Depois de se estabelecer um processo de esterilizao final,
isto , fundamentar a libertao de um lote de unidades avalia-se a sua eficcia na rotina, sempre que possvel, por
esterilizadas mais nos dados de produo do que nos verificao e registo apropriados das condies fsicas ou
resultados de um ensaio de esterilidade efectuado sobre uma qumicas atingidas pela carga, durante toda a durao do
amostra desse lote. ciclo de esterilizao.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 649


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5.1.1. Mtodos de preparao de produtos estreis

Esterilizao pelo vapor (em autoclave). Quando aplicvel, taxa de letalidade adequada e reprodutvel quando aplicado
a esterilizao pelo vapor saturado sob presso o mtodo como rotina dentro dos limites de tolerncia estabelecidos.
recomendado, nomeadamente para as solues aquosas. Os mtodos e precaues utilizados permitem obter um NSE
Para este mtodo de esterilizao final, as condies padro de, pelo menos, 106.
aplicveis s preparaes aquosas so de 121C, durante,
Durante o processo de esterilizao, a radiao absorvida
pelo menos, 15 min. Podem utilizar-se outras combinaes
pelo produto objecto de verificaes regulares, efectuadas
de temperatura e tempo desde que se demonstre que o
por processos dosimtricos que so independentes da taxa de
processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada radiao. Os aparelhos so calibrados em relao a uma fonte
e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos padro numa instalao de referncia quando da recepo
limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues e depois com intervalos de tempo apropriados que no
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. As ultrapassam 1 ano.
informaes relativas validao por meio do conceito F0 so
dadas mais adiante (5.1.5). Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao,
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2).
Os parmetros fsicos (temperatura e presso) existentes
dentro da autoclave durante o processo de esterilizao so Esterilizao por gases. Este mtodo s utilizado quando no
conhecidos. A temperatura geralmente determinada por possvel aplicar qualquer um dos outros processos. essencial
meio de sondas instaladas no interior de vrios recipientes assegurar a penetrao do gs e da humidade no produto a
5. Textos gerais

representativos bem como em pontos da autoclave esterilizar e utilizar depois um processo de eliminao do gs
previamente identificados como os mais frios do conjunto em condies que se verificou previamente permitirem que no
da carga. Os parmetros fsicos so registados durante todo produto esterilizado os resduos ou produtos de transformao
o decorrer do ciclo, por exemplo na forma de diagrama do gs se reduzem a uma concentrao inferior que pode
temperatura/tempo ou qualquer outra apropriada. provocar efeitos txicos quando da utilizao. A este respeito,
as notas explicativas da CEE fornecem indicaes quanto ao
Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao, emprego do xido de etileno.
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2).
Convm, sempre que possvel, determinar e registar a
Esterilizao pelo calor seco. Para este mtodo de concentrao do gs, a humidade relativa, a temperatura e
esterilizao final as condies padro so de 160C durante, o tempo de esterilizao. As determinaes so efectuadas
pelo menos, 2 h. Podem utilizar-se outras combinaes nos locais mais desfavorveis do ponto de vista da realizao
de temperatura e tempo desde que se demonstre que o das condies de esterilizao, locais estes que foram
processo escolhido assegura uma taxa de letalidade adequada determinados quando da validao.
e reprodutvel quando aplicado como rotina dentro dos
limites de tolerncia estabelecidos. Os mtodos e precaues A eficcia do processo verificada, para cada carga
utilizados permitem obter um NSE de, pelo menos, 106. esterilizada, com indicadores biolgicos apropriados (5.1.2).

A esterilizao pelo calor seco realiza-se em estufas de Um amostra apropriada de cada lote submetida a um ensaio
ventilao forada ou noutros dispositivos especialmente de esterilidade (2.6.1) antes da sua libertao.
preparados para o efeito. A carga colocada de tal modo que
a temperatura seja uniforme em todo o conjunto. Obtm-se Filtrao
dados relativos temperatura no interior do esterilizador Certas substncias activas ou produtos no susceptveis
durante o processo de esterilizao, recorrendo geralmente de serem submetidos a uma esterilizao final podem
a sondas instaladas no interior de vrios recipientes ser esterilizados por filtrao usando um tipo de filtro
representativos bem como em pontos do esterilizador que satisfaa a uma prova microbiana realizada com um
previamente identificados como os mais frios do conjunto da microrganismo de ensaio apropriado. Pode servir uma
carga. A temperatura registada durante todo o decorrer do suspenso de Pseudomonas diminuta (ATCC 19146 NCIMB
ciclo, de forma apropriada. 11091 ou CIP 103020). Recomenda-se aplicar uma carga
Quando se procede a um ensaio biolgico de verificao, de prova de, pelo menos, 107 UFC por cm2 de rea activa
conveniente utilizar um indicador biolgico apropriado (5.1.2). de filtrao e preparar a suspenso num meio de cultura
de triptona-soja que, aps passagem atravs do filtro,
O calor seco a mais de 220C frequentemente utilizado recolhido em condies asspticas e incubado em aerobiose
para esterilizar e despirogenar material de vidro. Neste caso, a 32C. Estes produtos necessitam de precaues especiais.
em lugar de utilizar indicadores biolgicos de esterilizao O processo e o ambiente de produo so escolhidos de
(5.1.2), possvel demonstrar a existncia de uma reduo de modo a limitar os riscos de contaminao microbiana e so
3 log das endotoxinas resistentes ao calor. objecto de verificao regular por mtodos apropriados.
Esterilizao por radiaes ionizantes. Este mtodo de O equipamento, os recipientes e fechos e, se possvel, os
esterilizao efectua-se por exposio do produto a uma componentes do produto so submetidos a um processo de
radiao ionizante que pode ser uma radiao gama esterilizao conveniente. Efectua-se a filtrao esterilizante
proveniente de um radioistopo apropriado (cobalto 60, por to prximo quanto possvel do ponto de enchimento.
exemplo) ou um feixe de electres acelerados por meio de um As operaes que se seguem filtrao so realizadas em
condies asspticas.
acelerador apropriado.
As solues so filtradas por uma membrana antibacteriana
Em certos pases existem regulamentaes especiais para a
de porosidade nominal inferior ou igual a 0,22 m ou por
utilizao das radiaes ionizantes para fins de esterilizao
outro tipo de filtro que possua propriedades equivalentes de
(ver, por exemplo, as Notas Explicativas CEE).
reteno de bactrias. So tomadas precaues para evitar
Para este mtodo de esterilizao final, a dose padro (dose as perdas de soluto por adsoro no filtro e a libertao de
absorvida) de 25 kGy. Podem utilizar-se outros valores contaminantes pelo filtro. Tem-se em conta a contaminao
desde que se demonstre que a dose escolhida assegura uma microbiana antes da filtrao, a capacidade do filtro, o

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5.1.2. Indicadores biolgicos de esterilizao

tamanho dos lotes e o tempo de filtrao. Um mesmo filtro Microrganismos da mesma espcie bacteriana que as bactrias
no utilizado durante um espao de tempo superior quele utilizadas para fabricar os indicadores biolgicos podem ser
que foi definido como adequado quando da validao do inoculados directamente num produto lquido a esterilizar,
conjunto filtro-produto. ou num produto lquido similar ao produto a esterilizar. Neste
caso, demonstra-se que o lquido utilizado no tem efeito
A integridade dos filtros esterilizantes verificada antes e inibidor para os esporos utilizados, em particular quanto
depois do seu uso por meio de ensaios adaptados ao tipo de sua germinao.
filtro e etapa em que efectuada a verificao (por exemplo,
ponto de bolha, resistncia presso ou taxa de difuso). Os indicadores biolgicos so caracterizados pelo nome da
espcie bacteriana do microrganismo indicador, nmero
Dados os riscos suplementares que comporta a filtrao, da estirpe na coleco de origem, nmero de esporos
em relao aos outros mtodos de esterilizao, pode viveis por suporte e pelo valor D. O valor D o valor de
ser desejvel proceder a uma pr-filtrao com um filtro um parmetro de esterilizao (durao ou dose absorvida)
antibacteriano quando impossvel limitar a contaminao necessrio para reduzir em 10 por cento do valor inicial, o
microbiana por outros meios. nmero de microrganismos viveis. S tem significado em
condies experimentais bem definidas. Esto presentes
Preparao assptica apenas os microrganismos indicados. Podem ser utilizados
como indicadores biolgicos suportes com mais do que uma
O objectivo da preparao assptica manter a esterilidade
espcie bacteriana. So fornecidas informaes sobre o meio

5. Textos gerais
de um produto obtido a partir de componentes previamente
de cultura e condies de incubao.
esterilizados por um dos mtodos antes descritos. O
processo de atingir este objectivo operar em condies Recomenda-se que os indicadores biolgicos sejam
e em instalaes concebidas para impedir a contaminao colocados em locais considerados menos acessveis ao
microbiana. A preparao assptica pode compreender agente esterilizante, ou identificados como tais por prvias
o enchimento e o fecho assptico dos recipientes, a determinaes fsicas. Aps exposio ao agente esterilizante,
mistura assptica dos componentes da frmula seguida do utiliza-se uma tcnica assptica para transferir o suporte
enchimento e do acondicionamento asspticos. carregado de esporos para o meio de cultura, afim de evitar
qualquer risco de contaminao na altura do exame. Podem
Para manter a esterilidade dos componentes e do produto ser utilizados indicadores biolgicos que incluam uma
durante a preparao conveniente dispensar ateno ampola com meio de cultura directamente colocada na
especial aos seguintes aspectos: embalagem de proteco do suporte semeado.
meio ambiente, A escolha dos microrganismos indicadores efectuada com
pessoal laborante, base nos seguintes critrios:
reas crticas, a) a resistncia da estirpe indicadora ao mtodo de
esterilizao considerado , quando comparada, superior
esterilizao dos recipientes/fechos e operaes de de todos os microrganismos patognicos e dos
transferncia de produtos, microrganismos potencialmente presentes no produto,
durao mxima da armazenagem antes da embalagem final. b) a estirpe indicadora no patognica,
A validao do processo de preparao compreende c) a estirpe indicadora desenvolve-se facilmente,
verificaes adequadas sobre o conjunto dos parmetros
referidos e o prprio processo objecto de verificaes O desenvolvimento aps incubao dos microrganismos
regulares por simulao com meios de crescimento indicadores submetidos ao processo de esterilizao
microbiano que so postos a incubar e examinados com vista demonstra que o processo foi insuficiente.
deteco de uma eventual contaminao microbiana. Alm 1. Esterilizao pelo vapor. Recomenda-se a utilizao de
disso, dos produtos esterilizados por filtrao ou preparados indicadores biolgicos na esterilizao pelo vapor para
em condies asspticas submetida ao ensaio de esterilidade a validao dos ciclos de esterilizao. Recomenda-se a
(2.6.1) uma amostra apropriada antes da libertao do lote. utilizao de esporos de Bacillus stearothermophilus
(por exemplo ATCC 7953, NCTC 10007, NCIMB 8157
ou CIP 52.81). O nmero de esporos viveis por suporte
5.1.2. INDICADORES BIOLGICOS superior a 5 105 e o valor D a 121C superior a
DE ESTERILIZAO 1,5 min. Verifica-se se a exposio dos indicadores
biolgicos ao vapor durante 6 min a 121 1C mantm
os esporos revivificveis, e que no h desenvolvimento
Os indicadores biolgicos so preparaes aferidas de
dos microrganismos indicadores aps exposio ao vapor
microrganismos seleccionados, utilizados para avaliar a
durante 15 min a 121 1C.
eficcia de um procedimento de esterilizao. So geralmente
constitudos por uma populao de esporos bacterianos 2. Esterilizao pelo calor seco. Recomenda-se a utilizao de
depositados num suporte inerte, por exemplo uma tira Bacillus subtilis (por exemplo a var. niger ATCC 9372,
de papel de filtro, uma lmina de vidro ou um tubo de NCIMB 8058 ou CIP 77.18) na preparao de indicadores
material plstico. O suporte semeado embalado de modo biolgicos. O nmero de esporos viveis por suporte
a que o conjunto fique protegido de qualquer alterao superior a 1 105 e o valor D a 160C da ordem
ou contaminao, permitindo no entanto que o agente de 1 a 3 min. O calor seco a temperaturas superiores
esterilizante entre em contacto com os microrganismos. As a 220C utilizado frequentemente na esterilizao e
suspenses bacterianas podem apresentar-se em ampolas eliminao de pirognios no material de vidro. Neste caso,
seladas. Os indicadores biolgicos so preparados de modo a a demonstrao da existncia de uma reduo de 3 log de
poderem ser conservados em condies definidas. endotoxinas bacterianas resistentes ao calor substitui a
Determina-se um prazo de validade. utilizao de indicadores biolgicos.

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5.1.3. Eficcia dos conservantes antimicrobianos

3. Esterilizao por radiaes. Podem ser utilizados Durante a fase de desenvolvimento de uma preparao
indicadores biolgicos para monitorizar as operaes de farmacutica, verifica-se a actividade antimicrobiana prpria
rotina, como meio suplementar para avaliar a eficcia da preparao ou, se necessrio, demonstra-se que, quando
da dose de radiao escolhida, especialmente no caso de adicionada de 1 ou mais conservantes apropriados, assegura
esterilizao com electres acelerados. Recomenda-se a uma proteco adequada contra os efeitos nocivos que podem
utilizao de esporos de Bacilius pumilus (por exemplo, resultar da contaminao ou da proliferao microbiana
ATCC 27.142, NCTC 10327, NCIMB 10692 ou CIP 77.25). O durante o perodo de conservao e emprego da preparao.
nmero de esporos viveis por suporte superior a 1 107. A eficcia da actividade antimicrobiana demonstra-se atravs
O valor D superior a 1,9 kGy. Verifica-se que no existe do ensaio abaixo descrito, que no se destina ao controlo de
desenvolvimento de microrganismos indicadores aps rotina.
exposio a 25 kGy (dose mnima absorvida)
4. Esterilizao por gases. A utilizao de indicadores ENSAIO DE EFICCIA DOS CONSERVANTES
biolgicos necessria para todos os procedimentos ANTIMICROBIANOS
de esterilizao por gases, tanto na validao dos ciclos
como nas operaes de rotina. A esterilizao por gases O ensaio consiste na contaminao artificial da preparao,
correctamente utilizada para os dispositivos mdicos, se possvel no recipiente definitivo, atravs da inoculao
de microrganismos apropriados, conservando a preparao
5. Textos gerais

os isoladores, os locais, etc. A utilizao dos gases neste


contexto no faz parte das actividades da Farmacopeia. semeada a uma temperatura adequada, colhendo amostras do
A utilizao de esporos de Bacillus subtilis (por exemplo recipiente em determinados intervalos de tempo e efectuando
a variedade niger ATCC 9372, NCIMB 8058 ou CIP nelas uma contagem dos microrganismos.
77.18) recomendado para o xido de etileno. O nmero Consideram-se adequadas as propriedades conservantes
de esporos viveis por suporte superior a 5 105. da preparao quando, nas condies do ensaio e aps
Os parmetros de resistncia so conhecidos para o intervalos de tempo e temperaturas prescritos, se produzir,
procedimento utilizado: por exemplo, para o xido de conforme os casos, uma diminuio importante ou uma
etileno, o valor D superior a 2,5 min para um ciclo ausncia de aumento do nmero de microrganismos na
de ensaio envolvendo 600 mg/l de xido de etileno a preparao inoculada. Os critrios de aceitao, em termos
54C com 60 por cento de humidade relativa. Verifica-se de diminuio do nmero de microrganismos em funo do
a ausncia de desenvolvimento dos microrganismos tempo, variam para as diversas categorias de preparaes de
indicadores aps exposio durante 60 min no ciclo do acordo com o grau de proteco pretendido (ver quadros)
ensaio atrs descrito, e que a sua exposio durante Microrganismos de ensaio
15 min num ciclo com temperatura reduzida (600 mg/l,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82.118.
30C e 60 por cento de humidade relativa) deixa os
esporos revivificveis. A exposio dos indicadores a Staphylococcus aureus ATCC 6538; NCTC 10788; NCIMB 9518;
600 mg/l de xido de etileno, durante 60 min, a 54C e CIP 4.83.
sem humidificao deve deixar esporos revivificveis para Candida albicans ATCC 10231; NCPF 3 179; IP 48.72.
assegurar que o indicador biolgico capaz de revelar a
existncia de uma humidificao insuficiente. Aspergillus niger ATCC 16404; IMI 149007; IP 1431.83.

Os ensaios efectuam-se com 1 estirpe de cada vez.


Complementam-se os microrganismos especificados com
5.1.3. EFICCIA DOS CONSERVANTES estirpes ou espcies que constituem contaminantes potenciais
ANTIMICROBIANOS da preparao. Por exemplo, a Escherichia coli (ATCC 8739;
NCIMB 8545; CIP 53.126) utiliza-se em todas as preparaes
orais e a Zygosaccharomyces rouxii (NCY 381; IP 2021.92) nas
Quando as preparaes farmacuticas no possuam elas
preparaes orais com elevada concentrao de acar.
prprias propriedades conservantes adequadas, podem
adicionar-se-lhes agentes de conservao antimicrobianos,
Preparao do inculo
particularmente em preparaes aquosas, com o fim de evitar
ou limitar a proliferao microbiana que pode ocorrer nas Antes do ensaio, semeie superfcie de um meio gelosado
condies normais de conservao e de emprego e assim B (2.6.12) para bactrias ou um meio gelosado C sem
apresentar um risco de infeco para o doente e deteriorao antibiticos (2.6.12) para fungos uma cultura-me recente
da preparao, nomeadamente nos recipientes multidose. Os obtida de cada um dos microrganismos especificados. Incube
agentes de conservao antimicrobianos no so utilizados as culturas bacterianas a uma temperatura entre 30-35C,
para substituir o cumprimento das boas prticas de fabrico. durante 18-24 h, a cultura de C. albicans entre 20-25C,
durante 48 h, e a cultura de A. niger entre 20-25C, durante
A eficcia de um agente de conservao antimicrobiano 1 semana ou at obteno de uma esporulao satisfatria.
pode ser aumentada ou diminuda pelo composto activo Podem ser necessrias subculturas depois de revitalizao dos
da preparao, pela composio da preparao na qual microrganismos, at que estes atinjam um desenvolvimento
incorporado ou pelo recipiente e modo de fecho adoptado. ptimo, sendo recomendvel que se mantenha um nmero
A actividade antimicrobiana da preparao no recipiente mnimo de repicagens.
definitivo avaliada para o seu perodo de validade com Para a colheita das culturas bacterianas e de C. albicans
o objectivo de assegurar que aquela actividade no sofre utilize um lquido de suspenso estril contendo 9 g/l de
alterao durante o perodo de conservao. Estes exames cloreto de sdio R. Disperse e transfira a cultura desenvolvida
so efectuados em amostras colhidas do recipiente definitivo em superfcie para um recipiente apropriado. Junte uma
imediatamente antes do ensaio. quantidade adequada de lquido de suspenso para reduzir o

652 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas

nmero de microrganismos para cerca de 108 por mililitro. Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja
Para recolher a cultura de A. niger utilize um lquido de atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem
suspenso estril contendo 9 g/l de cloreto de sdio R e ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
0,5 g/l de polissorbato 80 R e ajuste o nmero de esporos reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.
para cerca de 108 por mililitro com a mesma soluo. Colha
imediatamente uma amostra apropriada de cada suspenso Preparaes tpicas e locais
e determine o nmero de unidades formadoras de colnias Reduo logartmica
por mililitro em cada suspenso, atravs da sementeira em 2 dias 7 dias 14 dias 28 dias
placas ou filtrao por membrana (2.6.12). Este valor serve Bactrias A 2 3 SA
para determinar o inculo e a linha de base a ser utilizada no B 3 SA
ensaio. As suspenses so usadas imediatamente. Fungos A 2 SA
B 1 SA

MTODO Os critrios A representam a eficcia que se recomenda seja


atingida. Quando justificados, se os critrios A no puderem
Para se efectuar a contagem de microrganismos viveis ser atingidos, por exemplo devido ao risco de se aumentarem
nas preparaes inoculadas, use o mesmo meio gelosado reaces indesejveis, aplicam-se os critrios B.

5. Textos gerais
que foi empregue na cultura inicial do microrganismo Preparaes orais
correspondente. Reduo logartmica
Semeie vrios recipientes da amostra com uma suspenso de 14 dias 28 dias
um dos microrganismos de ensaio de modo a que se obtenha Bactrias 3 SA
um inculo com 105 a 106 microrganismos por mililitro ou Fungos 1 SA
por grama da preparao. O volume da suspenso do inculo
no ultrapassa 1 por cento do volume do produto. Misture
cuidadosamente para assegurar uma distribuio homognea. Estes critrios representam a eficcia que se recomenda seja
atingida.
Mantenha o produto semeado a uma temperatura entre
20C e 25C, ao abrigo da luz. Colha amostras apropriadas
de cada recipiente, por exemplo 1 ml ou 1 g, no tempo 0 e 5.1.4. QUALIDADE MICROBIOLGICA
nos intervalos de tempo apropriados, consoante o tipo de DAS PREPARAES FARMACUTICAS
preparao, e calcule o nmero de microrganismos viveis
atravs da sementeira em placas ou filtrao por membrana O presente captulo publicado a ttulo de informao.
(2.6.12), assegurando que toda a actividade antimicrobiana Este captulo geral tem 2 conjuntos de critrios de aceitao
residual da preparao tenha sido eliminada pela diluio, recomendados em matria de qualidade microbiolgica. O 1.
por filtrao ou atravs da utilizao de um desactivador representa os critrios de aceitao associados aos primeiros
especfico. No caso de se utilizar o mtodo das diluies, conjuntos de ensaios dos captulos 2.6.12 e 2.6.13. Do mesmo
leva-se em linha de conta a reduo da sensibilidade na modo que nestes conjuntos de ensaios, os critrios de aceitao
deteco de pequeno nmero de microrganismos viveis. No correspondentes destinam-se a serem posteriormente
caso de se utilizar um desactivador especfico, confirma-se, substitudos pelo 2. conjunto de critrios. Adimite-se, sob
atravs de controlos apropriados, a capacidade do sistema de reserva de autorizao, a utilizao do 2. conjunto de critrios
permitir o crescimento dos microrganismos de ensaio. em vez do 1. conjunto antes de se proceder sua substituio.
Este 2. conjunto de critrios foi desenvolvido em conjunto com
O mtodo validado com o objectivo de se verificar a a Farmacopeia do Japo e a Farmacopeia dos Estados Unidos
capacidade para pr em evidncia a reduo na contagem do no mbito do processo de harmonizao internacional.
nmero de microrganismos viveis.

A. MTODO DA FARMACOPEIA EUROPEIA


CRITRIOS DE ACEITAO
O fabrico, o acondicionamento, a conservao e a distribuio
Os critrios para avaliao da actividade antimicrobiana das preparaes farmacuticas so conduzidas de modo a
apresentam-se na tabela em termos de reduo logartmica assegurar uma qualidade microbiolgica satisfatria. As
do nmero de microrganismos viveis relativamente ao valor preparaes farmacuticas satisfazem s seguintes exigncias:
obtido no inculo.
Categoria 1
Preparaes parentricas e oftlmicas
Preparaes obrigatoriamente estreis de acordo com a
Reduo logartmica monografia da forma farmacutica correspondente e outras
6h 24 h 7 dias 14 dias 28 dias preparaes rotuladas de estreis.
Bactrias A 2 3 NE
Ensaio de esterilidade (2.6.1)
B 1 3 SA
Fungos A 2 SA
Categoria 2
B 1 SA
Preparaes para aplicao local ou para administrao
SA: sem aumento nas vias respiratrias, com excepo das preparaes
NE: no encontrado obrigatoriamente estreis, e sistemas transdrmicos.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 653


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas

Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). No B. Preparaes para administrao por via oral contendo
mximo, 102 bactrias, fungos e leveduras por grama, por matrias primas de origem natural (animal, vegetal
mililitro ou por sistema transdrmico (compreendendo a ou mineral), quando impossvel um pr-tratamento
pelcula protectora e a camada de suporte). antimicrobiano e autorizada para as matrias primas uma
contaminao microbiana superior a 103 microrganismos
Enterobactrias e outras bactrias Gram-negativas (2.6.13). por grama ou por mililitro. Excluem-se os medicamentos
Dispositivos transdrmicos: ausncia de bactrias, com base em plantas descritos na categoria 4.
verificada em 1 sistema (comprendendo a pelcula
protectora e a camada de suporte). Outras preparaes: no Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12).
mximo, 10 bactrias por grama ou por mililitro. No mximo, 104 bactrias e 102 fungos e leveduras por
grama ou mililitro.
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa verificada em 1,0 g,
1 ml ou 1 sistema (comprendendo a pelcula protectora e a Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No
camada de suporte) (2.6.13). mximo, 102 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13).
Ausncia de Staphylococcus aureus verificada em 1,0 g, Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13).
1 ml ou 1 sistema (comprendendo a pelcula protectora e a Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
camada de suporte) (2.6.13).
Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml) (2.6.13).
5. Textos gerais

Categoria 3
Categoria 4
A. Preparaes para administrao por via oral ou rectal
Medicamentos com base em plantas, exclusivamente
Contagem de germes aerbios viveis totais (2.6.12). No compostos por uma ou vrias drogas vegetais (inteiras, em
mximo, 103 bactrias e 102 leveduras por grama ou por fragmentos ou em p).
mililitro.
A. Medicamentos com base em plantas que necessitam do
Ausncia de Escherichia coli (1,0 g ou 1,0 ml). uso de gua fervente.
QUADRO 1 Critrios de avaliao da qualidade microbiolgica das substncias para uso farmacutico no estreis

Via de administrao DNGA DNTF


Microrganismos especficos
(UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
Via oral: preparaes no aquosas 103 102 Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Via oral: preparaes aquosas 102 101 Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
Via rectal 103 102
Via bucal
Via gengival
Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Via cutnea 102 101
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
Via nasal
Via auricular
Via vaginal 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
Ausncia de Candida albicans (1 g ou 1 ml)
Via transdrmica (limites para um 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
sistema transdrmico, incluindo Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
pelcula protectora e suporte)
Inalao (aplicam-se as exigncias 102 101 Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
especficas para as preparaes Ausncia de Pseudomonas aeruginosa (1 g ou 1 ml)
lquidas dispensadas atravs de Ausncia de bactrias gram-negativas resistentes aos sais
nebulizadores) biliares (1 g ou 1 ml)
Disposio especial da Ph. Eur. para
as preparaes para administrao
oral contendo matrias-primas
naturais (animal, vegeta1 ou No mximo, 102 UFC de bactrias gram-negativas
mineral), quando for impossvel resistentes aos sais biliares (1 g ou 1 ml)
um pr-tratamento antimicrobiano
e quando a Autoridade competente 104 102 Ausncia de salmonelas (10 g ou 10 ml)
admite uma contaminao Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
microbiana das matrias-primas Ausncia de Staphylococcus aureus (1 g ou 1 ml)
superior a 103 microrganismos
viveis por grama ou por mililitro

Disposio especial da Ph. Eur. para


as preparaes base de plantas
exclusivamente compostas por uma
ou vrias drogas vegetais (inteiras,
em fragmentos ou em p):
medicamentos com base em 107 105 No mximo, 102 de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
plantas que necessitam de gua
fervente No mximo, 103 UFC de bactrias gram-negativas
medicamentos com base em resistentes aos sais biliares (1 g ou 1 ml)
105 104
plantas em que no intervm Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml)
gua fervente Ausncia de salmonelas (10 g ou 10 ml)

654 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.4. Qualidade microbiolgica das preparaes farmacuticas

Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). prescrito, utiliza-se um mtodo validado com um limite de
No mximo, 107 bactrias e 105 fungos e leveduras por deteco to prximo quanto possvel do critrio de aceitao.
grama ou por mililitro. Alm dos microrganismos citados no quadro 1, avalia-se a
No mximo, 102 Escherichia coli por grama ou por importncia em aceitar a presena de outros microrganismos
mililitro (2.6.13), utilizando diluies apropriadas. tendo em vista os seguintes factores:

B. Outros medicamentos com base em plantas em que no utilizao do produto: risco varivel consoante a via de
intervm a gua fervente. administrao (oftlmica, nasal, respiratria),

Contagem dos germes aerbios viveis totais (2.6.12). natureza do produto: aco sobre o crescimento
No mximo, 105 bactrias e 104 fungos e leveduras por microbiano (substrato favorvel? Propriedades
grama ou por mililitro. antimicrobianas adequadas?),
Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas. No modo de administrao,
mximo, 103 bactrias por grama ou por mililitro (2.6.13).
categoria de pacientes alvo: risco potencialmente diferente
Ausncia de Escherichia coli (1 g ou 1 ml) (2.6.13). para os lactentes, crianas jovens, pessoas fragilizadas,
Ausncia de Salmonelas (10 g ou 10 ml) (2.6.13). emprego de imunossupressores, de corticosterides,

5. Textos gerais
existncias de patologias, feridas, leses orgnicas.
B. MTODO HARMONIZADO: QUALIDADE MICROBIOLGICA Nos casos justificados, efectua-se uma avaliao dos factores
DAS PREPARAES FARMACUTICAS E DAS em causa, com respeito ao risco induzido, conduzida por
SUBSTNCIAS PARA USO FARMACUTICO NO ESTREIS
pessoal com formao especializada em anlise microbiolgica
e interpretao dos dados microbiolgicos. Nas matrias-
A presena de alguns microrganismos nas preparaes no
-primas, esta avaliao tem em conta o tratamento a que
estreis pode reduzir ou at anular a actividade teraputica
do produto e constitui um perigo potencial para a sade o produto submetido, as tcnicas actuais de controlo e a
do paciente. Os fabricantes tm, pois, a responsabilidade disponibilidade de produtos com a qualidade desejada.
de assegurar uma fraca carga microbiana nas formas Anexo: disposio especial da Farmacopeia Europeia para
farmacuticas finais atravs da implementao dos textos em os medicamentos com base em plantas exclusivamente
vigor sobre as Boas Prticas de Fabrico durante o fabrico, constitudas por um ou vrios frmacos vegetais (inteiros,
conservao e distribuio das preparaes farmacuticas. divididos ou em p):
O controlo microbiolgico dos produtos no estreis realiza- Proceda com o protocolo seguinte:
-se de acordo com os mtodos descritos na Parte B. Mtodo
harmonizado dos captulos gerais 2.6.12 e 2.6.13. O quadro 1 Preparao das amostras e pr-incubao. Prepare uma
e o quadro 2 mencionam os critrios de aceitao aplicveis amostra como se descreve no captulo geral 2.6.12, Parte B.
aos produtos farmacuticos no estreis com base na Mtodo harmonizado, utilizando uma diluio a 1/10 de,
determinao do nmero total de germes aerbios (DNTGA) pelo menos, 1 g da amostra e semeie uma quantidade
e da determinao do nmero total de fungos/leveduras apropriada (determnada como indicado em 3-4 no captulo
(DNTFL). Os critrios de aceitao baseiam-se nos resultados geral 2.6.12, Parte B. Mtodo harmonizado) de meio quido
individuais, ou na mdia dos resultados quando se efectuam de peptonas de casena e soja com as quantidades da amostra
vrias contagens, por exemplo, nas contagens em placas. correspondentes, respectivamente, a 0,1 g, 0,01 g e 0,001 g
Quando se prescreve um critrio de aceitao no que respeita (ou 0,1 ml, 0,01 ml, 0,001 ml) do produto. Misture e incube a
qualidade microbiolgica, este interpretado do seguinte 30-35C durante 18-24h.
modo: Seleco e subcultura. Agite o recipiente, transfira 1 ml de
101 UFC: nmero mximo aceitvel 20; meio lquido de peptonas de casena e soja para 100 ml de
meio lquido de MacConkey e incube a 42-44C durante
102 UFC: nmero mximo aceitvel 200;
24-48h. Repique para meio gelosado de MacConkey e incube
103 UFC: nmero mximo aceitvel 2000 e assim a 30-35C durante 18-72h.
sucessivamente.
Interpretao. O crescimento de clinas indica a provvel
O quadro 1 compreende uma lista de microrganismos presena de E. Coli, a confirmar por ensaios de identificao.
especficos para os quais se estabeleceram critrios de
aceitao. Esta lista forosamente no exaustiva e a Anote a menor quantidade de produto que d resultado
pesquisa de outros microrganismos pode ser necessria positivo e a maior quantidade de produto que d resultado
para uma determinada preparao, consoante a natureza da negativo.
matria-prima de origem e o mtodo de fabrico. Determine o nmero provvel de bactrias usando o quadro
QUADRO 2 Critrios de aceitao da qualidade microbiolgica das seguinte.
substncias para uso farmacutico no estreis
Resultados obtidos com uma quantidade de produto de Nmero provvel de
DN-GA DNTF bactrias por grama ou
0,1 g ou 0,1 ml 0,01 g ou 0,01 ml 0,001 g ou 0,001 ml mililitro de produto
(UFC/g ou UFC/ml) (UFC/g ou UFC/ml)
Substncias para 103 102 103
uso farmacutico 103 e 102
102 e 10
Se se demonstrou que nenhuma das pesquisas prescritas
permite uma contagem vlida dos microrganismos no nvel 10

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 655


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

5.1.5. APLICAO DO CONCEITO F0 1. INTRODUO GERAL


ESTERILIZAO PELO VAPOR DAS O objectivo deste captulo facilitar a implementao
PREPARAES AQUOSAS e utilizao de mtodos alternativos no controlo
microbiolgico quando estes conduzem a melhores
Esta seco publicada a ttulo de informao. custos e aumentam a garantia da qualidade dos produtos
farmacuticos. Estes mtodos alternativos podem tambm
encontrar aplicaes na vigilncia do ambiente.
O valor F0 associado a um processo de esterilizao pelo
vapor saturado exprime a sua letalidade, em termos de tempo Os mtodos microbiolgicos descritos na Farmacopeia
(em minutos) de exposio temperatura de 121C que seria Portuguesa vm sendo utilizados h quase um sculo e os
necessrio para obter o mesmo resultado que com o processo mtodos de contagem e identificao dos microrganismos
utilizado, aplicado ao produto na sua embalagem final, em prestam ainda grandes servios aos microbiologistas. Durante
relao aos microrganismos que possuem um valor de Z de 10. todos estes anos constituram um instrumento precioso
para controlar os produtos farmacuticos e para assegurar
O valor F0 total de um processo tem em conta as fases de
a sua segurana microbiolgica. No entanto, os mtodos
aquecimento e de arrefecimento do ciclo e pode ser calculado
microbiolgicos convencionais so lentos e os resultados s
por integrao relativamente aos tempos das taxas de
esto disponveis aps um perodo de incubao que pode
letalidade associados a intervalos de temperatura pouco
5. Textos gerais

ir at 14 dias. Os resultados dos controlos microbiolgicos


pronunciados.
convencionais raramente permitem uma correco antecipada.
Quando um ciclo de esterilizao pelo vapor escolhido na
Durante os ltimos anos surgiram mtodos alternativos
base do conceito F0, confirmado que ele permite obter, de
para o controlo da qualidade microbiolgica e alguns
modo constante, uma adequada segurana de esterilidade.
destes mtodos so capazes de disponibilizar resultados
Para validar o processo, pode igualmente ser necessrio em tempo real (ou quase real) com a possibilidade de uma
efectuar um acompanhamento microbiolgico contnuo e aco correctiva mais precoce. Estes novos mtodos trazem
rigoroso durante a produo de rotina para demonstrar que igualmente uma melhoria significativa da qualidade dos
os parmetros microbiolgicos se mantm compreendidos controlos.
dentro das tolerncias estabelecidas para obter um NSE de,
Neste captulo informativo descrevem-se os mtodos
pelo menos, 10 6.
microbiolgicos que tm aplicaes farmacuticas. Para
Na esterilizao pelo vapor, Z caracteriza a resistncia de um cada mtodo descreve-se o princpio bsico, discutem-se
microrganismo s variaes de temperatura. Define-se como os benefcios e as desvantagens, depois apresentam-se as
a variao de temperatura necessria para modificar o valor potenciais utilizaes, quer dizer, as aplicaes efectivas que
D de um factor de 10. podem ser encaradas tendo em vista o princpio em que o
mtodo se baseia. Finalmente, incluem-se as consideraes
D o valor de um parmetro de esterilizao (durao ou
gerais para a validao destes mtodos, ilustrada com
dose absorvida) necessrio para reduzir at 10 por cento do
exemplos especficos para cada tipo de mtodo. A ttulo
valor inicial o nmero de micorganismos viveis. D s tem
informativo, descreve-se, no final do captulo, um protocolo
significado em condies experimentais bem definidas.
detalhado de validao.
Entre estes diferentes parmetros existem as seguintes
Este captulo no tem objectivo de recomendar um ou
relaes matemticas:
outro mtodo, nem de fornecer uma lista exclusiva ou
exaustiva de mtodos alternativos que podem ser utilizados
no controlo farmacutico. O seu contedo apenas
informativo mas pode servir de guia no s na escolha de
um mtodo microbiolgico alternativo, como complemento
ou substituio da abordagem dos mtodos microbiolgicos
convencionais, mas tambm para se proceder validao
do mtodo escolhido. Nesta rea em evoluo constante e
rpida, so sempre susceptveis de aparecerem novos mtodos
e as indicaes que se mencionam neste captulo podem ser
tambm aplicveis a estes mtodos.
Existem 3 grandes tipos de determinaes especficas em
matria de controlos microbiolgicos. Estes incluem:
ensaios qualitativos de presena/ausncia de
microrganismos,
ensaios quantitativos de contagem de microrganismos,
ensaios de identificao.

5.1.6. MTODOS ALTERNATIVOS 1-1. ENSAIOS QUALITATIVOS DE PRESENA/AUSNCIA DE


MICRORGANISMOS
PARA O CONTROLO DA QUALIDADE
MICROBIOLGICA Nas anlises microbiolgicas convencionais, os ensaios deste
tipo utilizam tipicamente a turvao ou outra alterao
O captulo seguinte publicado a ttulo informativo. relacionada no meio de cultura como evidncia da presena

656 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

de microrganismos viveis na amostra. O exemplo mais produtos farmacuticos, a deteco pode levar 24 h ou mais,
comum o ensaio de esterilidade. Outros exemplos deste tipo sobretudo no caso de fungos e leveduras. Pode conseguir-
so os ensaios que visam determinar a presena/ausncia na -se um aumento da sensibilidade procedendo filtrao do
amostra de um tipo particular de microrganismos. produto. Neste caso, a membrana filtrante incubada no
meio e os resultados so expressos em termos de presena/
/ausncia na quantidade de produto correspondente ao volume
1-2. ENSAIOS QUANTITATIVOS DE CONTAGEM DE filtrado. Estes sistemas, devido ao facto de utilizarem uma
MICRORGANISMOS etapa de incubao em meio lquido, no do informaes
quantitativas e permitem apenas estabelecer uma presena/
A filtrao por membrana e a contagem em placa so os /ausncia na quantidade de produto analisado. A anlise
mtodos convencionais utilizados para estimar o nmero de de diferentes quantidades da amostra podem permitir uma
microrganismos viveis presentes numa amostra. O ensaio determinao semi-quantitativa (ensaio limite). A principal
denominado de nmero mais provvel (NMP) constitui vantagem destes mtodos, comparando com os mtodos
outro exemplo deste tipo de mtodos. Foi desenvolvido para clssicos, reside muitas vezes na sua capacidade de permitir
se estimar o nmero de microrganismos viveis presentes um tratamento simultneo de um grande nmero de
na amostra quando esta no apropriada para a contagem amostras e potencialmente a obteno de resultados num
directa em placa. intervalo de tempo mais curto.

5. Textos gerais
1-3. ENSAIOS DE IDENTIFICAO 2-1-1-2. Mtodos electroqumicos
Princpio. A multiplicao e a actividade metablica dos
A caracterizao bioqumica e morfolgica de um microrganismos num meio de cultura apropriado conduzem
microrganismo desconhecido constitui o mtodo clssico produo de metabolitos inicos com cargas elevadas a
de identificao utilizado nos ensaios da Farmacopeia. partir dos nutrientes orgnicos com cargas fracas, induzindo
Os mtodos desenvolvidos recentemente permitiram assim uma modificao das propriedades elctricas do meio.
racionalizar e automatizar alguns aspectos desta Estas modificaes da impedncia (medidas pela condutncia
identificao, nomeadamente no que respeita ao tratamento, e/ou capacitncia) so monitorizadas por meio de elctrodos
anlise e armazenamento dos dados. Vrias novas integrados nos recipientes de cultura e em contacto com o
abordagens foram integradas neste mtodos, como algumas
meio. O ponto final da medio o tempo necessrio para
reaces bioqumicas, utilizao de substratos de carbono,
se detectar uma variao pr-determinada da impedncia. O
caracterizao da composio em cidos gordos, perfil das
tempo de deteco inversamente proporcional ao tamanho
bandas com endonucleases de restrio e anlise da sequncia
do inculo inicial. Para os fungos e leveduras que apenas
16S do ADNr.
produzem pequenas variaes da impedncia, recorre-
-se geralmente a uma medio indirecta da condutncia
2. PRINCPIOS GERAIS DOS MTODOS ALTERNATIVOS utilizando um reservatrio de hidrxido de potssio. A
medio directa da capacitncia pode tambm ser possvel.
Os mtodos microbiolgicos alternativos recorrem a tcnicas Aspectos crticos. Deteco automatizada com dados gerados
directas ou indirectas de deteco; em alguns casos, obtm-se electronicamente, grficos das variaes da impedncia
a amplificao do sinal por mtodos de enriquecimento. Para reflectindo a curva de crescimento dos microrganismos e
ter em conta estas diferenas e por razes de comodidade reduo at 48 h da durao do ensaio.
na apresentao deste captulo, dividem-se os mtodos
alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica em Potenciais utilizaes. Doseamento microbiolgico de
3 categorias: antibiticos, eficcia dos conservantes antimicrobianos,
presena/ausncia na quantidade da amostra analisada quando
mtodos com base no crescimento, em que geralmente efectuada a contagem do total de microrganismos viveis.
se obtm um sinal detectvel no final de um perodo de
subcultura,
2-1-1-3. Medio do consumo ou da produo de um gs.
medio directa, com diferenciao e visualizao das
clulas individuais, Princpio. Os microrganismos em fase de multiplicao e de
metabolismo activos, utilizam meios de cultura apropriados,
anlise dos componentes celulares, com medio produzindo por seu lado metabolitos ou induzindo a
indirecta da presena microbiana atravs da expresso de eliminao de nutrientes especficos. Uma das abordagens
componentes celulares especficos. possveis consiste em verificar as modificaes da composio
Estas distines podem em algumas casos ser artificiais, mas dos gases no espao superior dos recipientes de cultura
possibilitam que se crie uma classificao. fechados, com transdutores de presso que reagem produo
de um gs (CO2, por exemplo) ou ao consumo de um gs
(O2, por exemplo). Podem tambm ser utilizados outros
2-1. MTODOS COM BASE NO CRESCIMENTO indicadores, nomeadamente a deteco colorimtrica do CO2.
Aspectos crticos. Nos microrganismos de crescimento
2-1-1. Deteco precoce do crescimento lento, como as micobactrias, este mtodo permite uma
2-1-1-1. Aspectos crticos gerais dos mtodos com base na deteco mais rpida. No existe relao directa entre a
deteco precoce do crescimento carga microbiolgica inicial e o ponto final de deteco. A
temperatura de incubao e o algoritmo de tratamento dos
Estes mtodos esto criticamente dependentes do dados influenciam muito os resultados.
crescimento bacteriano para se conseguir um nmero
detectvel de microrganismos. Nos casos tpicos de baixos Potenciais utilizaes. Produtos nos quais podem estar
nveis de contaminao microbiana que caracterizam os presentes microrganismos de crescimento lento.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 657


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

2-1-1-4. Bioluminiscncia -se a produo de calor introduzindo a amostra contaminada


numa ampola selada contendo meio de cultura que se coloca
Princpio. O trifosfato de adenosina (ATP) um marcador
num calormetro. A utilizao de aparelhos sensveis permite
de viabilidade celular muito conhecido. O mtodo de
traar curvas de crescimento. A calorimetria de fluxo permite
bioluminiscncia consiste em provocar a libertao de ATP
detectar importantes cargas microbiolgicas.
pelos microrganismos por meio de um agente de extraco
apropriado e depois efectuar um doseamento quantitativo Aspectos crticos. Teoricamente este mtodo no requer
com um sistema enzimtico luciferina/luciferase que emite crescimento mas apenas actividade catablica. Contudo,
uma luz de intensidade proporcional quantidade do ATP necessrio um nmero mnimo de microrganismos para
presente. A luz emitida medida com um bioluminmetro gerar medies trmicas superiores linha de base que
e expressa em unidades de luz relativa (ULR) no caso da geralmente se obtm utilizando um meio de enriquecimento.
bioluminiscncia em meio lquido. O valor de ULR obtido
para uma amostra comparado com um valor limite de Potenciais utilizaes. Eficcia da conservao antimicrobiana.
ULR do meio de cultura ou da suspenso da amostra,
determinado 2 ou 3 vezes. O resultado positivo se a 2-1-1-6. Turbidimetria
ULR obtida na amostra for superior a este limite. Este
Princpio. O crescimento microbiano conduz a modificaes
mtodo comporta uma variante que consiste em reter os
microrganismos numa membrana, depois cultiv-los atravs detectveis da opacidade dos meios que possvel quantificar
com exactido atravs da medio da densidade ptica a um
5. Textos gerais

da incubao em gelose, sendo as microcolnias formadas


detectadas com uma cmara com um detector de carga comprimento de onda especfico. Na sua forma mais simples,
acoplado (CCD) e os resultados expressos em estas medies so efectuadas com um espectrofotmetro
micro-UFC. Este mtodo quantitativo, mas com um padro, geralmente numa gama de comprimentos de onda
intervalo de linearidade estreito. de 420-615 nm. Existem tambm sistemas automatizados
com leitores de microplacas que continuamente emitem as
Aspectos crticos. Se o produto de onde provm a amostra leituras e permitem uma deteco precoce das modificaes
apresenta um elevado nvel de contaminao bacteriana (na de densidade ptica.
ordem de 500-1000 UFC por quantidade da amostra examinada),
a deteco rpida (1 h). Se o nvel de contaminao for baixo Aspectos crticos. Foram feitas tentativas para deduzir por
(menos de 100 UFC por quantidade da amostra examinada), extrapolao a carga microbiolgica inicial a partir do tempo
necessrio amplificar o nmero de microrganismos atravs da de deteco, mas elas limitam-se aos microrganismos sos
incubao no meio de cultura (lquido ou gelosado) durante que apresentam caractersticas de crescimento reprodutveis.
12-48 h consoante o mtodo utilizado. Aps este perodo de O mtodo no permite diferenciar microrganismos viveis e
incubao, uma nica clula capaz de crescer, ser multiplicada no viveis.
por 1000 e poder ser detectada. A produo de ATP varivel Potenciais utilizaes. Determinao do tamanho dos
de um microrganismo a outro contendo as bactrias 1-10 fg e os inculos de suspenses bacterianas a utilizar nos ensaios
germes fngicos cerca de 100 fg por clula, existindo numerosos farmacuticos a partir de curvas de calibrao. No
outros factores que podem afectar o teor em ATP na clula: modo automatizado, determinao da sensibilidade aos
espcie, fase de crescimento, estado nutricional, stress ou idade
conservantes por parte dos microrganismos de referncia
da clula. No , pois, possvel obter uma contagem directa a
isolados dos produtos formulados.
partir do valor de ULR. Por outro lado a turvao e a colorao
da amostra podem afectar a reaco, quer amplificando (devido
ao aumento do sinal luminoso emitido), quer atenuando 2-1-1-7. Mtodos com base em fagos
(devido a uma diminuio do sinal de luz emitido). Por razes Princpio. Os vrus bacterianos (bacterifagos ou fagos)
devidas natureza enzimtica, a reaco tambm sensvel podem infectar clulas hospedeiras e provocar a sua lise ou a
interferncia de produtos susceptveis de inibir ou de reduzir incorporao do seu material gentico e expresso de novas
a actividade enzimtica. Na prtica, este tipo de interferncia protenas. A sua elevada especificidade para o hospedeiro
rara, devendo contudo ser objecto de um estudo aprofundado pode ser aproveitada nos mtodos de deteco que utilizam
na altura da validao. A reaco tambm sensvel presena como ponto final as consequncias da infeco. Os pontos
de outros nucleotidos fosfatados como o ADP ou o GTP,
finais deste tipo de mtodos so, por exemplo, a formao
que interferem produzindo o ATP na presena da adenilato
de uma placa num tapete slido de bactrias, a deteco dos
quinase. Esta enzima utilizada para melhorar a sensibilidade
contedos intracelulares libertados pelas bactrias lisadas
de alguns mtodos de bioluminiscncia: adiciona-se neste
(eventualmente por colorimetria) ou a observao dos efeitos
caso um terceiro reagente contendo o ADP e produzido ATP
de origem fgica como a enucleao de cristais de gelo ou a
suplementar em presena da adenilato quinase libertada pelos
bioluminiscncia aps infeco por um fago geneticamente
microrganismos.
modificado. Colifagos acoplados a um marcador fluorescente
Potenciais utilizaes. Eficcia da conservao podem ser utilizados para a deteco selectiva de E. Coli
antimicrobiana, presena/ausncia de microrganismos na vivel em combinao como mtodo DEFT (ver 2-2-3.).
quantidade da amostra analisada quando da contagem do
total de germes aerbios viveis (bioluminiscncia em tubo Aspectos crticos. A deteco com fagos pode ser utilizada
ou em microplaca), contagem do total de germes aerbios tanto para culturas homogneas como para culturas mistas,
viveis (bioluminiscncia em membrana), vigilncia do onde a especificidade para o hospedeiro permite a deteco
ambiente e da qualidade da gua. O mtodo aplicvel aos e a identificao. Para ser detectvel, o ponto final requer
produtos filtrveis ou no filtrveis. muitas vezes a presena de um nmero mnimo de clulas
alvo que assegurem a obteno de sinal mensurvel o que
implica um enriquecimento em situaes de baixa carga
2-1-1-5. Microcalorimetria microbiolgica. O processo de infeco vrica pode ser
Princpio. O catabolismo microbiano gera calor que pode ser afectado pela composio da amostra. Na maior parte dos
medido com exactido por microcalorimetria. Pode detectar- casos, a elevada especificidade para o hospedeiro torna

658 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

difcil a deteco de um espectro largo de contaminantes diferenciao de microrganismos viveis e de partculas


microbianos. auto-fluorescentes. A grande sensibilidade e a rapidez
do mtodo permitem a deteco dos contaminantes
Potenciais utilizaes. Mtodos sobretudo utilizados no
microbianos em tempo quase real. Pode obter-se o nmero
domnio da investigao, com alguns desenvolvimentos
total de clulas utilizando um corante com fluorescncia
comerciais focando principalmente a microbiologia clnica
permanente.
e alimentar. Estes mtodos so susceptveis de ser utilizados
para determinar a presena/ausncia de microrganismos Aspectos crticos. O mtodo torna possvel a deteco
especficos. de microrganismos viveis, metabolicamente activos,
dificilmente cultivveis ou no cultivveis. Este facto pode
2-1-2. Desenvolvimento de meios destinados a melhorar a tornar necessrio um reajuste nos limites de contaminao
deteco microbiana estabelecidos para as amostras em anlise.
A deteco de esporos exige que a germinao se tenha
Princpio. H muitos anos que existem meios de cultura que iniciado.
so objecto de constantes melhorias. Inovao recente neste
domnio so os substratos cromognicos que so cada vez mais possvel a deteco de clulas individuais, mas a sua
utilizados em microbiologia clnica e alimentar. A propriedade identificao no faz parte actualmente do protocolo do
de detectar enzimas especficas atravs de substratos ensaio de rotina. A utilizao de anticorpos fluorescentes
pode abrir caminho para a deteco selectiva. A presena de

5. Textos gerais
apropriados levou ao desenvolvimento de um grande nmero
de mtodos com o objectivo de identificar os microrganismos partculas auto-fluorescentes, por vezes difceis de distinguir
dos microrganismos, pode originar falsos positivos.
por meio de tcnicas manuais ou automatizadas. A
incorporao destes substratos num meio de isolamento Potenciais utilizaes. Mtodo rpido e sensvel para
primrio, selectivo ou no selectivo, evita ter de se proceder a avaliao no especfica da carga microbiana. A citometria de
subculturas e testes bioqumicos posteriores para identificar fase slida tem aplicaes na rea do controlo das guas de
alguns microrganismos. Os meios de cultura cromognicos grau farmacutico.
lquidos ou slidos visam estimular actividades enzimticas
especficas que permitam a deteco e a diferenciao de 2-2-2. Citometria de fluxo
microrganismos. A formulao destes meios particulares
comporta substratos definidos que so hidrolisados por uma Princpio. Os microrganismos em suspenso marcados com
enzima celular especfica produzida por uma determinada fluorforos, so detectados quando so passados por um
bactria quando do seu crescimento. Estes substratos so citmetro de fluxo. A utilizao de um substrato com um
escolhidos em funo da actividade enzimtica de diagnstico fluorforo indicador de viabilidade permite diferenciar os
pesquisada e so associados a indicadores corados. microrganismos viveis das partculas no viveis (ver 2-2-1.).
Aspectos crticos. A utilizao de meios inovadores traz vrias Aspectos crticos. A citometria de fluxo aplica-se anlise
vantagens: melhor diferenciao das colnias numa cultura microbiolgica dos produtos filtrveis e no filtrveis.
mista, facilidade de emprego e de interpretao, tempo de Permite a deteco em tempo quase real mas no to
resposta mais curto dada a simultaneidade do crescimento e sensvel como a citometria de fase slida. Para se obter a
da identificao dos microrganismos. Exige, contudo, uma sensibilidade necessria no campo farmacutico, muitas
rigorosa validao dos meios para assegurar que so no s vezes necessrio introduzir uma etapa de incubao em meio
especficos, como selectivos e robustos. A qualidade do sinal de cultura, o que transforma este mtodo num mtodo com
no se fundamenta apenas na escolha das enzimas utilizadas base no crescimento. Podem ser necessrias diluies em
para a deteco porque as enzimas podem estar presentes em srie para optimizar o desempenho da anlise das amostras
gneros diferentes, mas tambm em algumas caractersticas no filtrveis e o tamanho das partculas pode ter uma
fsico-qumicas do meio, como o pH. influncia significativa neste desempenho. Com excepo
da filtrabilidade, aplicam-se a este mtodo as mesmas
Potenciais utilizaes. Deteco de microrganismos consideraes da citometria de fase slida. A aglomerao das
especficos como o E. coli, coliformes, salmonelas, bactrias pode ser um problema (por exemplo o S. aureus).
estafilococos e estreptococos. Grande utilidade nos ensaios
de controlo da presena/ausncia. Deteco de leveduras Potenciais utilizaes. Ao contrrio da citometria de
tambm possvel com meios de cultura cromognicos. fase slida, possibilidade de deteco e contagem dos
microrganismos nos produtos que contm quantidades
significativas de partculas. Se for necessria uma etapa de
2-2. LEITURAS DIRECTAS incubao, o mtodo torna-se qualitativo.

2-2-1. Citometria de fase slida 2-2-3. Tcnica de filtrao e epifluorescncia directa (DEFT)
Princpio. Utiliza-se um filtro de membrana para reter os Princpio. Este mtodo pode ser considerado como o
contaminantes microbianos que so corados atravs da percursor da citometria de fase slida. Os microrganismos
marcao com um fluorforo (indicador de viabilidade) concentrados atravs da filtrao da amostra so corados com
antes ou aps filtrao. O fluorforo um substrato um reagente fluorescente (antes pelo laranja de acridina, mas
conjugado inicialmente no fluorognico que necessita agora mais frequentemente pelo 4,6-diamidino-2-
uma actividade enzimtica intracelular para a sua clivagem -fenilindol ou DAPI), e podem ser detectados com iluminao
e libertao da entidade fluorescente. A membrana celular epifluorescente. As tcnicas de colorao vital com
deve estar intacta para assegurar a reteno do fluorforo fluorescncia utilizadas em citometria de fase slida (ver
no seio do citoplasma. Opera-se depois a deteco atravs 2-2-1.) so transpostas para a DEFT e corantes fluorescentes
de excitao laser e varrimento automtico que permite a redox como o cloreto de 5-ciano-2,3-ditoliltetrazlio (CTC)
visualizao individual dos microrganismos fluorescentes podem ser utilizados para pr em evidncia clulas com
viveis. Aplicaes informticas apropriadas permitem a actividade respiratria. Acoplada a um microscpio, a DEFT

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 659


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

permite a rpida deteco de microrganismos, dependendo os isolados sejam cultivados em meios e em condies de
a sensibilidade absoluta do volume do produto filtrado e do incubao normalizados. A cromatografia em fase gasosa
nmero de campos examinados. A utilizao de sistemas deve tambm ser efectuada em condies de trabalho
autofocalizantes semiautomatizados acoplados anlise de normalizadas, com anlise frequente de preparaes padro e
imagens melhorou a utilidade deste mtodo. Uma variante de isolados conhecidos.
deste mtodo utiliza uma tcnica de amostragem com uma
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
pelcula adesiva para colher clulas das superfcies sendo
flora no ambiente ou num produto, para marcao dos
a colorao efectuada depois na pelcula que examinada contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
directamente com microscpio com epifluorescncia.
Aspectos crticos. A distribuio dos microrganismos sobre 2-3-1-3. Espectroscopia de infravermelho com transformada
a membrana influencia a robustez do mtodo. A intensidade de Fourier (FTIR)
da fluorescncia pode ser afectada pelo procedimento
de colorao e estado metablico dos microrganismos. Princpio. O espectro de infravermelho com transformada de
Uma curta fase de cultura superfcie do filtro antes da Fourier dos microrganismos inteiros, d um perfil estvel,
colorao permite a formao de microcolnias. Estas coram identificvel e caracterstico de cada grupo taxonmico.
rapidamente, podem ser facilmente contadas e comprovam a Os aparelhos disponveis no mercado asseguram a anlise
viabilidade. Novos desenvolvimentos utilizando a hibridao do perfil FTIR. Cultiva-se o isolado num meio padro que
depois colhido. Aps transferncia da massa celular para
5. Textos gerais

in situ com fluorescncia (FISH), que resultam da interaco


complementar de uma sonda oligonucleotdica acoplada a um suporte, o registo do espectro e clculo da transformada
um marcador de fluorescncia e de uma sequncia especfica de Fourier, o perfil obtido comparado ao perfil de isolados
conhecidos que constam de uma base de dados para pesquisa
de ARNr, abrem caminho para uma deteco selectiva.
de concordncia e de uma eventual identificao.
Potenciais utilizaes. Utilizao geralmente limitada a
Aspectos crticos. A utilizao de perfis FTIR para a
fluidos com fraca viscosidade, embora uma pr-diluio ou
identificao de microrganismos requer um elevado nvel
pr-filtrao seja por vezes efectuada em produtos viscosos
de normalizao. Para a anlise de um perfil FTIR, crucial
ou particulares. D bons resultados no controlo das cargas
que os isolados sejam cultivados em meios e em condies
microbiolgicas dos produtos farmacuticos aquosos.
de incubao normalizadas. Todas as clulas devem estar na
mesma fase de crescimento na altura da anlise. Deve dar-se
2-3. ANLISE DE COMPONENTES CELULARES uma ateno particular validao.
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
2-3-1. Fentipo flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos
2-3-1-1. Mtodos imunolgicos contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.

Princpio. Reaces do tipo antignio-anticorpo podem ser 2-3-1-4. Espectrometria de massa


utilizadas para detectar determinantes celulares nicos
de microrganismos especficos. Para a evidncia destas Princpio. O aquecimento a presso reduzida dos isolados
reaces podem intervir a hemaglutinao, a colorimetria bacterianos provoca a libertao de produtos de
ou a fluorimetria, permitindo uma deteco tanto qualitativa decomposio gasosa que podem ser analisados por
como quantitativa. A imunoadsoro com enzima conjugada espectrometria de massa e do espectros de massa
(ELISA) oferece metodologias simples de fase slida. caractersticos. Do mesmo modo, as clulas microbianas
intactas, quando submetidas a uma ionizao intensa num
Aspectos crticos. A deteco por mtodos imunolgicos sistema de espectrometria de massa com ionizao por
depende da expresso unvoca de determinantes celulares dessoro laser com anlise de tempo de voo (MALDI-TOF),
nicos. Estes mtodos no demonstram necessariamente a apresentam um perfil distintivo da espcie carregada. Estes
presena de microrganismos viveis. espectros podem ser comparados aos dos perfis conhecidos
Potenciais utilizaes. Deteco e identificao de como forma rpida de identificao.
microrganismos especficos. Aspectos crticos. A anlise dos isolados necessita uma prvia
fase de cultura.
2-3-1-2. Perfil da composio em cidos gordos Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da
Princpio. A composio em cidos gordos dos flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos
microrganismos estvel, bem conservada e apresenta um contaminantes ou deteco de microrganismos especficos.
grau de homogeneidade elevada no seio dos diferentes grupos
taxonmicos. Cultiva-se o isolado num meio padro que 2-3-1-5. Doseamentos bioqumicos baseados nas reaces
depois colhido. Aps saponificao, metilao e extraco fisiolgicas
dos cidos gordos, efectua-se por cromatografia em fase
gasosa a identificao e a quantificao dos steres metlicos Princpio. Geralmente o doseamento precedido por uma
resultantes. A composio em cidos gordos do isolado colorao de Gram ou um outro teste de diferenciao
desconhecido comparada ao perfil de isolados conhecidos precoce que permita escolher o protocolo de ensaio
que constam de uma base de dados para pesquisa de apropriado. As suspenses de clulas microbianas so
concordncia e de uma eventual identificao. examinadas com equipamentos de identificao que utilizam
uma propriedade bioqumica particular do microrganismo,
Aspectos crticos. A utilizao do perfil de composio em como a utilizao de fontes de carbono especficas. Efectua-
cidos gordos na identificao de microrganismos requer um -se a identificao da cultura comparando o perfil da reaco
elevado nvel de normalizao. Para a anlise da composio bioqumica com uma base de dados. Estes mtodos so postos
em cidos gordos das clulas microbianas, crucial que em prtica manualmente ou com aparelhos automatizados.

660 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

Aspectos crticos. necessrio dispor de uma colnia pura que microrganismos mortos tambm conterem ADN. O ARNm
no tenha mais de 3 dias. A implementao do sistema no rapidamente degradado aps a morte das bactrias
tem dificuldade, mas a interpretao dos resultados pode ser considerado o melhor marcador de viabilidade.
subjectiva. Consoante o sistema utilizado e os microrganismos
Aspectos crticos da RT-PCR. A RT-PCR baseia-se na sntese
estudados, a obteno dos resultados pode ser rpida.
de ADNc a partir de uma matriz de ARN, efectuada com uma
Potenciais utilizaes. Identificao ou caracterizao da transcriptase inversa. Uma parte especfica do ADNc depois
flora no ambiente ou num produto, para a traabilidade dos amplificada pela PCR. A eficcia da sntese do ADNc varia de
contaminantes ou deteco de microrganismos especficos. acordo com a qualidade do procedimento de isolamento do
ARN. A RT-PCR pode ser utilizada para a deteco especfica de
2-3-2. Gentipo ARN se a contaminao de amostras de ARN por ADN for fraca.
2-3-2-1. Tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos Aspectos crticos das tcnicas de amplificao do ARN. Estas
tcnicas provaram ser muito teis na deteco especfica
Princpio geral. As tcnicas de amplificao baseiam-se na (quantitativa) de ARN. No entanto, podem ser difceis de
repetio da reaco de polimerizao do ADN segundo implementar como rotina.
processo chamado de polimerizao em cadeia (PCR), que
conduz a um aumento exponencial do teor de um fragmento Aspectos crticos da deteco (semi)quantitativa (PCR em
especfico do cido nucleico considerado. Este processo cclico, tempo real). Os mtodos clssicos da PCR fundamentam-

5. Textos gerais
termfilo, consiste em amplificar um fragmento especfico -se numa deteco no ponto final. A anlise dos fragmentos
de ADN utilizando iniciadores oligonucleotdicos (ver 2.6.21). geralmente efectuada com geles de agarose e com
O ARN pode tambm ser amplificado atravs da PCR aps marcadores de tamanho especficos. Contudo, no existe
transcrio em ADNc com uma transcriptase inversa, mtodo correlao entre a quantidade do produto de amplificao
chamado de PCR com transcriptase inversa (RTPCR). Outros obtido no final da reaco e a quantidade inicial da
mtodos especficos para o ARN, como as tcnicas com base molcula alvo. Em contrapartida, a quantidade do produto
na amplificao de sequncias de cido nucleico (NASBA) de amplificao detectado no incio da fase exponencial da
ou amplificao mediada por transcrio (TMA), permitem reaco apresenta uma boa correlao com a quantidade
amplificar cpias mltiplas anti-sentido do ARN alvo. Os inicial do cido nucleico a amplificar. Desenvolveram-se
fragmentos de cido nucleico amplificados podem ser analisados tcnicas modernas da PCR em tempo real, para medir esta
por vrios mtodos: anlise do tamanho dos fragmentos, fase exponencial da reaco. Uma sonda marcada especfica
anlise de uma sequncia especfica, repetio da amplificao permite detectar em tempo real o produto de amplificao
com um segundo par de iniciadores, ou deteco especfica formado e obter-se assim uma visualizao directa da
por hibridao com uma sonda associada a um marcador fase exponencial da reaco da PCR. Uma quantificao
fluorescente. Consoante o mtodo de anlise escolhido, a tcnica da molcula ento possvel por comparao com os
de amplificao pode ser qualitativa, semi-quantitativa ou grficos de amplificao obtidos com uma srie de diluies
quantitativa. Para as aplicaes de identificao/caracterizao, de referncia. Esto disponveis no mercado sistemas
pode recorrer-se a uma sequenciao de regies especficas do automatizados da PCR em tempo real. Uma outra vantagem
genoma (16S ou 23S dos ARNr alvo). desta tcnica a de reduzir o risco de contaminao cruzada,
pois os produtos de amplificao so detectados atravs de
Aspectos crticos gerais. As tcnicas de amplificao dos
leitura laser em tubos fechados. Contudo, criar preparaes
cidos nucleicos tm numerosas vantagens em relao aos
de referncia uma operao difcil.
mtodos clssicos de deteco dos microrganismos:
so altamente especficas, na condio de os iniciadores Aspectos crticos da amplificao dos genes que codificam
escolhidos serem especficos de um microrganismo ou as regies 16S ou 23S do ARNr. Uma das mais poderosas
grupo particular de microrganismos, aplicaes da PCR a amplificao e posterior sequenciao
das regies especficas do ADN que codificam as regies
os procedimentos so rpidos e permitem ultrapassar o 16S ou 23S do ARNr. A anlise destas sequncias especficas
problema que se levanta com uma incubao prolongada, permite na maior parte dos casos a identificao de um
a sua grande sensibilidade permite teoricamente a deteco microrganismo at ao nvel da espcie. A seleco de
e amplificao de um fragmento nico do cido nucleico na iniciadores universais apropriados ou mesmo de pares
mistura reagente. de iniciadores especficos da espcie a partir de bases de
dados internacionais permite uma elevada especificidade
Contudo, existem numerosas restries prticas sua na amplificao dos fragmentos. A sistemtica moderna
utilizao: fundamenta-se na anlise comparativa das sequncias.
a sensibilidade e a eficcia atingidas so influenciadas pela Potenciais utilizaes. Devido sua elevada especificidade, as
concentrao dos fragmentos alvo na amostra, tcnicas de amplificao adaptam-se bem s identificaes.
a presena de inibidores do processo enzimtico conduzem Permitem a deteco de microrganismos especficos ou de
a reaces falsamente negativas, alguns grupos de microrganismos como os micoplasmas.
Para a contagem, necessrio recorrer PCR quantitativa
o pequeno volume inicial da amostra analisada, (em tempo real).
devido contaminao cruzada com fragmentos
anteriormente amplificados, a sensibilidade dos 2-3-2-2. Impresso gentica
procedimentos conduz a reaces falsamente positivas.
Princpio. Este mtodo permite caracterizar e identificar
Consoante os objectivos da anlise, necessrio optar pela os microrganismos utilizando fragmentos de restrio dos
amplificao do ARN ou ADN alvos. A escolha do alvo cidos nucleicos a partir de genomas bacterianos ou fngicos.
afecta a correlao com a viabilidade. A utilizao do ADN Aps lise das clulas de uma colnia pura extrai-se o ADN
como marcador tem um inconveniente pelo facto de os do lisado e fragmenta-se com uma enzima de restrio.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 661


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

Separam-se os fragmentos de ADN, em funo do tamanho, Alguns mtodos alternativos fundamentam-se na utilizao
por electroforese, que se visualizam e comparam aos de bases de dados. Para a validao, necessrio ter em
perfis de isolados microbianos conhecidos. A impresso conta o carcter mais ou menos completo da base de dados
gentica constitui um marcador estvel que permite uma relativamente gama de microrganismos considerada.
diferenciao absoluta das espcies ou at mesmo uma
caracterizao abaixo do nvel da espcie. A ribotipagem A validade de qualquer mtodo novo ou modificado deve
um exemplo tpico desta tcnica. H tambm mtodos de ser demonstrada atravs de um ensaio comparativo entre o
impresso com base na PCR, com iniciadores que se ligam mtodo oficial e o mtodo alternativo. Esta comparao deve
a vrios locais do genoma bacteriano que criam produtos ser efectuada com base em parmetros definidos na presente
amplificados que apresentam uma distribuio de tamanho seco.
caracterstica.
Aspectos crticos. necessrio dispor de uma colnia pura, 3-1. DIVERSOS TIPOS DE ENSAIOS MICROBIOLGICOS
mas sem se proceder a uma etapa de cultura preliminar.
As condies de crescimento (temperatura, tipo de meio) Na validao, crucial identificar a parte do ensaio
no afectam os resultados da anlise. Existem no mercado respeitante ao mtodo alternativo. Existem, por exemplo,
sistemas semiautomatizados para a identificao de bactrias. diversos mtodos que permitem detectar a presena de
Potenciais utilizaes. Mais do que para a identificao das clulas viveis. Estes mtodos podem ter aplicao em
5. Textos gerais

espcies, para a discriminao de estirpes (caracterizao variados ensaios (carga microbiolgica, esterilidade, etc.),
abaixo do nvel da espcie). mas no se substituem forosamente totalidade do ensaio
em todos os seus aspectos mais crticos. Por exemplo, o
ensaio de esterilidade por filtrao por membrana pode
3. REQUISITOS GERAIS PARA A VALIDAO ser efectuado pelo procedimento da Farmacopeia at ao
momento da reunio do filtro tratado com o meio de cultura.
O objectivo desta seco fornecer indicaes para a A presena de clulas viveis pode ento ser demonstrada
validao dos mtodos alternativos que podem substituir por um ou outro dos mtodos disponveis. A validao
os mtodos microbiolgicos clssicos da Farmacopeia. desta aplicao incidir mais sobre o sistema de isolamento
Por razes diversas que podem estar relacionadas com o utilizado do que sobre o ensaio no seu todo.
custo, comodidade ou rapidez das anlises, os laboratrios
de anlises microbiolgicas recorrem preferencialmente Critrios gerais. A validao de um mtodo microbiolgico
a outros mtodos alternativos aos descritos nos captulos um processo que visa estabelecer experimentalmente que
gerais, no isolamento e na identificao dos microrganismos. os parmetros do desempenho do mtodo esto conforme
Exige-se a validao destes mtodos e o captulo 1.1. as exigncias da aplicao em causa. Dado que os ensaios
Prescries gerais d indicaes com este objectivo. microbiolgicos tm 3 aplicaes bsicas, so necessrios
3 conjuntos de critrios que se descrevem a seguir.
A validao dos mtodos microbiolgicos alternativos deve
levar em linha de conta a inerente variabilidade associada
aos mtodos convencionais. Por exemplo, numa anlise 3-2. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS
convencional de contagem em placa, a gama de resultados QUALITATIVOS (PRESENA/AUSNCIA DE
observados muitas vezes maior do que os que normalmente MICRORGANISMOS)
se obtm nos ensaios qumicos.
Quando se utiliza um equipamento especfico, crucial 3-2-1. Exactido e preciso
para a aplicao do mtodo alternativo que o equipamento Para demonstrar a equivalncia de 2 mtodos qualitativos,
(materiais, incluindo as aplicaes informticas) seja objecto um mtodo directo consiste em efectu-los paralelamente e
de uma qualificao completa nos seguintes aspectos: determinar o grau de equivalncia entre o mtodo a avaliar
qualificao da concepo, fornecida pelo fabricante, com e o mtodo da Farmacopeia. Pode dar-se como exemplo o
provas documentadas de que a concepo do equipamento ensaio de esterilidade, onde esta abordagem se traduz pela
compatvel com a aplicao completa do mtodo, comparao entre as taxas de resultados positivos e negativos
com amostras idnticas, respectivamente, obtidos com o
qualificao das instalaes, com prova documentada de
mtodo alternativo e com o mtodo da Farmacopeia. Contudo,
que o equipamento foi fornecido e instalado de acordo com
pelo facto de haver poucas falhas, num caso como o do ensaio
as suas especificaes,
de esterilidade, o problema que so necessrios milhares de
qualificao de trabalho, com prova documentada de que o ensaios comparativos para estabelecer a equivalncia.
equipamento instalado funciona nos limites estabelecidos
quando se utiliza de acordo com os procedimentos de Um mtodo mais realista para avaliar a preciso de um
trabalho, mtodo alternativo qualitativo por comparao com um
mtodo da Farmacopeia pode ser o de considerar o grau de
qualificao do desempenho, com prova documentada de concordncia entre os 2 mtodos quando os procedimentos
que o equipamento, instalado e utilizado de acordo com so aplicados de forma repetida a diferentes lotes do mesmo
os procedimentos de trabalho, d desempenhos constantes produto. A exactido e a preciso do mtodo alternativo pode
e conformes com os critrios pr-estabelecidos e deste ser expressa em termos de propores relativas de falsos
modo resultados correctos para o mtodo. Esta qualificao negativos e de falsos positivos obtidas com o novo mtodo
efectua-se tipicamente com um sistema modelo (utilizando relativamente ao da Farmacopeia, quando se utiliza um
microrganismos de referncia) que permite assegurar inculo normalizado de fraca concentrao.
que as condies de trabalho aplicadas pelo operador
do laboratrio satisfazem no laboratrio aos critrios A taxa de ocorrncia de falsos negativos obtida em
estabelecidos por quem forneceu o mtodo. presena da amostra com os 2 mtodos pode ser calculada

662 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

com microrganismos de referncia presentes em baixa 3-3. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS


concentrao. Este modelo de ensaio similar ao utilizado QUANTITATIVOS (CONTAGEM DE MICRORGANISMOS)
no ensaio padro de bacteriostase/fungistase, mas o nmero
de microrganismos inoculados deve ser muito baixo, por 3-3-1. Exactido
exemplo na ordem de 5 UFC por unidade, para assegurar uma
A exactido de um mtodo alternativo mede a proximidade
frequncia de falhas suficientemente elevada para permitir
entre os resultados obtidos pelo mtodo alternativo e os
a comparao dos 2 mtodos. O mtodo alternativo deve
valores obtidos com o mtodo da Farmacopeia. A exactido
assegurar uma frequncia de isolamentos pelo menos to
deve ser demonstrada no intervalo de valores do ensaio. A
elevada como o mtodo da farmacopeia.
exactido geralmente expressa pela percentagem de re-
isolamentos obtida com o mtodo.
3-2-2. Especificidade
A exactido pode ser demonstrada preparando uma suspenso
A especificidade de um mtodo alternativo mede a de microrganismos no limite superior do intervalo de valores
sua capacidade em detectar uma gama pretendida de do ensaio e depois proceder a diluies em srie at ao
microrganismos potencialmente presentes na amostra. limite inferior desse intervalo. Se, por exemplo, o mtodo
Este aspecto convenientemente coberto pelo ensaio de alternativo se destina a substituir uma tradicional contagem
fertilidade dos meios, nos mtodos qualitativos que utilizam de microrganismos viveis em placa, um intervalo de medida
o crescimento para demonstrar a presena/ausncia de razovel pode ser de 100-106 UFC/ml. Se, em vez disso, se

5. Textos gerais
microrganismos. Nos mtodos que no se baseiam no pretende substituir o mtodo do NMP, pode ser utilizado
crescimento como indicador de presena microbiana, a um intervalo mais estreito. preciso analisar, para cada
especificidade assegura a ausncia de interferncia no ensaio microrganismo de referncia, no mnimo, 5 suspenses
de elementos estranhos presentes no sistema. Se o objectivo repartidas pelo intervalo de medida. Se o mtodo alternativo
do ensaio justificar, utilizam-se misturas de microrganismos se destina a substituir um mtodo convencional, ele deve
na validao. fornecer um valor do nmero de microrganismos viveis
que no seja inferior em 70 por cento ao valor obtido com o
3-2-3. Limite de deteco mtodo da Farmacopeia.
O limite de deteco de um mtodo alternativo o mais O protocolo utilizado para verificar a linearidade do mtodo
pequeno nmero de microrganismos que podem ser (ver 3-3-5.) pode tambm ser utilizado para verificar a
detectados numa amostra nas condies experimentais exactido: procede-se simultaneamente contagem pelo
descritas. Em microbiologia, um ensaio limite serve para mtodo da Farmacopeia das suspenses de microrganismos
determinar a presena/ausncia de microrganismos e o preparadas para o mtodo alternativo. Demonstra-se a
limite de deteco refere-se ao nmero de microrganismos exactido se os ensaios de conformidade mostrarem que o
presentes na amostra inicial antes de qualquer diluio ou declive da regresso linear no significativamente diferente
incubao e no ao nmero de microrganismos presentes no do valor 1 e se a ordenada na origem no significativamente
momento do ensaio. diferente de 0.

Os 2 mtodos (alternativo e da Farmacopeia) devem ser


3-3-2. Preciso
avaliados com um inculo que contm um baixo nmero
de microrganismos de referncia (por exemplo 5 UFC por A preciso de um mtodo alternativo mede o grau de
unidade) seguido da medio da taxa de isolamentos. A concordncia obtido entre os resultados individuais quando a
concentrao do inculo deve ser ajustada at que, pelo tcnica aplicada de forma repetida a mltiplas amostras de
menos, 50 por cento das amostras apresentem crescimento suspenses homogneas de microrganismos nas condies
no ensaio da Farmacopeia. necessrio repetir vrias prescritas. geralmente expressa em termos de varincia, de
vezes esta determinao porque o limite de deteco de um desvio padro ou de coeficiente de variao de uma srie de
ensaio determina-se com base num nmero apropriado resultados de medida.
de repeties (por exemplo, no inferior a 5). A aptido
Como procedimento mnimo, sujeita-se a vrias contagens
dos 2 mtodos em detectar a presena de microrganismos
uma suspenso de microrganismos com uma concentrao
individuais pode ser demonstrada pelo teste do x2.
situada habitualmente no meio do intervalo de medida.

3-2-4. Robustez Escolhe-se o nmero de repeties de modo que todo o


ensaio possa ser efectuado durante a mesma sesso de
A robustez de um mtodo alternativo qualitativo mede a trabalho, quer dizer, nas mesmas condies de trabalho
sua capacidade em no ser afectado por pequenas variaes e sem modificao da suspenso de microrganismos.
deliberadas nos parmetros de trabalho e d uma indicao Efectuam-se depois outras sesses de trabalho em condies
da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio normais, de variabilidade mxima (diferentes reagentes, diferentes
mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos, lotes de operadores, dias diferentes, etc.). Calcula-se a varincia
reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a resistncia dos resultados observados em cada sesso (grupo).
intrnseca s influncias exercidas nos resultados do ensaio Se as varincias so homogneas, calcula-se a varincia
pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez um da repetibilidade. Calcula-se a varincia dos resultados
parmetro de validao que o fornecedor est em melhor intergrupos. A varincia da preciso intermdia a soma
condio de efectuar, mas, se o utilizador introduzir das varincias da repetibilidade e da varincia intergrupos.
modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na Calculam-se depois os coeficientes de variao. Regra geral,
robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo um coeficiente de variao na ordem de 10-15 por cento
qualitativo pela sua aptido em detectar os microrganismos aceitvel. Independentemente dos resultados especficos
de referncia quando deliberadamente se variam os obtidos, o mtodo alternativo no deve dar um coeficiente de
parmetros de trabalho. variao mais elevado que o mtodo da Farmacopeia.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 663


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

3-3-3. Especificidade 3-4. VALIDAO DE ENSAIOS ALTERNATIVOS


DE IDENTIFICAO
Demonstra-se a especificidade de um mtodo alternativo
quantitativo com uma gama de microrganismos apropriados.
Mltiplas observaes demonstram a considervel
Se o objectivo do ensaio justificar, utilizam-se na validao
variabilidade dos diferentes mtodos quanto sua
misturas de microrganismos.
capacidade em identificar os microrganismos nos produtos
farmacuticos. preciso aceitar a ideia de que um mtodo
3-3-4. Limite de quantificao de sistemtica, se internamente consistente, pode diferir
O limite de quantificao de um mtodo alternativo de outros mtodos quanto identificao dos isolados. Por
quantitativo o mais pequeno nmero de microrganismos outras palavras, a identificao de um isolado pode no
que podem ser contados com exactido. Como no possvel conduzir mesma concluso, consoante o mtodo utilizado
se baseia na actividade bioqumica, no perfil da composio
obter uma amostra fivel com um nmero conhecido de
em cidos gordos, na anlise do ADN ou noutro mtodo. As
microrganismos, torna-se indispensvel determinar o
identificaes microbiolgicas, de acordo com um sistema
limite de quantificao a partir de um determinado nmero
particular, derivam directamente da experincia adquirida
de repeties, por exemplo, no mnimo, 5. Os resultados
com o sistema e podem por isso diferir ligeiramente das
dos estudos de linearidade e de exactido podem tambm
identificaes efectuadas por um outro sistema.
ser utilizados. A mais baixa concentrao do intervalo de
linearidade ento considerada como limite de quantificao
5. Textos gerais

do mtodo. Este valor no deve ser superior ao limite de 3-4-1. Exactido


quantificao do mtodo da farmacopeia. A exactido de um mtodo alternativo de identificao mede
a sua capacidade em identificar o microrganismo estudado
3-3-5. Linearidade ao nvel taxonmico pretendido e de o diferenciar de outros
microrganismos presentes na amostra. Deve demonstrar-
A linearidade de um mtodo alternativo quantitativo mede -se com uma gama de microrganismos de referncia ou
a sua capacidade em produzir, num determinado intervalo, de microrganismos obtidos a partir de amostras tipo
resultados proporcionais concentrao de microrganismos previamente identificadas por um outro mtodo.
na amostra. Convm determinar a linearidade no intervalo de
medida correspondente ao objectivo do mtodo alternativo.
3-4-2. Preciso
Pode-se para o efeito seleccionar diferentes concentraes de
cada microrganismo de referncia e efectuar vrias repeties A preciso de um mtodo alternativo de identificao mede o
para cada concentrao. Fixa-se o nmero de repeties de grau de concordncia obtido entre os resultados individuais
modo que o conjunto do ensaio possa ser efectuado durante quando o mtodo aplicado de forma repetida a mltiplas
a mesma sesso de trabalho. Efectuam-se de seguida 2 outras amostras de suspenso de microrganismos de referncia
sesses de trabalho em condies de variabilidade mxima cobrindo o intervalo de medida do ensaio.
(diferentes reagentes, diferentes operadores, dias diferentes,
etc.). Aps verificao da homogeneidade da varincia dos 3-4-3. Robustez
resultados obtidos em cada concentrao, calcula-se a
regresso linear. Determina-se a linearidade se o declive A robustez de um mtodo alternativo de identificao
estimado significativo e se o desvio de linearidade no for mede a sua capacidade em no ser afectado por pequenas
significativo. variaes deliberadas nos parmetros de trabalho. D uma
indicao da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio
normais, mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos,
3-3-6. Intervalo de medida lotes de reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a
O intervalo de medida de um mtodo alternativo quantitativo resistncia intrnseca s influncias exercidas nos resultados
o intervalo compreendido entre a menor e a mais do ensaio pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez
elevada concentrao em microrganismos que puderam um parmetro de validao que o fornecedor est em
ser determinadas com preciso, exactido e linearidade melhor condio de realizar, mas, se o utilizador introduzir
do mtodo descrito. O intervalo de medida deduzido dos modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na
estudos de preciso, de exactido e de linearidade. robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo
de identificao pela sua aptido em assegurar de forma
constante a identificao dos microrganismos de referncia
3-3-7. Robustez quando deliberadamente se variam os parmetros de trabalho.
A robustez de um mtodo alternativo quantitativo mede a
sua capacidade em no ser afectado por pequenas variaes
deliberadas nos parmetros de trabalho. D uma indicao 4. EXIGNCIAS ESPECFICAS DE VALIDAO
da fiabilidade do mtodo nas condies de ensaio normais,
mas variveis, como diferentes analistas, aparelhos, lotes de 4-1. CONTEXTO
reagentes e laboratrios. Pode ser definida como a resistncia
intrnseca s influncias exercidas nos resultados do ensaio Consoante os contextos, a validao definida de forma um
pelas variveis de trabalho e ambientais. A robustez um pouco diferente, mas a sua definio consensual a de que
parmetro de validao que o fornecedor est em melhor consiste em estabelecer uma prova documentada de que um
condio de efectuar, mas, se o utilizador introduzir procedimento ir permitir realizar de forma reprodutvel o
objectivo a que se destina. Por consequncia, essencial para
modificaes a alguns parmetros crticos, o seu efeito na
a validao correcta de um novo mtodo compreender bem e
robustez deve ser avaliado. Julga-se a robustez de um mtodo
definir qual o seu objectivo.
qualitativo pela sua aptido em assegurar uma contagem
de microrganismos de referncia estatisticamente correcta Para a aplicao de mtodos microbiolgicos convencionais
quando deliberadamente se variam os parmetros de trabalho. ou alternativos, preciso encarar 2 nveis de validao. A

664 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

validao primria de um mtodo regra geral realizada pelo intervalo de medida,


fornecedor do mtodo, enquanto que a sua validao para o
linearidade da resposta,
uso efectivo previsto, que consiste em verificar a adequao
ou aplicabilidade do mtodo numa determinada situao, da exactido e preciso das respostas,
responsabilidade do utilizador. Antes da validao para o uso
efectivo previsto, o utilizador deve efectuar uma qualificao robustez do mtodo num sistema modelo,
do desempenho como se descreve na seco 3. Requisitos limites de aplicabilidade.
gerais para a validao.
Desde que o mtodo tenha sido caracterizado desta forma
Os mtodos microbiolgicos utilizam tipicamente algumas pelo fornecedor, o princpio de deteco no necessita de ser
caractersticas especficas dos microrganismos como verificado por cada utilizador.
indicadores ou princpios de deteco para responder
a questes mais gerais. As informaes necessrias so
4-1-2. Validao de um mtodo microbiolgico alternativo
a presena, o nmero, a viabilidade, a resistncia ou a
identidade dos microrganismos num produto ou num 4-1-2-1. Anlise risco/benefcio
determinado ambiente.
Para a validao de mtodos microbiolgicos alternativos
Um determinado mtodo d geralmente uma resposta especficos, crucial que o objectivo do procedimento
indirecta e condicional s questes colocadas. Por exemplo, seja descrito rigorosamente. Com este propsito , pois,

5. Textos gerais
uma indicao do nmero total e da viabilidade dos necessrio definir o tipo e o grau de preciso das informaes
microrganismos dada pelo nmero de microrganismos pretendidas. No mbito de uma anlise de risco/benefcio,
capazes de se reproduzirem em determinadas condies deve ser efectuado um estudo comparativo do mtodo
de preparao da amostra, de cultura e de incubao. A convencional e do mtodo alternativo, quanto s informaes
reproduo , pois, em microbiologia clssica, utilizada como obtidas e s suas limitaes.
indicador geral de viabilidade. Existem, no entanto, outros
parmetros que podem servir de indicadores de viabilidade. A aplicao de um mtodo alternativo pode ser considerada
justificada se as informaes obtidas fornecerem respostas
O nvel do ATP, a acumulao ou o metabolismo de substratos cientificamente fundamentadas s questes colocadas pelo
nas clulas vivas so igualmente indicadores possveis de procedimento e se o mtodo no for mais restritivo que o
viabilidade. Os resultados obtidos a partir de diferentes mtodo convencional.
indicadores de viabilidade no sero sempre idnticos. Os
microrganismos podem ser incapazes de se reproduzir num
determinado meio, sendo no entanto capazes de acumular 4-1-2-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
e metabolizar um substrato. Do mesmo modo, num O mtodo alternativo deve ser aplicado no mbito do
determinado estado de deteriorao, podem ser incapazes de procedimento em vigor e com as amostras a analisar sob
acumular um substrato mas serem no entanto capazes de se a responsabilidade do utilizador. Deve demonstrar-se que
perpetuar e reproduzir. um sistema modelo fornece resultados comparveis aos
Estas consideraes aplicam-se tambm aos mtodos caracterizados pelo fornecedor. As questes especficas que se
utilizados na identificao de microrganismos. A colocam neste contexto, consoante o caso, so, por exemplo:
caracterizao do perfil metablico de microrganismos a compatibilidade da resposta com as modalidades de
muitas vezes utilizada na identificao das espcies, enquanto preparao das amostras para o ensaio,
que um outro mtodo consiste em comparar as sequncias
de ADN. Novamente, as respostas obtidas com os diferentes os limites e a gama de deteco do mtodo, tendo em conta
mtodos de identificao podem no coincidir totalmente o tamanho e a disponibilidade das amostras,
e uma resposta pode ser apropriada construo de uma a especificidade da resposta, tendo em conta todos os tipos
rvore de correlao filogentica, enquanto que outra de amostras a analisar,
mais til no contexto do poder patognico ou de outras
propriedades de microrganismos diferenciados. a exactido e a preciso da resposta, tendo em conta todos
os tipos de amostras a analisar,
4-1-1. Validao primria a robustez do mtodo, tendo em conta todos os tipos de
Para caracterizar um mtodo microbiolgico especfico, amostras a analisar.
essencial que o princpio de deteco associado seja Em funo da aplicao e dos dados da validao, ser
claramente descrito pelo fornecedor. O mtodo deve ser necessrio definir os critrios de aceitao aplicveis
descrito com pormenor no que diz respeito s condies de utilizao de rotina do mtodo.
aplicao, aos produtos e equipamentos necessrios e ao sinal
esperado. O princpio do mtodo deve estar descrito numa
publicao cientfica reconhecida. 4-2. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS POR
BIOLUMINISCNCIA
O princpio de deteco deve estar caracterizado num
sistema modelo e/ou com um conjunto de microrganismos
4-2-1. Anlise risco/benefcio
de referncia, no que diz respeito, no mnimo, aos seguintes
aspectos: Como comprovam os estudos cientficos aprofundados e
tratamento prvio das amostras ou dos microrganismos, os anos de utilizao, o mtodo que utiliza o ATP como
marcador de viabilidade equivalente aos mtodos clssicos
tipo de respostas, de contagem em placa quanto gama de microrganismos
especificidade da resposta, que permite detectar. Estando dependente do crescimento, a
principal melhoria trazida por este mtodo, comparando aos
limite de deteco, mtodos clssicos, a vantagem de se obter um resultado

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 665


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

com maior rapidez (24 h para a bioluminiscncia, 5 dias para 4-3-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
a cultura em placa). A identificao dos microrganismos
A citometria baseia-se na deteco de um sinal de
detectados por bioluminiscncia possvel a partir do
fluorescncia emitido pelos microrganismos marcados.
meio de incubao, mas deve recordar-se que numa
cultura mista alguns microrganismos podem competir Deve ser efectuada uma qualificao do desempenho para
com outros durante a incubao. Estes mtodos permitem assegurar que os aparelhos funcionam no limite dos parmetros
a avaliao das amostras em 24 h no caso de produtos de trabalho definidos. Estes controlos envolvem a utilizao
filtrveis e no filtrveis (gua, controlo durante o processo, de padres de fluorescncia com a intensidade prescrita bem
amostras ambientais, matrias primas slidas e lquidas, como de culturas contendo um tipo e um nmero conhecido
produtos finais slidos e lquidos, etc.) assim como de um de microrganismos. Estes permitem comprovar o sistema de
grande nmero de amostras quando a etapa de deteco deteco quantitativo. Os reagentes e consumveis (testemunhas
automatizada. negativas) devem ser igualmente utilizados para assegurar a
aplicabilidade do protocolo do ensaio de rotina e verificar que
4-2-2. Validao para a utilizao efectiva prevista a qualidade dos materiais utilizados no ensaio no falseia o
resultado final. Utilizam-se culturas puras de microrganismos
O mtodo baseia-se na deteco de ATP de microrganismos de referncia para comprovar o sistema de deteco e para
viveis. Deve ser efectuada uma qualificao do desempenho comparar os resultados com os obtidos com a clssica contagem
com microrganismos de referncia para se assegurar que as em placas. Utilizam-se mltiplas repeties (pelo menos, 5) de
5. Textos gerais

condies de trabalho aplicadas pelo utilizador do laboratrio culturas incubadas durante 1 noite, diludas num determinado
permitem satisfazer aos critrios definidos pelo fornecedor intervalo de concentraes (por exemplo 100 por cento, 75 por
em matria de preciso, de exactido e de linearidade cento, 50 por cento, 25 por cento, 10 por cento), para avaliar
(mtodo quantitativo), de limite de deteco (mtodo a linearidade, a exactido, a preciso, o intervalo de medida, a
qualitativo e semiquantitativo) no intervalo de medida especificidade, o limite de quantificao (mtodo quantitativo)
requerido para o uso pretendido. Aps esta etapa, prossegue- e o limite de deteco (citometria de fluxo com pr-incubao).
-se a validao em 3 fases: Dado que a citometria se caracteriza por uma elevada
fase 1: fertilidade do meio em presena do produto (se for sensibilidade (a citometria de fase slida permite a deteco
realizada uma etapa de incubao), de clulas individuais e a citometria de fluxo possui uma
sensibilidade da ordem de 10-15 clulas por mililitro) e por uma
fase 2: pesquisa de interferncias que podem aumentar ou deteco no baseada no crescimento, a linearidade da resposta
inibir a produo de ATP (atravs da adio na amostra de instrumental pode ser verificada por comparao dos resultados
uma soluo padro de ATP), efectivos com o valor esperado. A seguir a esta etapa, a validao
fase 3: estudo comparativo com o mtodo da Farmacopeia. prossegue em 2 fases: validao relativamente amostra e
ensaios comparativos. Os resultados de cada fase devem ser
Descreve-se no final deste captulo um exemplo detalhado de avaliados em relao aos critrios de aceitao pr-estabelecidos
validao de um mtodo de bioluminiscncia. em presena de testemunhas positivas e negativas:
fase 1: para verificar que o processo de preparao das
4-3. CONTAGEM DE MICRORGANISMOS POR CITOMETRIA amostras e as prprias amostras no afectam o desempenho
(DE FLUXO OU DE FASE SLIDA) do sistema de deteco, necessrio sobrecarregar os
produtos a avaliar por citometria, com uma quantidade
4-3-1. Anlise risco/benefcio definida de microrganismos; deve ser dada uma ateno
particular ausncia na matriz das amostras de factores
Como comprovam os estudos cientficos aprofundados, que podem influenciar a deteco (cromforos endgenos,
este mtodo que utiliza um fluorforo como marcador de partculas auto-fluorescentes) e, no caso da citometria de
viabilidade, superior aos mtodos clssicos de contagem fluxo, o tamanho/diluio da amostra e o dbito devem ser
em placa, quanto gama de microrganismos que permite optimizados,
detectar e/ou contar. A citometria permite com efeito
detectar a totalidade dos microrganismos viveis, incluindo fase 2: devem ser efectuados ensaios para se comparar
alguns que podiam no ser detectados pelos mtodos os resultados obtidos por citometria e pelo mtodo da
baseados no crescimento. Embora rpido, o isolamento dos Farmacopeia. Devem ser definidos num protocolo de
microrganismos aps anlise limitado. O prosseguimento comparabilidade o nmero de amostras necessrias e a
da anlise das amostras tendo em vista uma identificao, durao do ensaio. O nmero de amostras necessrias
requer o emprego de outros corantes fluorescentes ou de um pode ser varivel, mas deve ser representativo do processo
mtodo alternativo. Actualmente, no possvel utilizar a de avaliao do produto (tempo/nmero) e permitir
citometria por rotina na identificao dos microrganismos, uma avaliao estatstica. Todas as amostras devem ser
embora a sua morfologia geral seja claramente apreciada preparadas de acordo com os procedimentos definidos
com microscpio de fluorescncia com citometria de fase e avaliados relativamente aos critrios de validao e de
slida. Este mtodo permite uma avaliao rpida das aceitao escolhidos, semelhantes aos utilizados para a
amostras e permite uma interveno antecipada durante o avaliao de culturas puras.
fabrico, facilitando assim integrar a qualidade nas operaes
farmacuticas. No estando dependente do crescimento,
4-4. IDENTIFICAO ATRAVS DA ANLISE DO PERFIL DE
este mtodo permite a deteco de todos os microrganismos
COMPOSIO EM CIDOS GORDOS
que tenham actividade metablica. Actualmente, contudo, o
limite de deteco da citometria de fluxo tal que no pode
4-4-1. Anlise risco/benefcio
ser utilizada na maior parte das amostras farmacuticas, na
contagem atravs do exame directo. Se for necessria uma A identificao atravs do perfil da composio em cidos
pr-incubao a estimativa torna-se semi-quantitativa (ensaio gordos pode ser mais precisa do que as identificaes
limite). baseadas nos perfis metablicos dos mtodos de cultura

666 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

convencionais. As bases de dados so mais extensas do que os Quando so utilizadas na identificao as tcnicas de
mtodos de cultura convencionais. necessria uma pr- amplificao do ADN, estas no permitem distinguir os
-incubao, mas a extraco e a identificao so mais rpidas microrganismos vivos dos microrganismos mortos. Isto
que com os mtodos bioqumicos e, como consequncia significa que no podem ser utilizadas directamente no
disso, mais rpida a obteno dos resultados. Outros produto mas apenas aps passagens num tradicional meio
mtodos modernos como a anlise das sequncias 16S de de cultura, o que faz perder uma parte da sua vantagem
ADNr em que a impresso gentica apresenta um domnio em termos de rapidez. Por outro lado, se so aplicados
de diferenciao tambm grande, do resultados to rpidos directamente no produto, no permitem obter no final da
como este mtodo. A diferenciao de microrganismos muito anlise uma estirpe que possa ser utilizada em experincias
aparentados (como E. coli e salmonelas) atravs da anlise posteriores, e no trazem qualquer vantagem quando os
dos perfis da composio em cidos gordos pode ser difcil. microrganismos a detectar so dificilmente cultivveis ou
Quando esta diferenciao particularmente importante, esto em stress. As tcnicas de amplificao do ARN (por
outros sistemas podem dar resultados mais precisos. Para exemplo a RT-PCR) permitem a identificao directa de
uma determinada aplicao, importante especificar que microrganismos vivos no produto (mas no de esporos),
tipos de microrganismos importante identificar. Se for mas so muito mais difceis de utilizar na rotina que
crucial caracterizar correctamente a espcie do isolado do os mtodos tradicionais. Em contrapartida, quando se
ponto de vista filogentico, os mtodos de identificao utilizam iniciadores especficos, os mtodos que recorrem
baseados na sequncia do ADN do resultados mais fiveis.

5. Textos gerais
amplificao de cidos nucleicos permitem uma identificao
Outra das limitaes da identificao com base nos perfis (ou tipagem) mais precisa que os mtodos tradicionais e
da composio em cidos gordos a necessidade de se trazem por vezes ainda outras vantagens. Por exemplo, na
cultivar os microrganismos em meios padro e em condies identificao de algumas vacinas (vacina contra a clera,
normalizadas de temperatura e de tempos de incubao. vacina contra a tosse convulsa com clulas inteiras) a sua
Microrganismos que no podem ser cultivados nestes meios utilizao pode substituir a utilizao de soros especficos e
no podem ser identificados. contribuir para reduzir a utilizao de animais ou, noutras
vacinas especficas (BCG), podem permitir uma identificao
4-4-2. Validao para a utilizao efectiva prevista muito especfica, at agora impossvel.

Deve demonstrar-se que o mtodo d resultados constantes Estes mtodos so em geral no quantitativos (PCR) ou semi-
com uma gama de microrganismos de referncia com, pelo -quantitativos (PCR em tempo real). Os seus resultados no
menos, 3 repeties em cada caso. podem ser comparados aos da contagem de colnias, nos
quais se exige uma contagem exacta dos microrganismos
Deve ser efectuada pelo utilizador a identificao de um presentes na amostra. No entanto, apesar do valor assumido da
nmero significativo de isolados obtidos a partir de amostras contagem de colnias, este dogma no se verifica na realidade
tipo, 3 vezes para cada isolado, pelo menos. Os resultados no caso das bactrias que apresentam uma tendncia para a
obtidos em cada caso devem ser coerentes e estar em aglomerao (micobactrias) ou para a organizao em cadeias
conformidade com os resultados obtidos por outros mtodos ou agregados (estreptococos, estafilococos). Uma normalizao
de identificao. Se um outro sistema de identificao d um
precisa dos mtodos semi-quantitativos pode dar resultados
resultado diferente, deve investigar-se a causa. Se existir uma
com fiabilidade comparvel.
explicao cientificamente plausvel para o reconhecimento
de espcies diferentes, a divergncia entre os sistemas de
identificao pode ser aceitvel. Neste caso, necessrio 4-5-2. Validao para a utilizao efectiva prevista
assegurar que o reconhecimento da espcie identificada O mtodo validado em conformidade com as disposies
robusto. tambm necessrio verificar se o sistema no descritas em 2.6.21. A comparao dos mtodos
reagrupa numa mesma espcie isolados mal conhecidos, convencionais e dos mtodos com base no PCR, que
simulando o isolamento repetido da mesma espcie. apresentam importantes diferenas de sensibilidade e de
especificidade, particularmente difcil e pode conduzir a
4-5. TCNICAS DE AMPLIFICAO DOS CIDOS concluses divergentes.
NUCLEICOS O exemplo seguinte publicado a ttulo informativo e no
para aplicao geral.
4-5-1. Anlise risco/benefcio
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos so
muito utilizadas para fins de diagnstico em virtude da
sua preciso e da sua rapidez, aos quais se juntam o custo Exemplo de validao de um mtodo
relativamente baixo das anlises, mas no dos aparelhos,
relativamente aos mtodos tradicionais. Com a condio de
alternativo: protocolo detalhado seguido
terem sido efectuadas validaes especficas, estes mtodos, por um laboratrio para implementar a
correctamente utilizados, podem trazer vantagens no bioluminiscncia
negligenciveis em algumas reas relativamente aos mtodos
clssicos. Os mtodos clssicos, em contrapartida, so
mais fceis de normalizar, necessitam um menor nvel de
competncias tcnicas e podem ter um custo menos elevado. CONTEXTO
Regra geral, mesmo quando para pr em prtica os mtodos
de amplificao dos cidos nucleicos no mais difcil que Os mtodos que comportam uma etapa de pr-incubao em
para os mtodos tradicionais, a interpretao dos resultados meio lquido (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca)
requer um grau superior de competncias cientficas. no oferecem informaes quantitativas, mas permitem

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 667


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5.1.6. Mtodos alternativos para o controlo da qualidade microbiolgica

determinar uma presena/ausncia na quantidade de produto medida escolhido que satisfaz aos critrios de linearidade,
analisada. Utilizando diferentes quantidades de amostra, o de exactido e de preciso. Critrio de aceitao: o limite de
sistema pode permitir uma determinao semi-quantitativa quantificao do mtodo de bioluminiscncia inferior ou
(ensaio limite). Por exemplo, a quantidade de produto igual ao da Farmacopeia.
classicamente examinada na contagem do total de germes
aerbios viveis nos produtos no estreis de 0,1 g ou 0,1 ml Preciso
e permite concluir a ausncia de germes em 0,1 g ou 0,1 ml;
um resultado negativo corresponde assim a um nmero de Avaliaes quantitativas. Para cada microrganismo de
microrganismos inferior a 10 em 1 g ou 1 ml, e um resultado referncia, efectue 5 repeties da mesma srie, no mnimo,
positivo a um nmero de microrganismos superior ou igual que inclua, pelo menos, a concentrao de microrganismos
a 10 em 1 g ou 1 ml. Se se examinar simultaneamente uma que corresponde ao meio do intervalo. Efectue 3 ensaios
quantidade de 0,01 g ou 0,01 ml, um resultado negativo independentes. Proceda a uma anlise estatstica para
corresponde a um nmero de microrganismos inferior a 100 comparar a preciso dos dois mtodos ou calcule o coeficiente
em 1 g ou 1 ml. A combinao de um resultado negativo para de variao (CV). Critrio de aceitao: CV entre 15 por cento
0,01 g ou 0,01 ml e de um resultado positivo para 0,1 g ou e 30 por cento, ou sem diferena de preciso (com risco alfa
0,1 ml, d uma estimativa do nvel de contaminao do de 5 por cento) entre os 2 mtodos. Se a preciso for diferente,
produto, que inferior a 100 microrganismos mas superior o mtodo de bioluminiscncia superior ao mtodo da
ou igual a 10 microrganismos por grama ou mililitro. Como farmacopeia se der um desvio padro inferior.
5. Textos gerais

se indica na seco 2, a bioluminiscncia pode ser utilizada


como mtodo quantitativo se os microrganismos forem Avaliaes qualitativas ou semi-quantitativas. Utilize
retidos numa membrana filtrante e depois incubados num o procedimento alternativo descrito para determinar o
meio de cultura (bioluminiscncia em membrana). limite de deteco e compare as percentagens de resultados
positivos obtidos com o mtodo de bioluminiscncia
O protocolo descrito a seguir diz respeito validao de e o mtodo da Farmacopeia. Critrio de aceitao: a
mtodos de bioluminiscncia qualitativos, semi-quantitativos percentagem de resultados positivos obtidos com o mtodo
e quantitativos. de bioluminiscncia no limite de deteco de 100 por cento
e esta frequncia superior ou igual obtida com o mtodo
QUALIFICAO DO DESEMPENHO DO MTODO da Farmacopeia.
ALTERNATIVO
Linearidade
Especificidade
Para cada microrganismo de referncia, prepare 5
Proceda a uma avaliao prvia do mtodo com concentraes compreendidas no intervalo de medida
microrganismos de referncia apropriados. Por exemplo, (normalmente indicado pelo fornecedor) do mtodo de
para a contagem do total de germes aerbios viveis nos bioluminiscncia. Efectue o ensaio em paralelo pelo mtodo
produtos no estreis, necessrio utilizar, no mnimo, os da farmacopeia e da bioluminiscncia. Repita mais 2 vezes
microrganismos especificados em 2.6.12 para verificar a este ensaio para obter resultados de 3 ensaios independentes.
fertilidade dos meios em presena do produto. Efectue esta Efectue testes de regresso linear, de declive, de falta de
determinao 3 vezes, pelo menos, para cada microrganismo. ajustamento pelo teste F (com risco alfa de 5 por cento). Se
Critrio de aceitao: todos os microrganismos de referncia no for possvel uma anlise estatstica, calcule o coeficiente
so detectados. de correlao R2 para os 2 mtodos e o declive. Critrio
de aceitao: a anlise estatstica permite determinar a
Limite de deteco (apenas para mtodos semi-quantitativos regresso linear, a existncia de um declive e no haver falta
e qualitativos) de ajustamento com risco de 5 por cento; determina-se a
equao y = a + bx, sendo b o declive e a a ordenada na
Prepare um pequeno inculo (cerca de 5 UFC na amostra
origem. Na ausncia de anlise estatstica, R2 deve ser igual ou
inicial) de cada microrganismo de referncia. Efectue a
superior a 0,9 e o declive no se deve desviar mais de 20 por
anlise pelo mtodo da Farmacopeia e pelo mtodo de
cento do valor 1 (b compreendido entre 0,8 e 1,2). Se no for
bioluminiscncia considerado com, pelo menos, 5 repeties.
Critrio de aceitao: aptido dos 2 mtodos em detectar demonstrada a linearidade em todo o intervalo, este intervalo
a presena de um microrganismo isolado, que pode ser pode ser reduzido e a linearidade demonstrada apenas com 3
determinada pelo teste do 2. Procedimento alternativo: concentraes em vez de 5.
preparar para cada microrganismo de referncia uma srie de
diluies com vrias diluies com cerca de 5 UFC por inculo Exactido
(por exemplo 10 UFC/inculo, 5 UFC/inculo, 2,5 UFC/inculo,
Avaliaes quantitativas. A exactido pode ser determinada
1,25 UFC/inculo, 0,75 UFC/inculo). Efectue o ensaio em
a partir de valores obtidos para a linearidade. Para cada
5 sries independentes pelo mtodo da Farmacopeia e pelo
microrganismo, utilize 3 a 5 concentraes compreendidas
mtodo de bioluminiscncia. Determine o limite de deteco
no intervalo de linearidade do mtodo. Efectue uma anlise
para cada mtodo. O limite de deteco corresponde ltima
diluio na qual se obteve nas 5 sries, um resultado positivo. estatstica (teste t de Student com risco de 5 por cento) para
Critrio de aceitao: o limite de deteco do mtodo de verificar a conformidade entre o declive estimado (valor = 1)
bioluminiscncia inferior ou igual ao da Farmacopeia. e o declive obtido, e a conformidade entre a ordenada na
origem estimada (valor = 0) e a ordenada na origem obtida.
Por exemplo, para um declive estimado b com desvio padro
Limite de quantificao (mtodo quantitativo) s(b) igual a 0,090 em 5 concentraes de microrganismos,
Pode ser determinado ao mesmo tempo que a linearidade. calcule t = (b - 1)/s(b)); para uma ordenada na origem a com
Corresponde concentrao mais baixa do intervalo de desvio padro s(a) calcule t = (a - 0)/ s(a) Compare estes valores

668 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.7. Segurana vrica

ao valor t de Student com 5 por cento, para 13 graus de depois efectue a contagem das colnias bioluminiscentes
liberdade (3 ensaios, 5 concentraes). Critrio de aceitao: presentes na membrana. Critrio de aceitao: o ensaio
se os valores t obtidos so inferiores aos valores t de Student, positivo (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca); o
o mtodo exacto no intervalo considerado. No caso de no isolamento dos microrganismos superior ou igual a 70 por
conformidade do declive (valor diferente de 1) ou da ordenada cento (bioluminiscncia em membrana).
na origem (valor diferente de 0), o mtodo no exacto no
intervalo considerado. Fase 2: ausncia de interferncia do produto
Avaliaes qualitativas ou semi-quantitativas. Utilize o O objectivo demonstrar que o produto no introduz luz
procedimento alternativo descrito para determinar o limite parasita ou ATP no microbiano (no induz resultados
de deteco. Calcule a percentagem de falsos negativos no falsamente positivos: critrio A) ou no diminui a deteco do
mtodo da bioluminiscncia e no mtodo da Farmacopeia no ATP (no induz resultados falsamente negativos: critrio B).
conjunto das diluies examinadas. Compare as percentagens
de falsos negativos obtidos em 2 ou 3 concentraes de Bioluminiscncia em tubo ou em microplaca
microrganismos imediatamente inferiores ao limite de
deteco (por exemplo, 5 UFC/inculo ou 2,5 UFC/inculo ou A. Efectue o ensaio de bioluminiscncia apenas no meio de
1,25 UFC/inculo) que do um resultado positivo. Critrio cultura e no meio de cultura em presena do produto e
de aceitao: a percentagem de falsos negativos obtida com o determine os valores de ULR correspondentes.

5. Textos gerais
mtodo da bioluminiscncia nas concentraes inferiores ao B. Efectue o ensaio de bioluminiscncia apenas no meio
limite de deteco inferior ou igual obtida com o mtodo de cultura e no meio de cultura em presena de ATP e
da Farmacopeia. determine o coeficiente de resposta concentrao de
ATP, em percentagem.
Intervalo de medida
Critrios de aceitao:
Trata-se do intervalo compreendido entre a mais baixa e
critrio A: o valor de ULR obtido no meio de cultura na
a mais elevada concentrao de microrganismos onde foi
presena do produto 2 vezes inferior ao valor obtido s
verificada a linearidade, a preciso e a exactido. com o meio de cultura (se o critrio A no for satisfatrio,
necessrio determinar um limite especfico para o produto),
Robustez
critrio B: o valor de ULR obtido no meio de cultura na
Esta informao fornecida pelo fabricante. presena do produto e de ATP est compreendido entre
25 por cento e 200 por cento do valor obtido no meio de
cultura em presena de ATP.
VALIDAO PARA O USO EFECTIVO PREVISTO
Bioluminiscncia em membrana
No exemplo aqui considerado, no necessrio determinar a
exactido e o limite de deteco em presena do produto. A Efectue integralmente o ensaio de bioluminiscncia
validao comporta 3 fases que permitem verificar: para pesquisa de interferncias. Critrios de aceitao: o
isolamento de microrganismos superior ou igual a 70 por
fase 1: a fertilidade do meio em presena do produto, cento e inferior ou igual a 200 por cento.
fase 2: a ausncia de interferncia do produto susceptvel de
aumentar ou reduzir a produo de ATP, Fase 3: exame do produto em paralelo com o mtodo da
fase 3: o exame do produto em paralelo com o mtodo da Farmacopeia
Farmacopeia. Examine em paralelo o produto considerado pelo mtodo da
bioluminiscncia validado e pelo mtodo da Farmacopeia,
Estas 3 fases de validao so efectuadas em 3 ensaios
para determinar a correlao entre os 2 mtodos para o
independentes utilizando, por exemplo, 2 lotes do produto,
produto considerado, efectuando 3 ensaios independentes
no mnimo.
com 2 lotes diferentes, no mnimo. Exprima o resultado
como positivo ou negativo numa determinada quantidade de
Fase 1: fertilidade do meio de cultura produto (bioluminiscncia em tubo ou em microplaca) ou
Se o produto apresenta um nvel de contaminao em nmero de microrganismos por quantidade de produto
conhecido elevado (mais de 500 microrganismos por filtrado (bioluminiscncia em membrana). Critrio de
grama ou mililitro), a etapa de incubao intil e os aceitao: os resultados devem estar correlacionados com o
microrganismos podem ser detectados directamente. Neste mtodo da Farmacopeia.
caso, o controlo de fertilidade em presena do produto
no necessrio. Contudo, o nvel de contaminao 5.1.7. SEGURANA VRICA
dos produtos farmacuticos normalmente mais baixo
e necessrio o crescimento dos microrganismos para Este captulo geral contm exigncias gerais respeitantes
permitir uma deteco por bioluminiscncia. preciso por segurana vrica dos medicamentos cujo fabrico tenha
isso demonstrar que o produto no inibe o crescimento implicado o uso de substncias de origem humana ou
dos microrganismos nas condies do ensaio. Com este animal. A segurana vrica constitui uma questo complexa,
objectivo, adicione separadamente a uma poro do considerando-se importante proceder a uma avaliao do
meio contendo o produto, um inculo com o mximo risco. As exigncias aplicadas a um medicamento especfico
de 100 UFC de cada microrganismo de referncia. Na so decididas pela Autoridade competente.
bioluminiscncia em tubo ou em microplaca, efectue
o ensaio de bioluminiscncia. Na bioluminiscncia em Quando existe risco de contaminao vrica, so tomadas
membrana, incube a 30-35C ou 20-25C durante 5 dias, medidas complementares, conforme o caso, para garantir a

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 669


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.1 ESTERILIDADE (NDICE)

5.1.7. Segurana vrica

segurana vrica dos medicamentos, com base: que possam influenciar o nvel potencial de partculas
infecciosas no medicamento, assim como factores ligados ao
na seleco da origem das substncias e na pesquisa de
uso do medicamento, determinando ou influenciando o risco
contaminantes vricos,
vrico para os indivduos tratados.
no controlo da capacidade do mtodo de produo em
eliminar e/ou inactivar os vrus, A avaliao do risco tem em considerao factores relevantes,
por exemplo:
na pesquisa de uma contaminao vrica em fases de
produo apropriadas. a espcie de origem,

Nos casos apropriados, aplicam-se um ou vrios mtodos o rgo, o tecido, a origem do fluido,
validados de eliminao ou de inactivao dos vrus. os potenciais contaminantes tendo em vista a origem do
Recomendaes suplementares pormenorizadas sobre a material de partida e dos antecedentes do(s) dador(es), de
segurana vrica, incluindo os estudos de validao, so preferncia incluindo dados epidemiolgicos,
fornecidas, em particular, pelas Normas aplicadas relativas os potenciais contaminantes resultantes do mtodo de
aos estudos de validao virolgica: planificao, contribuio fabrico (por exemplo, proveniente de materiais de risco
e interpretao dos estudos validando a inactivao e a
utilizados durante o fabrico),
eliminao dos vrus (CPMP/BWP/268/95) do Comit das
5. Textos gerais

Especialidades Farmacuticas e a Orientao ICH Q5A sobre a infecciosidade e a patogenicidade dos potenciais
a avaliao da segurana vrica dos produtos resultantes contaminantes para os indivduos aos quais o medicamento
da biotecnologia e derivados de linhas celulares de origem destinado, tendo em conta a via de administrao do
humana ou animal (assim como as revises posteriores destes medicamento,
documentos).
a quantidade de substncia utilizada para produzir uma
As exigncias respeitantes s vacinas e aos soros para uso dose de medicamento,
veterinrio figuram nas monografias Vacinas para uso
veterinrio e Soros para uso veterinrio e nos captulos os controlos efectuados em dador(es), no material de
gerais associados. partida, durante a produo e no produto final,
o mtodo de fabrico do produto e a capacidade deste para
Avaliao do risco eliminar e/ou inactivar os vrus.
Efectua-se uma avaliao do risco virolgico, se forem A avaliao do risco pode principalmente ser baseada nas
utilizadas substncias de origem humana ou animal, como condies de fabrico se estas incluem etapas de inactivao
componentes de medicamentos ou durante o fabrico de rigorosas (por exemplo, para a gelatina) e produtos que sejam
substncias activas, de excipientes ou de medicamentos. objecto de uma esterilizao final pelo vapor ou calor seco,
O princpio da avaliao do risco considera vrios factores como descrito nos textos gerais em esterilidade (5.1).

670 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.2. TEXTOS GERAIS


SOBRE PRODUTOS
BIOLGICOS
5.2. Textos gerais sobre produtos biolgicos 673 5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas para
5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias uso veterinrio 683
de produtos biolgicos 673 5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas para uso
5.2.2. Bandos de frangos isentos de microrganismos veterinrio 685

5. Textos gerais
patognicos especficos para a produo e o 5.2.8. Minimizao do risco da transmisso de
controlo da qualidade de vacinas 674 agentes de encefalopatias espongiformes
5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao animais pelos medicamentosos para
de vacinas para uso humano 677 uso humano e para uso veterinrio 686
5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao 5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote
de vacinas para uso veterinrio 680 de vacinas e soros para uso veterinrio 698
5.2.5. Substncias de origem animal utilizadas na
preparao de vacinas para uso veterinrio 683

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 671


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.1. Terminologia utilizada nas monografias de produtos biolgicos

5.2. TEXTOS GERAIS SOBRE do tecido animal de origem. Nas linhas celulares contnuas,
as clulas so capazes de se multiplicarem indefinidamente
PRODUTOS BIOLGICOS em cultura e podem ser obtidas de tecidos sos ou tumorais.
Algumas linhas celulares contnuas podem, em certas
condies, ter actividade oncognica.

5.2.1. TERMINOLOGIA UTILIZADA Cultura de clulas de produo. Cultura de clulas derivada


NAS MONOGRAFIAS DE PRODUTOS de um ou de vrios recipientes do banco de clulas de
trabalho ou cultura de clulas primrias destinadas a ser
BIOLGICOS utilizadas na produo.
Sistema de lote semente. Sistema em que lotes sucessivos de
um produto derivam do mesmo lote semente primrio. Para a Clulas testemunha. Quantidade de clulas reservadas,
produo de rotina, um lote semente de trabalho preparado no momento da inoculao do vrus, a servirem de clulas
a partir do lote semente primrio. A origem e a histria das testemunha no inoculadas. As culturas so incubadas
passagens do lote semente primrio e do lote semente de em condies similares s culturas celulares utilizadas na
trabalho so registadas. produo.

5. Textos gerais
Lote semente primrio. Cultura de um microrganismo Colheita nica. Material colhido por uma ou vrias vezes
distribuda a partir de um nico granel, em recipientes de uma nica cultura celular de produo inoculada com
processados em conjunto numa nica operao de forma o mesmo lote semente de trabalho ou com uma suspenso
a assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir a proveniente do lote semente de trabalho, incubado e
contaminao. Um lote semente primrio na forma liquida colhido num nico ciclo de produo.
normalmente conservado a uma temperatura igual ou
inferior a -70C. Um lote semente primrio liofilizado
conservado a uma temperatura que reconhecidamente Mistura monovalente de colheitas. Mistura de colheitas
assegure a sua estabilidade. contendo a mesma estirpe ou tipo de microrganismo ou
antignio e derivadas de ovos, de recipientes de culturas
celulares etc. e processadas ao mesmo tempo.
Lote semente de trabalho. Cultura de microrganismo
a partir do lote semente primrio e que se destina a ser
utilizado na produo. Os lotes semente de trabalho so Granel final. Produto submetido a todas as fases de fabrico
distribudos em recipientes e conservados como descrito com excluso do acondicionamento final. constitudo
anteriormente para o lote semente primrio. por uma ou vrias misturas de colheitas monovalentes,
provenientes de culturas de uma ou mais espcies ou tipos
de microrganismos, aps eventual clarificao, diluio ou
Sistema de banco de clulas. Sistema em que lotes
sucessivos de um produto so fabricados a partir de culturas adio de adjuvante ou outra substncia auxiliar. tratado
de clulas que derivam do mesmo banco de clulas primrio. de forma a assegurar a sua homogeneidade e utilizado
Utiliza-se um certo nmero de recipientes do banco de para enchimento dos recipientes pertencentes a um ou a
clulas primrio para preparar o banco de clulas de vrios lotes finais.
trabalho. O sistema de banco de clulas validado no nvel
mximo de passagens que se atinge na produo de rotina. Lote final. Um conjunto de recipientes definitivos,
fechados, ou de outras unidades de dosagem, que se espera
Banco de clulas primrio. Uma cultura de clulas seja homogneo nomeadamente no que respeita ao risco
distribuda em recipientes numa nica operao, de contaminao durante o enchimento ou preparao
processados em conjunto e conservados de forma a do produto final. As unidades de dosagem so cheias ou
assegurar a uniformidade e a estabilidade e a prevenir preparadas de forma diferente, a partir do mesmo granel
a contaminao. Um banco de clulas primrio final, liofilizadas em conjunto, se for o caso, e fechadas
normalmente conservado a uma temperatura igual ou numa nica sesso contnua de trabalho. Levam um
inferior a -70C. nmero ou um cdigo de identificao que identifica o
lote final. Quando o granel final cheio e/ou liofilizado em
Banco de clulas de trabalho. Cultura de clulas derivada vrias sesses de trabalho diferentes, resultam vrios lotes
do banco de clulas primrio e destinada a ser utilizada na finais aparentados (tambm chamados sublotes ou lotes de
preparao de culturas de clulas de produo O banco de repartio) que normalmente so identificados com uma
clulas de trabalho distribudo em recipientes e processado parte comum no nmero ou cdigo de identificao.
e conservado como descrito para o banco de clulas
primrio. Vacinas combinadas. Preparao com vrios componentes,
formulada de tal forma que os vrios antignios
Cultura de clulas primrias. Cultura de clulas obtida por so administrados simultaneamente. Os diferentes
tripsinizao de um rgo ou tecido apropriado. As clulas componentes antignicos destinam-se a proteger contra
so essencialmente idnticas s do tecido animal de origem e diferentes tipos ou estirpes do mesmo microrganismo e/ou
no tm mais do que 5 passagens in vitro aps a preparao contra diferentes espcies de microrganismos. Uma vacina
inicial obtida a partir do tecido animal. combinada pode ser apresentada pelo fabricante, quer sob
a forma de uma preparao lquida nica ou liofilizada,
Linhas celulares. Cultura de clulas com elevada capacidade quer sob a forma de vrios constituintes acompanhados
de multiplicao in vitro. Nas linhas celulares diplides, as das indicaes necessrias para a mistura antes da
clulas tm essencialmente as mesmas caractersticas que as utilizao.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 673


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

5.2.2. BANDOS DE FRANGOS ISENTOS so preparadas com substratos isentos do VAP. As vacinas
inactivadas administradas a aves com menos de 7 dias podem
DE MICRORGANISMOS PATOGNICOS ser produzidas a partir de material proveniente de bandos
ESPECFICOS PARA A PRODUO sem prova de estarem isentos do VAP, com a condio de se
demonstrar que o mtodo de inactivao utilizado eficaz
E CONTROLO DA QUALIDADE DE para o VAP.
VACINAS
Quando vem especificado numa monografia, os frangos, ESTABELECIMENTO DE UM BANDO SPF
os embries e as culturas celulares utilizados na produo
e no controlo de qualidade das vacinas, so obtidos de Um bando qualificado como SPF quando provm de pintos
ovos provenientes de um bando de frangos isentos de que se demonstrou estarem isentos de microrganismos
microrganismos patognicos especficos (SPF). A qualidade patognicos de transmisso vertical cuja lista consta do
de um bando SPF assegurada por meio do sistema descrito quadro 1. Para o efeito, efectuam-se ensaios em 2 geraes
a seguir. A lista de microrganismos especificada baseia-se nos anteriores quela donde provm o bando a qualificar. O
conhecimentos actuais e ser actualizada quando for necessrio. procedimento a seguir para estabelecer e manter um bando
SPF est resumido no quadro 2. Para estabelecer um bando
Um bando definido como um grupo de aves pertencentes SPF, so efectuados uma srie de ensaios em 3 geraes
5. Textos gerais

a um ambiente comum, com um criador prprio que no de aves. Todas as aves da 1. gerao so submetidas, pelo
tenha tido nenhum contacto com bandos no SPF. Uma vez menos, uma vez antes das 20 semanas a ensaios para
definido o bando, no se junta qualquer ave no SPF. confirmar a ausncia de antignios do grupo da leucose
Coloca-se o bando em condies que reduzam ao mnimo o aviria assim como de anticorpos contra os vrus dos subtipos
risco de contaminao. Os locais onde os bandos esto instalados A, B e J da leucose aviria atravs de ensaios de doseamento
encontram-se distanciados de qualquer bando no SPF imunoenzimtico (ELISA). Alm disso, confirma-se a
exceptuando os bandos imbudos no processo de qualificao ausncia de anticorpos contra os agentes patognicos de
como SPF e colocados em locais e em condies adaptadas aos transmisso vertical cuja lista consta do quadro 1. A partir
bandos SPF. O bando SPF instalado num isolador ou num das 8 semanas de idade as aves do bando so controladas
local ventilado com ar filtrado sob presso positiva. So tomadas para se verificar a ausncia de salmonelas. O exame clnico
medidas apropriadas a fim de impedir o acesso a roedores, aves das aves do bando efectuado a partir das 8 semanas no
selvagens, insectos e ao pessoal no autorizado. revela qualquer sinal de doena infecciosa. Os mtodos a
utilizar para estes ensaios esto descritos no quadro referido
O pessoal autorizado a entrar nas instalaes no tem e explicaes suplementares so tambm fornecidas a
qualquer contacto com outras aves ou agentes susceptveis seguir na seco relativa aos controlos de rotina dos bandos
de infectar o bando. recomendado ao pessoal que tome classificados SPF. Quando as aves atingem a idade de 20
um duche e mude de roupa ou use vesturio protector para semanas, controla-se o bando conforme se descreve em
entrar na instalao controlada. Controlos de rotina dos bandos SPF.
Sempre que possvel, os produtos introduzidos no pavilho Todas as fases deste regime de controlo aplicam-se s 2
so esterilizados. Nomeadamente, recomenda-se que os geraes seguintes, com excepo dos ensaios para pesquisa
alimentos sejam submetidos a tratamento apropriado de de agentes patognicos de transmisso vertical efectuada em
modo a evitar a introduo de microrganismos indesejveis todas as aves antes da postura. Para que o bando constitudo
e a utilizar gua com qualidade pelo menos equivalente da 3. gerao possa ser qualificado SPF, todos os ensaios
gua potvel, por exemplo proveniente de um reservatrio efectuados indicam ausncia de agentes patognicos nas 3
clorado. No se administra aos animais do bando nenhum geraes.
medicamento que possa interferir com a deteco de doenas.
Admite-se a introduo nos bandos de embries SPF
Mantm-se um registo permanente da sade geral do bando provenientes de outros bandos SPF, colocados numa
e qualquer anomalia objecto de investigao. Os factores instalao separada no mesmo local. A partir da idade
a controlar compreendem a morbilidade, a mortalidade, a de 8 semanas, as aves de substituio so consideradas
condio fisica geral, o consumo de alimentos, a postura como um bando e so submetidas aos controlos descritos
diria e a qualidade dos ovos, a fertilidade e a taxa de ecloso anteriormente
dos ovos. Conservam-se os registos, pelo menos, durante
5 anos. Qualquer desvio que se constate relativamente ao
normal quanto aos parmetros do rendimento mencionados CONTROLO INICIAL A REALIZAR NAS NOVAS
ou qualquer infeco detectada so objecto de uma GERAES PROVENIENTES DE UM BANDO SPF
comunicao detalhada aos utilizadores dos ovos no mais
curto intervalo de tempo. Quando um bando de substituio exclusivamente
proveniente de um bando SPF completamente confirmado, a
Os ensaios ou a combinao de ensaios descritos a seguir tm
nova gerao submetida a ensaios antes de ser classificado
uma especificidade e uma sensibilidade conveniente para os
SPF. Alm da pesquisa de salmonelas, da vigilncia do estado
serotipos dos vrus apropriados. Tomam-se as amostras para
geral de sade e dos critrios de rendimento do bando,
o ensaio de forma aleatria.
exigem-se ensaios especficos complementares a partir das
Um resultado positivo no ensaio de pesquisa do vrus 8 semanas de idade. Estes ensaios efectuam-se em amostras
da anemia do pinto (VAP) no exclui necessariamente a de 2 populaes que representam cada uma 5 por cento do
utilizao dos produtos do bando. No entanto, as vacinas bando (no mnimo, 10 e, no mximo, 200 aves), colhidas
vivas preparadas com substratos provenientes dos bandos respectivamente com um intervalo de, pelo menos, 4
SPF e destinadas a aves com menos de 7 dias de idade, semanas entre as idades de 12-16 semanas e 16-20 semanas.

674 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

QUADRO 1

Agente infeccioso Mtodo a utilizar** Transmisso vertical Difuso rpida/lenta

Adenovrus avirios, grupo 1 AGP, ELISA sim lenta


Vrus da encefalomielite aviria AGP, ELISA sim rpida
Vrus da bronquite infecciosa aviria IH, ELISA no rpida
Vrus da laringotraquete infecciosa aviria SN, ELISA no lenta
Vrus da leucose aviria ELISA para o vrus sim lenta
SN para os anticorpos

Vrus da nefrite aviria IM no lenta


Orthoreovrus avirios IM, ELISA sim lenta
Vrus via reticuloendoteliose aviria AGP, IM, ELISA sim lenta
Vrus da anemia do pinto IM, ELISA, SN sim lenta
Vrus do sndrome da queda da postura IH, ELISA sim lenta

5. Textos gerais
Vrus da bursite aviria Serotipo 1: AGP, ELISA, SN no rpida
Serotipo 2: SN

Vrus da gripe tipo A AGP, ELISA, IH no rpida


Vrus da doena de Marek AGP no rpida
Vrus da doena de Newcastle IH, ELISA no rpida
Vrus da rinotraquete do peru ELISA no lenta
Mycoplasma gallisepticum Agl e IH para confirmar sim lenta
um resultado positivo,
ELISA, IH

Agl e IH para confirmar sim rpida


Mycoplasma synoviae um resultado positivo,
ELISA, III

Sallmonella pulloram Agl sim lenta

Agl: aglutinao. IH: inibio de hemaglutinao.

AGP: precipitao em gelose; esta tcnica apropriada se os ensaios forem efectuados semanalmente. IM: imunomarcao.

ELISA: doseamento imunoenzimtico. SN: seroneutralizao.

**Sob reserva de autorizao da Autoridade competente, pode-se utilizar outro tipo de ensaios na condio de se demonstrar que possuem uma sensibilidade,
pelo menos, igual dos mtodos mencionados e uma especificidade apropriada.

Todas as amostras so colhidas e examinadas de amostras histolgicas que sero objecto de coloraes
individualmente. Tomam-se amostras de sangue para a especficas para verificar a ausncia de contaminao
pesquisa de anticorpos e tambm amostras apropriadas para por Mycobacterium avium. A ausncia de Salmonella
a pesquisa do antignio da leucose aviria. Os mtodos de spp, pesquisa-se no contedo cecal de todas as carcaas
ensaio a utilizar so os descritos em Controlos de rotina dos disponveis, atravs de exame microbiolgico com as tcnicas
bandos SPF. A nova gerao classificada como SPF se e s anteriormente descritas. Nos casos apropriados, podem ser
se todos os ensaios confirmarem a ausncia de infeco. misturadas amostras de contedos cecais de vrias aves (no
mximo, 5).

CONTROLOS DE ROTINA DOS BANDOS SPF Pesquisa de Salmonella spp. em cultura. Efectua-se a
pesquisa de Salmonella spp. tanto a partir de amostras de
Exame geral e necrpsia. Durante toda a vida do bando, fezes ou zaragatoas da cloaca, quer a partir de amostras
efectua-se um exame clnico, pelo menos, 1 vez por semana, obtidas de zaragatoas de arrasto. No caso de ensaios
para verificar se as aves esto indemnes do vrus da varola efectuados a partir de amostras de fezes ou zaragatoas da
aviria e esto isentos de qualquer sinal de infeco. Em cloaca, convm examinar um total de 60 amostras num
casos de mortalidade superior a 0,1 por cento por semana, perodo de 4 semanas durante a vida do bando. Os ensaios
efectua-se a necrpsia de todas as carcaas disponveis podem efectuar-se com misturas de amostras (no mximo,
para verificar a ausncia de sinais de infeco. Nos casos 10). No caso de amostras de zaragatoas de arrasto, convm
apropriados, realizam-se anlises histopatolgicas e/ou examinar, no mnimo, 2 de zaragatoas de arrasto por perodos
microbiolgicas/virulgicas para confirmar o diagnstico. de 4 semanas durante toda a vida do bando. A deteco de
Efectua-se uma pesquisa especfica de leses de tipo salmonelas efectua-se atravs do pr-enriquecimento das
tuberculoso, e qualquer leso suspeita d lugar colheita amostras seguida de culturas em meio selectivo.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 675


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5.2.2. Bandos de frangos SPF para as vacinas

Pesquisa do antignio da leucose. Antes do nicio da postura, cento do efectivo (no mnimo, em 10 e, no mximo, 200)
efectuam-se exames a partir de zaragatoas da cloaca, ou de durante 4 semanas aps a ltima colheita de ovos. Durante
amostras de sangue (atravs da cultura da camada leucocitria) 4 semanas colhem-se amostras de sangue de dada ave deste
para se detectar a presena de antignio especfico de cada grupo e 1,25 por cento das aves do bando (25 por cento do
grupo da leucose. Estes exames efectuam-se em 5 por cento bando retido) so sangrados o mais tardar 4 semanas aps a
do bando (no mnimo, 10 e, no mximo, 200 aves) durante 4 ltima colheita de ovos. Pelos mtodos indicados efectua-se
semanas. Durante a postura, realizam exames ao albmen de 5 a pesquisa dos agentes de transmisso vertical (identificados
por cento (no mnimo, em 10 e, no mximo 200 aves) dos ovos no quadro 1) nas amostras de soros. Quando as amostras
durante 4 semanas. Efectuam-se por ELISA, para a pesquisa do so colhidas semanalmente, examinam-se, pelo menos, 1,25
antignio especfico de cada grupo, por tcnicas que permitem por cento das aves (25 por cento do grupo retido) durante
detectar o antignio dos subgrupos A, B e J. o perodo considerado. Outra opo possvel proceder
Pesquisa de anticorpos contra outros agentes. Durante colheita de sangue e/ou de outras amostras apropriadas em
todo o perodo de postura do bando efectua-se a pesquisa de 5 por cento do efectivo do bando, nas 4 semanas seguintes
anticorpos contra todos os agentes mencionados no quadro 1. ltima colheita de ovos e pesquisar a presena de agentes
Esta pesquisa realiza-se em 5 por cento (no mnimo, 10 e, no de transmisso vertical nas amostras atravs de tcnicas
mximo, 200 aves) do bando durante 4 semanas. Recomenda- validadas de amplificao dos cidos nucleicos. (2.6.21).
-se que a colheita de amostras seja efectuada todas as semanas
em 1,25 por cento do bando e alguns mtodos de pesquisa de
5. Textos gerais

agentes infecciosos semanalmente. O quadro 1 classifica os MEDIDAS A TOMAR NO CASO DE DETECO DE UM


agentes de acordo com a sua rapidez de difuso, distinguindo AGENTE ESPECIFICADO
os que se propagam rapidamente no seio do bando e os que se
propagam lentamente ou que no so susceptveis de infectar Se os resultados evidenciarem a presena de uma
a totalidade do bando. Para os agentes classificados como de contaminao do bando por um agente classificado no quadro
difuso lenta, examinam-se as amostras individualmente. 1 de difuso lenta, todos os produtos provenientes do bando
Nos de difuso rpida, examinam-se individualmente 20 por nas 4 semanas anteriores so considerados no conformes.
cento das amostras colhidas durante 4 semanas, a no ser Igualmente, se os resultados evidenciarem a presena de uma
que se proceda por seroneutralizao ou ELISA, casos em que contaminao do bando por um agente classificado no quadro
todas as amostras podem ser examinadas individualmente 1 de difuso rpida, todos os produtos provenientes do bando
ou sob a forma de misturas preparadas a partir de 5 amostras nas 2 semanas anteriores data em que a amostra positiva
individuais colhidas na mesma altura. foi colhida so considerados no conformes. Se os produtos
No quadro 1 indicam-se os mtodos apropriados de pesquisa. tiverem sido utilizados para produo ou para controlo, os
Sob reserva de autorizao da Autoridade competente, podem produtos para os quais obrigatria a utilizao de ovos
ser utilizados outros tipos de ensaios com a condio de se ter SPF so considerados no satisfatrios e so rejeitados e os
demonstrado que possuem uma sensibilidade, pelo menos, controlos efectuados no so vlidos.
igual dos mtodos citados e uma especificidade apropriada. Logo aps a descoberta da existncia de uma contaminao,
os produtores notificam todos os utilizadores dos ovos.
ENSAIO A EFECTUAR NO FINAL DO PERODO DE POSTURA Um bando no qual foi detectada e confirmada uma
contaminao no pode reassumir o estatuto SPF. A
A seguir ltima colheita de ovos, efectua-se um controlo totalidade da descendncia proveniente deste bando a contar
final para se confirmar a ausncia dos agentes de transmisso das 4 semanas anteriores colheita da ltima amostra
vertical mencionados no quadro 1. Para este retm-se 5 por negativa, excluda do estatuto SPF.

QUADRO 2 Representao esquemtica do processo de estabelecimentos e manuteno dos bandos SPF

NOVO BANDO Estabelecimento da ausncia de agentes de transmisso vertical


Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
2. GERAO Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
3. GERAO Pesquisa de antignio e de anticorpos da leucose aviria em todas as aves antes das 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
BANDO QUALIFICADO COMO SPF SE SATISFAZ TODOS OS ENSAIOS
3. GERAO Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
Ensaio aps a postura para estabelecer a ausncia de agentes de transmisso vertical
GERAES SEGUINTES Pesquisa de antignio da leucose aviria e de anticorpos contra agentes especficos em 2 amostras
representando cada uma 5 por cento do bando, entre as 12 e as 20 semanas
Pesquisa de Salmonella spp. e observao clnica geral a partir das 8 semanas de idade
Ensaios de rotina para pesquisa de agentes especficos a partir das 20 semanas
Ensaio aps a postura para estabelecer a ausncia de agentes de transmisso vertical

676 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

5.2.3. SUBSTRATOS CELULARES respeitantes utilizao das linhas celulares e aplicao dos
mtodos de ensaio.
UTILIZADOS NA PREPARAO DE
Quando uma vacina produzida com clulas primrias, ou
VACINAS PARA USO HUMANO clulas que foram submetidas apenas a uma pequeno nmero
de passagens, sem constituio de um banco de clulas, as
O presente captulo geral trata das linhas celulares diplides exigncias aplicveis vacina constam da monografia especfica.
e das linhas celulares contnuas utilizadas na preparao de
vacinas para uso humano; os aspectos especficos das vacinas
preparadas com a tecnologia do ADN recombinante so Linhas celulares diplides. Uma linha celular diplide possui
tratados na monografia Produtos obtidos pela tecnologia uma capacidade elevada mas definida de multiplicao in vitro.
do ADN recombinante. O quadro 1 fornece uma lista de
ensaios a efectuar nas diferentes etapas (clulas semente, Linhas celulares contnuas. Uma linha celular contnua
banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho, possui uma capacidade ilimitada de multiplicao in vitro;
clulas pertencentes ao nvel de duplicao da populao, muitas vezes as clulas apresentam diferenas de cariotipo
pelo menos, igual ao nvel mximo que ir ser utilizado com as clulas de origem; podem ser obtidas a partir de um
na produo). Descrevem-se a seguir as disposies gerais tecido saudvel ou de um tecido tumoral.

5. Textos gerais
QUADRO 1 Ensaios efectuados nas linhas celulares

Banco Banco Clulas do nvel de duplicao


Ensaio Clulas de clulas de clulas de populao pelo menos igual
semente primrio de trabalho ao nvel mximo que ir ser
(BCP) (BCT) utilizado na produo

1. IDENTIDADE E PUREZA

Morfologia

Seleco apropriada entre os seguintes


ensaios: bioqumicos (por ex.
isoenzimas), imunolgicos (por ex.
histocompatibilidade), marcadores
citogenticos, impresso genmica

Cariotipo (linhas celulares diplides) (1) (1)


Longevidade das clulas (linhas
celulares diplides) 2. AGENTES ESTRANHOS

Contaminao bacteriana e fngica

Micoplasmas

Ensaio em culturas celulares

Co-cultura (2) (2)

Ensaios em animais e em ovos (2) (2)

Pesquisa especfica de potenciais (2) (2)


contaminantes de acordo com a origem
das clulas (ver a seguir em Agentes
contaminantes infecciosos)

Retrovrus (3) (3)

3. PODER TUMORGENO

Poder tumorgeno (4)

(1)A caracterstica diplide demonstra-se para cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos,
igual ao nvel mximo que ir ser utilizado para a produo.
(2)Ensaio efectuado em cada banco de clulas de trabalho utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que
ir ser utilizado para a produo.
(3)Ensaio efectuado em cada banco de clulas primrias utilizando-se as clulas com nvel de duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo que
ir ser utilizado para a produo.
(4)
As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder tumorgeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno. Os
ensaios de poder tumorgeno j no so realizados em linhas celulares com poder tumorgeno conhecido ou previsto.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 677


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5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

No caso de vacinas injectveis preparadas com uma linha (1) identidade (por exemplo, isoenzimas, serologia, impresso
celular contnua, o procedimento de purificao validado genmica),
para se demonstrar a reduo da concentrao de ADN das
(2) caractersticas de crescimento e propriedades
clulas do substrato at um nvel equivalente, no mximo, a 10
morfolgicas (microscopia ptica e electrnica),
ng por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio.
(3) cariotipo das linhas celulares diplides,
Sistema de banco de clulas. A produo de vacinas em (4) longevidade in vitro das linhas celulares diplides, em
linhas celulares contnuas ou em linhas celulares diplides termos do nvel de duplicao da populao
baseia-se num sistema de banco de clulas. A idade in vitro
das clulas contada a partir do lote semente primrio.
Estabilidade dos substratos celulares. Demonstra-se que a
Cada banco de clulas de trabalho preparado a partir de
linha celular tem uma viabilidade apropriada nas condies
1 ou vrios recipientes do banco de clulas primrio. A
previstas para a sua conservao. Para cada produto
utilizao, a identidade e o inventrio dos recipientes so
preparado com a linha celular, necessrio demonstrar que
minuciosamente registados. pode ser obtida uma produo reprodutvel com as clulas
pertencentes aos nveis de passagens situadas entre o incio e
Meios e substncias de origem humana ou animal. A o fim da durao prevista de utilizao.
composio dos meios utilizados para o isolamento e para
5. Textos gerais

o conjunto das culturas posteriores minuciosamente Agentes contaminantes infecciosos. As linhas celulares
registado; se so utilizadas substncias de origem humana ou utilizadas para a produo de vacinas esto isentas de agentes
animal, elas esto isentas de agentes estranhos. infecciosos. As pesquisas de agentes contaminantes efectuam-
Se for utilizada albumina humana, ela est em conformidade -se como indicado no quadro.
com a monografia Soluo de albumina humana. Atravs Consoante a origem e a histria da linha celular, pode ser
de ensaios apropriados, demonstra-se que os soros de origem necessria a pesquisa de alguns potenciais contaminantes
bovina utilizados para a preparao e manuteno das culturas especficos, nomeadamente aqueles que reconhecidamente
celulares so estreis e isentos de vrus bovinos, nomeadamente constituem agentes infecciosos latentes da espcie de origem
do vrus da diarreia bovina assim como de micoplasmas. (por exemplo, o vrus smio 40 para o macaco rhesus). No caso
Efectuam-se ensaios apropriados na tripsina utilizada de linhas celulares provenientes de roedores, so efectuados
para a preparao das culturas celulares para demonstrar ensaios para a produo de anticorpos no murganho, no rato e
a esterilidade e a ausncia de micoplasmas e de vrus, no hamster para detectar eventuais vrus especficos da espcie.
nomeadamente de pestivrus e parvovrus. Pesquisam-se retrovrus nas linhas celulares como se
descreve adiante. Se for detectada a presena de retrovrus
Clulas semente. Os dados na base dos quais avaliada a capazes de se replicarem, a linha celular no aceitvel para
aceitabilidade das clulas semente compreendem, sempre que a produo de vacinas.
possvel, a origem, a histria e a caracterizao.
Origem das clulas semente. Para as linhas celulares Poder tumorgeno. Para a preparao de vacinas vivas, a linha
humanas, o dossier contm as seguintes informaes celular no possui poder tumorgeno ao nvel de duplicao
do dador: origem tnica e geogrfica, idade, sexo, estado da populao utilizada na produo.
fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado, resultados da Se a linha celular com poder tumorgeno for utilizada
eventual pesquisa de agentes patognicos. na preparao de outras vacinas, valida-se o sistema de
Para as linhas celulares animais, o dossier contm as purificao a fim de demonstrar que a concentrao de ADN
seguintes informaes da origem das clulas: espcie, proveniente das clulas equivalente, no mximo, a 10 ng
linhagem, condies de explorao, origem geogrfica, idade, por dose humana unitria, salvo indicao em contrrio, e
sexo, estado fisiolgico geral, tecido ou rgo utilizado, que a concentrao em protenas provenientes das clulas do
resultados da eventual pesquisa de agentes patognicos. substrato reduzida at um limite aceitvel.

As clulas de origem neural (por exemplo, os neuroblastomas Se a linha celular possuir um reconhecido poder tumorgeno,
no necessrio proceder a ensaios de poder tumorgeno.
e as clulas P12) podem conter substncias que concentrem
Se o potencial poder tumorgeno de uma linha celular for
os agentes das encefalopatias espongiformes; estas clulas
desconhecido, a linha celular considerada como tumorgena,
no so utilizadas na produo de vacinas.
ou submetida a um ensaio de poder tumorgeno in vitro como
Histria das clulas semente. O dossier contm as seguintes adiante se descreve; se os resultados do ensaio in vitro forem
informaes: mtodo utilizado para isolar as clulas semente, negativos ou se no forem claramente positivos, a linha celular
os mtodos de cultura e qualquer outro procedimento ser objecto de um ensaio in vivo como adiante se descreve.
utilizado para estabelecer o banco de clulas primrio, Os ensaios so efectuados em clulas pertencentes ao nvel de
nomeadamente aqueles susceptveis de provocar uma duplicao da populao, pelo menos, igual ao nvel mximo
exposio das clulas a agentes estranhos. que ir ser utilizado na produo. As linhas celulares MRC-5,
WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas como no possuindo poder
As informaes disponveis sobre os ingredientes dos meios tumorgeno e no necessitam do ensaio de poder tumorgeno.
de cultura das clulas, por exemplo a provenincia das
substncias de origem animal, so muitas vezes incompletas;
em casos justificados e autorizados, os bancos de clulas j Caracterizao genmica. Demonstra-se a diploidia
estabelecidos com esses meios podem ser utilizados para a das linhas celulares diplides; se no estiver validada a
produo de vacinas. eliminao de clulas intactas durante o tratamento aps
a colheita, necessrio efectuar uma caracterizao mais
Caracterizao das clulas semente. A caracterizao das aprofundada pela anlise do cariotipo. So examinadas
clulas semente assenta nos seguintes aspectos: amostras provenientes de 4 nveis de passagens regularmente

678 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.3. Substratos celulares utilizados na preparao de vacinas para uso humano

distribudas pelo perodo de vida da linha celular. Cada recm-nascidos, por via subcutnea) 107 clulas viveis
exame incide em, pelo menos, 200 clulas em metafase, para igualmente repartidas entre os animais do grupo:
se verificar o nmero exacto de cromossomas e avaliar a
(1) 2 ninhadas com, pelo menos, 10 murganhos recm-
frequncia de hiperploidia, de hipoploidia, de poliploidia, de
-nascidos com menos de 24 horas de idade,
fracturas e de anomalias estruturais.
(2) 10 murganhos adultos.
As linhas celulares MRC-5, WI-38 e FRhL-2 so reconhecidas
como sendo diplides e bem caracterizadas; desde que no Injecte por via intracerebral em cada um dos 10 murganhos
tenham sido geneticamente modificadas, no necessrio adultos 106 clulas viveis para deteco da eventual presena
efectuar uma caracterizao mais aprofundada. do vrus da coriomeningite linfocitria.
Mantenha os animais em observao durante, pelo menos, 4
MTODOS DE ENSAIO APLICVEIS S CULTURAS semanas. Examine os animais que apresentam sintomas de
CELULARES doena ou anomalia para determinar a sua causa. As clulas
satisfazem ao ensaio se no se observarem sinais de presena
Identificao. A identidade das clulas estabelece-se com de agentes estranhos. O ensaio s vlido se, pelo menos,
base na impresso genmica e numa escolha apropriada dos 80 por cento dos animais de cada grupo permanecem de boa
seguintes aspectos: sade e sobrevivem at ao final do perodo de observao.
No caso de clulas de roedores (por exemplo clulas ovricas

5. Textos gerais
(1) caractersticas bioqumicas (anlise dos isoenzimas),
de hamster chins ou clulas renais de hamster recm-
(2) caractersticas imunolgicas (antignios de -nascido), efectue, nos animais aos quais as clulas foram
histocompatibilidade), injectadas, uma pesquisa de anticorpos contra potencias
(3) marcadores citogenticos. contaminantes vricos para a espcie.

Clulas contaminantes. As impresses genmicas efectuadas Ensaios em ovos. Injecte, pelo menos, 106 clulas viveis
com finalidade de identificao servem igualmente para na cavidade alantide de cada um de 10 ovos de galinha SPF
demonstrar a ausncia de clulas contaminantes. (5.2.2) com 9 a 11 dias idade, e no saco vitelino de 10 ovos de
galinha SPF (5.2.2) com 5 a 6 dias idade. Incube-os durante,
pelo menos, 5 dias. Proceda pesquisa de hemaglutininas
Contaminao bacteriana e fngica. O banco de clulas nos lquidos alantides, com eritrcitos mamferos e avirios;
primrio e o banco de clulas de trabalho satisfazem ao efectue o ensaio a temperaturas de 5 3C e 20-25C e
ensaio de esterilidade (2.6.1), efectuado para cada meio em proceda leitura dos resultados decorridos 30 a 60 min. As
10 ml do sobrenadante das culturas celulares e em 1 por clulas satisfazem ao ensaio se no se observar qualquer sinal
cento dos recipientes, com o mnimo de 2 recipientes. da presena de agentes estranhos. O ensaio s vlido se,
pelo menos, 80 por cento dos embries permanecem sos e
Micoplasmas (2.6.7). O banco de clulas primrio e o banco sobrevivem at ao final do perodo de observao.
de clulas de trabalho satisfazem ao ensaio dos micoplasmas,
efectuado em 1 ou vrios recipientes pelo mtodo cultural e Ensaio de poder tumorgeno in vitro. Podem ser utilizados
pelo mtodo de epifluorescncia em culturas celulares. os seguintes ensaios:
(1) formao de colnias em gelose mole,
Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares.
As clulas satisfazem ao ensaio dos vrus hemadsorventes e aos (2) produo de crescimento celular invasivo aps inoculao
ensaios de pesquisa dos agentes estranhos em culturas celulares em culturas de rgos,
que esto descritos no capitulo 2.6.16 em Culturas celulares de
(3) estudo da actividade de transformao atravs, por
produo: clulas testemunhas. Se as clulas so de smio, so
exemplo, do sistema de prova 3T3 que pe em evidncia a
tambm inoculadas em culturas de clulas renais de coelho para
presena de oncogenes activos.
pesquisa do herpesvrus B (herpesvrus 1 de cercopiteco).

Ensaio de poder tumorgeno in vivo. O ensaio consiste em


Co-cultura. Co-cultive separadamente clulas intactas e
estabelecer uma comparao entre a linha celular contnua
clulas lisadas com outros sistemas celulares compreendendo
e uma testemunha positiva apropriada (por exemplo, clulas
clulas humanas e clulas de smio. Pesquise a apario de
HeLa ou Hep2).
eventuais alteraes morfolgicas. Efectue a pesquisa de
agentes hemaglutinantes nos lquidos de cultura. As clulas So apropriados os seguintes sistemas animais:
satisfazem ao ensaio se no houver qualquer indicao da
presena de agente estranho. (1) murganhos atmicos (genotipo Nu/Nu),
(2) murganhos, ratos ou hamsters recm-nascidos tratados
Retrovrus. Pesquise a eventual presena de retrovrus: com soro ou com globulina antitimocitria,
(1) atravs de ensaio de infectividade, (3) murganhos timectomizados e irradiados que foram
reconstitudos T-, B+) com medula ssea de murganhos sos.
(2) por microscopia electrnica de transmisso,
Qualquer que seja o sistema animal escolhido, a linha celular
(3) se os ensaios (1) e (2) derem resultados negativos, e as clulas de referncia so injectadas em grupos distintos
pela pesquisa da transcriptase inversa (em presena do de 10 animais cada um. Em ambos os casos, o inculo por
magnsio e do mangansio) realizada nos depsitos animal de 107 clulas em suspenso num volume de 0,2 ml
obtidos por centrifugao a alta velocidade. e a injeco pode ser por via intramuscular ou subcutnea. Se
se utiliza animais recm-nascidos, estes so tratados com
Ensaio em animais. A cada grupo dos seguintes animais, 0,1 ml de soro ou globulina antitimocitria nos dias 0, 2,
injecte por via intramuscular (ou no caso de murganhos 7 e 14 aps o nascimento. So considerados soros ou as

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 679


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5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

globulinas activos aqueles que suprimem os mecanismos temperatura igual ou inferior a -70C. No so utilizadas na
imunitrios dos animais em crescimento ao ponto de a produo de vacinas clulas que tenham sido submetidas a
inoculao das 107 clulas de referncia positivas produzirem um nmero de passagens superior a 20 a partir do banco de
regularmente tumores e metstases. Se os animais forem clulas primrio. Quando se utilizam culturas de clulas em
severamente afectados e apresentarem sem ambiguidades suspenso, um aumento do nmero de clulas correspondente
tumores de crescimento progressivo, sacrifique-os antes do a trs duplicaes da populao equivale aproximadamente a
final do ensaio para evitar sofrimento intil. uma passagem. Se as clulas utilizadas na produo tiverem
No final do perodo de observao, sacrifique e examine todos sido submetidas a um nmero de passagens superior a 20,
os animais, incluindo os grupos testemunhas; pesquise, no demonstra-se, por validao ou atravs de novos ensaios,
local de injeco e noutros rgos por exemplo, os gnglios que as clulas de produo so sensivelmente idnticas s
linfticos, os pulmes, os rins e o fgado), sinais macroscpicos clulas do banco de clulas primrio no que diz respeito s
e microscpicos de proliferao das clulas inoculadas. caractersticas biolgicas e pureza, e que a sua utilizao no
tem efeitos prejudiciais na produo da vacina.
Em todos os casos, examine os animais em intervalos
regulares procedendo palpao para detectar a formao conhecida com detalhe e registada por escrito a histria da
eventual de ndulos nos locais de injeco. Mea os ndulos linha celular (por exemplo, origem, nmero de passagens e o
em 2 direces perpendiculares e registe regularmente meio utilizado na multiplicao, condies de conservao).
os resultados das medies para determinar se so de
Fica registada uma descrio dos mtodos de conservao
5. Textos gerais

crescimento progressivo. Se alguns animais apresentarem,


durante a observao, ndulos com sinais de regresso, e de utilizao das clulas, incluindo pormenores que
sacrifique-os antes que os ndulos no sejam detectveis permitam assegurar que durante a produo o nmero de
palpao e proceda a um examine histolgico. Observe os passagens permitidas no ultrapassado.
animais que apresentam ndulos em crescimento progressivo
Conservam-se, para fins analticos, quantidades suficientes do
durante 1-2 semanas. Nos animais que no apresentam
formao de ndulos, metade so observados durante 3 banco de clulas primrio e de cada banco de clulas de trabalho.
semanas e a outra metade durante 12 semanas, antes de Os ensaios descritos a seguir so efectuados em culturas
serem sacrificados para se proceder observao histolgica. do banco de clulas primrio e do banco de clulas de
Efectue uma necrpsia em cada animal, para pesquisa trabalho ou em clulas do banco de clulas de trabalho com
no local de injeco e em outros rgos (por exemplo, o nmero mximo de passagens admitido para a produo e
gnglios linfticos, pulmes, crebro, bao, rins, fgado), provenientes de uma amostra homognea e representativa.
nomeadamente sinais macroscpicos de formao tumoral. Demonstra-se a representatividade da amostra.
Proceda ao exame histolgico de todas as leses com
QUADRO 2 Fases das culturas celulares em que os ensaios
aparncia tumoral e do local de injeco. Alm disso,
so efectuados
dado que algumas linhas celulares podem dar metstases
sem manifestao de crescimento tumoral local, proceda Banco de Banco de Clulas do banco
sistematicamente em todos os animais, ao exame histolgico clulas clulas de clulas de
dos gnglios linfticos regionais detectveis e dos pulmes. primrio de trabalho trabalho com o
nmero mximo
O ensaio s vlido se, pelo menos, 9 dos 10 animais de passagens
inoculados com clulas de referncia positivas apresentarem Microscopia geral + + +
tumores de crescimento progressivo. Bactrias e fungos + +
Micoplasmas + +
Vrus + +
5.2.4. CULTURAS CELULARES Identificao da espcie + +
Anlise cariotpica + +
UTILIZADAS NA PREPARAO Poder tumorgeno +
DE VACINAS PARA USO VETERINRIO
As culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete
para uso veterinrio satisfazem s exigncias descritas nesta celular antes e depois da colorao histolgica. Regista-se,
seco. Pode tambm ser necessrio que as culturas celulares se possvel sob a forma numrica, a informao relativa
utilizadas no controlo das vacinas satisfaam todas ou especialmente velocidade e taxa de crescimento.
algumas destas exigncias. igualmente indicada a presena ou ausncia de inibio por
contacto, de clulas plurinucleadas ou de qualquer outra
Para a maioria dos vrus dos mamferos possvel a sua anomalia celular.
multiplicao em clulas de linha celulares, no sendo por
isso aceite a utilizao de clulas primrias.
Anlise cariotpica. Efectua-se um exame cromossmico
As clulas cronicamenie infectadas utilizadas na preparao em, pelo menos, 50 clulas em mitose do banco de clulas
de vacinas veterinrias satisfazem s exigncias que lhes so primrio e da passagem mxima admitida para a produo.
aplicveis descritas a seguir. Demonstra-se que as clulas se Qualquer marcador cariotpico presente nas clulas do banco
encontram infectadas apenas com o agente indicado.
de clulas primrio encontrado nas clulas com o nmero
mximo de passagens. O nmero de cromossomas (valor
LINHAS CELULARES modal) nas clulas da passagem mxima no superior a
15 por cento do valor obtido no banco de clulas primrio.
As linhas celulares utilizadas na produo so normalmente Os cariotipos so idnticos. Se o nmero de cromossomas
obtidas atravs de um sistema de banco de clulas. Cada banco for superior ao valor declarado, se alguns marcadores
de clulas primrio identificado com um cdigo especfico. cariotpicos no forem encontrados nas clulas do banco
O banco de clulas primrio conservado em alquotas a uma de clulas de trabalho com o nmero mximo de passagens

680 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

utilizado na produo, ou se os cariotipos forem diferentes, a o produto se destina. Para poder efectuar os ensaios de
linha celular no utilizada no fabrico de vacinas. deteco de vrus especficos prepare, em suportes adequados,
um nmero suficiente de clulas. includo em cada ensaio
Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo validado, um nmero apropriado de controlos positivos. Os ensaios
que as clulas do banco de clulas primrio e do banco de clulas realizam-se, por exemplo, com anticorpos conjugados com
de trabalho com o nmero mximo de passagens utilizado na fluorescena ou reagentes similares.
produo pertencem espcie indicada pelo fabricante.
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha de
o soro especfico da espcie de origem das clulas e se tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos,
verifica que todas as clulas apresentam fluorescncia, no 140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes
necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares.
detectar contaminao com clulas de outras espcies. Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas
com uma confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos
seguintes tipos:
Contaminao bacteriana e fngica. As clulas satisfazem
ao ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas clulas primrias da espcie de origem,
contm, pelo menos, o nmero de clulas de um tapete
celular com uma rea de 70 cm2 e para clulas em suspenso clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo
da vacina,

5. Textos gerais
aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se
realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante, clulas sensveis aos pestivrus.
pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pela
menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao
Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos
como se descreveu anteriormente e inocule em culturas
micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas
frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente
em cultura durante. pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube
as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so
Ausncia de vrus contaminantes. Por tcnicas apropriadas, examinadas regularmente para se detectar a presena de
e pelos ensaios descritos a seguir, verifica-se a ausncia de qualquer efeito citopatognico devido a microrganismos vivos.
qualquer contaminao por vrus.
Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so
Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo menos, submetidas ao seguinte controlo:
70 cm2, so preparados e mantidos em cultura no mesmo meio
(incluindo aditivos) e nas mesmas condies que as clulas verificao da ausncia de microrganismos
utilizadas na preparao da vacina. Os tapetes celulares so citopatognicos ou hemadsorventes pelos mtodos
mantidos em cultura, pelo menos, durante 28 dias no total. As anteriormente indicados,
subculturas realizam-se com intervalos de 7 dias, a no ser que
verificao da ausncia de pestivrus ou outros
seja impossvel manter as clulas com vida durante tanto tempo.
Neste caso, convm realizar as subculturas com intervalos contaminantes especficos por imunofluorescncia
inferiores, mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas ou outros mtodos validados (Deteco de vrus
que se obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados, especficos).
suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir.
Poder tumorgeno. Se necessrio, efectuam-se ensaios para
Os tapetes celulares so examinados regularmente durante
avaliar o risco potencial da linha celular para as espcies alvo.
o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos
citopatognicos e, no final do perodo de observao,
so submetidos aos ensaios para pesquisa de vrus CLULAS PRIMRIAS
citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos,
estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por
A utilizao de clulas primrias como substrato de fabrico
qualquer outro mtodo apropriado a seguir indicado.
de vacinas destinadas aos mamferos no na maior parte
dos casos aceite, uma vez que se podem utilizar linhas
Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante celulares. Na entanto, se no houver alternativa utilizao
apropriado, a colorao citolgica a 2 tapetes celulares com, pelo de clulas primrias, estas provm de exploraes ou de
menos, 6 cm2 cada um. Examine toda a superfcie dos tapetes bandos isentos de microrganismos patognicos especficos,
celulares corados e verifique a presena eventual de corpos de completamente protegidos contra a introduo de doenas
incluso, de clulas gigantes em nmero anormalmente elevado (barreiras sanitrias, filtros nas entradas de ar, sistema
ou de qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que apropriado de quarentena antes da introduo de animais).
possam ser atribudas a um agente contaminante. No caso de se tratar de bandos de frangos, estes satisfazem
as exigncias prescritas em Bandos de Frangos Isentos de
Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com Microrganismos Patognicos Especficos para a Produo e
uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma o Controlo da Qualidade de Vacinas (5.2.2). No caso de se
rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de tratar de outros animais, demonstra-se que a explorao se
hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a encontra isenta de microrganismos patognicos especficos.
superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos Tambm os reprodutores da explorao de onde se obtm
de incubao, verifique a presena de hemadsoro. as clulas primrias destinadas ao fabrico de vacinas
so submetidos a controlos que incluiem, pelo menos,
Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios 2 exames serolgicos de rotina por ano e, entre estes, 2
apropriados a ausncia de contaminantes especficos da exames serolgicos suplementares em 15 por cento dos
espcie de origem da linha celular e das espcies s quais reprodutores.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 681


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5.2.4. Culturas celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso veterinrio

Particularmente no caso de clulas de mamferos, conveniente manter as clulas com vida durante tanto tempo. Neste caso,
utilizar, sempre que possvel, um sistema de lote semente convm realizar as subculturas com intervalos inferiores,
que compreenda, por exemplo, um banco de clulas primrio mas to longos quanto possvel. O nmero de clulas que se
submetido a menos de 5 passagens e um banco de clulas de obtm na ltima subcultura, em recipientes apropriados,
trabalho que no tenha sido submetido a mais do que 5 passagens suficiente para se efectuarem os ensaios descritos a seguir.
a partir da suspenso celular inicial obtida dos tecidos animais.
Os tapetes celulares so examinados regularmente durante
O banco de clulas primrio, banco de clulas de trabalho e o perodo de incubao para se detectar eventuais efeitos
as clulas com o nmero mximo de passagens utilizado na citopatognicos e, no final do perodo de observao,
produo so submetidos aos ensaios indicados no quadro 3 so submetidos aos ensaios para pesquisa de vrus
de acordo com os mtodos descritos a seguir. A amostra cobre citopatognicos, vrus hemadsorventes e vrus especficos,
todo o tipo de clulas utilizadas no fabrico da lote. Nenhum estes ltimos efectuados por imunofluorescncia ou por
lote de vacina produzida com estas clulas pode ser libertado qualquer outro mtodo apropriado como se indica a seguir.
se algum dos ensaios no der resultados satisfatrios.
QUADRO 3 Fases das culturas de clulas primrias em Deteco de vrus citopatognicos. Efectue, com um corante
que os ensaios so efectuados apropriado, a colorao citolgica de 2 tapetes celulares com,
pelo menos, 6 cm2 cada um.
Banco de Banco de Nvel mximo
Examine toda a superfcie dos tapetes celulares corados
5. Textos gerais

clulas clulas de passagens


primrio de trabalho e verifique a presena eventual de corpos de incluso, de
Microscopia geral + + + clulas gigantes em nmero anormalmente elevado ou de
Bactrias e fungos + + qualquer outra leso indicativa de anomalias celulares que
Micoplasmas + + possam ser imputadas a um agente contaminante.
Vrus + +
Identificao da espcie + Deteco de vrus hemadsorventes. Lave vrias vezes, com
uma soluo tampo apropriada, tapetes celulares com uma
rea total de 70 cm2. Adicione uma suspenso apropriada de
Caractersticas das culturas. Descreve-se o aspecto do tapete hemcias em volume suficiente para cobrir uniformemente a
celular antes e depois da colorao histolgica. Registam-se, superfcie dos tapetes celulares. Decorridos diferentes tempos
se possvel sob a forma numrica, informaes relativas de incubao, verifique a presena de hemadsoro.
especialmente velocidade e taxa de crescimento. Indica-se
igualmente a presena ou ausncia de inibio por contacto, de
Deteco de vrus especficos. Verifique atravs de ensaios
clulas plurinucleadas ou de qualquer outra anomalia celular.
apropriados a ausncia de contaminantes especficos da espcie
de origem da linha celular e das espcies alvo do produto.
Identificao da espcie. Demonstra-se, por um mtodo
validado, que as clulas do banco de clulas primrio Para poder efectuar os ensaios de deteco de vrus especficos,
pertencem espcie indicada. prepare, em suportes adequados, um nmero suficiente de
clulas includo em cada ensaio um nmero apropriado de
Quando se efectua um ensaio de imunofluorescncia com o controlos positivos. Os ensaios realizam-se, por exemplo, com
soro especfico da espcie de origem das clulas e se verifica anticorpos conjugados com fluorescena ou reagentes similares.
que todas as clulas examinadas apresentam fluorescncia, no
necessrio realizar outros ensaios com reagentes capazes de
detectar contaminao com clulas de outras espcies. Ensaios efectuados noutras culturas celulares. Disponha
tapetes celulares com uma superfcie total de, pelo menos,
140 cm2. Congele e descongele as clulas pelo menos 3 vezes
Esterilidade bacteriana e fngica. As clulas satisfazem ao e a seguir elimine por centrifugao os fragmentos celulares.
ensaio de esterilidade (2.6.1). A amostra de clulas contm, Inocule partes alquotas do lquido obtido, em clulas com uma
pelo menos, o nmero de clulas de um tapete celular confluncia inferior ou igual a 70 por cento, dos seguintes tipos:
com uma rea de 70 cm2 ou, para as clulas em suspenso,
aproximadamente o mesmo nmero de clulas. Antes de se clulas primrias da espcie de origem,
realizar o ensaio, as clulas so mantidas em cultura durante,
clulas sensveis aos vrus patognicos para as espcies alvo
pelo menos, 15 dias, sem antibiticos.
da vacina,

Micoplasmas (2.6.7). As clulas satisfazem ao ensaio dos clulas sensveis aos pestivrus.
micoplasmas. Antes de se realizar o ensaio, as clulas so mantidas Mantenha as clulas inoculadas em cultura durante, pelo
em cultura durante, pelo menos, 15 dias, sem antibiticos. menos, 7 dias, prepare os extractos congelao-descongelao
como se descreveu anteriormente, e inocule em culturas
Ausncia de vrus contaminantes. Pelos ensaios descritos a frescas de clulas do mesmo tipo numa quantidade suficiente
seguir, verifica-se a ausncia de qualquer contaminao por vrus. que permita realizar os ensaios descritos a seguir. Incube
as clulas durante, pelo menos, mais 7 dias. As culturas so
Os tapetes celulares examinados tm uma rea de, pelo examinadas regularmente para se detectar a presena de
menos, 70 cm2 e so preparados e mantidos em cultura no qualquer efeito citopatognico devido a microrganismos vivos.
mesmo meio (incluindo aditivos) e nas mesmas condies Ao fim do perodo de 14 dias, as clulas inoculadas so
que as clulas utilizadas na preparao da vacina. submetidas ao seguinte controlo:
Os tapetes celulares so mantidos em cultura, pelo menos, verificao da ausncia de microrganismos citopatognicos
durante 28 dias no total ou durante o perodo mais longo ou hemadsorventes pelos mtodos anteriormente indicados,
possvel, se 28 dias for impossvel. As subculturas realizam-
-se com intervalos de 7 dias, a no ser que seja impossvel verificao da ausncia de pestivrus ou de outros

682 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas e soros para uso veterinrio

contaminantes especficos, por imunofluorescncia foram sujeitos a um processo de inactivao validado.


ou outros mtodos validados (ver Deteco de vrus
especficos). Inactivao. O processo de inactivao escolhido capaz
de reduzir o ttulo de pelo menos 106 de certos potenciais
contaminantes na substncia considerada. Se no se puder
5.2.5. SUBSTNCIAS DE ORIGEM demonstrar experimentalmente esta reduo de ttulo, so
ANIMAL UTILIZADAS NA PREPARAO feitos estudos de cintica no processo de inactivao, que do
resultados satisfatrios tendo em conta o nvel mais provvel
DE VACINAS PARA USO VETERINRIO de contaminao.

No fabrico de medicamentos veterinrios imunolgicos A lista dos contaminantes potenciais para os quais se torna
podem ser utilizadas substncias de origem animal (por necessrio demonstrar a eficcia do mtodo de inactivao
exemplo, soro, tripsina e albumina srica), como ingredientes estabelecida em funo da espcie animal de origem da
dos meios de cultura ou como constituintes das vacinas ou substncia. A demonstrao da eficcia do mtodo, que
dos diluentes. Recomenda-se que a sua utilizao seja tanto tem em linha de conta cada situao particular, pode ter a
quanto possvel reduzida. forma de referncias a literatura publicada ou de resultados
experimentais produzidos pelo fabricante.
Colocam-se algumas restries utilizao de substncias de

5. Textos gerais
origem animal com o objectivo de minimizar o risco associado
eventual presena de agentes patognicos nessas substncias. Ensaio. Quando a amostra se apresenta na forma slida,
convm, para verificar a ausncia de contaminantes, dissolv-
A utilizao de substncias de origem animal como -la ou suspend-la num lquido apropriado de maneira a obter
constituintes das vacinas ou diluentes no em geral uma soluo ou uma suspenso com uma concentrao pelo
aceite, a no ser que sejam esterilizados por um mtodo menos igual a 300 g/l. Se a amostra for insolvel, ou tiver uma
validado apropriado. Quando a sua utilizao se revelar aco citotxica, utilizada uma concentrao mais baixa.
indispensvel e a esterilizao seja impossvel, so aplicados
os critrios indicados em Exigncias. Qualquer lote em que se revele a existncia de
microrganismos vivos de qualquer espcie no satisfaz,
As substncias de origem animal utilizadas durante o sendo rejeitado ou novamente processado e demonstrado
fabrico so esterilizadas ou inactivadas por um mtodo satisfatrio.
validado apropriado ou submetidas a um ensaio para
deteco de agentes estranhos como se descreve em Ausncia de contaminao vrica. A soluo (suspenso)
Exigncias. No caso de vacinas inactivadas, o mtodo da substncia slida ou da substncia lquida no diluda
utilizado para a inactivao da estirpe da vacina submetida a um ensaio para pesquisa de contaminantes
igualmente validado para a inactivao de eventuais por mtodos suficientemente sensveis. Os mtodos
contaminantes das substncias de origem animal. utilizados compreendem ensaios em culturas de clulas
suficientemente sensveis e incluem clulas primrias
Alm das restries descritas a seguir, os fabricantes aplicam provenientes da mesma espcie da amostra. Uma parte das
restries relativas manipulao de substncias de origem clulas submetida a, pelo menos, duas passagens.
animal nas instalaes de fabrico de vacinas.
As clulas so regularmente observadas durante 21 dias
Pode tornar-se necessrio adaptar as restries impostas para deteco de eventuais efeitos citopatognicos. Durante
nesta seco em funo da evoluo da situao zoo-sanitria este perodo de observao, todos os 7 dias, uma parte das
no pas de origem e na Europa. clulas da espcie de origem examinada para deteco
de efeitos citopatognicos aps fixao e colorao, uma
EXIGNCIAS outra parte submetida a um ensaio para deteco de
agentes hemoadsorventes e uma outra pesquisa de agentes
As substncias de origem animal satisfazem s exigncias da especficos por mtodos apropriados de serodiagnstico.
Farmacopeia no caso de existir a correspondente monografia. Contaminao bacteriana e fngica. Antes da sua utilizao,
as substncias so submetidas ao ensaio de esterilidade
Origem. Convm avaliar cuidadosamente as riscos associados (2.6.1) e ao ensaio dos micoplasmas (2.6.7), ou a um processo
evoluo da situao zoo-sanitria no pas de origem da de esterilizao que assegure a inactivao de qualquer
substncia e s doenas infecciosas potencialmente presentes contaminante bacteriano, fngico ou micoplsmico.
na espcie animal de origem, tendo em conta as espcies alvo
propostas. Os critrios de seleco so os mais exigentes, em
particular para as substncias utilizadas nos produtos que se 5.2.6. AVALIAO DA INOCUIDADE
destinam mesma espcie e para as substncias de origem
bovina, caprina, ovina e porcina. DAS VACINAS E SOROS PARA USO
VETERINRIO
Preparao. As substncias de origem animal so preparadas
a partir de um granel homogneo identificado por um O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a
nmero de lote. uma vacina como a um soro.
O lote pode conter substncias provenientes de um sem Durante a fase de desenvolvimento, efectuam-se ensaios
nmero de animais. No entanto, uma vez definido e de inocuidade na espcie alvo ou nas espcies alvo, com a
identificado por um nmero, o lote no de qualquer forma finalidade de pr em evidncia os riscos potencialmente
sujeito a adies ou a contaminaes. associados com a utilizaao do produto.
Demonstra-se que todos os lotes da substncia se encontram Vacinas. Nos ensaios laboratoriais, o termo dose designa a
isentos de contaminaes como se descreve a seguir, e/ou dose recomendada para um produto que contm o ttulo ou a

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 683


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.2 PRODUTOS BIOLGICOS (NDICE)

5.2.6. Avaliao da inocuidade das vacinas e soros para uso veterinrio

actividade mximos susceptveis de serem obtidos nos lotes de os soros. No caso das vacinas vivas liofilizadas, as 10 doses
fabrico. As vacinas vivas preparam-se apenas com estirpes cuja so reconstitudas num volume apropriado de diluente
inocuidade foi demonstrada. Para as vacinas vivas, necessrio para o ensaio. Mantm-se os animais em observao e
efectuar os ensaios com 1 ou vrios lotes da vacina preparada a examinam-se, pelo menos, 1 vez por dia para pesquisa de
partir da passagem menos atenuada utilizada na produo. reaces gerais ou locais. Registam-se igualmente outros
critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal
No caso de vacinas combinadas, demonstra-se a inocuidade; dos mamferos e o rendimento zootcnico. Mantm-se os
a conformidade s exigncias particulares que se aplicam animais em observao e examinam-se durante, pelo menos,
s vacinas vivas e que se descrevem a seguir para os 14 dias aps a administrao. Se a vacina se destina a animais
componentes vivos das vacinas combinadas, demonstram-se gestantes, efectue o ensaio em animais nas fases em que a
separadamente para cada estirpe da vacina. administrao no est contra-indicada e prolongue o perodo
Nas vacinas inactivadas, os ensaios de inocuidade efectuados de observao, pelo menos, at ao parto. Observe os animais
com a vacina combinada podem ser considerados suficientes e registe qualquer efeito na gestao ou na descendncia.
para demonstrar a inocuidade dos componentes individuais. Em casos muito particulares, como os soros, quando est
comprovado que a administrao de uma sobredose no
Soros. Nos ensaios laboratoriais, o termo dose designa a indicada e que o ensaio no efectuado, os perigos potenciais
dose mxima recomendada para um produto apresentando associados administrao de uma sobredose so claramente
a actividade mxima e o teor mximo em protenas totais assinalados nos documentos que acompanham o produto.
5. Textos gerais

susceptveis de serem obtidos nos lotes de fabrico.


Alm disso, a dose utilizada no ensaio contm igualmente, Inocuidade da administrao repetida de uma dose nica.
quando aplicvel, a quantidade mxima de imunoglobulina Pode ser necessria a administrao repetida de uma dose
ou de gamaglobulina. nica para revelar quaisquer efeitos indesejveis associados a
esta situao. Estes ensaios so particularmente importantes
Os ensaios descritos a seguir, com as modificaes ou ensaios quando o produto (em particular os soros) susceptvel de ser
suplementares indicados na seco Produo das monografias, administrado vrias vezes num intervalo de tempo relativamente
efectuam-se no mbito dos ensaios de desenvolvimento curto. Efectuam-se estes ensaios nas categorias de animais
necessrios para demonstrar a inocuidade do produto. mais sensveis da espcie alvo, para cada via de administrao
recomendada. O nmero de administraes , pelo menos,
igual ao nmero mximo recomendado; no caso das vacinas,
A. ENSAIOS LABORATORIAIS tem-se em conta o nmero de administraes para a vacinao
primria e para a revacinao; nos soros, tem-se em conta o
Inocuidade da administrao de uma dose nica. Administre, nmero de administraes requeridas para o tratamento. O
por cada uma das vias de administrao recomendadas, 1 intervalo de tempo entre as administraes apropriado (por
dose do produto a um grupo de animais de cada uma das exemplo, perodo de risco ou durao de tratamento requerido)
espcies e categorias alvo. Consoante o caso, este grupo e compatvel com o modo de emprego do produto. No caso
inclui animais com a idade mnima para vacinao e fmeas das vacinas, por razes de comodidade, admite-se que sejam
gestantes. Observam-se e examinam-se os animais, pelo utilizados perodos mais curtos que os recomendados no campo,
menos, 1 vez por dia, para pesquisa de reaces gerais ou mas, no mnimo, mantm-se um intervalo de 14 dias entre as
locais. Quando apropriado, os estudos compreendem um administraes para permitir o desenvolvimento de eventuais
exame necrpsico detalhado, macroscpico e microscpico, reaces de hipersensibilidade. Pelo contrrio, nos soros, a
do local de injeco. Registam-se igualmente outros administrao segue o esquema recomendado. Observam-se e
critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal examinam-se os animais, pelo menos 1 vez por dia, no mnimo,
dos mamferos e o rendimento zootcnico. Regista-se a durante 14 dias aps a ltima administrao para pesquisa
temperatura corporal, pelo menos, no dia anterior ao da de reaces gerais ou locais. Registam-se igualmente outros
vacinao, no momento da vacinao, 4 h mais tarde e nos critrios objectivos, por exemplo a temperatura corporal dos
4 dias seguintes. Mantm-se os animais em observao e mamferos e o rendimento zootcnico.
examinam-se, pelo menos, 1 vez por dia durante o perodo
de tempo em que se espera haver reaces mas, em todos os Resduos. No caso de vacinas vivas contra zoonoses bem
casos, durante, no mnimo, 14 dias aps a administrao. conhecidas, pode ser necessrio efectuar a pesquisa do
microrganismo da vacina residual no local de injeco, para
Estudos da funo reprodutora. Os estudos de inocuidade alm dos estudos de disseminao que se descrevem a seguir.
podem igualmente incluir o exame da funo reprodutora
quando os dados sugerem que a origem da matria-prima do Efeitos indesejveis nas funes imunolgicas. No caso
produto constitui um factor de risco. Se estiver prescrito na de um produto poder afectar negativamente a resposta
monografia, efectua-se o estudo das funes reprodutoras dos imunitria do animal ao qual foi administrado ou da sua
machos e das fmeas gestantes e no gestantes, incluindo a descendncia, efectuam-se ensaios adequados das funes
pesquisa de efeitos indesejveis na descendncia, por exemplo imunolgicas.
de natureza teratognica e abortiva, para cada uma das vias
de administrao recomendadas. Efeitos de interaco indesejveis. Quando se recomenda a
administrao do produto simultaneamente ou no quadro de
Inocuidade da administrao de uma sobredose. Administra- um programa de administrao de vrios produtos num curto
-se uma sobredose por cada uma das vias de administrao perodo de tempo, efectuam-se estudos para demonstrar a
recomendadas, aos animais das categorias mais sensveis ausncia de efeitos de interaco indesejveis na inocuidade do
das espcies alvo, incluindo, quando aplicvel, animais produto.
com a idade mnima recomendada e fmeas gestantes.
A sobredose consiste normalmente em 10 doses para as Exigncias especiais aplicveis s vacinas vivas. Efectuam-se
vacinas vivas ou 2 doses para as vacinas inactivadas ou para os seguintes ensaios nas vacinas vivas.

684 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.7. Avaliao da eficcia das vacinas e soros para uso veterinrio

(a) Difuso da estirpe da vacina. Utilizando a via de decurso dos ensaios de campo. Sob reserva de que os ensaios
administrao recomendada mais favorvel para a difuso, laboratoriais tenham avaliado adequadamente a inocuidade
investiga-se a possibilidade de transmisso da estirpe da vacina e a eficcia de um produto nas condies experimentais
de animais vacinados a animais no vacinados da espcie alvo. utilizando vacinas com ttulo ou actividade respectivamente
Pode tambm ser necessrio investigar os riscos de transmisso mximo(a) ou mnimo(a), pode ser utilizado apenas um
a espcies no alvo potencialmente muito sensveis estirpe da nico lote para avaliar ao mesmo tempo a inocuidade e a
vacina viva. Convm igualmente avaliar o nmero possvel de eficcia no campo. Neste caso, pode ser utilizado um lote de
transmisses de animal para animal em circunstncias normais, rotina representativo, com ttulo ou actividade intermdios.
assim como as suas consequncias previsveis.
Nos mamferos destinados ao consumo, os ensaios incluem a
medio da temperatura corporal antes e aps a administrao
(b) Disseminao no organismo do animal vacinado. Verifica- do produto num nmero suficientemente elevado de animais;
-se a presena do microrganismo nas fezes, urina, leite, ovos no caso de outras espcies de mamferos, essas medies
e secrees orais, nasais ou outras. Alm disso, pode ser efectuam-se quando os ensaios laboratoriais indiciem qualquer
necessrio estudar a disseminao da estirpe da vacina no problema. Regista-se o tamanho e a persistncia de qualquer
corpo do animal, com especial destaque para os seus locais reaco local e a proporo de animais que apresentam
de multiplicao preferenciais. Este estudo obrigatrio para reaces locais ou gerais. Nos casos apropriados, convm
vacinas vivas contra zoonoses bem conhecidas e administradas igualmente medir o rendimento zootcnico.
a animais destinados ao consumo.

5. Textos gerais
No caso de galinhas poedeiras, os ndices de rendimento
abrangem a mortalidade semanal, os ndices de consumo,
(c) Aumento de virulncia. Utilize a estirpe do nvel de
a idade ao abate e o peso, assim como a desvalorizao ou
passagem que se espera seja a mais virulenta para a espcie
rejeies do local de produo. Para as vacinas destinadas s
alvo, entre o lote semente primrio e o produto final.
aves poedeiras ou s aves que se podem destinar postura,
Os animais utilizados tm uma idade apropriada para
consoante o caso, efectua-se um estudo sobre os efeitos da
recuperao do vrus e os animais de todos os grupos tm
vacina no rendimento da postura e na taxa de ecloso.
essa idade no momento da inoculao. A primeira vacinao
efectua-se pela via de administrao recomendada mais
favorvel reverso virulncia. Efectuam-se a seguir, pelo C. ECOTOXICIDADE
menos, 5 passagens em srie em animais das espcies alvo.
As passagens realizam-se pela via de administrao mais Avaliam-se os efeitos nocivos do produto para o ambiente
favorvel reverso virulncia. Se as propriedades do vrus e identificam-se as medidas preventivas necessrias para
permitem passagens sucessivas por propagao natural nos diminuir os referidos riscos. Avalia-se o grau de exposio
5 grupos, pode ser utilizado este mtodo, seno efectua-se do ambiente ao produto, levando em conta a espcie alvo e
uma passagem como se descreve em cada monografia e o modo de administrao e de excreo do produto. Se estes
pesquisa-se o aumento de virulncia no vrus recuperado no factores indicarem haver um risco significativo de exposio
nvel de passagem mais elevado. Utilizam-se, pelo menos, do ambiente ao produto, avalia-se a ecotoxicidade potencial
2 animais em cada passagem. Comprova-se a presena de levando em linha de conta as propriedades do produto.
microrganismos vivos provenientes da vacina no substrato de
cada passagem. Compara-se a inocuidade da estirpe do nvel
mais elevado de passagens com a da estirpe de origem.
5.2.7. AVALIAO DA EFICCIA
No caso de vrus particulares, a monografia pode exigir
um maior nmero de passagens e para cada passagem um DAS VACINAS E SOROS PARA USO
nmero de animais mais elevado, se os dados disponveis VETERINRIO
indicarem interesse. Efectua-se a ltima passagem, pelo
menos, em animais da categoria mais apropriada para avaliar O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a
o risco potencial. uma vacina como a um soro.
Durante a fase de desenvolvimento do produto, demonstra-se
(d) Propriedades biolgicas da estirpe da vacina. Podem a sua eficcia atravs de ensaios efectuados em cada uma das
ser necessrios mais ensaios por forma a determinar, to espcies e categorias s quais a vacina se destina, utilizando
precisamente quanto possvel, as propriedades biolgicas cada uma das vias de administrao recomendadas e o
intrnsecas da estirpe utilizada na vacina (por exemplo, esquema vacinal proposto. O natureza dos ensaios a efectuar
neurotropismo). No caso de vacinas que utilizam vectores, varia consideravelmente consoante o tipo de vacina.
necessrio fazer uma avaliao do risco de uma modificao
do tropismo ou da virulncia da estirpe e, se necessrio, Os ensaios indicados na seco Produo de uma
efectuar ensaios especficos. Estes ensaios so sistematica- monografia especfica podem ser efectuados no quadro dos
mente efectuados quando se incorpora um gene estranho na ensaios de desenvolvimento necessrios para demonstrar a
estirpe como protena estrutural. eficcia. Convm ter em conta as seguintes consideraes.
A dose a utilizar nos ensaios ser a quantidade de produto
(e) Recombinao ou rearranjo genmico da estirpe. Analisa- recomendada para utilizao, contendo o ttulo ou a
-se a probabilidade de recombinao ou rearranjo genmico actividade mnimos admitidos no fim do prazo de validade.
com a estirpe de campo ou outras. No caso de vacinas vivas, necessrio efectuar os ensaios com
a vacina contendo vrus/bactria do nvel de passagem mais
atenuada que poder estar presente num lote de vacina.
B. ENSAIOS DE CAMPO
No caso dos soros, quando aplicvel, a dose examinada contm
Os resultados dos ensaios laboratoriais normalmente igualmente as quantidades mnimas de imunoglobulinas ou de
completam-se e confirmam-se com dados obtidos no gamaglobulinas e/ou de protenas totais.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 685


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Os ensaios de eficcia confirmam todas as indicaes laboratoriais tenham avaliado adequadamente a inocuidade e a
reclamadas para o produto. Se, por exemplo, se indica que eficcia de um produto nas condies experimentais utilizando
o produto confere proteco contra doenas respiratrias, vacinas com ttulo ou actividade respectivamente mximo(a)
pelo menos, demonstra-se que a proteco contra os sinais ou mnimo(a), pode ser utilizado apenas um nico lote para
clnicos da doena respiratria est assegurada. Quando se avaliar ao mesmo tempo a inocuidade e a eficcia no campo.
reclama uma proteco anti-infecciosa, este facto demonstra- Neste caso, pode ser utilizado um lote de rotina representativo,
-se por tcnicas de reisolamento. Se apresentam vrias com ttulo ou actividade intermdios. Quando os ensaios
indicaes, a sua eficcia demonstra-se para cada uma delas. laboratoriais no permitem demonstrar a eficcia, admite-se
que sejam efectuados apenas ensaios no campo.
Vacinas. Avalia-se adequadamente a influncia na eficcia
da presena de anticorpos adquiridos passivamente ou
transmitidos pela me. Qualquer declarao ou indicao
implcita quanto ao incio e durao da proteco 5.2.8. MINIMIZACO DO RISCO DE
reivindicada corroborada com resultados dos estudos. TRANSMISSO DE AGENTES DE
Para as vacinas combinadas e multivalentes, a eficcia de cada ENCEFALOPATIAS ESPONGIFORMES
componente demonstra-se utilizando a vacina combinada.
ANIMAIS PELOS MEDICAMENTOS
Soros. D-se uma ateno particular aos dados que
demonstram a eficcia do esquema recomendado. Por PARA USO HUMANO E PARA USO
5. Textos gerais

exemplo, se se recomenda administrar o soro apenas uma VETERINRIO


vez para fornecer um efeito profilctico ou teraputico,
demonstra-se este facto. Qualquer indicao, declarada ou Este captulo idntico Nota Explicativa sobre a
implcita quanto ao incio e durao da proteco ou do minimizao do risco de transmisso de agentes de
efeito teraputico, apoia-se nos dados obtidos nos ensaios. encefalopatias espongiformes animais atravs dos
Por exemplo, estuda-se a durao da proteco permitida por medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
uma dose profilctica de um soro para se poder fornecer no Reviso 2, Outubro de 2003 [Comit de Especialidades
rtulo indicaes apropriadas ao utilizador. Farmacuticas (CEF). Comit de Medicamentos
Conduzem-se ensaios de compatibilidade imunolgica quando Veterinrios (CMV), Agncia Europeia para a Avaliao de
se recomenda a administrao simultnea de vrios produtos Medicamentos].
ou quando ele faz parte de um esquema de administrao Contedo
habitual. Quando o produto faz parte de um esquema habitual
de administrao recomendado, demonstra-se a seu papel 1. INTRODUO
tanto na vacinao primria como na revacinao, ou a sua 1-1. Contexto cientfico
contribuio na eficcia do esquema no seu todo. 1-2. Conformidade regulamentar
Avalia-se adequadamente a influncia da imunidade 2. MBITO DO CAPTULO
conferida por anticorpos passivamente adquiridos ou de
origem materna na eficcia da vacina. Qualquer declarao 3. CONSIDERAES DE ORDEM GERAL
ou indicao respeitante ao incio e durao da proteco 3-1. Princpios cientficos de minimizao do risco
corroborada com os resultados obtidos nos ensaios. 3-2. Animais de origem
Demonstra-se a eficcia de cada um dos componentes das 3-2-1. Origem geogrfica
vacinas combinadas, utilizando a vacina combinada.
3-2-1-1. Matrias de origem bovina
3-2-1-2. Ovinos e caprinos (pequenos ruminantes)
ENSAIOS LABORATORIAIS
3-2-2. Efectivos (fechados) de bovinos com risco
insignificante de BSE
Em princpio, a demonstrao da eficcia efectua-se no
laboratrio em condies controladas atravs de prova 3-3. Partes dos animais, fluidos e secrees utilizados como
matrias-primas
virulenta no animal alvo, nas condies de utilizao
recomendadas. Na medida do possvel, as condies de 3-4. Idade dos animais
realizao da prova virulenta reproduzem as condies 3-5. Processo de fabrico
naturais de infeco, por exemplo quanto ao nmero de
microrganismos e via de administrao utilizados. 4. AVALIAO DO RISCO LIGADO S MATRIAS OU
SUBSTNCIAS UTILIZADAS NO FABRICO OU NA PREPARAO
Vacinas. Salvo excepo justificada, a prova virulenta efectua- DE UM MEDICAMENTO NO CONTEXTO DA CONFORMIDADE
-se utilizando uma estirpe diferente daquela que foi utilizada REGULAMENTAR
na produo da vacina. 5. AVALIAO RISCO/BENEFCIO
Se possvel, convm determinar qual o tipo de mecanismo 6. CONSIDERAES ESPECFICAS
imunitrio (celular/humoral, local/geral, classe de 6-1. Colagnio
imunoglobulina) que resulta da administrao do produto
aos animais alvo. 6-2. Gelatina
6-3. Derivados do sangue bovino
6-4. Derivados do sebo
ENSAIOS DE CAMPO
6-5. Carvo animal
De uma forma geral, os resultados dos ensaios laboratoriais 6-6. Leite e derivados do leite
so completados por dados obtidos nos ensaios de campo,
6-7. Derivados da l
efectuados, salvo excepo justificada, com animais
testemunhas no tratados. Sob reserva de que os ensaios 6-8. Aminocidos

686 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

1. INTRODUO O tremor epizotico est presente em todo o mundo e foi


notificado na maior parte dos pases europeus. A sua incidncia
1-1. CONTEXTO CIENTFICO mais elevada no Reino Unido. Embora o ser humano tenha
sido exposto durante mais de 200 anos ao tremor epizotico
As encefalopatias espongiformes transmissveis (TSE - espontneo, no h dados epidemiolgicos que permitam
transmissible spongiform encephalopathies) so doenas estabelecer uma relao directa entre ele e as encefalopatias
degenerativas crnicas do sistema nervoso caracterizadas pela espongiformes do ser humano. No entanto, subsiste um
acumulao de uma isoforma anormal de uma glicoproteina risco terico actualmente inquantificvel de que alguns
celular denominada PrP ou protena do prio. Esta isoforma suplementos proteicos contaminados pela BSE possam ter
anormal da PrP (PrPSc) difere da PrP normal (PrPc) pelo sido ingeridos por ovinos. Se tais alimentos causarem uma
facto de ser altamente resistente ao tratamento pela protease infeco recorrente com o agente da BSE, essa infeco
e desnaturao trmica. Cr-se que a PrPSc o agente poder ser diagnosticada como tremor epizotico e constituir,
infeccioso responsvel pela transmisso das TSE. portanto, um risco de TSE humana. Alm disso, h que partir
As TSE veterinrias incluem: do pressuposto de que qualquer agente da BSE introduzido
na populao dos pequenos ruminantes atravs de alimentos
a encefalopatia espongiforme bovina (BSE - bovine
contaminados ser provavelmente reciclado e amplificado.
spongiform encephalopathy), nos bovinos,

5. Textos gerais
o tremor epizotico (scrapie), nos ovinos e caprinos,
1-2. CONFORMIDADE REGULAMENTAR
a doena crnica emaciante (CWD - chronic wasting
disease) dos cervdeos (veados e alces), Avaliao do risco - Dado ser impossvel evitar a utilizao
a encefalopatia transmissvel do vison (TME - transmissible de matrias de origem animal na produo de alguns
mink encephalopathy), nos visons de criao, medicamentos e s raramente ser possvel suprimir
totalmente o risco na fonte, as medidas adoptadas para
a encefalopatia espongiforme dos felinos (FSE - feline
spongiform encephalopathy), especificamente nos gatos controlar o risco de transmisso das TSE atravs dos
domsticos e em felinos de grande porte em cativeiro, medicamentos constituem uma minimizao, e no uma
supresso do risco. Por conseguinte, a conformidade
a encefalopatia espongiforme dos ungulados exticos dos regulamentar deve assentar numa avaliao do risco que
jardins zoolgicos. atenda a todos os factores pertinentes explicitados no
No ser humano, as encefalopatias espongiformes abrangem presente captulo (ver adiante).
vrias formas da doena de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), o Kuru,
a sndroma de Gerstmann-Strussler-Scheinker (GSS) e a Aspectos jurdicos - A Nota Explicativa tem fora de lei,
Insnia Fatal Familiar (FF). nos termos do Anexo I das Directivas 2001/82/CE e 2001/83/CE
Foi notificada a transmisso iatrognica das encefalopatias do Parlamento Europeu e do Conselho [com a redaco
espongiformes Nos ovinos, o tremor epizotico foi que lhes foi dada pela Directiva 2003/63/CE (1) relativas,
acidentalmente transmitido pela utilizao da vacina respectivamente, aos medicamentos para uso veterinrio
Louping Ill, preparada a partir da mistura do crebro e bao e para uso humano. Estas directivas estabelecem que os
de ovinos tratados com formaldedo, na qual tinham sido requerentes de autorizaes de introduo no mercado de
inadvertidamente incorporadas matrias-primas provenientes medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
de ovinos infectados com essa doena. No homem, foram comprovem que tais medicamentos so fabricados de acordo
notificados casos de transmisso da DCJ atribudos com a ltima verso da presente Nota Explicativa publicada
administrao parentrica repetida de hormona do crescimento no Jornal Oficial da Unio Europeia. Trata-se de uma
e de gonadotropina derivadas da hipfise de cadveres humanos. obrigao que se mantm aps a concesso da autorizao de
Alguns casos de DCJ foram igualmente atribudos utilizao introduo no mercado.
de instrumentos contaminados na cirurgia do crebro e ao
transplante de dura-mter e crneas humanas. Por definio, o princpio das matrias de risco especfico,
tal como definidas no Regulamento (CE) n 999/2001
A transmisso das TSE entre espcies limitada por vrias do Parlamento Europeu e do Conselho(2), no se aplica
barreiras naturais, sendo a transmissibilidade afectada aos medicamentos. A utilizao de substncias derivadas
pela espcie de origem, a estirpe do prio, a dose, a via de tecidos com elevada infecciosidade deve justificar-se
de exposio e, nalgumas espcies, o alelo do gene PrP plenamente e surgir na sequncia de uma avaliao adequada
do hospedeiro. As barreiras entre espcies podem ser
da relao risco/benefcio (ver adiante).
ultrapassadas em condies adequadas.
A Nota Explicativa deve ser lida em conjugao com
A encefalopatia espongiforme bovina (BSE) foi identificada
os vrios instrumentos jurdicos da Comunidade
pela primeira vez no Reino Unido em 1986, tendo sido
afectados muitos bovinos e efectivos. Apurou-se que a BSE Europeia, nomeadamente as vrias decises da Comisso
uma doena transmitida por via alimentar atravs da carne progressivamente aplicadas desde 1991. Sempre que
e das farinhas de carne e de ossos de animais afectados necessrio, so indicadas referncias a essas decises. As
pelas TSE. Verificaram-se casos de BSE noutros pases, quer declaraes de tomada de posio e as notas explicativas
em animais importados do Reino Unido, quer em animais elaboradas pelo Comit das Especialidades Farmacuticas
autctones. H provas convincentes de que a nova variante (CEF) e pelo Comit dos Medicamentos Veterinrios (CMV) so
da DCJ (vDCJ) causada pelo agente etiolgico da BSE ainda aplicveis para efeitos de conformidade regulamentar, a
dos bovinos. Por conseguinte, continua a justificar-se a menos que sejam alteradas na Nota Explicativa.
mxima prudncia caso os materiais biolgicos das espcies
espontaneamente afectadas por essas doenas, em especial os (1) JO L 159 de 27.6.2003, p.46.
bovinos, sejam utilizados no fabrico de medicamentos. (2) JO 1- 147 de 31.5-20017 p.1.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 687


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

A monografia geral Produtos com risco de transmisso substncias activas,


dos agentes das encefalopatias espongiformes animais da
excipientes e adjuvantes,
Farmacopeia Europeia remete para um captulo de carcter
geral que idntico Nota Explicativa. Esta monografia matrias-primas e reagentes utilizados na produo (por
constitui a base para a emisso de certificados de conformidade, exemplo, albumina srica bovina; enzimas; meios de
um procedimento que demonstra a conformidade TSE das cultura, incluindo os utilizados na preparao de bancos
substncias e matrias utilizadas no fabrico de medicamentos de clulas de trabalho, ou de novos bancos de clulas
para uso humano e para uso veterinrio. primrias, para medicamentos sujeitos a uma nova
autorizao de introduo no mercado).
Clarificao da Nota Explicativa - medida que os
O presente captulo igualmente aplicvel s matrias que
conhecimentos cientficos sobre as TSE, e em especial sobre a
entram em contacto directo com o equipamento de produo
patognese destas doenas, progredirem, o CEF e o respectivo
dos medicamentos, ou que possam entrar em contacto
Grupo de Trabalho Biotecnologia, em colaborao com o
CMV e o seu Grupo de Trabalho Produtos Imunolgicos, corn eles, e constituem, portanto, uma eventual fonte de
podero necessitar de elaborar orientaes suplementares, contaminao.
sob a forma de declaraes de tomada de posio ou de notas As matrias usadas na validao das instalaes e do
explicativas, para clarificar a Nota Explicativa. equipamento, como meios de cultura usados em experincias
de enchimento para validar processos de enchimento
5. Textos gerais

Estas orientaes suplementares sero publicadas pela assptico, devem ser consideradas em conformidade com o
Comisso, bem como no stio web da Agncia Europeia de presente captulo se o ou os seus constituintes derivarem de
Avaliao dos Medicamentos (EMEA - European Agency for the tecidos sem infecciosidade detectvel (tecidos da categoria C),
Evaluation of Medicinal Products), e sero devidamente se tiver sido analisado o risco de contaminao cruzada com
tomadas em considerao no mbito da certificao da Directrio tecidos potencialmente infecciosos (ver seco 3.3) e se essas
Europeia da Qualidade dos Medicamentos (EDQM - European matrias provierem de um pas com um RGB I/II (ver seco
Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare). 3.2). Estas informaes podem ser apresentadas no dossier
de autorizao de introduo no mercado e verificadas no
Aplicao da Nota Explicativa revista - Todos os decurso da inspeco de rotina para conformidade com as
medicamentos autorizados na UE esto em conformidade Boas Prticas de Fabrico (BPF).
com a Nota Explicativa sobre a minimizao do risco de Outros materiais, como agentes de limpeza, amaciadores e
transmisso de agentes das encefalopatias espongiformes lubrificantes, que entrem em contacto com o medicamento
animais pelos medicamentos para uso humano e para
no decurso do fabrico de rotina, da fase de acabamento ou da
uso veterinrio (EMEA/410/01 - Rev. 1), dado o requisito
embalagem primria, consideram-se em conformidade com
legal constante do Anexo I das Directivas 2001/82/CE
o presente captulo caso se trate de derivados do sebo que
(medicamentos para uso veterinrio) e da Directiva
respeitem as condies descritas na seco 6.
2001/83/CE, com a ltima redaco que lhe foi dada pela
Directiva 2003/63/CE (medicamentos para uso humano). A
Nota Explicativa revista dever ser aplicada prospectivamente, LOTES SEMENTE, BANCOS DE CLULAS E
ou seja, em relao a todos os medicamentos futuramente FERMENTAO PRODUO DE ROTINA(5)
autorizados ou cuja autorizao de introduo no mercado
seja renovada aps a data inicial da sua aplicao.
Para efeitos de conformidade regulamentar, as sementes
primrias, ou bancos de clulas primrias, respeitantes
2. MBITO DO CAPTULO aos pedidos de autorizao de introduo no mercado
apresentados aps 1 de Julho de 2000 (no que respeita aos
ESPCIES ANIMAIS RELEVANTES EM TERMOS DAS TSE medicamentos para uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (no
que se refere aos medicamentos para uso veterinrio) esto
Os bovinos, ovinos, caprinos e outros animais que possam ser cobertas pela Nota Explicativa.
espontaneamente infectados pelos agentes das encefalopatias As sementes primrias e bancos de clulas primrias,
espongiformes transmissveis, ou a quem a infeco possa
ser transmitida por via oral, excepto o ser humano(3) e outros para antignios de vacinas,
primatas, so definidos como espcies animais relevantes para medicamentos obtidos por processos biotecnolgicos,
em termos das TSE(4).
na acepo da parte A do Anexo do Regulamento CE
n. 2309/93 do Conselho, e
Matrias - O presente captulo diz respeito a matrias
derivadas de espcies animais relevantes em termos das para outros medicamentos em cujo fabrico sejam utilizados
TSE usadas na preparao de: lotes semente e sistemas de bancos de clulas,
j aprovados em relao ao fabrico de um constituinte
(3) O Comit das Especialidades Farmacuticas e o respectivo Grupo de de um medicamento autorizado sero considerados em
Trabalho de Biotecnologia publicaram orientaes regulamentares e conformidade com a Nota Explicativa, mesmo que constem
documentos de tomada de posio sobre os medicamentos derivados
de tecidos humanos no que respeita DCJ e vDCJ. Estas orientaes dos pedidos de autorizao de introduo no mercado
encontram-se no seguinte endereo: http:www.emea.eu.int
(4) Os sunos e as aves, que so espcies animais particularmente teis (5)Consultar igualmente o documento para adopo de uma posio sobre a
para a produo de medicamentos, no so susceptveis de ser infectados avaliao do risco de transmisso de agentes das encefalopatias espongiformes
espontaneamente por via oral. Por conseguinte, no so espcies animais animais pelos lotes semente primrios utilizados na produo de vacinas
relevantes em termos das TSE, na acepo do presente captulo. Tambm os ces, veterinrias (EMEA/CVMP/019/01 - Fevereiro de 2001), adoptado pelo Comit
os coelhos e os peixes no so espcies animais relevantes em termos das TSE, na dos Medicamentos Veterinrios (CMV) em Julho de 2001 (Jornal Oficial das
acepo do presente capitulo. Comunidades Europeias C 286 de 12 de Outubro de 2001, p. 12).

688 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

apresentados aps 1 de Julho de 2000 (no que respeita aos A minimizao do risco de transmisso das TSE baseia-se em
medicamentos para uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (no trs parmetros complementares:
que se refere aos medicamentos para uso veterinrio).
os animais de origem e a sua origem geogrfica,
No que respeita aos bancos de clulas primrias e aos lotes
semente primrios criados antes de 1 de Julho de 2000 (no a natureza das matrias de origem animal utilizadas no
que respeita aos medicamentos para uso humano) e 1 de fabrico e dos eventuais procedimentos aplicados para
Outubro de 2000 (no que se refere aos medicamentos para evitar a contaminao cruzada com matrias de risco mais
uso veterinrio) e ainda no aprovados como constituintes elevado,
de um medicamento autorizado, deve comprovar-se que o ou os processos de produo, incluindo o sistema
satisfazem aos requisitos da Nota Explicativa. Se, em relao de garantia da qualidade aplicado para assegurar a
a alguma matria-prima, produto de base ou reagente uniformidade e a traabilidade do produto.
utilizado para a criao destes bancos de clulas ou de lotes
semente, se no encontrarem, ou j se no encontrarem,
disponveis provas documentais exaustivas, o requerente deve 3-2. ANIMAIS DE ORIGEM
apresentar a avaliao de risco descrita na seco 4 da Nota
Explicativa. As matrias-primas usadas na produo de matrias
Os lotes semente ou bancos de clulas de trabalho destinadas ao fabrico de medicamentos devem ser

5. Textos gerais
estabelecidos utilizados no fabrico de medicamentos provenientes de animais considerados adequados para
autorizados antes de 1 de Julho de 2000 (medicamentos para consumo humano, na sequncia de uma inspeco ante
uso humano) e 1 de Outubro de 2000 (medicamentos para e post mortem em conformidade com as condies
uso veterinrio) que foram sujeitos a uma avaliao de risco comunitrias ou equivalentes (pases terceiros), excepto
adequada pela Autoridade competente dos Estados- Membros as matrias derivadas de animais vivos, que devem ser
ou pela EMEA e declarados aceitveis devem ser igualmente declarados saudveis na sequncia de um exame clnico.
considerados conformes.
No entanto, se as matrias derivadas de espcies animais 3-2-1. Origem geogrfica
relevantes em termos das TSE forem utilizadas em 3.2.1.1. Matrias de origem bovina. Actualmente, h duas
processos de fermentao/produo de rotina ou para a organizaes envolvidas na avaliao da situao em matria
criao de lotes semente de trabalho e de bancos de clulas
de BSE de um dado pas ou zona especfica. Por um lado, a
de trabalho, o requerente deve comprovar que observam os
OIE (Organisation Internationale des Epizooties(6) estabelece
requisitos da Nota Explicaliva.
critrios de avaliao da situao dos pases no captulo do
Cdigo Zoossanitrio Internacional sobre a encefalopatia
3. CONSIDERAES DE ORDEM GERAL espongiforme bovina. A OIE tambm disponibiliza uma lista
de casos notificados de BSE a nvel mundial. Por outro lado,
3-1. PRINCPIOS CIENTFICOS DE MINIMIZAO DO RISCO o Comit Cientfico Director (CCD)(7) da Comisso Europeia
estabeleceu um sistema de classificao dos pases de acordo
Caso possam optar, os fabricantes devem preferir a utilizao com o respectivo risco geogrfico de BSE (RGB).
de matrias de espcies animais no relevantes em termos
O Regulamento (CE) n 999/2001 do Parlamento Europeu
das TSE ou de origem no animal. Devem ser expostos os
e do Conselho, que estabelece regras para a preveno, o
motivos da utilizao de matrias derivadas de espcies
controlo e a erradicao de determinadas encefalopatias
animais relevantes em termos das TSE, e no de matrias
espongiformes transmissveis (Regulamento TSE)(2), entrou
derivadas de espcies animais no relevantes em termos
das TSE ou de origem no animal. Se tiverem de ser em vigor em 1 de Julho de 2001. Embora os medicamentos,
utilizadas matrias derivadas de espcies animais relevantes os dispositivos mdicos e os cosmticos estejam excludos
em termos das TSE, deve atender-se a todas as medidas do mbito desse regulamento, h que atender aos princpios
necessrias para minimizar o risco de transmisso das TSE. de determinao da situao em matria de BSE na
categorizao de um dado pas ou regio.
Ainda no se encontram disponveis testes de diagnstico
in vivo da infeco pelas TSE. O diagnstico baseia-se na Para efeitos do presente captulo, a classificao RGB do
confirmao post mortem da existncia de leses cerebrais Comit Cientfico Director deve ser utilizada como um
caractersticas, atravs da histopatologia e/ou da deteco da indicador da situao de um dado pas. No entanto, quando os
PrPSc pelo western blot ou por imunoensaio. Para confirmao, pases forem categorizados de acordo com o Regulamento (CE)
utiliza-se igualmente a demonstrao da infecciosidade atravs n 999/2001, h que recorrer a esta ltima categorizao.
da inoculao de tecido suspeito em espcies-alvo ou em
Classificao do Comit Cientifico Director da comisso
animais de laboratrio. No entanto, dado o longo perodo de
Europeia
incubao de todas as TSE, os resultados dos testes in vivo
apenas esto disponveis meses ou anos depois. A classificao do risco geogrfico de BSE (RGB) do Comit
Foram aprovados vrios testes de diagnstico in vitro capazes Cientfico Director da Comisso Europeia indica o grau de
de detectar a PrPSc em amostras de tecido cerebral de animais probabilidade da existncia de um ou mais bovinos infectados
infectados, embora, em termos gerais, sejam menos sensveis
(6)http:www.oie.int
do que os testes de infecciosidade in vivo. No entanto, a (7)O Comit Cientfico Director estabelecido pela Deciso 97/404/CE da
despistagem dos animais de origem atravs de testes in Comisso assiste a Comisso na obteno dos melhores pareceres cientficos
vitro pode evitar a utilizao de animais nas fases tardias disponveis sobre questes relacionadas corn a sade dos consumidores.
de incubao da doena e conduzir a informaes sobre a A partir de Maio de 2003, as suas funes foram retomadas pela Autoridade
situao epidemiolgica de um dado pas ou regio. Europeia para a Segurana dos Alimentos (AESA): http://www.efsa.eu.int

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 689


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

com a BSE, em fase clnica ou pr-clnica, num dado pas O conceito prtico de efectivos (fechados) de bovinos
ou regio. O quadro que se segue apresenta a definio das com risco insignificante de BSE foi elaborado pelo CCD e
quatro categorias: aprovado pelo CEF e pelo CMV. Os critrios de atribuio e
Grau de Presena de um ou mais bovinos infectados com a BSE, manuteno da situao de efectivos (fechados) de bovinos
RGB em fase clnica ou pr-clnica, numa regio geogrfica ou pas com risco insignificante de BSE constam do parecer do CCD
de 22-23 de Julho de 1999(9)
I Altamente improvvel
Actualmente, ainda no possvel quantificar a reduo
II Improvvel, mas no excluda
do risco geogrfico de BSE em relao aos bovinos
III Provvel, mas no confirmada, ou confirmada a um nvel provenientes de efectivos (fechados) de bovinos com risco
inferior insignificante de BSE. No entanto, cr-se que tal reduo
do risco seja significativa. Por conseguinte, o recurso a tais
IV Confirmada a um nvel superior (1)
efectivos (fechados) de bovinos ser analisado no mbito da
(1) 100 casos/1 milho de bovinos adultos por ano avaliao de risco, conjuntamente com a classificao RGB
do pas.
No stio web do CCD (8), encontram-se os relatrios de
avaliao do RGB por pas. Se a situao do pas em matria
de BSE no tiver sido definida pelo CCD, deve ser apresentada 3-3. PARTES DOS ANIMAIS, FLUIDOS E SECREES
5. Textos gerais

a avaliao de risco tendo em conta os critrios do CM em UTILIZADOS COMO MATERIAS-PRIMAS


relao classificao RGB.
Os diversos rgos e secrees de um animal infectado
Sempre que possvel, os animais devem provir de pases com
o mnimo RGB possvel, a menos que se justifique a utilizao com uma TSE tm graus diferentes de infecciosidade(10) Os
de matrias originrias de pases com um RGB mais elevado. quadros constantes do anexo ao presente captulo (11) resumem
Algumas das matrias indicadas na seco 6 Condies dados actualizados sobre a distribuio da infecciosidade e da
especficas podem ser originrias de pases com um RGB da PrPSc em bovinos com a BSE e em ovinos ou caprinos com o
categoria III e, nalguns casos, da categoria IV, desde que sejam tremor epizotico.
aplicados os controlos e respeitados os requisitos especificados As informaes constantes dos quadros baseiam-se
nas seces relevantes que se seguem. Fora estas excepes, os
unicamente em observaes de casos de doena
animais no devem ser originrios de pases da categoria IV e
deve apresentar-se sempre uma justificao para a utilizao de espontnea ou de infeco primria experimental por
animais da categoria III. via oral (em bovinos) e no incluem dados relativos a
modelos que utilizem estirpes dos agentes das TSE que
foram adaptadas a animais de experincia, visto que os
3.2.1.2. Ovinos e caprinos (pequenos ruminantes). Foram
fentipos das estirpes passadas podem diferir de modo
notificados casos clnicos espontneos de tremor epizotico
em vrios pases a nvel mundial. Uma vez que, nos ovinos, significativo e imprevisvel dos fentipos implicados na
a BSE poder ser confundida com o tremor epizotico, a doena espontnea. Uma vez que se comprovou que a
origem das matrias derivadas de pequenos ruminantes deve deteco imuno-histoqumica e/ou atravs do western
atender, como medida de precauo, prevalncia quer da blot da protena do hospedeiro anormalmente configurada
BSE, quer do tremor epizotico no pas em causa, bem como (PrPSc) um marcador de infecciosidade, os resultados do
aos tecidos de onde provm as matrias. teste da PrPSc foram apresentados paralelamente aos dados
do bioensaio. Os tecidos so agrupados em trs grandes
Os princpios respeitantes aos efectivos de bovinos com
categorias de infecciosidade, independentemente da fase
risco insignificante de BSE (fechados) (ver seco 3-2-2)
deveriam ser igualmente aplicados no contexto dos pequenos da doena:
ruminantes, a fim de desenvolver um enquadramento
que permita definir a situao em matria de BSE de um Categoria A Tecidos com elevada infecciosidade
efectivo de pequenos ruminantes. No que respeita aos ovinos, Tecidos do sistema nervoso central (SNC), com
dada a preocupao em relao possvel existncia de um elevado grau de infecciosidade nas ltimas
BSE, ponderar-se- a utilizao de um ou mais gentipos fases de todas as TSE, bem como certos tecidos
comprovadamente resistentes BSE/tremor epizotico no anatomicamente ligados ao SNC
estabelecimento de efectivos isentos das TSE. No entanto,
nos caprinos no h estudos suficientes sobre a sensibilidade Categoria B Tecidos com baixa infecciosidade
especfica de um gentipo. Tecidos perifricos com resultados positivos de
infecciosidade e/ou PrPSc em pelo menos uma das TSE
As matrias provenientes de pequenos ruminantes devem
preferivelmente ser originrias de pases com uma longa Categoria C Tecidos sem infecciosidade detectvel
tradio de ausncia de tremor epizotico, como a Nova Tecidos cuja infecciosidade foi analisada sem que
Zelndia ou a Austrlia, ou de efectivos isentos de TSE. Ser tenha sido detectada infecciosidade e/ou PrPSc
obrigatrio justificar matrias provenientes de outras origens. (resultados negativos)

(9) Parecer cientifico do CCD relativo aos efectivos (fechados) de bovinos com
3-2-2. EFECTIVOS (FECHADOS) DE BOVINOS COM RISCO
risco insignificante de BSE. Adoptado na sua reunio de 22-23 de Julho de
INSIGNIFICANTE DE BSE 1999.
(10) Se houver que recorrer a espcies animais relevantes em termos das

A origem mais segura a de pases em que a BSE altamente TSE, dever-se- ponderar a utilizao das matrias da categoria de risco mais
improvvel, ou seja, de pases com RGB I. Os restantes pases reduzido.
(11) Os quadros de classificao dos tecidos baseiam-se nas directrizes mais
podem ter, ou ter tido, casos de BSE.
recentes da OMS sobre as encefalopatias espongiformes transmissveis e os
produtos biolgicos e os medicamentos (Fevereiro de 2003).
(8) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/outcome/en.html WHO/BCT/QSD/03.01.

690 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Os tecidos da categoria A e as substncias deles derivados no quantidade de infecciosidade BSE existente no crebro do
devem ser utilizados no fabrico de medicamentos, a menos animal abatido,
que tal se justifique (ver seco 5). grau de leso cerebral,
Embora a categoria dos tecidos de baixo risco (tecidos da disseminao de partculas cerebrais no corpo do animal.
categoria B) quase seguramente abranja alguns (como o
sangue) que envolvem um risco inferior a outros (como
os tecidos linfo-reticulares), os dados sobre o grau de Deve atender-se a estes factores em conjunto com a
infecciosidade so insuficientes para que se possa subdividir classificao RGB dos animais de origem, idade dos animais
(no que respeita aos bovinos) e aos resultados dos testes post
esta categoria em vrios graus de risco. igualmente
mortem dos bovinos que envolvam mtodos validados.
evidente que a incluso de um dado tecido numa categoria
pode depender da doena e da espcie em causa e estar Os princpios subjacentes acima expostos poderiam ser
sujeito a reviso, medida que surjam novos dados. igualmente aplicveis aos ovinos e aos caprinos.
No que respeita avaliao do risco (ver seco 4), os O risco de contaminao cruzada depender de vrios
fabricantes e/ou os titulares ou requerentes da autorizao factores complementares, designadamente:
de introduo no mercado devem atender aos quadros de das medidas adoptadas para evitar a contaminao durante
classificao dos tecidos constantes do Anexo ao presente a recolha de tecidos (ver supra);

5. Textos gerais
captulo(12).
do grau de contaminao (quantidade de tecido
As categorias constantes dos quadros so meramente contaminante);
indicativas, sendo importante sublinhar os seguintes aspectos.
da quantidade e tipos de matrias recolhidos
Em determinadas situaes, pode ocorrer a contaminao simultaneamente.
cruzada de tecidos com vrias categorias de infecciosidade.
O risco potencial influenciado pelas circunstncias Os fabricantes ou os titulares/requerentes de autorizaes
em que os tecidos foram obtidos, em especial caso haja de introduo no mercado devem atender ao risco de
contacto de tecidos com menor infecciosidade ou sem contaminao cruzada.
infecciosidade detectvel (tecidos das categorias B e C) com
tecidos de elevada infecciosidade (tecidos da categoria 3-4. IDADE DOS ANIMAIS
A) Assim, a contaminao cruzada de alguns tecidos
pode ser maior se os animais infectados forem abatidos Uma vez que a infecciosidade das TSE aumenta
por atordoamento cerebral com penetrao, ou se o cumulativamente nos bovinos durante um perodo de
crebro e/ou a medula espinal forem serrados. O risco de incubao de vrios anos, prudente utilizar matrias
contaminao cruzada ser menor se os fluidos corporais provenientes de animais jovens.
forem recolhidos com danos tecidulares mnimos, se os
componentes celulares forem retirados e se o sangue
fetal for recolhido sem ser contaminado por outros 3-5. PROCESSO DE FABRICO
tecidos maternos ou fetais, incluindo a placenta e os
fluidos amniticos e alantides. Em relao a certos A avaliao da reduo global do risco de TSE ligado a um
tecidos, muito dificil, ou at mesmo impossvel, evitar a medicamento deve atender s medidas de controlo institudas
contaminao cruzada com tecidos da categoria A (como o em relao aos seguintes pontos:
crnio). A avaliao de risco deve atender a este facto. origem das matrias-primas/produtos de base
Em relao a certas classes de substncias, as tcnicas de processo de fabrico.
atordoamento/abate utilizadas, podem ser importantes
para minimizar o risco potencial(13), dada a probabilidade A origem controlada urn critrio muito importante para
da disseminao de partculas cerebrais para os rgos que se alcance uma segurana aceitvel do produto, em
perifricos, designadamente para os pulmes. Tais virtude da resistncia comprovada dos agentes das TSE
tcnicas, bem como os procedimentos de remoo de maioria dos processos de inactivao.
tecidos com elevada infecciosidade, devem ser descritos. Devem existir sistemas de garantia da qualidade, como a
Os procedimentos de recolha de tecidos/rgos animais a certificao ISO 9000, a anlise dos riscos e identificao dos
utilizar e as medidas aplicadas para evitar a contaminlo pontos crticos de controlo (HACCP)(14) ou as BPF, para o
cruzada com matrias de risco mais elevado devem tambm controlo do processo de produo e a delimitao dos lotes
ser pormenorizadamente expostos. (isto , a definio de lote, a separao dos lotes e a limpeza
entre lotes). Devem existir procedimentos que assegurem a
O risco de contaminao de tecidos e rgos por matrias
traabilidade, bem como a auditoria interna e auditoria aos
do sistema nervoso com possvel infecciosidade BSE em
fornecedores de matrias-primas.
virtude do mtodo de atordoamento utilizado no abate de
bovinos depende dos seguintes factores: Alguns processos de produo, como os processos utilizados
no fabrico do sebo e dos seus derivados (ver seco 6), podem
(12) A introduo do sistema de classificao de tecidos em 3 categorias no contribuir muito para a reduo do risco de contaminao com
afecta as avaliaes de risco respeitantes aos medicamentos autorizados, TSE. Uma vez que processamentos to rigorosos no podem ser
baseadas na classificao de tecidos em 4 categorias anteriormente utilizada. aplicados a uma grande quantidade de produtos, provvel que
(13) Parecer do CCD sobre mtodos de atordoamento e risco de BSE (Risco de

disseminao de partculas cerebrais para o sangue e a carcaa quando so


processos que envolvam a remoo fisica, como a precipitao e
utilizados determinados mtodos de atordoamento), adoptado na sua reunio
de 10-11 de Fevereiro de 2002. (14)HACCP - Hazard Analysis Critical Control Points (anlise do risco e pontos
http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/out245_en.pdf de controlo crticos).

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 691


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

a filtrao para remoo de matrias ricas em pries, sejam mais Como foi referido na introduo ao presente captulo, a
adequados do que tratamentos qumicos. Deve ser apresentada conformidade regulamentar baseia-se nos resultados favorveis
uma descrio do processo de fabrico, nomeadamente dos da avaliao de risco A avaliao de risco efectuada pelo
controlos aplicados durante o processamento, e h que expor fabricante e/ou pelo titular ou requerente da autorizao de
as medidas que podero contribuir para reduzir ou suprimir a introduo no mercado em relao a cada uma das matrias
contaminao com agentes das TSE. Caso haja vrios locais de ou substncias provenientes de espcies animais relevantes
fabrico, preciso identificar claramente os passos efectuados em em termos das TSE utilizadas no fabrico do medicamento,
cada stio. Devem ser descritas as medidas aplicadas para assegurar deve demonstrar que foram tomados em considerao todos
a traabilidade de cada lote de produo at aos produtos de base. os factores de risco das TSE e, sempre que possvel, que
o risco foi minimizado graas aplicao dos princpios
Processo de limpeza - Pode ser dificil validar a limpeza descritos no presente captulo. Os certificados de conformidade
do equipamento utilizado no que respeita eliminao TSE emitidos pela EDQM podem ser utilizados como base
da avaliao de risco pelos titulares ou requerentes de
dos agentes das TSE. Foi referido que, aps a exposio a
autorizaes de introduo no mercado.
preparaes com um ttulo muito elevado de agentes das
TSE, a infecciosidade detectvel pode permanecer associada A avaliao de risco global do medicamento, efectuada pelos
superficie de ao inoxidvel. A remoo de todas as titulares ou requerentes de autorizaes de introduo no
protenas adsorvidas atravs da utilizao de desinfectantes mercado, deve atender s avaliaes de risco de todas as
que libertem hidrxido de sdio ou cloro (p ex., 20 000 ppm matrias provenientes de espcies animais relevantes em
5. Textos gerais

de cloro durante 1 hora) foi considerada uma abordagem termos das TSE e, se adequado, reduo ou inactivao dos
aceitvel caso dos equipamentos no substituveis expostos agentes das TSE nas etapas de fabrico da substncia activa e/
a material possivelmente contaminado. Caso se utilizem /ou do produto acabado.
matrias da categoria A no fabrico de um produto, deve ser
A determinao final da conformidade regulamentar incumbe
usado equipamento dedicado, a no ser que devidamente
Autoridade competente. Os fabricantes e/ou titulares ou
justificado.
requerentes das autorizaes de introduo no mercado
Caso se utilizem matrias de risco no fabrico de um produto, de medicamentos para uso humano e para uso veterinrio
deve aplicar-se processos de limpeza, incluindo medidas de devem seleccionar e justificar as medidas de controlo em
controlo, para minimizar o risco de contaminao cruzada entre relao a um dado produto derivado de uma espcie animal
lotes de produo. Tais processos so especialmente importantes relevante em termos das TSE, atendendo ao estado da
se, na mesma instalao, forem manuseadas matrias de vrias cincia e da tecnologia.
categorias de risco utilizando o mesmo equipamento.
5. AVALIAO DA RELAO RISCO/BENEFCIO
Validao da remoo/inactivao - Os estudos de validao
dos processos de remoo/inactivao dos agentes das A aceitabilidade de um dado medicamento que contenha
TSE so dificeis de interpretar, pois necessrio atender matrias provenientes de espcies animais relevantes em
natureza do produto intencionalmente contaminado e termos das TSE, para alm dos parmetros referidos nas
sua relevncia para a situao real, concepo do estudo seces 3 e 4, deve atender aos seguintes factores:
(incluindo a reduo de escala dos processos) e ao mtodo
de deteco do agente (teste in vitro ou in vivo). So via de administrao do medicamento;
necessrios estudos complementares para compreender quantidade de matrias animais utilizadas no medicamento;
qual a metodologia de preparao 1 intencionalmente
contaminada mais adequada para os estudos de validao. dose teraputica mxima (dose diria e durao do
Por esse motivo, de um modo geral, estes estudos de tratamento);
validao no so actualmente exigidos. No entanto, se se utilizao prevista do medicamento e suas vantagens clnicas
alegar a segurana de um produto em relao s TSE com
base na capacidade de remoo ou inactivao dos agentes Os tecidos com elevada infecciosidade (categoria A) e
das TSE do processo de fabrico, tais alegaes devem ser as substncias deles derivadas no devem, portanto, ser
comprovadas atravs de estudos de validao adequados. utilizados no fabrico de medicamentos, nem das respectivas
matrias-primas e produtos intermedirios (incluindo
Os fabricantes, para alm de deverem recorrer a fontes substncias activas, excipientes e reagentes), excepto em casos
adequadas, devem ser incentivados a prosseguir a devidamente justificados. Nestes casos devem ser apresentados
investigao de mtodos de remoo e inactivao, para os motivos pelos quais no podem ser utilizadas quaisquer
identificarem passos/procedimentos que possam assegurar a outras matrias. Em tais circunstncias excepcionais e
remoo ou inactivao dos agentes das TSE. Em todo o caso, fundamentadas, pode ser previsto o recurso a tecidos com
a concepo de um processo de produo deve ter em conta, elevada infecciosidade no fabrico de substncias activas se,
sempre que possvel, as informaes disponveis sobre os aps a execuo da avaliao de risco tal como descrito na
mtodos que presumivelmente possam inactivar ou remover seco 4 do presente captulo e tendo em conta a indicao
estes agentes. clnica prevista, o requerente da autorizao de introduo no
mercado puder apresentar uma avaliao positiva da relao
risco/benefcio. As substncias provenientes de matrias
4. AVALIAO DE RISCO DAS MATRIAS OU da categoria A, caso a sua utilizao se justifique, devem ser
SUBSTNCIAS UTILIZADAS NO FABRICO E produzidas a partir de animais originrios de pases com RGB I.
PREPARAO DE UM MEDICAMENTO NO MBITO DA
CONFORMIDADE REGULAMENTAR
6. CONSIDERAES ESPECIFCAS
A avaliao do risco associado s TSE requer uma ateno
escrupulosa a todos os parmetros expostos na seco 3-1 As matrias que se seguem, preparadas a partir de espcies
Princpios cientficos de minimizao do risco. animais relevantes em termos das TSE, so consideradas em

692 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

conformidade com o presente captulo desde que observem, Mtodos de fabrico


no mnimo, as condies que se seguem. Os requerentes/
No h medidas especficas em relao s condies de
/titulares das autorizaes de introduo no mercado devem
processamento exigidas em relao gelatina produzida a
apresentar as informaes relevantes e o certificado de partir do couro, desde que sejam aplicadas medidas de controlo
conformidade concedido pela EDQM. para evitar a contaminao cruzada quer durante a extraco a
partir do couro, quer durante o processo de fabrico.
6-1. COLAGNIO No entanto, se o osso for utilizado como matria-prima, h
que atender ao modo de fabrico.
O colagnio uma protena fibrosa e um dos componentes do
O osso (incluindo as vrtebras) destinado produo de
tecido conjuntivo dos mamferos. gelatina em que se recorra ao tratamento cido apenas deve
A documentao que comprova a conformidade do colagnio provir de pases com RGB I ou II. Um tratamento alcalino
com o presente captulo deve ser apresentada tendo em conta adicional (pH 13 durante 1 hora) do osso ou da ossena
as medidas enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso, h que poder aumentar ainda mais a segurana em relao s TSE
atender ao seguinte: da gelatina derivada do osso por tratamento cido.

em relao ao colagnio obtido a partir do osso, aplicam-se as Ao osso proveniente de pases da categoria RGB III deve ser
condies especificadas para a gelatina (ver adiante). aplicado um tratamento alcalino. No entanto, este mtodo

5. Textos gerais
de fabrico facultativo no que respeita ao osso originrio de
o colagnio obtido a partir de tecidos, como os couros e pases das categorias RGB I e II.
peles, no envolve geralmente um risco mensurvel de TSE
desde que, na sua extraco, seja evitada a contaminao Num processo tpico de fabrico alcalino, o osso
com matrias potencialmente infectadas, como o sangue finamente triturado, desengordurado com gua quente e
desmineralizado com cido clordrico diludo (com uma
e/ou tecidos do sistema nervoso central.
concentrao no inferior a 4 por cento e a pH inferior a
1,5) durante um perodo de, pelo menos, 2 dias, a fim de
6-2. GELATINA produzir ossena Segue-se um tratamento alcalino com uma
soluo saturada de cal (pH de 12,5, pelo menos) durante um
perodo de, no mnimo, 20 dias. A gelatina extrada, lavada,
A gelatina uma protena solvel natural, gelificante ou no,
filtrada e concentrada. Procede-se a uma fase de tratamento
obtida por hidrlise parcial do colagnio proveniente dos
trmico instantneo (esterilizao) a 138-140 C durante
ossos, couros e peles, tendes e msculos de animais.
4 s. A gelatina proveniente do couro bovino tambm pode
Deve ser apresentada a documentao que comprova a ser produzida atravs do processo alcalino. O osso bovino
conformidade da gelatina com o presente captulo tendo em pode igualmente ser tratado atravs de um processo cido.
conta as medidas enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso, A etapa do tratamento pela cal ento substituda pelo
h que atender ao seguinte. pr-tratamento cido, em que a ossena embebida numa
soluo com pH inferior a 4, durante a noite.
Matria-prima utilizada
A gelatina utilizada nos medicamentos pode ser fabricada a
6-3. DERIVADOS DO SANGUE BOVINO
partir do osso ou do couro.
Couro como matria-prima. Em termos dos conhecimentos O soro fetal de bovino frequentemente utilizado em culturas
actuais, o couro utilizado para a produo de gelatina de clulas. O soro fetal de bovino deve ser obtido a partir de
constitui uma matria-prima muito mais segura do que fetos colhidos em matadouros em vacas saudveis e adequadas
o osso. No entanto, recomenda-se vivamente que sejam para o consumo humano. O tero deve ser completamente
aplicadas medidas para evitar a contaminao cruzada com removido e o sangue fetal deve ser colhido num espao ou
matrias potencialmente infectadas durante a extraco. local destinado a esse efeito por puno cardaca para um
sistema fechado de colheita, em condies de assepsia.
Osso como matria-prima. Se for utilizado o osso para
fabricar a gelatina, h que aplicar condies de produo O soro de vitelo recm-nascido obtido a partir de vitelos com
mais rigorosas (ver adiante). Em todo o caso, considera-se menos de 20 dias de vida e o soro de vitelo a partir de animais
que a primeira medida de precauo, que afecta em grande com idade inferior a 12 meses. No que respeita ao soro bovino
medida a segurana do produto, a remoo do crnio e da de dadores, visto poder derivar de animais com idade inferior
medula espinal da matria-prima. Na medida do possvel, a 36 meses, deve ser bem definida e documentada a situao
o osso deve provir de pases com RGB I e II O que provm em matria de TSE do efectivo dador. O soro deve ser sempre
recolhido de acordo com protocolos especificados pelo pessoal
de pases com RGB III pode ser utilizado se a gelatina for
formado em relao a estes procedimentos, a fim de evitar a
fabricada nas condies especificas adiante descritas e se se
contaminao cruzada com tecidos de risco mais elevado.
proceder remoo das vrtebras dos bovinos com idade
superior a 12 meses(15). No que respeita aos derivados do sangue de bovino,
necessrio apresentar a documentao comprovativa da
(15) Salvojustificao em contrrio, aplica-se o Regulamento (CE) n. observncia do presente captulo, tendo em conta as medidas
1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, que estabelece enumeradas nas seces 3 a 5. Alm disso, devem ser
regras sanitrias relativas aos subprodutos animais no destinados ao igualmente tomados em considerao os seguintes aspectos:
consumo humano. No que respeita ao fabrico de gelatina e colagnio
ou importao das suas matrias-primas com vista sua utilizao em
medicamentos, apenas devem ser utilizadas matrias provenientes de Traabilidade
animais adequados para consumo humano. Continua a ser autorizada a
utilizao das vrtebras de tais animais originrios de pases da categoria II H que assegurar a traabilidade at ao matadouro de cada lote
que foram considerados seguros na sequncia da avaliao de risco. de soro ou plasma. Os matadouros devem dispor de listas de

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 693


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

exploraes de onde os animais provm. Se o soro for obtido a processo em contnuo: a uma temperatura no inferior a
partir de animais vivos, devem existir registos de cada lote de 140C, sob presso, durante pelo menos 8 minutos, ou
soro que assegurem a traabilidade at s exploraes. equivalente,
destilao a 200C.
Origem geogrfica
improvvel que os derivados do sebo fabricados de acordo
Embora a infecciosidade da BSE nos bovinos seja mais com estas condies constituam qualquer espcie de risco de
limitada do que sucede com o tremor epizotico, como TSE, pelo que devem ser considerados em conformidade com
medida de precauo o sangue de bovino deve ser originrio o presente capitulo.
de pases com RGB I ou II, salvo justificao em contrrio.
Deve comprovar-se a conformidade com o presente captulo
dos derivados do sebo produzidos noutras condies.
Mtodos de atordoamento
Se for obtido a partir de animais abatidos, o mtodo de abate
importante para garantir a segurana do material. Foi 6-5. CARVO ANIMAL
comprovado que o atordoamento atravs de pistola de dardo
perfurante, com ou sem mielotomia, bem como atravs de O carvo animal preparado atravs da carbonizao de
pistola pneumtica, especialmente se houver injeco de tecidos animais (como o osso) a temperaturas elevadas,
5. Textos gerais

ar, pode destruir o crebro e disseminar tecido cerebral no superiores a 800 C. Salvo justificao em contrrio, a
sangue O risco pode ser considerado insignificante caso se matria-prima para o fabrico de carvo animal devem ser
recorra a um mtodo de atordoamento no-penetrante ou matrias da categoria 3 ou equivalente, tal como definidas
electronarcose(16). No que respeita ao processo de recolha de no Regulamento (CE) n 1774/2002 do Parlamento Europeu
sangue de bovino h, portanto, que descrever os mtodos de e do Conselho, de 3 de Outubro de 2002, que estabelece
atordoamento. Se forem autorizadas matrias originrias de regras sanitrias relativas aos subprodutos animais no
pases em que foram detectados casos de BSE (com RGB III), destinados ao consumo humano. Independentemente da
deve ser utilizado no abate um mtodo de atordoamento no origem geogrfica e da natureza do tecido, para efeitos
penetrante. de conformidade regulamentar, o carvo animal deve ser
considerado em conformidade com o presente captulo.
E improvvel que o carvo fabricado de acordo com estas
6-4. DERIVADOS DO SEBO condies constitua qualquer espcie de risco de TSE, pelo
que deve ser considerado em conformidade com o presente
O sebo a gordura obtida a partir de tecidos como os das captulo. H que comprovar a conformidade com o presente
zonas subcutneas, abdominais e intermusculares e o osso. captulo do carvo produzido noutras condies.
O sebo utilizado como matria-prima para o fabrico dos
seus derivados deve provir de matrias da categoria 3 ou
equivalente, tal como definidas no Regulamento (CE) 6-6. LEITE E DERIVADOS DO LEITE
n 1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, de
3 de Outubro de 2002, que estabelece regras sanitrias luz dos actuais conhecimentos cientficos, e
relativas aos subprodutos animais no destinados ao independentemente da sua origem geogrfica, pouco
consumo humano(17). provvel que o leite constitua qualquer espcie de risco de
contaminaco com as TSE.
Cr-se ser improvvel que produtos derivados do sebo, como
a glicerina e os cidos gordos, fabricados atravs de processos Algumas matrias, como a lactose, so extradas do soro
rigorosos, possam ser infecciosos. Estes produtos foram lcteo, o lquido proveniente da coagulao na produo
objecto de anlises especficas do CEF e do CMV. Por este de queijo. A coagulao tambm envolve a utilizao de
motivo, estas matrias, desde que fabricadas em condies coalheira de vitelo, um extracto do abomaso, ou de coalheira
pelo menos to rigorosas como as adiante indicadas, sero derivada de outros ruminantes. O CEF/CMV procedeu a uma
consideradas em conformidade com o presente captulo, anlise de risco da lactose e de outros derivados do soro
independentemente da sua origem geogrfica e da natureza lcteo produzidos a partir da coalheira de vitelo e concluiu
dos tecidos de que os derivados do sebo provm. So exemplo que o risco de TSE insignificante se ela for produzida de
de processo rigorosos: acordo com o processo descrito no relatrio de avaliao do
risco(18). Esta concluso foi avalizada pelo Comit Cientfico
a transesterificao ou hidrlise a uma temperatura no
Director(19), que tambm procedeu a uma avaliao geral do
inferior a 200 C, durante pelo menos 20 minutos, sob
risco TSE da coalheira(20).
presso (produo de glicerina, cidos gordos e steres de
cidos gordos), (18) O Comit das Especialidades Farmacuticas e o respectivo Grupo de

a saponificao com NaOH 12 M (produo de glicerina e de Trabalho Biotecnologia procederam a uma avaliao regulamentar e do
sabo), risco da lactose preparada utilizando a coalheira de vitelo. Esta avaliao de
risco abrangeu a origem dos animals, a exciso do abomaso e a existncia de
processo por lote: a uma temperatura no inferior a 95 C, procedimentos bem definidos de garantia da qualidade. particularmente
importante a qualidade dos eventuais substitutos do leite utilizados na
durante, pelo menos, 3 horas, alimentao dos animais de que os abomasos provm. Estas orientaes
encontram-se acessveis no seguinte endereo: http://iwww.emea.eu.int
(16) (19) Declarao provisria sobre a segurana da coalheira de vitelo no fabrico
Parecer do CCD sobre mtodos de atordoamento e risco de BSE
(Risco de disseminao de partculas cerebrais para o sangue e a carcaa da lactose. Adoptada na reunio de 4-5 de Abril de 2002 do Comit Cientifico
quando so utilizados determinados mtodos de atordoamento), adoptado Director, (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/ssc/out255_en.pdf).
(20) O CCD emitiu um parecer sobre a segurana da coalheira animal no que
na sua reunio de 10-11 de Janeiro de 2002. http://europa.eu.int/comm/
food/fs/sc/ssc/out245_en.pdf respeita ao risco de EET veterinrias e, em especial, de BSE, na sua reunio de
(17) JO L 273, 10.10.2002, p.1. 16 de Maio de 2002. (http://europa.eu.int//comm/food/fs/sc/ssc/out265_en.pdf).

694 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

improvvel que os derivados do leite fabricados de acordo Aminocidos produzidos a partir de couros e peles atravs
com condies que se seguem constituam qualquer espcie de um processo que envolva a exposio das matrias a
de risco de TSE, pelo que devem ser considerados em um pH de 1 a 2, seguida do tratamento a um pH > 11, e,
conformidade com o presente captulo. aps isso, de um tratamento trmico a 140 C durante 30
leite que provenha de animais saudveis e nas mesmas minutos a 3 bares;
condies que o leite destinado ao consumo humano; os aminocidos ou pptidos resultantes devem ser filtrados
no utilizao de outras matrias de ruminantes, excepto a aps a produo;
coalheira de vitelo, na preparao de tais derivados efectuar-se uma anlise, utilizando um mtodo validado e
(ex.: tratamento da casena por enzimas pancreticas).
sensvel, para verificar a ausncia de eventuais macromolculas
Deve comprovar-se a conformidade com o presente captulo residuais intactas, sendo fixado um limite adequado.
dos derivados do leite produzidos atravs de outros processos
necessrio comprovar a conformidade com o presente
e da coalheira derivada de outras espcies de ruminantes.
captulo dos aminocidos produzidos noutras condies.

6-7. DERIVADOS DA L
ANEXO: PRINCIPAIS CATEGORIAS DE INFECCIOSIDADE

5. Textos gerais
Os derivados da l e do plo de ruminantes, como a lanolina
e os lcoois de l derivados do plo, devem ser considerados Os quadros que se seguem constituem uma adaptao
em conformidade com o presente captulo se a l e o plo dos publicados na WHO Guideline on Transmissible
provierem de animais vivos. Spongiform Encephalopathies in Relation to Biological and
Pharmaceutical Products (Nota Explicativa da OMS sobre
improvvel que os derivados da l produzidos a partir de
as encefalopatias espongiformes transmissveis relativa aos
l proveniente de animais abatidos declarados adequados
produtos biolgicos e farmacuticos), de Fevereiro de 2003.
para consumo humano e cujo processo de fabrico, no
que respeita ao pH, temperatura e durao do tratamento,
observe pelo menos uma das condies exigidas de Abreviaturas utilizadas:
processamento que se seguem constituam qualquer espcie + = Existncia de infecciosidade ou da PrPTSE (23)
de risco de TSE, pelo que devem ser considerados em
conformidade corn o presente captulo. - = Inexistncia de infecciosidade ou de PrPTSE detectvel
Tratamento a pH 13 (inicial; correspondente a uma NT = No testado(a)(s)
concentrao mnima de NaOH 0,1 M) e a uma temperatura
? = Resultados controversos ou incertos
60C durante, pelo menos, 1 hora, o que sucede
normalmente durante a fase de refluxo do tratamento
alcalino orgnico; Categoria A: tecidos com elevada infecciosidade

destilao molecular a uma temperatura 220C e a presso Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
reduzida. Deve comprovar-se a conformidade com o presente BSE Tremor epizotico
captulo dos derivados da l produzidos noutras condies.
Infecciosidade1 PrPTSE Infecciosidade1 PrPTSE

Crebro + + + +
6-8. AMINOCIDOS
Medula espinal + + + +

Os aminocidos podem ser obtidos por hidrlise de materiais Retina, nervo ptico + NT NT +
provenientes de vrias fontes. Gnglios espinais + NT NT +
Salvo justificao em contrrio, a matria-prima utilizada no Gnglio do trigmeo + NT NT +
fabrico de aminocidos deve provir de matrias da categoria
Hipfise2 - NT + NT
3 ou equivalente, tal como definidas no Regulamento (CE)
n 1774/2002 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 3 de Dura-mter2 NT NT NT NT
Outubro de 2002, que estabelece regras sanitrias relativas aos
subprodutos animais no destinados ao consumo humano. 1. Foram efectuados bioensaios de inlecciosidade de tecidos de bovinos quer
em bovinos, quer no murganho (ou em ambas as espcies); a maior parte dos
improvvel que os aminocidos preparados nas bioensaios de tecidos de ovinos e/ou caprinos apenas foram efectuados no
murganho. Em relao aos ovinos e caprinos, nem todos os resultados foram
condies de processamento que se seguem, bem como em consistentes em ambas as espcies.
conformidade com a Deciso 98/256/CE da Comisso(21) e
2. No foram notificados dados experimentais sobre a infccciosidade da
com a Deciso 2001/376/CE da Comisso(22), constituam hipfise ou da dura-meter humanas, embora os enxertos de dura-mter
qualquer espcie de risco de TSE, pelo que devem ser de cadver e a hormona do crescimento derivada das hipfises de cadver
tenham transmitido doena a inmeros pacientes e devam, portanto, ser
considerados em conformidade com o presente captulo. includas na categoria dos tecidos com elevada infecciosidade.

(21) JO L 113 de 15.04.1998. p.32.


(22) JO L 132 de 15.05.2001, p. 17.
(23) No corpo do texto do presente captulo, a isoforma anormal da

protena do prio designada PrPSc. No entanto, uma vez que estes


quadros so reproduzidos directamente a partir da directriz da OMS
supracitada, foi mantida a nomenclatura da OMS em relao protena
do prio anormal (PrPTSE).

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 695


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Categoria B: tecidos com menor infecciosidade


Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
BSE Tremor epizotico
Infecciosidade PrPTSE Infecciosidade PrPTSE
Sistema nervoso perifrico
Nervos perifricos - NT + NT
Plexos entricos1 NT + NT +
Tecidos info-reticulares
Bao - - + +
Gnglios linfticos - - + +
Amgdalas + NT + +
Membrana nictitante NT - NT +
Timo - NT + NT
Tubo digestivo
5. Textos gerais

Esfago - NT NT +
Pr-estmago2 (apenas ruminantes) - NT NT +
Estmago/abomaso2 - NT NT +
Duodeno - NT NT +
Jejuno - NT NT +
leo3 + + + +
Intestino grosso + NT + +
Tecidos reprodutivos
Placenta - NT + +
Outros tecidos
Pulmo* - NT - NT
Fgado - NT + NT
Rim* - - - -
Glndula supra-renal NT NT + NT
Pncreas - NT + NT
Medula ssea + NT + NT
Vasos sanguneos - NT NT +
Mucosa olfactiva - NT + NT
Tecido gengival* NT NT NT NT
Glndula salivar - NT + NT
Crnea4* NT NT NT NT
Fluidos corporais
Lquido cerebrospinal - NT + NT
Sangue 5 - NT + -

1. Limitado ao leo distal nos bovinos.


2.O pr-estmago dos ruminantes (retculo, rmen e omaso) largamente consumido, tal como sucede com o estmago verdadeiro (abomaso). O abomaso dos
bovinos (e, por vezes, dos ovinos) tambm uma fonte de coalheira.
3. Nos bovinos e ovinos, s se procedeu ao bioensaio de infecciosidade do leo distal.
4.Visto que s um ou dois casos de DCJ foram plausivelmente atribudos a transplantes da crnea em centenas de milhares de procedimentos, a cmea
classificada como um tecido com menor infecciosidade; outros tecidos da cmara anterior (cristalino, humor aquoso, ris e conjuntiva) foram testados, com
resultados negativos em relao quer vDCJ, quer a outras TSE humanas e no h dados epidemiolgicos que comprovem estarem associados transmisso
iatrognica de doena.
5.No foram confirmadas as primeiras notificaes da transmisso da doena a roedores a partir do sangue de doentes com DCJ e a avaliao do conjunto dos
dados experimentais e epidemiolgicos relevantes para a transmisso de TSE atravs do sangue, de componentes do sangue e de produtos plasmticos para fins
teraputicos no sugere a transmisso de nenhum tipo de TSE clssica atravs do sangue dos doentes. No h dados suficientes que permitam formular a
mesma afirmao em relao ao sangue de doentes com a vDCJ. No h infecciosidade detectvel no sangue fetal de vitelo, embora em ovinos genotipicamente
sensveis com tremor epizotico natural ou com BSE induzida experimentalmente a transfuso de grandes volumes de sangue tenha resultado na transmisso
da doena a ovinos saudveis. Foi igualmente demonstrada a infecciosidade em estudos de estirpes de TSE adaptadas aos roedores.
*Estes tecidos foram classificados na categoria B-Tecidos com menor infecciosidade, visto ter sido comprovada infecciosidade e/ou PrPTSE no contexto da DCJ
humana (vDCJ ou outra).

696 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.8. Minimizaco do risco de transmisso de agentes de encefalopatias espongiformes animais

Categoria C: tecidos sem infecciosidade detectvel


Tecidos Bovinos Ovinos e caprinos
BSE Tremor epizotico
Infecciosidade PrPTSE Infecciosidade PrPTSE
Tecidos reprodutivos
Testculo - NT - NT
Prstata/Epiddimo/
/Vesicula seminal - NT - NT
Smen - NT NT NT
Ovrio - NT - NT
tero (no-grvido) - NT - NT
Fluidos placentares - NT NT NT
Feto1 - NT - NT
Embries1 - NT ? NT

5. Textos gerais
Tecidos
msculo-esquelticos
Osso - NT NT NT
Msculo esqueltico2 - NT - NT
Lngua - NT NT NT
Corao/pericrdio - NT - NT
Tendo - NT NT NT
Outros tecidos
Traqueia - NT NT NT
Pele - NT - NT
Tecido adiposo - NT NT NT
Glndula tiride NT NT - NT
Glndula mamria/bere - NT - NT
Fluidos, secrees e
excrees corporais
Leite3 - NT - NT
Colostro4 NT NT - NT
Sangue do cordo4 - NT NT NT
Saliva NT NT - NT
Suor NT NT NT NT
Lgrimas NT NT NT NT
Muco nasal NT NT NT NT
Urina 4, 5 - NT NT NT

Fezes - NT - NT

1.Os embries de bovinos afectados pela BSE no transmitiram a doena aos murganhos, embora se no tenham efectuado medies da infecciosidade em
tecidos fetais de vitelos para alm do sangue (bioensaio negativo no murganho). Os vitelos descendentes de vacas que receberam embries de bovinos afectados
pela BSE sobreviveram durante perodos de observao de at sete anos e o exame dos crebros quer das vacas no afectadas, quer dos respectivos vitelos no
revelaram encefalopatia espongiforme, nem a existncia dc PrPTSE.
2.A inoculao intracerebral de msculo homogeneizado no transmitiu a doena a: 1) primatas, a partir de doentes com a DCJ: 2) murganhos e bovinos, a
partir de bovinos com a BSE; 3) murganhos, a partir de ovinos e caprinos com tremor epizotico espontneo ou induzido experimentalmente. No entanto,
notificaes prvias haviam descrito casos isolados de transmisso a partir do msculo de caprinos e de cobaias e uma notificao mais recente descreve a
transmisso a partir do msculo de murganhos de tipo selvagem e transgnico, no entanto, tendo em conta que estes estudos foram efectuados com estirpes de
agentes das TSE que sofreram vrias passagens, a sua relevncia em termos da ocorrncia espontnea da doena permanea por esclarecer. Um caso humano
recente descreve um doente com DCJ e miosite de corpos de incluso, que apresentava uma quantidade abundante de PrPTSE no msculo doente. Aps anlise
aprofundada, o Comit decidiu, no entanto, manter o msculo na categoria de tecidos sem inlecciosidade detectvel enquanto se aguardam mais informaes
sobre a infeco espontnea e sem complicaces
3. Os dados comprovativos de que a infecciosidade no detectvel no leite incluem observaes epidemiolgicas temporo-espaciais que no permitiram detectar

transmisso materna; observaes clnicas de mais de uma centena de vitelos amamentados por vacas infectadas, os quais no desenvolveram a BSE; observaes
experimentais de que o leite proveniente de vacas infectadas no transmitiu a doena quando foi administrado a murganhos intracerebral ou oralmente. Esto a decorrer
experincias em que grandes volumes de leite proveniente de vacas infectadas experimentalmente so concentrados e testados para detectar a presena de PrPTSE.
4.A notificao de casos isolados de transmisso da infecciosidade da DCJ a partir do sangue do cordo umbilical, do colostro e da urina humanos nunca foi
comprovada e considerada improvvel.
5.Um tipo de PrP nunca antes notificado, denominado PrPu, foi identificado na urina de doentes com a DCJ espordica e familiar, mas continua por esclarecer o
seu significado em termos de risco de transmisso.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 697


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5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio

5.2.9. AVALIAO DA INOCUIDADE Perodo de observao. Quando se registam critrios


objectivos como se descreve a seguir, tal como a temperatura
DE CADA LOTE DE VACINAS E SOROS corporal, os animais so examinados e observados durante,
PARA USO VETERINRIO pelo menos, 3 dias antes da administrao do produto.
Aps administrao do produto, os animais so mantidos
O termo produto utilizado neste texto, tanto se aplica a em observao e examinados, pelo menos, 1 vez por dia,
uma vacina como a um soro. durante, no mnimo, 14 dias, para se detectar reaces locais
e gerais. No dia da administrao do produto, necessrio
Definio das reaces anormais. Durante os estudos de efectuar, pelo menos, 1 inspeco suplementar aps 4 h, ou
desenvolvimento, o tipo e o tamanho das reaces esperadas nos intervalos de tempo especificados nas monografias. Nos
aps administrao do produto so definidas luz dos casos de segunda administrao do produto, o perodo de
estudos de inocuidade. No quadro dos ensaios de inocuidade observao termina 14 dias aps a segunda administrao.
efectuados em cada lote, esta definio das reaces locais e
gerais normais ou anormais depois utilizada para se avaliar Reaces locais e gerais. Os animais que apresentam
as reaces aceitveis e no aceitveis. reaces locais ou gerais anormais graves so abatidos. Em
todos os animais mortos efectua-se um exame necrpsico
Quantidade administrada durante o ensaio. Para um macroscpico. Podem ser indicados exames microscpicos e
5. Textos gerais

produto apresentando o ttulo ou a actividade pretendidos microbiolgicos complementares.


dentro dos limites especificados para os lotes de produo, Os animais mantidos em observao so examinados com
o termo dose nos ensaios, designa a dose recomendada. vista a serem detectadas reaces locais ou gerais.
A quantidade a ser administrada no ensaio geralmente
definida em nmero de doses. No caso de vacinas vivas Quando constituam indicadores de utilidade reconhecida,
liofilizadas, as 10 doses so reconstitudas num volume so tambm registados outros critrios, por exemplo a
apropriado de solvente para o ensaio. No caso de produtos temperatura corporal, a massa corporal, outros ndices de
rendimento e consumo de alimentos.
que se apresentam na forma de 2 recipientes contendo
respectivamente um ou vrios componentes vivos liofilizados Reaces locais. Na medida em que for apropriado e possvel,
e um ou vrios componentes inactivados a utilizar como registam-se o tamanho e a persistncia de qualquer reaco
diluente, pode ser necessrio utilizar lquido suplementar local (incluindo o aparecimento de reaces dolorosas) e
para reconstituir o(s) componente(s) liofilizado(s). Quando tambm o nmero de animais que manifestam as reaces
necessrio e justificado, convm injectar num local o locais.
contedo de 2 recipientes do componente inactivado Reaces gerais. A temperatura e, se apropriado, a massa
misturado no contedo de um nmero mximo de corporal so anotados como indicadores gerais dos efeitos
recipientes do componente vivo liofilizado e os restantes sistmicos da administrao do produto. Todos os sinais
componentes vivos liofilizados reconstitudos num solvente clnicos so igualmente registados.
apropriado podem ser inoculados num local separado. No
caso de vacinas combinadas, os ensaios efectuados na vacina Temperatura corporal. Nos mamferos, os estudos incluem
combinada consideram-se como suficientes para estabelecer a medio da temperatura corporal durante o perodo
a inocuidade dos componentes individuais. de observao. A temperatura corporal registada, pelo
menos, 3 dias antes da administrao do produto, na altura
da administrao e depois, decorridas 4 h e em intervalos
Via de administrao. O produto administra-se por uma das regulares. A temperatura corporal antes da administrao
vias recomendadas. Em princpio, convm preferencialmente do produto encontra-se entre os valores fisiolgicos. Pelo
utilizar a via de administrao mais favorvel para permitir a menos nos produtos em que previsvel um aumento
deteco de reaces. significativo da temperatura (por exemplo, nos produtos que
contm endotoxinas e vrias vacinas vricas vivas) ou nos
Quando se sabe que existe um risco particular, por exemplo quais a monografia correspondente especifica um aumento
na sequncia dos estudos de desenvolvimento, efectua-se da temperatura (por exemplo, no mximo, 2C nas vacinas
uma segunda administrao com a dose apropriada aps um contra a actinobacilose do porco), recomenda-se a utilizao
intervalo apropriado como se determinou durante a fase de da temperatura mdia dos dias anteriores administrao
desenvolvimento. do produto (por exemplo, 3 dias ao dia 0) como linha base
de temperatura, para se dispor de um critrio claro para a
avaliao do ensaio.
Espcies animais e categorias alvo. Salvo excepo
justificada e autorizada, convm utilizar animais com idade Massa corporal e consumo de alimento. Quando constitui
mnima recomendada e da espcie mais sensvel para a um indicador de inocuidade com uma fiabilidade e uma
vacinao ou administrao do produto. utilidade reconhecidas, por exemplo nos animais jovens
em fase de crescimento ou nos peixes, a massa corporal
medida e documentada pouco tempo antes da administrao
Nmero de animais. Nas monografias indica-se o nmero de
do produto e durante o perodo de observao. Controla-se
animais a utilizar. Regra geral, de 2 para os mamferos e de
o consumo de alimentos e documenta-se como indicador
10 para as aves e os peixes.
do efeito da administrao do produto. Na maior parte dos
casos, suficiente registar a rao diria consumida ou a
Identificao dos animais. Salvo excepo justificada, todos que parcial ou totalmente rejeitada, mas, em alguns casos,
os animais so objecto de uma marcao que permita o pode ser necessrio registar o peso efectivo da alimentao
registo individual dos dados respeitantes ao perodo total de consumida, quando se trata de um indicador apropriado da
observao. inocuidade do produto.

698 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.2.9. Avaliao da inocuidade de cada lote de vacinas e soros para uso veterinrio

Sinais clnicos. Anotam-se todos os sinais clnicos de Critrios para a repetio do ensaio. Se surge um sinal
natureza geral, esperados ou no, nomeadamente as anormal, com base, se necessrio, de um exame necrpsico,
modificaes do estado de sade e as alteraes de o veterinrio responsvel determina se esse sinal devido ao
comportamento. produto. Se a causa do sinal clnico no for clara, ou quando
Fichas de avaliao. Em funo dos sinais esperados, um animal retirado do ensaio por motivos independentes do
preparam-se as fichas de avaliao para cada produto. Todos produto, o ensaio pode ser repetido. Se, no segundo ensaio,
os parmetros e todos os dados so registados nestas fichas. As reaparece o mesmo sinal anormal, o produto no satisfaz
fichas incluem parmetros gerais mas tambm so adaptadas ao ensaio. Regista-se qualquer tratamento administrado aos
a cada tipo de produto e incluem a lista de sinais clnicos que animais durante o perodo de observao. Se o tratamento
podem ser mais marcantes para um dado produto. puder interferir com o ensaio, o ensaio no vlido.

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 699


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5.3. ANLISES
ESTATSTICAS DE
RESULTADOS DE ENSAIOS
E TESTES BIOLGICOS
5.3. Anlise estatstica de resultados de ensaios e testes 5. Exemplos....................................................................... 715

5. Textos gerais
biolgicos................................................................... 703 6. Combinao de resultados de ensaios.......................... 727
1. Introduo.................................................................... 703 7. Para alm desta monografia......................................... 729
2. Aleatoriedade e independncia 8. Tabelas e mtodos de clculo....................................... 730
de tratamentos individuais........................................ 703 9. Glossrio de smbolos e termos................................... 734
3. Ensaios dependentes de respostas quantitativas......... 704 10. Bibliografia recomendada.......................................... 735
4. Ensaios dependentes de respostas qualitativas............ 713

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 701


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5.3. Anlises estatsticas

A segunda verso desta monografia aparece agora Os limites de confiana para uma determinada actividade
restruturada, mantendo-se os conceitos definidos na do uma indicao da preciso com a qual a actividade foi
introduo feita na traduo portuguesa para a Farmacopeia calculada no ensaio. So calculados tendo em ateno o
Portuguesa VI. Aconselhamos a consulta daquela monografia, desenho experimental e o tamanho da amostra. O limite de
pois alguns conceitos no esto aqui contemplados; por outro confiana para 95 por cento habitualmente escolhido para
lado, e mantendo o princpio j consignado, apresenta-se em os ensaios biolgicos. Os mtodos matemticos so utilizados
suplemento um glossrio de termos estatsticos nas verses para calcular aqueles limites e para garantir que existe a
portuguesa e inglesa, uma vez que a terminologia estatstica probabilidade de 95 por cento de que estes limites incluam a
est muito ligada lngua inglesa. actividade real. A aceitao desta preciso pela Farmacopeia
depende dos requisitos estipulados na monografia da
preparao em causa.
1. INTRODUO
Os termos mdia e desvio padro so usados aqui
Este captulo contm indicaes relativas concepo de tal como definidos nos manuais de bioestatstica mais
ensaios biolgicos prescritos na Farmacopeia e anlise dos divulgados.
seus resultados. Foi redigido para uso dos utilizadores de que Os termos actividade declarada ou actividade rotulada,
nem a formao nem as funes principais sejam de estatstica, actividade atribuda, actividade assumida, relao de
mas que, pelas suas funes devem analisar ou interpretar os actividade e actividade estimada so usados neste captulo

5. Textos gerais
resultados daqueles ensaios, muitas vezes sem o auxlio ou para os conceitos seguintes:
orientao de um especialista. Os mtodos de clculo descritos
aqui no tm um carcter obrigatrio para interpretao dos actividade declarada ou actividade rotulada: no caso
doseamentos que constituem parte integrante da Farmacopeia. de um produto preparado, um valor nominal atribudo a
Podem ser utilizados mtodos alternativos, sob a condio partir do conhecimento existente da actividade da matria
de serem to fiveis como os aqui descritos. H uma grande prima; no caso da matria prima, consiste na actividade
escolha de programas de clculo informticos disposio do prevista pelo fabricante,
analista, e podem ser mais ou menos teis de acordo com as actividade atribuda: a actividade da substncia padro,
facilidades disponveis e as competncias do analista.
actividade assumida: actividade provisria de uma
H situaes onde a orientao de um especialista necessria: amostra que forma a base de clculo da dose que ir ter
tratamento global da organizao e anlise de ensaios no mbito uma actividade equivalente dose da preparao com o
da investigao ou do desenvolvimento de novos produtos; as padro a utilizar,
restries impostas ao desenho do ensaio neste captulo no
sejam satisfeitas, por exemplo restries laboratoriais especficas relao de actividade de uma amostra: relao entre
podem requerer desenhos de ensaios particulares, ou quando o as doses da preparao padro e da amostra com uma
uso de doses em nmero igual e equidistantes no apropriado; actividade equivalente nas condies do ensaio,
anlise de curvas dose-resposta no lineares de grande extenso, actividade estimada: actividade calculada a partir dos
como por exemplo nos ensaios imunolgicos. Um esboo dados do ensaio.
pormenorizado de anlises de curva dose-resposta para um
conjunto alargado de modelos includo na seco 3.4 e um A seco 9 (Glossrio de smbolos e termos) contm uma
exemplo simples dado na seco 5.4. tabela com os smbolos mais usados neste anexo. Quando
o texto se referir a um smbolo inexistente naquela seco
ou usar um smbolo para um conceito diferente, ele ser
1.1. DESENHO GERAL E PRECISO definido na respectiva parte do texto.

A Farmacopeia descreve mtodos biolgicos destinados ao


doseamento de substncias e preparaes em que a actividade 2. ALEATORIEDADE E INDEPENDNCIA
no pode ser correctamente determinada por mtodos qumicos DE TRATAMENTOS INDIVIDUAIS
ou fsicos. Na medida do possvel, o princpio aplicado nos
doseamentos a comparao com a preparao padro de modo
A distribuio de diferentes tratamentos a diferentes unidades
a determinar a quantidade da amostra que produz o mesmo
experimentais (animais, tubos, etc.) deve ser realizada
efeito biolgico que uma quantidade determinada da substncia
estritamente por processos aleatrios. Qualquer outra escolha
padro, a Unidade. Uma das condies essenciais aplicao
de condies experimentais, que no sejam contempladas
destes mtodos de titulao que os ensaios so efectuados
simultaneamente com as preparaes padro e as amostras, no desenho experimental, deve igualmente ser aleatria.
e em condies idnticas. Para certos ensaios (por exemplo, Exemplos disso so a escolha da posio das jaulas num
determinao de ttulos de vrus), a actividade da amostra no laboratrio e a ordem de administrao dos tratamentos. Em
expressa em termos relativos em relao ao padro. A seco 4.5 particular, um grupo de animais que receba a mesma dose de
refere-se a este tipo de ensaio. qualquer preparao no deve ser tratado em conjunto (ao
mesmo tempo ou na mesma posio), a no ser que exista uma
Qualquer avaliao da actividade derivada do ensaio biolgico forte evidncia que a fonte de variao relevante (por exemplo,
sujeita a erro aleatrio devido variabilidade inerente entre tempos ou entre posies) seja negligencivel. A
das respostas biolgicas e devem ser feitos os clculos dos distribuio aleatria pode ser obtida a partir de computadores
erros, se possvel, a partir dos resultados dos ensaios, mesmo usando a funo aleatria pr-definida. O experimentador deve
quando so utilizados os mtodos oficiais. Os mtodos para verificar que so produzidas sries de nmeros diferentes cada
o desenho dos ensaios e clculos dos respectivos erros so, vez que a funo activada.
assim, descritos a seguir. Em cada caso, antes da adopo
de um mtodo estatstico, devem ser realizados ensaios As preparaes atribudas a cada unidade experimental devem
preliminares em nmero apropriado de modo a certificar a ser to independentes quanto possvel. Dentro de cada grupo
aplicabilidade do mtodo. experimental, as diluies atribudas a cada tratamento no

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 703


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

devem ser apenas divises da mesma dose, mas preparadas introduzem defeitos nas anlises, desde que as diferentes
individualmente. Sem esta precauo indispensvel, a rplicas por tratamento sejam includas. Em caso de
variabilidade inerente preparao no estar completamente dvida, pode ser feito um teste para desvio normalidade
representada na varincia do erro experimental. O resultado (p. ex. o teste de Shapiro-Wilk(1)),
ser uma subestimao do erro residual conduzindo a:
a condio 3 pode ser verificada com um teste de
1) um aumento injustificado do rigor dos testes da anlise de homogeneidade de varincias (p. ex. o teste de
varincia (ver seces 3.2.3 e 3.2.4), Bartlett(2) ou o teste de Cochran(3)). A inspeco das
2) uma subestimativa dos verdadeiros limites de confiana representaes grficas dos dados pode igualmente ser
para o teste, que so calculados a partir da estimativa de s2 elucidativa deste objectivo (ver exemplos na seco 5).
(mdia quadrtica do erro residual), tal como mostrado Quando as condies 2 e/ou 3 no forem satisfeitas, a
na seco 3.2.5. transformao das respostas podem originar um melhor
preenchimento daquelas condies. Exemplos so ln y, y ou y2:
a transformao logartmica das respostas y em ln y pode
3. ENSAIOS DEPENDENTES ser til quando a homogeneidade das varincias no
DE RESPOSTAS QUANTITATIVAS satisfatria. Pode igualmente melhorar a normalidade da
distribuio quando ela est desviada para a direita,
5. Textos gerais

3.1. MODELOS ESTATSTICOS


a transformao de y em y til quando as observaes
3.1.1. PRINCPIOS GERAIS seguem a distribuio de Poisson, isto , quando so obtidas
por contagem,
Os ensaios biolgicos includos na Farmacopeia foram a transformao quadrtica de y em y2 til quando, por
concebidos como ensaios de diluio, o que significa exemplo, mais provvel que a dose seja proporcional rea de
que suposto que as amostras a serem ensaiadas tenham uma zona de inibio do que medida do dimetro da zona.
a mesma substncia activa que as preparaes padro, mas
em propores diferentes de substncia activa e substncias Para alguns ensaios dependentes de respostas quantitativas,
inertes. Em tal caso, as amostras podem, em teoria, tal como os imunoensaios ou ensaios in vitro em clulas,
ser derivadas das preparaes padro por diluio com deve ser usado um grande nmero de doses. Estas doses
substncias inertes. Para verificar se um ensaio em especial do respostas que abarcam toda a latitude de respostas e
pode ser considerado um ensaio de diluio, necessrio produzem uma curva no linear prolongada da dose-
observar os efeitos da diluio dos padres na relao dose- -resposta. Tais curvas so tpicas de todos os bioensaios, mas
-resposta da substncia activa. Quando a diferena entre a para muitos ensaios o uso de um largo nmero de doses
relao dose-resposta das preparaes padro e da amostra no tico (por exemplo, ensaios in vivo) ou prtico, e os
num ensaio se desvia marcadamente do efeito da diluio da objectivos do ensaio podem ser atingidos com um nmero
substncia activa na diluio terica do ensaio, este modelo limitado de doses. , deste modo, habitual restringir as
no validado para este ensaio especfico. doses parte linear da curva dose-resposta obtida por uma
Diferenas significativas nas relaes dose-resposta do transformao apropriada, de modo a que os mtodos
padro e da amostra podem sugerir que uma das preparaes descritos nas seces 3.2 ou 3.3 sejam aplicveis. Contudo,
contm, para alm da substncia activa, outras componentes em alguns casos a anlise de toda a curva dose-resposta
que no so inertes mas que podem influenciar as respostas desejvel. Um esboo de um modelo aplicvel para tais
medidas. anlises dado na seco 3.4 e um exemplo simplificado
apresentado na seco 5.4.
Para realizar o efeito da diluio no modelo terico aparente,
til transformar a relao dose-resposta numa funo linear Uma categoria separada constituda pelos ensaios em
na maior latitude possvel de doses. Dois modelos estatsticos que a resposta no pode ser mensurada em cada unidade
so de interesse para os ensaios biolgicos prescritos: o experimental, mas em que apenas a fraco das unidades
modelo de linhas paralelas e o modelo de relao de declives. respondendo a cada tratamento podem ser contadas. Esta
A aplicao de qualquer um deles dependente do categoria abordada na seco 4.
preenchimento das seguintes condies:
1) os diferentes tratamentos foram atribudos aleatoriamente 3.1.2. ENSAIOS DE ROTINA
s unidades experimentais,
Quando um ensaio de utilizao em rotina, normalmente
2) as respostas de cada tratamento esto normalmente
distribudas, possvel verificar sistematicamente o cumprimento das
condies 1 a 3, porque o nmero limitado de observaes
3) os desvios padres da resposta dentro de cada por ensaio pode influenciar a sensibilidade dos testes
grupo tratado do padro e da amostra no diferem estatsticos. Felizmente, foi demonstrado que, em
significativamente uns dos outros. ensaios balanceados simetricamente, pequenos desvios
Quando um ensaio desenvolvido, o analista deve determinar homogeneidade da varincia e da normalidade no afectam
que os dados recolhidos em mltiplos ensaios obedecem s seriamente os resultados do ensaio.
seguintes condies tericas:
(1) Wilk, M. B. e Shapiro, S. S. (1968). The joint assessment of nor- mality of
a condio 1 pode ser preenchida atravs de um uso several independent samples, Technometrics, 10: 825-839.
eficiente da seco 2, (2) Bartlett, M. S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc.

Roy. Soc. London, Series A, 160: 280-282.


a condio 2 um requisito que na prtica sempre (3) Cochran, W. G. (1951). Testing a linear regression amoung variances,

cumprido. Desvios menores deste requisito geralmente no Biometrics 7, 17-32.

704 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

A aplicabilidade do modelo estatstico deve ser questionada todas as causas de variao que podem afectar o ensaio, o que
apenas quando uma srie de ensaios demonstrar uma pode originar na subavaliao do erro residual conducente a
validao duvidosa. Pode ento ser necessrio desenvolver grandes rcios-F.
uma srie de investigaes preliminares como discutido na
Nem sempre possvel ter em ateno todas as causas
seco 3.1.1. possveis de variao num nico ensaio (por exemplo,
Duas outras condies necessrias condicionam o modelo variao diria). Nestes casos, os limites de confiana
estatstico a ser usado: de ensaios repetidos da mesma amostra podem no se
sobreporsatisfatoriamente, e deve ter-se cuidado na
para o modelo de linhas paralelas interpretao dos limites de confiana individuais. De modo
4A. A relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode a obter uma avaliao mais correcta do limite de confiana
ser representada por uma linha recta no intervalo das doses pode ser necessrio realizar vrios ensaios independentes e
usadas, combin-los numa nica actividade estimada e num nico
intervalo de confiana (ver seco 6).
5A. Para qualquer amostra no ensaio, a linha recta
paralela obtida com o padro. Com o objectivo fazer o controlo de qualidade de ensaios de rotina
recomendado manter o registo das previses do declive da
para o modelo de relao de declives regresso e da previso do erro residual nos mapas de controlo.
4B. A relao entre a dose e a resposta pode ser Um erro residual excepcionalmente elevado pode indicar

5. Textos gerais
representada por uma linha recta para cada preparao no um problema tcnico. Este facto deve ser investigado e, se
ensaio acima do intervalo de doses utilizadas, for demonstrado que algo correu mal durante o processo,
o ensaio deve ser repetido. Um erro residual invulgarmente
5B. Para cada amostra no ensaio, a linha recta intersecta o
elevado pode igualmente indicar a presena de uma resposta
eixo y (na dose zero) no mesmo ponto que a linha recta da
fora de contexto (outlying) ou de uma observao aberrante.
preparao padro (isto , as funes de resposta de todas
Uma resposta questionvel devido falha de cumprimento
as preparaes do ensaio devem ter o mesmo ponto de
do procedimento durante um ensaio rejeitada. Se for
intercepo da resposta da funo padro). descoberto um valor aberrante aps o registo das respostas,
As condies 4A e 4B apenas podem ser verificadas em mas puder ser relacionado com irregularidades do ensaio,
ensaios em que, pelo menos, 3 diluies de cada preparao pode ser justificada a sua omisso. A rejeio ou reteno
foram testadas. O uso de um ensaio com apenas 1 ou arbitrria de uma resposta aparentemente aberrante pode ser
2 diluies pode ser justificado quando a experincia uma forte causa de interferncia. Em geral, desencoraja-se a
demonstrou que a linearidade e o paralelismo ou igual rejeio de observaes apenas devido significncia de um
intercepo so regularmente realizadas. teste de contexto.

Depois de recolher os resultados de um ensaio, e antes de Um erro residual excepcionalmente baixo pode verificar-
calcular a sua actividade relativa de cada amostra, deve se esporadicamente e d origem a rcios-F que excedem
ser feita uma anlise de varincia de modo a verificar se as os valores crticos. Em tal caso, pode justificar-se a
condies 4A e 5A (ou 4B e 5B) so cumpridas. Para tal, o substituio do erro residual estimado a partir do ensaio
total da soma dos quadrados subdividido num certo nmero individual pelo erro residual mdio baseado nos dados
de somas de quadrados correspondentes a cada condio que histricos registados nos mapas de controlo.
foi realizada. O restante da soma dos quadrados representa o
erro experimental residual para a qual a ausncia ou presena
3.1.3. CLCULOS E RESTRIES
de causas relevantes de variao pode ser comparada pelas
sries de rcios-F.
De acordo com os princpios gerais de um bom desenho
Quando a validao est estabelecida, a actividade de cada experimental as seguintes 3 restries so normalmente
amostra relativamente ao padro pode ser calculada e impostas no desenho dos ensaios. Elas tm vantagens quer na
expressa como uma relao de actividade ou convertida numa facilidade de clculo quer na preciso.
qualquer unidade relevante para a amostra em teste, por a) Cada preparao no ensaio deve ser testada com o mesmo
exemplo em Unidades Internacionais. Os limites de confiana nmero de diluies.
podem ser calculados para cada conjunto de dados do ensaio.
b) No modelo de linhas paralelas, o rcio de doses adjacentes
Se alguma das cinco condies (1, 2, 3, 4A e 5A ou 1, 2, 3, deve ser constante para todos os tratamentos do ensaio;
4B e 5B) no for preenchida, os mtodos de calculo aqui no modelo de relao de declives, o intervalo entre doses
descritos no so vlidos e deve ser realizado um estudo adjacentes deve ser constante para todos os tratamentos
especial do ensaio tcnico. do ensaio.
O analista no deve usar mais nenhuma transformao a c) Deve existir um nmero igual de unidades experimentais
no ser que seja demonstrado que o incumprimento dos em cada tratamento.
requisitos no acidental mas devido a uma modificao
sistemtica das condies experimentais. Neste caso, os Se for usado um desenho experimental que satisfaa
ensaios, tal como descrito na seco 3.1.1., devem ser estas condies os clculos so simples. As frmulas so
repetidos antes de adoptar uma nova transformao nos apresentadas nas seces 3.2 e 3.3. recomendado o uso
ensaios de rotina. de programas informticos (software) que tenha sido
desenvolvido expressamente para este objectivo. Existem
Um nmero excessivo de ensaios invlidos devido ausncia vrios programas que podem facilmente ser utilizados para
de paralelismo ou de linearidade, num ensaio de rotina todos os desenhos experimentais descritos nas monografias.
realizado para comparar materiais similares, indica desenhos Nem todos os programas usam as mesmas frmulas e
experimentais com replicao inadequada. Esta inadequao algoritmos, mas todos eles devem chegar aos mesmos
resulta normalmente do reconhecimento incompleto de resultados.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 705


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5.3. Anlises estatsticas

Desenhos experimentais que no cumpram as restries devem existir respostas iguais para doses iguais. A distncia
acima mencionadas podem ser realizveis e correctos, mas as horizontal entre as linhas representa a verdadeira
frmulas necessrias so demasiado complicadas para serem actividade da amostra, relativamente sua actividade
descritas neste texto. Uma breve descrio dos mtodos de assumida. Quanto maior a distncia entre as 2 linhas, pior
clculo apresentada na seco 7.1. Estes mtodos podem a actividade assumida da amostra. Se a linha da amostra
igualmente ser usados em desenhos restringidos, mas nesse est situada direita da do padro, a actividade assumida foi
caso eles so equivalentes com as frmulas simples. As sobrestimada, e os clculos indicam uma actividade estimada
frmulas para os desenhos restringidos apresentadas neste menor do que a actividade assumida. Igualmente, se a linha
texto podem ser usadas, por exemplo, para criar programas da amostra est situada esquerda da do padro, a actividade
especficos numa folha de clculo. Os exemplos na seco 5 assumida foi subestimada, e os clculos indicam uma
podem ser usados para clarificar o especialista e para verificar actividade estimada superior actividade assumida.
se um dado programa fornece os resultados correctos.

3.2.2. DESENHO EXPERIMENTAL


3.2. MODELO DE LINHAS PARALELAS
As seguintes condies so teis na optimizao da preciso
3.2.1. INTRODUO do desenho experimental:
1) o rcio entre o declive e o erro residual deve ser o maior
5. Textos gerais

O modelo de linhas paralelas ilustrado na figura 3.2.1.-I. O


possvel,
logaritmo das doses est representado no eixo horizontal com
a menor concentrao esquerda a com a maior direita. 2) a amplitude das doses deve ser a maior possvel,
As respostas esto indicadas no eixo vertical. As respostas
individuais de cada tratamento esto indicadas com pontos 3) as linhas devem estar to prximas quanto possvel, isto
negros. As 2 linhas representam as relaes ln(dose)-resposta , a actividade assumida deve ser um bom clculo da
do padro e da amostra. verdadeira actividade.
A alocao de unidades experimentais (animais, tubos, etc.) a
diferentes tratamentos pode ser feita de vrias maneiras.

3.2.2.1. Desenho completamente aleatrio


Se a totalidade das unidades experimentais parecer
ser razoavelmente homognea sem indicao de que a
variabilidade da resposta menor dentro de certos subgrupos
reconhecidos, a distribuio das unidades a diferentes
tratamentos deve ser efectuada aleatoriamente.
Se unidades dentro de subgrupos, tais como posies fsicas
ou dias de experimentao, tiverem tendncias a serem mais
homogneos do que a totalidade das unidades, a preciso do
ensaio pode ser aumentada atravs da introduo de uma
ou mais restries no desenho. Uma escolha cuidadosa do
balano sobre estas restries permite a eliminao de fontes
de variao irrelevantes.

3.2.2.2. Desenho de bloco aleatrio


Neste desenho possvel segregar uma fonte de variao
identificvel, tal como a variao sensvel entre ninhadas de
animais de experimentao ou a variao entre caixas de Petri
nos ensaios de difuso microbiolgica. O desenho requer
FIGURA 3.2.1.-I Modelo de linhas paralelas para um ensaio 3 + 3. que cada tratamento seja aplicado em igual nmero de vezes
em cada bloco (ninhada ou caixa de Petri) e s adequado
Nota: o logaritmo natural (ln ou loge) usado
quando o bloco for suficientemente grande para acomodar
extensivamente neste texto. O termo antilogaritmo usado
todos os tratamentos.
para designar ex. No entanto, igualmente possvel utilizar os
logaritmos decimais ou de Briggs (log ou log10); neste caso, o Isto est ilustrado na seco 5.1.3. igualmente possvel usar
antilogaritmo correspondente 10x. um desenho aleatrio com replicao. Os tratamentos devem
atribudos aleatoriamente a cada bloco. Na seco 8.5
Para a existncia de um ensaio satisfatrio a actividade
apresentado um algoritmo para obter permutaes aleatrias.
assumida das amostras do teste deve ser prxima da
actividade real. Com base nesta actividade assumida e na
actividade atribuda do padro, so preparadas diluies 3.2.2.3. Desenho do quadrado latino
equivalentes (se possvel), isto , doses correspondentes do Este desenho apropriado quando a resposta pode ser
padro e da amostra devem dar a mesma resposta. Se no afectada por duas fontes de variao diferentes, cada uma das
existir informao sobre a actividade assumida, devem ser quais assume k diferentes nveis ou posies. Por exemplo,
realizados ensaios preliminares num grande amplitude de num ensaio de um antibitico em placa os tratamentos
doses para determinar a amplitude onde a curva linear. podem ser arranjados numa ordenao de k k numa placa
Quanto mais prximo da actividade assumida correcta da grande, cada tratamento ocorrendo uma vez em cada linha
amostra, mais prximas estaro as 2 linhas, uma vez que de cada coluna. O desenho apropriado quando o nmero

706 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

de linhas, o nmero de colunas e o nmero de tratamentos aplicados nmeros iguais de tratamentos por amostra e a
for igual. As respostas so registadas num quadrado de cada tratamento aplicado um nmero igual de vezes. No se
formato conhecido por quadrado latino. As variaes devidas devem usar estas frmulas em quaisquer outras circunstncias.
s diferenas nas respostas entre as k linhas e entre as k
Para alm de alguns ajustamentos ao termo de erro, a anlise
colunas podem ser segregadas, deste modo reduzindo o erro.
bsica dos dados resultantes de um ensaio a mesma para
Na seco 5.1.2 apresenta-se um exemplo de desenho de
os desenhos completamente aleatrio, de bloco aleatrio e
quadrado latino, e na seco 8.6 fornecido um algoritmo
para obter quadrados latinos. de quadrado latino. As frmulas de testes de bloco aleatrio
no se adaptam completamente a este esquema, pelo que so
incorporadas no Exemplo 5.5.5.
3.2.2.4. Desenho de permutao
Tendo considerado os pontos discutidos na seco 3.1.
Este desenho til quando a experincia pode ser subdividida e transformado as respostas, se necessrio, devem ser
em blocos mas possvel aplicar apenas dois tratamentos calculadas as mdias dos valores em cada tratamento e em
a cada bloco, por exemplo um bloco pode ser uma unidade cada preparao, como mostrado nas tabelas 3.2.3.-I. Os
singular que pode ser testada em duas ocasies. O desenho contrastes lineares, que relacionam os declives das rectas de
pretende incrementar a preciso eliminando os efeitos das ln(dose)-resposta, devem igualmente ser formados. Na tabela
diferenas entre unidades ao mesmo tempo que balana o efeito 3.2.3.-II so apresentadas 3 frmulas adicionais, necessrias
de qualquer diferena entre nveis gerais de resposta nas duas para a construo da anlise de varincia.

5. Textos gerais
etapas do teste. Se forem testadas duas doses de um padro e de
uma amostra designado como um teste de permutao duplo. A variao total na resposta causada por diferentes tratamentos
agora dividida, como mostrado na tabela 3.2.3.-III., sendo as
A experincia dividida em duas partes separadas por um somas dos quadrados derivadas dos valores obtidos nas tabelas
intervalo de tempo apropriado. As unidades so divididas em 3.2.3.-I e 3.2.3.-II. A soma dos quadrados devidos ausncia de
quatro grupos e cada grupo recebe um dos quatro tratamentos linearidade apenas pode ser calculada se pelo menos 3 doses
na primeira parte do teste. As unidades que receberam por preparao forem includas no ensaio.
uma preparao na primeira parte do teste recebem a outra
preparao na segunda parte, e unidades recebendo pequenas O erro residual do ensaio obtm-se pela subtraco das
doses numa parte do teste recebem as grandes doses na outra. variaes permitidas no desenho variao total da resposta
O arranjo das doses mostrado na tabela 3.2.2.-I. Na seco (tabela 3.2.3.-IV). Nesta tabela representa a mdia de todas as
5.1.5 pode ser encontrado um exemplo. respostas registadas no ensaio. Deve ter-se em ateno que
para um quadrado latino, o nmero de respostas replicadas
TABELA 3.2.2.-I Ordenao das doses num ensaio cruzado (n) igual ao nmero de linhas, colunas ou tratamentos (dh).

Grupo de unidades Tempo I Tempo II A anlise de varincia agora completada do seguinte modo.
Cada soma de quadrados dividida pelo nmero de graus
1 S1 T2
de liberdade correspondentes para dar origem s mdias
2 S2 T1 quadrticas. A mdia quadrtica para cada varivel em teste
3 T1 S2 expressa como o rcio do erro residual (s2) e a significncia
destes valores (conhecidos como rcios-F) so verificadas
4 T2 S1
pelo uso da tabela 8.1 ou uma subrotina apropriada de um
programa informtico.
3.2.3. ANLISE DE VARINCIA
Esta seco fornece as frmulas requeridas para desenvolver 3.2.4. TESTES DE VALIDAO
a anlise de varincia e ser mais facilmente percebida
referenciando com os exemplos prticos da seco 5.1. Igualmente Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente
deve ser consultado o glossrio de smbolos (seco 9). vlidos se o resultado desses testes for o seguinte.
As frmulas so indicadas para ensaios simtricos onde uma 1) O termo da regresso linear significativo, isto , a
ou mais amostras (T, U, etc.) so comparadas com o padro probabilidade calculada inferior a 0,05. Se este critrio
(P). Deve ser realado que as frmulas apenas podem ser no for satisfeito, no possvel calcular os limites de
usadas se as doses forem igualmente espaadas, se forem confiana para 95 por cento,

TABELA 3.2.3.-I Frmulas para os ensaios de linhas paralelas com d doses de cada preparao

Padro (S) 1 amostra (T) 2 amostra (U, etc.)

Resposta mdia dose mais baixa S1 T1 U1

Resposta mdia 2 dose S2 T2 U2

... ... ... ...

Resposta mdia dose mais elevada Sd Td Ud

Total da amostra PS S1 S2 ... Sd PT T1 T2 ... Td PU ... etc.

Contraste linear LS 1S1 2S2 ... LT 1T1 2T2 ... LU ... etc.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 707


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 3.2.3.-II Frmulas complementares para a construo da anlise de varincia

TABELA 3.2.3.-III Frmulas para o calculo da soma dos quadrados e graus de liberdade

Origem da variao Graus de liberdade (f) Soma dos quadrados

Amostras h1 SSprep HP (PS2 P T2 ...) K

Regresso linear 1 SSreg HL (LS LT ...) 2


No paralelismo h1 SSpar HL (LS2 LT2 ...) SSreg
No linearidade (*) h (d 2)
5. Textos gerais

SSlin SStreat SSprep SSreg SSpar


Tratamentos hd 1 SStreat n(S12 ... Sd2 T 12 ... T d2 ...) K
(*) No calculado para as titulaes de 2 doses.

TABELA 3.2.3.-IV Clculo do erro residual

Origem da variao Graus de liberdade Soma dos quadrados

blocos (linhas) (*) n1 SSblock hd (R12 ... Rn2) K

colunas (**) n1 SScol hd (C12 ... Cn2) K

total aleatrio hd (n 1) SSres SStot SStreat

erro residual (***) blocos completos (hd 1) (n 1) SSres SStot SStreat SSblock

quadrado latino (hd 2) (n 1) SSres SStot SStreat SSblock SScol

total nhd 1 SStot (y


y) 2
(*)(*) No calculado para os ensaios totalmente aleatrios.
(**) S calculado para os quadrados latinos.
(***) Depende do tipo de ensaio utilizado.

2) o termo de no-paralelismo no significativo, isto , a preparao, o declive comum (b) de ensaios com d doses de
probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica cada preparao obtm-se a partir de:
que a condio 5A, da seco 3.1 satisfeita,
3) o termo de no-linearidade no significativo, isto , a
probabilidade calculada no inferior a 0,05. Isto indica
que a condio 4A, da seco 3.1 satisfeita. e o logaritmo da relao de actividade de uma amostra, por
exemplo T, :
Um desvio significativo ao paralelismo num ensaio mltiplo
pode ser devido incluso no ensaio de uma amostra que
d uma recta ln(dose)-resposta com um declive diferente
do das outras preparaes. Em vez de declarar a invalidao
do ensaio, pode ser decidido eliminar todos os dados
relacionados com aquela preparao e recomear a anlise do A actividade calculada uma estimativa da verdadeira
princpio. actividade de cada desconhecido. Os limites de confiana
podem ser calculados como os antilogaritmos de:
Quando a validao estatstica estabelecida, podem ser
calculadas as actividades e os limites de confiana pelos
mtodos descritos na seco seguinte.

3.2.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE


CONFIANA
O valor de t pode ser obtido na tabela 8.2 para p = 0,05 e
Sendo I o ln do rcio entre doses adjacentes de uma com os graus de liberdade iguais ao nmero de graus de

708 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

liberdade do erro residual. A actividade estimada (RT) e os em que B a soma das respostas do bloco contendo o valor
limites de confiana associados obtm-se multiplicando os em falta, T o total do tratamento correspondente e G a soma
valores obtidos por AT depois da obteno dos antilogaritmos. de todas as respostas registadas no ensaio.
Se as solues de armazenamento no so exactamente
equivalentes, com base nas actividades atribudas e Desenho do quadrado latino
assumidas, necessrio introduzir um factor de correco
(ver Exemplos 5.1.2 e 5.1.3). O valor em falta obtm-se de:
k(B C T) 2G
y = (3.2.6.-2)
3.2.6. VALORES EM FALTA (k 1) (k 2)

Num ensaio balanceado, um acidente totalmente desligado onde B e C so as somas das respostas na linha e coluna
dos tratamentos aplicados pode conduzir perda de uma contendo o valor em falta. Neste caso k = n.
ou mais respostas, por exemplo devido morte de um Desenho de permutao
animal. Se se considerar que o acidente no est ligado
composio da preparao administrada, os clculos exactos Se ocorrer um acidente conduzindo perda de valores num
podem ser realizados mas as frmulas so mais complicadas desenho de permutao, deve ser consultado um livro de
e podem apenas ser dadas dentro do contexto dos modelos estatstica (por exemplo, D. J. Finney, ver seco 10), pois a

5. Textos gerais
lineares gerais (ver seco 7.1). Contudo, existe um mtodo aplicao das frmulas apropriadas depende das combinaes
aproximado que mantm a simplicidade do desenho de tratamentos efectuados.
balanceado substituindo a resposta em falta por um valor
calculado. A perda de informao tomada em considerao 3.3. MODELO DE RELAO DE DECLIVES
diminuindo os graus de liberdade do total da soma dos
quadrados e para o erro residual pelo nmero de valores em 3.3.1. INTRODUO
falta e usando uma das frmulas a seguir fornecidas para
o valor em falta. Deve ter-se em ateno que este mtodo
Este modelo adequado, por exemplo, para alguns ensaios
apenas aproximativo, e que o uso de um mtodo exacto
microbiolgicos quando a varivel independente a
preferencial.
concentrao de um factor de crescimento essencial inferior
Se mais do que uma observao estiver em falta pode usar- concentrao ptima do meio. O modelo de relao de
-se a mesma frmula. O procedimento consiste em fazer uma declives ilustrado na figura 3.3.1.-I.
estimativa aproximada de todos os valores em falta, excepto de
um, e usar a frmula apropriada para esse valor e usar todos
os restantes valores incluindo os estimados por aproximao.
Preencha o valor calculado. Continue de modo semelhante
calculando o valor da primeira estimativa grosseira. Depois
de calcular todos os valores em falta deste modo, todo o ciclo
deve ser repetido desde o princpio, e em cada clculo utilize o
valor mais recente, calculado ou estimado, para cada resposta
qual a frmula tenha sido aplicada. Este procedimento deve
ser repetido at que 2 ciclos consecutivos dem os mesmos
valores; a convergncia normalmente rpida.
Considerando que o nmero de valores substitudos
pequeno relativamente ao nmero total de observaes na
experincia completa (digamos, inferior a 5 por cento), a
aproximao implcita nesta substituio e reduo dos graus
de liberdade pelo nmero de valores em falta substitudos
deste modo normalmente satisfatria. Contudo, a anlise
deve ser interpretada com grande cuidado, especialmente
se existir uma preponderncia de valores em falta num
tratamento ou bloco; se forem encontrados aspectos
invulgares deve consultar-se um especialista. A substituio
de valores em falta num teste sem rplicas uma operao
particularmente delicada.
FIGURA 3.3.1.-I Modelo de relao de declives para um ensaio
Desenho completamente aleatrio 231
Num ensaio completamente aleatrio o valor em falta pode As doses esto representadas no eixo horizontal com a
ser substitudo pela mdia aritmtica das outras respostas do concentrao zero esquerda e a maior concentrao
mesmo tratamento. direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As
respostas individuais de cada tratamento esto indicadas
Desenho de bloco aleatrio
com pontos negros. As 2 linhas so as relaes dose-resposta
O valor em falta obtm-se aplicando a equao: calculadas para o padro e para a amostra, na condio que se
interceptam na dose zero. Ao contrrio do modelo de linhas
paralelas, as doses no so transformadas logaritmicamente.
Tal como no caso de um ensaio baseado no modelo de linhas
paralelas, importante que a actividade assumida esteja
prxima da actividade real, e preparar diluies equivalentes

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 709


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5.3. Anlises estatsticas

das amostras e do padro (se possvel). Quanto mais correcta das respostas para cada tratamento e cada preparao como
for a actividade assumida mais juntas estaro as 2 linhas. O mostrado na tabela 3.3.3.1.-I. Adicionalmente calcula-se a
rcio dos declives representa a verdadeira actividade da resposta mdia dos brancos (B).
amostra relativamente actividade assumida. Se o declive da
amostra for mais ngreme que o do padro, a actividade foi A soma dos quadrados nas anlises de varincia so calculadas
subestimada e os clculos indicam uma actividade estimada como se mostra nas tabelas 3.3.3.1.-I at 3.3.3.1.-III. A soma
maior que a actividade assumida. De igual modo, se o declive dos quadrados devidos no linearidade pode apenas ser
da amostra for menos ngreme que o do padro, a actividade calculada se, pelo menos 3 doses de cada preparao tiverem
foi sobrestimada e os clculos indicam uma actividade sido includas no ensaio. O erro residual obtido subtraindo
estimada inferior actividade assumida. as variaes permitidas no desenho variao total da
resposta (tabela 3.3.3.1.-IV).
Na preparao de uma experincia, todas as respostas devem
ser examinadas quanto ao cumprimento das condies 1, 2 e A anlise de varincia completada como se segue. Cada
3 da seco 3.1. A anlise de varincia a realizar em ensaios de soma de quadrados divido pelo correspondente nmero
rotina descrita na seco 3.3.3 de modo a que o cumprimento de graus de liberdade para obter mdias quadrticas. A
das condies 4B e 5B da seco 3.1 possa ser examinado. mdia quadrtica de cada varivel a ser testada expressa
como o rcio do erro residual (s2) e a significncia destes
valores (rcios-F) avaliada atravs da tabela 8.1 ou de uma
3.3.2. DESENHO DO ENSAIO subrotina adequada de um programa informtico.
5. Textos gerais

A utilizao da anlise estatstica apresentada a seguir impe 3.3.3.2. O desenho (hd)


as seguintes restries ao ensaio:
As frmulas so basicamente as mesmas do desenho (hd + 1),
a) o padro e as amostras devem ser testadas com o mesmo mas existem algumas pequenas diferenas.
nmero de diluies igualmente espaadas,
B retirado de todas as frmulas,
b) um grupo extra de unidades experimentais que no esteja
sujeito ao tratamento deve ser testado (os brancos), n(PS PT ...)2
K ,
c) deve existir um nmero igual de unidades experimentais
hd
em cada tratamento.
SSblank removido da anlise de varincia,
Tal como j foi referido na seco 3.1.3, os desenhos experimentais
que no cumpram estas restries podem ser possveis e o nmero de graus de liberdade para os tratamentos torna-
correctos, mas as anlises estatsticas simples aqui apresentadas se hd 1,
no so aplicveis e deve ser obtido aconselhamento especializado
ou ser utilizada programao apropriada. o nmero de graus de liberdade do erro residual e da
varincia total calculado como descrito para o modelo de
O desenho com 2 doses por preparao e 1 branco, o desenho linhas paralelas (ver tabela 3.2.3.-IV).
(2h+1) com zero comum prefervel, uma vez que permite
a maior preciso combinada com a possibilidade de verificar a
validao dentro das restries atrs mencionadas. As validaes do ensaio, da actividade e dos intervalos de
confiana so descritas nas seces 3.3.4. e 3.3.5.
No entanto, nem sempre pode ser assumida como vlida
uma relao linear abaixo da dose zero. Com uma ligeira
perda de preciso um desenho sem brancos pode ser usado. 3.3.4. TESTES DE VALIDAO
Neste caso, 3 doses por preparao, o desenho (3h) com
zero comum, prefervel a 2 doses por preparao. As doses Os resultados dos ensaios so considerados estatisticamente
devem ser como se segue: vlidos se o resultado das anlises de varincia forem os
1) o padro dado numa dose alta, perto mas no excedendo seguintes:
a mais alta dose com uma resposta mdia na parte 1) a variao devida aos brancos nos desenhos (hd+1) no
rectilnea da curva dose-resposta, significativa, isto , a probabilidade calculada no
2) as outras doses devem estar uniformemente distribudas menor que 0,05. Isto indica que as respostas dos brancos
entre a dose mais alta e a dose zero, no diferem significativamente da intercepo comum e a
relao linear vlida abaixo da dose zero,
3) as amostras devem ser dadas em doses correspondentes
baseadas na actividade assumida do material. 2) a variao devida intercepo no significativa, isto , a
probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto indica
Um desenho completamente aleatrio, de blocos aleatrios que a condio 5B, seco 3.1 satisfeita,
ou de quadrado latino pode ser usado, tal como descrito na
seco 3.2.2. O uso de qualquer um dos desenhos necessita 3) em ensaios incluindo pelo menos 3 doses por preparao,
de ajustamentos ao erro da soma dos quadrados tal como a variao devida no-linearidade no significativa, isto
descrito para os ensaios baseados no modelo de linhas , a probabilidade calculada no menor que 0,05. Isto
paralelas. A anlise de um ensaio de uma ou mais amostras indica que a condio 4B, seco 3.1 satisfeita.
contra um padro descrita a seguir. A variao significativa devida aos brancos indica que a
hiptese da linearidade no vlida perto da dose zero. Se
3.3.3. ANLISE DE VARINCIA isto for sistemtico e no acidental para o tipo de ensaio, o
desenho hd mais apropriado. Qualquer resposta dos brancos
deve ser rejeitada.
3.3.3.1. O desenho (hd 1)
Quando estes testes indicam que o ensaio vlido, a
As respostas so verificadas tal como descrito na seco 3.1 actividade calculada com os seus limites de confiana tal
e, se necessrio, transformadas. ento calculada a mdia como descrito na seco 3.3.5.

710 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 711


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5.3. Anlises estatsticas

3.3.5. CLCULO DA ACTIVIDADE E DOS LIMITES DE 3.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS
CONFIANA
Este modelo aconselhado, por exemplo, para alguns
imunoensaios quando a anlise requerida para curvas dose-
3.3.5.1. O desenho (hd+1)
-resposta sigmoides prolongadas. Este modelo ilustrado na
A intercepo comum a das preparaes pode ser calculada a figura 3.4.-I.
partir de:
Os logaritmos das doses esto representados no eixo
horizontal com a menor concentrao esquerda e a maior
direita. As respostas esto indicadas no eixo vertical. As
respostas individuais de cada tratamento esto indicadas com
pontos negros. As 2 curvas so as relaes ln(dose)-resposta
O declive do padro, e de modo idntico para cada uma das calculadas para o padro e amostras.
preparaes, calculado a partir de:
5. Textos gerais

A relao de actividade de cada amostra pode agora ser


calculada a partir de:

que deve multiplicado por AT, a actividade assumida da


amostra, de modo a determinar a actividade estimada RT.
Se o intervalo entre doses adjacentes no for idntico para o
padro e amostra, a actividade deve ser multiplicada por
IS /IT. Note que, ao contrrio da anlise de linhas paralelas,
no so calculados os antilogaritmos.
O intervalo de confiana para RT calculado a partir de:

FIGURA 3.4.-I Modelo de curva logstica de 4 parmetros


A forma geral das curvas pode usualmente ser descrita pela
V1 e V2 esto relacionados com a varincia e covarincia do funo logstica, mas outras formas so igualmente possveis.
numerador e denominador de RT . Eles podem ser calculados Cada curva pode ser caracterizada por 4 parmetros: a
a partir de: assmptota superior (), a assmptota inferior (), o factor
de declive () e a locao horizontal (). Este modelo assim
habitualmente referido como o modelo dos 4 parmetros. A
representao matemtica da curva ln(dose)-resposta :

Para um ensaio vlido necessrio que as curvas do padro e


Os limites de confiana so multiplicados por AT, e se das amostras tenham o mesmo factor de declive, e o mesmo
necessrio por IS/IT. nvel de respostas mximas e mnimas nos extremos. Apenas a
locao horizontal () das curvas pode ser diferente. A distncia
3.3.5.2. O desenho (hd) horizontal entre as curvas est relacionada com a actividade
As formulas so as mesmas do que no desenho (hd+1), com verdadeira da amostra. Se o ensaio usado em rotina, pode
as seguintes modificaes: ser suficiente testar as condies de igualdade de resposta dos
nveis superior e inferior quando o ensaio desenvolvido e
ento voltar a testar esta condio directamente apenas em
intervalos apropriados ou quando existirem alteraes dos
materiais ou das condies de ensaio.
Os clculos de semelhanas mximas dos parmetros e dos seus
intervalos de confiana podem ser obtidos atravs de programas
informticos apropriados. Estes programas informticos podem
incluir alguns testes de validao. Por exemplo, se os clculos
de semelhanas mximas mostrarem desvios significativos
aos modelos ajustados nas condies assumidas de igualdade

712 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

superior e inferir das assmptotas e declives, ento uma ou todas mais rpidos consiste na optimizao directa da funo
as condies podem no estar satisfeitas. das semelhanas mximas (ver seco 7.1), que pode ser
facilmente realizado com programas informticos que tenham
O modelo logstico levanta um nmero de problemas
uma subrotina interna para este objectivo. Infelizmente, a
estatsticos que podem requerer solues diferentes para
maior parte destes procedimentos no fazem a estimativa dos
diferentes tipos de ensaios, e no possvel fazer um
limites de confiana, e a tcnica para os obter demasiado
resumo simples. Uma grande variedade de aproximaes
complica para ser aqui descrita. A tcnica a seguir descrita no
descrita na literatura relevante. Para este tipo de anlises
a mais rpida, mas foi escolhida devido sua simplicidade
recomendado aconselhamento profissional. De qualquer comparativamente com outras tcnicas alternativas. Pode
maneira, includo um exemplo simples na seco 5.4 de ser usada para ensaios em que uma ou mais amostras so
modo a ilustrar uma via possvel para analisar os dados comparadas com um padro. Para alm disso, devem estar
apresentados. Na seco 7.5 apresentada uma pequena preenchidas as seguintes condies:
discusso de mtodos alternativos juntamente com outras
consideraes estatsticas. 1) a relao entre o logaritmo da dose e a resposta pode
ser representada pela curva da distribuio normal
Se no for possvel nem o aconselhamento profissional cumulativa,
nem o recurso a programas apropriados, possvel o uso de
mtodos alternativos: 1) se existirem estimativas razoveis 2) as curvas do padro e da amostra so paralelas, isto , tm
dos limites superior () e inferior (), seleccionar para forma idntica e apenas podem diferir pela sua localizao

5. Textos gerais
todas as amostras as doses com mdias de respostas (u) horizontal,
compreendidas entre 20 por cento e 80 por cento dos limites, 3) em teoria, no existe uma resposta natural a doses
transforme as respostas das doses seleccionadas para e use extremamente baixas nem uma ausncia de resposta a
o modelo de linhas paralelas (seco 3.2) para a anlise; 2) doses extremamente altas.
seleccione a amplitude de doses para as quais as respostas (u)
ou as respostas apropriadamente transformadas, por exemplo
ln(u), sejam aproximadamente lineares quando graficadas 4.2. MTODO DA PROBABILIDADE ITERATIVA (4)
contra o ln(dose); o modelo de linhas paralelas (seco 3.2)
podem ento ser usado para a anlise. A curva sigmoide pode ser linearizada substituindo cada
resposta, isto , a fraco de resposta positiva do grupo, pelo
valor correspondente da distribuio normal padronizada
4. ENSAIOS DEPENDENTES DE cumulativa. Este valor, muitas vezes referido como normit,
distribui-se teoricamente entre e . No passado,
RESPOSTAS QUALITATIVAS foi proposto acrescentar 5 a cada normit para obter o
probit. Este facto facilita os clculos manuais porque
os valores negativos so evitados. Com a chegada dos
4.1. INTRODUO computadores, a necessidade de adicionar 5 aos normits
desapareceu. O termo mtodo normit mais adequado
Em certos ensaios impossvel, ou excessivamente para o mtodo descrito a seguir. No entanto, e uma vez que
trabalhoso, medir o efeito de cada unidade experimental a designao anlise probit est to divulgada, neste texto
numa escala quantitativa. Em alternativa, um efeito tal como ir-se- manter aquela designao.
a morte ou sintomas de hipoglicmia podem ser observados
Uma vez linearizadas as respostas possvel aplicar a anlise
quer ocorrendo ou no em cada unidade, e o resultado
de linhas paralelas, como descrito na seco 3.2. Infelizmente,
depende do nmero de unidades em que ocorreu. Tais ensaios
a condio de validao da homogeneidade da varincia para
so designados qualitativos ou tudo-ou-nada.
cada dose no cumprida. A varincia mnima para o normit
A situao muito semelhante descrita para os ensaios = 0 e aumenta para valores positivos e negativos do normit. ,
quantitativos na seco 3.1, mas em vez de n repostas por isso, necessrio dar maior peso resposta na parte mdia
separadas para cada tratamento um nico valor registado, da curva, e menor peso nas zonas extremas da curva. Este
isto , a percentagem de unidades em cada grupo de mtodo, a anlise de varincia, e a estimativa da actividade e
tratamento mostrando um efeito positivo. Quando estas dos intervalos de confiana descrito a seguir.
percentagens so graficadas em funo do logaritmo das
doses a curva resultante tende a ser sigmoide (forma de S)
em vez de ser linear. 4.2.1. TABULAO DE RESULTADOS

O clculo da curva dose-resposta feito atravs de uma A tabela 4.2.1.-I utilizada para introduzir os dados nas
funo matemtica que representa esta curvatura sigmoide. colunas indicadas por nmeros:
A funo mais utilizada a funo da distribuio normal
cumulativa. Esta funo tem algum mrito terico, e (1) a dose do padro ou da amostra,
talvez a melhor escolha quando a resposta um reflexo da (2) o nmero de n unidades submetidas a tratamento,
tolerncia das unidades. Se a resposta mais provavelmente
depende de um processo de crescimento, o modelo de (3) o nmero de unidades r com resposta positiva ao
distribuio logstica prefervel, embora o resultado da tratamento,
diferena entre os 2 modelos seja muito pequeno. (4) o logaritmo x da dose,
As estimativas das semelhanas mximas do declive e (5) a fraco p = r/n das respostas positivas do grupo.
localizao das curvas apenas podem ser encontradas aplicando
um procedimento iterativo. H muitos procedimentos que (4)
Embora na maioria dos textos de estatstica publicados em portugus se
conduzem aos mesmos resultados, mas eles diferem em mantenha o termo probit, entendeu-se traduzir pelo seu real significado
eficcia devido velocidade de convergncia. Um dos mtodos probabilidade iterativa.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 713


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5.3. Anlises estatsticas

O primeiro ciclo comea aqui. e a intercepo a do padro, e igualmente para as amostras,


obtm-se
(6) a coluna Y preenchida com zeros na primeira iteraco,
(7) o valor = (Y) da funo da distribuio normal
padronizada cumulativa (ver igualmente a tabela 8.4).
As colunas (8) a (10) so calculadas usando as seguintes A coluna (6) da primeira tabela de trabalho pode agora ser
substituda por Y = a + bx e o ciclo repete-se at que a diferena
entre 2 ciclos seja pequena (por exemplo, a mxima diferena de
Y entre dois ciclos consecutivos menor que 10-8).

P 4.2.2. TESTES DE VALIDAO


y Y
Z
A validade dos ensaios deve ser avaliada antes de calcular
a actividade e os intervalos de confiana. Os desvios
linearidade podem ser medidos como se segue, se pelos
2 menos 3 doses de cada preparao forem includas: adicione
uma 13 coluna tabela 4.2.1.-II e preencha-a com:
5. Textos gerais

As colunas (11) a (15) podem ser facilmente calculadas a partir


das colunas (9) e (10) como wx, wx2 e wxy, respectivamente,
e o somatrio () de cada uma das colunas (10) a (15)
calculada separadamente para cada uma das preparaes.
Os somatrios calculados na tabela 4.2.1.-I so transferidos O somatrio da coluna a medida dos desvios linearidade
para as colunas (1) a (6) da tabela 4.2.1.-II e as 6 colunas e segue aproximadamente uma distribuio 2 com N-2h
adicionais (7) a (12) so calculadas como se segue: graus de liberdade. A significncia deste valor pode ser
avaliada com a ajuda da tabela 8.3 ou com uma subrotina
apropriada de um programa informtico. Se o valor for
significativo para o nvel de probabilidade 0,05, o ensaio deve
provavelmente ser rejeitado (ver seco 4.2.4). Quando o
teste acima no der uma indicao de desvios significativos
regresso linear, os desvios ao paralelismo so testados para o
nvel de significncia 0,05 com:

com h-1 graus de liberdade.

4.2.3. CLCULO DA ACTIVIDADE E SEUS LIMITES DE


CONFIANA

Quando no existirem indicaes de um desvio significativo


do paralelismo e linearidade o ln(relao de actividade) MT
calculado com:

TABELA 4.2.1.-I. Primeira tabela de trabalho

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)
dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy
S . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .

T . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . .

etc.

714 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 4.2.1.-II. Segunda tabela de trabalho


(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)
w wx wy wx2 wy2 wxy Sxx Sxy Syy
x y a
S . . . . . . . . . . . .
T . . . . . . . . . . . .
etc. . . . . . .

e o antilogaritmo retido. Faa t = 1,96 e s = 1. Os limites de 50 por cento das unidades. O mtodo probit pode ser usado
confiana so calculados como os antilogaritmos de: para determinar a dose efectiva mediana (ED50), mas uma vez
que no h necessidade de exprimir esta dose relativamente a
um padro, as frmulas so ligeiramente diferentes.
Nota: pode opcionalmente ser includo um padro de modo
a validar um ensaio. Habitualmente o ensaio considerado
vlido se o valor calculado de ED50 para o padro for
suficientemente prximo da ED50 assumida. O significado
de suficientemente prximo neste contexto depende dos

5. Textos gerais
requisitos especificados na monografia.
A tabulao das respostas das amostras, e opcionalmente do
4.2.4. RESULTADOS INVLIDOS padro, realizada de acordo com o descrito na seco 4.2.1. O
teste para a linearidade realizado tal como descrito na seco
Se o teste de desvio linearidade descrito na seco 4.2.2 4.2.2. Para este tipo de ensaio no h necessidade de fazer o teste
for significativo, o ensaio deve normalmente ser rejeitado. de paralelismo. A ED50 da amostra T, e de igual modo para as
Se existirem razes para conservar o ensaio, as frmulas so outras amostras, obtido tal como descrito na seco 4.2.3, com
ligeiramente modificadas. t transforma-se no valor-t as seguintes modificaes nas frmulas 4.2.3.-1 e 4.2.3.-2).
(p = 0,05) com o mesmo nmero de graus de liberdade usado
para verificar a linearidade e s2 transforma-se no valor de 2
dividido pelo mesmo nmero de graus de liberdade (e assim
tipicamente maior que 1).
O teste para paralelismo tambm ligeiramente modificado.
O valor de 2 para no-paralelismo dividido pelo seu
nmero de graus de liberdade. O valor obtido dividido pelo
valor de s2 anteriormente calculado de modo a obter o rcio-
-F com h-1 e N-2h graus de liberdade, que avaliado do
modo habitual para o nvel de significncia 0,05.

5. EXEMPLOS
4.3. O MTODO LOGIT
Esta seco composta por exemplos trabalhados para ilustrar
Tal como indicado na seco 4.1 o mtodo logit pode, por a aplicao das frmulas. Os exemplos foram seleccionados
vezes, ser o mais apropriado. O nome do mtodo derivado com o objectivo principal de ilustrar os mtodos estatsticos
da funo logit que o inverso da distribuio logstica. O
de clculo. No tm por objectivo reflectir o mtodo mais
procedimento idntico ao descrito para o mtodo probit
com as seguintes modificaes nas frmulas e Z. adequado para o ensaio, caso as monografias individuais
permitam a possibilidade de usar alternativas. Para aumentar o
seu valor para a validao de programas, so apresentados mais
nmeros decimais do que o necessrio. Deve igualmente ser
notado que existem outros mtodos de clculo equivalentes.
Esses mtodos devem conduzir exactamente aos mesmos
resultados do que os apresentados nos exemplos.

4.4. OUTRAS FORMAS DA CURVA 5.1. MODELO DE LINHAS PARALELAS


Os mtodos probit e logit so quase sempre adequados para 5.1.1. ENSAIO MLTIPLO DE DUAS DOSES COM DESENHO
as anlises de respostas qualitativas exigidas na Farmacopeia. COMPLETAMENTE ALEATRIO
No entanto, deve ser referido que a curva ln(dose)-resposta
tem outras formas para alm das 2 curvas descritas, podendo
ser adoptada uma outra curva . Ensaio de corticotrofina por injeco subcutnea em rato

Por exemplo, se for demonstrado que a curva no simtrica, O padro administrado nas doses de 0,25 e 1,0 unidade
pode ser apropriado aplicar a distribuio de Gompertz (mtodo por 100 g de peso corporal. Assumiu-se que as 2 amostras
gompit) sendo nesse caso e 1 e e Y e Z eY eY. tm uma actividade de 1 unidade por miligrama e so
administradas nas mesmas quantidades que o padro. As
respostas individuais e as mdias de cada grupo tratado so
4.5. A DOSE EFECTIVA MEDIANA apresentadas na tabela 5.1.1.-I. A representao grfica no
sugere qualquer dvida quanto homogeneidade da varincia
Em alguns tipos de ensaios desejvel determinar a dose e normalidade dos dados, mas sugere problemas quanto ao
efectiva mediana que a dose que produz uma resposta em paralelismo da preparao U.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 715


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.1.-I Resposta instrumental y massa de cido tambm significativo (p = 0,0075) o que era esperado da
ascrbico (mg) por 100 g de glndula supra-renal observao do grfico onde a amostra U no paralela ao
padro. Esta amostra por isso rejeitada e a anlise repetida
Padro S Amostra T Amostra U
usando apenas a amostra T e o padro.
S1 S2 T1 T2 U1 U2
300 289 310 230 250 236 TABELA 5.1.1.-III Anlise de varincia sem a amostra U
310 221 290 210 268 213 Graus Soma
330 267 360 280 273 283 Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
290 236 341 261 240 269 liberdade quadrados
364 250 321 241 307 251 Amostras 1 390,6 390,6
328 231 370 290 270 294 Regresso 1 66830,6 66830,6 90,5 0,000
390 229 303 223 317 223 No lineariadade 1 34,2 34,2 0,05 0,831
360 269 334 254 312 250
Tratamentos 3 67255,5
342 233 295 216 320 216
306 259 315 235 265 265 Erro residual 36 26587,3 738,54
mdia 332,0 248,4 323,9 244,0 282,2 250,0 Total 39 93842,8

A anlise sem a amostra U conclui que os resultados esto de


5. Textos gerais

acordo com os requisitos quanto regresso e ao paralelismo,


e em consequncia a actividade pode ser calculada. As
frmulas na seco 3.2.5 do:

FIGURA 5.1.1.-I.

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos


resultados:

PS 580,4 LS 41,8
Tomando os antilogaritmos encontramos a relao de
P T 567,9 LT 39,95 actividade de 1,11 com os limites de confiana para 95 por
cento entre 0,82 e 1,51.
PU 532,2 LU 16,1
120 Multiplicando pela actividade assumida da amostra T conduz
HP 10/2 5 HL 20 a uma actividade de 1,11 unidades/mg com os limites de
6
confiana para 95 por cento entre 0,82 e, 1,51 unidades/mg.
A anlise de varincia pode agora ser completada com as
frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.1.-II
apresenta os resultados. 5.1.2. DESENHO DE QUADRADO LATINO COM 3 DOSES
TABELA 5.1.1.-II Anlise de varincia
Ensaio de difuso de um antibitico usando um tabuleiro
Graus Soma rectangular
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F O padro tem uma actividade atribuda de 4855 UI/mg. A
liberdade quadrados
Amostas 2 6256,6 3128,3 amostra tem uma actividade assumida de 5600 UI/mg. Para
as solues de armazenamento dissolva 25,2 mg de padro
Regresso 1 63830,8 63830,8 83,38 0,000
em 24,5 ml de solvente, e 21,4 mg de amostra em 23,95 ml
No paralelismo 2 8218,2 4109,1 5,37 0,007 de solvente. As solues finais so preparadas diluindo
Tratamentos 5 78305,7 inicialmente as solues de armazenamento a 1/20 e de
seguida usando uma razo de diluio de 1,5.
Erro residual 54 41340,9 765,57
Total 59 119646,6 O quadrado latino gerado com o mtodo descrito na seco
8.6 (ver tabela 5.1.2.-I). As respostas deste ensaio de rotina
A anlise confirma a existncia de uma regresso linear so mostradas na tabela 5.1.2.-II (halos de inibio em mm
altamente significativa. O desvio ao paralelismo, no entanto, 10). Os valores mdios dos tratamentos so mostrados

716 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

na tabela 5.1.2.-III. A representao grfica dos dados (ver A anlise de varincia pode agora ser completada com as
figura 5.1.2.-I) no coloca dvidas quanto normalidade e frmulas das tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. A tabela 5.1.2.-IV
homogeneidade da varincia dos dados. apresenta os resultados

TABELA 5.1.2.-I Distribuio dos tratamentos na placa TABELA 5.1.2.-IV Anlise de varincia
1 2 3 4 5 6 Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
S1 T1 T2 S3 S2 T3 de dos Probabilidade
1 da variao mdio F
liberdade quadrados
2 T1 T3 S1 S2 T2 S3 Amostas 1 11,1111 11,1111
3 T2 S3 S2 S1 T3 T1 Regresso 1 8475,0417 8475,0417 408,1 0,000
4 S3 S2 T3 T1 S1 T2 No paralelismo 1 18,3750 18,3750 0,885 0,358
5 S2 T2 S3 T3 T1 S1 No
2 5,4722 2,7361 0,132 0,877
6 T3 S1 T1 T2 S3 S2 lineariadade
Tratamentos 5 8510
TABELA 5.1.2.-II Medidas das zonas de inibio (mm 10) Blocos 5 412 82,40 3,968 0,012

5. Textos gerais
Colunas 5 218,6667 43,73 2,106 0,107
1 2 3 4 5 6 mdia de linha
Erro residual 20 415,3333 20,7667
1 161 160 178 187 171 194 175,2 R1
Total 35 9556
2 151 192 150 172 170 192 171,2 R2
3 162 195 174 161 193 151 172,7 R3 A anlise mostra diferenas significativas entre as linhas.
4 194 184 199 160 163 171 178,5 R4 Isto indica o aumento de preciso adquirido pela utilizao
5 176 181 201 202 154 151 177,5 R5 desenho do quadrado latino em vez de um desenho
completamente aleatrio. Uma regresso altamente
6 193 166 161 186 198 182 181,0 R6
significativa e uma origem sem significncia das linhas
mdia individuais da regresso para o paralelismo e linearidade
de 172,8 179,7 177,2 178,0 174,8 173,5
coluna C1 confirmam que o ensaio satisfaz as actividades calculadas.
C2 C3 C4 C5 C6
As frmulas na seco 3.2.5 do:
TABELA 5.1.2.-III Mdia dos tratamentos
para o declive comum:
Padro S Amostra T 3 (35,833 39,333)
S1 S2 S3 T1 T2 T3
b 46,346
ln 1,5 6 2
mdia 158,67 176,50 194,50 156,17 174,67 195,50
o ln(actividade) :
526,333 529,667
MT 0,023974
3 46,346

A relao de actividade encontrada tomando os


antilogaritmos, resultando em 0,9763 com os limites de
confiana para 95 por cento de 0,9112 a 1,0456.

FIGURA 5.1.2.-I. necessrio aplicar o factor de correco de

As frmulas nas tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduzem aos 4855 25,2/24,5


0,00700
resultados: 5600 21,4 / 23,93

PS 529,667 LS 35,833 porque as solues no so exactamente equivalentes com


base na sua actividade assumida. Multiplicando por este factor
P T 526,333 LT 39,333
a potncia assumida de 5 600 UI/mg obtm-se a potncia de
72 5 456 UI/mg com limites de confiana para 95 por cento entre
HP 6/3 2 HL 3
24
5 092 e 5 843 UI/mg.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 717


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5.3. Anlises estatsticas

5.1.3. DESENHO DE UM BLOCO ALEATRIO DE 4 DOSES TABELA 5.1.3.-II Anlise de varincia


Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
Titulao de um antibitico por turbidimetria da variao
de dos
mdio F
Probabilidade
liberdade quadrados
O objectivo desta titulao a atribuio de uma actividade
Amostas 1 632,025 632,025
em unidades internacionais por ampola. A actividade
atribuda do padro de 670 UI/ml, a actividade assumida da Regresso 1 101745,6 101745,6 1887,1 0,000
amostra de 20 000 UI/ampola. Com base nestes dados, so
No paralelismo 1 25,205 25,205 0,467 0,500
preparadas as solues-me como se segue: dissolver
16,7 mg do padro em 25 ml de solvente, e o contedo de No lineariadade 4 259,14 64,785 1,202 0,332
uma ampola da amostra em 40 ml de solvente. As solues
finais so obtidas atravs de uma primeira diluio a 1/40 das Tratamentos 7 102662
2 solues-me, seguidas de uma srie de diluies na razo Linhas 4 876,75 219,188 4,065 0,010
de 1,5. Os tubos so colocados em banho de gua segundo
uma repartio em blocos completos (ver seco 8.5). As Erro residual 28 1509,65 53,916
respostas obtidas so registadas na tabela 5.1.3.-I. Total 39 105048,4
A anlise da figura 5.1.3.-I no pe em dvida a validao das
hipteses da normalidade dos dados e da homogeneidade da
5. Textos gerais

Existe uma diferena significativa entre os blocos, o que


varincia. O desvio padro de S3 um pouco elevado mas sem demonstra que um ensaio de blocos completos permite obter
apresentar razes para preocupao. A aplicao das frmulas uma fidelidade superior. O carcter altamente significativo
das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II conduz aos seguintes resultados: da regresso e a ausncia de desvios de paralelismo e de
linearidade significativos confirmam que a titulao permite
PS 719,4 LS 229,1
calcular as actividades. As frmulas da seco 3.2.5 do:
P T 687,6 LT 222
60
HP 5/4 1,25 HL 1
60
A anlise de varincia efectuada com a ajuda das frmulas
apresentadas nas tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados
obtidos so apresentados na tabela 5.1.3.-II.

TABELA 5.1.3.-I Absorvncia das suspenses ( 1000)

Padro S Amostra T
Bloco S1 S2 S3 S4 T1 T2 T3 T4 Mdia
1 252 207 168 113 242 206 146 115 181,1
2 249 201 187 107 236 197 153 102 179,0
3 247 193 162 111 246 197 148 104 176,0
4 250 207 155 108 231 191 159 106 175,9
5 235 207 140 98 232 186 146 95 167,4
mdia 246,6 203,0 162,4 107,4 237,4 195,4 150,4 104,4 Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
uma relao de actividade de 1,0741 com um intervalo de
confiana para 95 por cento de 1,0291 a 1,1214. A aplicao
670 16,7 / 25
de um factor de correco de 0,89512
20000 1 / 40
necessria porque, tendo em conta a actividade prevista
da amostra, as doses utilizadas no so exactamente
equivalentes. Multiplicando a relao de actividade por este
factor de correco e pela actividade assumida de
20 000 UI/ampola, obtemos uma actividade estimada de
19 228 UI/ampola, com um intervalo de confiana para 95 por
cento de 18 423 a 20 075 UI/ampola.

5.1.4. ENSAIO MLTIPLO DE 5 DOSES COMPLETAMENTE


ALEATRIAS

Titulao in vitro de 3 vacinas da hepatite B por comparao


com um padro
Trs sries independentes de 5 diluies a 0,5 so preparadas
a partir de cada vacina. Aps alguns passos adicionais
inerentes ao ensaio, a absorvncia foi medida. Os resultados
FIGURA 5.1.3.-I. obtidos so apresentados na tabela 5.1.4.-I.

718 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.1.4.-I Absorvncia


PS 9,108 LS 6,109
Diluio Padro S Amostra T
1:16000 0,043 0,045 0,051 0,097 0,097 0,094 P T 5,586 LT 6,264
1:8000 0,093 0,099 0,082 0,167 0,157 0,178
1:4000 0,159 0,154 0,166 0,327 0,355 0,345 PU 6,544 LU 6,431

1:2000 0,283 0,295 0,362 0,501 0,665 0,576


PV 6,027 LV 6,384
1:1000 0,514 0,531 0,545 1,140 1,386 1,051
3 36
HP 0,6 HL 0,3
5 120
Diluio Amostra U Amostra V
1:16000 0,086 0,071 0,073 0,082 0,082 0,086 A anlise de varincia completada com as frmulas das
1:8000 0,127 0,146 0,133 0,145 0,144 0,173 tabelas 3.2.3.-III e 3.2.3.-IV. Os resultados obtidos so
1:4000 0,277 0,268 0,269 0,318 0,306 0,316
apresentados na tabela 5.1.4.-III.
1:2000 0,586 0,489 0,546 0,552 0,551 0,624
1:1000 0,957 0,866 1,045 1,037 1,039 1,068 TABELA 5.1.4.-III Anlise de varincia

5. Textos gerais
Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
liberdade quadrados
Os logaritmos da densidade ptica tm uma relao linear
Amostas 3 4,475 1,492
com os logaritmos das doses. As mdias das transformadas
logartmicas dos valores da densidade ptica so apresentadas Regresso 1 47,58 47,58 7126 0,000
na tabela 5.1.4.-II. A representao grfica dos dados no No paralelismo 3 0,0187 0,006 0,933 0,434
demonstra nenhuma anomalia.
No lineariadade 12 0,0742 0,006 0,926 0,531

Tratamentos 19 52,152
TABELA 5.1.4.-II Mdia das transformadas logartmicas Erro residual 40 0,267 0,0067
de absorvncia
Total 59 52,42
S1 3,075 T1 2,344 U1 2,572 V1 2,485

S2 2,396 T2 1,789 U2 2,002 V2 1,874


Uma regresso altamente significativa e a ausncia de desvios
S3 1,835 T3 1,073 U3 1,305 V3 1,161
do paralelismo e de linearidade confirmam que a actividade
S4 1,166 T4 0,550 U4 0,618 V4 0,554 pode ser calculada com segurana. As frmulas da seco
S5 0,635 T5 0,169 U5 0,048 V5 0,047 3.2.5 do:
para o declive comum

0,3 (6,109 6,264 6,431 6,384)


b 0,90848
ln 2 3 4

para ln(relao de actividade) da amostra T:

FIGURA 5.1.4.-I.
Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
A aplicao das frmulas das tabelas 3.2.3.-I e 3.2.3.-II uma relao de actividade de 2,171 com um intervalo de
conduz aos seguintes resultados: confiana para 95 por cento de 2,027 a 2,327.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 719


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5.3. Anlises estatsticas

Como todas as preparaes tm uma actividade assumida TABELA 5.1.5.-II Resposta y: soma dos valores da glicmia
de 20 g de protena por mililitro, o clculo d para a (mg/100ml) aps 1 hora e 2,5 horas
mostra T uma actividade de 43,3 g de protena por
grupo 1 grupo 2 grupo 3 grupo 4
mililitro com um intervalo de confiana para 95 por cento
de 40,5 a 46,5 g de protena por mililitro. S1 T2 S2 T1 T1 S2 T2 S1

O mesmo procedimento usado para calcular a actividade 112 104 65 72 105 91 118 144
das outras amostras e dos intervalos de confiana 126 112 116 160 83 67 119 149
associados. Os resultados obtidos so apresentados na 62 58 73 72 125 67 42 51
tabela 5.1.4.-IV. 86 63 47 93 56 45 64 107
52 53 88 113 92 84 93 117
TABELA 5.1.4.-IV Clculos finais da actividade das vacinas a
examinar e limites de confiana para 95 por cento (em g de 110 113 63 71 101 56 73 128
protena por mililitro) 116 91 50 65 66 55 39 87
101 68 55 100 91 68 31 71
Limite inferior Estimativa Limite superior
mdia 95,6 82,8 69,6 93,3 89,9 66,6 72,4 106,8
Vacina T 40,5 43,4 46,5
5. Textos gerais

Vacina U 32,9 35,2 37,6


A anlise de varincia mais complicada neste ensaio do que nos
Vacina V 36,8 39,4 42,2 outros porque, na soma dos quadrados, a componente devida
ao paralelismo no independente da devida s diferenas entre
animais. Para verificar o paralelismo das rectas de regresso,
5.1.5. DUPLO ENSAIO CRUZADO necessrio calcular um segundo termo de erro obtido subtraindo
a componente do paralelismo e duas componentes de interaco
Titulao de insulina por injeco subcutnea em coelhos componente devida s diferenas entre animais.
O padro administrado a 1 unidade e 2 unidades por A anlise de varincia usa 3 componentes de interaco
mililitro. A amostra administrada em doses equivalentes resultantes da repetio dos tratamentos no interior de cada
grupo:
determinadas com base na actividade assumida do produto
que de 40 unidades por mililitro. Cada animal recebe por dias preparao; dias regresso; dias paralelismo.
via subcutnea 0,5 ml das solues apropriadas, de acordo Estes termos reflectem a tendncia que tm os factores
com o plano representado na tabela 5.1.5.-I. As respostas considerados (preparaes, regresso e paralelismo) para
obtidas so apresentadas na tabela 5.1.5.-II. A grande variar de dia para dia. Os rcio-F correspondentes permitem
varincia constatada reflecte a variabilidade dos resultados verificar a validade do ensaio neste aspecto. Se os valores
entre os animais e mostra a utilidade de aplicar um ensaio de F so significativamente elevados, convm interpretar
cruzado. os resultados do ensaio com circunspeco e mesmo, se
possvel, de o reiniciar.
A anlise de varincia realizada aplicando as frmulas das
tabelas 3.2.3.-I a 3.2.3.-III separadamente para cada um dos 2
dias e ao conjunto de todos os dados. As frmulas das tabelas
3.2.3.I e 3.2.3.-II do:

Dia 1 PS 165,25 LS 13

P T 162,25 LT 8,75
8 96
HP 4 HL 16
2 6
Dia 2 PS 173,38 LS 20,06

P T 176,99 LT 5,25
8 96
HP 4 HL 16
2 6
conjunto PS 169,31 LS 16,53

P T 169,13 LT 7,00
16 192
HP 8 HL 32
FIGURA 5.1.5.-I. 2 6
e as frmulas da tabela 3.2.3.-III permitem calcular:
TABELA 5.1.5.-I Ordem dos tratamentos
Dia 1 Dia 2 Conjunto
Grupo de coelhos
1 2 3 4
SSprep 18,000 SSprep 13,781 SSprep 0,141

dia 1 S1 S2 T1 T2 SSreg 3784,5 SSreg 5125,8 SSreg 8859,5


dia 2 T2 T1 S2 S1 SSpar 144,5 SSpar 1755,2 SSpar 1453,5

720 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

Os termos da interaco obtm-se pela operao: Dia 1 Dia Tomando o antilogaritmo destes ltimos valores, obtemos
2 conjunto: uma relao de actividade de 1,003 com um intervalo
de confiana para 95 por cento de 0,835 a 1,204. Estes
SSdias prep 31,64 resultados multiplicados por AT = 40 do uma actividade de
SSdias reg 50,77 40,1 unidades por mililitro com um intervalo de confiana
para 95 por cento de 33,4 a 48,2 unidades por mililitro.
SSdias par 446,27
Calcula-se tambm a soma dos quadrados devidos 5.2. MODELO DE RELAO DE DECLIVES
variabilidade diria:
5.2.1. DESENHO COMPLETAMENTE ALEATRIO (0,3,3)

Ensaio do factor VIII


e a soma dos quadrados devidos aos blocos (variabilidade
Um laboratrio desenvolve um ensaio colorimtrico do
entre animais):
factor VIII em solues concentradas. O laboratrio no
tem experincia deste tipo de titulaes mas tenta torn-lo
operacional. So preparadas 3 diluies equivalentes para o
padro e para a amostra. igualmente preparado um branco

5. Textos gerais
onde Bi a resposta mdia por animal. embora no seja esperada uma relao dose-resposta linear
para as doses mais baixas. Cada diluio observada com
A anlise de varincia pode ser completada conforme descrito 8 rplicas, um nmero superior ao que ser utilizado nos
na tabela 5.1.5.-III. ensaios de rotina.
TABELA 5.1.5.-III Anlise de varincia A representao grfica dos dados mostra claramente que a
relao dose-resposta efectivamente no linear para as doses
Graus Soma baixas. As respostas obtidas para o branco no so usadas nos
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao
liberdade quadrados
mdio F clculos (so necessrios novos ensaios para justificar esta
deciso). As frmulas das tabelas 3.3.3.2.-I e 3.3.3.1-II do:
No paralelismo 1 1453,5 1453,5 1,064 0,311
PS = 0,6524 PT = 0,5651
Dias amostra 1 31,6 31,6 0,023 0,880
Dias reg. 1 50,8 50,8 0,037 0,849 LS = 1,4693 LT = 1,2656
Erro residual aS = 0,318 aT = 0,318
28 38258,8 1366,4
entre coelhos
bS = 0,329 bT = 0,271
Coelhos 31 39794,7 1283,7
Amostras 1 0,14 0,14 0,001 0,975
GS = 0,1554 GT = 0,1156
Regresso 1 8859,5 8859,5 64,532 0,000 JS = 4,17 . 10-8 JT = 2,84 . 10-6
Dias 1 478,5 478,5 3,485 0,072 e
Dias no para 1 446,3 446,3 3,251 0,082 HI = 0,09524 a= 0,05298 K = 1,9764
Erro residual
entre coelhos
28 3844,1 137,3 E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas
das tabelas 3.3.3.1.-III e 3.3.3.1.-IV.
Total 63 53423,2
A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a
As frmulas da seco 3.2.5. do: ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a
actividade pode ser calculada.
para o declive comum
Declive da curva do padro:

para ln(relao de actividade): Declive da curva da amostra

A aplicao da frmula 3.3.5.1.-3 d:

e para o In(limites de confiana):

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 721


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5.3. Anlises estatsticas

e os limites de confiana para 95 por cento so: 5.2.2. ENSAIO TOTALMENTE ALEATRIO (0,4,4,4)

Ensaio in vitro de vacinas da gripe


O teor em antigneo da hemaglutinina (AH) de 2 vacinas
gripais determinado por imunodifuso radial simples. As 2
vacinas possuem uma actividade declarada de 15 g de AH
A relao de actividade estimada de 0,823 com um intervalo por dose, equivalente a um teor em AH de 30 g/ml. O teor
de confiana para 95 por cento entre 0,817 e 0,829. em AH atribudo ao padro de 39 g/ml.
O padro e as vacinas a titular so examinadas em 4
TABELA 5.2.1.-I Absorvncias concentraes, preparadas em duplicado com base nos
respectivos teores (atribudo ou declarado). Quando obtido
branco padro S (em UI/ml) amostra T (em UI/ml) o equilbrio entre o reagente interno e o reagente externo,
Conc. B S1 S2 S3 T1 T2 T3 mede-se a rea da zona anelar da precipitao. Os resultados
0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03
obtidos so apresentados na tabela 5.2.2.-I.
0,022 0,133 0,215 0,299 0,120 0,188 0,254 A representao grfica dos dados no apresenta nenhum
aspecto fora do habitual. A aplicao das frmulas das tabelas
0,024 0,133 0,215 0,299 0,119 0,188 0,253
5. Textos gerais

3.3.3.1.-I e 3.3.3.1-II do:


0,024 0,131 0,216 0,299 0,118 0,190 0,255
0,026 0,136 0,218 0,297 0,120 0,190 0,258 PS = 108,2 P T = 103,85 PU = 85,8
0,023 0,137 0,220 0,297 0,120 0,190 0,257 LS = 301,0 LT = 292,1 LU = 234,1
0,022 0,136 0,220 0,305 0,121 0,191 0,257
aS = 141,0 aT = 116,7 aU = 139,8
0,022 0,138 0,219 0,299 0,121 0,191 0,255
bS = 61,2 bT = 64,95 bU = 39,2
0,023 0,137 0,218 0,302 0,121 0,190 0,254
GS = 3114,3 GT = 2909,4 GU = 1917,3
mdia 0,0235 0,1351 0,2176 0,2996 0,1200 0,1898 0,2554
JS = 0,223 JT = 2,227 JU = 0,083

e
HI = 0,0093 a = 11,04 K = 14785,8

E a anlise de varincia realizada com a ajuda das frmulas


das tabelas 3.3.3.1.III e 3.3.3.1.-IV. Os resultados obtidos so
apresentados na tabela 5.2.2.-II.
A existncia de uma regresso muitssimo significativa e a
ausncia de desvio da linearidade e interseco indicam que a
actividade pode ser calculada.
Declive da curva do padro:

Declive da curva da vacina T:

FIGURA 5.2.1.-I.

Declive da curva da vacina U:


TABELA 5.2.1.-II Anlise de varincia

Origem Graus Soma Quadrado Rcio


da variao de dos mdio F Probabilidade
liberdade quadrados
Regresso 2 0,1917 0,0958 24850 0,000
Interseco 1 3.109 3.109 7.104 0,978 A relao de actividade estimada de 6,056/6,356 = 0.953
para a vacina T e de 4,123/6,356 = 0,649 para a vacina U.
No linear 2 2.105 1.105 2,984 0,061
Tratamentos 5 0,1917
Erro residual 42 1,62.104 3,86.106
Total 47 0,1919

722 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

Os limites de confiana so dados pela frmula 3.3.5.1.-4. TABELA 5.2.2.-III Estimativa da quantidade de AH (g/dose)

Para a vacina T: Limite inferior Estimativa Limite superior


Vacina T 13,4 14,3 15,3
Vacina U 8,9 9,7 10,6

Para a vacina U:
5.3. RESPOSTAS QUALITATIVAS

5.3.1. TITULAO DE UMA PREPARAO RELATIVAMENTE


A UM PADRO PELO MTODO DA PROPABILIDADE
ITERACTIVA (PROBIT)
O teor em AH, expresso em g/dose, calculado
multiplicando as relaes de actividade e os limites de Ensaio in vivo de uma vacina diftrica
confiana pela actividade assumida (15 g/dose). Os
resultados obtidos figuram na tabela 5.2.2.-III. Uma vacina diftrica, com a actividade assumida de 140
UI/ampola, titulada por comparao com um padro
com a actividade atribuda de 132 UI/ampola. Com bases

5. Textos gerais
TABELA 5.2.2.-I Superfcie de precipitao (mm2) nestas actividades, preparam-se doses equivalentes destas
preparaes, que so administradas de modo aleatrio a um
Conc. Padro S Amostra T Amostra U grupo de cobaios. Aps determinado intervalo de tempo, os
(g/ml) I II I II I II animais so submetidos a uma prova de virulncia atravs da
7,5 18,0 18,0 15,1 16,8 15,4 15,7 toxina diftrica. Os resultados obtidos, expressos em nmero
de animais sobreviventes, so apresentados na tabela 5.3.1.-I.
15,0 22,8 24,5 23,1 24,2 20,2 18,6
22,5 30,4 30,4 28,9 27,4 24,2 23,1 Os valores so transpostos para a primeira tabela de trabalho,
onde so calculadas as colunas seguintes como descrito na
30,0 35,7 36,6 34,4 37,8 27,4 27,0
seco 4.2.1. A tabela 5.3.1.-II representa o primeiro ciclo de
clculo.

TABELA 5.3.1.-I Dados brutos do ensaio


em cobaios da vacina diftrica

Padro (S) Amostra (T)


actividade atribuda actividade assumida
132 UI/ampola 140 UI/ampola
dose submetidos protegidos dose submetidos protegidos
(UI/ml) a prova (UI/ml) a prova
1,0 12 0 1,0 11 0
1,6 12 3 1,6 12 4
2,5 12 6 2,5 11 8
4,0 11 10 4,0 11 10

FIGURA 5.2.2.-I.

TABELA 5.2.2.-II Anlise de varincia

Graus Soma
Origem Quadrado Rcio
de dos Probabilidade
da variao mdio F
liberdade quadrados
Regresso 3 1087,7 362,6 339,5 0,000
Interseco 2 3,474 1,737 1,626 0,237
No linear 6 5,066 0,844 0,791 0,594
Tratamentos 11 1096,2
Erro residual 12 12,815 1,068
Total 23 1109,0
FIGURA 5.3.1.-I.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 723


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 5.3.1.-II. Primeira tabela de trabalho no primeiro ciclo

Vacina Dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy

S 1,0 12 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 1,253 7,64 0,00 9,57 0,00 12,00 0,00

1,6 12 3 0,470 0,250 0 0,5 0,399 0,627 7,64 3,59 4,79 1,69 3,00 2,25

2,5 12 6 0,916 0,500 0 0,5 0,399 0,000 7,64 7,00 0,00 6,41 0,00 0,00

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

T 1,0 11 0 0,000 0,000 0 0,5 0,399 1,253 7,00 0,00 8,78 0,00 11,0 0,00

1,6 12 4 0,470 0,333 0 0,5 0,399 0,418 7,64 3,59 3,19 1,69 1,33 1,50

2,5 11 8 0,916 0,727 0 0,5 0,399 0,570 7,00 6,42 3,99 5,88 2,27 3,66

4,0 11 10 1,386 0,909 0 0,5 0,399 1,025 7,00 9,71 7,18 13,46 7,36 9,95

TABELA 5.3.1.-III. Segunda tabela de trabalho no primeiro ciclo


5. Textos gerais

vacina w wx wy wx2 wy2 wxy2 Sxx Sxy Syy


x
y a
S 29,92 20,30 7,18 21,56 22,36 7,70 7,79 12,58 20,64 0,68 0,24 1,36

T 28,65 19,72 0,80 21,03 21,97 12,11 7,46 12,66 21,95 0,69 0,03 1,17

TABELA 5.3.1.-IV. Primeira tabela de trabalho no segundo ciclo

Vacina Dose n r x p Y Z y w wx wy wx2 wy2 wxy


S 1,0 12 0 0,000 0,000 1,36 0,086 0,158 1,911 3,77 0,00 7,21 0,00 13,79 0,00
1,6 12 3 0,470 0,250 0,58 0,279 0,336 0,672 6,74 3,17 4,53 1,49 3,04 2,13
2,5 12 6 0,916 0,500 0,15 0,561 0,394 0,001 7,57 6,94 0,01 6,36 0,00 0,01
4,0 11 10 1,386 0,909 0,93 0,824 0,258 1,260 5,07 7,03 6,39 9,75 8,05 8,86
T 1,0 11 0 0,000 0,000 1,17 0,122 0,202 1,769 4,20 0,00 7,43 0,00 13,14 0,00
1,6 12 4 0,470 0,333 0,39 0,349 0,370 0,430 7,23 3,40 3,11 1,60 1,34 1,46
2,5 11 8 0,916 0,727 0,35 0,637 0,375 0,591 6,70 6,14 3,96 5,62 2,34 3,63
4,0 11 10 1,386 0,909 1,13 0,870 0,211 1,311 4,35 6,03 5,70 8,36 7,48 7,90

TABELA 5.3.1.-V. Segunda tabela de trabalho depois do ltimo ciclo

vacina w wx wy wx2 wy2 wxy Sxx Sxy Syy


x
y a
S 18,37 14,80 2,14 14,85 17,81 5,28 2,93 7,00 17,56 0,81 0,12 2,05
T 17,96 12,64 0,55 11,86 18,35 6,76 2,96 7,15 18,34 0,70 0,03 1,72

A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de teste de paralelismo pode ser efectuado como descrito na
seguida para cada uma das preparaes, e os resultados so mesma seco. O valor de 2 com 1 grau de liberdade de
transportados para a segunda tabela de trabalho (ver tabela
5.3.1.-III), onde as outras colunas so calculadas com a
ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a 4.2.1.-10. O declive comum b
resultante de 1,655.
de 0,974 o que no significativo.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira Procedendo como indicado na seco 4.2.3, obtemos as
tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de seguintes estimativas:
clculo (tabela 5.3.1.-IV).
para ln(relao de actividade):
Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos at
obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos
consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se
ento sob a forma indicada na tabela 5.3.1.-V.
O teste de linearidade feito conforme descrito na seco
4.2.2. O valor de 2 com 4 graus de liberdade de
0,851 1,070 1,921, ou seja, um valor de p de 0,750 o
que no significativo.
Uma vez que no h desvio significativo da linearidade, o

724 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

e para ln(limites de confiana): TABELA 5.3.3.-I Diluies (10x l de vacina no diluda)

A actividade e os limites de confiana podem agora ser


obtidos multiplicando os antilogaritmos pela actividade
assumida (149 UI/ampola). A estimativa assim obtida de
160,6 UI/ampola com um intervalo de confiana para 95 por
cento entre 121,0 e 215,2 UI/ampola.

5.3.2. MTODO LOGIT E OUTROS MTODOS DE ANLISE


DA TITULAO DE UMA AMOSTRA RELATIVAMENTE A UM
PADRO

5. Textos gerais
Os resultados sero fornecidos para a situao onde o mtodo
logit e outros mtodos clssicos desta famlia so aplicados
para os dados da seco 5.3.1. Este exemplo deve ser
considerado como um exerccio iluestrativo, e no como uma
alternativa ao mtodo da probabilidade iteractiva (probit)
no caso particular. S poder ser utilizada outra funo com
base em justificaes experimentais ou tericas.

FIGURA 5.3.3.-I.

A soma das 6 ltimas colunas desta tabela realizada de


seguida e os resultados so transportados para a segunda
tabela de trabalho (ver tabela 5.3.3.-III), onde as outras
colunas so calculadas com a ajuda das frmulas 4.2.1.-4 a
4.2.1.-10. O declive comum b resultante de -0,295.
De seguida substitui-se por a + bx os valores de Y na primeira
tabela de trabalho, e de seguida efectua-se o segundo ciclo de
clculo. Procede-se assim por ciclos de clculos iteractivos
at obteno de uma diferena mnima entre 2 ciclos
consecutivos. A segunda tabela de trabalho apresenta-se
ento sob a forma indicada na tabela 5.3.3.-IV.
O teste de linearidade feito conforme descrito na seco
4.2.2. O valor de 2 com 8 graus de liberdade de 2,711, ou
seja, um valor de p de 0,951 o que no significativo.
Procedendo como indicado na seco 4.5, obtemos as
5.3.3. DETERMINAO DA DE50 DE UMA SUBSTNCIA seguintes estimativas:
PELO MTODO DA PROBABILIDADE ITERACTIVA (PROBIT) para ln(relao de actividade):

Ensaio in vitro de uma vacina oral da poliomielite (7,931)


MT 12,273
A titulao de uma vacina oral da poliomielite efectuada 0,646
pela determinao de DE50 em placas ELISA com 10 diluies
diferentes e 8 rplicas de 50 l. Os resultados obtidos so
apresentados na tabela 5.3.3.-I.
Estes valores so transpostos para a primeira tabela de
trabalho, onde so calculadas as colunas seguintes como
descrito na seco 4.2.1. A tabela 5.3.3.-II representa o
primeiro ciclo deste mtodo de clculo.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 725


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5.3. Anlises estatsticas


5. Textos gerais

e para ln(limites de confiana): no conduzem, na maior parte das situaes, a resultados


muito diferentes. Encontramos na seco 7.5 uma breve
discusso destas aproximaes alternativas bem como de
outras consideraes estatsticas.

TABELA 5.4.1.-I Respostas observadas


Esta estimativa expressa em termos de ln(diluio).
Para converter esta expresso em ln(DE50)/ml necessrio

Como a actividade deste tipo de vacina expresso em termos


de log10(DE50)/ml, necessrio dividir os resultados por
ln(10). A actividade estimada assim obtida igual a 6,63
log10(DE50)/ml, com um intervalo de confiana para 95 por
cento entre 6,30 e 6,96 log10(DE50)/ml.

5.4. CURVAS DOSE-RESPOSTA SIGMOIDES PROLONGADAS

5.4.1. ANLISE DE UMA CURVA LOGSTICA DE 4


PARMETROS

Titulao serolgica de imunosoros tetnicos


Um imunosoro de cobaio doseado por comparao com
Como j foi previamente indicado na seco 3.4, este exemplo um imunosoro de referncia (0,4 UI/ml) com uma tcnica
tem por objectivo ilustrar um modo possvel de anlise de imunoadsoro por enzima conjugado (ELISA) Aplicam-
dos dados apresentados, mas no necessariamente reflectir -se 10 diluies de cada soro numa placa ELISA com 96
o nico modo de anlise ou o mais apropriado. Muitas pocilhos. Cada diluio aplicada 2 vezes. Os resultados
outras aproximaes esto descritas na literatura, mas elas observados so apresentados na tabela 5.4.1.-I.

726 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

Para este exemplo assume-se que o laboratrio validou as assmptotas superior e inferior no for satisfeita, provvel
condies 1 a 3 especificadas na seco 3.1.1, quando o ensaio que se observem desvios significativos de linearidade e/ou
foi desenvolvido em condies de rotina. Para alm disso, paralelismo, uma vez que os testes de paralelismo e de
o laboratrio validou tambm as condies de igualdade do linearidade reflectem a justeza do ajustamento do modelo de
limite superior e do limite inferior das amostras. 4 parmetros na sua totalidade. O erro residual na anlise de
varincia sempre igual a 1 em resultado da transformao.
A representao grfica no demonstra aspectos anormais.
, no entanto, possvel calcular um factor de heterogeneidade
Procede-se ao ajustamento dos parmetros da funo
(anlogo ao utilizado no mtodo dos probits).
logstica pelo mtodo dos mnimos quadrados, utilizando um
programa informtico apropriado, supondo que os termos de A actividade relativa da amostra pode ser obtida pelo clculo
erro residual so variveis aleatrias normais independentes do antilogaritmo de S T. Multiplicando este valor pela
e identicamente distribudas. Neste caso so necessrios 3 actividade atribuda da preparao de referncia, obtemos
parmetros ( , e ) para descrever o factor de declive
uma actividade estimada de 1,459 0,4 0,584 UI/ml. A
comum e as assmptotas comuns inferior e superior, mais
frmula 4.2.3.-2 d, para os limites de confiana para 95 por
2 parmetros complementares (S e T) para descrever a
cento, os valores de 0,557 e 0,612 UI/ml.
posio horizontal das 2 curvas. O programa fornece as
estimativas para os diferentes parmetros:

5. Textos gerais
6. COMBINAO DE RESULTADOS
DE ENSAIOS
6.1. INTRODUO

Alm disso, fornece para a varincia residual s2 uma Para satisfazer as exigncias da Farmacopeia muitas
estimativa de 0,001429 com 20 graus de liberdade (variao vezes necessrio realizar vrios ensaios independentes e
intra-tratamentos). combinar os seus resultados. A questo coloca-se quanto
admissibilidade da combinao dos resultados dos ensaios, e
Para obter os limites de confiana, e verificar o paralelismo e
em caso afirmativo, de que modo.
a linearidade, linearisam-se as respostas u observadas, antes
de as submeter a uma anlise de linhas paralelas ponderada Dois ensaios podem ser considerados como independentes
atravs do programa. Este procedimento muito semelhante quando a execuo de um deles no afecta as probabilidades
ao descrito na seco 4.2 pelo mtodo da probabilidade associadas aos resultados dos outros. Isto implica que
iteractiva (probit), introduzindo-se as seguintes modificaes: o conjunto dos erros aleatrios ligados aos principais
factores de influncia de um dos ensaios (por exemplo,
diluies do padro e da amostra, sensibilidade do indicador
biolgico) devem ser independentes dos erros aleatrios
correspondentes ao outro ensaio. Os ensaios realizados
em vrios dias consecutivos a partir de diluies do padro
preparadas no mesmo momento no so considerados
ensaios independentes.
Existem vrios mtodos para combinar os resultados de
ensaios independentes, sendo o mais aceitvel do ponto
de vista terico o que apresenta maior dificuldade de
Obtm-se assim, uma anlise de varincia ponderada das aplicao. A seguir so descritos 3 mtodos de aproximao
respostas transformadas y com as ponderaes w: simplificada; outros podem ser usados desde que as condies
necessrias sejam satisfeitas.
TABELA 5.4.1.-II. Anlise de varincia ponderada
Antes de combinar as actividades obtidas a partir dos ensaios
Origem graus de
da variao liberdade
Chi-quadrado Probabilidade baseados no modelo de linhas paralelas ou no modelo da
probabilidade iteractiva (probit) devem ser expressos em
Amostras 1 0,529653 0,467
logaritmos; pelo contrrio, as actividades obtidas a partir
Regresso 1 6599,51 0,000
de ensaios baseados no modelo de relao de declives so
No paralelismo 1 0,0458738 0,830 utilizadas tal qual. Como os 2 primeiros modelos so de
No linearidade 16 8,89337 0,918 utilizao mais corrente que o da relao de declives, o
Tratamentos 19 6608,98 0,000 smbolo M (representando o logaritmo da actividade) que
Erro residual 20 20,0000 usado nas frmulas desta seco. Lendo R (relao de declive)
Total 39 6628,98 em vez de M, o experimentador pode aplicar as mesmas
frmulas para calcular os resultados dos ensaios baseados no
No se observam desvios significativos de paralelismo e de modelo de relao de declives. Antes de serem combinados,
linearidade; o mtodo de doseamento satisfatrio para todas as estimativas de actividade devem ser corrigidas
os clculos da actividade. Se a condio de igualdade das relativamente actividade atribuda para preparao.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 727


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5.3. Anlises estatsticas

6.2. COMBINAO PONDERADA DE RESULTADOS DE 6.2.3. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES
ENSAIOS DE CONFIANA

Este mtodo pode ser utilizado se as seguintes condies Os produtos WM so formados para cada ensaio e a sua soma
forem satisfeitas: dividida pela soma dos factores de ponderao de todos os
ensaios, para dar a mdia logartmica ponderada da actividade.
1) As estimativas de actividade resultam de ensaios
independentes,
2) para cada ensaio, C est perto de 1 (digamos inferior a 1,1),
O erro tipo de ln(actividade mdia) a raiz quadrada do
3) o nmero de graus de liberdade dos erros residuais inverso da soma dos factores de ponderao:
individuais superior ou igual a 6 e de preferncia
superior a 15,
4) as estimativas individuais de actividade formam uma srie
homognea (ver seco 6.2.2).
Se as condies no forem satisfeitas, este mtodo no pode e os limites de confiana aproximados so obtidos tomando o
ser aplicado. O mtodo descrito na seco 6.3 pode ento antilogaritmo do valor dado pela equao:
5. Textos gerais

ser utilizado para obter a melhor estimativa da actividade


mdia, podendo ser adoptado para os ensaios ulteriores como
actividade assumida.
onde o nmero de graus de liberdade associado a t igual
soma do nmero de graus de liberdade para os quadrados
6.2.1. CLCULO DOS FACTORES DE PONDERAO mdios do erro nos ensaios individuais.

presumido que os resultados de cada um dos n ensaios


foram analisados para dar origem a n valores de M com os 6.2.4. CLCULO DA MDIA PONDERADA E DOS LIMITES
limites de confiana associados. Para cada ensaio, o intervalo DE CONFIANA BASEADO NAS VARIAES INTRA- E
de confiana logartmico L obtido por subtraco ao limite INTER-ENSAIOS
superior o inferior. O factor de ponderao W calculado
Quando os resultados de vrios ensaios repetidos so
para cada valor de M com a ajuda da frmula 6.2.1.-1, onde t
combinados, o valor de 2 pode ser significativo. Considera-se
toma o mesmo valor que o utilizado no clculo dos limites de ento que a variabilidade observada tem duas componentes:
confiana.

6.2.2. HOMOGENEIDADE DAS ESTIMATIVAS DE


onde M a mdia no ponderada. A primeira varia de um
ACTIVIDADE ensaio para outro, enquanto que a segunda comum a todos
os valores M.
Elevando ao quadrado o desvio de cada valor de M
Calculamos ento, para cada valor M, um factor de
relativamente mdia ponderada, e depois multiplicando ponderao:
cada um dos desvios pelo factor de ponderao apropriado
e efectuando a sua soma no conjunto dos ensaios, obtemos
uma varivel estatstica em que a distribuio segue
aproximadamente uma lei de 2 (ver tabela 8.3) e que pode
ser utilizado para verificar a homogeneidade de uma srie de
que substitui W na seco 6.2.3, onde t toma aproximadamente
estimativas do logaritmo da actividade: o valor 2.

6.3. COMBINAO NO PONDERADA DE RESULTADOS DE


ENSAIOS
Se o valor de 2 assim calculado inferior ao valor da tabela
que corresponde a (n1) graus de liberdade, as actividades Para combinar da maneira mais simples as n estimativas de
so homogneas e os valores obtidos na seco 6.2.3 para a M obtidas a partir de n ensaios, determinamos a sua mdia
actividade mdia e os limites associados tero significado. seguida do clculo do desvio padro segundo a frmula:
Se o valor de 2 calculado superior ao valor da tabela, as
actividades so heterogneas. Isto significa que as variaes
entre as estimativas individuais de M so superiores ao que
seria previsvel pelas estimativas dos limites de confiana,
quer dizer que existe uma variabilidade significativa entre os
ensaios. Nestas circunstncias, a condio 4 no satisfeita e os limites de confiana so dados por
e as equaes da seco 6.2.3 no so aplicveis, mas elas
podem ser substitudas pelas da seco 6.2.4.

728 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

onde t possui (n1) graus de liberdade. O nmero n de 7.1 MODELOS LINEARES GERAIS
estimativas de M normalmente pequeno, e em consequncia
o valor de t relativamente grande. Os mtodos descritos neste anexo podem, globalmente, ser
descritos como modelos lineares gerais (ou generalistas para
poder incluir os mtodos de probits e de logits). O princpio
6.4. EXEMPLO DE ACTIVIDADE MDIA PONDERADA E DOS geral consiste na definio de uma matriz de estrutura linear X
SEUS LIMITES DE CONFIANA (ou matriz de planificao) em que cada linha representa uma
observao e cada coluna um efeito linear (preparao, bloco,
Na tabela 6.4.-I esto representadas 6 estimativas
coluna, dose). Por exemplo, o ensaio de quadrado latino do
independentes da actividade da mesma preparao, com os
exemplo 5.1.2 poder ser representado por uma matriz de 36
limites de confiana para 95 por cento e os nmeros de graus
linhas e 13 colunas: 1 coluna para cada preparao, 1 coluna para
de liberdade correspondentes. As condies 1, 2 e 3 da seco
as 5 doses, 5 colunas para os blocos com excepo do primeiro
6.2 so satisfeitas. Os valores ln(actividade) e os factores de
e 5 colunas para as linhas com excepo da primeira. Todas as
ponderao so calculados como descrito na seco 6.2.
colunas, com excepo daquela contendo as doses so preenchidas
com o valor 0 ou 1 dependendo da observao corresponder
TABELA 6.4.-I. Anlise de varincia ponderada

5. Textos gerais
ou no ao efeito considerado. Um vector Y construdo com as
observaes (transformadas). As actividades so estimadas com
auxlio da frmula (XtX)-1XtY, e fcil de deduzir a estimativa da
actividade m atravs do rcio dos efeitos relevantes. O intervalo de
confiana calculado pelo teorema de Fieller:

A homogeneidade das estimativas de actividade avaliada por e v11, v22, v12 representam respectivamente os multiplicadores
meio da frmula 6.2.2.-1, que d um valor de 2 de 4,42 com da varincia para o numerador e denominador e o
5 graus de liberdade. Este resultado no significativo multiplicador da covarincia. Eles so obtidos directamente a
(p 0,49) e portanto todas as condies so satisfeitas. partir de (XtX)1 ou indirectamente fazendo:

O clculo da actividade mdia ponderada para a frmula Var(a1a2) Var(a1) Var(a2) 2Cov(a1,a2)
6.2.3.-1 d um valor de 9,8085.
e Cov(a1a2,b) Cov(a1,b) Cov(a2,b)
A frmula 6.2.3.-2 d um desvio padro de 0,00673 e
os limites de confiana para 95 por cento aproximados Uma anlise de varincia completa implicando a partio
calculados pela frmula 6.2.3.-3, onde t possui 120 graus de de todas as componentes ligeiramente mais complexa
liberdade, so de 9,7951 e 9,8218. porque ela implica uma redefinio de X, com mais colunas,
para verificar as hipteses de paralelismo e de linearidade,
Tomando o antilogaritmo destes valores, obtemos uma
depois do qual as hipteses lineares podem ser testadas. Para
actividade de 18 187 UI/ampola com um intervalo de
as titulaes baseadas em respostas qualitativas, os efeitos
confiana para 95 por cento entre 17 946 e 18 431 UI/ampola. lineares (ordenadas na origem aS, aT, etc e declive comum b)
so determinadas maximizando a soma dos tratamentos
7. PARA ALM DESTA MONOGRAFIA nln (ai bx) (n r)ln(1 (ai bx)), onde x
ln(dose), representa a forma da distribuio e i {S, T, ...}.
impossvel apresentar uma exposio completa de
mtodos estatsticos num texto da Farmacopeia, mas os 7.2. HETEROGENEIDADE DA VARINCIA
mtodos anteriormente descritos devem ser normalmente
suficientes para a maior parte dos ensaios da farmacopeia. Nem sempre possvel resolver o problema da
O objectivo desta seco a de tentar trazer uma viso heterogeneidade da varincia pela simples transformao das
mais global sobre os mtodos alternativos ou mais gerais respostas. Uma aproximao possvel consiste na utilizao de
que foram desenvolvidos. O leitor que estiver interessado uma regresso linear ponderada. Para obter uma estimativa
convidado a aprofundar o assunto explorando a literatura sem distoro (bias) aplica-se s observaes um factor de
existente. De qualquer modo, a aplicao de mtodos ponderao proporcional ao inverso do erro das varincias.
estatsticos mais especializados dever ser deixada ao Como o verdadeiro erro das varincias nem sempre
cuidado de especialistas. conhecido, pode-se proceder atravs da determinao

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 729


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.3 ANLISES ESTATSTICAS (NDICE)

5.3. Anlises estatsticas

iteractiva das ponderaes. No entanto, o clculo do intervalo 3) Os procedimentos estatsticos de ajustamento das curvas
de confiana coloca ainda novos problemas. podem originar estimativas diferentes dependendo das
hipteses colocadas quanto homogeneidade da varincia
e ao intervalo das respostas utilizado.
7.3. VALORES ABERRANTES E ROBUSTEZ DOS MTODOS
4) Em princpio, a igualdade das respostas mxima e
O mtodo dos mnimos quadrados descrito neste anexo mnima, obtidas com as diferentes preparaes includas
apresenta o inconveniente de ser extremamente sensvel a numa dosagem, pode ser directamente verificada em
resultados aberrantes. Um resultado nitidamente aberrante cada ensaio. No entanto, a interpretao dos resultados
pode falsear totalmente os resultados. Resolve-se esse destes testes estatsticos pode no ser evidente. Os
problema normalmente, rejeitando esses resultados dos testes de linearidade e de paralelismo descritos no
dados do ensaio. Esta pratica pode conduzir rejeio mtodo de anlise simplificada (exemplo 5.4.1) incluem
arbitrria de dados, e no isenta de perigos. No fcil indirectamente as verificaes de igualdade e de preciso
dos limites inferior e superior.
propor regras gerais sobre o modo de decidir se uma
observao especfica constitui ou no um resultado 5) Muitos doseamentos incluem os controlos que
aberrante, e por isso mtodos mais robustos foram servem para identificar as respostas limite (inferior e/ou
5. Textos gerais

desenvolvidos, que so menos sensveis presena de superior), mas estes valores podem no ser coincidir com
resultados aberrantes porque atribuem menor peso s os limites superior e inferior obtidos pelo ajustamento
observaes que se afastam muito do valor presumido. Estes estatstico a partir da curva dose-resposta prolongada.
mtodos colocam, no entanto, outros problemas ligados ao 6) O mtodo de anlise simplificado descrito no exemplo
clculo dos intervalos de confiana ou definio de uma 5.4.1 fornece intervalos de confiana aproximados. Outros
funo de ajustamento satisfatria. mtodos podem igualmente ser utilizados para o clculo,
como por exemplo o mtodo baseado na ausncia de
7.4. ERROS CORRELACIONADOS ajustamento do modelo completamente especificado.
Para dados de doseamentos tpicos, com respostas
A aleatoriedade absoluta nem sempre realizvel ou cobrindo o conjunto do intervalo para cada preparao
verdadeiramente sustentvel do ponto de vista prtico. testada, todos os mtodos do resultados similares.
, por isso, frequente que as doses sucessivas de uma srie
de diluies apresentem erros correlacionados e que, em
consequncia, os limites de confiana sejam demasiado 8. TABELAS E MTODOS DE CLCULO
aproximados.
As tabelas contidas nesta seco apresentam os valores
Foram desenvolvidos mtodos que permitem ter em ateno crticos correspondentes aos nmeros de graus de
este efeito de autocorrelao. liberdade mais usuais. Se determinado valor crtico no
figurar, devem ser consultadas tabelas mais detalhadas.
Numerosos programas informticos contm funes
7.5. CURVAS DOSE-RESPOSTA NO LINEARES estatsticas, e o seu emprego prefervel ao uso das tabelas
PROLONGADAS aqui apresentadas. Uma outra aproximao possvel
consiste na utilizao dos mtodos de clculo descritos
A anlise das curvas dose-resposta no lineares prolongadas a seguir a cada tabela, para determinar a probabilidade
coloca um conjunto de problemas estatsticos que correspondente a uma varivel estatstica e a um nmero
indispensvel ter em considerao, e por causa dos quais de graus de liberdade dados.
recomendada a consulta a um especialista. Alguns desses
problemas so apresentados sucintamente a seguir.
8.1 DISTRIBUIO DE F
1) Um exemplo utilizando a funo logstica de 4 parmetros
descrito anteriormente. No entanto, igualmente possvel Se o valor observado superior ao valor indicado na Tabela,
utilizar modelos baseados em funo que dem outras 8.1-I considerado como significativo (linhas superiores,
curvas sigmoides. Foi sugerido o emprego de modelos p = 0,05) ou muito significativo (linhas inferiores, p = 0,01).
comportando parmetros suplementares de assimetria. df1 o nmero de graus de liberdade do numerador e df2 o
nmero de graus de liberdade do denominador.
2) A heterogeneidade da varincia corrente quando as
respostas se distribuem numa grande intervalo. Se a Mtodo de clculo: seja F o rcio-F e df1 e df2 como descrito
anlise ignora esta heterogeneidade, a interpretao acima. Seja pi p 3,14159265358979... O mtodo
dos resultados corre o risco de ser incorrecta e as seguinte Tabela 8.1-II permite o clculo do valor p.
estimativas distorcidas (biased). Perante um nmero
de rplicas limitado o recurso a factores de ponderao 8.2. DISTRIBUIO DE T
proporcionais ao inverso das varincias de erro tem
poucas oportunidades de ser fivel. Uma aproximao Se o valor observado superior ao valor indicado na tabela
satisfatria pode ser o clculo de uma funo que exprima 8.2-I, considerado significativo (p 0,05) ou muito
uma relao entre a varincia e a resposta mdia. significativo (p 0,01).

730 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 8.1.-I. Valores crticos da distribuio de F

df1 1 2 3 4 5 6 8 10 12 15 20
df2

10 4,965 4,103 3,708 3,478 3,326 3,217 3,072 2,978 2,913 2,845 2,774 2,538
10,044 7,559 6,552 5,994 5,636 5,386 5,057 4,849 4,706 4,558 4,405 3,909

12 4,747 3,885 3,490 3,259 3,106 2,996 2,849 2,753 2,687 2,617 2,544 2,296
9,330 6,927 5,953 5,412 5,064 4,821 4,499 4,296 4,155 4,010 3,858 3,361

15 4,543 3,682 3,287 3,056 2,901 2,790 2,641 2,544 2,475 2,403 2,328 2,066
8,683 6,359 5,417 4,893 4,556 4,318 4,004 3,805 3,666 3,522 3,372 2,868

20 4,351 3,493 3,098 2,866 2,711 2,599 2,447 2,348 2,278 2,203 2,124 1,843
8,096 5,849 4,938 4,431 4,103 3,871 3,564 3,368 3,231 3,088 2,938 2,421

5. Textos gerais
25 4,242 3,385 2,991 2,759 2,603 2,490 2,337 2,236 2,165 2,089 2,007 1,711
7,770 5,568 4,675 4,177 3,855 3,627 3,324 3,129 2,993 2,850 2,699 2,169

30 4,171 3,316 2,922 2,690 2,534 2,421 2,266 2,165 2,092 2,015 1,932 1,622
7,562 5,390 4,510 4,018 3,699 3,473 3,173 2,979 2,843 2,700 2,549 2,006

50 4,034 3,183 2,790 2,557 2,400 2,286 2,130 2,026 1,952 1,871 1,784 1,438
7,171 5,057 4,199 3,720 3,408 3,186 2,890 2,698 2,563 2,419 2,265 1,683

3,841 2,996 2,605 2,372 2,214 2,099 1,938 1,831 1,752 1,666 1,571 1,000
6,635 4,605 3,782 3,319 3,017 2,802 2,511 2,321 2,185 2,039 1,878 1,000

TABELA 8.2.-I. Valores crticos da distribuio de T TABELA 8.2.-II. Mtodos de clculo para a distribuio de T

df p 0,05 p 0,01 df p 0,05 p 0,01


t = 1,959964 +

1 12,706 63,656 22 2,074 2,819 2,37228 / df +


2 4,303 9,925 24 2,064 2,797 2,82202 / df ^ 2 +
3 3,182 5,841 26 2,056 2,779 2,56449 / df ^ 3 +
4 2,776 4,604 28 2,048 2,763
1,51956 / df ^ 4 +
5 2,571 4,032 30 2,042 2,750
1,02579 / df ^ 5 +
6 2,447 3,707 35 2,030 2,724
0,44210 / df ^ 7
7 2,365 3,499 40 2,021 2,704
8 2,306 3,355 45 2,014 2,690
8.3. DISTRIBUIO DE 2
9 2,262 3,250 50 2,009 2,678
10 2,228 3,169 60 2,000 2,660 TABELA 8.3.-I. Valores crticos da distribuio de 2
12 2,179 3,055 70 1,994 2,648
df p 0,05 p 0,01 df p 0,05 p 0,01
14 2,145 2,977 80 1,990 2,639
1 3,841 6,635 11 19,675 24,725
16 2,120 2,921 90 1,987 2,632
2 5,991 9,210 12 21,026 26,217
18 2,101 2,878 100 1,984 2,626
3 7,815 11,345 13 22,362 27,688
20 2,086 2,845 1,960 2,576
4 9,488 13,277 14 23,685 29,141
5 11,070 15,086 15 24,996 30,578
Mtodos de clculo: o valor p para determinado t com df
6 12,592 16,812 16 26,296 32,000
graus de liberdade obtido pelos mtodos descritos na seco
8.1 com F = t2, df1 = 1 e df2 = df. 7 14,067 18,475 20 31,410 37,566
8 15,507 20,090 25 37,652 44,314
O valor t (p = 0,05) para um dado nmero de graus de
liberdade df obtido pelo mtodo seguinte tabela 8.2-II, que 9 16,919 21,666 30 43,773 50,892
exacto at 6 casas decimais. 10 18,307 23,209 40 55,758 63,691

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 731


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5.3. Anlises estatsticas

TABELA 8.1.-II. Mtodo de clculo para a distribuio de F


5. Textos gerais

Se um valor observado superior ao valor indicado na tabela 8.4. DISTRIBUIO (DISTRIBUIO NORMAL
8.3-I, ele considerado significativo (p = 0,05) ou muito REDUZIDA CUMULATIVA)
significativo (p = 0,01).
TABELA 8.4.-I. Valores de distribuio de
Mtodo de clculo: seja x2 o valor da varivel 2 e df tal
como descrito acima. O mtodo seguinte permite calcular o
valor de p.

Neste mtodo phi a distribuio normal reduzida


cumulativa (ver seco 8.4).

732 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

Para os valores de x negativos, o valor de obtm-se a partir independentes para obter um quadrado latino.
da Tabela 8.4-I tomando 1-(-x).
1). gerar uma permutao aleatria de N tratamentos
Mtodo de clculo: Seja x o valor da varivel x. O mtodo possveis (ver seco 8.5):
seguinte permite obter o valor de correspondente se
0 x 8,15. Se x 8,15 o valor de pode ser igualado a 1. T3 S3 S1 T2 T1 S2
Se x negativo, pode-se utilizar a frmula indicada acima. Este
mtodo assume que o computador pode apresentar cerca de 15 2). pode construir-se um quadrado latino simples rodando para
casas decimais. Se o nmero de dgitos for inferior ou superior a direita os termos desta permutao. Inscreva na primeira
a 15, este mtodo necessita de alguns ajustamentos simples. linha a permutao obtida na etapa 1. A segunda linha
constituda pela mesma permutao, mas em que os termos
foram transpostos para a direita, o tratamento situado
na extrema direita vem ocupar o espao livre na extrema
esquerda. Repita esta operao em cada linha at que todos
os tratamentos apaream uma vez em cada coluna:

T3 S3 S1 T2 T1 S2

S2 T3 S3 S1 T2 T1

5. Textos gerais
T1 S2 T3 S3 S1 T2

T2 T1 S2 T3 S3 S1

S1 T2 T1 S2 T3 S3

S3 S1 T2 T1 S2 T3

8.5. PERMUTAES ALEATRIAS 3). gere de seguida 2 permutaes aleatrias independentes


dos nmeros 1 a N:
As permutaes aleatrias so indispensveis no caso de ensaios
de blocos completos. O algoritmo representado a seguir mostra uma para as linhas:
como obter uma permutao aleatria de N tratamentos por
meio da funo de clculo de um sistema informtico. 2 3 6 1 4 5

1. inscrever na linha os N tratamentos possveis. e uma para as colunas:


2. escolher aleatoriamente um nmero inteiro r tal que 1 r N.
3 4 6 2 5 1
3. permutar o r-simo tratamento e N-simo tratamento da linha.
4). O quadrado latino pode agora ser encontrado colocando
4. fazer N N 1 e repetir os passos 2 a 4 at N 1. por ordem as linhas e colunas do quadrado latino simples
O exemplo seguinte, de 6 tratamentos, ilustra este algoritmo. de acordo com as 2 permutaes para as linhas e colunas:

1. N 6 S1 S2 S3 T1 T2 T3

2. r 2
3. S1 T3 S3 T1 T2 S2

4. N 5

2. r 4

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N 4

2. r 4

3. S1 T3 S3 T2 T1 S2

4. N 3

2. r 1

3. S3 T3 S1 T2 T1 S2

4. N 2

2. r 1
3. T3 S3 S1 T2 T1 S2

4. N 1

8.6. QUADRADOS LATINOS

O exemplo seguinte mostra como utilizar 3 permutaes

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 733


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5.3. Anlises estatsticas

9. GLOSSRIO DE SMBOLOS E TERMOS H B , HI Multiplicadores usados na anlise de varincia dos


ensaios de relao de declives.
9.1. GLOSSRIO DE SMBOLOS I Nos ensaios de linhas paralelas, o ln do rcio entre
doses adjacentes. Nos ensaios de relao de declives, o
Smbolo Definio intervalo entre doses adjacentes.
a Interseco da regresso linear das respostas com a JS, JT,... Valores lineares usados na anlise de varincia dos
dose ou ln(dose) ensaios de relao de declives
b Declive da regresso linear da resposta em dose, ou K Termo de correco utilizado no clculo da soma de
logaritmo da dose quadrados numa anlise de varincia
d Nmero de nveis de doses para cada preparao L Amplitude do intervalo de confiana em logaritmos
(excluindo o branco nos ensaios do modelo de relao
de declives) LS, LT,... Contrastes lineares de padres e amostras

e Base de logaritmos naturais (= 2,71828182845905...) M ln relao da actividade de uma amostra especfica

g Clculo usado no teorema de Fieller: N Nmero total de respostas num ensaio ( dh)
PS,P T,.... Soma do padro e das amostras
5. Textos gerais

h Nmero de preparaes num ensaio, incluindo a


preparao padro R Actividade estimada de uma amostra especfica

m Actividade estimada obtida como o rcio dos efeitos R Relao da actividade de uma amostra especfica
nos modelos lineares R1 ... Rn Resposta mdia em cada linha 1 a n do desenho do
n Nmero de rplicas de cada tratamento quadrado latino, ou em cada bloco num desenho de
blocos aleatrio
p Probabilidade de que determinado clculo seja
S Padro
superior ao valor observado. Igualmente usado no
rcio r/n na probabilidade iteractiva S1,...,Sd Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um
r Nmero de unidades respondendo em cada grupo padro S
tratado em ensaios dependentes de respostas SS Soma dos quadrados de uma fonte especfica de
qualitativas variao
s Estimativa do desvio padro T, U, V, ... Amostras em ensaio
s 2 Estimativa da varincia residual dada pelo erro mdio T1,...,Td Resposta mdia menor dose 1 at maior d de um
quadrtico na anlise de varincia padro T
t Estatstica de Student (tabela 8.2) V Coeficiente de varincia no clculo dos limites de
u Resposta observada na anlise de quatro parmetros confiana
W Factor de ponderao usada na combinao de
v11, v12, v22 Multiplicadores de (co)varincia para o numerador e resultados de ensaios
denominador do rcio m no teorema de Fieller
X Estrutura linear ou desenho matricial usado para
w Coeficiente de ponderao gerar modelos lineares
x O ln(dose) Y Vector representativo das respostas (transformadas)
y nos modelos lineares gerais
Resposta individual ou transformada
Z A primeira derivada de
A Actividade assumida das amostras quando se
preparam doses Assmptota superior da curva ln(dose)-resposta na
B anlise de quatro parmetros
Resposta mdia dos brancos nos ensaios de de relao
de declives Factor de declive da curva ln(dose)-resposta na
anlise de quatro parmetros
C Estatstica usada no clculo dos limites de confiana:
1 O ln(dose) correspondente a 50 por cento de resposta
C no modelo de quatro parmetros
1g
Cp,...,Cn Resposta mdia de cada coluna do desenho do Assmptota inferior da curva ln(dose)-resposta na
quadrado latino anlise de quatro parmetros

D1, D2 3,141592653589793238...
Resposta total no tempo I, tempo II no ensaio de
permutao duplo Distribuio normal reduzida cumulativa (tabela 8.4)
F Rcio de 2 estimativas independente de varincia 2 Estatstica chi-quadrado (tabela 8.3)
seguindo a distribuio-F (tabela 8.1.)
GS,GT,... Valores do tratamento usados na anlise de varincia
dos ensaios de relao de declives.
HP, HL Multiplicadores usados na anlise de varincia dos
ensaios de linhas paralelas.

734 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.3. Anlises estatsticas

9.2. GLOSSRIO DE TERMOS 10. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA


Correspondncia utilizada entre a terminologia portuguesa e Esta seco contm uma lista de referncias bibliogrficas de
a inglesa (5). leitura recomendada para um estudo mais aprofundado do
assunto.
Terminologia Terminologia Finney, D. J. (1971). Probit Analysis, 3a Ed. Cambridge
em lngua portuguesa em lngua inglesa
University Press, Cambridge.
actividade potency
actividade atribuda assigned potency Nelder, J. A. & Wedderburn, R. W. M. (1972). Generalized
actividade declarada stated potency linear models, Journal of the Royal Statistical Society, Series
actividade estimada estimated potency A 135, 370-384.
actividade real true potency DeLean, A., Munson, P. J. e Rodbard, D. (1978).
actividade rotulada labelled potency
Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves:
aleatoriedade randomisation
Application to bioassay, radioligand assay and physiological
amplitude range
dose-response curves, Am J. Physiol. 235 (2): E97-E102.
distoro bias
Finney, D. J. (1978). Statistical method in biological assay,

5. Textos gerais
coeficiente de regresso conjunto pooled regression coeficient
curvatura oposta opposite curvature 3a Ed. Griffin, London.
desenho de 5 ponto com zero comum common-zero 5 point design Sokal, R. R. & Rohlf, F. R. (1981). Biometry: Principles and
desvio padro standard deviation Practice of Statistics in Biological Research, 2 Ed. W. H.
desvio padro da mdia standard deviation of the mean Freeman & Co, New York.
ensaio assay
Peace, K. E. (1988). Biopharmaceutical Statistics for Drug
ensaios qualitativos quantal assays Development, Marcel Dekker Inc., New York/Basel.
erro das varincias error variances
erro padro standard error Bowerman, B. L. & OConnell (1990). Linear Statistical
fluxograma flowchart Models an Applied Approach, 2 Ed. PWS-KENT Publishing
limite de confiana confidence interval
Company, Boston.
mdia no ponderada unweighted mean Govindarajulu, Z. (2001). Statistical Techniques in Bioassay,
mdia ponderada weighted mean 2 Ed, Karger, New York.
mdia(s) mean(s)
mtodo das semelhanas mximas maximum likehood method
modelo de linhas paralelas parallel-line model
modelo de relao de declives slope-ratio model
no paralelismo non-parallelism
ordenao array
permutao cross-over
probabilidade iterativa probit
probabilidade iterativa funcional working probit
relao de actividade potency ratio
soma dos quadrados para o erro sum of squares for error
termo de erro error term
termo de erro mdio quadrtico error-mean square term
termo de no-paralelismo non-parallelism term
teste test
transformao probabilstica iterativa probit transformation

(5)Esta sub seco aqui introduzida para facilidade de consulta, pelo leitor da
bibliografia em ingls e compreenso da terminologia adoptada nesta rea pela
Comisso da Farmacopeia Portuguesa, a partir da 6 edio. Em estatstica est
muito consagrada a termino- logia em ingls, e foi nossa inteno proceder
adequao termi- nologia portuguesa, pelo que apresenta aqui um glossrio
de termos com a correspondncia verso inglesa da Farmacopeia Europeia.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 735


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5.4. SOLVENTES
RESIDUAIS
5.4. Solventes residuais.................................................... 739 4. Limites de solventes residuais..................................... 741
Limitao dos teores de solventes residuais nas 4.1. Solventes a evitar.................................................. 741
substncias activas, nos excipientes 4.2. Solventes de utilizao limitada........................... 742
e nos medicamentos................................................... 739 4.3. Solventes com baixo potencial txico.................. 742
Impurezas : nota explicativa relativa aos solventes......... 739 4.4. Solventes para os quais no foram encontrados
1. Introduo.................................................................... 739 dados toxicolgicos adequados............................. 742
2. mbito da presente nota explicativa........................... 740 Glossrio........................................................................... 742
3. Princpios gerais.......................................................... 740 Anexo 1. Lista dos solventes includos nesta
3.1. Classificao dos solventes residuais em funo nota explicativa........................................................... 743

5. Textos gerais
da avaliao do risco............................................. 740 Anexo 2. Informaes complementares........................... 745
3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites A2.1. Regulamentao ambiental para os solventes
de exposio.......................................................... 740 orgnicos volteis....................................................... 745
3.3. Opes que permitem descrever os limites dos A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacuticos... 745
solventes da classe 2............................................. 740 Anexo 3. Mtodos relativos ao estabelecimento
3.4. Procedimentos analticos..................................... 741 de limites de exposio............................................... 745
3.5. Declarao de conformidade dos limites em
solventes residuais................................................ 741

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 737


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5.4. Solventes residuais

5.4. SOLVENTES RESIDUAIS IMPUREZAS: NOTA EXPLICATIVA


RELATIVA AOS SOLVENTES RESIDUAIS
LIMITAO DOS TEORES (CSP/ICH/283/95)
DE SOLVENTES RESIDUAIS 1. INTRODUO
2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA
NAS SUBSTNCIAS ACTIVAS, 3. PRINCPIOS GERAIS
NOS EXCIPIENTES E NOS 3.1. Classificao dos solventes residuais em funo da avaliao
do risco
MEDICAMENTOS 3.2. Mtodos que permitem estabelecer os limites de exposio
3.3. Opes que permitem descrever os limites dos solventes da
classe 2
A Conferncia Internacional para a Harmonizao (ICH) 3.4. Procedimentos analticos
(International Conference on Harmonization of Technical 3.5. Declarao de conformidade dos limites em solventes
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for residuais
Human Use) adoptou um documento intitulado Impurezas: 4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
Nota explicativa relativa aos solventes residuais, que 4.1. Solventes a evitar
prescreve os limites do teor de solventes que podem 4.2. Solventes de utilizao limitada
permanecer nas substncias activas, nos excipientes e nos

5. Textos gerais
4.3. Solventes com baixo potencial txico
medicamentos aps fabrico. Esta nota explicativa, cujo texto 4.4. Solventes para os quais no foram encontrados dados
reproduzido a seguir, exclui os produtos j comercializados. toxicolgicos adequados
Contudo, a Farmacopeia Portuguesa aplica s substncias GLOSSRIO
activas, aos excipientes e aos medicamentos existentes os ANEXO 1. Lista dos solventes includos nesta nota explicativa
princpios enunciados na nota explicativa, tenham estes ANEXO 2. Informaes complementares
sido objecto, ou no, de uma monografia na Farmacopeia. A2.1. Regulamentao ambiental para os solventes
conveniente pesquisar, no conjunto das substncias e orgnicos volteis
produtos, eventuais vestgios de solventes que tenham A2.2. Solventes residuais nos produtos farmacuticos
subsistido aps fabrico. ANEXO 3. Mtodos relativos ao estabelecimento de limites de exposio
Quando os limites a aplicar esto conformes aos a seguir
fornecidos, os ensaios de solventes residuais no so, regra 1. INTRODUO
geral, mencionados nas monografias especficas, uma vez
que os solventes utilizados podem diferir de fabricante para A presente nota explicativa tem por objectivo recomendar as
fabricante e os requisitos deste captulo geral so postos quantidades de solventes residuais admissveis nos produtos de
em prtica pela aplicao da monografia geral Substncias utilizao farmacutica por forma a excluir qualquer risco para a
para uso farmacutico. Por consequncia, a Autoridade sade do paciente. Preconiza a utilizao de solventes de menor
competente deve estar informada dos solventes utilizados toxicidade e descreve, para alguns solventes, as taxas residuais
durante o processo de fabrico. Estas informaes devem consideradas aceitveis sob um ponto de vista toxicolgico.
figurar igualmente no processo apresentado para pedido de
obteno de um certificado de conformidade s monografias Os solventes residuais nos produtos de utilizao farmacutica
da Farmacopeia Portuguesa e so mencionadas no so aqui definidos como produtos qumicos orgnicos volteis
certificado. utilizados ou produzidos no fabrico de substncias activas e
excipientes ou entrando na preparao de medicamentos. Os
Quando se utilizam solventes da classe 3, a substncia pode processos de fabrico correntes no permitem a eliminao
ser submetida a um ensaio de perda por secagem ou pode ser completa dos solventes. A escolha apropriada do solvente para
efectuada uma determinao especfica. Se um solvente da a sntese da substncia activa pode melhorar o rendimento ou
classe 3 apresenta um limite justificado e autorizado superior determinar caractersticas como a forma cristalina, a pureza
a 0,5 por cento, necessrio proceder determinao e a solubilidade. Assim, o solvente pode, por vezes, constituir
especfica desse solvente. um elemento crtico do processo de sntese. A presente nota
explicativa no se refere aos solventes exclusivamente utilizados
Em caso de utilizao de solventes residuais das classes 1 e como excipientes nem aos solvatos. , contudo, conveniente
2 (ou solventes da classe 3 cujo teor seja superior a 0,5 por avaliar e justificar o teor em solventes de tais produtos.
cento), deve ser aplicada, sempre que possvel, a metodologia
descrita no mtodo geral (2.4.24.). Nos restantes casos, deve Sabendo que os solventes residuais no apresentam qualquer
recorrer-se a um mtodo validado apropriado. vantagem teraputica, conveniente elimin-los, sempre
que possvel, para satisfazer s exigncias da qualidade
Quando efectuada a determinao quantitativa de um (especificaes, Boas Prticas de Fabrico de Medicamentos).
solvente residual, esta tida em conta para o clculo do teor Os medicamentos no devem apresentar teores de solventes
da substncia, a no ser que tambm se efectue um ensaio de residuais superiores aos previstos nos dados de segurana.
perda por secagem.
Os solventes da classe 1 (quadro 1), pela elevada toxicidade que
possuem, no devem ser utilizados na fabrico de substncias
activas, de excipientes, ou de medicamentos, a no ser que
se justifique claramente aps uma avaliao risco/benefcio.
Os solventes da classe 2 (quadro 2), cuja toxicidade menor,
devem ter utilizao limitada, tendo em vista a proteco
dos pacientes de reaces adversas. Idealmente, devem ser
utilizados sempre que possvel os solventes da classe 3 (quadro
3), menos txicos. A lista completa dos solventes figura no
Anexo 1 da presente nota explicativa.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 739


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5.4. Solventes residuais

As listas apresentadas neste documento no so exaustivas, Os solventes residuais referidos neste documento esto
podendo outros solventes em uso actualmente vir a ser listados no anexo 1 por nomes e estrutura, e foram avaliados
acrescentados s diferentes listas. Os limites recomendados em funo do risco que apresentam para a sade humana.
para os solventes das classes 1 e 2, ou a classificao dos Subdividem-se em trs classes:
solventes, podem variar em funo do aparecimento de novos Classe 1: Solventes a evitar.
dados de segurana. Os dados de segurana que permitem
suportar o pedido de colocao no mercado de um novo Carcinognios humanos conhecidos ou fortemente
medicamento, contendo um novo solvente, podem inspirar- suspeitos, perigosos para o ambiente.
-se nas informaes apresentadas neste documento ou nas Classe 2: Solventes cuja utilizao est submetida a
Guideline ICH-Q3A (Impurezas nas novas substncias limitaes.
activas) Guideline ICH-Q3B (Impurezas nos novos
medicamentos), ou, ainda, no conjunto dos trs documentos. Carcinognios animais no genotxicos ou
eventuais agentes causadores de outros efeitos
txicos irreversveis como a neurotoxicidade ou a
2. MBITO DA PRESENTE NOTA EXPLICATIVA teratogenicidade.
Solventes suspeitos de estarem na origem de outros
Esta nota faz o inventrio dos solventes residuais presentes efeitos txicos importantes mas reversveis.
nas substncias activas, nos excipientes e nos medicamentos.
Por consequncia, deve ser realizado um ensaio dos Solventes Classe 3: Solventes com baixo potencial txico.
5. Textos gerais

residuais sempre que os processos de fabrico ou de purificao Solventes com baixo potencial txico para o homem
decorrem na presena de tais solventes. A pesquisa incidir no sendo exigido qualquer limite em relao
apenas sobre os solventes utilizados ou produzidos durante o exposio. Os solventes da classe 3 apresentam
processo de fabrico ou na purificao das substncias activas, valores de EDA iguais ou superiores a 50 mg.
dos excipientes ou dos medicamentos. Mesmo que os fabricantes
possam escolher efectuar a determinao sobre o medicamento,
possvel utilizar um mtodo cumulativo que permite calcular 3.2. MTODOS QUE PERMITEM ESTABELECER OS
os teores de solventes residuais no medicamento a partir dos LIMITES DE EXPOSIO
teores existentes nos diferentes elementos constitutivos. Se este
clculo der um resultado inferior ou igual ao nvel de solvente O mtodo utilizado para estabelecer os valores de EDA aos
indicado nesta nota explicativa, a determinao dos solventes solventes residuais est apresentado no Anexo 3. Os resumos
residuais no medicamento no exigida. Pelo contrrio, se o dos dados de toxicidade que serviram para estabelecer estes
teor de solventes residuais for superior ao nvel recomendado, o valores esto publicados em Pharmeuropa, Vol. 9, n 1,
ensaio deve ser efectuado no medicamento para assegurar que suplemento do ms de Abril de 1997.
o teor de solventes residuais foi conduzido a valores admissveis
durante a formulao. Os medicamentos devem igualmente ser
submetidos a este ensaio sempre que um solvente for utilizado 3.3. OPES QUE PERMITEM DESCREVER OS LIMITES
durante o fabrico. DOS SOLVENTES DA CLASSE 2

A presente nota explicativa no se aplica s novas substncias Duas opes permitem fixar os limites que se aplicam aos
activas, excipientes ou medicamentos potenciais utilizados solventes da classe 2.
nos estdios de desenvolvimento de pesquisa clnica, nem aos
medicamentos j comercializados. Opo 1: Podem ser utilizados os limites de concentrao
A presente nota explicativa aplica-se a todas as formas (em ppm) indicados no quadro 2. Estes limites foram
farmacuticas e a todas as vias de administrao. Teores determinados com ajuda da expresso (1) a seguir
elevados de solventes residuais so admissveis em certos apresentada e tomam como referncia uma dose de 10 g
casos, por exemplo em tratamentos de curta durao (30 dias administrada quotidianamente.
ou menos) ou em aplicaes tpicas. Estes teores devem ser
objecto de uma justificao caso a caso.
Para complementar as informaes relativas aos solventes
residuais ver o anexo 2. Neste caso o valor da EDA indicado em mg/dia e a dose em g/dia.
Estes limites so considerados aceitveis para todas as substncias,
excipientes ou medicamentos. Em consequncia, esta opo pode
3. PRINCPIOS GERAIS ser aplicada quando a dose diria desconhecida ou varivel.
Se o conjunto dos excipientes e das substncias activas de uma
3.1. CLASSIFICAO DOS SOLVENTES RESIDUAIS EM formulao satisfizerem aos limites da opo 1 estes componentes
FUNO DA AVALIAO DO RISCO podem ser utilizados em quaisquer propores. No necessrio
qualquer outro clculo desde que a dose diria no ultrapasse
O International Program on Chemical Safety (IPCS) utiliza 10 g. Os medicamentos administrados em doses superiores a 10 g
a expresso dose diria tolervel (DDT) (em ingls TDI = por dia devem ser considerados na opo 2.
tolerable daily intake) para descrever os limites de exposio
aos produtos qumicos txicos. Para este mesmo conceito, Opo 2: No se considera necessrio que cada componente do
a OMS e outras autoridades ou institutos (nacionais ou medicamento satisfaa aos limites indicados na opo 1. O valor
internacionais) de sade pblica utilizam a expresso dose da EDA, expresso em mg/dia, tal como se mostra no quadro
diria admissvel (DDA) (em ingls ADI = acceptable 2, pode ser utilizado com a dose diria mxima conhecida
daily intake). A exposio diria admissvel (EDA) (em e a equao (1), atrs apresentada, pode ser usada para
ingls PDE = Permitted daily exposure) a nova expresso determinar a concentrao de solvente residual autorizada num
consagrada para o presente documento, a qual permite evitar medicamento. Tais limites so considerados aceitveis se ficar
qualquer confuso entre os diferentes valores de DDA para demonstrado que a presena de solvente residual foi reduzida
uma mesma substncia. ao mnimo possvel. Os limites devem ser realistas em relao

740 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.4. Solventes residuais

preciso analtica, capabilidade no decurso do fabrico e a uma particular. Em presena de solventes exclusivamente da classe 3,
variao razovel no processo de fabrico. Em suma, os limites pode utilizar-se um mtodo no especfico, como por exemplo
devem reflectir os padres de fabrico actuais. a perda por secagem. A validao dos mtodos de determinao
dos nveis de solventes residuais deve obedecer s normas
possvel utilizar a opo 2 adicionando as quantidades de ICH seguintes: Text of Analytical Procedures e Extension on
solventes residuais presentes em cada um dos componentes do Validation of Analytical Procedures.
medicamento. A soma das quantidades de solventes admissveis
por dia deve ser inferior indicada pelo valor de EDA.
A ttulo de exemplo, consideremos a aplicao das opes 1 e 2 3.5. DECLARAO DE CONFORMIDADE DOS LIMITES EM
ao acetonitrilo contido num medicamento. A exposio diria SOLVENTES RESIDUAIS
admissvel ao acetonitrilo de 4,1 mg/dia, por consequncia
o limite preconizado pela opo 1 de 410 ppm. A quantidade A fim de respeitar os critrios descritos nesta nota explicativa,
mxima de medicamento administrada por dia de 5,0 g e os fabricantes de produtos farmacuticos necessitam de
este medicamento contm dois excipientes. A composio informaes sobre os teores de solventes residuais contidos nos
do medicamento e o clculo do teor mximo em acetonitrilo excipientes e substncias activas. As seguintes afirmaes so
residual esto apresentados no quadro seguinte: dadas como exemplos aceitveis da informao que deve ser
facultada pelos fornecedores de excipientes ou de substncias
Quantidade na Teor em Exposio activas aos fabricantes de produtos farmacuticos. Conforme o
Componente
Formulao acetonitrilo diria caso, o fornecedor deve escolher uma das seguintes:

5. Textos gerais
Substncia activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg provavelmente s esto presentes solventes da classe 3. A
Excipiente 1 0,9 g 400 ppm 0,36 mg perda por secagem inferior a 0,5 por cento,
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg provavelmente s esto presentes os solventes X, Y, da
Medicamento 5,0 g 728 ppm 3,64 mg classe 2. Todos se encontram abaixo dos limites preconizados
na opo 1. (Neste caso o fornecedor deve indicar o nome dos
O excipiente 1 satisfaz ao limite imposto pela opo 1, mas solventes da classe 2 representados por X, Y, ),
a substncia activa, o excipiente 2 e o medicamento no
correspondem s exigncias deste limite. No entanto, o provavelmente s esto presentes os solventes X, Y,
medicamento satisfaz ao limite da opo 2 (4,1 mg por dia) e, da classe 2 e solventes da classe 3. Os teores de solventes
consequentemente, s recomendaes desta nota explicativa. residuais da classe 2 encontram-se abaixo dos limites
preconizados na opo 1 e os teores dos solventes residuais
Consideremos um segundo exemplo de acetonitrilo residual. da classe 3 so inferiores a 0,5 por cento.
A quantidade mxima de um medicamento administrada
diariamente de 5,0 g e este medicamento contm dois Se solventes da classe 1 estiverem provavelmente presentes,
excipientes. devem ser identificados e quantificados. Provavelmente
presente refere-se simultaneamente ao solvente utilizado no
A composio do medicamento e o clculo do teor de passo final do fabrico e aos solventes que so usados no decurso
acetonitrilo residual esto indicadas no quadro seguinte: das etapas precedentes do fabrico e que no so removidos
sistematicamente recorrendo a um processo validado.
Quantidade na Teor em Exposio
Componente Se solventes da classe 2 ou classe 3 estiverem presentes em
Formulao acetonitrilo diria
Substncia activa 0,3 g 800 ppm 0,24 mg quantidade, respectivamente, superior ao limite da opo 1 ou
superior a 0,5 por cento, devem ser identificados e quantificados.
Excipiente 1 0,9 g 2000 ppm 1,80 mg
Excipiente 2 3,8 g 800 ppm 3,04 mg
4. LIMITES DE SOLVENTES RESIDUAIS
Medicamento 5,0 g 1016 ppm 5,08 mg

Neste caso, acontece que pela soma dos teores de cada 4.1. SOLVENTES A EVITAR
constituinte, o medicamento no respeita nem o limite da
opo 1, nem o da opo 2. O fabricante pode ento analisar Os solventes da classe 1 no devem ser utilizados no fabrico
o medicamento com vista a saber se o processo de fabrico de substncias activas, excipientes e medicamentos devido
permitiu reduzir o teor de acetonitrilo. Se o teor de acetonitrilo sua toxicidade inaceitvel ou ao seu efeito nocivo no ambiente.
no foi reduzido para o limite autorizado durante a formulao, Contudo, se a utilizao destes solventes for incontornvel para
o fabricante deve tomar outras medidas para reduzir a a produo de um medicamento que corresponda a um avano
quantidade de acetonitrilo no medicamento. Se todos estes teraputico importante, os seus teores no devem ultrapassar
procedimentos no permitirem a reduo do teor de solvente os valores apresentados no quadro 1, salvo excepo justificada.
residual, o fabricante pode, a ttulo excepcional, relatar as
O 1,1,1-tricloroetano est includo no quadro 1 devido ao seu
medidas tomadas para reduzir o teor de solvente para o limite
efeito nocivo sobre o ambiente. O limite assinalado de 1500
preconizado e apresentar uma anlise avaliadora dos riscos e dos
ppm est fundamentado na avaliao dos dados de segurana.
benefcios que justifiquem a utilizao do medicamento com um
teor de solvente residual superior ao limite autorizado. QUADRO 1 Solventes da classe 1 em produtos farmacuticos
(solventes que devem ser evitados)

3.4. PROCEDIMENTOS ANALTICOS Solvente


Concentrao
Nocividade
limite (ppm)
Os teores de solventes residuais so habitualmente Benzeno 2 Carcinognico
determinados por tcnicas cromatogrficas, como, por exemplo, Tetracloreto de carbono 4 Txico e nocivo
a cromatografia em fase gasosa. Para determinar os teores de para o ambiente
solventes residuais conveniente aplicar, na medida do possvel, 1,2-Dicloroetano 5 Txico
os procedimentos harmonizados descritos nas farmacopeias. 1,1-Dicloroetano 8 Txico
Em caso de impossibilidade, os fabricantes podem escolher um
1,1,1-Tricloroetano 1500 Nocivo para o ambiente
procedimento analtico validado e apropriado a uma aplicao

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 741


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5.4. Solventes residuais

4.2. SOLVENTES DE UTILIZAO LIMITADA QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas
BPF ou outros requisitos de qualidade (continuao)
Os solventes apresentados no quadro 2 devem estar limitados
nos produtos farmacuticos, devido sua toxicidade intrnseca. Acetato de isopropilo Etilmetilcetona
Os valores das EDA so apresentados com a aproximao Acetato de metilo Formato de etilo
de 0,1 mg/dia e as concentraes so apresentadas com a Acetato de propilo Heptano
aproximao de 10 ppm. Os valores apresentados no reflectem Acetona Isobutilmetilcetona
necessariamente a preciso analtica da determinao. A preciso cido actico 3-Metil-l-butanol
deve ser calculada e fazer parte da validao do mtodo. cido frmico 2-Metil-l-propanol
QUADRO 2 Solventes da classe 2 em produtos farmacuticos Anisol Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
Solvente EDA (mg/dia) Concentrao limite (ppm) 2-Butanol 1-Propanol
Acetonitrilo 4,1 410 Cumeno 2-Propanol
Ciclo-hexano 38,8 3880 Dimetilsulfxido
Clorobenzeno 3,6 360
Clorofrmio 0,6 60
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870 4.4. SOLVENTES PARA OS QUAIS NO FORAM
Diclorometano 6,0 600 ENCONTRADOS DADOS TOXICOLGICOS ADEQUADOS
5. Textos gerais

N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090


Os solventes seguintes (quadro 4) podem tambm ter
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
interesse para os fabricantes de excipientes, de substncias
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
activas ou de medicamentos. Contudo, no foram ainda
1,4-Dioxano 3,8 380
encontrados dados toxicolgicos adequados que permitam
Etilenoglicol 6,2 620
determinar uma EDA. Os fabricantes devem fornecer uma
2-Etoxietanol 1,6 160
justificao relativa aos nveis residuais destes solventes nos
Formamida 2,2 220
produtos farmacuticos.
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000 QUADRO 4 Solventes para os quais no foram encontrados dados
Metilbutilcetona 0,5 50 toxicolgicos adequados
Metilciclo-hexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530 cido tricloractico ter de petrleo
2-Metoxietanol 0,5 50 cido trifluoractico ter isoproplico
Nitrometano 0,5 50 1,1-Dietoxipropano Isoctano
Piridina 2,0 200 1,1-Dimetoxietano Isopropilmetilcetona
Sulfolano 1,6 160 2,2-Dimetoxipropano Metiltetra-hidrofurano
Tetra-hidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890 GLOSSRIO
1,1,2-Tricloroetano 0,8 80
Carcinognios genotxicos: Carcinognios que produzem
Xileno* 21,7 2170
cancro por afectarem genes ou cromossomas.
* Habitualmente 60 por cento de m-xileno, 14 por cento de p-xileno, 9 por
LOEL: Abreviatura de lowest-observed effect level.
cento de o-xileno com 17 por cento de etilbenzeno.
Lowest-observed effect level: A menor dose de substncia
que, num estudo ou grupo de estudos, produz aumentos
4.3. SOLVENTES COM BAIXO POTENCIAL TXICO
biologicamente significativos na frequncia ou gravidade de
qualquer efeito nos animais ou humanos expostos.
Os solventes da classe 3 (apresentados no quadro 3) podem
ser considerados como os de menor toxicidade e de menor Factor de modificao: Um factor determinado por um
risco para a sade humana. A classe 3 no inclui qualquer toxicologista profissional e aplicado aos resultados de um
solvente que se saiba ser nocivo para a sade humana bioensaio para obter a relao com os dados humanos nas
nos limites autorizados para os produtos farmacuticos. condies de segurana satisfatrias.
Contudo, no existem estudos de toxicidade a longo
prazo nem estudos de carcinogenicidade para muitos dos Neurotoxicidade: A capacidade de uma substncia para
solventes da classe 3. Os dados disponveis indicam que eles provocar efeitos indesejveis sobre o sistema nervoso.
apresentam baixa toxicidade em estudos de toxicidade aguda
NOEL: Abreviao de no-observed-effect level
ou de curta durao e resultados negativos nos estudos
de genotoxicidade. O limite admissvel, sem justificao No-observed-effect level: A dose mais elevada de substncia
particular, para os solventes desta classe inferior ou igual para a qual no se verificam aumentos biologicamente
a 50 mg/dia (correspondendo a 5000 ppm ou a 0,5 por cento significativos da frequncia ou da gravidade de qualquer
de acordo com a opo 1). Quantidades superiores referida efeito no homem ou nos animais expostos.
podem tambm ser aceites desde que sejam realistas em
relao capabilidade de fabrico e s boas prticas de fabrico. EDA: Abreviatura de exposio diria admissvel (em ingls
PDE = permitted daily exposure).
QUADRO 3 Solventes da classe 3 que devem ser limitados pelas
BPF ou outros requisitos de qualidade Exposio diria admissvel: a dose mxima diria de
solvente residual admitida num produto farmacutico.
Acetato de butilo Etanol
Toxicidade reversvel: Ocorrncia de efeitos nocivos causados
Acetato de etilo ter etlico
por uma substncia e que desaparecem uma vez que cesse a
Acetato de isobutilo terc-butilmetilter
exposio substncia.

742 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.4. Solventes residuais

Carcinognio humano fortemente suspeito: Uma substncia Teratogenicidade: Aparecimento de malformaes


para a qual as provas epidemiolgicas de carcinognese no estruturais no decurso do desenvolvimento fetal quando se
puderam ser estabelecidas, ainda que existam dados genotxicos administra uma substncia durante a gravidez.
positivos e provas evidentes de carcinognese em roedores.

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 743


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5.4. Solventes residuais


5. Textos gerais

744 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.4. Solventes residuais

ANEXO 2. INFORMAES COMPLEMENTARES J. Environ. Pathology, 4,305,1980), est apropriado para os


solventes carcinognicos da classe 1. No estabelecimento de
A2.1. REGULAMENTAO AMBIENTAL PARA OS
limites de exposio, apenas os dados de carcinogenicidade
SOLVENTES ORGNICOS VOLTEIS
fiveis podem justificar uma extrapolao por aplicao
Um certo nmero de solventes residuais, correntemente de modelos matemticos. Os limites de exposio dos
utilizados no fabrico de produtos farmacuticos, considerado solventes da classe 1 podem ser determinados combinando
como substncias txicas nas monografias EHC (Environmental factores de segurana elevados (ex. 10 000 a 1000 000) e
Health Criteria) relativas aos critrios de sade e de ambiente os dados de no-observed-effect level (NOEL). A deteco e
e no sistema IRIS (Integrated Risk Information System). Faz quantificao destes solventes deve responder aos ltimos
parte dos objectivos dos organismos como o International desenvolvimentos em matria de tcnicas analticas.
Programme on Chemical Safety (IPCS), o United States
Environmental Protection Agency (USEPA) e o United States Os teores de exposio aceitveis apresentados nesta nota
Food and Drug Administration (USFDA), a determinao dos explicativa para os solventes da classe 2 foram estabelecidos
teores de exposio admissveis. O objectivo desta determinao aps calcular os valores de EDA, de acordo com os
proteger a sade pblica e preservar o ambiente contra procedimentos que permitem estabelecer os limites aplicveis
os eventuais efeitos nocivos resultantes de uma exposio aos produtos farmacuticos (Pharmacopeia Forum, Nov-Dez
prolongada a estas substncias. Os mtodos utilizados para a 1989) e o mtodo adoptado pela IPCS para avaliao do risco
avaliao dos limites mximos de exposio sem causar efeitos apresentado pelas substncias qumicas (Assessing Human

5. Textos gerais
nocivos assentam geralmente em estudos conduzidos a longo Health Risk of Chemicals-Environmental Health Criteria
prazo. Se no se dispuser de resultados de estudos a longo 170, WHO, Geneve, 1994). Estes mtodos so semelhantes
prazo, podem utilizar-se os resultados obtidos em estudos aos utilizados pela EPA (RIS), FDA (Red Book) e por outros
de curto prazo, com a condio de certos parmetros serem organismos. O mtodo aqui apresentado para permitir uma
modificados (por exemplo, a utilizao de factores de segurana melhor compreenso da origem dos valores de EDA. No
mais elevados). A contribuio aqui descrita baseia-se numa necessrio efectuar estes clculos para utilizar os valores de
exposio a longo prazo ou exposio durante o tempo de vida EDA indicados no ponto 4 do presente documento. A EDA
da populao no seu meio ambiente, ou seja, ao ar ambiente, calculada a partir do no-observed-effect level (NOEL), ou
alimentao, gua potvel e a outros meios. ainda do lowest-observed-effect level (LOEL), obtidos no
estudo mais relevante realizado com animais, com a ajuda da
expresso:
A2.2. SOLVENTES RESIDUAIS NOS PRODUTOS
FARMACUTICOS

Os limites de exposio contidos nesta nota explicativa


so definidos a partir de mtodos e dados de toxicidade Preferencialmente a EDA deve ser derivada do NOEL. Se
apresentados nas monografias ECH e IRIS. Contudo, ao o NOEL no puder ser obtido, deve utilizar-se o LOEL. Os
estabelecer estes limites, deve ter-se em conta alguns factores de modificao aqui propostos, que permitem aplicar
postulados relativos aos resduos dos solventes utilizados na aos seres humanos os dados obtidos, assemelham-se aos
sntese e no fabrico de produtos farmacuticos. Os postulados factores de incerteza utilizados nas EHC (Environmental
so os seguintes: Health Criteria 170, WHO, Geneve, 1994), e aos factores
de modificao aos factores de segurana mencionados
1) Apenas os pacientes (e no a populao em geral) utilizam no Pharmacopeial Forum. A hiptese de uma exposio
produtos farmacuticos com o objectivo de se tratarem ou sistmica de 100% utilizada em todos as clculos, sem
prevenir as infeces e doenas. distino das diferentes vias de administrao.
2) Para a maior parte dos produtos farmacuticos, o Os factores de modificao so as seguintes:
princpio de uma exposio durante toda a vida no
necessria, mas pode servir de hiptese de trabalho com F1 = um factor que permite a extrapolao entre as espcies:
vista reduo de riscos para a sade. F1 = 2 para extrapolar do co para o homem
3) Os solventes residuais entram inevitavelmente na F1 = 2,5 para extrapolar do coelho para a homem
fabricao dos produtos farmacuticos e fazem
F1 = 3 para extrapolar da macaco para a homem
frequentemente parte integrante dos medicamentos.
F1 = 5 para extrapolar da rato para a homem
4) Excepo feita para casos muito particulares, o teor
em solventes residuais no deve ultrapassar os limites F1 = 10 para extrapolar dos outros animais para o homem
prescritos.
F1 = 12 para extrapolar do ratinho para o homem.
5) Os resultados dos estudos toxicolgicos utilizados para
determinar os teores aceitveis de solventes residuais F1 permite ter em conta as relaes comparativas superfcie/
devem ter origem em protocolos experimentais /massa corporal para as espcies em questo e para o homem.
apropriados, tais como os descritos pela OCDE e pelo A superfcie (S) calculada com ajuda da expresso seguinte:
Red Book da FDA.
S = k M0,67 (2)
em que M corresponde massa corporal e k uma constante
ANEXO 3. MTODOS RELATIVOS AO ESTABELECIMENTO
cujo valor est fixado em 10. As massas corporais utilizadas
DE LIMITES DE EXPOSIO
na equao esto no quadro A3.1, apresentado mais frente.
O mtodo de Gaylor-Kodell, relativo avaliao do risco F2 = 10 e representa o factor que tem em conta a
(Gaylor, D. W. and Kodell, R. L.: Linear Interpolation variabilidade entre os indivduos. Em regra, um factor
algorithm for low dose assessmerzt of toxic substance, de 10 est indicado para o conjunto dos solventes

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 745


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.4 SOLVENTES RESIDUAIS (NDICE)

5.4. Solventes residuais

orgnicos. Este valor aplicado sistematicamente na Para ilustrar a aplicao desta equao, tomemos, a ttulo
presente nota. de exemplo, um estudo de toxicidade do acetonitrilo no
rato, que apresentado no suplemento de Abril de 1997 de
F3 = um factor varivel que corresponde aos estudos de Pharmeuropa, vol. 9, n 1, pgina S24 (verso inglesa). O
toxicidade relativos a uma exposio a curto prazo: valor de NOEL estimado 50,7 mg kg1 dia1. Neste caso
F3 = 1, para os estudos cuja durao corresponde, pelo concreto, o valor da EDA calculado como se segue:
menos, a um tempo de semi-vida (1 ano para os EDA = 50,7 mg kg1 dia1 50 kg/12 10 5 1 1
roedores ou coelhos; 7 anos para os gatos, ces e
macacos) EDA = 4,22 mg dia1
F3 = 1, para os estudos relativos reproduo, no Neste exemplo,
decurso dos quais est coberto todo o perodo da F1 = 12, para ter em conta a extrapolao do rato para o
organognese homem
F3 = 2, para um estudo de 6 meses com roedores ou de F2 = 10, para ter em conta as diferenas entre os indivduos
3,5 anos com no roedores
F3 = 5, uma vez que a durao do estudo est limitada a
F3 = 5, para um estudo de 3 meses com roedores ou de apenas 13 semanas
2 anos com no roedores
F4 = 1, porque no se verifica qualquer toxicidade grave
5. Textos gerais

F3 = 10, para os estudos de curta durao.


F5 = 1, porque foi determinada a dose no efectiva
Quando os estudos tm uma durao que se situa entre o
incio e o fim de perodos acima determinados, utiliza-se o QUADRO A3.1 Valores utilizados para os clculos apresentados
factor mais elevado, por exemplo, um factor de 2 para um neste documento
estudo de 9 meses com roedores.
Massa corporal do rato 425 g
F4 = um factor que pode ser utilizado em todos os casos Massa corporal de uma rata em gestao 330 g
de toxicidade elevada, por exemplo carcinogenicidade Massa corporal do ratinho 28 g
no genotxica, neurotoxicidade ou teratogenicidade. Massa corporal de uma ratinha em gestao 30 g
Nos estudos de toxicidade ligada reproduo devem Massa corporal do cobaio 500 g
utilizar-se os factores indicados a seguir: Massa corporal do macaco Rhesus 2,5 kg
Massa corporal do coelho (em gestao ou no) 4 kg
F4 = 1, para a toxicidade associada ao feto ou me
Massa corporal do co beagle 11,5 kg
F4 = 5, para a toxicidade associada ao feto sem a me Volume respiratrio do rato 290 1/dia
Volume respiratrio do ratinho 43 1/dia
F4 = 5, para um efeito teratognico com efeito txico
Volume respiratrio do coelho 1440 1/dia
para a me
Volume respiratrio do cobaia 430 1/dia
F4 = 10, para um efeito teratognico sem efeito txico Volume respiratrio do homem 28800 1/dia
para a me. Volume respiratrio do co 9000 1/dia
Volume respiratrio do macaco 1150 1/dia
F5 = um factor varivel que pode ser utilizado se a dose no Consumo de gua do ratinho 5 ml/dia
efectiva no foi estabelecida. Consumo de gua do rato 30 ml/dia
Quando apenas se conhece o valor LOEL, pode utilizar-se um Consumo alimentar do rato 30 g/dia
factor que pode ir at 10, em funo do grau de toxicidade.
No que se refere s concentraes de gs utilizadas nos
O ajustamento do peso efectuado assumindo o valor estudos de inalao, a equao dos gases perfeitos,
arbitrrio de 50 Kg para a massa corporal de um adulto do PV = nRT, permite converter ppm em mg/l ou mg/m3.
sexo masculino ou feminino. Este valor, relativamente baixo, A ttulo de exemplo, o estudo de toxicidade reprodutiva
oferece uma margem de segurana acrescida em relao ao do rato por inalao de tetracloreto de carbono (massa
peso padro, 60 ou 70 kg, frequentemente utilizado neste tipo molecular 153,84) apresentado no Suplemento de Abril
de clculo. Para os adultos com menos de 50 kg, considera- de 1997 de Pharmaeuropa, vol. 9, n 1, pgina S9.
se que esto protegidos pela acumulao dos factores de
n/V = P/RT = 300 106 atm 153840 mg mol1/0,082 atm
segurana utilizados na determinao da EDA. Se o solvente K1 mol1 298K = 46,15 mg/24,45 l = 1,89 mg/l
estiver presente num medicamento exclusivamente para uso
peditrico, deve proceder-se correco do peso, ajustando-o Foi utilizada a correspondncia 1000 l = 1 m3, para converter
para o valor inferior adequado. o resultado em mg/m3.

746 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.5. TABELAS
ALCOOMTRICAS
5.5. Tabelas alcoomtricas 749

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 747


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

5.5. TABELAS ALCOOMTRICAS % V/V % m/m 20 (kg/m3)


5,3 4,22 990,65
A frmula geral fixada pelo Conselho das Comunidades 5,4 4,30 990,52
Europeias nas suas Directivas de 27 de Julho de 1976 sobre 5,5 4,38 990,39
a alcoometria serviu de base para estabelecer as tabelas 5,6 4,46 990,26
seguintes. 5,7 4,54 990,12
5,8 4,62 990,99
% V/V % m/m 20 (kg/m3) 5,9 4,70 989,86
0,0 0,0 998,20
0,1 0,08 998,05 6,0 4,78 989,73
0,2 0,16 997,90 6,1 4,86 989,60
0,3 0,24 997,75 6,2 4,95 989,47
0,4 0,32 997,59 6,3 5,03 989,34
6,4 5,11 989,21
0,5 0,40 997,44
6,5 5,19 989,08
0,6 0,47 997,29
6,6 5,27 988,95
0,7 0,55 997,14
6,7 5,35 988,82
0,8 0,63 996,99
6,8 5,43 988,69

5. Textos gerais
0,9 0,71 996,85
6,9 5,51 988,56

1,0 0,79 996,70


7,0 5,59 988,43
1,1 0,87 996,55
7,1 5,67 988,30
1,2 0,95 996,40
7,2 5,75 988,18
1,3 1,03 996,25
7,3 5,83 988,05
1,4 1,11 996,11
7,4 5,91 987,92
1,5 1,19 995,96
7,5 5,99 987,79
1,6 1,27 995,81
7,6 6,07 987,67
1,7 1,35 995,67
7,7 6,15 987,54
1,8 1,43 995,52
7,8 6,23 987,42
1,9 1,51 995,38
7,9 6,32 987,29

2,0 1,59 995,23


8,0 6,40 987,16
2,1 1,67 995,09
8,1 6,48 987,04
2,2 1,75 994,94
8,2 6,56 986,91
2,3 1,82 994,80
8,3 6,64 986,79
2,4 1,90 994,66
8,4 6,72 986,66
2,5 1,98 994,51
8,5 6,80 986,54
2,6 2,06 994,37
8,6 6,88 986,42
2,7 2,14 994,23
8,7 6,96 986,29
2,8 2,22 994,09
8,8 7,04 986,17
2,9 2,30 993,95
8,9 7,12 986,05

3,0 2,38 993,81


9,0 7,20 985,92
3,1 2,46 993,66
9,1 7,29 985,80
3,2 2,54 993,52
9,2 7,37 985,68
3,3 2,62 993,38
9,3 7,45 985,56
3,4 2,70 993,24
9,4 7,53 985,44
3,5 2,78 993,11
9,5 7,61 985,31
3,6 2,86 992,97
9,6 7,69 985,19
3,7 2,94 992,83
9,7 7,77 985,07
3,8 3,02 992,69
9,8 7,85 984,95
3,9 3,10 992,55
9,9 7,93 984,83

4,0 3,18 992,41


10,0 8,01 984,71
4,1 3,26 992,28
10,1 8,10 984,59
4,2 3,34 992,14
10,2 8,18 984,47
4,3 3,42 992,00
10,3 8,26 984,35
4,4 3,50 991,87
10,4 8,34 984,23
4,5 3,58 991,73
10,5 8,42 984,11
4,6 3,66 991,59
10,6 8,50 983,99
4,7 3,74 991,46
10,7 8,58 983,88
4,8 3,82 991,32
10,8 8,66 983,76
4,9 3,90 991,19
10,9 8,75 983,64

5,0 3,98 991,06


11,0 8,83 983,52
5,1 4,06 990,92
11,1 8,91 983,40
5,2 4,14 990,79
11,2 8,99 983,29

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 749


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

11,3 9,07 983,17 17,3 13,98 976,46


11,4 9,15 983,05 17,4 14,07 976,35
11,5 9,23 982,94 17,5 14,15 976,25
11,6 9,32 982,82 17,6 14,23 976,14
11,7 9,40 982,70 17,7 14,31 976,03
11,8 9,48 982,59 17,8 14,40 975,92
11,9 9,56 982,47 17,9 14,48 975,81

12,0 9,64 982,35 18,0 14,56 975,71


12,1 9,72 982,24 18,1 14,64 975,60
12,2 9,80 982,12 18,2 14,73 975,49
12,3 9,89 982,01 18,3 14,81 975,38
12,4 9,97 981,89 18,4 14,89 975,28
12,5 10,05 981,78 18,5 14,97 975,17
12,6 10,13 981,67 18,6 15,06 975,06
12,7 10,21 981,55 18,7 15,14 974,95
5. Textos gerais

12,8 10,29 981,44 18,8 15,22 974,85


12,9 10,37 981,32 18,9 15,30 974,74

13,0 10,46 981,21 19,0 15,39 974,63


13,1 10,54 981,10 19,1 15,47 974,52
13,2 10,62 980,98 19,2 15,55 974,42
13,3 10,70 980,87 19,3 15,63 974,31
13,4 10,78 980,76 19,4 15,72 974,20
13,5 10,87 980,64 19,5 15,80 974,09
13,6 10,95 980,53 19,6 15,88 973,99
13,7 11,03 980,42 19,7 15,97 973,88
13,8 11,11 980,31 19,8 16,05 973,77
13,9 11,19 980,19 19,9 16,13 973,66

14,0 11,27 980,08 20,0 16,21 973,56


14,1 11,36 979,97 20,1 16,30 973,45
14,2 11,44 979,86 20,2 16,38 973,34
14,3 11,52 979,75 20,3 16,46 973,24
14,4 11,60 979,64 20,4 16,55 973,13
14,5 11,68 979,52 20,5 16,63 973,02
14,6 11,77 979,41 20,6 16,71 972,91
14,7 11,85 979,30 20,7 16,79 972,80
14,8 11,93 979,19 20,8 16,88 972,70
14,9 12,01 979,08 20,9 16,96 972,59

15,0 12,09 978,97 21,0 17,04 972,48


15,1 12,17 978,86 21,1 17,13 972,37
15,2 12,26 978,75 21,2 17,21 972,27
15,3 12,34 978,64 21,3 17,29 972,16
15,4 12,42 978,53 21,4 17,38 972,05
15,5 12,50 978,42 21,5 17,46 971,94
15,6 12,59 978,31 21,6 17,54 971,83
15,7 12,67 978,20 21,7 17,62 971,73
15,8 12,75 978,09 21,8 17,71 971,62
15,9 12,83 977,98 21,9 17,79 971,51

16,0 12,91 977,87 22,0 17,87 971,40


16,1 13,00 977,76 22,1 17,96 971,29
16,2 13,08 977,65 22,2 18,04 971,18
16,3 13,16 977,55 22,3 18,12 971,08
16,4 13,24 977,44 22,4 18,21 970,97
16,5 13,32 977,33 22,5 18,29 970,86
16,6 13,41 977,22 22,6 18,37 970,75
16,7 13,49 977,11 22,7 18,46 970,64
16,8 13,57 977,00 22,8 18,54 970,53
16,9 13,65 976,89 22,9 18,62 970,42

17,0 13,74 976,79 23,0 18,71 970,31


17,1 13,82 976,68 23,1 18,79 970,20
17,2 13,90 976,57 23,2 18,87 970,09

750 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

23,3 18,96 969,98 29,3 24,01 963,07


23,4 19,04 969,87 29,4 24,10 962,95
23,5 19,13 969,76 29,5 24,18 962,83
23,6 19,21 969,65 29,6 24,27 962,71
23,7 19,29 969,54 29,7 24,35 962,58
23,8 19,38 969,43 29,8 24,44 962,46
23,9 19,46 969,32 29,9 24,52 962,33

24,0 19,54 969,21 30,0 24,61 962,21


24,1 19,63 969,10 30,l 24,69 962,09
24,2 19,71 968,99 30,2 24,78 961,96
24,3 19,79 968,88 30,3 24,86 961,84
24,4 19,88 968,77 30,4 24,95 961,71
24,5 19,96 968,66 30,5 25,03 961,59
24,6 20,05 968,55 30,6 25,12 961,46
24,7 20,13 968,43 30,7 25,20 961,33

5. Textos gerais
24,8 20,21 968,32 30,8 25,29 961,21
24,9 20,30 968,21 30,9 25,38 961,08

25,0 20,38 968,10 31,0 25,46 960,95


25,1 20,47 967,99 31,1 25,55 960,82
25,2 20,55 967,87 31,2 25,63 960,70
25,3 20,63 967,76 31,3 25,72 960,57
25,4 20,72 967,65 31,4 25,80 960,44
25,5 20,80 967,53 31,5 25,89 960,31
25,6 20,88 967,42 31,6 25,97 960,18
25,7 20,97 967,31 31,7 26,06 960,05
25,8 21,05 967,19 31,8 26,15 959,92
25,9 21,14 967,08 31,9 26,23 959,79

26,0 21,22 966,97 32,0 26,32 959,66


26,1 21,31 966,85 32,1 26,40 959,53
26,2 21,39 966,74 32,2 26,49 959,40
26,3 21,47 966,62 32,3 26,57 959,27
26,4 21,56 966,51 32,4 26,66 959,14
26,5 21,64 966,39 32,5 26,75 959,01
26,6 21,73 966,28 32,6 26,83 958,87
26,7 21,81 966,16 32,7 26,92 958,74
26,8 21,90 966,05 32,8 27,00 958,61
26,9 21,98 965,93 32,9 27,09 958,47

27,0 22,06 965,81 33,0 27,18 958,34


27,1 22,15 965,70 33,1 27,26 958,20
27,2 22,23 965,58 33,2 27,35 958,07
27,3 22,32 965,46 33,3 27,44 957,94
27,4 22,40 965,35 33,4 27,52 957,80
27,5 22,49 965,23 33,5 27,61 957,66
27,6 22,57 965,11 33,6 27,69 957,53
27,7 22,65 964,99 33,7 27,78 957,39
27,8 22,74 964,88 33,8 27,87 957,26
27,9 22,82 964,76 33,9 27,95 957,12

28,0 22,91 964,64 34,0 28,04 956,98


28,1 22,99 964,52 34,1 28,13 956,84
28,2 23,08 964,40 34,2 28,21 956,70
28,3 23,16 964,28 34,3 28,30 956,57
28,4 23,25 964,16 34,4 28,39 956,43
28,5 23,33 964,04 34,5 28,47 956,29
28,6 23,42 963,92 34,6 28,56 956,15
28,7 23,50 963,80 34,7 28,65 956,01
28,8 23,59 963,68 34,8 28,73 955,87
28,9 23,67 963,56 34,9 28,82 955,73

29,0 23,76 963,44 35,0 28,91 955,59


29,1 23,84 963,32 35,1 28,99 955,45
29,2 23,93 963,20 35,2 29,08 955,30

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 751


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

35,3 29,17 955,16 41,3 34,46 945,93


35,4 29,26 955,02 41,4 34,55 945,76
35,5 29,34 954,88 41,5 34,64 945,59
35,6 29,43 954,73 41,6 34,73 945,43
35,7 29,52 954,59 41,7 34,82 945,26
35,8 29,60 954,44 41,8 34,91 945,09
35,9 29,69 954,30 41,9 35,00 944,93

36,0 29,78 954,15 42,0 35,09 944,76


36,1 29,87 954,01 42,1 35,18 944,59
36,2 29,95 953,86 42,2 35,27 944,42
36,3 30,04 953,72 42,3 35,36 944,25
36,4 30,13 953,57 42,4 35,45 944,08
36,5 30,21 953,42 42,5 35,54 943,91
36,6 30,30 953,28 42,6 35,63 943,74
36,7 30,39 953,13 42,7 35,72 943,57
5. Textos gerais

36,8 30,48 952,98 42,8 35,81 943,40


36,9 30,56 952,83 42,9 35,90 943,23

37,0 30,65 952,69 43,0 35,99 943,06


37,1 30,74 952,54 43,1 36,08 942,88
37,2 30,83 952,39 43,2 36,17 942,71
37,3 30,92 952,24 43,3 36,26 942,54
37,4 31,00 952,09 43,4 36,35 942,37
37,5 31,09 951,94 43,5 36,44 942,19
37,6 31,18 951,79 43,6 36,53 942,02
37,7 31,27 951,63 43,7 36,62 941,84
37,8 31,35 951,48 43,8 36,71 941,67
37,9 31,44 951,33 43,9 36,80 941,49

38,0 31,53 951,18 44,0 36,89 941,32


38,1 31,62 951,02 44,1 36,98 941,14
38,2 31,71 950,87 44,2 37,07 940,97
38,3 31,79 950,72 44,3 37,16 940,79
38,4 31,88 950,56 44,4 37,25 940,61
38,5 31,97 950,41 44,5 37,35 940,43
38,6 32,06 950,25 44,6 37,44 940,26
38,7 32,15 950,10 44,7 37,53 940,08
38,8 32,24 949,94 44,8 37,62 939,90
38,9 32,32 949,79 44,9 37,71 939,72

39,0 32,41 949,63 45,0 37,80 939,54


39,1 32,50 949,47 45,1 37,89 939,36
39,2 32,59 949,32 45,2 37,98 939,18
39,3 32,68 949,16 45,3 38,08 939,00
39,4 32,77 949,00 45,4 38,17 938,82
39,5 32,86 948,84 45,5 38,26 938,64
39,6 32,94 948,68 45,6 38,35 938,46
39,7 33,03 948,52 45,7 38,44 938,28
39,8 33,12 948,37 45,8 38,53 938,10
39,9 33,21 948,21 45,9 38,62 937,91

40,0 33,30 948,05 46,0 38,72 937,73


40,1 33,39 947,88 46,1 38,81 937,55
40,2 33,48 947,72 46,2 38,90 937,36
40,3 33,57 947,56 46,3 38,99 937,18
40,4 33,66 947,40 46,4 39,08 937,00
40,5 33,74 947,24 46,5 39,18 936,81
40,6 33,83 947,08 46,6 39,27 936,63
40,7 33,92 946,91 46,7 39,36 936,44
40,8 34,01 946,75 46,8 39,45 936,26
40,9 34,10 946,58 46,9 39,54 936,07

41,0 34,19 946,42 47,0 39,64 935,88


41,1 34,28 946,26 47,1 39,73 935,70
41,2 34,37 946,09 47,2 39,82 935,51

752 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

47,3 39,91 935,32 53,3 45,55 923,50


47,4 40,00 935,14 53,4 45,65 923,30
47,5 40,10 934,95 53,5 45,74 923,09
47,6 40,19 934,76 53,6 45,84 922,88
47,7 40,28 934,57 53,7 45,93 922,68
47,8 40,37 934,38 53,8 46,03 922,47
47,9 40,47 934,19 53,9 46,13 922,26

48,0 40,56 934,00 54,0 46,22 922,06


48,1 40,65 933,81 54,1 46,32 921,85
48,2 40,75 933,62 54,2 46,41 921,64
48,3 40,84 933,43 54,3 46,51 921,43
48,4 40,93 933,24 54,4 46,61 921,22
48,5 41,02 933,05 54,5 46,70 921,01
48,6 41,12 932,86 54,6 46,80 920,80
48,7 41,21 932,67 54,7 46,90 920,59

5. Textos gerais
48,8 41,30 932,47 54,8 46,99 920,38
48,9 41,40 932,28 54,9 47,09 920,17

49,0 41,49 932,09 55,0 47,18 919,96


49,1 41,58 931,90 55,1 47,28 919,75
49,2 41,68 931,70 55,2 47,38 919,54
49,3 41,77 931,51 55,3 47,47 919,33
49,4 41,86 931,31 55,4 47,57 919,12
49,5 41,96 931,12 55,5 47,67 918,91
49,6 42,05 930,92 55,6 47,77 918,69
49,7 42,14 930,73 55,7 47,86 918,48
49,8 42,24 930,53 55,8 47,96 918,27
49,9 42,33 930,34 55,9 48,06 918,06

50,0 42,43 930,14 56,0 48,15 917,84


50,1 42,52 929,95 56,1 48,25 917,63
50,2 42,61 929,75 56,2 48,35 917,42
50,3 42,71 929,55 56,3 48,45 917,20
50,4 42,80 929,35 56,4 48,54 916,99
50,5 42,90 929,16 56,5 48,64 916,77
50,6 42,99 928,96 56,6 48,74 916,56
50,7 43,08 928,76 56,7 48,84 916,35
50,8 43,18 928,56 56,8 48,93 916,13
50,9 43,27 928,36 56,9 49,03 915,91

51,0 43,37 928,16 57,0 49,13 915,70


51,1 43,46 927,96 57,1 49,23 915,48
51,2 43,56 927,77 57,2 49,32 915,27
51,3 43,65 927,57 57,3 49,42 915,05
51,4 43,74 927,36 57,4 49,52 914,83
51,5 43,84 927,16 57,5 49,62 914,62
51,6 43,93 926,96 57,6 49,72 914,40
51,7 44,03 926,76 57,7 49,81 914,18
51,8 44,12 926,56 57,8 49,91 913,97
51,9 44,22 926,36 57,9 50,01 913,75

52,0 44,31 926,16 58,0 50,11 913,53


52,1 44,41 925,95 58,1 50,21 913,31
52,2 44,50 925,75 58,2 50,31 913,09
52,3 44,60 925,55 58,3 50,40 912,87
52,4 44,69 925,35 58,4 50,50 912,65
52,5 44,79 925,14 58,5 50,60 912,43
52,6 44,88 924,94 58,6 50,70 912,22
52,7 44,98 924,73 58,7 50,80 912,00
52,8 45,07 924,53 58,8 50,90 911,78
52,9 45,17 924,32 58,9 51,00 911,55

53,0 45,26 924,12 59,0 51,10 911,33


53,1 45,36 923,91 59,1 51,19 911,11
53,2 45,46 923,71 59,2 51,29 910,89

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 753


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

59,3 51,39 910,67 65,3 57,46 896,94


59,4 51,49 910,45 65,4 57,56 896,71
59,5 51,59 910,23 65,5 57,67 896,47
59,6 51,69 910,01 65,6 57,77 896,23
59,7 51,79 909,78 65,7 57,87 896,00
59,8 51,89 909,56 65,8 57,98 895,76
59,9 51,99 909,34 65,9 58,08 895,52

60,0 52,09 909,11 66,0 58,18 895,28


60,1 52,19 908,89 66,1 58,29 895,05
60,2 52,29 908,67 66,2 58,39 894,81
60,3 52,39 908,44 66,3 58,49 894,57
60,4 52,49 908,22 66,4 58,60 894,33
60,5 52,59 908,00 66,5 58,70 894,09
60,6 52,69 907,77 66,6 58,81 893,85
60,7 52,79 907,55 66,7 58,91 893,61
5. Textos gerais

60,8 52,89 907,32 66,8 59,01 893,37


60,9 52,99 907,10 66,9 59,12 893,13

61,0 53,09 906,87 67,0 59,22 892,89


61,1 53,19 906,64 67,1 59,33 892,65
61,2 53,29 906,42 67,2 59,43 892,41
61,3 53,39 906,19 67,3 59,54 892,17
61,4 53,49 905,97 67,4 59,64 891,93
61,5 53,59 905,74 67,5 59,74 891,69
61,6 53,69 905,51 67,6 59,85 891,45
61,7 53,79 905,29 67,7 59,95 891,20
61,8 53,89 905,06 67,8 60,06 890,96
61,9 53,99 904,83 67,9 60,16 890,72

62,0 54,09 904,60 68,0 60,27 890,48


62,1 54,19 904,37 68,1 60,37 890,23
62,2 54,30 904,15 68,2 60,48 889,99
62,3 54,40 903,92 68,3 60,58 889,75
62,4 54,50 903,69 68,4 60,69 889,50
62,5 54,60 903,46 68,5 60,80 889,26
62,6 54,70 903,23 68,6 60,90 889,01
62,7 54,80 903,00 68,7 61,01 888,77
62,8 54,90 902,77 68,8 61,11 888,52
62,9 55,00 902,54 68,9 61,22 888,28

63,0 55,11 902,31 69,0 61,32 888,03


63,1 55,21 902,08 69,1 61,43 887,79
63,2 55,31 901,85 69,2 61,54 887,54
63,3 55,41 901,62 69,3 61,64 887,29
63,4 55,51 901,39 69,4 61,75 887,05
63,5 55,61 901,15 69,5 61,85 886,80
63,6 55,72 900,92 69,6 61,96 886,55
63,7 55,82 900,69 69,7 62,07 886,31
63,8 55,92 900,46 69,8 62,17 886,06
63,9 56,02 900,23 69,9 62,28 885,81

64,0 56,12 899,99 70,0 62,39 885,56


64,1 56,23 899,76 70,1 62,49 885,31
64,2 56,33 899,53 70,2 62,60 885,06
64,3 56,43 899,29 70,3 62,71 884,82
64,4 56,53 899,06 70,4 62,81 884,57
64,5 56,64 898,83 70,5 62,92 884,32
64,6 56,74 898,59 70,6 63,03 884,07
64,7 56,84 898,36 70,7 63,13 883,82
64,8 56,94 898,12 70,8 63,24 883,57
64,9 57,05 897,89 70,9 63,35 883,32

65,0 57,15 897,65 71,0 63,46 883,06


65,1 57,25 897,42 71,1 63,56 882,81
65,2 57,36 897,18 71,2 63,67 882,56

754 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

71,3 63,78 882,31 77,3 70,39 866,67


71,4 63,89 882,06 77,4 70,51 866,40
71,5 63,99 881,81 77,5 70,62 866,13
71,6 64,10 881,55 77,6 70,73 865,86
71,7 64,21 881,30 77,7 70,85 865,59
71,8 64,32 881,05 77,8 70,96 865,32
71,9 64,43 880,79 77,9 71,07 865,05

72,0 64,53 880,54 78,0 71,19 864,78


72,1 64,64 880,29 78,1 71,30 864,50
72,2 64,75 880,03 78,2 71,41 864,23
72,3 64,86 879,78 78,3 71,53 863,96
72,4 64,97 879,52 78,4 71,64 863,69
72,5 65,08 879,27 78,5 71,76 863,41
72,6 65,19 879,01 78,6 71,87 863,14
72,7 65,29 878,75 78,7 71,98 862,86

5. Textos gerais
72,8 65,40 878,50 78,8 72,10 862,59
72,9 65,51 878,24 78,9 72,21 862,31

73,0 65,62 877,99 79,0 72,33 862,04


73,1 65,73 877,73 79,1 72,44 861,76
73,2 65,84 877,47 79,2 72,56 861,49
73,3 65,95 877,21 79,3 72,67 861,21
73,4 66,06 876,96 79,4 72,79 860,94
73,5 66,17 876,70 79,5 72,90 860,66
73,6 66,28 876,44 79,6 73,02 860,38
73,7 66,39 876,18 79,7 73,13 860,10
73,8 66,50 875,92 79,8 73,25 859,83
73,9 66,61 875,66 79,9 73,36 859,55

74,0 66,72 875,40 80,0 73,48 859,27


74,1 66,83 875,14 80,1 73,60 858,99
74,2 66,94 874,88 80,2 73,71 858,71
74,3 67,05 874,62 80,3 73,83 858,43
74,4 67,16 874,36 80,4 73,94 858,15
74,5 67,27 874,10 80,5 74,06 857,87
74,6 67,38 873,84 80,6 74,18 857,59
74,7 67,49 873,58 80,7 74,29 857,31
74,8 67,60 873,32 80,8 74,41 857,03
74,9 67,71 873,06 80,9 74,53 856,75

75,0 67,82 872,79 81,0 74,64 856,46


75,1 67,93 872,53 81,1 74,76 856,18
75,2 68,04 872,27 81,2 74,88 855,90
75,3 68,15 872,00 81,3 74,99 855,62
75,4 68,26 871,74 81,4 75,11 855,33
75,5 68,38 871,48 81,5 75,23 855,05
75,6 68,49 871,21 81,6 75,34 854,76
75,7 68,60 870,95 81,7 75,46 854,48
75,8 68,71 870,68 81,8 75,58 854,19
75,9 68,82 870,42 81,9 75,70 853,91

76,0 68,93 870,15 82,0 75,82 853,62


76,1 69,04 869,89 82,1 75,93 853,34
76,2 69,16 869,62 82,2 76,05 853,05
76,3 69,27 869,35 82,3 76,17 852,76
76,4 69,38 869,09 82,4 76,29 852,48
76,5 69,49 868,82 82,5 76,41 852,19
76,6 69,61 868,55 82,6 76,52 851,90
76,7 69,72 868,28 82,7 76,64 851,61
76,8 69,83 868,02 82,8 76,76 851,32
76,9 69,94 867,75 82,9 76,88 851,03

77,0 70,06 867,48 83,0 77,00 850,74


77,1 70,17 867,21 83,1 77,12 850,45
77,2 70,28 866,94 83,2 77,24 850,16

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 755


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.5 TABELAS ALCOOMTRICAS (NDICE)

5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

83,3 77,36 849,87 89,3 84,76 831,48


83,4 77,48 849,58 89,4 84,89 831,15
83,5 77,60 849,29 89,5 85,02 830,82
83,6 77,72 848,99 89,6 85,15 830,50
83,7 77,84 848,70 89,7 85,28 830,17
83,8 77,96 848,41 89,8 85,41 829,84
83,9 78,08 848,11 89,9 85,54 829,51

84,0 78,20 847,82 90,0 85,66 829,18


84,1 78,32 847,53 90,1 85,79 828,85
84,2 78,44 847,23 90,2 85,92 828,52
84,3 78,56 846,93 90,3 86,05 828,19
84,4 78,68 846,64 90,4 86,18 827,85
84,5 78,80 846,34 90,5 86,31 827,52
84,6 78,92 846,05 90,6 86,44 827,18
84,7 79,04 845,75 90,7 86,57 826,85
5. Textos gerais

84,8 79,16 845,45 90,8 86,71 826,51


84,9 79,28 845,15 90,9 86,84 826,17

85,0 79,40 844,85 91,0 86,97 825,83


85,1 79,53 844,55 91,1 87,10 825,49
85,2 79,65 844,25 91,2 87,23 825,15
85,3 79,77 843,95 91,3 87,36 824,81
85,4 79,89 843,65 91,4 87,49 824,47
85,5 80,01 843,35 91,5 87,63 824,13
85,6 80,14 843,05 91,6 87,76 823,78
85,7 80,26 842,75 91,7 87,89 823,44
85,8 80,38 842,44 91,8 88,02 823,09
85,9 80,50 842,14 91,9 88,16 822,74

86,0 80,63 841,84 92,0 88,29 822,39


86,1 80,75 841,53 92,1 88,42 822,04
86,2 80,87 841,23 92,2 88,56 821,69
86,3 81,00 840,92 92,3 88,69 821,34
86,4 81,12 840,62 92,4 88,83 820,99
86,5 81,24 840,31 92,5 88,96 820,63
86,6 81,37 840,00 92,6 89,10 820,28
86,7 81,49 839,70 92,7 89,23 819,92
86,8 81,61 839,39 92,8 89,37 819,57
86,9 81,74 839,08 92,9 89,50 819,21

87,0 81,86 838,77 93,0 89,64 818,85


87,1 81,99 838,46 93,1 89,77 818,49
87,2 82,11 838,15 93,2 89,91 818,12
87,3 82,24 837,84 93,3 90,05 817,76
87,4 82,36 837,52 93,4 90,18 817,40
87,5 82,49 837,21 93,5 90,32 817,03
87,6 82,61 836,90 93,6 90,46 816,66
87,7 82,74 836,59 93,7 90,59 816,30
87,8 82,86 836,27 93,8 90,73 815,93
87,9 82,99 835,96 93,9 90,87 815,55

88,0 83,11 835,64 94,0 91,01 815,18


88,1 83,24 835,32 94,1 91,15 814,81
88,2 83,37 835,01 94,2 91,29 814,43
88,3 83,49 834,69 94,3 91,43 814,06
88,4 83,62 834,37 94,4 91,56 813,68
88,5 83,74 834,05 94,5 91,70 813,30
88,6 83,87 833,73 94,6 91,84 812,92
88,7 84,00 833,41 94,7 91,98 812,54
88,8 84,13 833,09 94,8 92,13 812,15
88,9 84,25 832,77 94,9 92,27 811,77

89,0 84,38 832,45 95,0 92,41 811,38


89,1 84,51 832,12 95,1 92,55 810,99
89,2 84,64 831,80 95,2 92,69 810,60

756 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.5. Tabelas alcoomtricas

% V/V % m/m 20 (kg/m3) % V/V % m/m 20 (kg/m3)

95,3 92,83 810,21 97,8 96,51 799,80


95,4 92,98 809,82 97,9 96,66 799,35
95,5 93,12 809,42
95,6 93,26 809,02 98,0 96,81 798,90
95,7 93,41 808,63 98,1 96,97 798,45
95,8 93,55 808,23 98,2 97,12 798,00
95,9 93,69 807,82 98,3 97,28 797,54
98,4 97,43 797,08
96,0 93,84 807,42 98,5 97,59 796,62
96,1 93,98 807,01 98,6 97,74 796,15
96,2 94,13 806,61 98,7 97,90 795,68
96,3 94,27 806,20 98,8 98,06 795,21
96,4 94,42 805,78 98,9 98,22 794,73
96,5 94,57 805,37
96,6 94,71 804,96 99,0 98,38 794,25
96,7 94,86 804,54 99,1 98,53 793,77

5. Textos gerais
96,8 95,01 804,12 99,2 98,69 793,28
96,9 95,16 803,70 99,3 98,86 792,79
99,4 99,02 792,30
97,0 95,31 803,27 99,5 99,18 791,80
97,1 95,45 802,85 99,6 99,34 791,29
97,2 95,60 802,42 99,7 99,50 790,79
97,3 95,75 801,99 99,8 99,67 790,28
97,4 95,90 801,55 99,9 99,83 789,76
97,5 96,05 801,12
97,6 96,21 800,68 100,0 100,0 789,24
97,7 96,36 800,24

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 757


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MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.6. AFERIO DOS


INTERFERES
5.6. Aferio dos interferes 761

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 759


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MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)

5.6. Aferio dos interferes

5.6. AFERIO DOS As clulas so conservadas na forma congelada seguindo


mtodos padronizados. Podem ser mantidas em cultura at,
INTERFERES no mximo, 30 passagens aps o que devem preparar-se novas
culturas a partir dos lotes congelados.
O captulo seguinte publcado a ttulo de informao. Para iniciar a aferio, proceda recolha das clulas quando
os tapetes celulares apresentarem uma confluncia de 90
por cento, pelo mtodo de tratamento com tripsina que se
1. INTRODUO
descreve a seguir:
As monografias relativas aos interferes humanos incluem, remova o meio de cultura dos frascos,
geralmente, uma aferio biolgica fundamentada na
aco inibidora, exercida pelos interferes, sobre o efeito junte a cada frasco 5 ml de soluo de tripsina aquecida a
citopatognico de um vrus sobre uma cultura celular. 37C, preparada extemporaneamente por diluio a 1/50
Entretanto, geralmente, no do especificaes pormenorizadas com tampo salino de fosfato a partir de uma soluo-
no que se refere ao vrus, linha celular e tcnica a utilizar, de -me concentrada contendo 4 mg/ml de tripsina R e
modo a permitir uma certa flexibilidade, indispensvel nos casos 4 mg/ml de edetato de sdio R. Rolhe os frascos e agite com
em que a monografia inclui vrias subclasses de interferes. movimentos circulares para lavar o tapete celular. Elimine
o excesso de soluo de tripsina,
A presente monografia tem por finalidade fornecer ao analista

5. Textos gerais
indicaes gerais sobre a tcnica, a optimizao e a validao deste coloque os frascos na incubadora a 37C durante 5-10
tipo de ensaios, uma vez escolhida uma combinao apropriada min. Proceda a um exame visual ou microscpico para
de linha celular e vrus citopatognico. Descreve em pormenor, a observar os sinais de separao das clulas. Ao microscpio,
ttulo de exemplo de mtodo apropriado, um processo analtico estas aparecem ou aglutinadas ou separadas flutuando
aplicvel a uma aferio de actividade anti-vrica particular, livremente. Agite energicamente os frascos para separar
fornecendo informaes sobre outras combinaes vrus-linha todas as clulas e, de seguida, junte cerca de 5 ml de
celular e indicaes sobre as modalidades de adaptao e de meio de cultura A. Agite energicamente para obter uma
validao do processo para essas outras combinaes.
suspenso de clulas separadas,
para preparar as suspenses celulares para a aferio,
2. AFERIO DA ACTIVIDADE ANTIVRICA disperse as clulas com precauo aspirando e expirando
(REDUO DO EFEITO CITOPATOGNICO) com uma pipeta para desfazer os agregados celulares e
conte as clulas ajustando a concentrao das suspenses
A aferio da actividade antivrica dos interferes humanos em 6 105 clulas por mililitro.
baseia-se na avaliao da resposta induzida em clulas
humanas pelos interferes que suprimem ou reduzem
o efeito citopatognico produzido nessas clulas por um 3.2. MULTIPLICAO DO VRUS EMC
vrus infeccioso. A actividade do interfero avaliada por
comparao da sua capacidade de proteger clulas da aco O vrus EMC multiplicado em clulas L-929 de murganho
citopatognica de um vrus com a de uma preparao padro
de modo a obter-se uma suspenso-me do vrus. A
apropriada, calibrada em Unidades Internacionais.
manuteno das clulas L-929 deve ser efectuada por
tratamento com tripsina e repicagem como se descreve para
3. AFERIO DE UM INTERFERO POR MEIO DE as clulas Hep2c (NOTA: em caso de crescimento celular
CLULAS Hep2c E DO VRUS DA ENCEFALOMIOCARDITE fraco, pode ser necessrio substituir o soro de vitela recm-
INFECCIOSA -nascida por soro fetal de vitela).
Tome vrios frascos contendo culturas confluentes de
O mtodo de aferio que se descreve a ttulo de exemplo baseia- clulas L-929. Retire o meio de cultura contido nos frascos.
-se na reduo do efeito citopatognico. Utiliza clulas humanas
Introduza em cada frasco 2 ml de suspenso do vrus EMC,
Hep2c que so infectadas com o vrus da encefalomiocardite
previamente diludo at uma concentrao de cerca de
infecciosa (EMC) com a finalidade de avaliar a actividade de
diferentes preparaes de interfero humano. Este mtodo foi 2,5 108 UFP/ml com meio de cultura B. Em cada frasco
empregado desde que foram feitos estudos patrocinados pela contendo 4-6 l07 clulas L-929 a multiplicidade da infeco
Organizao Mundial de Sade (OMS) para estabelecimento ser aproximadamente de 10 UFP/clula. Disperse com
de padres internacionais dos interferes humanos alfa, beta e precauo a suspenso vrica na superfcie de um tapete
gama e a sua sensibilidade, fiabilidade e reprodutibilidade para celular, agitando com movimentos circulares, e coloque de
estimulao da actividade desses diferentes tipos de interferes novo na incubadora durante cerca de 1 h. Mantenha o pH do
humanos foram demonstrados por variadas vezes. meio entre 7,4 e 7,8.
Para as culturas de clulas de mamferos, todas as operaes Aps a adsoro do vrus EMC, junte a cada frasco cerca de
so conduzidas segundo os mtodos padronizados 40 ml de meio de cultura B e volte a colocar na incubadora a
estabelecidos para estas culturas celulares. Os volumes de 37C durante cerca de 30 h. Mantenha o pH do meio entre 7,4
reagentes a utilizar so aqui indicados para culturas efectuadas e 7,8 para obter um rendimento mximo em vrus. Recolha o
em frascos de 75 cm2; podem utilizar-se outros tipos de sobrenadante da cultura e conserve-o a cerca de 4C.
recipientes (frascos ou caixas de cultura) e, nesse caso os
volumes devem ser, ento, consequentemente adaptados. Coloque os frascos a -20C para congelar os tapetes celulares
e, de seguida, aquea at temperatura ambiente. Junte
cerca de 5 ml de meio de cultura e agite para romper as
3.1. CULTURA E PREPARAO DAS CLULAS HEP2C membranas celulares. Passe o contedo de cada frasco para o
recipiente que contm o sobrenadante da cultura e transfira
As clulas Hep2c so mantidas e repicadas em meio de esta mistura para tubos de centrfuga de plstico de 50 ml
cultura A. e centrifugue a cerca de 500 g durante, aproximadamente,

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 761


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)

5.6. Aferio dos interferes

10 min, para separar os resduos celulares. Reparta o testemunhas vrus. O tempo necessrio para obter um
sobrenadante lmpido em tubos de vidro de tampa roscada efeito citopatognico mximo pode variar de uma aferio
em fraces de 20, 10, 5, 1, 0,5 ou 0,2 ml por tubo, segundo para outra devido variabilidade intrnseca da reaco das
as necessidades. Conserve a -70C. Os volumes mais altos clulas Hep2c prova vrica num determinado perodo da
podem ser descongelados e divididos em quantidades cultura em contnuo.
mais pequenas e recongelados, se necessrio. Convm,
entretanto, notar que esta suspenso-me do vrus EMC no Remova a maior parte do meio de cultura contido nas
conserva o seu ttulo inicial a no ser que seja conservada cavidades para uma soluo descontaminante apropriada
ininterruptamente a cerca de -70C; ciclos de congelao- (por exemplo, hipoclorito de sdio). Junte nas cavidades
-descongelao repetidos ou a conservao a temperaturas soluo salina tamponada de pH 7,4 R e remova-a para uma
mais elevadas (por exemplo, da ordem de -20C) conduzem a soluo descontaminante. Introduza em cada cavidade
uma perda progressiva do ttulo. 150 l de soluo de colorao e deixe a colorao das clulas
efectuar-se durante cerca de 30 min temperatura ambiente;
de seguida, remova a soluo de colorao para uma soluo
3.3. MTODO DE AFERIO descontaminante. Junte nas cavidades cerca de 150 l de
soluo de fixao, deixe agir durante 10 min temperatura
3.3.1. Determinao do intervalo de medida ambiente e remova a soluo de fixao para uma soluo
descontaminante. Lave os tapetes celulares colocando as
5. Textos gerais

Preparao das solues de interfero


placas num recipiente de plstico em gua corrente. Seque
Dilua o padro de interfero apropriado (por exemplo, um superficialmente as placas com papel absorvente. Seque, de
padro OMS de um subtipo de interfero especfico) no meio seguida, a uma temperatura compreendida entre 20 e 37C
de cultura A de modo a obter uma srie de diluies de razo at evaporao total da humidade.
10 cobrindo o intervalo de doses de 1 000-0,001 U.I./ml.
Utilize placas de microtitulao de 96 cavidades. Introduza Junte em cada cavidade 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M.
em cada cavidade 100 l de meio de cultura A. Junte a todas Elua o corante agitando suavemente as placas ou batendo
as cavidades, com excepo das que serviro de testemunhas com elas repetidas vezes na palma da mo. Assegure-se que a
vrus, cerca de 100 l de cada uma das diluies da repartio da colorao uniforme no conjunto das cavidades
preparao padro. Misture cuidadosamente o contedo das antes de proceder s determinaes espectrofotomtricas.
cavidades com uma pipeta multicanais regulada para 100 l.
Determine a absorvncia em 610-620 nm usando um leitor
Distribuio da suspenso celular de placas de microtitulao, utilizando como branco uma
cavidade, ou uma linha de cavidades, que no contenham
Verta numa placa de Petri estril a suspenso de clulas
clulas mas 150 l de hidrxido de sdio 0,1 M. Calcule as
Hep2c ajustada de modo a conter cerca de 6 105 clulas por
mililitro de meio de cultura A e reparta o contedo da placa concentraes do padro de interfero que corresponde,
de Petri nas cavidades da placa de microtitulao utilizando respectivamente, reduo mxima e reduo mnima
uma pipeta multicanais regulada para 100 l. do efeito citopatognico. Estas concentraes definem o
intervalo de medida que ser utilizado para a aferio.
Coloque as placas na incubadora a 37C em atmosfera com 5
por cento de CO2, durante cerca de 24 h.
3.3.2. Aferio
Infeco pelo vrus
Efectue a aferio segundo o mtodo que antes se descreveu,
Nesta etapa, verifique ao microscprio que os tapetes utilizando:
de clulas Hep2c so confluentes, que apresentam uma
como solues problema, uma srie de diluies a 1/2
distribuio celular relativamente uniforme, que a
morfologia est correcta e que as clulas esto de boa sade. da amostra em meio de cultura A, cujas concentraes
nominais preencham o intervalo de medida da aferio,
Esvazie, ento, a maior parte do meio de cultura contido nas
cavidades, procedendo do seguinte modo: inverta a placa, como solues padro, uma srie de diluies a 1/2 em
sacuda-a e seque-a com papel absorvente (deve proceder-se meio de cultura A do padro apropriado (por exemplo, um
sempre do mesmo modo para esvaziar o lquido contido nas padro OMS de um subtipo de interfero especfico), cujas
cavidades). Dilua a suspenso-me do vrus EMC com meio concentraes nominais preencham o intervalo de medida
de cultura A fresco de modo a obter um ttulo infeccioso de da aferio.
cerca de 3 x 107 UFP/ml (NOTA: so necessrios cerca de
20 ml de vrus diludo para cada placa, mais 5-10 por cento 3.3.3. Anlise dos resultados
de volume suplementar). Coloque a suspenso diluda numa
placa de Petri estril de 9 cm e, de seguida, com uma pipeta Os resultados das aferies da actividade antivrica ajustam-
multicanais regulada para 200 l, reparta o contedo da -se geralmente a uma curva dose-resposta de tipo sigmide,
placa por todas as cavidades (compreendendo as que servem quando se constri o grfico da concentrao em interfero
de testemunhas vrus), com excepo das previstas como (logaritmo do inverso da diluio) em funo da absorvncia.
testemunhas clulas; nestas ltimas, junte cerca de 200 l Construa a curva da concentrao em interfero (logaritmo do
de meio de cultura A que no contenha vrus. inverso da diluio) em funo da absorvncia determinada,
Volte a colocar as placas na incubadora a 37C, em atmosfera para as solues padro e para as solues problema.
com 5 por cento de CO2, durante cerca de 24 h. Considerando s a zona linear da curva, calcule o teor em
interfero da amostra por comparao das respostas obtidas
Colorao com as solues problema e as solues padro, segundo
Examine as placas ao microscpio para confirmar o os mtodos estatsticos habituais para os ensaios em linhas
efeito citopatognico produzido pelo vrus EMC sobre as paralelas.

762 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)

5.6. Aferio dos interferes

4. VALIDAO DE OUTROS MTODOS 4.4. VALIDAO DO PLANO DE ENSAIO

4.1. ESCOLHA DA LINHA CELULAR E DO VRUS Como para todas as aferies em placas de microtitulao,
necessria uma validao do plano do ensaio utilizado.
Para a aferio da actividade antivrica dos interferes podem importante, nomeadamente, despistar os erros resultantes de
uma ordem de distribuio no aleatria nas cavidades ou o
ser utilizados um certo nmero de outras combinaes efeito de margem da placa, e elimin-los efectuando um plano
linha celular/vrus, por exemplo, o vrus EMC com clulas de aferio aleatria ou evitando utilizar cavidades das margens.
do epitelioma pulmonar A549, o vrus Forest Semliki (vrus
SF) ou o vrus Sindbis com fibroblastos humanos, o vrus da
estomatite vesicular com fibroblastos diplides humanos, a 5. REAGENTES E MEIOS DE CULTURA
linha celular amnitica humana WISH ou a linha de clulas
Meio de cultura A (soro de vitela recm-nascida: 10 por cento)
renais bovinas de Madin-Darby. A combinao linha celular/
/vrus escolhida deve ser, geralmente, aquela cuja resposta Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado
preparao de interfero a titular apresentar a sensibilidade de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina
mxima e que permita obter respostas paralelas com 10 ng/ml) 450 ml
preparaes da amostra e do padro do interfero. L-Glutamina, 200 mM, estril 5 ml

5. Textos gerais
Soro de vitela recm-nascida 50 ml

4.2. ESCOLHA DA TCNICA DE COLORAO VITAL Meio de cultura B (soro fetal de vitela: 2 por cento)
Meio de cultura RPMI 1640, se necessrio adicionado
A tcnica de colorao atrs descrita permite determinar o de antibiticos (penicilina 10 000 U.I./ml; estreptomicina
nmero residual de clulas viveis. Podem ser igualmente 10 ng/ml) 490 ral
utilizadas outras tcnicas, nomeadamente a colorao com L-Glutamina, 200 mM, estril 5 ml
violeta de metilo ou com violeta de cristal, ou o mtodo de Soro fetal de vitela 10 ml
converso do azul de tiazol (MTT). Em todos os casos, o
Soluo de colorao
critrio de escolha do mtodo deve ser a obteno, entre a
colorao e o nmero de clulas viveis, de uma relao que Negro de naftaleno 0,5 g

apresente uma linearidade e uma sensibilidade satisfatrias. cido actico glacial 90 ml


Acetato de sdio anidro 8,2 g
gua q.b.p 1 000 ml
4.3. VALIDAO ESTATSTICA
Soluo de fixao
Como todas as aferies biolgicas efectuadas segundo o Formaldedo (40 por cento) 100 ml
modelo de linhas paralelas, a aferio da actividade antivrica cido actico glacial 90 ml
deve satisfazer s condies estatsticas habituais de Acetato de sdio anidro 8,2 g
linearidade da resposta, de paralelismo e de varincia. gua q.b.p. 1 000 ml

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 763


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.6 AFERIO DOS INTERFERES (NDICE)
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE)

5.7. QUADRO
DAS CARACTERSTICAS
DOS RADIONUCLIDOS
CITADOS NA
FARMACOPEIA

5. Textos gerais
PORTUGUESA
5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos
citados na Farmacopeia Portuguesa 767

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 765


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)
MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

5.7. QUADRO DAS ** PTB (Physikalisch-Technishe Bundesanstalt,


Braunschweig, Alemanha),
CARACTERSTICAS DOS *** NPL (National Physical Laboratory, Teddington,
RADIONUCLIDOS CITADOS NA Middlesex, Reino Unido).
A incerteza da semi-vida dada entre parntesis. Em
FARMACOPEIA PORTUGUESA princpio, o nmero entre parntesis o valor numrico
da incerteza-padro dos ltimos dgitos correspondentes
O quadro seguinte publicado para completar a monografia ao valor indicado (Guide to the Expression of Uncertainty
geral Preparaes radiofarmacuticas.
in measurement, International Organisation for
Os valores foram obtidos a partir da base de dados Standardisation (ISO), 1993, ISBN 92-67-20188-3).
do National Nuclear Data Center (NNDC) situado no
So utilizadas as abreviaturas seguintes:
Brookhaven National Laboratory, Upton, NY, Estados Unidos
da Amrica, directamente acessvel pela Internet: eA = electres Auger,
http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html.
ec = electres de converso,
Se for preferida uma outra fonte de informaes (valores
mais recentes), deve ser mencionada explicitamente. = electres,

5. Textos gerais
Outras fontes de dados: + = positres,
* DAMRI (Dpartement des Applications et de la Mtrologie = raios gama,
des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, X = raios X
Frana),

Emisso electrnica Emisso fotnica

Radionuclido Semi-vida Probabilidade Probabilidade


de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

Azoto-13 (13N) 9,965 (4) min + 0,492 (I) (mx: 1,198) 99,8 0,511 199,6 (II)

Carbono-11 (11C) 20,385 (20) min + 0,386 (I) (mx: 0,960) 99,8 0,511 199,5 (II)

30,04 (3) anos eA 0,026 0,8 X 0,005 1


0,032-0,036 7
Csio-137 (137Cs)
em equilbrio ec 0,624 8,0
com Brio-137m (137mBa: 0,656 1,4 0,662 85,1
(137mBa) 2,552 (1) min)
0,174 (I) 94,4
0,416 (I) 5,6

9,33 (3) h eA 0,055 3 X 0,070-0,073 69


0,083 19
ec 0,246 8,5
0,276 2 0,331 79
0,316 2,3 0,361 9,9
0,406 2,0
Chumbo-201 ( 201Pb)
0,585 3,6
(produz Tlio-201
0,692 4,3
radioactivo)
0,767 3,2
0,826 2,4
0,908 5,7
0,946 7,9
1,099 1,8
1,277 1,6

51,873 (9) h eA 0,055 3,0 X 0,010 37,0


0,071-0,073 69,6
ec 0,194 13,3 0,083 19,4
Chumbo-203 ( 203Pb)
0,279 80,8
0,401 3,4

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 767


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

77,27 (3) dias eA 0,006 47 X 0,006-0,007 25

+ 0,179 (I) 0,9 0,511 38,0 (II)


0,631 (I) 18,1 0,847 100,0
1,038 14,1
1,175 2,2
1,238 66,1
Cobalto-56 ( 56Co)
1,360 4,3
1,771 15.5
2,015 3,0
2,035 7,8
2,598 17,0
3,202 3,1
5. Textos gerais

3,253 7,6

271,79 (9) dias eA + ec 0,006-0,007 177,4 X 0,006-0,007 57

ec 0,014 7,4 0,014 9,2


Cobalto-57 ( 57Co)
0,115 1,8 0,122 85,6
0,129 1,3 0,136 10,7
0,692 0,15

70,86 (7) dias eA 0,006 49,4 X 0,006-0,007 26,3

+ 0,201 (I) 14,9 0,511 29,9 (II)


Cobalto-58 ( 58Co)
0,811 99,4
0,864 0,7
1,675 0,5

5,2714 (5) anos 0,096 (I) (mx. 0,318) 99,9 1,173 100,0
Cobalto-60 ( 60Co)
1,333 100,0

13,10 (3) s ec 0,176 26,4 X 0,012-0,014 17,0


Crpton-81m ( 81mKr) 0,189 4,6
0,190 67,6

27,7025 (24) dias eA 0,004 67 X 0,005 22,3


Crmio-51 ( 51Cr)
0,320 9,9

Enxofre-35 ( 35S) 87,51 (12) dias 0,049 (I) (mx: 0,167) 100

Estrncio-89 ( 89Sr) 50,53 (7) dias 0,583 (I) (mx: 1,492) 99,99 0,909 0,01
em equilbrio com
trio-89m ( 89mY) ( 89mY: 16,06 (4) s)

Estrncio-90 ( 90Sr) 28,74 (4) anos 0,196 (I) (mx: 0,546) 100
em equilbrio com
trio-90 ( 90Y) ( 90Y: 64,l0 (8) h)

Flor-18 (18F) 109,77 (5) min + 0,250 (I) (mx: 0,633) 96,7 0,511 193,5 (II)

Fsforo-32 ( 32P) 14,26 (4) dias 0,695 (I) (mx: 1,71) 100

Fsforo-33 ( 33P) 25,34 (12) dias 0,076 (I) (mx: 0,249) 100

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

768 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

9,49 (7) h eA 0,008 21 X 0,009-0,010 19,1

+ 0,157 (I) 1 0,511 112 (II)


0,331 (I) 0,7 0,834 5,9
0,397 (I) 3,8 1,039 37
0,782 (I) 0,3 1,333 1,2
1,90 (I) 50 1,919 2,1
2,190 5,6
Glio-66 ( 66Ga)
2,423 1,9
2,752 23,4
3,229 1,5
3,381 1,5
3,792 1,1

5. Textos gerais
4,086 1,3
4,295 4,1
4,807 1,8

3,2612 (6) dias eA 0,008 62 X 0,008-0,010 57

ec 0,082-0,084 30,4 0,091-0,093 42,4


0,090-0,092 3,6 0,185 21,2
Glio-67 ( 67Ga)
0,175 0,3 0,209 2,4
0,300 16,8
0,394 4,7
0,888 0,15

67,629 (24) min eA 0,008 5,1 X 0,009-0,010 4,7


Glio-68 ( 68Ga)
+ 0,353 (I) 1,2 0,511 178,3
0,836 (I) 88,0 1,077 3,0

270,82 (27) dias eA 0,008 42,4 X 0,009-0,010 44,1


Germnio-68 ( 68Ge)
em equilbrio com
( 68Ga: 67,629 (24) min) + 0,353 (I) 1,2 0,511 178,3
Glio-68 ( 68Ga)
0,836 (I) 88,0 1,077 3,0

4,9 (1) h eA 0,019 13,4 X 0,023-0,026 70,5

0,642 25,9
ndio-110 (110In) 0,658 98,3
0,885 92,9
0,938 68,4
0,997 10,5

69,1 (5) min eA 0,019 5,3 X 0,023-0,026 27,8

ndio-110m (110m In) + 1,015 (I) 6,1 0,511 123,4 (II)


0,658 97,8
2,129 2,1

2,8047 (5) dias eA 0,019 15,6 X 0,003 6,9


0,023-0,026 82,3
ec 0,145 7,8
ndio-111 (111In)
0,167-0,171 1,3 0,171 90,2
0,219 4,9 0,245 94,0
0,241-0,245 1,0

49,51 (1) dia ec 0,162 40 X 0,023-0,027 36,3


0,186-0,190 40
ndio-114m (114mIn)
em equilbrio com
0,190 15,6
ndio-114 (114 In)
* 0,777 (I) (mx: 1,985) 95 0,558 3,2
(114In: 71,9 (1) s) 0,725 3,2

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 769


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

13,27 (8) h eA 0,023 12,3 X 0,004 9,3


0,027-0,031 86,6
0,127 13,6
0,154 1,8 0,159 83,3
Iodo-123 (123I) 0,158 0,4 0,346 0,1
0,440 0,4
0,505 0,3
0,529 1,4
0,538 0,4

59,402 (14) dias eA + ec 0,004 80 X 0,004 15,5


0,023-0,035 33 0,027 114
5. Textos gerais

Iodo-125 (125I) 0,031 26

0,035 6,7

13,11 (5) dias eA 0,023 6 X 0,027-0,031 42,2

ec 0,354 0,5 0,388 34


0,634 0,1 0,491 2,9
0,511 2,3 (II)
Iodo-126 (126I)
0,109 (I) 3,6 0,666 33
0,290 (I) 32,1 0,754 4,2
0,459 (I) 8,0 0,880 0,8
1,420 0,3
+ 0,530 (I) 1

8,02070 (11) dias ec 0,46 3,5 X 0,029-0,030 3,9


0,330 1,6

0,069 (I) 2,1 0,080 2,6


Iodo-131 (131I)
0,097 (I) 7,3 0,284 6,1
0,192 (I) 89,9 0,365 81,7
0,637 7,2
0,723 1,8

20,8 (1) h 0,140 (I) 3,8 0,530 87


Iodo-133 (133I)
0,162 (I) 3,2 0,875 4,5
(produz Xnon-133
0,299 (I) 4,2 1,298 2,4
radioactivo)
0,441 (I) 83

*0,527
6,57 (2) h 0,140 (I) 7,4 13,8
0,237 (I) 8 0,547 7,2
0,307 (I) 8,8 0,837 6,7
Iodo-135 (135I) 0,352 (I) 21,9 1,039 8,0
(produz Xnon-135 0,399 (I) 8 1,132 22,7
radioactivo) 0,444 (I) 7,5 1,260 28,9
0,529 (I) 23,8 1,458 8,7
1,678 9,6
1,791 7,8

trio-90 ( 90Y) 64,10 (8) h 0,934 (I) (mx: 2,280) 100

65,94 (1) h 0,133 (I) 16,4 X 0,018-0,021 3,6


0,290 (I) 1,1

Molibdnio-99 ( 99Mo) 0,443 (I) 82,4 0,041 1,1


em equilbrio com 0,141 4,5
Tecncio-99m ( 99mTc) 0,181 6
0,366 1,2
0,740 12,1
( 99mTc: 6,01(1) h) 0,778 4,3

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

770 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS TEXTOS GERAIS (NDICE) 5.7 CARACTERSTICAS DOS RADIONUCLIDOS (NDICE)

5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

Oxignio-15 (15O) 122,24 (16)s + 0,735 (I) (mx: 1,732) 99,9 0,511 199,8 (II)

4,576 (5) h eA 0,011 31,3 X 0,013-0,014 57,2

ec 0,176 25,0 0,190 64


Rubdio-81 ( 81Rb)
0,188 4,3 0,446 23,2
em equilbrio com
0,457 3,0
Cripton-81m ( 81mKr)
+ 0,253 (I) 1,8 0,510 5,3
0,447 (I) 25,0 0,511 54,2
( 81mKr: 13,10 (3) s) 0,538 2,2

39,26 (2) dias eA + ec 0,017 12 X 0,020-0,023 9,0

5. Textos gerais
Rutnio-103 (103Ru)
ec 0,030-0,039 88,3 0,497 91
em equilbrio
0,610 5,8
com Rdio-103m
0,031 (I) 6,6
(103mRh)
(103mRh:
56,144 (20) min) 0,064 (I) 92,9

26,1 (1) h ec 0,285 3,4 X 0,010 32,0


0,353 1,4 0,069-0,071 63,3
0,08 17,5
+ 0,495 (I) 0,3
0,368 87,2
0,579 13,8
Tlio-200 (200Tl)
0,828 10,8
1,206 29,9
1,226 3,4
1,274 3,3
1,363 3,4
1,515 4,0

72,912 (17) h ec 0,016-0,017 17,7 X 0,010 46,0


0,027-0,029 4,1 0,069-0,071 73,7
0,052 7,2 0,080 20,4
Tlio-201 (201Tl) 0,084 15,4

0,153 2,6 0,135 2,6


0,167 10,0

12,23 (2) dias eA 0,054 2,8 X 0,010 31,0


0,069-0,071 61,6
Tlio-202 (202Tl) ec 0,357 2,4 0,080 17,1

0,440 91,4

Tecncio-99 ( 99Tc) 2,11 105 anos 0,085 (I) (mx: 0,294) 100

6,01(1) h ec 0,002 74 X 0,018-0,021 7,3

eA 0,015 2,1 0,141 89,1


Tecncio-99m ( 99mTc)
ec 0,120 9,4
0,137-0,140 1,3

**19,16 (5) dias eA 0,022 11,6 X 0,026-0,030 75,6

0,470 1,4
Telrio-121 (121Te)
0,508 17,7
0,573 80,3

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 771


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5.7. Quadro das caractersticas dos radionuclidos citados na Farmacopeia Portuguesa

Emisso electrnica Emisso fotnica

Probabilidade Probabilidade
Radionuclido Semi-vida
de emisso de emisso
Tipo Energia (MeV) Tipo Energia (MeV)
(por 100 (por 100
desintegraes) desintegraes)

154,0 (7) dias eA 0,003 88,0 X 0,026-0,031 50,5


0,022-0,023 7,4
Telrio-121m (121mTe)
em equilbrio com
ec 0,050 33,2 0,212 81,4
Telrio-121 (121Te)
(121Te: 19,16(5) dias 0,077 40,0 1,102 2,5
0,180 6,1

Trtio ( 3H) *12,33 (6) anos * *0,006 (I) (mx: 0,019) *100

11,84 (7) dias eA 0,025 6,8 X 0,004 8,3


0,030 44,0
ec 0,129 61 0,034 10,2
Xnon-131m (131m Xe)
0,159 28,5
5. Textos gerais

0,163 8,3 0,164 2,0

5,243 (1) dias eA 0,026 5,8 X 0,004 6,3


0,031 40,3

Xnon-133 (133m Xe) ec 0,045 55,1 0,035 9,4


0,075-0,080 9,9
0,080 38,3
0,101 (I) 99,0

2,19 (1) dias eA 0,025 7 X 0,004 7,8


0,030 45,9
Xnon-133m (133m Xe)
(produz Xnon-133 ec 0,199 64,0 0,034 10,6
radioactivo) 0,228 20,7

0,232 4,6 0,233 10,0

ec
9,14 (2) h 0,214 5,5 X 0,031-0,035 5,0
Xnon-135 (135Xe)
0,171 3,1 0,250 90,2
0,308 96,0 0,608 2,9

(I) Energia mdia do espectro .


(II) Probabilidade de emisso mxima correspondente a uma aniquilao total na fonte por 100 desintegraes.

772 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0


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5.8. HARMONIZAO DAS


FARMACOPEIAS
5.8. Harmonizao das Farmacopeias 775

5. Textos gerais

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 773


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5.8. Harmonizao das Farmacopeias

5.8. HARMONIZAO DAS Farmacopeias (PDG) que associa a Farmacopeia dos Estados
Un