FP9.0 Cap2 MetodosAnaliticos PDF

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0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE)
2. MTODOS
ANALTICOS
2. Mtodos
Analticos
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MENU9.0 MTODOS ANALTICOS (NDICE)
1. Prescries gerais
2. Mtodos
Analticos
14 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2. MTODOS
ANALTICOS
2. Mtodos
Analticos
2.1. Aparelhos 17 2.6. Mtodos biolgicos 167
2.2. Mtodos fsicos e fsico-qumicos 23 2.7. Aferies biolgicas 229
2.3. Identificao 113 2.8. Mtodos de farmacognosia 275
2.4. Ensaios limire das impurezas inorgnicas 121 2.9. Mtodos de farmacotecnia 289
2.5. Mtodos de doseamento 147
FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 15

MENU9.0 MTODOS ANALTICOS (NDICE)
1. Prescries gerais
2. Mtodos
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE)
2.1. APARELHOS
2.1. Aparelhos 19 2.1.3. Lmpadas de radiao ultravioleta para anlise 19
2.1.1. Conta-gotas 19 2.1.4. Tamises 20
2. Mtodos
Analticos
2.1.2. Quadro de comparao dos filtros de vidro 2.1.5. Tubos para ensaios comparativos 20
poroso 19 2.1.6. Tubos detectores de gs 20

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.1 APARELHOS (NDICE)
2.1.3. Lmpadas de radiao ultravioleta para anlise

2. Mtodos
Analticos

2.1.3. Lmpadas de radiao ultravioleta para anlise
2.1. APARELHOS 2.1.2. QUADRO DE COMPARAO DOS

FILTROS DE VIDRO POROSO (1)
2.1.1. CONTA-GOTAS QUADRO 1 Usos especiais
O termo gotas designa gotas ditas normais debitadas por

Nmero de Dimetro mximo
um conta-gotas normal abaixo definido.
2. Mtodos
porosidade dos poros em Alemanha Frana Reino Unido
Analticos
(F.P.) (2) micrmetros
O conta-gotas normal (ver figura 1) de vidro praticamente
incolor. A sua extremidade inferior apresenta um orifcio 1,6 inferior a 1,6 5f
circular de escoamento de bordo plano, perpendicular ao eixo
1 2,5 5 5
do conta-gotas.
4 1,6 4
4-6 5
10 4-10 4f 4
16 10-16 4 4
40 16-40 3 3 3
40-50 2
100 40-100 2 2
100-120 1
160 100-160 1 1
150-200 0 0
250 160-250
200-500 00
Dimetro em micrmetros
< 2,5 filtrao bacteriolgica

4 10 filtrao ultrafina, separao de microrganismos de
grande dimetro
10 40 filtrao analtica, filtrao muito fina de mercrio,
disperso muito fina de gases
40 100 filtrao fina, filtrao de mercrio, disperso fina de
gases
100 160 filtrao de materiais grosseiros, disperso e lavagem de
gases, suporte para outros materiais de filtrao
160 500 filtrao de materiais muito grosseiros, disperso e
lavagem de gases.
2.1.3. LMPADAS DE RADIAO

ULTRAVIOLETA PARA ANLISE
Utilize, como fonte de radiao ultravioleta, uma lmpada de
quartzo de vapor de mercrio. Um filtro apropriado permite
eliminar as radiaes visveis do espectro emitidas por esta
lmpada.
Quando se prescreve na Farmacopeia que o exame feito
com luz ultravioleta de 254 nm ou de 365 nm, utilize um
dispositivo composto de uma lmpada de vapor de mercrio e
de um filtro cujo espectro apresente uma banda de intensidade
mxima na vizinhana de 254 nm ou de 365 nm. A lmpada
deve revelar com segurana uma mancha padro de salicilato
FIGURA 1 Conta-gotas normal de sdio de cerca de 5 mm de dimetro, numa placa de gel de
slica g R, colocada numa posio normal radiao.
Dimenses em milmetros
Prepare para este efeito uma soluo de salicilato de sdio
Podem ser utilizados outros conta-gotas com a condio de R em etanol a 96 por cento R (3) a 0,4 g/l para exame em 254
satisfazerem ao ensaio seguinte: nm e a 2 g/l para exame em 365 nm. Deposite sobre a placa
5 l de cada soluo. A distncia entre a lmpada e a placa
20 gotas de gua R a 20 1C que se escoam em queda livre a examinar num ensaio prescrito na Farmacopeia, no
de um conta-gotas normal conservado em posio vertical, superior distncia usada no controlo acima descrito.
com um dbito constante de uma gota por segundo, pesam
1000 50 mg, tendo o conta-gotas sido lavado (1) Os limites indicados so apenas aproximados.
cuidadosamente antes do emprego. Com um dado conta-gotas, (2) A Farmacopeia Portuguesa adoptou o sistema proposto pela
execute pelo menos 3 determinaes; nenhum resultado se Organizao Internacional de Normalizao (ISO).
afasta mais de 5 por cento da mdia das 3 determinaes. (3) Verifique que o etanol a 96 por cento R utilizado no fluorescente.

2.1.6. Tubos detectores de gs
2.1.4. TAMISES Dimetro do fio d: os dimetros dos fios dados no quadro

aplicam-se tela metlica montada num caixilho. As
Os tamises so fabricados com materiais apropriados e dimenses nominais recomendadas dos dimetros dos fios
tm malhas quadradas. Para operaes no destinadas podem afastar-se destes valores dentro dos limites dmx e dmim.
anlise, podem ser utilizados tamises de malhas circulares Estes limites correspondem a um intervalo de 15 por cento
cujo dimetro interior seja igual a 1,25 vezes a largura das em relao s dimenses nominais recomendadas. Num
malhas quadradas do tamis correspondente (quadro 2). tamis padro, os fios da trama e da urdidura tm o mesmo
2. Mtodos
Analticos
dimetro nominal.
No pode ocorrer nenhuma reaco entre os produtos
a tamisar e o material usado na tamisao.
O grau de diviso prescrito na monografia designado 2.1.5. TUBOS PARA ENSAIOS
pelo nmero do tamis que indica a largura das malhas em COMPARATIVOS
micrmetros e figura entre parntesis a seguir ao nome da
substncia. Os tubos para ensaios comparativos so tubos calibrados de
vidro incolor, de dimetro interno uniforme e cujo fundo
Tolerncia mxima(4) para uma abertura (+ X): nenhuma transparente e plano.
dimenso da abertura ultrapassa a dimenso nominal de mais
de X com Examine a coluna de lquido segundo o eixo vertical do
tubo, sobre fundo branco ou, se necessrio, sobre fundo
negro. Aprecie a tonalidade em luz difusa.
Utilizam-se tubos de 16 mm de dimetro interno. Podem
igualmente ser utilizados os tubos com dimetro interno
w = abertura da malha superior a 16 mm mas, neste caso, o volume de lquido
examinado maior para que a espessura da camada nos tubos
Tolerncia para a mdia das aberturas (Y): a abertura mdia no seja inferior obtida quando se usa o volume prescrito de
no se afasta da abertura nominal mais de Y com lquido e tubos de dimetro interno de 16 mm.
2.1.6. TUBOS DETECTORES DE GS

Tolerncia intermdia (+ Z): no mais de 6 por cento do Os tubos detectores de gs so tubos cilndricos selados,
total das aberturas do tamis tem dimenses compreendidas constitudos por um material inerte transparente e
entre os limites do nominal + X e do nominal + Z com construdos de maneira a permitirem a passagem de um gs.
Contm os reagentes adsorvidos sobre suportes inertes
apropriados revelao da substncia a detectar e, se
necessrio, camadas preliminares e/ou filtros adsorventes
destinados eliminao de substncias interferentes com
a substncia a detectar. A camada indicadora contm, quer
um reagente nico para a deteco de uma dada impureza,
quer vrios reagentes para a deteco de vrias substncias
(4) Veja-se a norma ISO 3310/1 (1975).
(tubo detector monocamada e multicamada).
QUADRO 2 Valores em micrmetros
Tolerncia das aberturas Dimetro do fio

Nmero
dos tamises Tolerncia Tolerncia Dimenses
Tolerncia Dimenses limites
(Dimenses mxima para para a mdia das nominais
intermdia admissveis
nominais das uma abertura aberturas recomendadas
aberturas)
+X Y +Z d d mx d mn
11 200 770 350 560 2500 2900 2100

8000 600 250 430 2000 2300 1700
5600 470 180 320 1600 1900 1300
4000 370 130 250 1400 1700 1200
2800 290 90 190 1120 1300 950
2000 230 70 150 900 1040 770
1400 180 50 110 710 820 600
1000 140 30 90 560 640 480
710 112 25 69 450 520 380
500 89 18 54 315 360 270
355 72 13 43 224 260 190
250 58 9,9 34 160 190 130
180 47 7,6 27 125 150 106
125 38 5,8 22 90 104 77
90 32 4,6 18 63 72 54
63 26 3,7 15 45 52 38
45 22 3,1 13 32 37 27
38 30 35 24

2.1.6. Tubos detectores de gs
Realize o ensaio fazendo passar o volume requerido do gs d informaes sobre a sua reactividade para os diferentes
a analisar pelo tubo indicador. O comprimento da camada leos. Se o leo utilizado no aparecer citado, o fabricante do
corada ou a intensidade de uma colorao desenvolvida tubo verifica a sua reactividade e, se necessrio, fornece um
sobre escala graduada fornece indicaes relativas s tubo especfico para aquele leo.
impurezas presentes no gs a analisar.
A verificao da calibrao dos tubos detectores efectuada Tubo detector de dixido de carbono. Tubo de vidro selado
contendo filtros adsorventes e suportes apropriados para os
2. Mtodos
segundo as instrues do fabricante.
Analticos
indicadores hidrazina e violeta de cristal. O valor mnimo
Mtodo. Opere segundo as instrues do fabricante indicado de 100 ppm, com um desvio padro relativo
ou proceda como segue: mximo de 15 por cento.
O recipiente da amostra ligado a um regulador de presso
apropriado e a uma vlvula de agulha. Ligue o tubo flexvel, Tubo detector de dixido de enxofre. Tubo de vidro selado
munido de uma pea em Y vlvula e ajuste o fluxo do contendo filtros adsorventes e suportes apropriados para o
gs em anlise a fim de purgar o tubo para obter um dbito indicador iodo-amido. O valor mnimo indicado de 0,5 ppm
apropriado (ver figura 2). Prepare o tubo indicador e ligue-o com um desvio padro relativo mximo de 15 por cento.
bomba doseadora em conformidade com as instrues do
fabricante. Ligue a extremidade aberta do tubo indicador ao Tubo detector de leo. Tubo de vidro selado contendo filtros
segmento curto do tubo e accione a bomba para fazer passar adsorventes e suportes apropriados para o indicador cido
no tubo um volume apropriado do gs a analisar. Determine sulfrico. O valor mnimo indicado de 0,1 mg/m3 com um
o valor correspondente ao comprimento da camada corada desvio padro relativo mximo de 30 por cento.
ou de intensificao da colorao desenvolvida sobre a
escala graduada. Se o resultado for negativo, verifique os
tubos indicadores com um gs de calibrao que contenha a Tubo detector de monxido de azoto e de dixido de azoto.
impureza apropriada. Tubo de vidro selado contendo filtros adsorventes e suportes
apropriados para uma camada oxidante (sal de Cr(VI)) e para
Devido grande diversidade de leos para compressores, o indicador difenilbenzidina. O valor mnimo indicado de
necessrio verificar a reactividade dos tubos detectores de 0,5 ppm, com um desvio padro relativo mximo de 15 por
leo para o leo utilizado. O folheto fornecido com cada tubo cento.
Tubo detector de monxido de carbono. Tubo de vidro

selado contendo filtros adsorventes e suportes apropriados
para os indicadores pentxido de diiodo, dixido de selnio e
cido sulfrico fumante. O valor mnimo indicado igual ou
inferior a 5 ppm, com um desvio padro relativo mximo de
15 por cento.
Tubo detector de sulfureto de hidrognio. Tubo de vidro

selado contendo filtros adsorventes e suportes apropriados
para o indicador de chumbo apropriado. O valor mnimo
indicado igual ou inferior a 1 ppm com um desvio padro
1. recipiente do gs relativo mximo de 10 por cento.
2. regulador de presso
3. vlvula de agulha
4. pea em Y Tubo detector de vapor de gua. Tubo de vidro selado
5. tubo indicador contendo filtros adsorventes e suportes apropriados para o
6. bomba do tubo indicador
7. extremidade aberta para o ar livre
indicador perclorato de magnsio. O valor mnimo indicado
igual ou inferior a 67 ppm, com um desvio padro relativo
FIGURA 2 Aparelho para os tubos detectores de gs mximo de 20 por cento.

2. Mtodos MTODOS
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CAPTULOS (NDICE)
GERAIS MTODOS
2.1 APARELHOS
ANALTICOS (NDICE)
Analticos

2.2. MTODOS FSICOS

E FSICO-QUMICOS
2. Mtodos
Analticos
2.2. Mtodos fsicos e fsico-qumicos 25 2.2.28. Cromatografia em fase gasosa 51
2.2.1. Limpidez e grau de opalescncia 2.2.29. Cromatografia lquida 53
dos lquidos 25 2.2.30. Cromatografia de excluso 54
2.2.2. Grau de colorao dos lquidos 27 2.2.31. Electroforese 55
2.2.3. Determinao potenciomtrica do pH 28 2.2.32. Perda por secagem 60
2.2.4. Correspondncia entre a reaco do meio, 2.2.33. Espectrometria de ressonncia magntica
o pH aproximado e a colorao de alguns nuclear 61
indicadores 30 2.2.34. Anlise trmica 62
2.2.5. Densidade 30 2.2.35. Osmolalidade 64
2.2.6. ndice de refraco 31 2.2.36. Determinao potenciomtrica da concentrao
2.2.7. Poder rotatrio 31 inica com elctrodos de membrana
2.2.8. Viscosidade 32 selectivos 65
2.2.9. Viscosidade mtodo do tubo capilar 32 2.2.37. Espectrometria de fluorescncia-X 66
2.2.10. Viscosidade mtodo do viscosmetro 2.2.38. Condutividade 67
rotativo 33 2.2.39. Determinao da massa molecular
2.2.11. Intervalo de destilao 35 dos dextranos 68
2.2.12. Ponto de ebulio 35 2.2.40. Espectrofotometria no infravermelho
2.2.13. Determinao da gua por arrastamento 36 prximo 69
2.2.14. Ponto de fuso mtodo do tubo capilar 37 2.2.41. Dicrosmo circular 74
2.2.15. Ponto de fuso mtodo do tubo capilar 2.2.42. Massa volmica de um slido 75
aberto 37 2.2.43. Espectrometria de massa 76
2.2.16. Ponto de fuso mtodo da fuso 2.2.44. Carbono orgnico total na gua para uso
instantnea 37 farmacutico 79
2.2.17. Ponto de gotejamento 38 2.2.45. Cromatografia em fase supercrtica 80
2.2.18. Ponto de solidificao 39 2.2.46. Tcnicas de separao cromatogrfica 81
2.2.19. Titulaes amperomtricas 39 2.2.47. Electroforese capilar 86
2.2.20. Titulaes potenciomtricas 40 2.2.48. Espectrometria de Raman 91
2.2.21. Fluorimetria 40 2.2.49. Viscosidade mtodo do viscosmetro de
2.2.22. Espectrometria de emisso atmica 41 queda de esfera 93
2.2.23. Espectrometria de absoro atmica 42 2.2.54. Focalizao isoelctrica 93
2.2.24. Espectrofotometria de absoro 2.2.55. Cartografia peptdica 96
no infravermelho 45 2.2.56. Anlise de aminocidos 99
2.2.25. Espectrofotometria de absoro no 2.2.57. Espectrometria de emisso atmica com
ultravioleta e no visvel 47 plasma de acoplamento indutivo (IPC-AES) 108
2.2.26. Cromatografia em papel 49 2.2.58. Espectrometria de massa com plasma
2.2.27. Cromatografia em camada fina 49 de acoplamento indutivo (ICP-MS) 110

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.2 MTODO FSICOS E FSICO-QUMICOS (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.2 MTODO FSICOS E FSICO-QUMICOS (NDICE)
2.2.1. Limpidez e grau de opalescncia dos lquidos
2.2. MTODOS FSICOS respectivamente, de 3 UNT, 6 UNT, 18 UNT e 30 UNT. Existem

no comrcio suspenses de formazina estabilizadas que
E FSICO-QUMICOS podem ser utilizadas para preparar padres de turbidez
diludos estveis, aps comparao com os padres
preparados como se descreveu.
2.2.1. LIMPIDEZ E GRAU A variados ttulos, a formazina um excelente padro de
DE OPALESCNCIA DOS LQUIDOS
2. Mtodos
turbidez. Pode ser preparada de modo reprodutvel a partir
Analticos
de matrias-primas doseadas. As suas caractersticas fsicas
fazem dela um padro bem adaptado s determinaes
MTODO VISUAL de difuso da luz. Na forma polimrica composta por
cadeias de diferentes comprimentos com configuraes
Em tubos de ensaio idnticos, de vidro neutro, incolor e aleatrias. Daqui resulta uma grande diversidade das formas e
transparente, com dimetro interno de 15 a 25 mm e de configuraes das partculas que permite a anlise de diversos
fundo plano, compare o lquido em ensaio com a suspenso tipos de partculas que podero estar presentes nas amostras
de referncia abaixo descrita, preparada extemporaneamente, reais. A reprodutibilidade da preparao da formazina, as suas
fazendo a observao numa camada de lquido com 40 mm propriedades de difuso e a sua capacidade de representao
de profundidade. Cinco minutos depois da preparao da grfica fazem dela o padro geralmente utilizado para
suspenso de referncia, observe os lquidos segundo o eixo estabelecer os algoritmos de padronizao dos instrumentos
do tubo, sobre fundo negro e luz natural difusa.
e critrios de performance.
A difuso da luz tal que permita distinguir facilmente
a suspenso de referncia I da gua R e a suspenso de
referncia II da suspenso de referncia I. MTODOS INSTRUMENTAIS
Um lquido considerado como lmpido quando a sua limpidez
corresponde da gua R ou do solvente utilizado, nas INTRODUO
condies operatrias indicadas acima ou se a sua opalescncia
no mais pronunciada que a da suspenso de referncia I. O grau de opalescncia pode igualmente ser determinado
por mtodos instrumentais que se baseiam no efeito de
absoro ou de difuso da luz resultante da existncia
REAGENTES de zonas de no homogeneidade de densidade ptica,
escala submicroscpica, nas solues e suspenses
Soluo de sulfato de hidrazina. Dissolva 1,0 g de sulfato de opalescentes. A nefelometria e a trubidimetria so duas das
hidrazina R em gua R e complete 100,0 ml com o mesmo tcnicas utilizadas para este fim. Para as determinaes
solvente. Deixe em repouso durante 4 a 6 h. turbidimtricas de amostras coradas so utilizadas a
turbidimetria de ratio e a nefelometria em modo de ratio.
Soluo de hexametilenotetramina. Num balo de 100 ml O efeito de difuso da luz pelas partculas em suspenso
com rolha dissolva 2,5 g de hexametilenotetramina R em pode ser determinado por observao da luz transmitida
25,0 ml de gua R.
(turbidimetria) ou da luz difundida (nefelometria). A
turbidez de ratio combina os princpios da nefelometria
Suspenso-me de opalescncia (suspenso de formazina). e da turbidimetria. A turbidimetria e a nefelometria so
Tome 25,0 ml da soluo de sulfato de hidrazina, introduza- utilizadas para as determinaes a obter nas suspenses de
-os no balo contendo a soluo de hexametilenotetramina e opalescncia ligeira. Necessitam da utilizao de suspenses
misture. Deixe em repouso durante 24 h. Esta suspenso pode padro preparadas em condies bem definidas. Para as
ser conservada durante 2 meses num recipiente de vidro com determinaes quantitativas, indispensvel construir uma
superfcie sem defeitos. A suspenso no adere s paredes do curva de calibrao porque a relao entre as propriedades
recipiente e cuidadosamente misturada antes do emprego. pticas da suspenso e a concentrao da fase dispersa ,
quando muito, semi-emprica.
Padro de opalescncia. Tome 15,0 ml da suspenso-me
de opalescncia e complete 1000,0 ml com gua R. Esta A determinao do grau de opalescncia dos lquidos corados
suspenso preparada no momento do emprego e pode ser efectua-se com o auxlio de um turbidmetro de ratio ou de
conservada durante 24 h, no mximo. um nefelmetro em modo de ratio. A colorao, ao atenuar
a luz incidente ou a luz difundida, introduz, com efeito, uma
interferncia negativa e diminui a turbidez determinada. A
Suspenses de referncia. Prepare as suspenses de referncia
amplitude deste efeito, mesmo nas amostras pouco coradas,
segundo o quadro 1 A. Misture e agite antes do emprego.
impede a utilizao de nefelmetros convencionais.
QUADRO 1 A Para a avaliao da limpidez e da opalescncia a tcnica

instrumental constitui um mtodo de ensaio mais
I II III IV discriminante que o exame visual e no depende da acuidade
Padro de opalescncia 5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml visual do analista. A obteno de resultados numricos
gua R 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml sobretudo til para a avaliao da qualidade e do
controlo dos processos, em particular quando dos estudos
de estabilidade. Pode, por exemplo, projectar-se dados
Padro de turbidez. A suspenso de formazina preparada por numricos precedentemente obtidos sobre a estabilidade
mistura de volumes iguais de soluo de sulfato de hidrazina para determinar se um dado lote de uma formulao ou de
e soluo de hexametilenatetramina definida como padro uma substncia activa corre o risco de se encontrar fora das
primrio de 4000 UTN (unidades de turbidez nefelomtrica). especificaes antes da data de expirao do seu prazo de
Os valores das suspenses padro I, II, III e IV so, utilizao.

2.2.1. Limpidez e grau de opalescncia dos lquidos
NEFELOMETRIA ratio a influncia da luz parasita torna-se negligencivel.

Os nefelmetros so utilizados para medir o grau de
Quando uma suspenso examinada em ngulos opalescncia dos lquidos incolores.
perpendiculares direco da luz incidente, o sistema As determinaes efectuadas nas suspenses padro I-IV
torna-se opalescente devido reflexo de luz nas com um turbidmetro de ratio mostram a existncia de
partculas presentes na suspenso (efeito de Tyndall). O uma relao linear entre as concentraes e os valores UTN
feixe incidente que penetra num lquido turvo em parte
2. Mtodos
obtidos. As suspenses I-IV da Ph. Eur. podem ser utilizadas

Analticos
transmitido, em parte absorvido e em parte difundido para a calibrao dos instrumentos.

pelas partculas em suspenso. Se a determinao
efectuada num ngulo de 90 em relao ao feixe QUADRO 1 B
incidente, a luz difundida pelas partculas permite
determinar a sua concentrao desde que o nmero e Suspenses de formazina Valores de opalescncia (UTN)
tamanho das partculas que influenciam a difuso se
mantiverem constantes. As suspenses padro devem Supenso padro I 3
apresentar um nvel constante de turvao e serem Suspenso padro II 6
preparadas nas mesmas condies que as amostras. O Suspenso padro III 18
efeito de Tyndall depende do nmero e do tamanho das Suspenso padro IV 30
partculas. As determinaes nefelomtricas so mais Padro de opalescncia 60
fiveis quando a turvao ligeira, em que exista uma Suspenso-me de opalescncia 4000
relao linear entre a turbidez expressa em unidade de
turbidez nefelomtrica (UTN) e o sinal relativo emitido
pelo detector. Quando o nvel de turbidez aumenta, surge DETERMINAO INSTRUMENTAL DA OPALESCNCIA
como consequncia um duplo problema: algumas das
partculas no so expostas ao feixe incidente e o raio As exigncias das monografias so expressas pela
difundido pelas outras partculas impedido de alcanar referncia ao mtodo visual e por comparao com as
o detector. Os valores nefelomtricos mximos que suspenses padro definidas. Entretanto, os mtodos
podem ser determinados de modo fivel so da ordem instrumentais podem igualmente ser utilizados
de 1750-2000 UTN. Convm estabelecer a linearidade para verificar a conformidade com as exigncias das
construindo a curva de calibrao a partir de, pelo monografias, desde que a adequao do instrumento (ver
menos, 4 concentraes. adiante) seja estabelecida e que tenha sido padronizado
com as suspenses padro I-IV e com a gua R ou o
solvente utilizado.
TURBIDIMETRIA Aparelhagem. Os turbidmetros de ratio ou os
nefelmetros que possuam um modo de ratio utilizam
A turbidimetria exprime a propriedade ptica que faz como fonte luminosa quer uma lmpada de filamento
que, dada a interaco entre a luz e as partculas em de tungstnio tendo uma sensibilidade espectral de
suspenso num lquido, a luz seja difundida e absorvida cerca de 550 nm e operando a uma temperatura de
de preferncia a ser transmitida em linha recta atravs cor de 2700 K, quer uma LED-IR tendo uma emisso
da amostra. Permite determinar a quantidade de matria mxima a 860 nm e uma largura de banda espectral de
slida em suspenso pela medida da intensidade da luz 60 nm. Podem igualmente ser utilizadas outras fontes
transmitida. Obtm-se uma relao linear entre a turbidez luminosas apropriadas. Os fotododos de silcio e os
e a concentrao quando o tamanho das partculas em
fotomultiplicadores so correntemente empregados
suspenso uniforme e homogneo. Esta condio s
como detectores e registam as variaes de intensidade
se realiza nas suspenses muito diludas e que contm
luminosa difundida ou transmitida pela amostra. A luz
partculas de tamanho pequeno. Convm estabelecer a
difundida a 90 2,5 detectada pelo detector primrio
linearidade da relao turbidez-concentrao construindo
enquanto que outros detectores servem para determinar
uma curva de calibrao a partir de, pelo menos, 4
a radiao rectrodifundida ou difundida para diante bem
concentraes.
como a luz transmitida. Os instrumentos utilizados so
calibrados por meio de preparaes de turvao conhecida
TURBIDIMETRIA DE RATIO e permitem determinaes automticas da turvao. Os
resultados expressos em UTN so directamente fornecidos
Em turbidimetria de ratio determina-se a relao entre pelo instrumento e comparados com as especificaes da
a determinao da luz transmitida e a determinao da monografia considerada. Os instrumentos que satisfaam
luz difundida a 90. Esta aproximao permite compensar s especificaes seguintes so apropriados.
o enfraquecimento do sinal, consequncia da colorao Unidades de medida: UTN; a UTN definida a partir
da amostra. Pode igualmente eliminar-se a influncia da turvao de um padro primrio de formazina. As
da colorao utilizando como fonte luminosa um dodo unidades UTF (unidade turbidimtrica formazina) e a
electroluminiscente emitindo no infravermelho (LED-IR)
UNF (unidade mefelomtrica formazina) so igualmente
em 860 nm. Os detectores de fotododo do instrumento
utilizadas e so equivalentes UTN nas baixas regies
recebem e medem, por um lado, a luz emergente difundida
num ngulo de 90, por outro lado, a luz difundida cerca (at 40 UTN). Estas unidades so utilizadas para os 3
da frente da amostra (luz reflectida) e a luz transmitida mtodos instrumentais (nefelometria, turbidimetria e
directamente atravs da amostra. Os resultados da turbidimetria de ratio).
determinao, expressos em UTN (ratio) so obtidos por Intervalo de medida: 0,01 1100 UTN.
clculo da relao entre os valores determinados para a luz
difundida a 90 e para a soma dos compostos de difuso Resoluo: 0,01 UTN no intervalo de 1 UTN a 10 UTN,
cerca da frente e da transmisso. Em turbidimetria de 0,1 UTN no intervalo de 10 UTN a 100 UTN e 1 UTN a

2.2.2. Grau de colorao dos lquidos
partir de 100 UTN; o instrumento calibrado e regulado REAGENTES

com o auxlio de padres de formazina.
Exactido: 0-10 NTU: (2 por cento do valor lido +0,01) Solues primrias
UTN. 10-1000 UTN 5 por cento. Soluo amarela. Dissolva 46 g de cloreto frrico R em
Repetibilidade: 0-10 UTN: 0,01 UTN. 10-1000 UTN: 2 cerca de 900 ml de uma mistura de 25 ml de cido clordrico
por cento do valor determinado. R e 975 ml de gua R e complete 1000,0 ml com a mesma
2. Mtodos
Analticos
mistura. Titule e ajuste a soluo para 45,0 mg de FeCl3,
Calibrao: com 4 suspenses padro de formazina 6H2O por mililitro, por adio da mesma mistura cida.
compreendidas no intervalo de medida; utilize as
Conserve ao abrigo da luz.
suspenses padro descritas no presente captulo ou podem
ser utilizados padres apropriados estabelecidos em relao
s suspenses padro primrias. Titulao. Num matrs de 250 ml com rolha, introduza
10,0 ml da soluo, 15 ml de gua R, 5 ml de cido
Luz parasita: fonte de erro significativo nos baixos nveis
clordrico R e 4 g de iodeto de potssio R. Rolhe o balo,
de turvao; a luz parasita atinge o detector do sistema
deixe em repouso na obscuridade durante 15 min e junte
ptico sem provir da amostra; 0,15 UTN no intervalo de
0-10 UTN, 0,5 UTN no intervalo de 10-1000 UTN. 100 ml de gua R. Titule o iodo libertado com tiossulfato
de sdio 0,1 M em presena de 0,5 ml de soluo de amido
O emprego de instrumentos que respondam a estes critrios R adicionada perto do final da titulao.
e verificados por meio de suspenses padro descritas no
mtodo visual pode substituir o exame visual para avaliao 1 ml de tiossulfato de sdio 0,1 M corresponde a 27,03 mg de
da conformidade com as exigncias das monografias. FeCl3, 6H2O.
Instrumentos que apresentem caractersticas (intervalo de
medida, resoluo, exactido, repetibilidade) diferentes das Soluo vermelha. Dissolva 60 g de cloreto de cobalto R
mencionadas podem igualmente ser utilizados desde que se em cerca de 900 ml de uma mistura de 25 ml de cido
tenha feito uma validao suficiente e sejam adaptados ao clordrico R e 975 ml de gua R e complete 1000,0 ml com
uso considerado. A metodologia utilizada para a substncia a mesma mistura. Titule e ajuste a soluo para 59,5 mg
ou produto a analisar deve igualmente ser objecto de uma de CoCl2, 6H20 por mililitro, por adio da mesma mistura
validao das suas potencialidades analticas. O instrumento cida.
e a metodologia devem ser adaptados s propriedades do
produto a analisar. Titulao. Num matrs de 250 ml com rolha, introduza
5,0 ml da soluo, 5 ml de soluo diluda de perxido de
hidrognio R e 10 ml de soluo de hidrxito de sdio R
2.2.2. GRAU DE COLORAO a 300 g/l. Faa ferver lentamente durante 10 min, deixe
DOS LQUIDOS arrefecer e junte 60 ml de cido sulfrico diludo R e
2 g de iodeto de potssio R. Rolhe o balo e dissolva o
Para apreciar o grau de colorao dos lquidos nas cores precipitado agitando suavemente. Titule o iodo libertado
castanho-amarelo-vermelho, utilize dos 2 mtodos
com tiossulfato de sdio 0,1 M at colorao rsea, em
abaixo descritos, o que for indicado na monografia.
presena de 0,5 ml de soluo de amido R adicionada no
Uma soluo diz-se incolor se tem o aspecto da gua R final da titulao.
ou do solvente, ou se no mais corada que a soluo de
1 ml de tiossulfato de sdio 0,1 M corresponde a 23,79 mg de
referncia C9.
CoCl2, 6H2O.
MTODO I Soluo azul. Dissolva 63 g de sulfato de cobre R em cerca de

900 ml de uma mistura de 25 ml de cido clordrico R e
Em tubos de ensaio idnticos, de vidro neutro, incolor e 975 ml de gua R e complete 1000,0 ml com a mesma
transparente, com dimetro exterior de 12 mm, compare mistura. Titule e ajuste a soluo para 62,4 mg de CuSO4,
2,0 ml do lquido em ensaio com 2,0 ml de gua R, do 5H2O por mililitro, por adio da mesma mistura cida.
solvente ou da soluo de referncia (ver quadros das
solues de referncia) prescrita na monografia. Aprecie as
Titulao. Num matrs de 250 ml com rolha, introduza
tonalidades luz natural difusa, observando horizontalmente
10,0 ml da soluo, 50 ml de gua R, 12 ml de cido
sobre fundo branco.
actico diludo R e 3 g de iodeto de potssio R. Titule o
iodo libertado com tiossulfato de sdio 0,1 M at fraca
MTODO II colorao castanha clara, em presena de 0,5 ml de
soluo de amido R adicionada no final da titulao.
Em tubos de ensaio idnticos, de vidro neutro, incolor e
1 ml de tiossulfato de sdio 0,1 M corresponde a 24,97 mg de
transparente, com dimetro interior de 15 a 25 mm e de
CuSO4, 5H2O.
fundo plano, compare o lquido em ensaio com a gua
R, o solvente ou a soluo de referncia (ver quadros das
solues de referncia) prescrita na monografia, sob uma Solues padro
espessura de 40 mm. Aprecie as tonalidades luz natural
difusa, observando segundo o eixo do tubo sobre fundo A partir das 3 solues primrias, prepare 5 solues
branco. padro como se indica:

2.2.3. Determinao potenciomtrica do pH
QUADRO 2 QUADRO 6 Solues de referncia Avd

Volumes em mililitros Volumes em mililitros
Soluo Soluo Soluo cido clordrico a Soluo Soluo cido clordrico

Soluo padro
amarela vermelha azul 10 g/l de HCl de referncia padro Avd a 10 g/l de HCl
C (castanha) 3,0 3,0 2,4 1,6 Avd1 25,0 75,0
2. Mtodos
Ac (amarela Avd2 15,0 85,0

Analticos
acastanhada) 2,4 1,0 0,4 6,2 Avd3 8,5 91,5

A (amarela) 2,4 0,6 0,0 7,0 Avd4 5,0 95,0
Avd (amarela Avd5 3,0 97,0
esverdeada) 9,6 0,2 0,2 0,0 Avd6 1,5 98,5
V (vermelha) 1,0 2,0 0,0 7,0 Avd7 0,75 99,25
Solues de referncia utilizadas nos mtodos I e II QUADRO 7 Solues de referncia V

Volumes em mililitros
A partir destas 5 solues padro, prepare as solues de
referncia seguintes: Soluo Soluo cido clordrico
de referncia padro V a 10 g/l de HCl
V1 100,0 0,0
QUADRO 3 Solues de referncia C
V2 75,0 25,0
V3 50,0 50,0
Soluo Soluo cido clordrico V4 37,5 62,5
de referncia padro C a 10 g/l de HCl V5 25,0 75,0
C1 75,0 25,0 V6 12,5 87,5
C2 50,0 50,0 V7 5,0 95,0
C3 37,5 62,5
C4 25,0 75,0
Conservao
C5 12,5 87,5
C6 5,0 95,0 Para o Mtodo I, as solues de referncia podem ser
C7 2,5 97,5 conservadas em tubos de ensaio de vidro neutro, incolor e
C8 1,5 98,5 transparente, de 12 mm de dimetro exterior, selados e ao
99,0 abrigo da luz.
C9 1,0
Para o Mtodo II, prepare as solues de referncia
imediatamente antes do emprego a partir das solues
padro.
QUADRO 4 Solues de referncia Ac
2.2.3. DETERMINAO
Soluo
de referncia
Soluo
padro Ac
cido clordrico
a 10 g/l de HCl POTENCIOMTRICA DO pH
Ac1 100,0 0,0 O pH o nmero que representa convencionalmente a
Ac2 75,0 25,0 concentrao dos ies hidrognio numa soluo aquosa. Por
Ac3 50,0 50,0 razes prticas, a sua definio experimental. O pH de uma
Ac4 25,0 75,0
soluo expresso em relao ao de uma soluo de referncia
(pHs) segundo a equao:
Ac5 12,5 87,5
Ac6 5,0 95,0
Ac7 2,5 97,5
em que E a tenso, expressa em volts, da clula contendo

QUADRO 5 Solues de referncia A a soluo problema, Es a tenso, expressa em volts, da clula
Volumes em mililitros contendo a soluo de referncia de pH conhecido (pHs) e
k a variao da tenso por variao de uma unidade de pH,
Soluo Soluo cido clordrico expressa em volts e calculada pela equao de Nernst.
de referncia padro A a 10 g/l de HCl
A1 100,0 0,0 QUADRO 8 Valores de k a diferentes temperaturas:
A2 75,0 25,0 Temperatura C k(V)
A3 50,0 50,0
15 0,0572
A4 25,0 75,0 20 0,0582
A5 12,5 87,5 25 0,0592
A6 5,0 95,0 30 0,0601
35 0,0611
A7 2,5 97,5

2.2.3. Determinao potenciomtrica do pH
QUADRO 9 Variao do pH das solues tampo em funo da temperatura
2. Mtodos
Analticos
A determinao potenciomtrica do pH efectuada medindo Tartarato cido de potssio, saturado a 25C.
a diferena de potencial entre 2 elctrodos judiciosamente Agite vigorosamente um excesso de C4H6KO6 com gua
escolhidos mergulhados na soluo; um destes um isenta de dixido de carbono R a 25C. Filtre ou decante.
elctrodo sensvel aos ies hidrognio (o mais das vezes, um Preparao extempornea.
elctrodo de vidro) e o outro um elctrodo de referncia (por
exemplo, um elctrodo de calomelanos saturado). Citrato monopotssico 0,05 M. Dissolva 11,41 g de C6H7KO7
em gua isenta de dixido de carbono R e complete 1000,0 ml
Aparelho. O aparelho de medida um voltmetro com o mesmo solvente. Preparao extempornea.
habitualmente graduado em unidades de pH. A sua
resistncia de entrada , pelo menos, 100 vezes superior dos Ftalato cido de potssio 0,05 M. Dissolva 10,13 g de
elctrodos utilizados e a sua sensibilidade , no mnimo, de C8H5KO4, previamente seco a 110 2C durante 1 hora, em
0,05 unidades de pH ou 0,003 V. gua isenta de dixido de carbono R e complete
Mtodo. Salvo indicao em contrrio na monografia, 1000,0 ml com o mesmo solvente.
efectue todas as medies mesma temperatura (20
a 25C). Indicam-se no quadro 9 os valores de pH de Fosfato monopotssico 0,025 M + Fosfato dissdico
algumas solues tampo de referncia preconizadas 0,025 M. Dissolva 3,39 g de KH2PO4 e 3,53 g de Na2HPO4,
para a calibrao, em funo da temperatura. Para uma previamente secos a 120 2C durante 2 horas, em gua
eventual correco da temperatura, recomenda-se seguir as isenta de dixido de carbono R e complete 1000,0 ml com o
instrues do construtor. Calibre o aparelho com a soluo mesmo solvente.
tampo de ftalato cido de potssio (padro primrio) e
uma outra soluo tampo de pH diferente (de preferncia Fosfato monopotssico 0,0087 M + Fosfato dissdico
uma das que figuram no quadro 9). O pH de uma terceira 0,0303 M. Dissolva 1,18 g de KH2PO4 e 4,30 g de Na2HPO4,
soluo tampo de pH intermdio lido na escala no difere previamente secos a 120 2C durante 2 horas, em gua
de mais de 0,05 unidades de pH do valor correspondente a isenta de dixido de carbono R e complete
essa soluo. Mergulhe os elctrodos na soluo problema 1000,0 ml com o mesmo solvente.
e efectue a leitura nas mesmas condies das solues
tampo.
Tetraborato dissdico 0,01 M. Dissolva 3,80 g de Na2B4O7,10H2O
Em caso de utilizao frequente do aparelho, efectue o em gua isenta de dixido de carbono R e complete 1000,0 ml
controlo regularmente. No caso contrrio, indispensvel com o mesmo solvente. Conserve ao abrigo do dixido de
efectu-lo antes de cada determinao. carbono do ar.
Todas as solues a analisar e as solues tampo de referncia
so preparadas com gua isenta de dixido de carbono R. Carbonato de sdio 0,025 M + Bicarbonato de sdio
0,025 M. Dissolva 2,64 g de Na2CO3, e 2,09 g de NaHCO3,
em gua isenta de dixido de carbono R e complete 1000,0 ml
PREPARAO DAS SOLUES TAMPO DE REFERNCIA com o mesmo solvente. Conserve ao abrigo do dixido de
carbono do ar.
Tetraoxalato de potssio 0,05 M. Dissolva 12,61 g de
C4H3KO8,2H2O em gua isenta de dixido de carbono R Hidrxido de clcio, saturado a 25C. Agite um excesso de
e complete 1000,0 ml com o mesmo solvente. hidrxido de clcio R com gua isenta de dixido de carbono

2.2.5. Densidade
R. Deixe decantar a 25C e separe o sobrenadante. Conserve Exprime-se em quilogramas por metro cbico ou em gramas
ao abrigo do dixido de carbono do ar. por centmetro cbico (1 kg m3 103g.cm3). Estas grandezas
esto relacionadas pelas equaes seguintes nas quais a massa
volmica expressa em gramas por centmetro cbico:
CONSERVAO
Conserve as solues em recipientes estanques e quimicamente

2. Mtodos
Analticos
inertes apropriados, por exemplo, frascos de vidro de tipo I

ou recipientes de material plstico apropriados para solues
aquosas.
Determine a densidade ou a massa volmica com o nmero de

2.2.4. CORRESPONDNCIA ENTRE A casas decimais prescrito na monografia usando um picnmetro
(slidos ou lquidos), uma balana hidrosttica (slidos), um
REACO DO MEIO, O pH APROXIMADO aremetro (lquidos) ou um densmetro digital munido de um
E A COLORAO DE ALGUNS captor de tubo oscilante (lquidos e gases). Se a determinao
INDICADORES for feita por pesagem, no considere a flutuabilidade do ar
que pode ser uma causa de erro de 1 unidade na terceira casa
A 10 ml da soluo problema, adicione 0,1 ml do indicador, decimal. Se utilizar um densmetro, a flutuabilidade do ar no
salvo indicao em contrrio do quadro 10. tem nenhuma influncia.
Densmetro munido de um captor de tubo oscilante. O
aparelho constitudo pelos elementos seguintes:
um tubo em U, geralmente de vidro borossilcico que
contm o lquido em ensaio,
um sistema de excitao electromagntica ou piezoelctrica
que faz vibrar o tubo como uma espcie de oscilador a uma
frequncia caracterstica que depende da massa volmica
do lquido em ensaio,
um instrumento de medida do perodo da oscilao (T)
que pode ser convertido pelo aparelho para fornecer uma
leitura directa da massa volmica ou que pode servir para
calcular a massa volmica com o auxlio das constantes A e
B descritas mais adiante.
A frequncia da ressonncia (f) uma funo da constante do
impulso (c) e da massa do sistema (m):
ou
M = massa do tubo,
V = volume interior do tubo.
A introduo das 2 constantes A = c/(4H2 V) e B = M / V
permite obter a equao clssica relativa ao captor de tubo
oscilante:
Determine as constantes A e B enchendo o tubo do aparelho

2.2.5. DENSIDADE em U com 2 amostras diferentes de massa volmica
conhecida como, por exemplo, gua R desgasificada e ar.
t Efectue medidas de controlo quotidianas utilizando a gua
A densidade d t 1 de uma substncia a relao entre
2
a massa de um dado volume dessa substncia a uma R desgasificada. Os resultados obtidos para a medida do
temperatura t1e a massa de igual volume de gua a uma controlo com a gua R desgasificada no devem desviar-
temperatura t2. -se mais do que o erro especfico para o valor de referncia
(20 0,998203 g.cm-3; = 1,000000). Por exemplo, um
Salvo indicao em contrrio, utiliza-se a densidade . aparelho cujo erro especificado em 0,0001 g.cm3 deve
A densidade tambm correntemente expressa em . Pode apresentar 0,9982 0,0001 g.cm-3 para ser apropriado para
igualmente ser utilizada a massa volmica 20, definida como medidas ulteriores. Caso contrrio, torna-se necessrio um
a massa de uma unidade de volume da substncia a 20C. ajustamento. Pratique regularmente uma calibrao com
materiais de referncia certificados. Efectue as determinaes

2.2.7. Poder rotatrio
utilizando o mesmo procedimento que para a padronizao. O poder rotatrio especfico a rotao, expressa em
Se necessrio, equilibre o lquido em ensaio num termostato radiano (rad), medida temperatura t e no comprimento
a 20C antes de o introduzir no tubo, para evitar a formao de onda , provocada por uma camada com 1 metro de
de bolhas e reduzir o tempo necessrio para a determinao. espessura de um lquido ou de uma soluo contendo
Os factores que afectam a exactido da medida so: 1 quilograma de substncia opticamente activa por metro
a uniformidade da temperatura ao longo do tubo, cbico da soluo. Por razes prticas, o poder rotatrio
2. Mtodos
Analticos
especfico expresso correntemente em miliradiano-
a no linearidade num intervalo do valor da massa metros quadrados por quilograma (mrad.m2.kg1).
volmica,
A Farmacopeia adopta as definies convencionais
os efeitos parasitas da ressonncia, seguintes: O ngulo de rotao ptica de um lquido o
a viscosidade que para as solues que tm uma viscosidade ngulo de rotao , expresso em graus (), do plano de
superior viscosidade do padro apresentam um valor da polarizao no comprimento de onda da risca D do sdio
massa volmica superior ao valor real. ( = 589,3 nm) medido a 20C sob a espessura de 1
decmetro. No caso de uma soluo, o mtodo de preparao
Os efeitos da no linearidade e da viscosidade podem ser prescrito na monografia.
evitados utilizando padres com massa volmica e com
O poder rotatrio especfico de um lquido definido
viscosidade prximos dos valores da amostra ( 5 por cento
para a massa volmica, 50 por cento para a viscosidade). pelo ngulo de rotao , expresso em graus (), do plano de
Certos densmetros dispem de funes que permitem a polarizao no comprimento de onda da risca D do sdio
correco automtica da viscosidade e a correco dos erros ( = 589,3 nm) medido a 20C numa soluo da substncia
em ensaio, referido a uma espessura de camada de 1
ligados s variaes da temperatura e da no linearidade.
decmetro e dividido pela massa volmica expressa em
A fidelidade (preciso) funo da repetibilidade e da gramas por centmetro cbico.
estabilidade da frequncia do oscilador que depende da
estabilidade do volume, da massa e da constante de actividade O poder rotatrio especfico de uma substncia em
da clula. soluo definido pelo ngulo de rotao , expresso em
Os densmetros permitem determinaes com um erro da graus (), do plano de polarizao no comprimento de onda
da risca D do sdio ( = 589,3 nm) medido a 20C numa
ordem de 110-3 g.cm-3 a 110-5 g.cm-3 e uma repetibilidade
soluo da substncia em ensaio, referido a uma espessura
de 110-4 g.cm-3 a 110-6 g.cm-3.
de camada de 1 decmetro e concentrao de 1 grama de
substncia por mililitro. O poder rotatrio especfico de
uma substncia em soluo sempre definido em relao a
2.2.6. NDICE DE REFRACO determinado solvente e a uma dada concentrao.
O ndice de refraco de um meio referido ao ar igual No sistema convencional adoptado pela Farmacopeia,
relao entre o seno do ngulo de incidncia de um raio o poder rotatrio especfico expresso pela forma de
luminoso no ar e o seno do ngulo de refraco do raio valor sem unidade; a unidade efectiva, grau-mililitro por
refractado no meio considerado. decmetro e por grama [().ml.dm1.g1] subentendido.
Salvo indicao contrria, o ndice de refraco O factor de converso do Sistema Internacional para o
determinado a 20 0,5C e referido risca D do sdio da Farmacopeia o seguinte:
(589,3 nm); o smbolo ento .
0,1745
Os refractmetros correntes determinam o ngulo limite. =
Nestes aparelhos, a parte essencial um prisma de ndice de

refraco conhecido, em contacto com o lquido em ensaio. Em certos casos indicados expressamente na monografia,
o ngulo de rotao pode ser medido a temperaturas
Calibre o aparelho com o auxlio de materiais de referncia
diferentes de 20C e em outros comprimentos de onda.
certificados.
O polarmetro permite leituras com a aproximao de 0,01.
Se se usa luz branca, o refractmetro est munido de um O controlo da escala do aparelho geralmente efectuado
sistema de compensao. O aparelho d leituras exactas at por meio de lminas de quartzo certificadas. A linearidade
terceira casa decimal, no mnimo, e possui um dispositivo da escala pode ser verificada com o auxlio de solues de
que torna possvel operar temperatura prescrita: o sacarose.
termmetro permite a leitura com a aproximao de, pelo
menos, 0,5C. Mtodo. Determine o zero do polarmetro e o ngulo de
rotao da luz polarizada no comprimento de onda da risca
D do sdio (589,3 nm) a 20 0,5C salvo indicao em
2.2.7. PODER ROTATRIO contrrio. No efectue as medidas a outra temperatura seno
quando a monografia indicar a correco de temperatura
O poder rotatrio a propriedade que apresentam as a aplicar ao poder rotatrio medido. Determine o zero do
substncias quirais de desviar o plano de polarizao da luz aparelho com o tubo fechado, vazio no caso de substncias
polarizada. lquidas, e cheio com o solvente prescrito no caso de
substncias slidas.
O poder rotatrio considerado como positivo (+) para
Calcule o poder rotatrio especfico por meio das
as substncias dextrgiras (isto , as que desviam o plano
frmulas abaixo indicadas.
de polarizao no sentido dos ponteiros do relgio) e
negativo () para as substncias levgiras. Para as substncias lquidas no diludas:

2.2.9. Viscosidade mtodo do tubo capilar
um cronmetro com uma aproximao de 1/5 de segundo.

O resultado s vlido se duas leituras consecutivas no
diferirem de mais de 1 por cento. A mdia de, pelo menos,
trs leituras d o tempo de escoamento do lquido em ensaio.
Para as substncias em soluo:
2. Mtodos
Analticos
em que c a concentrao em g/l do slido na soluo.

As frmulas seguintes permitem calcular o teor (c) em g/l ou
o teor (c) em percentagem m/m de uma substncia
dissolvida:
2.2.8. VISCOSIDADE
A viscosidade dinmica ou coeficiente de viscosidade a
fora tangencial por unidade de superfcie, designada por
tenso cortante e expressa em pascal, necessria para
deslocar paralelamente ao plano de deslizamento uma
camada de lquido de 1 metro quadrado a uma velocidade (v)
de 1 metro por segundo em relao a uma camada paralela
situada distncia (x) de 1 metro.
A relao dv/dx constitui um gradiente de velocidade,
representando a velocidade de corte D expressa em FIGURA 1 Viscosmetro de tubo capilar
segundos recprocos (s-1), de modo que h /D. No Sistema Dimenses em mililitros
Internacional, a unidade de viscosidade dinmica o pascal-
-segundo (Pa.s) sendo o submltiplo mais correntemente Calcule a viscosidade dinmica em milipascal-segundo
utilizado o milipascal-segundo (mPa.s). usando a frmula:
A viscosidade cinemtica v, expressa em metros quadrados k..t
por segundo, obtm-se dividindo a viscosidade dinmica h
pela massa volmica do lquido, expressa em quilogramas k = constante do viscosmetro, expressa em milmetros quadrados
por metro cbico e medida mesma temperatura, v h/. A por segundo quadrado,
viscosidade cinemtica a maior parte das vezes expressa = massa volmica do lquido em ensaio, expressa em miligramas
em milmetros quadrados por segundo. por centmetro cbico, obtida multiplicando a densidade ( )
Pode usar-se um viscosmetro de tubo capilar para a por 0,9982,
determinao da viscosidade de lquidos newtonianos e um
t = tempo de escoamento, em segundos, do lquido em ensaio.
viscosmetro rotativo para a determinao da viscosidade de
lquidos newtonianos e no-newtonianos. A constante k determinada usando um lquido de referncia
Alm dos viscosmetros abaixo descritos, podem ser utilizados para a calibrao de viscosmetros.
outros, desde que a exactido e a preciso no sejam Para calcular a viscosidade cinemtica (mm2.s1), usa-se a
inferiores s obtidas com aqueles. frmula v k.t.
As determinaes so efectuadas com um aparelho
apropriado, tendo as caractersticas mencionadas no quadro
2.2.9. VISCOSIDADE MTODO n 11(1).
DO TUBO CAPILAR O tempo de escoamento mnimo de 350 s para o tamanho
n 1 e de 200 s para todos os outros.
A determinao da viscosidade usando um viscosmetro de
tubo capilar efectuada a 20 0,1C, se no for indicada
outra temperatura. O tempo necessrio para que o nvel do (1) Descreve-se o sistema proposto pela Organizao Internacional de
lquido desa de uma marca a outra medido por meio de Normalizao (ISO).

2.2.10. Viscosidade mtodo do viscosmetro rotativo
Mtodo. Introduza no viscosmetro atravs do tubo L uma VISCOSMETROS DE CILINDROS CONCNTRICOS

quantidade de lquido em ensaio, levado previamente a 20C (VISCOSMETRO ABSOLUTO)
se no houver outra indicao, necessria para encher a
dilatao A, mas tendo o cuidado de que o nvel do lquido
na dilatao B fique abaixo da sada do tubo de ventilao M.
Mergulhe o viscosmetro num banho de gua a 20 0,1C, se
no for indicada outra temperatura, mantenha-o na posio
2. Mtodos
Analticos
vertical durante, pelo menos, 30 min que seja atingido o
equilbrio trmico.
FIGURA 1
Feche o tubo M e faa subir o nvel do lquido no tubo N at

cerca de 8 mm acima da marca E. Mantenha o lquido neste
nvel, fechando o tubo N, e abra o tubo M. Abra em seguida
o tubo N e determine o tempo necessrio para que o nvel do
lquido desa da marca E at marca F.
2.2.10. VISCOSIDADE MTODO

DO VISCOSMETRO ROTATIVO
PRINCPIO
FIGURA 2
O mtodo consiste em determinar a fora (binrio) que se exerce
sobre um corpo posto em rotao num lquido a uma velocidade
angular (velocidade de rotao) constante. Os viscosmetros Nos viscosmetros de cilindros concntricos (ou coaxiais), o
rotativos (ou de corpo mvel) permitem determinar a lquido cuja viscosidade se pretende determinar introduzido
viscosidade de lquidos newtonianos (cuja viscosidade no espao entre o cilindro interno e o cilindro externo. Para
independente do corte) ou no newtonianos (cuja viscosidade determinar a viscosidade, pode pr-se em rotao o cilindro
dependente do corte, designada viscosidade aparente). Podem interno (viscosmetros tipo Searle, ver figura 1), ou o cilindro
dividir-se em 2 grupos: os viscosmetros de tipo absoluto e os externo (viscosmetros tipo Couette, ver figura 2). Em regime de
de tipo relativo. Nos viscosmetros absolutos, dada a geometria escoamento laminar, a viscosidade (ou a viscosidade aparente)
de determinao adoptada, o escoamento bem definido; os expressa em pascal.segundos, dada pela seguinte frmula:
resultados so os valores absolutos da viscosidade e podem
ser comparados a outros valores absolutos. Nos viscosmetros
relativos, pela geometria de determinao que possuem, o
escoamento no bem definido; os resultados so valores
relativos da viscosidade e no possvel a sua comparao com
os valores absolutos nem com outros valores relativos que no M = binrio exercido na superfcie do cilindro, em newton-metros,
tenham sido determinados pelo mesmo mtodo viscosimtrico.
= velocidade angular, em radianos por segundo,
Existem diferentes sistemas para determinao podendo
h = profundidade de imerso do cilindro interno no meio lquido,
trabalhar-se com certas viscosidades e com diferentes
em metros,
velocidades de rotao.
Ri = raio do cilindro interno, em metros,
APARELHAGEM Ro = raio do cilindro externo, em metros,
Os tipos de aparelhos a seguir descritos so os mais usados. k = constante do viscosmetro, em radianos por metro cbico.

2.2.10. Viscosidade mtodo do viscosmetro rotativo
No caso dos lquidos no newtonianos, essencial precisar

por qual dos parmetro, tenso de corte ou velocidade
de corte , a viscosidade determinada. Quando se
trabalha em condies de espao muito limitado (como as
condies dos viscosmetros absolutos), existem relaes de
proporcionalidade entre M e e entre e :
2. Mtodos
Analticos
AM B
onde A e B so 2 constantes do viscosmetro cujas expresses

so dadas pelas seguintes relaes:
para os cilindros concntricos:
FIGURA 3
para os cone-prato:
M = binrio exercido na superfcie do cilindro do prato ou do cone,

em newton-metros,
= velocidade angular, em radianos por segundo,
Ri = raio do cilindro interno, em metros,
FIGURA 4
R0 = raio do cilindro externo, em metros,
R = raio do cone, em metros,
h = profundidade de imerso do cilindro interno no meio lquido, VISCOSMETROS DE AGULHA (VISCOSMETRO RELATIVO)
em metros,
Nos viscosmetros de agulha, pe-se em rotao no
= ngulo formado pelo prato e pelo cone, em radianos, lquido cuja viscosidade se pretende determinar, uma
= tenso de corte, em Pascal (Pa), agulha, por exemplo em forma de cilindro ou de disco
(ver figura 5 e 6 respectivamente). Os valores relativos
= velocidade de corte em segundos recprocos (s-1). da viscosidade (ou viscosidade aparente) so calculados
directamente por intermdio de factores de converso
a partir da leitura na escala, para dada velocidade
VISCOSMETRO CONES-PRATO (VISCOSMETRO ABSOLUTO)
de rotao. De um modo geral, a constante do
viscosmetro pode ser determinada a diversas velocidades
Nos viscosmetros cone-prato, o lquido introduzido no de rotao, usando um lquido certificado para aferio
espao que separa um disco plano (prato) e um cone, que dos viscosmetros. A viscosidade obtida atravs da
formam entre eles um ngulo definido. Para determinar a relao seguinte:
viscosidade, pe-se em rotao o cone ou o prato (ver figuras
3 e 4, respectivamente). Em regime de escoamento laminar, = M

a viscosidade (ou a viscosidade aparente), expressa em pascal.
segundos, dada pela seguinte frmula: respectivamente).
MTODO
Determine a viscosidade (ou a viscosidade aparente) de

acordo com as instrues do viscosimetro rotativo. A
M = binrio exercido na superfcie do prato ou do cone, em temperatura para a determinao da viscosidade indicada
newton-metros, na monografia. Para os sistemas no newtonianos, a
= velocidade angular, em radianos por segundo, monografia indica o tipo de viscosmetro a usar e, no
caso dos viscosmetros absolutos, a velocidade angular
= ngulo formado pelo prato e pelo cone, em radianos, ou a velocidade de corte a aplicar. Se impossvel obter
exactamente a velocidade de corte indicada, aplique um valor
R = raio do cone, em metros,
ligeiramente superior e um valor ligeiramente inferior e faa
k = constante do viscosmetro, em radianos por metro cbico. uma interpolao.
A e B so constantes do viscosmetro (ver em Viscosmetros No caso do viscosmetro relativo, a velocidade de corte na
de cilindros concntricos). amostra no homognea, sendo impossvel

2.2.12. Ponto de ebulio
defini-la. Nestas condies, se o lquido no newtoniano, a Aparelho. O aparelho (ver figura 2) constitudo por um
viscosidade determinada pela aplicao da relao anterior, balo de destilao (A), um refrigerante tubiforme (B) que
possui uma caracterstica relativa, que depende da natureza se adapta ao tubo lateral do balo e uma alonga curva (C)
da agulha, da velocidade angular e das dimenses do fixada na extremidade do tubo do refrigerante. A extremidade
recipiente ( = 80 mm, no mnimo) que contm a amostra e inferior do tubo do refrigerante pode tambm ser alongada e
a profundidade de imerso da agulha. Os valores obtidos no encurvada, substituindo a alonga. No colo do balo insere-se
so comparveis se no se trabalhar exactamente nas mesmas um termmetro, de forma a que a extremidade superior do
2. Mtodos
Analticos
condies experimentais. reservatrio de mercrio se localize 5 mm abaixo do ponto
de juno da parede inferior do tubo lateral. A escala do
termmetro graduada em 0,2C e abrange um intervalo
de cerca de 50C. Durante a determinao, utiliza-se um
anteparo, de forma a proteger o balo e o seu colo de
correntes de ar.
Mtodo. Introduza no balo (A) 50,0 ml da amostra e alguns
fragmentos de um material poroso. O destilado recolhido
numa proveta de 50 ml graduada em 1 ml. O arrefecimento
por circulao de gua indispensvel para os lquidos que
destilam abaixo de 150C. Aquea rapidamente ebulio
e observe a temperatura qual a primeira gota de destilado
cai na proveta. Regule o aquecimento de forma a que
o lquido destile velocidade constante de 2 a 3 ml por
minuto. Registe a temperatura quando a totalidade ou a
fraco prescrita do lquido, medida temperatura de 20C,
tenha destilado.
Corrija as leituras em funo da presso atmosfrica,
utilizando a frmula:
t1 t2 k (101,3 b)
t1 = temperatura corrigida,
FIGURA 5
t2 = temperatura observada presso atmosfrica b,

k = factor de correco (ver quadro 13), a menos que este factor
no seja considerado,
b = presso atmosfrica, expressa em quilopascals, durante a
destilao.
QUADRO 12 Correco da temperatura em funo da presso
Temperatura de destilao Factor de correco k
at 100C 0,30
acima de 100C e at 140C 0,34
acima de 240C 0,45
2.2.12. PONTO DE EBULIO

O ponto de ebulio a temperatura corrigida qual
a presso de vapor de um lquido igual a 101,3 kPa.
Aparelho. O aparelho o utilizado na determinao do
intervalo de destilao (2.2.11), exceptuando o facto de o
termmetro se encontrar colocado de forma a que a parte
FIGURA 6 inferior do reservatrio de mercrio se encontre ao nvel
do bordo inferior do colo do balo de destilao, o qual est
colocado sobre uma placa de um material isolante com um
orifcio de 35 mm de dimetro.
2.2.11. INTERVALO DE DESTILAO
Mtodo. No balo (A) introduza 20 ml da amostra e alguns
O intervalo de destilao o intervalo de temperaturas, fragmentos de um material poroso. Aquea de forma a atingir
corrigidas para 101,3 kPa (760 Torr) no qual um lquido rapidamente o ponto de ebulio e observe a temperatura
ou uma determinada fraco de um lquido, destila nas qual o lquido comea a escoar-se do tubo lateral do balo
condies descritas seguidamente. para o refrigerante.

2.2.13. Determinao da gua por arrastamento

2. Mtodos
Analticos
Corrija a temperatura observada em funo da presso durante cerca de 15 min. Quando o tolueno comear a ferver,
atmosfrica, utilizando a frmula: regule o aquecimento de forma a que a velocidade de destilao
corresponda a cerca de 2 gotas por segundo at que a maior
t1 t2 k (101,3 b) parte da gua seja arrastada e depois aumente a velocidade de
destilao at 4 gotas por segundo. Quando toda a gua tiver
t1 = temperatura corrigida, destilado, introduza no refrigerante cerca de 10 ml de tolueno R,

t2 = temperatura observada presso atmosfrica b,

k = factor de correco (ver quadro 13 em Intervalo de
destilao),
b = presso atmosfrica, expressa em quilopascals, durante a
determinao.
2.2.13. DETERMINAO DA GUA

POR ARRASTAMENTO
Aparelho. O aparelho constitudo por um balo de vidro (A)
ligado a um dispositivo, tambm de vidro, constitudo por
trs partes: um tubo encurvado (D), uma cabea cilndrica
(B) e outro tubo, graduado em 0,1 ml (E), servindo de
colector. Ao topo da parte B liga-se um refrigerante de refluxo
(C). O balo (A) aquecido de preferncia numa manta
elctrica munida de um restato ou num banho de leo. A
parte superior do balo e o tubo de ligao encurvado podem
ser isolados.
Mtodo. Lave cuidadosamente o balo, o tubo colector e o
refrigerante, passe-os por gua e seque-os.
Introduza no balo 200 ml de tolueno R e cerca de 2 ml de
gua R; destile durante 2 h, deixe arrefecer durante cerca de
30 min e leia o volume de gua arrastada, com a aproximao,
por estimativa, de 0,05 ml. Desmonte o balo e introduza uma
quantidade da amostra, pesada com a aproximao de 1 por
cento, susceptvel de conter 2 a 3 ml de gua, aproximadamente.
Se se tratar de uma substncia pastosa, pese-a numa naveta
constituda por uma folha metlica ou num pequeno recipiente
de vidro. Introduza alguns fragmentos de um material poroso, FIGURA 3 Aparelho para a determinao da gua por
adapte o balo ao dispositivo e aquea a temperatura baixa arrastamento (Dimenses em milmetros)

2.2.16. Ponto de fuso mtodo da fuso instantnea
de modo a lavar as suas paredes. Continue a destilao durante 2.2.15. PONTO DE FUSO MTODO
mais 5 min, remova o sistema de aquecimento e arrefea o
dispositivo de que faz parte o colector at temperatura do DO TUBO CAPILAR ABERTO
laboratrio, fazendo deslocar, com uma vareta, quaisquer
gotculas de gua aderentes s paredes. Aps separao Para certas substncias o mtodo seguinte aplicado para
completa da gua e do tolueno, leia o volume da gua e determinar o ponto de fuso.
calcule a sua percentagem na amostra utilizando a expresso: Utilize tubos capilares de vidro, abertos nas duas
2. Mtodos
Analticos
extremidades, com cerca de 80 mm de comprimento, 1,4
a 1,5 mm de dimetro externo e 1,0 a 1,2 mm de dimetro
interno.
m = massa da amostra, em gramas, Em 5 destes tubos introduza a substncia, previamente
tratada de acordo com as condies prescritas, em
n1 = nmero de mililitros de gua obtidos na primeira destilao,
quantidades suficientes para formarem, em cada tubo,
n2 = nmero total de mililitros de gua obtidos nas duas colunas com cerca de 10 mm de altura. Mantenha os tubos
destilaes. temperatura e durante o tempo indicados.
Salvo indicaes em contrrio, as substncias de consistncia
cerosa so fundidas em banho de gua, com precauo e
2.2.14. PONTO DE FUSO MTODO completamente, antes de serem introduzidas nos tubos
DO TUBO CAPILAR capilares. Deixe em repouso os tubos a 2-8C durante 2 h.
Fixe um dos tubos a um termmetro graduado em 0,2C,
O ponto de fuso determinado pelo mtodo do tubo capilar de forma a que a substncia esteja prxima do reservatrio
corresponde temperatura qual passa ao estado lquido a de mercrio. Introduza o termmetro e o tubo capilar
ltima partcula slida da substncia introduzida num tubo num recipiente cilndrico de forma a que a distncia entre
em coluna compacta. o fundo deste e a extremidade do reservatrio de mercrio
seja de 1 cm. Introduza gua no recipiente, at 5 cm do
Se a monografia o prescrever, o mesmo aparelho e o mesmo
fundo. Aumente progressivamente a temperatura da gua,
mtodo sero utilizados na determinao de outros factores,
velocidade de 1C por minuto.
tais como a formao do menisco ou o intervalo de fuso, que
caracterizam o comportamento de fuso da substncia. A temperatura qual a substncia comea a elevar-se no tubo
capilar considerada como a temperatura de fuso.
O aparelho constitudo por:
Repita a operao com cada um dos 4 tubos capilares
um vaso de vidro apropriado contendo o lquido do banho
restantes e calcule o resultado, considerando a mdia das 5
(por exemplo: gua, parafina lquida ou leo de silicone) e
um dispositivo de aquecimento apropriado, leituras.
um dispositivo de agitao mecnica que permita assegurar

a uniformidade da temperatura do banho, 2.2.16. PONTO DE FUSO MTODO
um termmetro adequado graduado em intervalos que DA FUSO INSTANTNEA
no ultrapassem 0,5C, munido de uma marca de imerso;
a gama de temperaturas visvel no termmetro no O ponto de fuso instantnea dado pela expresso
superior a 100C,
tubos capilares de vidro de elevada resistncia trmica e t1 + t2
isento de lcali, com um dimetro interno de 0,9 a 2,
1,1 mm, com parede de 0,10 a 0,15 mm de espessura,
em que t1 e t2 correspondem s temperaturas fixadas nas
fechados numa extremidade.
condies abaixo indicadas.
Mtodo. Salvo indicao em contrrio na monografia,
Aparelho. O aparelho constitudo por um bloco de metal
seque a substncia finamente pulverizada a presso
reduzida e sobre gel de slica anidra R durante 24 horas. ou uma liga metlica inatacvel (lato, por exemplo),
Num tubo capilar introduza uma quantidade suficiente bom condutor do calor e cuja face superior, plana,
para formar uma coluna compacta com uma altura de cuidadosamente polida. O bloco aquecido uniformemente
4 a 6 mm. Aquea at atingir uma temperatura cerca de em toda a sua extenso por intermdio de um sistema de
10C abaixo do ponto de fuso presumvel e regule em microchamas de gs ou de um dispositivo elctrico que
seguida a velocidade de aquecimento para 1C por minuto, permita uma regulao exacta da temperatura. O bloco
aproximadamente. Quando a temperatura for inferior possui uma cavidade cilndrica de dimetro suficiente para
em cerca de 5C ao ponto de fuso esperado, introduza conter um termmetro, que se mantm mesma altura
correctamente o tubo capilar no aparelho. No caso do durante a calibrao do aparelho e a determinao do ponto
dispositivo descrito acima, coloque o tubo capilar de modo de fuso da amostra. A cavidade cilndrica paralela face
que a sua extremidade fechada se encontre a meia altura polida superior do bloco e est colocada a cerca de 3 mm
do reservatrio de mercrio e que o trao de referncia desta. O aparelho calibrado com substncias de referncia
de imerso do termmetro esteja ao nvel da superfcie apropriadas, de ponto de fuso conhecido.
do lquido. Anote a temperatura qual a ltima partcula
Mtodo. Aquea o bloco rapidamente at uma temperatura
passa ao estado lquido.
inferior em cerca de 10C ao ponto de fuso esperado. Regule
Calibrao do aparelho. O aparelho pode ser calibrado seguidamente a velocidade de aquecimento, de forma a que
utilizando substncias de referncia para o ponto de fuso, esta corresponda ao aumento de 1C por min; com intervalos
tais como as da Organizao Mundial de Sade ou outras de tempo regulares, coloque no bloco, na proximidade do
substncias apropriadas. reservatrio do termmetro e limpando a superfcie depois

2.2.17. Ponto de gotejamento
de cada ensaio, algumas partculas da amostra pulverizada

e, quando indicado, previamente seca, preparada como
no mtodo do tubo capilar. Registe a temperatura t1 a que
a substncia funde instantaneamente aps o primeira
contacto com o metal. Suspenda o aquecimento. Durante o
arrefecimento, coloque no bloco, com intervalos de tempo
regulares, algumas partculas da substncia, limpando a
2. Mtodos
Analticos
superfcie metlica aps cada ensaio. Registe a temperatura

t2 qual a substncia deixa de fundir instantaneamente aps
contactar com o metal.
Calibrao do aparelho. O aparelho pode ser calibrado
utilizando substncias padro para ponto de fuso, como
as da Organizao Mundial de Sade ou outras substncias
apropriadas.
2.2.17. PONTO DE GOTEJAMENTO

O ponto de gotejamento a temperatura qual, em
condies definidas, a primeira gota da amostra fundida se
desprende de um receptculo cncavo.
Se a monografia no indicar o mtodo a utilizar, usa-se o
mtodo A. Qualquer alterao do mtodo A para o mtodo B
tem de ser objecto de uma validao.
FIGURA 1 Aparelho para a determinao do ponto de gotejamento.
MTODO A
atingir um valor inferior em cerca de 10C ao ponto de gota
esperado, regule a velocidade de aquecimento para cerca
Aparelho. O aparelho constitudo (ver figura 1) por duas de 1C por minuto. Registe a temperatura no momento
bainhas metlicas (A) e (B) aparafusadas uma outra. em que se desprende a primeira gota. Efectue, pelo menos,
A bainha (A) fixada a um termmetro de mercrio. trs determinaes, renovando as amostras em cada uma.
Um receptculo metlico cncavo (E) encontra-se ligado A diferena entre os valores encontrados no superior a
parte inferior da bainha metlica (B) por intermdio de 3C. A mdia das trs temperaturas corresponde ao ponto de
duas linguetas mveis (E). Dois suportes (D) com 2 mm de gotejamento da substncia.
comprimento condicionam a posio exacta do receptculo
cncavo e a adaptao, bem centrada, do termmetro. Um
orifcio (C), existente na parede (B), permite o equilbrio da MTODO B - MTODO AUTOMATIZADO
presso. A superfcie de escoamento do receptculo cncavo
plana e os bordos do orifcio de sada formam com ele Aparelho. O aparelho (ver figura 2) constitudo por um
ngulos rectos. A parte inferior do termmetro tem a forma cartucho composto por um porta-amostras no qual a cpula
e as dimenses indicadas na figura; permite leituras de da amostra fixada de forma amovvel e por uma manga
0 a 110C e, correspondendo a 1C na escala, a distncia colectora munida de uma fenda luminosa horizontal fixada sob
de 1 mm. O reservatrio de mercrio tem o dimetro de a cpula. Este conjunto colocado num bloco de aquecimento.
3,5 0,2 mm e a altura de 6,0 0,3 mm. O conjunto O bloco um cilindro metlico atravessado por um orifcio
do aparelho, colocado no eixo de um tubo de ensaio com cilndrico axial no qual colocado o cartucho. Uma sonda de
cerca de 200 mm de comprimento e com cerca de 40 mm temperatura colocada num outro orifcio cilndrico mais
de dimetro externo, encontra-se fixado a este tubo por estreito ao nvel da cpula da amostra. O bloco de aquecimento
intermdio de uma rolha com uma ranhura lateral e rodeado por um sistema de aquecimento elctrico. Uma
atravessada pelo termmetro. O orifcio do receptculo lmpada montada sob o bloco de aquecimento de modo a
cncavo encontra-se a 15 mm do fundo do tubo de ensaio. permitir a passagem de um feixe luminoso atravs da manga
O conjunto introduzido num copo, de cerca de 1 litro, cheio colectora e da fenda luminosa at um captor ptico em posio
de gua. O fundo do tubo de ensaio encontra-se a cerca de oposta. O sistema de aquecimento permite manter o bloco de
25 mm do fundo do copo. O nvel da gua atinge a parte aquecimento a uma temperatura exacta pr-definida e de o
superior da bainha metlica (A). Utiliza-se um agitador para aquecer a uma velocidade pr-definida exacta e regular aps
assegurar a homogeneidade da temperatura do banho. um perodo inicial isotrmico.
Mtodo. Prepare a amostra de acordo com as instrues da Mtodo. Funda a amostra e introduza-a na cpsula de acordo
monografia. Encha completamente o receptculo cncavo com as prescries da monografia. Proceda de seguida como se
com a amostra. Retire, com uma esptula, qualquer poro indica a seguir ou segundo as instruces do fabricante. Elimine
da substncia que exceda os bordos do receptculo. Fixadas com uma esptula o excesso de material nas
as bainhas (A e B), faa penetrar o receptculo no lugar 2 extremidades da cpula. Antes de efectuar a determinao,
apropriado da bainha (B), at atingir os suportes. Retire, com execute as especificaes de acondicionamento da amostra
uma esptula, a substncia deslocada pelo termmetro (temperatura e durao) prescritas na monografia. Introduza
Coloque o aparelho no banho de gua, nas condies acima a cpula no porta-amostras e fixe a manga colectora sobre a
descritas. Aquea o banho e, quando a temperatura cpula. Coloque o conjunto com o cartucho assim formado no

2.2.19. Titulaes amperomtricas
bloco de aquecimento. Ajuste o instrumento para as condies Calcule a temperatura mdia corrigida T2 usando a expresso
isotrmicas iniciais e regule a velocidade de aquecimento
posterior, de acordo com as prescries da monografia referente T1 F
amostra. Inicie o programa de temperatura. Quando a
primeira gota da amostra fundida cai atravs do orifcio situado T1 = temperatura mdia do ponto de gota das 3 amostra, em C,
no fundo da cpula da amostra, o feixe luminoso interrompido F = factor de correco aplicado para compensar a diferena de
e o sinal emitido pelo captor ptico provoca o registo automtico
2. Mtodos
Analticos
temperatura entre a amostra e o ponto do bloco de aquecimento
da temperatura do bloco de aquecimento. onde determinada a temperatura. Este factor varia segundo
Calibrao. Utilize o aparelho de acordo com as instruces o modelo de instrumento automtico de medida do ponto de
gotejamento e fornecido pelo fabricante.
do fabricante e efectue as operaes de calibrao prescritas
e os ensaios de eficcia do sistema com intervalos regulares, Tendo em conta o gotejamento T0 da substncia de
segundo a utilizao do aparelho e as substncias a ensaiar. O referncia certificada, a preciso da escala das temperaturas
cido benzico e a benzofenona so geralmente certificadas satisfatria se |T2 T0| no ultrapassar 0,3 C.
como substncias de referncia.
Podem ser usadas outras substncias na condio de no
apresentarem polimorfismo. 2.2.18. PONTO DE SOLIDIFICAO
Proceda como indicado a seguir ou de acordo com as O ponto de solidificao a temperatura mxima atingida
instrues do fabricante. Prepare 3 cpulas da amostra no decurso da solidificao de um lquido no estado de
para cada uma das 2 substncias de referncia certificadas. sobrefuso.
Coloque as cpulas sobre uma superfcie prpria. Introduza Aparelho. O aparelho (ver figura 1) constitudo por um tubo
uma pequena quantidade da amostra nas cpulas e de ensaio com cerca de 25 mm de dimetro externo e 150 mm
calque-as com a ajuda de uma vareta de cerca de 4,5 mm de comprimento, colocado no interior de um outro tubo,
de dimetro. Verifique que a abertura fica completamente com cerca de 40 mm de dimetro externo e 160 mm
cheia. Encha cerca de metade da cpula com a amostra e de comprimento. O tubo interior fechado com uma
comprima com uma vareta de cerca de 9 mm de dimetro. rolha munida de um termmetro com cerca de 175 mm de
Encha completamente a cpula e comprima a amostra. Junte comprimento, graduado em 0,2C, e fixado de forma a que o
e comprima a quantidade de amostra necessria para encher reservatrio se encontre a cerca de 15 mm do fundo do tubo.
completamente a cpula. Programe a temperatura para o A rolha possui ainda um orifcio que permite o deslocamento
cido benzico: temperatura inicial = 118,0C, velocidade da haste de um agitador de vidro ou de outro material
de aquecimento = 0,2C/min e temperatura final de 126,0C. apropriado, numa extremidade da qual existe um anel com
Aps a cpula atingir 118 C, programe um tempo de espera cerca de 18 mm de dimetro, cuja superfcie perpendicular
de 30 s antes de iniciar o aquecimento. haste. O conjunto dos dois tubos mantido no centro de
um copo de 1 litro, contendo um lquido de refrigerao
Programa de temperatura para a benzofenoma: temperatura apropriado, at altura de 20 mm do topo. No lquido de
inicial = 44,0C, velocidade de aquecimento = 0,2C/min refrigerao mergulha ainda um termmetro.
e temperatura final = 56,0C. Aps a cpula atingir 44 C, Mtodo. Introduza no tubo interior uma quantidade
programe um tempo de espera de 30 s antes de iniciar o suficiente da amostra no estado lquido ou previamente
aquecimento. Verifique os 3 resultados individuais: o ensaio fundida, de forma a que o reservatrio do termmetro fique
s vlido se os 3 resultados no se afastarem mais de 0,3C completamente coberto. Provocando um arrefecimento
do valor mdio. rpido, determine o ponto de solidificao aproximado.
Mergulhe, seguidamente, o tubo interior num banho
cuja temperatura seja superior em cerca de 5C ao valor
encontrado e mantenha-o mergulhado at que funda a
quase totalidade dos cristais ou massas formadas. Substitua
o lquido do copo por gua ou por uma soluo saturada de
cloreto de sdio, cuja temperatura seja inferior, em cerca de
5C, ao ponto de solidificao esperado. Introduza o tubo
interior no tubo exterior, assegurando-se da existncia de
alguns cristais ou de pequenos fragmentos, mergulhe o
conjunto no banho e agite energicamente at que se verifique
a solidificao. Registe a temperatura mais elevada que se
verificar no decurso da solidificao.
2.2.19. TITULAES AMPEROMTRICAS

Durante uma titulao amperomtrica o ponto de
A. cpula da amostra D. fonte luminosa G. amostra K. sonda de temperatura equivalncia determinado seguindo a variao de
intensidade da corrente, determinada entre dois elctrodos
B. bloco de aquecimento E. cartucho H. captor ptico
(um elctrodo indicador e um elctrodo de referncia ou dois
C. fonte luminosa F. sistema de J. manga colectora elctrodos indicadores) mergulhados na soluo a analisar
aquecimento e que se mantm a uma diferena de potencial constante,
em funo da quantidade de soluo titulada adicionada. O
FIGURA 2 Exemplo de aparelho de medida automtico potencial do elctrodo de medida tal que assegure uma
do ponto de gortejamento corrente de difuso da substncia electroactiva.

2.2.21. Fluorimetria
Aparelho. O aparelho constitudo por uma fonte de 2.2.20. TITULAES

corrente de tenso regulvel e um microampermetro
sensvel; o sistema de deteco geralmente constitudo por POTENCIOMTRICAS
um elctrodo indicador (de platina, de gota de mercrio,
giratrio ou de carbono) e um elctrodo de referncia (de Durante uma titulao potenciomtrica o ponto de
equivalncia determinado seguindo a variao da diferena
calomelanos ou de prata-cloreto de prata).
de potencial entre 2 elctrodos (um elctrodo indicador e
2. Mtodos
Analticos
Pode ser utilizada uma montagem com 3 elctrodos, um elctrodo de referncia ou 2 elctrodos indicadores)
constituda por um elctrodo indicador e um mergulhados na soluo a analisar, em funo da quantidade
elctrodo auxiliar, portadores da corrente e por um da soluo titulada adicionada.
elctrodo de referncia. Aparelho. O aparelho utilizado (potencimetro simples ou
aparelhos com circuitos electrnicos) inclui um voltmetro
Mtodo. Regule o potencial do elctrodo indicador que permite uma medida de 1 mV.
segundo as instrues da monografia e inscreva num
grfico a intensidade inicial da corrente e os valores A escolha do elctrodo indicador funo da natureza
obtidos de seguida em funo da quantidade de soluo das substncias a dosear: elctrodo de vidro ou elctrodo
titulada adicionada. Junte por 3 vezes, pelo menos, um metlico (platina, ouro, prata, mercrio, etc.). O elctrodo de
referncia geralmente um elctrodo de calomelanos ou um
volume total de soluo titulada correspondente a cerca de elctrodo de prata-cloreto de prata.
80 por cento do volume terico correspondente ao ponto
de equivalncia da reaco. Os 3 valores obtidos situam-se Nas titulaes cido-base, e salvo indicao em contrrio
sobre uma linha recta. Ultrapasse o ponto de equivalncia na monografia, pode utilizar-se um sistema de elctrodos
de vidro/calomelanos ou de vidro/prata-cloreto de prata.
e determine os valores de intensidade da corrente
correspondentes a, pelo menos, 3 quantidades sucessivas Se necessrio neutralize a mistura solvente antes da
de soluo titulada. Os 3 valores obtidos tambm se situam dissoluo da substncia a ser testada.
sobre uma linha recta. Prolongue os 2 ramos um de Mtodo. Se necessrio neutralize a mistura solvente antes da
encontro ao outro. O ponto de interseco corresponde ao dissoluo da substncia a ser tratada. Inscreva num grfico
ponto de equivalncia. as variaes de potencial em funo da quantidade de soluo
titulada adicionada, continuando a adio at ao ponto de
No caso de uma titulao amperomtrica com 2 elctrodos equivalncia terico da reaco. O ponto de equivalncia
indicadores, convm registar a totalidade da curva de corresponde a uma variao brusca do potencial.
titulao e utilizar esta para determinar o ponto de
equivalncia.
2.2.21. FLUORIMETRIA
A fluorimetria um mtodo que utiliza a medio da
intensidade da luz fluorescente emitida pela substncia
a analisar em relao emitida por um padro
determinado.
Mtodo. Dissolva a substncia no solvente ou na mistura de
solventes indicada na monografia, introduza a soluo na
tina ou no tubo do fluormetro e ilumine com luz excitadora
tanto quanto possvel monocromtica, cujo comprimento de
onda indicado na monografia.
Mea a intensidade da luz emitida sob um ngulo de 90
em relao direco da luz incidente, depois de a ter feito
atravessar um filtro que retenha a luz incidente e deixe passar
a radiao de fluorescncia. Podem ser utilizados outros
tipos de equipamento, desde que conduzam a resultados
idnticos. Para anlise quantitativa, introduza primeiramente
no aparelho o solvente ou a mistura de solventes utilizada
para dissolver a amostra. Acerte o instrumento em zero,
introduza a soluo de referncia e regule a sensibilidade
do instrumento de modo que a leitura ultrapasse o valor
central da escala. Depois de ter efectuado o segundo acerto
ajustando a largura das fendas, proceda a um novo acerto do
zero e a uma nova medio da intensidade de fluorescncia
da soluo de referncia. Finalmente, introduza a soluo de
concentrao desconhecida e leia o valor indicado na escala
do instrumento. Calcule a concentrao Cx da soluo por
meio da frmula:
Cx = concentrao da soluo problema,

Cr = concentrao da soluo de referncia,
FIGURA 1 Aparelho para a determinao do ponto de solidificao lx = intensidade da luz emitida pela soluo problema,

Dimenses em milmetros lr = intensidade da luz emitida pela soluo de referncia.

2.2.22. Espectrometria de emisso atmica
Quando a intensidade de fluorescncia no rigorosamente tomadas as precaues necessrias para que o solvente no
proporcional concentrao, a determinao pode ser feita afecte a estabilidade da chama.
a partir de uma curva de calibrao.
Em certos casos, a medio pode ser feita em relao a um INTERFERNCIAS
padro fixo (por exemplo, um vidro fluorescente ou uma
soluo de outra substncia fluorescente). A concentrao Para reduzir ou eliminar as interferncias espectrais,
2. Mtodos
Analticos
da substncia a analisar ser ento determinada a partir necessrio seleccionar uma risca de emisso apropriada
de uma curva de calibrao estabelecida nas mesmas medio, ou ajustar a fenda que determina a largura da banda
condies. espectral. As interferncias fsicas so corrigidas diluindo
a soluo problema, adaptando a matriz, ou utilizando o
mtodo das adies de padro. A reduo de interferncias
qumicas possvel recorrendo a modificadores qumicos ou
2.2.22. ESPECTROMETRIA a tampes de ionizao.
DE EMISSO ATMICA
PRINCPIO GERAL EFEITO DE MEMRIA
A emisso atmica o fenmeno observado quando uma Para limitar o efeito de memria que resulta do depsito
radiao electromagntica emitida por tomos ou ies do analito no aparelho, conveniente efectuar lavagens
excitados. Em espectrometria de emisso atmica, a amostra minuciosas entre os registos, diluir (se possvel) as solues a
submetida a temperaturas suficientemente elevadas para causar analisar para reduzir o teor em sais e aspirar as solues to
rapidamente quanto possvel.
no s a dissociao em tomos, mas tambm para originar
quantidades de excitao colisional e a ionizao dos tomos da
amostra. Uma vez que os tomos e os ies estejam nos estados MTODO
excitados, podem retomar os nveis de energia inferiores atravs
de transies energticas trmicas ou radioactivas que so recomendvel utilizar material de plstico, sempre que
acompanhadas de emisso de radiao electromagntica. O possvel.
espectro de emisso de um elemento contm muitas mais riscas
do que o espectro de absoro correspondente. Utilize o espectrmetro de emisso atmica de acordo com
as instrues do fabricante, trabalhando no comprimento
A espectrometria de emisso atmica uma tcnica de de onda prescrito. Optimize as condies experimentais
determinao da concentrao de um elemento numa (temperatura da chama, altura do queimador, utilizao de
amostra atravs da medio da intensidade de uma das riscas um tampo inico, concentrao das solues) em funo do
de emisso do vapor atmico do elemento gerado a partir da elemento a dosear e da matriz da amostra.
amostra. A medio efectuada no comprimento de onda
Introduza a soluo que constitui o branco no dispositivo
correspondente a esta risca de emisso.
de anlise e ajuste a leitura em zero, ou no valor do branco.
O presente captulo trata apenas a atomizao da chama. O Introduza seguidamente a soluo padro de concentrao
mtodo de espectrometria de emisso atmica utilizando uma mais elevada e regule a sensibilidade de modo a obter uma
fonte de plasma (ICP-ASE) est descrito noutro captulo geral. leitura apropriada.
prefervel usar concentraes situadas na parte linear
APARELHAGEM da curva de calibrao. Em caso de impossibilidade,
podem igualmente utilizar-se curvas de calibrao que
A aparelhagem compreende essencialmente: apresentem uma curvatura, desde que se recorra a programas
informticos de ajustamento apropriados.
um sistema de introduo e nebulizao das amostras,
As medies so efectuadas por comparao com solues
uma chama destinada a gerar os tomos a dosear, padro de concentrao conhecida no elemento a dosear,
seja pelo mtodo da curva de calibrao (Mtodo I), seja pelo
um monocromador,
mtodo das adies (Mtodo II).
um detector,
uma unidade de aquisio de dados. MTODO I MTODO DA CURVA DE CALIBRAO
A chama alimentada por uma mistura de ar ou oxignio
e um gs combustvel, por exemplo, o hidrognio, o Para as anlises de rotina, conveniente preparar e examinar
acetileno, o propano, ou o butano. A fonte de atomizao 3 solues padro e uma soluo em branco.
crucial, uma vez que deve fornecer energia suficiente para Prepare a soluo da amostra (soluo problema) conforme
excitar e atomizar os tomos. A chama tem a vantagem, o prescrito na monografia. Prepare, pelo menos, 3 solues
sobre outras fontes de atomizao, de gerar espectros padro cujas concentraes no elemento a dosear se
atmicos mais simples; a principal limitao no enquadrem na concentrao esperada da soluo problema.
possuir, para numerosos elementos, a potncia requerida Para os doseamentos, a gama de calibrao ptima vai de
para gerar uma emisso que permita a medio. A gua 0,7 vezes a 1,3 vezes o teor esperado no elemento a dosear
acidificada o solvente de escolha para a preparao das ou o teor limite prescrito na monografia. Para os ensaios de
solues problema e das solues de referncia. Todavia, pureza, a gama de calibrao estende-se desde o limite de
possvel utilizar tambm solventes orgnicos desde que deteco at 1,2 vezes o limite especificado para o elemento

2.2.23. Espectrometria de absoro atmica
a dosear. Todos os reagentes utilizados na preparao da EXACTIDO

soluo problema so adicionados, na mesma concentrao,
s solues padro e soluo em branco. Introduza cada Verifique a exactido utilizando, de preferncia, um material
uma das solues no dispositivo de anlise, usando o mesmo de referncia certificado (MRC). Em caso de impossibilidade,
nmero de replicados para cada soluo de forma a obter efectue um ensaio de recuperao.
uma leitura estvel.
2. Mtodos
Recuperao. Para os doseamentos, deve obter-se uma

Analticos
Clculo. Trace a curva de calibrao a partir da mdia das recuperao de 90 por cento a 110 por cento. Para outras
leituras obtidas com as solues padro, representando determinaes, por exemplo o doseamento de vestgios de
as mdias em funo da concentrao, e determine a elementos, o ensaio s vlido se a recuperao se situar no
concentrao do elemento a dosear na soluo problema por intervalo de 80 por cento a 120 por cento do valor terico. A
interpolao grfica. recuperao pode ser determinada com uma soluo padro
apropriada (soluo matriz), a qual enriquecida com uma
quantidade conhecida do elemento a analisar (concentrao
MTODO II MTODO DAS ADIES
mdia do intervalo de calibrao).
Introduza em, pelo menos, 3 bales marcados idnticos, A repetibilidade , no mximo, de 3 por cento para um
volumes iguais da soluo problema preparada conforme doseamento e de 5 por cento para um ensaio de pureza.
o prescrito. Junte a todos os bales, excepto um, volumes
crescentes de uma soluo padro de concentrao Verifique que o limite de quantificao (determinado, por
exactamente conhecida no elemento a dosear, de modo exemplo, pela aproximao 10) inferior ao valor a medir.
a obter uma srie de solues contendo quantidades
progressivamente crescentes do elemento e escolhidas de
modo que as respostas se situem na parte linear da curva 2.2.23. ESPECTROMETRIA
de calibrao. Complete o contedo de cada balo com o DE ABSORO ATMICA
solvente. Introduza cada uma das solues no dispositivo de
anlise, usando o mesmo nmero de replicados para cada PRINCPIO GERAL
soluo de forma a obter uma leitura estvel.
Clculo. Calcule a equao de regresso linear, utilizando o A absoro atmica o fenmeno observado quando
mtodo dos mnimos quadrados, e resolva-a de modo a obter um tomo no estado fundamental absorve uma radiao
a concentrao do elemento a dosear na soluo problema. electromagntica de comprimento de onda especfico e passa
a um estado excitado. Os tomos no estado fundamental
absorvem energia na sua frequncia de ressonncia e a
VALIDAO DO MTODO radiao electromagntica atenuada devido ressonncia.
A absoro de energia , em teoria, proporcional ao nmero
A eficincia dos mtodos prescritos nas monografias de tomos presentes.
verificada em intervalos de tempo adequados.
O presente captulo fornece informaes gerais e descreve
Prepare e analise, pelo menos, 4 solues padro cobrindo o os procedimentos a seguir para determinaes elementares
intervalo de calibrao e uma soluo em branco, com, no por espectrometria de absoro atmica utilizando diferentes
mnimo, 5 replicados. tcnicas de atomizao (chama, vaporizao electrotrmica
Calcule a curva de calibrao pelo mtodo dos mnimos numa cmara de grafite, gerao de hidretos, tcnica do
quadrados a partir do conjunto dos valores medidos. vapor frio para o mercrio).
Represente graficamente a curva de regresso, as mdias, A espectrometria de absoro atmica uma tcnica
os valores medidos e o intervalo de confiana da curva de de determinao da concentrao de um elemento
calibrao. O mtodo s vlido se: numa amostra, por medio da absoro de radiao
electromagntica pelo vapor atmico do elemento
o coeficiente de correlao for superior ou igual a 0,99, gerado a partir da amostra. A determinao efectuada
os resduos obtidos para cada concentrao de calibrao no comprimento de onda de uma das riscas de absoro
apresentem uma distribuio aleatria volta da curva de (de ressonncia) do elemento em causa. A quantidade de
calibrao. radiao absorvida , de acordo com a lei de Lambert-Beer,
proporcional concentrao do elemento.
Calcule a mdia e o desvio padro relativo para as concentraes
mais baixa e mais alta da gama de concentraes usadas para
a calibrao. APARELHAGEM
Se a relao entre os desvios padro calculados para a
A aparelhagem compreende essencialmente:
mais baixa e mais alta das concentraes for inferior a
0,5 ou superior a 2,0, necessrio uma avaliao mais uma fonte de radiao,
precisa da curva de calibrao, a qual pode ser obtida por um dispositivo de introduo das amostras,
regresso linear ponderada. As funes de ponderao do
primeiro e do segundo grau so aplicadas aos dados para um dispositivo de atomizao das amostras,
determinar a funo de ponderao mais apropriada. Se as um monocromador e um policromador,
mdias apresentarem um desvio de linearidade em relao
curva de calibrao, utiliza-se uma regresso linear um detector,
bidimensional. uma unidade de aquisio de dados.

O aparelho est geralmente equipado com um sistema de uma mistura de protxido de azoto-acetileno que permite
correco do rudo de fundo. As fontes de radiao utilizadas a obteno de temperatura elevada. O emprego de tampes
podem ser lmpadas de ctodo oco ou lmpadas de descarga de ionizao especficos (lantnio ou csio, por exemplo)
sem elctrodo (EDL), que emitem um espectro de riscas permite compensar as interferncias da ionizao. As
muito estreitas (com uma largura a meia altura de cerca de interferncias fsicas ligadas salinidade ou viscosidade da
0,002 nm) correspondente ao elemento a dosear. amostra so eliminadas diluindo a amostra, utilizando o
mtodo das adies de padro ou ajustando a matriz. Quanto
2. Mtodos
Analticos
Existem 3 tcnicas de atomizao das amostras.
s interferncias espectrais, que resultam da sobreposio de
riscas de ressonncia, podem ser evitadas usando uma linha de
Atomizao na chama ressonncia diferente. A correco do fundo por aplicao do
Este dispositivo de atomizao composto por um sistema efeito Zeeman permite igualmente compensar as interferncias
de nebulizao que contm um acessrio de produo espectrais e as interferncias da absoro molecular,
pneumtica de aerossol, um regulador de dbito gasoso especialmente quando se usa a tcnica de atomizao
e um queimador. So correntemente utilizadas diversas electrotrmica. A utilizao de lmpadas de ctodo oco multi-
misturas de combustvel-comburente para produzir -elementos pode tambm originar interferncias espectrais.
temperaturas que vo de cerca de 2000 K a 3000 K. Entre A absoro especfica ou no especfica medida numa gama
os combustveis gasosos figuram o propano, o hidrognio espectral definida pela largura da banda seleccionada pelo
e o acetileno; o comburente pode ser o ar ou o protxido monocromador (0,2-2 nm).
de azoto. A configurao do queimador adaptada ao
gs utilizado e o dbito gasoso regulvel. As amostras
CORRECO DO RUDO DE FUNDO
so nebulizadas e o solvente escolhido para a preparao
das solues problema e das solues padro a gua
A difuso e a absoro de fundo na chama ou na atomizao
acidificada. Todavia, possvel utilizar tambm solventes
electroqumica contribuem para um erro, aumentando
orgnicos desde que tomadas as precaues necessrias
os valores de absoro medidos. A absoro de fundo
para que o solvente no afecte a estabilidade da chama.
abrange um intervalo largo de comprimentos de onda,
enquanto que a absoro atmica especfica se produz num
Atomizao electrotrmica intervalo muito estreito de comprimentos de onda (0,005-
Este dispositivo de atomizao composto, geralmente, -0,02 nm). A absoro de fundo pode, em princpio, ser
por uma cmara de grafite e uma fonte de alimentao corrigida utilizando uma soluo em branco de composio
elctrica. Toda a amostra vaporizada na cmara de exactamente idntica da amostra, mas sem o elemento
grafite e o vapor atmico produzido retido durante especfico a determinar; contudo, este mtodo muitas vezes
um certo perodo de tempo no percurso ptico, o que impossvel de pr em prtica. Em atomizao electrotrmica
permite melhorar o limite de deteco. As amostras, conveniente optimizar a temperatura de pirlise para
lquidas ou slidas, so introduzidas directamente na eliminar os produtos de decomposio da matriz que so
cmara de grafite, a qual aquecida numa srie de etapas responsveis pela absoro de fundo. A correco de fundo
programadas com o objectivo de secar a amostra, eliminar pode igualmente ser efectuada utilizando 2 fontes luminosas
por pirlise os principais componentes da matriz e, depois, diferentes, a lmpada de ctodo oco que mede a absoro
atomizar a totalidade do elemento a analisar. A limpeza da total (elemento + fundo) e uma lmpada de deutrio de
cmara efectuada pela programao de uma temperatura espectro de emisso contnua que permite medir a absoro
final superior temperatura de atomizao. A circulao de fundo. A correco da absoro de fundo feita subtraindo
de um gs inerte na etapa de pirlise na cmara de grafite o sinal da lmpada de deutrio ao sinal da lmpada de ctodo
permite melhorar a eficincia da atomizao. oco. Contudo, este mtodo s aplicvel num domnio
espectral limitado, uma vez que os espectros emitidos pelas
lmpadas de deutrio vo de 190 nm a 400 nm. Tambm
Gerao de hidretos e vapor frio possvel medir o rudo de fundo efectuando leituras
O vapor atmico tambm pode ser gerado no exterior do numa risca no absorvente vizinha da risca de ressonncia
espectrmetro. o que acontece quando se recorre ao e subtrair os resultados obtidos da medio na linha de
mtodo dito do vapor frio para o mercrio ou gerao ressonncia. Outro mtodo de correco da absoro de
de hidretos para elementos como o arsnio, o antimnio, fundo consiste na utilizao do efeito Zeeman (decomposio
o bismuto, o selnio e o estanho. No que se refere ao da risca de absoro quando sob influncia de um campo
mercrio, os tomos so gerados por reduo qumica magntico). Este mtodo particularmente til quando a
com cloreto estanoso ou boro-hidreto de sdio e o vapor absoro de fundo apresenta uma estrutura fina, e, alm
atmico arrastado por uma corrente de gs inerte para disso, permite efectuar uma correco eficiente no intervalo
uma clula fria de quartzo colocada no percurso ptico 185-900 nm.
do instrumento. Os hidretos assim gerados so arrastados
por um gs inerte para uma clula aquecida, no interior da
qual so dissociados em tomos. ESCOLHA DAS CONDIES DE OPERAO
Depois de ter seleccionado o comprimento de onda e

INTERFERNCIAS a largura da fenda apropriados ao elemento a dosear,
necessrio verificar a necessidade dos aspectos seguintes:
As interferncias qumicas, fsicas, da ionizao ou
correco da absoro de fundo no especfica,
espectrais podem afectar as medies da absoro atmica.
As interferncias qumicas so compensadas pela adio adio de modificadores qumicos ou de tampes de
de modificadores da matriz, de agentes que modificam ionizao amostra, soluo em branco e s solues
a volatilidade do elemento, ou utilizando, para a chama, padro,

diluio da amostra para minimizar, por exemplo, as 0,7 vezes a 1,3 vezes o teor esperado no elemento a dosear
interferncias fsicas, ou o teor limite prescrito na monografia. Para os ensaios de
pureza, a gama de calibrao estende-se desde o limite de
descrio detalhada da programao de temperatura:
pr-aquecimento, secagem, pirlise, atomizao, ps- deteco at 1,2 vezes o limite especificado para o elemento
-atomizao, tempos de rampa e de temperatura fixa. a dosear. Todos os reagentes utilizados na preparao da
soluo problema so adicionados, na mesma concentrao,
dbito do gs inerte, s solues padro e soluo em branco. Introduza cada
2. Mtodos
Analticos
utilizao de modificadores de matriz para a atomizao uma das solues no dispositivo de anlise, usando o mesmo
electrotrmica (forno), nmero de replicados para cada soluo de forma a obter
uma leitura estvel.
emprego de agentes redutores para as determinaes de
mercrio ou outros elementos formadores de hidretos com
Clculo. Trace a curva de calibrao a partir da mdia das
uma clula de vapor frio ou uma clula aquecida,
leituras obtidas com as solues padro, representando
especificao do modelo do forno (tanque, plataforma de as mdias em funo da concentrao, e determine a
Lvov, etc). concentrao do elemento a dosear na soluo problema por
interpolao grfica.
MTODO
MTODO II MTODO DAS ADIES
Sempre que possvel, recomendvel a utilizao de material
de laboratrio de plstico. A preparao da amostra pode Introduza em, pelo menos, 3 bales marcados idnticos,
requerer dissoluo, digesto (muitas vezes com auxlio volumes iguais da soluo problema preparada conforme o
de micro-ondas), calcinao ou uma combinao destes prescrito. Junte a todos os bales, excepto a um, volumes
procedimentos a fim de purificar a matriz e/ou eliminar crescentes de uma soluo padro de concentrao
substncias contendo carbono. Se trabalhar em sistema exactamente conhecida no elemento a dosear, de modo
aberto, a temperatura de calcinao no deve ultrapassar a obter uma srie de solues contendo quantidades
600 C devido volatilidade de alguns metais, a no ser progressivamente crescentes do elemento e escolhidas de
quando est especificado de forma diferente na monografia.
modo que as respostas se situem na parte linear da curva
Utilize um espectrmetro de absoro atmica seguindo as de calibrao. Complete o contedo de cada balo com o
instrues do fabricante e trabalhando no comprimento de solvente.
onda prescrito.
Introduza, pelo menos por 3 vezes, cada uma das solues no
Introduza a soluo em branco no dispositivo de anlise dispositivo de anlise, usando o mesmo nmero de replicados
e ajuste o instrumento de modo a que este indique a para cada soluo de forma a obter uma leitura estvel.
transmisso mxima. O valor do branco pode ser
determinado utilizando solvente para regular o zero do Clculo. Calcule a equao de regresso linear, utilizando o
aparelho. Em seguida, introduza a soluo padro de
mtodo dos mnimos quadrados, e resolva-a de modo a obter
concentrao mais elevada e regule a sensibilidade de modo
a concentrao do elemento a dosear na soluo problema
a obter uma leitura de absorvncia mxima. Lave para evitar
contaminaes e efeitos de memria. Depois de completar a
anlise, lave com gua R ou com gua acidificada. VALIDAO DO MTODO
Se for necessria uma tcnica de amostragem slida, o
procedimento a seguir est detalhadamente descrito na A eficincia dos mtodos prescritos nas monografias
monografia. verificada em intervalos de tempo adequados.
Assegure que as concentraes a determinar se situam
preferencialmente na parte linear da curva de calibrao. LINEARIDADE
Caso no seja possvel, podem utilizar-se curvas de calibrao
que apresentem uma curvatura, desde que se recorra a Prepare e analise, pelo menos, 4 solues padro cobrindo o
programas informticos de calibrao adequados. intervalo de calibrao e uma soluo em branco, com, no
As medies so efectuadas por comparao com solues mnimo, 5 replicados.
padro de concentrao conhecida do elemento a dosear, Calcule a curva de calibrao pelo mtodo dos mnimos
seja pelo mtodo da curva de calibrao (Mtodo I), seja pelo quadrados a partir do conjunto dos valores medidos.
mtodo das adies (Mtodo II).
Represente graficamente a curva de regresso, as mdias,
os valores medidos e o intervalo de confiana da curva de
MTODO I MTODO DA CURVA DE CALIBRAO calibrao. O mtodo s vlido se
o coeficiente de correlao for superior ou igual a 0,99,
Para as anlises de rotina, conveniente preparar e examinar
3 solues padro e uma soluo em branco. os resduos obtidos para cada concentrao de calibrao
apresentem uma distribuio aleatria volta da curva de
Prepare a soluo da amostra (soluo problema) conforme calibrao.
o prescrito na monografia. Prepare, pelo menos, 3 solues
padro cujas concentraes no elemento a dosear se Calcule a mdia e o desvio padro relativo para as
enquadram na concentrao esperada da soluo problema. concentraes mais baixa e mais alta da gama de
Para os doseamentos, a gama de calibrao ptima vai de concentraes usadas para a calibrao.

2.2.24. Espectrofotometria de absoro no infravermelho
Se a relao entre os desvios padro calculados para a

mais baixa e mais alta das concentraes for inferior a
0,5 ou superior a 2,0, necessrio uma avaliao mais
precisa da curva de calibrao, a qual pode ser obtida por T = I/I0,
regresso linear ponderada. As funes de ponderao do
primeiro e do segundo grau so aplicadas aos dados para I0 = intensidade da radiao incidente

determinar a funo de ponderao mais apropriada. Se as
2. Mtodos
Analticos
I = intensidade da radiao transmitida.
mdias apresentarem um desvio de linearidade em relao
curva de calibrao, utiliza-se uma regresso linear
bidimensional. PREPARAO DA AMOSTRA
Registo por transmisso ou por absoro. Prepare a

EXACTIDO amostra utilizando um dos mtodos seguintes:
Verifique a exactido utilizando, de preferncia, um material Lquidos. Utilize o lquido quer na forma de uma
de referncia certificado (MRC). Em caso de impossibilidade, pelcula entre dois discos ou entre duas placas (janelas)
efectue um ensaio de recuperao. transparentes s radiaes de infravermelho, quer
numa clula com percurso ptico apropriado, tambm
transparente s mesmas radiaes.
Recuperao. Para os doseamentos, deve obter-se uma
recuperao de 90 por cento a 110 por cento. Para outras Lquidos ou slidos em soluo. Prepare uma soluo
determinaes, por exemplo o doseamento de vestgios de num solvente apropriado, com concentrao conveniente
elementos, o ensaio s vlido se a recuperao se situar no e utilizando uma clula com percurso ptico adequado de
intervalo de 80 por cento a 120 por cento do valor terico. A forma a obter um espectro aceitvel. Obtm-se, geralmente,
recuperao pode ser determinada com uma soluo padro bons resultados com concentraes de 10 g/l a 100 g/l num
apropriada (soluo matriz), a qual enriquecida com uma percurso ptico de 0,5 mm a 0,1 mm. A absoro devida
quantidade conhecida do elemento a analisar (concentrao ao solvente compensada colocando no percurso do feixe
mdia do intervalo de calibrao). de referncia uma clula semelhante contendo o solvente
utilizado.
No caso dos instrumentos com transformada de Fourier, esta
REPETIBILIDADE
compensao realizada pelo registo sucessivo dos espectros
do solvente e da amostra. A absorvncia do solvente, corrigida
A repetibilidade , no mximo, de 3 por cento para um
com um factor de compensao, subtrada da absorvncia
doseamento e de 5 por cento para um ensaio de pureza.
da amostra usando um programa de clculo.
Slidos. Examine um slido disperso quer num lquido
LIMITE DE QUANTIFICAO apropriado (pasta), quer num slido (disco de halogeneto).
Quando a monografia o indicar, utilize uma pelcula da
Verifique que o limite de quantificao (determinado, por amostra fundida entre 2 placas transparentes radiao
exemplo, pela aproximao 10) inferior ao valor a medir. infravermelha.
A. Pasta.
2.2.24. ESPECTROFOTOMETRIA Triture uma pequena quantidade da amostra com uma
quantidade mnima de parafina lquida R ou outro lquido
DE ABSORO NO INFRAVERMELHO apropriado; geralmente, 5 mg a 10 mg da amostra com
uma gota de parafina lquida R so suficientes para
Os espectrofotmetros destinados ao registo de espectros na preparar uma pasta adequada. Comprima a pasta entre 2
regio espectral do infravermelho esto adaptados s medidas placas transparentes radiao infravermelha.
1 1
de espectro na regio de 4000 cm a 650 cm (2,5 a 15,4 m)
1
ou, eventualmente, at 200 cm (50 m). B. Disco.
Os espectrofotmetros utilizados para o registo de Triture 1 mg a 2 mg da amostra com 300 mg a 400 mg,
espectros compreendem uma fonte luminosa apropriada, salvo indicao em contrrio, de brometo de potssio R ou
um monocromador ou um interfermetro e um detector. cloreto de potsso R finamente pulverizado e seco. Estas
Os espectrofotmetros com transformada de Fourier quantidades so geralmente suficientes para preparar um
utilizam uma radiao policromtica, efectuando o disco de 10-15 mm de dimetro e obter um espectro de
clculo do espectro no domnio da frequncia, a partir intensidade satisfatria. Se a amostra for um cloridrato,
dos dados obtidos, pela transformada de Fourier. Os recomendvel usar cloreto de potssio R. Triture
espectrofotmetros munidos de um sistema ptico capaz cuidadosamente a mistura, espalhe-a uniformemente
de fornecer uma radiao monocromtica na regio de numa matriz especial e submeta-a a presso reduzida,
2
a uma presso de cerca de 800 MPa (8 t.cm ). No caso
medio podem igualmente ser utilizados. O espectro
das substncias instveis nas condies atmosfricas
geralmente apresentado em funo da transmitncia, isto
normais, ou higroscpicas, o disco comprimido sob
, a relao entre a intensidade da radiao transmitida e
presso reduzida. Vrios factores como, por exemplo,
a intensidade da radio incidente. Pode igualmente ser
triturao insuficiente ou excessiva, humidade ou outras
apresentado em funo da absorvncia.
impurezas no meio de disperso ou uma pulverizao
A absorvncia (A) definida como sendo o logaritmo insuficiente, podem ser causa de obteno de discos
decimal do inverso da transmitncia (T). imperfeitos. Quando um exame visual revele uma falta de

2.2.24. Espectrofotometria de absoro no infravermelho
uniformidade na transparncia ou quando a transparncia Quando o ensaio no estado slido revelar desvios na
em cerca de 2000 cm1 (5 m), na ausncia de uma banda posio dos mnimos de transmisso (mximos de
de absoro especfica, for inferior a 60 por cento sem absoro), trate a amostra e o padro nas mesmas
compensao, o disco rejeitado. condies de modo a que cristalizem ou se apresentem na
Gases. Utilize uma clula transparente radiao mesma forma, ou proceda como prescrito na monografia
infravermelha que permita o exame da amostra gasosa num e, de seguida, registe novos espectros.
2. Mtodos
Analticos
comprimento de percurso ptico de cerca de 100 mm.

Aps ter eliminado o ar da clula, ligue-a, atravs de um
IDENTIFICAO POR MEIO DE ESPECTROS
tubo abdutor apropriado, ao recipiente que contm a
DE REFERNCIA
amostra gasosa e ajuste o contedo da clula a uma presso
apropriada por meio de uma torneira de passagem ou de uma
vlvula de agulha. Controlo do poder de resoluo. No caso dos aparelhos
com monocromador, registe o espectro de uma pelcula de
Se necessrio, ajuste o contedo da clula para a presso polistireno com cerca de 35 m de espessura. A diferena
atmosfrica utilizando um gs transparente radiao x (ver figura 6) entre a percentagem de transparncia
infravermelha (por exemplo, azoto R ou rgon R). no mximo de transmisso A em 2 870 cm1 (3,48 m) e
Com o fim de eliminar as interferncias de absoro no mnimo de transmisso B em 2 849,5 cm1 (3,51 m)
devidas gua, ao dixido de carbono ou a outros gases superior a 18. A diferena y entre a percentagem de
atmosfricos, efectue, se possvel, a determinao por
transparncia no mximo de transmisso C em 1 589 cm1
comparao com uma clula idntica onde se fez o
(6,29 m) e no mnimo de transmisso D em 1 583 cm1
vazio ou cheia com um gs transparente radiao
(6,32 m) superior a 10.
infravermelha.
No caso dos instrumentos com transformada de Fourier utilize
uma resoluo conveniente apodizao apropriada ao tipo de
DETERMINAO POR REFLEXO DIFUSA aparelho e indicada pelo fabricante. Verifique a resoluo por
um meio adequado, por exemplo, o registo do espectro de uma
Slidos. Triture uma mistura da amostra e brometo de
pelcula de polistireno de cerca de 35 m de espessura.
potssio R ou cloreto de potssio R finamente pulverizado
e seco. Utilize uma mistura contendo cerca de 5 por cento A diferena de absorvncia entre o mnimo de absoro em
da substncia, salvo indicao em contrrio. Triture a 2870 cm-1 e o mximo de absoro em 2849,5 cm-1 superior
mistura, coloque-a numa cpula e examine o espectro de a 0,33. A diferena de absorvncia entre o mnimo de absoro
reflectncia. em 1589 cm-1 e o mximo de absoro em 1583 cm-1 superior
Para obter o espectro de absorvncia trate matematicamente a 0,08.
o espectro obtido pela funo de Kubelka-Munk. Verificao da escala de nmeros de onda. A verificao da
escala de nmeros de onda pode efectuar-se com
DETERMINAO POR REFLEXO TOTAL ATENUADA
A reflexo total atenuada (que compreende a reflexo

mltipla) fundamenta-se na reflexo interna da luz por
um meio transmissor, geralmente com um certo nmero
de reflexes. Existem, entretanto, dispositivos nos quais s
se produz uma reflexo.
Prepare a amostra do modo seguinte. Coloque a amostra
em contacto ntimo com um elemento de reflexo interna
(ERI) do tipo do diamante, germnio, seleneto de zinco,
bromoiodeto de tlio (KRS-5) ou qualquer outro material
apropriado que possua um ndice de refraco elevado.
Assegure um contacto ntimo e uniforme entre a amostra e
toda a superfcie do cristal de ERI, quer aplicando presso,
quer dissolvendo a amostra num solvente apropriado
e recobrindo o ERI com soluo obtida e evaporando
secura. Examine o espectro de reflexo total atenuada.
IDENTIFICAO POR MEIO DE SUBSTNCIAS

DE REFERNCIA
Prepare a amostra e o padro do mesmo modo e registe os

espectros entre 4000 cm1 e 650 cm1 (2,5 m a 15,4 m) nas
mesmas condies operatrias. Os mnimos de transmisso
(mximos de absoro) do espectro obtido com a amostra Nmero de onda cm-1
correspondem, quanto posio e dimenses relativas, aos FIGURA 6 Exemplo de um espectro de polistireno utilizado para
do espectro obtido com a substncia de referncia (SQR). controlar o poder de resoluo

2.2.25. Espectrofotometria de absoro no ultravioleta e no visvel
uma pelcula de polistireno que apresenta mnimos de Na ausncia de outros factores fsico-qumicos, a absorvncia
transmisso (mximos de absoro) nos nmeros de onda medida (A) proporcional espessura (b) da camada
(expressos em cm1) indicados no quadro seguinte: atravessada e concentrao (c) da substncia dissolvida, de
acordo com a equao:
QUADRO 13. Mnimos de transmisso e tolerncias para uma A = .c.b
pelcula de polistireno
2. Mtodos
Analticos
= absortividade molar
Tolerncias admitidas (cm-1)
Mnimos (b expresso em centmetros e c em moles por litro)
de transmisso (cm-1) Instrumentos com Instrumentos com
monocromador transformada de Fourier
O smbolo representando a absorvncia especfica de
3060,0 1,5 1,0 uma substncia dossolvida, refere-se absrvncia de uma
2849,5 2,0 1,0 soluo a 10 g/l na espessura de 1 centmetro em um
comprimento de onda determinado; donde
1942,9 1,5 1,0
1601,2 1,0 1,0 = 10
1583,0 1,0 1,0 Mr
1154,5 1,0 1,0

Salvo indicao em contrrio, determine a absorvncia
1028,3 1,0 1,0 no comprimento de onda prescrito, na espessura de 1 cm.
Salvo indicao em contrrio, efectue as determinaes em
Mtodo. Prepare a amostra de acordo com as instrues relao ao mesmo solvente ou mesma mistura de solventes.
que acompanham o espectro ou a substncia de referncia A absorvncia do solvente, medida em relao ao ar e no
e registe o espectro da amostra nas mesmas condies comprimento de onda prescrito, no ultrapassa em nenhum
operatrias que tenham sido utilizadas para obter o espectro caso 0,4 e , de preferncia, inferior a 0,2. Trace o espectro de
de referncia que so habitualmente as condies nas quais o absoro marcando em ordenadas os valores de absorvncia
controlo do poder de resoluo foi efectuado. As posies e as ou de qualquer funo desta e em abcissas o comprimento
dimenses relativas das bandas do espectro da amostra e do de onda ou qualquer funo deste. Quando a monografia d
espectro de referncia devem ser concordantes. um nico valor para a posio de um mximo de absoro,
admite-se que o valor obtido possa afastar-se de 2 nm.
Compensao para o vapor de gua e dixido de carbono.
Nos casos dos instrumentos com transformada de Fourier, Aparelho. Os espectrofotmetros utilizados para o estudo das
efectua-se uma compensao da interferncia espectral devida regies ultravioleta e visvel do espectro so constitudos por
ao vapor de gua e ao dixido de carbono atmosfrico com um sistema ptico susceptvel de fornecer luz
o auxlio de algoritmos apropriados seguindo as instrues monocromtica na regio de 200 a 800 nm e por um
do fabricante. A aquisio dos espectros pode igualmente ser dispositivo apropriado para a medio da absorvncia.
realizada com instrumentos convenientemente purgados
ou registados em condies exactamente idnticas s dos Controlo dos comprimentos de onda. Verifique a escala dos
espectros de monofeixe da amostra e do fundo. comprimentos de onda utilizando os mximos de absoro
da soluo de perclorato de hlmio R, a risca da lmpada de
hidrognio ou de deutrio ou as riscas do espectro de arco
IMPUREZAS NOS GASES do vapor de mercrio indicadas no quadro 14. A tolerncia
admitida de 1 nm para a regio do ultravioleta e de
Para anlise de impurezas use uma tina transparente aos 3 nm para a regio do visvel. Podem igualmente ser
raios infravermelhos e de percurso ptico adequado (por utilizados materiais de referncia certificados apropriados.
exemplo, 1 a 20 m). Encha a tina seguindo o processo Controlo da absorvncia. Controle a absorvncia por meio
indicado na rubrica Gases. Proceda deteco e de filtros apropriados ou soluo de dicromato de potssio R
determinao quantitativa das impurezas de acordo com as nos comprimentos de onda indicados no quadro 15. Para cada
instrues dadas na monografia. comprimento de onda, figuram ali o valor preciso e os valores
limites da absorvncia especfica. A tolerncia admitida para a
absorvncia de 0,01.
2.2.25. ESPECTROFOTOMETRIA Para o controlo da absorvncia, utilize solues de dicromato
DE ABSORO NO ULTRAVIOLETA de potssio R previamente seco a 130C at massa constante.
E NO VISVEL Para o controlo da absorvncia em 235 nm, 257 nm e 350 nm,
dissolva uma tomada de ensaio de 57,0 g a 63,0 g de
Determinao da absorvncia. A absorvncia A de dicromato de potssio R em cido sulfrico 0,005 M e
uma soluo o logaritmo decimal do inverso da complete 1000,0 ml com o mesmo cido. Para o controlo
transparncia T para uma radiao monocromtica. da absorvncia em 430 nm, dissolva uma tomada de ensaio
Exprime-se pela equao: de 57,0 g a 63,0 g de substncia seca em cido sulfrico
0,005 M e complete 100,0 ml com o mesmo cido. Podem
igualmente ser utilizados materiais de referncia certificados
apropriados.
Limite da luz parasita. A luz parasita pode ser revelada num

dado comprimento de onda por meio de solues ou de filtros
apropriados; por exemplo, a absorvncia de uma soluo
de cloreto de potssio R a 12 g/l medida na espessura de

2.2.25. Espectrofotometria de absoro no ultravioleta e no visvel
1 cm aumenta de forma abrupta entre 220 nm e 200 nm Um espectro de derivao secundria (de segunda ordem)
e superior a 2,0 em 198 nm, quando comparada com a representa a curva do espectro de absoro em funo do
gua como lquido de compensao. Podem igualmente ser comprimento de onda (d2 A/d2). A segunda derivada do
utilizados materiais de referncia certificados apropriados. comprimento de onda depende da concentrao segundo
as equaes:
2. Mtodos
2
d 2A = d A d2A
Analticos
2
c'b = cb
d d2 10 d2 10
c' = concentrao da substncia absorvente em gramas por litro
Aparelhagem. Utilize um espectrofotmetro que satisfaa

s exigncias antes j indicadas e equipado com um mdulo
analgico de diferenciao da capacitncia-resistncia ou
com um mdulo numrico ou qualquer outro dispositivo que
permita produzir espectros derivados. Certos dispositivos que
permitem a obteno de espectros de derivao secundria
produzem um deslocamento dos comprimentos de onda em
relao ao espectro de ordem zero que convm ter em conta,
se necessrio.
Resoluo (anlise qualitativa) Quando a monografia o

exigir, efectue como se indica a seguir a medio do poder
de resoluo do aparelho: registe o espectro de uma soluo
de tolueno R a 0,02 por cento V/V em hexano R. A relao
entre a absorvncia no mximo em 269 nm e a absorvncia
no mnimo em 266 nm no inferior ao valor indicado na
monografia.
Largura da fenda espectral (anlise quantitativa). Para
evitar leituras errneas devidas largura da fenda
espectral, quando se utilize um instrumento com abertura
da fenda varivel no comprimento de onda escolhido, a
largura da fenda pequena em relao largura a meia
altura da banda de absoro, mas, ao mesmo tempo,
to larga quanto possvel para obter um valor elevado de
I0. Todavia, a largura da fenda escolhida de forma que
qualquer nova diminuio no v modificar a leitura da
absorvncia.
Tinas. A tolerncia da espessura das tinas utilizadas de
0,005 cm. Cheias com o mesmo solvente, as tinas
destinadas a conter a soluo a analisar e o lquido de
compensao apresentam a mesma transmitncia. Se assim FIGURA 7
no suceder, feita uma correco apropriada.
Vigie cuidadosamente a conservao e a limpeza das tinas.
Poder de resoluo. Quando for prescrito na monografia,
registe a segunda derivada do espectro de uma soluo de
ESPECTROFOTOMETRIA DERIVADA tolueno R a 0,02 por cento V/V em metanol R, utilizando
metanol R como lquido de compensao. O espectro
apresenta um pequeno extremo negativo situado entre dois
A espectrofotometria derivada consiste na transformao de
extremos negativos importantes em 261 nm e 268 nm como
um espectro de absoro (ordem zero) em espectros de
se ilustra na figura 7.
derivao primria, de derivao secundria ou de derivao
de ordens superiores. Salvo indicao em contrrio na monografia, a relao A/B
(ver figura 7) no inferior a 0,2.
Um espectro de derivao primria (de primeira ordem)
representa o traado do gradiente da curva de absoro (isto Mtodo. Prepare a soluo da amostra, regule o aparelho de
, do grau de mudana da absorvncia dA/d) em funo do acordo com as instrues do fabricante e calcule o teor da
comprimento de onda. substncia em anlise segundo as indicaes da monografia.

2.2.27. Cromatografia em camada fina
2.2.26. CROMATOGRAFIA EM PAPEL Com lpis de ponta fina, marque uma linha paralela a
uma das extremidades do papel, a uma distncia tal que,
CROMATOGRAFIA ASCENDENTE quando esta extremidade fixada na tina e a parte restante
do papel cai livremente, a linha se encontre alguns
Aparelhagem. A aparelhagem consiste num recipiente de centmetros abaixo das varetas de vidro e paralelamente a
vidro, esmerilado na parte superior, cujas dimenses esto estas. Utilizando uma micropipeta, coloque sobre a linha
em relao com as do papel a utilizar e cuja tampa, de o volume de soluo indicado na monografia. Se o lquido
2. Mtodos
Analticos
preferncia tambm esmerilada, permite obter um sistema
aplicado atingir um dimetro superior a 10 mm, coloque
perfeitamente estanque. O recipiente munido na parte
a soluo em fraces, de forma a permitir a evaporao
superior de um dispositivo apropriado para suspender o
do solvente aps cada aplicao. Se, na mesma tira de
papel, o qual, dever ser deslocado ao longo da cmara, sem
papel, se efectuam aplicaes em dois ou mais locais, deixe
a abrir. Na parte inferior colocada uma tina de fundo plano,
entre cada um, um espao no inferior a 3 cm. Suspenda o
destinada a conter a fase mvel na qual o papel pode imergir.
papel na cmara, tape-a e deixe em repouso durante 1 h e
O papel de cromatografia um papel de filtro apropriado,
30 min. Introduza na tina, atravs do orifcio da tampa, a
cortado em tiras de comprimento suficiente e de largura no
quantidade suficiente da fase mvel e volte a tapar o orifcio.
inferior a 2,5 cm, de forma a que a fase mvel se desloque na
Retire o papel da cmara quando o solvente tiver percorrido
direco das suas fibras.
a distncia prescrita ou quando tiver decorrido o tempo
indicado na monografia e deixe-o secar ao ar. Durante o
Mtodo. Coloque na tina uma camada com cerca de 2,5 cm perodo de desenvolvimento, mantenha o papel protegido de
de altura da fase mvel prescrita na monografia e, se nesta for luz intensa.
indicado, coloque tambm a fase mvel entre as paredes da
cmara e da tina. Adapte a tampa e deixe em repouso durante
24 h, a 20 25C; mantenha a mesma temperatura durante
as operaes subsequentes. distncia de 3 cm de uma das
2.2.27. CROMATOGRAFIA
extremidades do papel, marque uma linha, com lpis de EM CAMADA FINA
ponta fina. Utilizando uma micropipeta, coloque sobre a linha
o volume de soluo indicado na monografia. Se o lquido Princpio. A cromatografia em camada fina uma tcnica
aplicado atingir um dimetro superior a 10 mm, coloque a de separao na qual uma fase estacionria, constituda por
soluo em fraces, de forma a permitir a evaporao do um material apropriado, espalhada numa camada fina e
solvente aps cada aplicao. Se, na mesma tira de papel, uniforme sobre um suporte (placa) de vidro, de metal ou
se efectuam aplicaes em dois ou mais locais, deixe, entre de plstico. As solues em anlise so aplicadas sobre a
cada um, um espao no inferior a 3 cm. Coloque o papel placa antes do desenvolvimento. A separao assenta em
na cmara, tape-a e deixe em repouso durante 1 h e 30 min. mecanismos de adsoro, de partilha ou de troca de ies
Introduza o papel na fase mvel, retire-o da cmara quando ou na combinao destes mecanismos e efectua-se por
aquela tiver percorrido a distncia prescrita ou quando tiver migrao (desenvolvimento) de solues (solues em
decorrido o tempo indicado na monografia. Seque-o ao ar. anlise) atravs da camada fina (fase estacionria) num
Durante o perodo de desenvolvimento, mantenha o papel solvente ou mistura de solventes apropriada (fase mvel).
protegido de luz intensa.
APARELHAGEM
CROMATOGRAFIA DESCENDENTE
Placas. A cromatografia efectua-se com placas pr-
Aparelhagem. A aparelhagem consiste num recipiente de -fabricadas, satisfazendo descrio que figura em
vidro, esmerilado na parte superior, cujas dimenses esto em 4.1.1. Reagentes.
relao com as do papel a utilizar e cuja tampa, de preferncia
tambm esmerilada, permite obter um sistema perfeitamente Pr-condicionamento das placas. Pode ser necessrio
estanque. Na tampa existe um orifcio central com cerca lavar as placas antes da separao. Esta operao pode
de 1,5 cm de dimetro, tapado com uma placa de vidro ser efectuada por migrao de um solvente apropriado.
esmerilado ou com uma rolha. Na parte superior da cmara As placas podem tambm ser impregnadas por processos
e no seu interior, encontra-se uma tina apoiada em suportes, como o desenvolvimento, a imerso ou a pulverizao. No
munida de um dispositivo permitindo fixar a parte superior momento da utilizao, as placas podem ser activadas, se
do papel para cromatografia. Em cada lado da tina, paralela e necessrio, por aquecimento na estufa a 120C durante
ligeiramente acima dos seus bordos superiores, encontram-se 20 min.
duas varetas de vidro destinadas a servir de suporte ao papel,
cuja extremidade livre no deve contactar com qualquer ponto Cmara de cromatografia de fundo plano ou com tina dupla,
da cmara. O papel de cromatografia um papel de filtro em material transparente e inerte, de dimenses adaptadas
apropriado, cortado em tiras de comprimento suficiente e de s placas utilizadas e munida de uma tampa que assegure
largura compreendida entre 2,5 cm e o comprimento da tina um fecho estanque. Para o desenvolvimento horizontal a
de forma a que a fase mvel se desloque na direco das suas cmara munida de uma tina para a fase mvel e de um
fibras. dispositivo que permita guiar a fase mvel em direco fase
Mtodo. Coloque no fundo da cmara uma camada com estacionria.
cerca de 2,5 cm do solvente indicado na monografia. Adapte
a tampa, deixe em repouso durante 24 h, a 20 25C, e Micropipetas, microsseringas, capilares calibrados ou
mantenha a mesma temperatura durante as operaes qualquer outro dispositivo adaptado aplicao correcta das
subsequentes. solues.

2.2.27. Cromatografia em camada fina
Dispositivo de deteco de fluorescncia que permita medir Retire a placa quando a fase mvel tiver percorrido a
a fluorescncia directa ou a inibio da fluorescncia. distncia indicada na monografia. Seque e proceda
revelao dos cromatogramas como prescrito.
Dispositivos de revelao e reagentes para visualizar No caso de uma cromatografia bidimensional, seque
os compostos separados. So empregados dispositivos as placas aps o primeiro desenvolvimento e efectue o
apropriados para a derivatizao por transferncia de segundo desenvolvimento numa direco perpendicular do
2. Mtodos
reagentes sobre a placa (pulverizao, imerso, vapores) e, se

Analticos
primeiro.
for caso disso, para o aquecimento da placa.
Documentao. Pode empregar-se um dispositivo para obter AVALIAO VISUAL

um documento do cromatograma visualizado, por exemplo
uma fotografia ou um ficheiro informtico. Identificao. Compare visualmente a mancha principal do
cromatograma obtido com a soluo problema e a mancha
correspondente do cromatograma obtido com a soluo
TCNICA padro, comparando a colorao, as dimenses e o factor de
retardamento (RF) das duas manchas.
Aplicao das amostras. Aplique o volume prescrito das O factor de retardamento(RF) definido como sendo a relao
solues a uma distncia apropriada do bordo inferior e dos da distncia entre o ponto de aplicao e o centro da mancha,
lados da placa e numa linha paralela ao bordo inferior; deixe por um lado, e a distncia percorrida pela frente do solvente a
um intervalo de, pelo menos, 10 mm (5 mm para as placas de partir do ponto de aplicao, por outro.
alta resoluo) entre os centros das aplicaes circulares e de,
pelo menos, 5 mm (2 mm para as placas de alta resoluo) Verificao do poder de separao para fins de identificao.
entre os lados das aplicaes em traos. Aplique as solues Normalmente, os resultados obtidos no ensaio de poder de
em pores suficientemente pequenas para obter manchas separao cromatogrfica descrito em 4.1.1. Reagentes
circulares de 2-5 mm de dimetro (1-2 mm para as placas so suficientes. S em casos particulares se prescreve na
de alta resoluo) ou bandas de 10-20 mm (5-10 mm para as monografia um ensaio de poder de separao cromatogrfica
placas de alta resoluo) por 1-2 mm. suplementar.
Quando numa monografia, so utilizadas uma placa normal

Ensaio de substncias aparentadas. Compare visualmente
e uma placa de alta resoluo, as condies operatrias que
a(s) mancha(s) secundria(s) do cromatograma obtido
dizem respeito a esta ltima, so indicadas entre [], a seguir
com a soluo problema quer com a(s) mancha(s)
s que dizem respeito placa normal.
correspondente(s) do cromatograma obtido com a soluo
padro contendo a(s) impureza(s), quer com a mancha do
Procedimento vertical. Revista as paredes da cmara de cromatograma obtido com a soluo padro preparada a
cromatografia com papel de filtro. Verta na cmara de partir de uma diluio da soluo problema.
cromatografia uma quantidade da fase mvel suficiente, em
relao ao volume da cmara, para obter, aps impregnao Verificao do poder de separao. As exigncias relativas
do papel de filtro, uma altura de lquido adaptada s verificao do poder de separao so prescritas nas
dimenses da placa. Para a saturao da cmara coloque a monografias especficas.
tampa e deixe em repouso a 20-25C durante 1 h. Na ausncia Verificao do poder de deteco. O poder de deteco
de indicaes especficas na monografia, a separao considerado como satisfatrio se a mancha ou banda do
efectua-se numa cmara saturada. cromatograma obtido com a soluo mais diluda do padro
Aplique o volume prescrito como se descreve antes. Quando for nitidamente visvel.
o solvente das solues aplicadas se tiver evaporado, coloque
a placa na cmara de cromatografia, em posio to vertical
DETERMINAES QUANTITATIVAS
quanto possvel, ficando os pontos de aplicao sempre acima
do nvel da fase mvel. Feche a cmara de cromatografia e
As exigncias relativas resoluo e separao so
mantenha-a a 20-25C, ao abrigo da luz solar. Retire a placa
prescritas nas monografias especficas.
quando a fase mvel tiver percorrido a distncia indicada na
monografia. Seque e proceda revelao dos cromatogramas As substncias que respondem exposio s radiaes
como prescrito. ultravioleta-visvel separadas por cromatografia em
camada fina podem ser directamente determinadas numa
No caso de uma cromatografia bidimensional, seque as placa se se utilizar aparelhagem apropriada. Examine
placas aps o primeiro desenvolvimento e efectue o segundo a placa determinando a reflectncia do feixe incidente,
desenvolvimento numa direco perpendicular do primeiro. deslocando a placa ou o dispositivo de medida. Do mesmo
modo, a fluorescncia pode ser determinada usando um
Procedimento horizontal. Aplique o volume prescrito sistema ptico apropriado. As substncias que contm
como se descreve antes. Quando o solvente das solues radionuclidos podem ser quantificadas de trs maneiras
aplicadas se tiver evaporado, junte uma quantidade distintas: directamente, deslocando a placa em relao a
suficiente da fase mvel na tina da cmara, usando uma um contador apropriado ou vice-versa (ver Preparaes
seringa ou uma pipeta, Coloque horizontalmente a placa radiofarmacuticas), cortando as placas em bandas e
na cmara e ajuste o dispositivo que permite guiar a fase medindo a radioactividade em cada uma delas com um
mvel de acordo com as instrues do fabricante. Se a contador apropriado ou, ainda, raspando a fase estacionria,
monografia o prescrever, desenvolva as placas comeando dissolvendo-a numa mistura para cintilao apropriada
simultaneamente pelas duas extremidades. Feche a cmara e determinando a radioactividade com um contador de
e mantenha-a temperatura de 20-25C. cintilao lquida.

2.2.28. Cromatografia em fase gasosa
Aparelhagem. A aparelhagem que permite a determinao A cromatografia em fase gasosa fundamenta-se em

directa sobre a placa constituda por: mecanismos de adsoro, de distribuio de massa ou de
excluso.
um dispositivo para o posicionamento exacto e a
reproduo precisa do volume de substncia depositada na
placa, APARELHAGEM
um dispositivo mecnico que permite deslocar a placa ou
2. Mtodos
Analticos
o dispositivo de medida em redor do eixo dos x ou do eixo A aparelhagem constituda por um injector, uma coluna
dos y, cromatogrfica colocada num forno, um detector e um
sistema de aquisio de dados (um integrador ou um
um registador e um integrador apropriados ou um registador). O gs vector circula atravs da coluna a dbito ou
computador. presso controlados e depois passa atravs do detector.
Para as substncias que respondem exposio s radiaes A cromatografia pode desenvolver-se a temperatura constante
ultravioleta-visvel: ou de acordo com um programa de temperaturas.
para medir a reflectncia ou a transmitncia so usados um
fotmetro com uma fonte de luz, um sistema ptico capaz Injectores
de gerar luz monocromtica e uma clula fotoelctrica de A injeco directa das solues o mtodo usual de injeco,
sensibilidade adequada. Se a fluorescncia determinada, salvo indicao em contrrio prescrita na monografia. Pode
necessrio um filtro para impedir a luz de excitao de ser efectuada directamente no topo da coluna por meio de
atingir o detector deixando passar a luz emitida ou uma uma seringa ou de uma vlvula de injeco ou numa cmara
parte especfica desta. de vaporizao que pode estar equipada com um divisor de
Para as substncias que contm radionuclidos: um contador fluxo.
adequado para a determinao da radioactividade. Deve ser A injeco em fase de vapor pode ser efectuada por meio de
verificado o intervalo de linearidade.
sistemas de injeco do vapor em equilbrio com a amostra
(head-space) esttico ou dinmico.
Mtodo. Prepare a soluo da amostra (soluo problema)
segundo as indicaes estabelecidas na monografia e, se Os sistemas de injeco head-space dinmico
necessrio, prepare solues padro utilizando o mesmo compreendem um dispositivo que arrasta as substncias
solvente que na soluo problema. Aplique o mesmo volume volteis em soluo para uma coluna absorvente mantida
de cada soluo na placa e submeta ao desenvolvimento. a baixa temperatura onde so absorvidas. Procede-se, de
seguida, por aquecimento rpido da coluna absorvente, a uma
Substncias que respondem exposio s radiaes libertao das substncias retidas para a fase mvel.
ultravioleta-visvel. Prepare e aplique, pelo menos, trs
solues padro cujas concentraes enquadrem o valor Os sistemas de injeco head-space esttico compreendem
esperado para a soluo problema (cerca de 80, 100 e 120 por uma cmara de aquecimento termostatada na qual os
cento). Pulverize com o reagente prescrito, se necessrio, e frascos fechados contendo as amostras slidas ou lquidas
registe a reflectncia, a transmitncia ou a fluorescncia dos so colocados durante um determinado tempo para permitir
cromatogramas obtidos com a soluo problema e com as a vaporizao dos compostos volteis at ao equilbrio
solues padro. A partir dos resultados obtidos determine a entre a fase de vapor e a fase no gasosa. Uma vez atingido
quantidade de substncia na soluo problema. o equilbrio, uma quantidade determinada do vapor em
equilbrio com a amostra (head-space) injectada no
Substncias que contm radionuclidos. Prepare e aplique
cramatgrafo.
uma soluo problema que contenha cerca de 100 por cento
do valor esperado. Determine a radioactividade em funo do
comprimento do percurso e anote a radioactividade em cada Fases estacionrias
pico da resultante, na forma de percentagem da quantidade As colunas que contm a fase estacionria podem ser de
de radioactividade total. Critrios de conformidade do diferentes tipos:
sistema so descritos no captulo Tcnicas de separao
cromatogrfica (2.2.46). Os limites dentro dos quais coluna capilar de slica fundida de parede recoberta pela
possvel fazer variar os diferentes parmetros para satisfazer fase estacionria,
aos critrios de conformidade do sistema so igualmente coluna cheia com partculas inertes impregnadas com a
indicados naquele captulo. fase estacionria,
coluna cheia com uma fase estacionria slida.
2.2.28. CROMATOGRAFIA As colunas capilares tm de 0,1 mm a 0,53 mm de dimetro
EM FASE GASOSA interno ()e de 5 m a 60 m de comprimento. A fase lquida
ou estacionria depositada na parede interna da coluna,
qual pode estar quimicamente ligada, na forma de uma
A cromatografia em fase gasosa (CFG) uma tcnica de
pelcula de 0,1 m a 5,0 m de espessura.
separao cromatogrfica baseada na distribuio diferencial
das espcies entre duas fases no miscveis, uma fase As colunas cheias, de vidro ou metal, tm geralmente
estacionria contida numa coluna e um gs vector, como de 1 m a 3 m de comprimento e de 2 mm a 4 mm de
fase mvel, que atravessa a fase estacionria. Aplica-se s dimetro interno (). As fases estacionrias so geralmente
substncias, ou derivados das substncias, que se volatilizam constitudas por polmeros porosos ou por suportes slidos
nas condies de temperatura utilizadas. impregnados com uma fase lquida.

2.2.28. Cromatografia em fase gasosa
Os suportes para a anlise de compostos polares em APARELHAGEM

colunas cheias com fase estacionria fracamente polar de
baixa capacidade so inertes para evitar o fenmeno de Compe-se de um cromatgrafo em fase gasosa ao qual
arrastamento dos picos. A reactividade do material que se adapta um dispositivo de introduo da amostra,
constitui o suporte pode ser reduzida por silanizao feita eventualmente ligado a um mdulo de programao que
antes da introduo da fase lquida. Utiliza-se frequentemente controla automaticamente a temperatura e a presso; pode
a terra de infusrios calcinada e lavada com cido. Os materiais igualmente compreender, se necessrio, um dispositivo de
2. Mtodos
Analticos
existem em diferentes granulometrias sendo as compreendidas eliminao de solventes.

nos intervalos de 150-180 m e de 125-150 m as mais A amostra introduzida num recipiente que tem um
correntemente utilizadas. obturador apropriado, bem como um sistema de vlvulas
que permitam a passagem do gs vector. O conjunto
Fases mveis colocado numa cmara termostatada temperatura prescrita
para a substncia examinada. A amostra mantida a essa
O tempo de reteno e a eficcia so funo do dbito do temperatura durante o tempo necessrio para atingir o
gs vector. O tempo de reteno tambm directamente equilbrio entre a fase gasosa e a fase slida ou lquida.
proporcional ao comprimento da coluna, enquanto que a
resoluo proporcional raiz quadrada do comprimento O gs vector introduzido no recipiente e, aps o tempo
da coluna. No caso das colunas cheias, o dbito do gs vector prescrito, a abertura de uma vlvula apropriada permite
geralmente expresso em mililitros por minuto, presso ao gs passar, detendo-se na coluna, arrastando consigo os
atmosfrica e temperatura ambiente. determinado compostos volatilizados.
sada do detector com um dispositivo mecnico calibrado Em vez de um cromatgrafo especialmente equipado para
ou com um contador de bolhas quando a coluna atinge a introduo das amostras, possvel utilizar seringas
a sua temperatura de funcionamento. A um certo dbito estanques e um cromatgrafo normal. Neste caso, a
volmico, a velocidade linear de deslocao do gs atravs da equilibrao realizada num conjunto separado, sendo
coluna cheia inversamente proporcional raiz quadrada do aconselhvel tomar as precaues necessrias para evitar
dimetro interno da coluna: um dbito de 60 ml/min numa qualquer modificao do equilbrio, quando da transferncia
coluna de 4 mm de dimetro interno e um dbito de 15 ml/min da fase de vapor para a coluna.
numa coluna de 2 mm de dimetro interno daro a mesma
velocidade linear de deslocao e, por consequncia, tempos
de reteno semelhantes. MTODO
Os gases vectores mais correntemente utilizados so o Com o auxlio de preparaes padro, proceda aos acertos
hlio ou o azoto para as colunas cheias, o azoto, o hlio e o necessrios para obter uma boa resposta.
hidrognio para as colunas capilares.
Calibrao directa
Detectores
Em recipientes idnticos, introduza separadamente a
Os detectores de ionizao de chama so os mais utilizados, preparao a examinar e cada uma das preparaes padro,
mas, segundo o objectivo da anlise, igualmente possvel segundo as prescries da monografia, de modo que o
recorrer captura de electres, a detectores azoto-fsforo, dispositivo de colheita no entre em contacto com as amostras.
espectrometria de massa, condutividade trmica ou
espectrofotometria no infravermelho com transformada de Feche hermeticamente os recipientes e coloque-os numa
Fourier e a outros mtodos. cmara termostatada, regulada para a temperatura e presso
indicadas na monografia; depois da equilibrao proceda
cromatografia nas condies prescritas.
MTODO
Mtodo das adies
Equilibre a coluna, o injector e o detector para as
temperaturas e dbitos indicados na monografia, at obter Numa srie de recipientes idnticos e apropriados, introduza
uma linha de base estvel. Prepare a(s) soluo(es) problema volumes iguais da preparao a examinar. Adicione a todos
e a(s) soluo(es) padro prescritas. As solues esto os recipientes, excepto um, as quantidades apropriadas de
isentas de partculas slidas. uma preparao padro contendo o composto a dosear numa
concentrao conhecida, de modo a obter uma srie de
No captulo Tcnicas de separao cromatogrfica (2.2.46) preparaes de concentrao progressivamente crescente.
descrevem-se critrios de conformidade do sistema. Os
Feche os recipientes hermeticamente e coloque-os numa
limites dentro das quais se podem fazer variar os diferentes
cmara termostatada, regulada para a temperatura e presso
parmetros, para satisfazer aos critrios de conformidade do
indicadas na monografia; aps a equilibrao, proceda
sistema esto igualmente indicados nesse captulo.
cromatografia nas condies prescritas.
Calcule a equao da recta pelo mtodo dos mnimos
Cromatografia em fase gasosa com quadrados. Com esta equao, calcule a concentrao do
head-space esttico composto a dosear na amostra. Tambm possvel proceder
como se segue: transporte para um grfico a mdia dos
A cromatografia em fase gasosa com head-space esttico valores lidos, em funo da quantidade adicionada do
uma tcnica especialmente adaptada separao e ao composto a dosear. Extrapole a recta com os pontos do
doseamento de compostos volteis presentes em amostras grfico at ao eixo das concentraes. A distncia entre o
slidas ou lquidas. Baseia-se na anlise de uma fase de vapor ponto de interseco e a origem representa a concentrao do
em equilbrio com a fase slida ou lquida. composto a dosear na amostra.

2.2.29. Cromatografia lquida
ESGOTAMENTO SUCESSIVO (EXTRACO COM HEAD- slica, alumina, ou grafite porosa, utilizadas em
-SPACE MLTIPLO) cromatografia de polaridade de fase normal em que a
separao assenta numa adsoro diferencial e/ou numa
Quando prescrito o mtodo do esgotamento sucessivo o distribuio mssica,
processo inteiramente descrito na monografia. resinas ou polmeros com grupos cidos ou bsicos,
utilizados em cromatografia de troca de ies na qual a
2. Mtodos
separao assenta na competio entre os ies a separar e
Analticos
2.2.29. CROMATOGRAFIA LQUIDA os ies da fase mvel,
slica ou polmeros porosos, utilizados em cromatografia
A cromatografia lquida (CL) uma tcnica de separao de excluso em que a separao assenta nas diferenas de
cromatogrfica que se baseia na distribuio diferencial das volume entre molculas, o que corresponde a uma excluso
espcies entre duas fases no miscveis, uma fase estacionria estrica,
contida numa coluna e uma fase mvel lquida que atravessa,
por percolao, a fase estacionria. diversos suportes qumicos modificados, preparados a
partir de polmeros, de slica ou de grafite porosa,
A CL fundamenta-se principalmente em mecanismos de utilizados em CL de polaridade de fase inversa, em que a
adsoro, de distribuio de massa, de troca de ies, de separao assenta principalmente na partilha das molculas
excluso ou de interaco estereoqumica. entre a fase mvel e a fase estacionria,
fases estacionrias especiais, quimicamente modificadas,
APARELHAGEM como derivados da celulose ou da amilose, das protenas ou
dos peptidos, das ciclodextrinas, etc., para a separao dos
enantimeros (cromatografia quiral).
A aparelhagem consiste num sistema de bombagem, um
injector, uma coluna cromatogrfica (eventualmente A maior parte das separaes assenta em mecanismos de
termostatada), um detector e um sistema de obteno de partilha que utilizam slica quimicamente modificada como
dados (ou um integrador ou um registador). A fase mvel, fase estacionria e solventes polares como fase mvel. A
libertada a partir de um ou vrios reservatrios, circula superfcie do suporte (por exemplo, os grupos silanol da
atravs da coluna geralmente com dbito constante, slica) posta em presena de diferentes reagentes da famlia
passando, em seguida, atravs do detector. dos silanos, com os quais reage, formando, por ligao
covalente, derivados sililados que ocupam um nmero
Sistemas de bombagem varivel dos locais reactivos da superfcie do suporte. A
natureza da fase ligada um parmetro determinante para
Os sistemas de bombagem para CL fornecem a fase mvel as propriedades de separao do sistema cromatogrfico. As
com um dbito constante. Convm limitar, tanto quanto fases ligadas mais correntemente utilizadas so as seguintes:
possvel, as flutuaes de presso, por exemplo fazendo passar
o solvente sob presso atravs de um dispositivo amortecedor octilo = Si(CH2)7CH3 C8

das variaes de presso. Os tubos e ligaes devem resistir octadecilo = Si(CH2)17CH3 C18

s presses desenvolvidas pela bomba. As bombas para CL fenilo = Si(CH2)n(C6H5) C6H5

podem ser equipadas com um dispositivo de purga que cianopropilo = Si(CH2)3CN CN
permita eliminar as bolhas de ar incorporadas. aminopropilo = Si(CH2)3NH2 NH2

diol = Si(CH2)3OCH(OH)CH2OH
Os sistemas comandados por microprocessadores so capazes
de libertar com preciso uma fase mvel de composio Salvo indicao em contrrio do fabricante, as colunas de fase
constante (eluio isocrtica) ou varivel (eluio em inversa com base em slica, so consideradas como estveis
gradiente), segundo um programa definido. Para as para as fases mveis de pH aparente compreendido entre 2,0
cromatografias com eluio em gradiente existem sistemas e 8,0. As colunas com base em grafite porosa ou de partculas
de bombagem que libertam o(s) solvente(s) a partir de de polmeros como o copolmero estirenodivinilbenzeno so
vrios reservatrios, podendo a mistura ser efectuada quer a estveis para um intervalo de pH mais largo.
montante (baixa presso), quer a jusante (alta presso) da(s)
bomba(s). possvel, em certos casos, proceder por cromatografia
em fase normal utilizando como fase estacionria slica
no modificada, grafite porosa ou slica quimicamente
Injectores modificada, polar (cianopropilo ou diol, por exemplo), com
A amostra introduzida na fase mvel entrada da coluna ou uma fase mvel no polar.
na proximidade desta com a ajuda de um sistema de injeco Em cromatografia analtica, o tamanho das partculas
concebido para funcionar a presso elevada. que constituem as fases estacionrias mais utilizadas est
Os injectores podem ser em ansa (loop) ou de volume compreendida entre 3 m e 10 m. As partculas podem ser
varivel, de funcionamento manual ou comandados por de forma esfrica ou irregular e de porosidade e superfcie
um auto-analisador. O enchimento parcial das ansas, especfica variveis. Estes parmetros tm influncia no
manualmente, pode provocar uma menor fiabilidade do comportamento cromatogrfico da fase estacionria. No
volume injectado. caso das fases inversas, a natureza da fase estacionria, a
taxa de ligao (expressa, por exemplo, em taxa de carbono)
e o facto de a fase estacionria ter ou no ligaes (end-
Fases estacionrias -capping: sililao dos grupos silanol residuais) so
tambm factores determinantes. A presena de grupos
Utilizam-se numerosos tipos de fases estacionrias em CL, silanol residuais pode facilitar a assimetria (tailing) dos
nomeadamente: picos, nomeadamente das substncias bsicas.

2.2.30. Cromatografia de excluso
As colunas utilizadas para a cromatografia analtica so de na monografia, at obteno de uma linha de base
ao inoxidvel, salvo indicao em contrrio na monografia, estvel. Prepare a(s) soluo(es) problema e a(s)
e so de comprimento e dimetro interno () variveis. soluo(es) padro prescritas. As solues esto isentas
As colunas de dimetro interno inferior a 2 mm so de partculas slidas.
frequentemente chamadas de microcolunas. A temperatura
Descrevem-se critrios de conformidade do sistema no
da fase mvel e da coluna mantida constante durante todo
captulo "Tcnicas de separao cromatogrfica (2.2.46)". Os
o tempo que dura o ensaio. A maior parte das separaes
2. Mtodos
Analticos
limites dentro dos quais possvel fazer variar os diferentes

so efectuadas temperatura ambiente, mas possvel
aquecer as colunas para obter uma maior eficcia. Contudo, parmetros para satisfazer aos critrios de conformidade do
recomendado no ultrapassar 60C, dado o risco de sistema constam igualmente no referido captulo.
degradao da fase estacionria ou alterao da composio
da fase mvel.
2.2.30. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSO
Fases mveis
A cromatografia de excluso uma tcnica cromatogrfica
Para a cromatografia em fase normal, os solventes utilizados que permite separar molculas dissolvidas em funo do
so de baixa polaridade. Torna-se necessrio um rigoroso seu tamanho. Quando se utilizam fases mveis de natureza
controlo da presena de gua na fase mvel para obter orgnica, este mtodo de separao designado por
resultados reprodutveis. Para a CL em fase inversa, cromatografia de permeao em gel e, quando se utilizam
utilizam-se fases mveis aquosas, com ou sem modificantes fases mveis aquosas, a designao habitual de
orgnicos. cromatografia de filtrao em gel.
Os componentes da fase mvel so geralmente filtrados A amostra introduzida numa coluna que contm um
para eliminar as partculas de tamanho superior a 0,45 m. suporte constitudo por um gel ou por partculas de um
As fases mveis constitudas por vrios componentes so material slido poroso e eluda pela fase mvel que percorre
preparadas pela medida dos volumes requeridos para cada
a coluna. A separao das molculas, em funo dos seus
componente (a menos que as propores sejam especificadas
tamanhos, efectua-se por trocas sucessivas das molculas
em massa) que, de seguida, so misturadas. Em alternativa,
do soluto entre o solvente da fase mvel e o mesmo solvente
os solventes so dispensados por meio de bombas individuais
fixado no interior do material de suporte (fase estacionria),
comandados por vlvulas de dbito proporcional, sendo
assim preparada a mistura nas propores programadas. cuja porosidade mdia constitui o factor determinante
Os solventes so normalmente desgasificados antes da do intervalo das dimenses moleculares dentro do qual a
bombagem, por passagem de uma corrente de hlio, por separao se pode verificar.
ultra-sons ou por filtrao em mdulos membrana/vcuo. As molculas suficientemente pequenas para poderem
Esta operao destina-se a evitar a formao de bolhas de gs penetrar em todos os poros do material de suporte so eludas
na clula de deteco. da coluna no volume de permeao total (Vt). Por outro
Os solventes utilizados para preparar a fase mvel so lado, as molculas cujo tamanho aparentemente superior
normalmente isentos de agentes estabilizantes e so dimenso mxima dos poros do mesmo material deslocam-se
transparentes no comprimento de onda da deteco, ao longo da coluna, passando somente atravs dos espaos
quando se utiliza um detector de UV. Os solventes e outros intersticiais do suporte sem que sejam retidas, e so eludas
componentes utilizados so de qualidade apropriada. O da coluna no volume de excluso (Vo, volume intersticial). A
ajuste do pH, se necessrio, exclusivamente efectuado no separao, de acordo com o tamanho das molculas, ocorre
componente aquoso da fase mvel e no na mistura. Quando entre o volume de excluso e o volume de permeao total,
se utilizam solues tampo, convm lavar cuidadosamente verificando-se, habitualmente, nos primeiros dois teros
o sistema com uma mistura de gua e solvente orgnico deste intervalo.
da fase mvel (5 por cento V/V), uma vez a cromatografia
Aparelhagem. A aparelhagem consiste, essencialmente,
terminada, para evitar a cristalizao dos sais.
numa coluna cromatogrfica de comprimento e dimetro
As fases mveis podem conter aditivos como, por exemplo, interno () variveis, termostatada quando necessrio, tendo
um contra-io no caso de uma cromatografia por como enchimento um material de suporte com capacidade
emparelhamento de ies ou um selector quiral no caso de de separao das substncias em funo de um intervalo
uma cromatografia de fase estacionria aquiral. apropriado relativamente ao tamanho das suas molculas.
O eluente desloca-se atravs da coluna com velocidade
Detectores constante. entrada da coluna encontra-se geralmente
adaptado um dispositivo apropriado que permite a introduo
Os detectores mais utilizados so os espectrofotmetros
da amostra, tal como um regulador de fluxo, uma seringa
de ultravioleta/visvel (UV/Vis), incluindo os detectores de
atravessando um septo ou uma vlvula de injeco, podendo
matriz de dodos. A deteco pode igualmente assentar na
fluorimetria, na refractometria diferencial, em mtodos ainda existir uma bomba apropriada para controlo do fluxo
electroqumicos, na espectrometria de massa, na disperso da do eluente. Como alternativa, a amostra pode ser aplicada
luz, na radioactividade e noutros mtodos particulares. directamente sobre a superfcie do material de suporte
drenado ou, quando a amostra mais densa que o eluente,
pode ser distribuda na interface deste com o material de
MTODO suporte. A sada da coluna encontra-se geralmente ligada
a um detector apropriado, associado a um registador
Equilibre a coluna com a fase mvel e o dbito indicados, automtico que permite a determinao das concentraes
temperatura ambiente ou temperatura especificada relativas dos componentes separados. Os detectores so

2.2.31. Electroforese
normalmente baseados em propriedades fotomtricas, 2.2.31. ELECTROFORESE

refractomtricas ou de luminiscncia. Quando necessrio,
pode encontrar-se ligado ao sistema um colector automtico
de fraces. PRINCPIOS GERAIS
O material de suporte pode ser pouco consistente, como Por aco de um campo elctrico, as partculas carregadas
um gel impregnado, ou rgido, tal como vidro, slica ou um dissolvidas ou dispersas numa soluo electroltica
2. Mtodos
Analticos
polmero orgnico reticulado compatvel com os solventes. migram em direco ao elctrodo de polaridade oposta.
Os suportes rgidos requerem, geralmente, sistemas Na electroforese em gel, o deslocamento das partculas
pressurizados permitindo separaes mais rpidas. A escolha retardado pelas interaces com o gel da matriz que constitui
da fase mvel depende da natureza da amostra, do meio de o meio de migrao e comporta-se como um tamis
separao e do mtodo de deteco. Antes de se efectuar a molecular. O campo elctrico e o tamis molecular agem em
separao, o material de suporte objecto de um tratamento sentido contrrio. Tal facto produz um efeito de velocidade de
apropriado e procede-se ao enchimento da coluna de acordo migrao diferencial segundo o tamanho, a forma e a carga
com as indicaes da monografia ou as instrues do das partculas. Devido s suas propriedades fsico-qumicas
fabricante. diferentes, as diversas macromolculas contidas numa
mistura migraro a velocidades diferentes durante a
No captulo Tcnicas de separao cromatogrfica (2.2.46) electroforese, ficando assim separadas em fraces bem
indicam-se critrios de conformidade do sistema. Os definidas. As separaes electroforticas podem ser
limites dentro dos quais possvel fazer variar os diferentes conduzidas em sistemas sem fase de suporte (por exemplo,
parmetros para satisfazer aos critrios de conformidade do electroforese capilar livre em soluo), ou em meios
sistema so igualmente indicados no referido captulo. estabilizantes como placas de camada fina, filmes ou geles.
Determinao das quantidades relativas dos componentes de ELECTROFORESE LIVRE OU DE FRONTEIRA

misturas
Proceda separao de acordo com as indicaes da Este mtodo principalmente utilizado na determinao
monografia. Se for possvel, acompanhe a eluio dos de mobilidades, sendo as caractersticas experimentais
compostos recorrendo a um registador e determine as reas directamente medidas e reprodutveis. Aplica-se, sobretudo,
a substncias de massa molecular relativa elevada, pouco
dos picos correspondentes. Se a amostra controlada com
difusveis.
base numa propriedade fsico-qumica em relao qual
os diversos componentes originam respostas equivalentes As fronteiras so inicialmente demarcadas por um processo
(a mesma absorvncia especfica, por exemplo), calcule a fsico como a refractometria ou a condutimetria. Aps a
quantidade relativa de cada componente dividindo a rea do aplicao de um campo elctrico definido, durante um
pico correspondente pela soma das reas dos picos de todos tempo exacto, obtm-se novas fronteiras e determinam-se
os componentes em anlise. Se a resposta dos detectores no as posies respectivas. As condies operatrias permitem
equivalente para todos os componentes em anlise, calcule no s a determinao das fronteiras como tambm dos
as suas concentraes por intermdio de curvas de calibrao constituintes.
obtidas com os padres indicados na monografia.
ELECTROFORESE EM SUPORTE OU ELECTROFORESE
Determinao de massas moleculares DE ZONA
A cromatografia de excluso pode utilizar-se para a
Este mtodo s necessita de tomadas de ensaio reduzidas.
determinao de massas moleculares por comparao com
padres de calibrao apropriados, indicados na monografia. A natureza do suporte, como papel, gelose, acetato de
Os volumes de reteno dos padres de calibrao podem ser celulose, amido, agarose, metacrilamida ou gel misto,
marcados num grfico em funo dos logaritmos das suas fazem intervir factores suplementares que modificam a
massas moleculares. O traado aproxima-se, habitualmente, mobilidade:
de uma recta dentro dos limites de excluso e de permeao a) devido sinuosidade dos canalculos do suporte, a
total, relativamente ao sistema utilizado. As massas distncia aparentemente percorrida mais pequena que a
moleculares podem ser determinadas a partir desta curva de distncia real,
calibrao. A calibrao da massa molecular apenas vlida
b) certos suportes no so electricamente neutros e, como o
para um dado sistema soluto macromolecular/sistema de meio constitui uma fase estacionria, pode provocar uma
solvente, nas condies experimentais prescritas. corrente de electroendosmose importante,
c) o aquecimento devido ao efeito de Joule pode produzir
Determinao da distribuio das dimenses moleculares
uma certa evaporao do lquido do suporte, o que conduz,
de polmeros por capilaridade, a um deslocamento da soluo das
A cromatografia de excluso pode aplicar-se determinao extremidades para o centro; assim, a fora inica tende a
da distribuio das dimenses moleculares de polmeros. aumentar progressivamente.
Todavia, a comparao entre diferentes amostras vlida A velocidade de migrao depende, pois, de quatro factores
somente para resultados obtidos nas mesmas condies principais: mobilidade da partcula carregada, corrente de
experimentais. A natureza das substncias utilizadas para electro-endosmose, corrente de evaporao e intensidade do
a calibrao e as tcnicas de determinao da distribuio campo. Por estas razes necessrio proceder em condies
das dimenses moleculares de polmeros so indicadas na experimentais bem determinadas e utilizar, se possvel,
monografia. substncias padro.

Aparelhagem. Um aparelho de electroforese consta de: Mtodo. De um modo geral, recomenda-se desgaseificar
as solues antes da polimerizao e utilizar o gel
um gerador de corrente contnua de tenso controlvel e
imediatamente aps a sua preparao.
de preferncia estabilizada.
Prepare o gel segundo as indicaes da monografia. Verta
uma tina de electroforese, geralmente de forma
a mistura nos tubos de vidro apropriados, fechados na
rectangular, de vidro ou de matria plstica rgida,
com dois compartimentos separados, o andico e o extremidade inferior com uma rolha, at uma altura igual
2. Mtodos
em todos eles, distncia de cerca de 1 cm do bordo superior

Analticos
catdico, que contm a soluo electroltica; em cada

compartimento mergulha um elctrodo, por exemplo, do tubo. Evite a introduo de bolhas de ar nos tubos. Cubra
de platina ou de grafite, respectivamente nodo e ctodo, a mistura com uma camada de gua R a fim de impedir o
ligados por um circuito convenientemente isolado ao borne contacto com o ar e deixe em repouso. A formao do gel
correspondente do gerador; o nvel do lquido nos dois requere geralmente cerca de 30 min e est completa quando
compartimentos igual para evitar o efeito de sifonagem. aparece uma delimitao ntida entre o gel e a fase aquosa.
Elimine a fase aquosa. Encha o reservatrio inferior com
A tina tem uma tampa para assegurar a estanquicidade, a soluo tampo prescrita e retire as rolhas dos tubos.
permitindo manter no seu interior uma atmosfera saturada Coloque estes nas juntas do reservatrio superior de modo
de humidade e atenuar, assim, a evaporao do solvente que a sua parte inferior mergulhe na soluo tampo do
durante a migrao. Utiliza-se um dispositivo de segurana reservatrio inferior. Prepare as solues problema e as
que corte a corrente, quando se retira a tampa da tina. Para solues padro contendo o indicador corado prescrito.
potncias superiores a 10 W, aconselha-se o arrefecimento Encha cuidadosamente os tubos com a soluo tampo
do suporte de electroforese. indicada. Aplique as solues, cuja densidade foi aumentada,
um dispositivo porta-suporte. por adio de sacarose R, por exemplo, superfcie do gel,
utilizando um tubo diferente para cada soluo. Verta a
Na electroforese sobre tiras de suporte, estas so mesma soluo tampo no reservatrio superior. Ligue os
previamente impregnadas com a mesma soluo elctrodos fonte de corrente e proceda electroforese,
condutora e cada extremidade mergulhada no utilizando a corrente de intensidade ou de tenso constante
compartimento do elctrodo. As tiras ficam bem e a temperatura prescritas na monografia. Interrompa a
estendidas, fixadas sobre um porta-suporte apropriado corrente quando o indicador corado atingir o reservatrio
para evitar a difuso da soluo condutora como, por inferior. Retire imediatamente os tubos e proceda extruso
exemplo, um caixilo horizontal, um cavalete em V do gel. Localize a posio das bandas nos electroforegramas
invertido ou uma superfcie uniforme, com pontos de
segundo o processo indicado.
contacto convenientemente espaados.
Na electroforese sobre gel, o dispositivo consiste numa
placa de vidro, como, por exemplo, uma simples lmina ELECTROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
de microscpio, na qual se deposita uma camada de gel COM DODECILSULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)
aderente e de espessura uniforme em toda a superfcie da
lmina. O contacto entre o gel e a soluo condutora varia Campo de aplicao. A electroforese em gel de
em funo do tipo do aparelho utilizado. Convm evitar a poliacrilamida utilizada para a caracterizao qualitativa
condensao de humidade ou a secagem da camada slida. das protenas contidas em preparaes biolgicas, para
controlos de pureza e para determinaes quantitativas.
um dispostivo de localizao ou de revelao.
Mtodo. Introduza a soluo do electrlito nos Finalidade. A anlise por electroforese em gel um processo
compartimentos dos elctrodos. Coloque o suporte adaptado identificao e ao controlo da homogeneidade
convenientemente embebido com a soluo do electrlito das protenas contidas em preparaes farmacuticas.
na tina, de acordo com o tipo de aparelho utilizado. Trace a utilizada como rotina para avaliar a massa molecular das
linha de partida e aplique a tomada de ensaio. Deixe passar subunidades proteicas e determinar as subunidades que
a corrente durante o tempo indicado; em seguida desligue a compem as protenas purificadas.
corrente, retire o suporte da tina, seque-o e revele.
No mercado existe uma grande variedade de geles e reagentes
prontos para serem utilizados em vez dos que se descrevem
ELECTROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA mais adiante, desde que os resultados obtidos sejam
EM TUBO CILNDRICO equivalentes e que possam ser satisfeitas as condies de
validade descritas em Validao do ensaio.
Na electroforese em gel de poliacrilamida, cilndrico (em
tubo) a fase estacionria constituda por um gel preparado
a partir de acrilamida e de N,N-metilenobisacrilamida. Os CARACTERSTICAS DOS GELES DE POLIACRILAMIDA
geles so preparados em tubos, geralmente com 7,5 cm de
comprimento e 0,5 cm de dimetro interno (gel cilndrico); As propriedades de tamis dos geles de poliacrilamida esto
aplicada em cada tubo uma nica amostra. relacionadas com a sua estrutura particular que a de uma
rede tridimensional de fibras e poros resultantes da formao
Aparelhagem. O aparelho constitudo por 2 reservatrios de ligaes cruzadas entre a bisacrilamida bifuncional e
destinados a receber as solues tampo e construdos com as cadeias adjacentes de poliacrilamida. A polimerizao
um material apropriado, tal como o polimetacrilato de catalisada por um gerador de radicais livres composto
metilo. Esto dispostos verticalmente, um acima do outro, e de persulfato de amnio (PSA) e tetrametiletilenodiamina
so munidos, cada um, de um elctrodo de platina. Estes dois (TEMED).
elctrodos so ligados a uma fonte de corrente permitindo
operar com intensidade e tenso constantes. Para os geles O tamanho efectivo dos poros de um gel tanto mais
cilndricos, o reservatrio superior est munido na sua pequeno quanto mais elevada for a sua concentrao em
base de juntas de elastmero situadas a igual distncia do acrilamida. A porosidade efectiva de um gel definida
elctrodo. de modo operacional pelas suas propriedades de tamis

molecular, isto , a resistncia que ele ope migrao das Condies redutoras
macromolculas. Existem limites para as concentraes de
A associao das subunidades polipeptdicas e a estrutura
acrilamida que podem utilizar-se. A concentraes muito
tridimensional das protenas assentam muitas vezes na
elevadas os geles desfazem-se mais facilmente e tornam-se
difceis de manipular. Quando o tamanho dos poros de um existncia de pontes dissulfureto. Um dos objectivos a
gel diminui, a velocidade de migrao de uma protena nesse atingir na anlise SDS-PAGE em condies redutoras a
gel diminui tambm. Ajustando a porosidade de um gel, ruptura desta estrutura por reduo das pontes dissulfureto.
2. Mtodos
A desnaturao e a dissociao completas das protenas por
Analticos
alterando a concentrao em acrilamida, possvel optimizar
a resoluo do mtodo para um determinado produto tratamento pelo 2-mercaptoetanol ou pelo ditiotreitol (DTT)
proteico. As caractersticas fsicas de um gel dependem, provoca um desdobramento da cadeia polipeptdica seguido
portanto, do seu teor em acrilamida e em bisacrilamida. Alm de uma complexao com o SDS. Nestas condies, a massa
da composio do gel, o estado da protena constitui um molecular das subunidades polipeptdicas pode ser calculada
outro factor importante para a sua mobilidade electrofortica. por regresso linear com a ajuda de padres de massa
No caso das protenas, a mobilidade electrofortica depende molecular apropriada.
do pK dos grupos com carga elctrica e do tamanho da
molcula. igualmente afectada pela natureza, concentrao Condies no redutoras
e pH do tampo, temperatura, intensidade de campo e
natureza do suporte. Para certas anlises, a dissociao completa da protena
em subunidades peptdicas no desejvel. Na ausncia
de tratamento pelos agentes redutores, como o
ELECTROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA 2-mercaptoetanol ou o DTT, as pontes dissulfureto covalentes
EM CONDIES DESNATURANTES permanecem intactas e a conformao oligomrica da
protena preservada. Os complexos SDS-oligmero
O mtodo descrito a ttulo de exemplo aplicvel migram mais lentamente que as subunidades SDS-peptido.
anlise dos polipeptidos monmeros de massa molecular Alm disso as protenas no reduzidas podem no ser
compreendida entre 14 000 e 100 000 daltons. possvel totalmente saturadas em SDS e, por consequncia, no se
ampliar este intervalo por diferentes tcnicas (por exemplo, ligam ao detergente numa relao de massa constante. Esta
pelo emprego de geles em gradiente ou de sistemas tampo circunstncia torna a determinao da massa molecular
especiais) mas tais tcnicas no fazem parte deste texto. destas molculas pelo SDS-PAGE mais difcil que a anlise
A electroforese em gel de poliacrilamida em condies de polipeptidos totalmente desnaturados j que para que a
desnaturantes usando o dodecilsulfato de sdio (SDS-PAGE) comparao seja possvel necessrio que os padres e as
a tcnica de electroforese mais utilizada para avaliar a protenas desconhecidas tenham configuraes semelhantes.
qualidade farmacutica dos produtos proteicos e sobretudo Entretanto, a obteno no gel de uma nica banda corada
dela que o presente texto trata. De modo geral, a electroforese permanece como critrio de pureza.
analtica das protenas realizada em gel de poliacrilamida
em condies que favorecem a dissociao das protenas nas CARACTERSTICAS DA ELECTROFORESE EM GEL
suas subunidades polipeptdicas e que limitam o fenmeno EM SISTEMA TAMPO DESCONTNUO
de agregao. Utiliza-se frequentemente para este efeito,
para dissociar as protenas antes da sua aplicao no gel, o O mtodo electrofortico mais divulgado para a
dodecilsulfato de sdio (SDS), um detergente fortemente caracterizao das misturas complexas de protenas
aninico, em combinao com o calor. Os polipeptidos assenta no emprego de um sistema tampo descontnuo
desnaturados ligam-se ao SDS, adquirem cargas negativas que inclui dois geles contguos mas distintos: um gel
e caracterizam-se por uma relao carga/massa constante,
(inferior) de separao ou de resoluo e um gel (superior)
qualquer que seja o tipo de protena considerado. Sendo a
de empilhamento. Estes dois geles so de porosidade, pH
quantidade de SDS ligada quase sempre proporcional massa
e fora inica diferentes. Alis, os ies mveis utilizados
molecular do polipeptido e independente da sua sequncia, os
nos geles e nos tampes de elctrodo so, eles tambm,
complexos SDS-polipeptido migram nos geles de poliacrilamida
com mobilidades que so funo do tamanho do polipeptido. diferentes. A descontinuidade do sistema tampo conduz a
uma concentrao de grande volume das amostras no gel
A mobilidade electrofortica dos complexos detergente- de empilhamento e, portanto, a uma melhoria da resoluo.
polipeptido resultantes, apresenta sempre a mesma relao Quando o campo elctrico aplicado, um gradiente de
funcional com a massa molecular. A migrao dos complexos tenso negativo instaura-se atravs da soluo da amostra
SDS efectua-se, como seria de prever, em direco ao nodo, e arrasta as protenas no gel de empilhamento. Os ies
a velocidade mais elevada para os complexos de baixa massa glicinato contidos no tampo de elctrodo seguem as
molecular do que para os de alta massa molecular. , assim, protenas no gel de empilhamento. Forma-se rapidamente
possvel determinar a massa molecular de uma protena a partir uma zona de fronteira mvel cuja frente constituda pelos
da sua mobilidade relativa, aps comparao com solues ies cloreto de alta mobilidade e a parte de trs pelos ies
padro de valor de massa molecular conhecida e a observao de glicinato mais lentos. Um gradiente de alta tenso localizado
uma banda nica constitui um critrio de pureza. instaura-se entre as frentes inicas da cabea e da cauda e
Todavia, as modificaes eventuais da constituio do leva os complexos SDS-protena a concentrarem-se numa
polipeptido, por exemplo uma N-ou uma O-glicosilao, tm banda muito estreita que migra entre as fraces cloreto e
um impacto no negligencivel sobre a massa molecular glicinato. Em larga medida, independentemente do volume
aparente de uma protena. Com efeito, o SDS no se liga da amostra aplicado, o conjunto dos complexos SDS-protena
da mesma maneira aos agrupamentos glucdicos ou aos sofrem um efeito de condensao e penetram no gel de
agrupamentos peptdicos, de modo que a constncia da separao na forma de uma banda estreita, bem definida, de
relao carga/massa deixa de verificar-se. A massa molecular alta densidade proteica. O gel de empilhamento, de poros
aparente das protenas que sofreram modificaes largos, no atrasa geralmente a migrao das protenas mas
ps-translacionais no reflecte realmente a massa da cadeia desempenha principalmente o papel de meio anticonvectivo.
polipeptdica. Na interface dos geles de empilhamento e de separao, as

protenas so confrontadas com um brusco aumento de efeito vrias vezes a superfcie do gel com gua para eliminar
de retardamento devido ao pequeno dimetro dos poros do completamente o isobutanol e, se necessrio, a acrilamida
gel de separao. Quando penetram no gel de separao, no polimerizada. Deixe o mnimo de lquido superfcie do
este retardamento prossegue devido ao efeito de tamis gel e, eventualmente, absorva a gua residual com a ponta de
molecular exercido pela matriz. Os ies glicinato ultrapassam um guardanapo de papel.
as protenas cuja migrao prossegue, ento, num meio Num matrs, prepare o volume apropriado de uma soluo
de pH uniforme constitudo pela soluo tampo de
2. Mtodos
de acrilamida da concentrao desejada usando os valores

Analticos
tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) e pela glicina. O efeito do quadro 17. Misture os componentes pela ordem indicada.
de tamis molecular conduz a uma separao dos complexos Antes de juntar a soluo de PSA e de TEMED, filtre, se
SDS-polipeptido com base na sua respectiva massa molecular. necessrio, a presso reduzida por uma membrana de acetato
de celulose (dimetro dos poros 0,45 m); mantenha sob
PREPARAO DE GELES DE POLIACRILAMIDA SDS vcuo agitando a unidade de filtrao at que deixem de se
VERTICAIS DE TAMPO DESCONTNUO formar bolhas na soluo. Junte as quantidades apropriadas de
solues de persulfato de amnio e de TEMED (ver quadro 17),
Montagem do molde agite e verta imediatamente sobre o gel de separao. Coloque
imediatamente no lugar um pente de politetrafluoroetileno
Com um detergente suave, limpe as duas placas de limpo na soluo do gel de empilhamento, tomando a
vidro (de 10cm 8 cm, por exemplo), o pente de precauo de evitar a formao de bolhas de ar. Junte mais
politetrafluoroetileno, os dois espaadores e o tubo de soluo do gel de empilhamento de modo a encher totalmente
borracha de silicone (0,6 mm de dimetro 35 cm, por os interstcios do pente. Deixe polimerizar o gel em posio
exemplo), e lave abundantemente com gua. Seque todos os vertical, temperatura ambiente.
elementos com papel ou tecido. Lubrifique os espaadores e o
tubo com lubrificante no siliconado. Coloque os espaadores
Montagem do gel no aparelho de electroforese e separao
a 2 mm da borda ao longo de cada um dos dois lados curtos
electrofortica
e a 2 mm de um dos lados compridos da placa de vidro. Este
ltimo corresponder ao fundo do gel. Comece a instalar o Quando a polimerizao terminar (cerca de 30 min), retire
tubo sobre a placa de vidro utilizando um dos espaadores o pente com precauo. Lave os poos imediatamente
como guia. Atingida a extremidade do espaador, dobre o com gua ou tampo de electroforese SDS-PAGE R para
tubo com precauo para o fazer seguir o lado longo da eliminar a acrilamida eventualmente no polimerizada.
placa de vidro. Mantendo o tubo no seu lugar com um dedo, Se necessrio, endireite os dentes do gel de empilhamento
dobre-o de novo para o fazer seguir o segundo lado curto da com uma agulha sem ponta, colocada numa seringa. Retire
placa, utilizando o espaador como guia. Coloque a segunda as pinas de um dos lados curtos da placa e remova com
placa no lugar, alinhando-a perfeitamente sobre a primeira, cuidado o tubo e recoloque as pinas. Proceda do mesmo
e mantenha o conjunto por presso manual. Coloque duas modo do outro lado curto e depois na base do molde. Coloque
pinas em cada um dos lados curtos do molde e depois, o gel no aparelho de electroforese. Introduza os tampes
com precauo, quatro outras pinas no lado longo que de electroforese nos reservatrios superior e inferior.
constituir a base do molde. Verifique se o tubo segue a borda Elimine as bolhas eventualmente aprisionadas na base do
das placas e no se deslocou aps a colocao das pinas. O gel entre as placas de vidro. recomendvel empregar para
molde est pronto e o gel pode ser nele vertido. este efeito uma agulha hipodrmica dobrada fixada numa
seringa. Nunca estabelea tenso elctrica no gel sem as
amostras pois pode destruir a descontinuidade do sistema
Preparao dos geles tampo. Antes de depositar a amostra, lave ou preencha
Para os geles de sistema tampo descontnuo, recomenda-se os poos com precauo com tampo de electroforese
colocar primeiro o gel de separao e deix-lo polimerizar SDS-PAGE R. Prepare as solues problema e as solues
antes de colocar o gel de empilhamento, porque o teor em padro utilizando o tampo para amostras recomendado e
acrilamida-bisacrilamida dos dois geles, o tampo e o pH so trate como se especifica na monografia da substncia em
diferentes. ensaio. Aplique nos poos do gel de empilhamento o volume
apropriado das diferentes solues. Proceda electroforese
Preparao do gel de separao. Num matrs prepare nas condies recomendadas pelo fabricante do aparelho.
o volume apropriado de uma soluo de acrilamida da Certos fabricantes de aparelhos para SDS-PAGE fornecem
concentrao desejada, usando os valores indicados no geles de diversas superfcies e espessuras. Para obter uma
quadro 16. Misture os componentes pela ordem indicada. separao ptima, pode ser necessrio fazer variar a durao
Antes de juntar a soluo de persulfato de amnio (PSA) e da electroforese e os parmetros elctricos como indicado
a tetrametiletilenadiamina (TEMED), filtre, se necessrio, a pelo fabricante. Verifique que a frente de colorao se desloca
presso reduzida por uma membrana de acetato de celulose no gel de separao. Quando ela atinge a base do gel, pare a
(dimetro dos poros 0,45 m); mantenha sob vazio agitando electroforese. Retire o molde do aparelho e separe as duas
a unidade de filtrao at que deixem de se formar bolhas na placas de vidro. Retire os espaadores, separe e rejeite o gel
soluo. Junte as quantidades apropriadas de soluo de PSA de empilhamento e proceda imediatamente colorao.
e de TEMED (ver quadro 16), agite e verta imediatamente no
espao que separa as duas placas de vidro do molde. Deixe
uma altura livre suficiente para o gel de empilhamento DETECO DAS PROTENAS NOS GELES
(altura de um dente do pente mais 1 cm). Usando uma pipeta
de vidro afilada, recubra com precauo a soluo com A colorao com azul de Coomassie o mtodo mais
isobutanol saturado de gua. Deixe polimerizar o gel em correntemente utilizado para as protenas, com um nvel
de deteco da ordem de 1 g a 10 g de protena por
posio vertical, temperatura ambiente.
banda. A colorao com nitrato prata o mtodo mais
Preparao do gel de empilhamento. Quando a polimerizao sensvel para a visualizao das protenas em geles; permite
terminar (cerca de 30 min), esgote o isobutanol e lave a deteco de bandas com 10 ng a 100 ng de protena.

2. Mtodos
Analticos

2.2.32. Perda por secagem
Todas as etapas da colorao dos geles so conduzidas DETERMINAO DA MASSA MOLECULAR

temperatura ambiente com agitao moderada (por exemplo,
sobre uma plataforma com movimento orbital) num recipiente A massa molecular das protenas determinada por
apropriado. necessrio o uso de luvas para evitar depositar comparao da sua mobilidade com a mobilidade de vrios
no gel impresses digitais que tambm ficariam coradas. marcadores proteicos de massa molecular conhecida.
Existem, para a padronizao dos geles, misturas de
Colorao com azul de Coomassie protenas de massa molecular conhecida exactamente, que
2. Mtodos
Analticos
permitem obter uma colorao uniforme. Tais misturas esto

Mergulhe o gel durante, pelo menos, 1 h, num largo excesso disponveis para diferentes sries de massa molecular. As
de soluo de colorao de azul de Coomassie R. Elimine a solues-me concentradas das protenas de massa molecular
soluo de colorao. conhecida so diludas em tampo para amostras apropriado,
e depositadas no mesmo gel que a amostra proteica a
Mergulhe o gel num largo excesso de soluo de descolorao
examinar. Imediatamente aps a electroforese, determine a
R. Renove vrias vezes a soluo de descolorao at que as
posio exacta do corante de marcao (azul de bromofenol)
bandas proteicas apaream nitidamente sobre fundo claro. para identificar a frente de migrao dos ies. Para este
Quanto mais forte for a descolorao do gel, tanto mais efeito, pode cortar-se uma pequena poro da borda do gel ou
pequenas quantidades de protena so detectveis por este mergulhar no interior do gel, ao nvel da frente de migrao
mtodo. possvel acelerar a descolorao incorporando na do corante, uma agulha molhada em tinta da China. Aps
soluo de descolorao R alguns gramas de resina trocadora a colorao do gel, determine a distncia de migrao de
de anies ou uma pequena esponja. cada banda proteica (marcadores e bandas desconhecidas)
a partir do bordo superior do gel de separao e divida cada
NOTA As solues cido-alcolicas utilizadas neste mtodo uma destas distncias de migrao pela distncia percorrida
no fixam totalmente as protenas do gel. Pode, portanto, pelo corante de marcao. As distncias de migrao assim
haver perda de certas protenas de massa molecular baixa obtidas so chamadas mobilidades relativas das protenas
durante as operaes de colorao-descolorao dos geles finos. (em referncia frente de colorao) e convencionalmente
Pode conseguir-se uma fixao permanente colocando o gel representadas por RF . Construa um grfico usando os
durante 1 h numa mistura de 1 volume de cido tricloractico logaritmos da massa molecular relativa Mr dos padres
R, 4 volumes de metanol R e 5 volumes de gua R antes de o proteicos em funo dos RF correspondentes. Os grficos
mergulhar na soluo de colorao de Coomassie R. obtidos so ligeiramente sigmoides. O clculo das massas
moleculares desconhecidas pode ser efectuado por regresso
Colorao com nitrato de prata linear ou por interpolao a partir da curva de variao de
log (Mr) em funo do RF desde que os valores obtidos para as
Mergulhe o gel durante 1 h num largo excesso de soluo amostras desconhecidas se situem na parte linear do grfico.
de fixao R. Elimine e renove a soluo de fixao e deixe
incubar durante, pelos menos, 1 h ou durante toda a noite, se
tal for mais prtico. Elimine a soluo de fixao e coloque VALIDAO DO ENSAIO
o gel num largo excesso de gua R durante 1 h e, de seguida,
mergulhe-o durante 15 min em soluo de glutaraldedo O ensaio s vlido se as protenas utilizadas como
R a 1 por cento V/V. Lave o gel colocando-o por duas vezes marcadores da massa molecular se distribuirem em 80
num largo excesso de gua R durante 15 min e, de seguida, por cento do comprimento do gel e se, no intervalo de
mergulhe-o durante 5 min, ao abrigo da luz, em reagente separao desejado (por exemplo, o intervalo que cubra o
de nitrato de prata R recentemente preparado. Lave o gel produto e o seu dmero, ou o produto e as suas impurezas
colocando-o por trs vezes num largo excesso de gua R aparentadas), existir para as bandas proteicas em causa uma
durante 15 min, e, de seguida, mergulhe-o durante cerca de relao linear entre o logaritmo da massa molecular e o
1 min em soluo de desenvolvimento R at obter colorao valor do RF. Exigncias de validao suplementares dizendo
satisfatria. Suspenda o desenvolvimento por imerso respeito preparao da amostra podem ser especificadas nas
durante 15 min em soluo de paragem R. Lave com gua R. monografias individuais.
SECAGEM DOS GELES DE POLIACRILAMIDA SDS DETERMINAO QUANTITATIVA DAS IMPUREZAS

CORADOS
Quando especificado na monografia, um teor em
O tratamento dos geles ligeiramente diferente conforme impurezas, conveniente preparar uma soluo padro
o mtodo de colorao utilizado. No caso da colorao com correspondente a esse teor diluindo a soluo problema.
Coomassie, a etapa de descolorao seguida da uma imerso Se, por exemplo, este limite for de 5 por cento, a soluo
do gel em soluo de glicerina R a 100 g/l durante, pelo padro uma diluio a 1:20 da soluo problema. O
menos, 2 h (ou uma noite). No caso da colorao com prata, electroforegrama obtido com a soluo problema no
a lavagem final seguida de uma imerso em soluo de apresenta nenhuma banda devida impureza (alm da banda
glicerina R a 20 g/l durante 5 min. principal) que seja mais intensa que a banda principal do
electroforegrama obtido com a soluo padro.
Mergulhe duas folhas de celulose porosa em gua R durante
5-10 min. Coloque uma das folhas num quadro de secagem.
Levante delicadamente o gel e deposite-o sobre a folha de 2.2.32. PERDA POR SECAGEM
celulose. Elimine bolhas que eventualmente tenham ficado
aprisionadas e verta alguns mililitros de gua R ao longo das
A perda por secagem a perda de massa expressa em
bordas do gel. Cubra com a segunda folha e elimine eventuais
percentagem m/m.
bolhas de ar aprisionadas. Termine o conjunto do quadro de
secagem. Coloque na estufa ou deixe secar temperatura Mtodo. Coloque a quantidade indicada da amostra num
ambiente. recipiente tarado e seco previamente nas condies preconizadas

2.2.33. Espectrometria de ressonncia magntica nuclear
para a substncia a ensaiar. A secagem da substncia faz-se at lhe corresponde, proporcional ao nmero de protes
massa constante ou durante o tempo indicado, segundo um dos equivalentes.
seguintes processos. Se a temperatura de secagem indicada
Aparelho. Um espectrmetro de ressonncia magntica
por um s valor em vez de um intervalo, a secagem efectuada
nuclear, trabalhando em ondas contnuas, constitudo por
temperatura prescrita 2C.
um magneto, um gerador de varredura de baixa frequncia,
a) no exsicador: a secagem efectuada em presena de um suporte da amostra, um emissor e um receptor de
2. Mtodos
pentxido de difsforo R, presso atmosfrica e
Analticos
radiofrequncias, um registador e um integrador electrnico.
temperatura ambiente, Um espectrmetro de impulsos est equipado, adicionalmente,
b) a presso reduzida: a secagem efectuada em presena com um emissor de impulsos e com um computador destinado
de pentxido de difsforo R, a uma presso compreendida recolha de dados, a memoriz-los e a transform-los
entre 1,5 kPa e 2,5 kPa e temperatura ambiente, matematicamente num espectro convencional.
c) a presso reduzida com indicao de um intervalo de Utilize um espectrmetro de ressonncia magntica nuclear
temperatura: a secagem efectuada em presena de trabalhando com a frequncia de 60 MHz, no mnimo,
pentxido de difsforo R, a uma presso compreendida para o 1H. Salvo indicao diferente, siga as instrues do
entre 1,5 kPa e 2,5 kPa e no intervalo de temperatura fabricante.
prescrito na monografia, Antes de registar o espectro proceda s verificaes a seguir
d) na estufa com indicao de um intervalo de temperatura: indicadas:
a secagem efectuada na estufa no intervalo de 1. A resoluo igual ou inferior a 0,5 Hz, por medio da
temperatura prescrito na monografia, largura do pico na zona correspondente a metade da sua
e) sob alto vazio: a secagem efectuada em presena de altura, utilizando uma escala adequada de expanso,
pentxido de difsforo R, a uma presso inferior a 0,1 kPa e da banda a 7,33 ppm ou a 7,51 ppm do multipleto
temperatura prescrita na monografia. simtrico da soluo a 20 por cento V/V de diclorobenzeno
Se forem prescritas outras condies, o processo a utilizar R em acetona deuterada R,
integralmente descrito na respectiva monografia. ou da banda a 0,00 ppm da soluo a 5 por cento V/V de
tetrametilsilano R em clorofrmio deuterado R.
2. A relao sinal-rudo (S/R), medida no espectro obtido,
2.2.33. ESPECTROMETRIA DE entre 2 ppm e 5 ppm, com uma soluo a 1 por cento V/V
RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR de etilbenzeno R em clorofrmio deuterado R igual, pelo
menos, a 25:1; esta relao calculada, tomando como base a
A espectrometria de ressonncia magntica nuclear (RMN) mdia de 5 determinaes sucessivas, pela expresso:
baseia-se no facto de certos ncleos, tais como 1H, 13C, 19F e
31P, possurem um momento magntico nuclear permanente.
S = 2,5 A
Quando colocados sob a aco de um campo magntico R H
externo (campo principal), assumem certas direces
bem definidas, relativamente direco deste campo, A = amplitude, medida em milmetros, do sinal mais intenso do
correspondentes a nveis energticos diferentes. Para um quadripleto resultante do grupo metilnico do etilbenzeno,
dado valor de intensidade de campo, as transies entre nveis centrado em 2,65 ppm. Esta amplitude medida a partir da
energticos imediatamente contguos devem-se absoro de linha de base, estabelecida dos centros dos pontos de rudo em
radiaes electromagnticas, da regio das radiofrequncias, cada lado do quadripleto e distncia de 1 ppm, pelo menos, do
com comprimentos de onda caractersticos. seu centro.
A determinao destas frequncias pode efectuar-se quer H = altura do nvel de rudo, medida em milmetros, entre os picos
por pesquisa sequencial das condies de ressonncia localizados de 4 ppm a 5 ppm.
(espectrometria de ondas contnuas), quer por excitao 3. A amplitude das bandas satlites de rotao no superior
simultnea de todas as transies com um impulso de a 2 por cento da altura do sinal correspondente amostra
frequncias mltiplas seguida da transformao por anlise num tubo cuja velocidade de rotao apropriada ao
computorizada dos interferogramas obtidos quando o sistema espectrmetro utilizado.
retoma o estado inicial (espectrometria por impulsos).
4. Para as determinaes quantitativas, verifique a
Um espectro de ressonncia magntica protnica apresenta- reprodutibilidade das respostas do integrador, a qual
-se como um conjunto de sinais correspondentes aos protes controlada com uma soluo de etilbenzeno R a 5 por cento
e que so caractersticos das suas vizinhanas nucleares V/V em clorofrmio deuterado R. Efectue cinco registos
e electrnicas dentro da molcula. A separao entre um sucessivos e determine a mdia dos valores obtidos para os
dado sinal e o de um composto de referncia designa-se protes dos grupos etilo. Nenhum dos valores individuais
por deslocamento qumico () e exprime-se em partes por difere da mdia em mais de 2,5 por cento.
milho (ppm), sendo caracterstico da espcie do proto
quanto a aspectos relacionados com a sua vizinhana nuclear Mtodo. Dissolva a amostra da forma indicada e filtre; a
e electrnica. Os sinais so frequentemente subdivididos soluo lmpida. Utilize um padro interno de deslocamento
em grupos de picos relacionados, designados por dupletos, qumico, o qual, salvo indicao em contrrio, constitudo
tripletos..., multipletos, multiplicidade que resulta da por uma soluo contendo de 0,5 a 1 por cento V/V de
presena de campos magnticos permanentes devidos tetrametilsilano R (TMS) em solventes orgnicos deuterados
a ncleos adjacentes, em particular de outros protes ou de 5 a 10 g/l de tetradeuteriodimetilsilapentanoato de
separados por 2 a 5 ligaes de valncia. A intensidade sdio R (TSP) em xido de deutrio R. Utilize a quantidade
de cada sinal, determinada em funo da rea total que necessria e registe o espectro.

2.2.34. Anlise trmica
ESPECTROMETRIA DE ONDAS CONTNUAS arrefecer a substncia segundo um programa de temperatura

determinado, um porta-amostras sob atmosfera controlada,
Ajuste o espectrmetro para condies de operao to uma electrobalana e um registador. Em certos casos, o
prximas quanto possvel das condies ideais de absoro e aparelho pode ser associado a um sistema permitindo analisar
utilize uma potncia de radiofrequncia que evite a saturao os produtos volteis.
dos sinais. Ajuste os comandos do espectrmetro de forma a Verificao da temperatura. Verifique a escala das
que o pico mais intenso do espectro da amostra quase atinja temperaturas, utilizando um material apropriado, de acordo
2. Mtodos
Analticos
o ponto mximo da escala do papel de registo e que o sinal do com as indicaes do fabricante.
padro interno corresponda a um deslocamento qumico de
0,00 ppm. Registe o espectro no intervalo indicado e, salvo Calibrao da electrobalana. Coloque uma quantidade
indicao em contrrio, a uma velocidade correspondente adequada de material de referncia certificado no
a um valor igual ou inferior a 2 Hz por segundo. Registe porta-amostras e determine a sua massa. Fixe a velocidade
a curva de integrao no mesmo intervalo espectral, de aquecimento segundo as indicaes do fabricante. Inicie o
velocidade apropriada, de acordo com o tipo de aparelho aquecimento e registe a curva termogravimtrica, marcando
utilizado. No caso de determinaes quantitativas, recorra s a temperatura, ou o tempo, em abcissas (valores crescentes
instrues mencionadas. da esquerda para a direita) e a massa em ordenadas (valores
crescentes de baixo para cima). Interrompa o aquecimento
quando a temperatura atingir cerca de 230C. Determine
ESPECTROMETRIA POR IMPULSOS no grfico a distncia entre os patamares inicial e final da
curva massa-temperatura, ou massa-tempo, distncia que
Ajuste os comandos do espectrmetro, especialmente os representa a perda de massa. A perda de massa declarada do
relacionados com o ngulo de impulso, com a amplitude da material de referncia certificado indicada no rtulo.
impulso e o intervalo de tempo entre impulsos sucessivos,
com a zona espectral e o nmero de pontos (resoluo), com Mtodo. Utilize o mesmo mtodo com a amostra, obedecendo
o tempo de aquisio de dados, de acordo com as instrues s condies operatrias prescritas na monografia. Calcule
do fabricante, e acumule o nmero necessrio de a perda de massa da amostra a partir da distncia medida no
interferogramas. Aps a transformao matemtica dos dados grfico obtido. Exprima o resultado em percentagem
pelo computador, ajuste o comando da fase, de forma a obter m/m.
um espectro tanto quanto possvel isento de interferncias No caso de utilizao frequente do aparelho, efectue
e calibre-o relativamente frequncia de ressonncia do regularmente o controlo da temperatura e a calibrao.
padro interno. Reproduza o espectro contido no computador Em caso contrrio, proceda a estas operaes antes de cada
num dispositivo apropriado de visualizao. No caso de determinao.
determinaes quantitativas, proceda integrao de acordo
com as possibilidades do aparelho. Sendo crtica a atmosfera do ensaio, so anotados os
parmetros seguintes quando de cada leitura: presso ou
dbito e composio do gs.
2.2.34. ANLISE TRMICA
ANLISE CALORIMTRICA DIFERENCIAL
A anlise trmica designa um conjunto de tcnicas que
permitem medir as variaes de uma propriedade fsica de A anlise calorimtrica diferencial (ACD) uma tcnica
uma substncia em funo da temperatura. As tcnicas mais que permite evidenciar os fenmenos energticos que se
habitualmente utilizadas so as que medem as variaes de produzem durante o aquecimento (ou arrefecimento) de
energia ou de massa de uma amostra da substncia. uma substncia (ou mistura de substncias) e determinar
as variaes de entalpia, as mudanas de calor especfico e a
TERMOGRAVIMETRIA temperatura qual eles se manifestam.
A termogravimetria uma tcnica que permite registar Esta tcnica permite medir o fluxo de calor diferencial (em
a massa de uma amostra da substncia em funo referncia temperatura), emitido ou absorvido pela amostra
datemperatura segundo um programa de temperatura analisada comparativamente ao da clula de referncia em
controlada. funo da temperatura. Esto disponveis dois tipos de
aparelhagem: os de compensao que mantm a amostra
Aparelhagem. Os constituintes principais de uma e a clula de referncia mesma temperatura por um
termobalana so: um dispositivo que permite aquecer ou fornecimento de calor e os que aplicam uma taxa de
FIGURA 8 Termograma

2.2.34. Anlise trmica
aquecimento constante e detectam uma diferena de Diagrama de fases. Traado dos diagramas de fases de
temperatura por determinao da diferena de fluxo de calor misturas no estado slido. O estabelecimento de diagramas
entre a amostra e a clula de referncia. de fases pode ser uma etapa importante da pr-formulao e
da optimizao do processo de liofilizao.
Aparelhagem. A aparelhagem de compensao constituda
por um forno contendo um porta-amostras constitudo por Determinao da pureza. A determinao da entalpia e
uma clula de referncia e uma clula de medida. O segundo da temperatura de fuso por ACD permite obter o teor em
tipo de aparelhagem constitudo por um forno contendo impureza a partir de um s diagrama trmico, utilizando no
2. Mtodos
Analticos
uma s clula constituda por um porta-amostras para o mais que alguns miligramas da amostra, sem necessitar de
cadinho de referncia e para o cadinho de medida. medies repetidas da temperatura real.
As aparelhagens possuem um dispositivo de programao da Em teoria, a fuso de uma substncia pura, totalmente
temperatura, um ou vrios detectores trmicos e um sistema cristalina, caracterizada, a uma presso constante, pela
de registo que pode ser associado a um sistema de tratamento entalpia de fuso Hf , numa faixa infinitamente estreita,
de dados. As determinaes so efectuadas em atmosfera correspondente temperatura de fuso T0. Um aumento
controlada. desta faixa constitui um critrio sensvel de deteco de
impurezas. Assim, amostras de uma mesma substncia cujos
Calibrao do apareIho. Calibre o aparelho para a
teores em impurezas diferem de algumas dcimas por cento
temperatura e a variao da entalpia, utilizando ndio
do diagramas trmicos visualmente diferenciveis (figura 9).
de grande pureza ou qualquer outro material certificado
apropriado, de acordo com as indicaes do construtor. Para A determinao da pureza molar por ACD baseada na
controlar a linearidade, pode ser utilizada uma combinao utilizao de uma aproximao matemtica da forma
de 2 metais como o ndio e o zinco. integrada da equao de Vant Hoff aplicada s concentraes
(e no s actividades) num sistema binrio
Mtodo. Num cadinho adequado pese uma quantidade
apropriada da amostra; coloque-a no porta-amostras. Fixe a
temperatura do incio e do fim da anlise e a velocidade
de aquecimento, de acordo com as condies operatrias (1)
prescritas na monografia.
Inicie a anlise e construa a curva da anlise calorimtrica
diferencial, inscrevendo em abcissas a temperatura, ou x2 = fraco molar da impureza, isto , o nmero de molculas
o tempo (valores crescentes da esquerda para a direita) e da impureza dividido pelo nmero total de molculas, na
a variao da energia em ordenadas, indicando o sentido fase lquida (ou fundida) temperatura T (expressa em graus
(endotrmico ou exotrmico). Kelvin),
O ponto de interseco (A) do prolongamento da linha de T0 = temperatura de fuso da substncia quimicamente pura, em
base com a tangente no ponto de maior inclinao (ponto graus Kelvin,
de inflexo) da curva corresponde mudana de fase, marca H = entalpia molar de fuso da substncia em joules,
a temperatura qual surge o fenmeno (figura 8). O fim do
fenmeno trmico marcado pelo ponto de inflexo da curva. R = constante dos gases perfeitos em joules.kelvin-1 mole-1.
A entalpia do fenmeno proporcional rea sob a curva Por consequncia, a determinao da pureza por ACD
limitada pela linha de base, sendo determinado o factor de reservada deteco de impurezas que formam um eutctico
proporcionalidade a partir da determinao da entalpia de com a substncia principal e de fraco molar inferior a 2 por
fuso de uma substncia conhecida (ndio, por exemplo) nas cento da amostra.
mesmas condies de trabalho.
Este mtodo no se aplica:
Cada termograma acompanhado dos dados seguintes:
condies utilizadas, indicao da ltima calibrao, s substncias amorfas,
tamanho e identidade da amostra (incluindo o seu histrico
trmico), recipiente, atmosfera (identidade, dbito, presso), aos solventes e aos compostos polimrficos que so
direco e taxa de variao da temperatura, sensibilidade do instveis na gama da temperatura experimental,
instrumento e do registador. s impurezas que formam solues slidas com a
substncia principal,
Aplicaes s impurezas insolveis na fase lquida ou na substncia
Mudana de fase. Determinao da temperatura, das principal em fuso.
variaes de capacidade trmica e da entalpia das transies Durante o aquecimento da amostra, a impureza funde
de fase que sofre uma substncia em funo da temperatura: inteiramente temperatura do eutctico. Acima desta
Transio slido-slido: alotropia, polimorfismo, temperatura, a fase slida no contm mais que a substncia
transio vitrosa pura. Quando do aumento progressivo da temperatura
dessolvatao entre a temperatura do eutctico e a temperatura de fuso
amorfo cristalino da substncia pura, a fraco molar da impureza no lquido
Transio slido-lquido: fuso diminui constantemente j que a quantidade de substncia
Transio slido-gs: sublimao pura liquefeita aumenta constantemente. A qualquer
Transio lquido-slido: solidificao temperatura superior temperatura do eutctido:
recristalizao
Transio lquido-gs: evaporao (2)
Mudana de composio qumica. Determinao das

entalpias e das temperaturas de reaco em determinadas F = fraco fundida da amostra em anlise,
condies experimentais, permitindo, por exemplo,
determinar cinticas de decomposio ou de dessolvatao. x2* = fraco molar da impureza da amostra analisada,

2.2.35. Osmolalidade
2. Mtodos
Analticos
FIGURA 9 Diagramas trmicos segundo a pureza
Quando toda a amostra fundiu, F 1 e x2 = x*2 . Se o soluto no est ionizado, v = 1; em caso contrrio, v
o nmero total de ies pre-existentes ou eventualmente
Relacionando a equao (2) com a equao (1) esta torna-se
formados por solvlise a partir de uma molcula do
soluto.
x2* RT02 1
T T 0 m a molalidade da soluo, isto , o nmero de moles de
Hf F soluto por quilograma de solvente.
o coeficiente osmtico total permitindo ter em conta as
O valor da entalpia de fuso obtido por integrao do pico interaces entre ies de carga oposta no seio da soluo.
de fuso. Depende do valor de m. Quando a complexidade das
A temperatura de fuso T0 da substncia determinada a solues aumenta, torna-se dificilmente mensurvel.
partir do grfico 1/F em funo da temperatura expressa em A unidade de osmolalidade o osmole por quilograma
graus Kelvin. A inclinao da recta, obtida aps linearizao (osmol/kg), mas mais geralmente o seu submltiplo, o
eventual, correspondente a permite calcular x*2. miliosmole por quilograma (mosmol/kg), que utilizado.
Salvo indicao em contrrio, a osmolalidade
A fraco x2* multiplicada por 100 fornece a percentagem determinada por abaixamento do ponto de congelao.
molar das impurezas eutcticas totais. Neste caso, a relao existente entre a osmolalidade e o
abaixamento t :
TERMOMICROSCOPIA m = T 1000 mosmol/kg
1,86
As transies de fase podem ser visualizadas por Aparelhagem. O aparelho utilizado (osmmetro) compreende:
termomicroscopia, mtodo que permite observar ao um sistema de arrefecimento do recipiente de medida,
microscpio, com luz polarizada, uma amostra submetida
a uma variao programada de temperatura. um sistema de determinao da temperatura constitudo
por uma resistncia varivel com a temperatura (resistor)
As observaes feitas em termomicroscopia permitem e munido de um dispositivo apropriado de medida da
identificar sem qualquer dvida a natureza dos corrente ou da diferena de potencial que pode ser
fenmenos desenvolvidos em termogravimetria e em calibrado em abaixamento de temperatura ou directamente
anlise calorimtrica diferencial. em osmolalidade,
Aparelhagem. O aparelho composto por um microscpio o aparelho geralmente munido de um dispositivo que
equipado com um dispositivo de polarizao da luz, uma platina permite a agitao da amostra.
com aquecimento, um programador de temperatura e de
velocidade de aquecimento e/ou arrefecimento e um dispositivo QUADRO 18 Solues de referncia para aferio do osmmetro
de registo das temperaturas de transio. Pode juntar-se a este
equipamento uma cmara e um gravador de vdeo.
2.2.35. OSMOLALIDADE
Na prtica, a osmolalidade uma maneira global de medir a
contribuio dos diferentes solutos presentes numa soluo
presso osmtica dessa soluo.
Um valor aproximado aceitvel da osmolalidade (m) duma
soluo aquosa dado por:
Mtodo. Prepare as solues padro requeridas, segundo
m m as indicaes do quadro 18. Determine o zero do aparelho

2.2.36. Determinao potenciomtrica da concentrao inica com elctrodos de membrana selectivos
com gua R. Calibre o aparelho por meio de solues Os elctrodos de membrana selectivos podem ser quer
padro, introduzindo 50 l a 250 l da amostra na clula elctrodos primrios de membrana cristalina ou no
de medida e pondo em funcionamento o sistema de cristalina, ou de matriz rgida (por exemplo, o elctrodo de
refrigerao. Geralmente o funcionamento do agitador vidro), quer elctrodos com condutores mveis carregados
programado para uma temperatura inferior ao abaixamento (positiva ou negativamente), quer, ainda, elctrodos
crioscpico previsto, a fim de evitar a sobrefuso. Um sensibilizados (elctrodos com substrato enzimtico,
sistema apropriado indica que se aingiu o equilbrio. Antes elctrodos indicadores de gs). O elctrodo de referncia ,
2. Mtodos
Analticos
de cada determinao lave a clula de medida com a soluo geralmente, um elctrodo de prata-cloreto de prata ou um
da amostra. elctrodo de calomelanos com lquidos de juno apropriados
Realize as mesmas operaes com a soluo problema. (na ponte), no produzindo qualquer interferncia.
Leia directamente a osmolalidade ou calcule-a a partir
do abaixamento crioscpico determinado. O valor est Mtodo
compreendido entre dois valores da gama de aferio. Efectue todas as medies a temperatura constante, com a
aproximao de 0,5C tendo em considerao as variaes
de inclinao da curva de calibrao do elctrodo em funo
2.2.36. DETERMINAO da temperatura (ver quadro 19). Ajuste a fora inica e,
eventualmente, o pH da amostra utilizando o reagente
POTENCIOMTRICA DA CONCENTRAO tampo prescrito na monografia. Equilibre o elctrodo
INICA COM ELCTRODOS DE mantendo-o imerso na soluo problema, sob agitao lenta e
MEMBRANA SELECTIVOS regular, at valor de leitura constante.
Teoricamente o potencial E de um elctrodo de membrana QUADRO 19 Valores de K a diversas temperaturas

selectivo varia linearmente com o logaritmo da actividade ai
de um dado io de acordo com a equao de Nernst: Temperatura (C) K
20 0,0582
25 0,0592
30 0,0602
Eo = parte do potencial constante atribuvel ao aparelho utilizado, No caso de utilizao frequente dos sistemas de elctrodos,
R = constante dos gases perfeitos, verifique regularmente a repetibilidade e a estabilidade das
T = temperatura absoluta, respostas, assim como a linearidade da curva de calibrao ou
do algoritmo de clculo na gama de concentraes da soluo
F = nmero de Faraday, problema. Alternativamente, efectue este controlo antes de
Zi = nmero de carga do io, afectado do respectivo sinal. cada srie de medies. Pode-se considerar que a resposta do
elctrodo linear se a inclinao S da curva de calibrao for
A fora inica constante, teremos: prxima de K/zi, por unidade de pCi.
K
E Eo log
zi MTODO I (CALIBRAO DIRECTA)
Ci = concentrao molar do io Determine, no mnimo, trs vezes sucessivas, o potencial de,

f = coeficiente de actividaade (ai = Ci) pelo menos, trs solues padro cujas concentraes, no
io a determinar, englobem a concentrao presumvel da
RT amostra.
K =
F
Registe a curva de calibrao ou registe graficamente o
Se: potencial mdio E obtido em funo da concentrao do
K log eS K io a dosear expressa em -log Ci ou pCi. Prepare as amostras
zi zi de acordo com as indicaes da monografia; determine o
potencial por 3 vezes e, a partir do potencial mdio e da curva
S = inclinao da curva de calibrao do elctrodo de calibrao, calcule a concentrao do io a dosear.
teremos o seguinte:
MTODO II (MTODO DAS ADIES MLTIPLAS DE
E E'0 + S log Ci e para log Ci pCi : E E'0 SpCi PADRO)
A determinao potenciomtrica da concentrao inica Prepare a amostra segundo as indicaes da monografia.
efectua-se pela medio da diferena de potencial entre
2 elctrodos apropriados imersos na soluo problema: o Determine no equilbrio o potencial ET dum volume VT desta
elctrodo indicador corresponde a um elctrodo selectivo soluo de concentrao CT desconhecida no io a dosear.
para o io a dosear e o outro, a um elctrodo de referncia. Proceda a, pelo menos, trs adies sucessivas de um volume
Aparelhagem Vs negligencivel comparativamente a VT (Vs 0,01 VT),
de uma soluo padro com a concentrao Cs conhecida
Utilize, como aparelho de medida, um voltmetro capaz por se situar na parte linear da curva de calibrao. Aps
de medies com a aproximao de 0,1 milivolt e cuja cada adio, determine o potencial e calcule a diferena
resistncia de entrada seja, pelo menos, 100 vezes maior que de potencial E entre o potencial medido e o clculo da
a dos elctrodos empregados. diferena de potencial E entre o potencial medido e ET E

2.2.37. Espectrometria de fluorescncia-x
relaciona-se com a concentrao do io a ser determinado, 2.2.37. ESPECTROMETRIA

pela equao
DE FLUORESCNCIA-X
E (
S log 1 CsVs
CTVT ) A espectrometria de fluorescncia-X dispersiva um mtodo
que utiliza a medida da intensidade da luz fluorescente
emitida por um elemento qumico (de nmero atmico
2. Mtodos
Analticos
ou compreendido entre 11 e 92), submetida a uma radiao X

contnua. A intensidade da fluorescncia produzida por um
dado elemento depende da concentrao desse elemento na
amostra, da absoro pela matriz, da radiao de excitao
e da radiao fluorescente. Em gamas de concentraes
baixas, onde a curva de calibrao linear, a intensidade da
VT = volume da soluo problema, fluorescncia de um dado elemento, numa dada matriz, num

CT = concentrao do io a ser determinada na soluo problema, dado comprimento de onda, directamente proporcional
concentrao desse elemento e inversamente proporcional
Vs = volume adicionado soluo padro, ao coeficiente de absoro mssico da matriz nesse

Cs = concentrao do io a ser determinada na soluo padro, comprimento de onda.

S = inclinao da curva de calibrao do elctrodo Mtodo
experimentalmente determinada, a temperatura constante, Regule e utilize o aparelho conforme as instrues do
pela determinao da diferena entre os potenciais obtidos fabricante. As amostras lquidas podem ser colocadas
em duas solues padro cuja concentrao difira por um directamente no aparelho, enquanto que as amostras
factor de 10 e esteja situada no intervalo em que a curva de slidas so previamente comprimidas sob a forma de discos,
calibrao linear. depois de misturadas com um agente ligante apropriado, se
E
Represente sobre um grfico 10 s (em ordenadas) em necessrio.
funo de Vs (em abcissas) e extrapole a recta obtida at Para determinar a concentrao de um elemento numa
sua intercepo com o eixo das abcissas. Na intercepo, amostra necessrio determinar a taxa bruta de impulsos
a concentrao CT da soluo em anlise no io a ser produzidos por um ou vrios padres, contendo quantidades
determinado dada pela equao: conhecidas do elemento a dosear numa dada matriz e
calcular ou medir o coeficiente de absoro mssico da
CsVs matriz na qual se encontra o elemento a dosear.
CT
VT Calibrao. A partir duma soluo padro ou duma srie
de diluies do elemento a analisar em diversas matrizes
determine o declive da curva de calibrao b0, atravs da
MTODO III (MTODO DA ADIO SIMPLES) seguinte equao:
A um volume VT da soluo problema preparada conforme 1 I cN

b0
prescrito na monografia, adicione um volume Vs de uma M c
soluo padro, contendo uma quantidade conhecida do io
a ser determinado, que d uma resposta situada na parte = coeficiente de absoro da matriz M, calculado ou determinado
linear da curva de calibrao. Prepare um ensaio em branco M por medida,
nas mesmas condies. Determine, pelo menos trs vezes,1o I cN = taxa bruta de impulsos,
b0
potencial da soluo problema e do branco, antes e depois da
M c
C = concentrao da preparao padro em elemento a dosear.
adio da soluo padro. Calcule a concentrao CT do io a
ser determinado utilizando a seguinte equao e procedendo Determinao do coeficiente de absoro mssico da matriz
s correces necessrias para o branco: da amostra. Se a frmula emprica da amostra conhecida,
calcule o seu coeficiente de absoro mssico a partir
do coeficiente de absoro mssico dos elementos que a
compem, fornecido por tabelas. Se a composio elementar
da amostra desconhecida, calcule o seu coeficiente de
VT = volume da soluo problema ou do branco, absoro mssico medindo a intensidade lU da radiao

CT = concentrao do io a ser determinada na soluo problema, X difratada (efeito Compton), com a ajuda da equao

seguinte:
V = volume da soluo padro adicionado,
Cs = concentrao do io a ser determinada na soluo padro,

E = diferena entre os potenciais mdios determinados antes e
aps a adio de Vs,
S = inclinao da curva de calibrao do elctrodo MP = coeficiente de absoro mssico da amostra,

experimentalmente determinada, a temperatura constante, lU = radiao X difractada.

determinando a diferena entre os potenciais obtidos a partir
de duas solues padro cuja concentrao difira por um Determinao da taxa bruta de impulsos do elemento
factor de 10, e est situada dentro do intervalo em que a curva a dosear na amostra. Calcule a taxa bruta de impulsos
de calibrao linear. do elemento a dosear I ;a partir da intensidade

2.2.38. Condutividade
medida da radiao de fluorescncia e da intensidade da platina, recobertos de negro de platina, cada um com uma
ou das radiaes associadas radiao de fundo, tendo superfcie S, mantidos paralelos a uma distncia L entre si
em ateno eventuais contaminaes devidas ao tubo. e, geralmente, protegidos por um invlucro de vidro.
Podem utilizar-se outros tipos de clula.
Clculo da concentrao do elemento a dosear. Se a
concentrao C de elemento a dosear na amostra se situa
na parte linear da curva de calibrao, pode ser calculada MODO OPERATRIO
2. Mtodos
Analticos
com a equao seguinte:
Determinao da constante da clula de medida
N
C I EP Escolha uma clula de medida adaptada s propriedades
bo 1 e condutividade da soluo problema. A constante da
MP
clula deve ser tanto mais elevada, quanto maior for a
condutividade esperada (baixa). A ttulo indicativo, as clulas
de medida correntemente utilizadas tm constantes da clula
f factor de diluio.
da ordem de 0,1 cm-1, 1 cm-1 e 10 cm-1. Utilize um material
de referncia certificado, por exemplo o cloreto de potssio,
apropriado para a medio. A condutividade do material
2.2.38. CONDUTIVIDADE de referncia certificado deve ser vizinha da condutividade
esperada para a soluo problema. Podem utilizar-se outros
A corrente de intensidade I (em amperes) que atravessa um materiais de referncia certificados, nomeadamente para
condutor directamente proporcional fora electromotriz as clulas com uma constante de 0,1 cm-1. Lave a clula de
E (em volt) aplicada e inversamente proporcional medida vrias vezes com gua destilada R e, depois, pelo
resistncia (em ohm) do condutor: menos 2 vezes com a soluo do material de referncia
certificado que utilizado para a determinao da constante
I = E/R
da clula de medida. Mea a resistncia da clula de medida
A condutividade de uma soluo ou, mais correctamente, em presen da soluo do material de referncia certificado
a condutncia especfica, por definio inversa da mantida temperatura de 25 1C. A constante Kcell da
resistividade . Esta definida como o quociente do campo clula de medida funo da sua geometria, em cm-1 e dada
elctrico pela densidade da corrente. A resistncia R (em ) pela expresso:
de um condutor de seco S (em cm2) e de comprimento L
Kcell = RMRC KMRC
(em cm) e dada pela expresso:
R = L/S RMRC = resistncia medida, expressa em mega-ohms,
donde: KMRC = condutividade da soluo do material de referncia

certificado utilizado, expressa em microsiemens por
R = 1/ L/S, ou seja = 1/R L/S centmetro.
A constante Kcell da clula de medida no deve afastar-se mais

L/S corresponde constante ideal da clula.
do que 5 por cento do valor indicado.
A unidade de condutividade no sistema internacional o Se a determinao da constante da clula de medida
siemens por metro (S.m-1). Na prtica, a condutividade for efectuada a uma temperatura diferente da indicada
elctrica de uma soluo expressa em siemens por centmetro para o material de referncia certificado, o valor da
(S.cm-1) ou em microsiemens por centmetro condutividade pode ser calculado pela expresso:
(S.cm-1). A unidade de resistividade no sistema
internacional o ohm.metro (.m). A resistividade de uma KT = KTMRC [12(TTMRC)]
soluo geralmente expressa em ohms.centmetro (.cm).
Salvo indicao em contrrio, a temperatura de referncia KT = valor da condutividade temperatura de calibrao,
para a expresso da condutividade ou da resistividade
KTMRC = valor da condutividade do material de refer ncia certificado,
de 25C. A aparelhagem e o modo operatrio descritos a
seguir so adequados para medies laboratoriais de valores T = temperatura de calibrao,
de condutividade superiores a 10 S.cm-1. A medida da
TMRC = temperatura indicada para o material de referncia
condutividade da gua tratada nas monografias respectivas.
certificado,
APARELHAGEM = coeficiente trmico aplicvel condutividade do material

de referncia certificado,
O aparelho utilizado (condutmetro ou resistivmetro)
= 0,021 para o cloreto de potssio.
permite determinar o valor da resistncia da coluna de
lquido compreendida entre os elctrodos do elemento de
medio imerso (clula de medida). O aparelho alimentado Determinao da condutividade da soluo problema
em tenso alterna a fim de evitar os efeitos de polarizao dos Aps calibrar o aparelho com uma soluo do material de
elctrodos. Est equipado com uma sonda de temperatura e referncia certificado, lave a clula de medida vrias vezes
com um dispositivo de compensao da temperatura. com gua destilada R e, depois, pelo menos 2 vezes com a
A clula de medida constituda por 2 elctrodos de soluo aquosa da amostra. Efectue sucessivas medies.

2.2.39. Distribuio da massa molecular dos dextranos
2.2.39. DISTRIBUIO DA MASSA Efectue a calibrao do sistema cromatogrfico por um dos

dois mtodos a seguir deescritos.
MOLECULAR DOS DEXTRANOS
Calibrao por desenho da curva. Para cada um dos
Proceda por cromatografia de excluso (2.2.30). dextranos para calibrao SQR calcule, usando a expresso
(1), o coeficiente de distribuio Kmax correspondente ao
Soluo problema. Dissolva 0,200 g da amostra na fase mvel ponto mais elevado do traado cromatogrfico. Trace um
e complete 10 ml com a fase mvel.
2. Mtodos
grfico em papel semi-logartmico com os valores de Kmax

Analticos
Soluo de marcao. Dissolva 5 mg de glucose R e 2 mg de (em abcissas) em funo da massa molecular declarada no
dextrano V0 SQR em 1 ml de fase mvel. ponto mais elevado do traado cromatogrfico Mmax de cada
um dos dextranos para calibrao SQR e da glucose. Trace
Solues de calibrao. Dissolva, separadamente, em 1 ml da uma primeira curva de calibrao a partir dos pontos obtidos,
fase mvel, 15 mg de dextrano 4 para calibrao SQR, 15 mg extrapolando entre o ponto Kmax obtido com o dextrano 250
de dextrano 10 para calibrao SQR, 20 mg de dextrano 40 para calibrao SQR e o valor mais baixo de K obtido com o
para calibrao SQR, 20 mg de dextrano 70 para calibrao
mesmo dextrano (ver a figura 10). Com a ajuda desta primeira
SQR e 20 mg de dextrano 250 para calibrao SQR.
recta de calibrao, transforme, para cada cromatograma,
Soluo de validao do sistema. Dissolva 20 mg de dextrano todosos valores do coeficiente de distribuio Ki em massa
40 para validao SQR (para a anlise do dextrano 40) ou molecular Mi e calcule a massa molecular mdia Mw de cada
20 mg de dextrano 60/70 para validao SQR (para a anlise dextrano para calibrao SQR usando a equao (3). Se os
do dextrano 60 e do dextrano 70), em 1 ml da fase mvel. valores calculados de Mw no diferirem mais de 5 por cento
A cromatografia pode ser realizada utilizando: dos valores declarados para cada um dos 5 dextranos para
calibrao SQR e se a diferena mdia for de 3 por cento,
uma coluna de 0,3 m de comprimento e 10 mm de a curva de calibraco satisfaz. Seno, desloque a curva de
dimetro interno, cheia com agarose reticulada para calibrao ao longo do eixo das ordenadas e repita o processo
cromatografia R, ou uma srie de colunas de 0,3 m de at que os valores calculados e declarados de Mw no difiram
comprimento e 10 mm de dimetro interno, cheias com mais de 5 por cento.
gel de politer hidroxilado para cromatografia R,
como fase mvel, com um dbito de 0,5 ml a 1 ml por min,
mantido constante com 1% de variao por hora, uma
soluo contendo 7 g de sulfato de sdio anidro R e 1 g de
clorobutanol R por litro de gua R,
como detector, um refractmetro diferencial,
um injector em ansa (loop) de 100 a 200 l.
Mantenha a temperatura do sistema constante com uma
variao de 1C.
Calibrao do sistema cromatogrfico.

Injecte vrias vezes o volume escolhido da soluo de
marcao. O cromatograma obtido apresenta 2 picos
sucessivos correspondentes, respectivamente, ao dextrano
V0 SQR e glucose R. Calcule o volume morto V0 a partir do
volume de eluio do pico correspondente ao dextrano V0 e o
volume total Vt a partir do pico correspondente dextrose.
Injecte o volume escolhido de cada uma das solues
de calibrao. Trace cuidadosamente a linha de base
de cada um dos cromatogramas obtidos. Divida cada
cromatograma em p (pelo menos 60) bandas verticais
iguais (correspondendo a volumes de eluio iguais). Em
cada banda i, correspondente a um volume de eluio Vi,
determine a altura yi do cromatograma acima da linha
de base e calcule o coeficiente de distribuio Ki pela
expresso:
V0 = volume morto da coluna, determinado a partir do pico

correspondente ao dextrano V0 do cromatograma obtido com a
soluo de marcao,
Vt = volume total da coluna determinado a partir do pico
correspondente glucose do cromatograma obtido com a
soluo de marcao,
Vi = volume de eluio da banda i do cromatograma obtido com
cada uma das solues de padronizao.

2.2.40. Espectrofotometria no infravermelho prximo
Calibrao por clculo da curva. Recorrendo s equaes (2) e O ensaio s ser vlido se o valor de Mwobtido para a fraco
(3), e utilizando um mtodo apropriado(1), calcule os valores de dextrano superior (10 por cento) for de:
b1, b2, b3, b4 e b5 que do valores de Mw que no diferem mais de
5 por cento do valor declarado de cada um dos dextranos para 110 000 a 130 000 para o dextrano 40 para ensaio de
calibrao SQR e de 180 2 para a glucose: eficcia SQR,
190 000 a 230 000 para o dextrano 60/70 para ensaio de
2. Mtodos
Analticos
eficcia SQR.
Massa molecular mdia da fraco dextrano inferior (10 por

cento).
Calcule Mw para a fraco dextrano inferior (10 por cento)
que eluda na e aps a banda m, usando a equao:
p = nmero de bandas que dividem o cromatograma
yi altura que separa a linha de base do traado do
cromatograma,
Mi = massa molecular no ponto i.
sendo m definido pelas expresses (8) e (9):

Validao do sistema cromatogrfico. Injecte o volume
escolhido da soluo de validao do sistema adequada
para o dextrano em anlise.
Massa molecular mdia total do dextrano para ensaio de

eficcia SQR.
Calcule Mw como se indica em Calibrao do sistema
cromatogrfico, utilizando quer a curva de calibrao, quer
os valores obtidos para b1, b2, b3, b4 e b5.
O ensaio s ser vlido se o valor de Mw for de:
p = nmero de bandas que dividem o cromatograma,
41 000 a 47 000 para o dextrano 40 para ensaio de eficcia
y = altura que separa a linha de base do traado do cromatograma
SQR, i
no ponto i,
67 000 a 75 000 para o dextrano 60/70 para ensaio de
M = massa molecular no ponto i.
eficcia SQR. i
O ensaio s ser vlido se o valor de Mwobtido para a fraco
Massa molecular mdia da fraco dextrano superior dextrano inferior (10 por cento) for de:
(10 por cento). 6000 a 8500 para o dextrano 40 para ensaio de eficcia
Calcule Mw para a fraco dextrano superior (10 por cento) SQR,
que eluda na banda n, usando a equao: 7000 a 11 000 para o dextrano 60/70 para ensaio de eficcia
SQR.
Distribuio da massa molecular da amostra. Injecte o

volume escolhido da soluo problema. Calcule os valores
de Mw correspondentes, respectivamente, distribuio da
massa molecular total, fraco dextrano superior (10 por
sendo definido pelas expresses (5) e (6)
cento) e fraco dextrano inferior (10 por cento) segundo as
indicaes dadas em Validao do sistema cromatogrfico.
2.2.40. ESPECTROFOTOMETRIA NO
INFRAVERMELHO PRXIMO
A espectrofotometria no infravermelho prximo (NIR)
p = nmero de bandas que dividem o cromatograma,
uma tcnica com aplicaes vastas e variadas na anlise
farmacutica. Os espectros no infravermelho prximo situam-
yi = altura que separa a linha de base do traado do cromatograma no -se na regio compreendida entre cerca de 780 nm e cerca de

ponto i, 2500 nm (cerca de 12 800 cm-1 e cerca de 4000 cm-1).
Mi = massa molecular no ponto i.
Em certos casos, as informaes mais teis encontram-se na
regio compreendida entre cerca de 1700 nm e cerca de
(1) Considera-se apropriado o mtodo de Gauss-Newton, modificado por 2500 nm (cerca de 6000 cm-1 e cerca de 4000 cm-1).
Harley (ver O. Hartley. Technometrics, 3, (1961) e K. Nilsson, J. Chromat.
101, 137 (1974). Pode ser utilizado um programa para microcomputador
Os espectros no infravermelho prximo so dominados
destinado ao ajustamento das curvas e capaz de efectuar regresses no pelas bandas de ressonncia ou pelas ressonncias parciais
lineares. C-H, N-H, O-H e S-H e combinaes de modos de vibrao

fundamentais, e tm um alto grau informativo, se a aparelhos de NIR so assim concebidos com um feixe simples.
informao for obtida por algoritmos quimiomtricos O silcio, o sulfureto de chumbo, o arsenieto de ndio, o
apropriados. As bandas no infravermelho prximo so muito arsenieto de ndio-glio, o telureto de mercrio e cdmio
mais fracas que as vibraes fundamentais no infravermelho (MCT) e o sulfato de triglicina deuterada, so frequentemente
mdio, de onde resultam. Devido s absortividades molares utilizados como substncias do detector. Os porta-amostras
fracas no infravermelho prximo, a radiao penetra, em de clulas convencionais, as sondas de fibra ptica, as clulas
geral, vrios milmetros nos materiais, mesmo nos slidos. de transmisso por imerso e os porta-amostras rotativos
2. Mtodos
Analticos
Alm disso, numerosos materiais como o vidro so ou de vai-vm, so dispositivos correntes para colocao
relativamente transparentes nesta regio. Alm dos mtodos da amostra. A escolha deve basear-se na aplicao desejada,
de amostragem e dos ensaios clssicos, as medies podem tendo em ateno a compatibilidade entre o sistema de
ser feitas directamente in situ, sobre as amostras. Os espectros amostragem e o tipo de amostra em anlise. Unidades
no infravermelho prximo fornecem informaes fsicas e apropriadas de tratamento e de avaliao dos dados fazem,
qumicas, tanto qualitativas como quantitativas. No entanto, em geral, parte do sistema.
a comparao directa do espectro obtido com a substncia
problema, com um espectro de referncia duma substncia
qumica de referncia como os utilizados no infravermelho, MTODOS DE MEDIO
no aconselhvel. necessrio um tratamento matemtico
dos dados, apropriado e validado. As aplicaes da Medio por transmisso. A transmitncia (T) uma medida
espectrofotometria NIR so muito variadas,tanto para a do decrscimo da intensidade da radiao a determinados
anlise qumica como fsica, por exemplo: comprimentos de onda, aps passagem da radiao atravs
anlise qumica da amostra. A amostra atravessada pelo feixe ptico entre
a fonte e o detector. A disposio anloga de numerosos
identificao de substncias activas, excipientes, formas espectrofotmetros convencionais e o resultado pode ser
farmacuticas, produtos intermedirios de fabricao, apresentado directamente em termos de transmitncia (Ir)
matrias primas qumicas e materiais de embalagem, e/ou de absorvncia (A).
quantificao de substncias activas e de excipientes, T = I/I0,
determinao de ndices qumicos como o ndice
de hidroxilo, o ndice de iodo, o ndice de cido, a I0 = intensidade da radiao incidente,

determinao do teor em gua e do grau de hidroxilao,
Ir = intensidade da radiao transmitida,
o controlo do teor em solventes,
A = -log10 T = log10 (l/T) = log10 (I0/I).
controlo do processo.
anlise fsica Medio por reflexo difusa. Este mtodo permite a medida
forma cristalina e cristalinidade, polimorfismo, da reflectncia (R), relao entre a intensidade da luz
pseudopolimorfismo, dimenso das partculas, reflectida pela amostra (I) e a reflectida por uma superfcie
reflectora de fundo ou de referncia (Ir). A radiao no
estudo dos processos de dissoluo e de desagregao, infravermelho prximo pode penetrar at uma profundidade
dureza, significativa no interior da amostra, onde pode ser absorvida
exame das propriedades de uma pelcula, pelas combinaes de vibraes e ressonncias parciais das
substncias em anlise presentes na amostra. A radiao
controlo dos processos, por exemplo a monitorizao das no absorvida reflectida pela amostra para o detector. Os
misturas e da granulao. espectros da reflectncia no infravermelho prximo so
As medies na regio do infravermelho prximo so geralmente obtidos por clculo e transposio grfica do log
influenciadas por numerosos factores qumicos e fsicos (1/R) em funo do comprimento de onda ou dos nmeros de
como se descreve a seguir; a reprodutibilidade e a relevncia onda.
dos resultados dependem do controlo destes factores e
R = I/Ir,
as medidas s so, no geral, vlidas para um modelo de
calibrao definido. I = intensidade da luz reflectida de modo difuso pela amostra,
Ir = intensidade da luz reflectida pela superfcie reflectora de fundo
APARELHAGEM ou de referncia,
AR = log10 (1/R) = log10 (Ir/I).
Os espectrofotmetros no infravermelho prximo so
utilizados para registar os espectros na regio compreendida
entre cerca de 780 nm e cerca de 2500 nm (cerca de Medio por transflexo. Este mtodo combina a
12 800 cm-1 e cerca de 4000 cm-1). As determinaes no transmitncia e a reflectncia. Quando se mede a reflectncia
infravermelho prximo baseiam-se na passagem da luz (T*), utiliza-se um espelho ou uma superfcie de reflectncia
atravs de uma amostra ou no interior de uma amostra e difusa para reflectir a radiao transmitida atravs da amostra
a medida da atenuao do feixe emergente (transmitido, uma segunda vez e, assim, duplicar o percurso ptico. A
difundido ou reflectido). Os espectrofotmetros adaptados radiao no absorvida reflectida pela amostra para o
para a medio na regio do infravermelho prximo detector.
so constitudos por uma fonte de luz apropriada, um T* = I/IT ,
monocromador ou um interfermetro. Os monocromadores
mais comuns so filtros foto-acsticos modulares (AOTF), IT = intensidade da radiao transflectida, sem amostra,

prismas ou grades. So utilizadas fontes de luz de alta I = intensidade da radiao transmitida e reflectida, medida na
intensidade, como as lmpadas de quartzo ou de tungstnio
amostra,
ou outras semelhantes. A fonte de luz da lmpada de
tungstnio pode ser altamente estabilizada. Numerosos A* = log10 (1/T*).

PREPARAO/APRESENTAO DA AMOSTRA ou para amostras mais finas de espessura constante, deve

haver um material de referncia estvel reflexo difusa e de
Medio por transmisso. A medida da transmitncia (T), reflectividade constante, de preferncia, elevada.
depende do espectro da transmitncia de fundo, necessrio
para o clculo. A referncia de fundo pode ser o ar, uma Propriedades pticas da amostra. Quando se trata de
clula vazia, um solvente que possa constituir um branco slidos, tanto as propriedades de disperso de superfcie
ou, em casos particulares, uma amostra de referncia. como as de disperso interna devem ser tidas em
2. Mtodos
Analticos
O mtodo aplica-se geralmente aos lquidos, diludos ou considerao. Os espectros das amostras que apresentam
no, s disperses, s solues e aos slidos. Para a medida heterogeneidade fsica, qumica ou ptica, podem necessitar
da transmitncia nos slidos, necessrio utilizar um do estabelecimento de uma mdia, aumentando o tamanho
acessrio suplementar para a amostra. As amostras so do feixe, examinando amostras mltiplas, ou fazendo
analisadas numa clula com um percurso ptico apropriado, rodar a sonda. Certos factores, como o grau de variao
(geralmente entre 0,5 mm e 4 mm), transparente radiao de compactao ou dimenses variveis das partculas nas
no infravermelho prximo, ou por imerso de uma sonda substncias pulverulentas ou o acabamento de superfcie,
de fibra ptica de configurao apropriada que produz um podem causar diferenas significativas entre os espectros.
espectro situado numa zona de transmisso, compatvel com
as especificaes do aparelho e com a utilizao desejada.
Polimorfismo. As variaes na estrutura cristalina
(polimorfismo), influenciam os espectros. Assim, as
Medio por reflexo difusa. Este mtodo aplica-se diferentes formas cristalinas e a forma amorfa dum slido,
geralmente aos slidos. A amostra examinada num podem ser diferenciadas umas das outras com base nos seus
dispositivo apropriado. As condies de medio devem ser espectros no infravermelho prximo. Se estiverem presentes
to reprodutveis quanto possvel, de amostra para amostra. formas cristalinas mltiplas, necessrio que as amostras
Quando se introduz uma sonda de fibra ptica na amostra, utilizadas para a calibrao apresentem uma distribuio de
necessrio cuidado no posicionamento da sonda, de modo a formas adequadas aplicao desejada.
garantir a sua imobilidade durante a aquisio dos espectros,
e que as condies de medio so to reprodutveis quanto
possvel, de amostra para amostra. necessrio proceder Idade das amostras. As propriedades fsicas, qumicas
ao varrimento da radiao reflectida por uma referncia ou pticas das amostras podem alterar-se com o tempo.
de fundo, para obter uma linha de base e, seguidamente, necessrio assegurar que as amostras analisadas no
mede-se a reflectncia de uma ou de vrias amostras. Os infravermelho prximo sejam representativas das amostras
padres de reflexo correntes so ladrilhos de cermica, utilizadas na calibrao. Se forem analisadas amostras de
polmeros perfluorados ou de ouro, ou de outros materiais idades diferentes, necessrio ter em conta potenciais
apropriados. Apenas os espectros medidos em relao a um diferenas de propriedades.
fundo, possuindo as mesmas propriedades pticas, podem ser
comparados uns com os outros. A dimenso das partculas,
a gua de hidratao e o estado de solvatao devem ser CONTROLO DO FUNCIONAMENTO DO APARELHO
tomados em considerao.
Utilize o aparelho de acordo com as instrues do fabricante
e efectue as verificaes previstas a intervalos regulares, em
Medio por transflexo. Este mtodo utiliza um reflector funo da utilizao do aparelho e das substncias em anlise.
colocado atrs da amostra, de modo a duplicar o percurso
ptico. Esta configurao pode ser adoptada para partilhar
uma mesma geometria do aparelho com os sistemas de Verificao da escala de comprimentos de onda (excepto
reflectncia e de fibra ptica, nos quais a fonte e o detector aparelhos com filtro). Verifique a escala de comprimentos
se situam do mesmo lado da amostra. A amostra examinada de onda utilizada, geralmente na regio compreendida entre
numa clula munida de um espelho ou de um reflector de cerca de 780 nm e cerca de 2500 nm (cerca de 12 800 cm-1
disperso apropriado, metlico ou de uma substncia inerte e cerca de 4000 cm-1) ou na gama de espectros prevista,
(por exemplo, dixido de titnio), que no absorva na regio com a ajuda de um ou de vrios padres de comprimentos
do infravermelho prximo. de onda apropriados, que apresentem mximos (mnimos)
caractersticos para os comprimentos de onda da regio
em causa, tais como o cloreto de metileno ou uma mistura
FACTORES QUE AFECTAM A RESPOSTA ESPECTRAL de xidos de terras raras. Escolha um espectro que tenha a
mesma resoluo espectral que a utilizada para obter o valor
Temperatura da amostra. Este parmetro importante para certificado e determine a posio de, pelo menos, 3 picos
as solues aquosas, nas quais uma diferena de alguns repartidos no intervalo utilizado. As tolerncias de aceitao
graus pode produzir modificaes substanciais no espectro. so de 1 nm a 1200 nm, 1 nm a 1600 nm e 1,5 nm a
A temperatura tambm um parmetro importante para os 2000 nm ( 8 cm-1 a 8300 cm-1, 4 cm-1 a 6250 cm-1 e
slidos e ps, contendo gua. 4 cm-1 a 5000 cm-1). Para o material de referncia utilizado,
aplique a tolerncia relativa ao comprimento de onda
Humidade e solventes residuais. A humidade e solventes (nmero de onda) mais prximo dos valores acima, para cada
residuais presentes nas amostras so responsveis por um dos picos utilizados. Para os aparelhos com transformada
bandas de absoro significativas na regio do infravermelho de Fourier, a calibrao da escala dos nmeros de onda pode
prximo. ser efectuada, utilizando uma banda estreita de vapor de gua
em 7299,86 cm-1 ou uma banda estreita de uma substncia
certificada. A referncia mais apropriada dos xidos de terras
Espessura da amostra. A espessura da amostra uma raras o NIST 1920 (a).
fonte conhecida de variabilidade do espectro e deve ser
compreeendida e/ou controlada. Por exemplo, numa medio Medio por transmisso. Pode ser utilizado o cloreto de
em reflexo, a amostra pode ter uma espessura infinita metileno R num percurso ptico de 1,0 nm, que apresenta

bandas caractersticas ntidas em 1155 nm, 1366 nm, Verificao do rudo fotomtrico. Determine o rudo
1417 nm, 1690 nm, 1838 nm, 1894 nm, 2068 nm e 2245 nm. fotomtrico usando um padro apropriado de reflectncia,
Utilize as bandas em 1155 nm, 1417 nm, 1690 nm e 2245 nm por exemplo, ladrilhos de cermica branca ou resinas
para a calibrao. Podem igualmente ser utilizados outros termoplsticas reflectoras (PTFE, por exemplo). Proceda
padres apropriados. ao varrimento do padro de reflexo em toda a gama de
Medio por reflexo difusa (reflectncia). Pode ser utilizada comprimentos de onda/nmeros de onda, conforme as
recomendaes do fabricante e calcule o rudo fotomtrico,
2. Mtodos
uma mistura de xidos de disprsio, hlmio e rbio

Analticos
(1 + 1 + 1, por massa), ou outras substncias certificadas. pico a pico. O valor aproximadamente o dobro do
Esta substncia de referncia apresenta picos caractersticos desvio padro. O rudo fotomtrico est de acordo com a
em 1261 nm, 1681 nm e 1935 nm. Se no possvel utilizar especificao do espectrofotmetro.
padres externos slidos e se as medidas de reflexo difusa
so efectuadas em clulas ou so utilizadas sondas de fibra
ptica, use uma suspenso de 1,2 g de dixido de titnio IDENTIFICAO E CARACTERIZAO
R em cerca de 4 ml de cloreto de metileno R, agitada (ANLISE QUALITATIVA)
energicamente, directamente na clula ou na sonda. Aps
2 min, registe o espectro. O dixido de titnio no absorve Criao de uma biblioteca de espectros. Registe o espectro
no infravermelho prximo. Os espectros so registados de um nmero apropriado de lotes da substncia em
com uma largura de banda nominal mxima do aparelho anlise, os quais tenham sido exaustivamente ensaiados
de 10 nm em 2500 nm (16 cm-1 a 4000 cm-1). Determine segundo as especificaes estabelecidas e que apresentem a
a posio de, pelo menos, 3 picos, repartidos no intervalo variao tpica dessa substncia (por exemplo: fornecedor,
utilizado. As tolerncias de aceitao so fornecidas em forma fsica, dimenso das partculas). A srie de espectros
Verificao da escala de comprimentos de onda. Para obtidos representa a quantidade de informao relativa
a substncia de referncia utilizada, aplique a tolerncia identificao e caracterizao que define os limites de
relativa ao comprimento de onda (nmero de onda) mais similaridade para a substncia e constitui a entrada no banco
prximo dos valores que figuram em Verificao da escala de de dados espectrais utilizado para a sua identificao. O
comprimentos de onda, para cada um dos picos utilizados. nmero de substncias presentes na biblioteca depende da
utilizao em vista, mas coleces demasiado grandes podem
Verificao da repetibilidade do comprimento de onda tornar difcil a discriminao entre as diversas substncias e a
(excepto aparelhos com filtro). Verifique a repetibilidade do validao. Os espectros na biblioteca tm
comprimento de onda com a ajuda de padres apropriados. O
desvio padro do comprimento de onda est de acordo com as um intervalo espectral e um nmero de dados idnticos,
especificaes do fabricante do aparelho. uma mesma tcnica de determinao,
Verificao da linearidade fotomtrica e da estabilidade da um tratamento prvio dos dados, idntico.

resposta. A verificao da linearidade fotomtrica demonstra- Se forem subgrupos (bibliotecas), aplicam-se os mesmos
-se com a ajuda de uma srie de padres de transmisso ou de critrios independentemente para cada grupo. A coleco de
reflexo, cujos valores em percentagem de transmitncia ou espectros pode ser representada de vrias maneiras, segundo
de reflectncia se conhecem. Para as medidas de reflectncia a tcnica matemtica usada para a identificao. Poder-se-
existem padres polmricos adicionados com carbono. tratar
Utilizam-se pelo menos 4 padres de referncia no intervalo
10-90 por cento como, por exemplo, 10 por cento, 20 por de todos os espectros individuais, representando a
cento, 40 por cento e 80 por cento, respectivamente, com substncia,
valores de absorvncia de 1,0, 0,7, 0,4 e 0,1. Se o sistema
utilizado para analisar substncias com absorvncias do espectro mdio de cada lote de substncia,
superiores a 1,0, junta-se um padro a 2 por cento e/ou 5 se necessrio, a descrio da variabilidade entre os
por cento, srie de padres. Construa um grfico com os espectros da substncia.
valores da absorvncia observados em funo dos valores
de absorvncia de referncia e analise a regresso linear. As Os dados electrnicos brutos de preparao da coleco de
tolerncias de aceitao so de 1,00 0,05 para o declive e de espectros devem ser arquivados.
0,00 0,05 para a ordenada na origem.
Os espectros obtidos a partir dos padres de reflectncia Tratamento prvio dos dados. Em numerosos casos, em
podem sofrer variaes devidas diferena entre as condies especial para os espectros de medio por reflexo, torna-se
experimentais em que foram calibrados na fbrica, e as til um tratamento matemtico prvio do espectro, antes da
condies em que so posteriormente utilizados. Assim, os definio de um modelo de classificao ou de calibrao.
valores de reflectncia em percentagem, fornecidos com uma O objectivo pode ser, por exemplo, reduzir as variaes da
srie de padres, podem no ser teis para o estabelecimento linha de base, reduzir o impacto de variaes conhecidas
duma calibrao absoluta, para um dado aparelho. No que interferem com os modelos matemticos posteriores,
entanto, e desde que os padres no se alterem qumica ou ou at comprimir os dados antes da utilizao. Os mtodos
fisicamente, e se se utiliza um fundo de referncia igual tpicos so a correco multiplicativa de disperso MSC
ao utilizado para obter os valores certificados, medidas (Multiplicative Scatter Correction), as frmulas de
posteriores dos mesmos padres em condies idnticas, Kubelka-Munk, as tcnicas de compresso espectral como a
incluindo o posicionamento da amostra, fornecem resoluo (windowing) ou a reduo do rudo e o clculo
informaes respeitantes estabilidade a longo prazo da numrico da 1 e 2 derivadas do espectro. As derivadas de
resposta fotomtrica. Aceita-se uma tolerncia de 2 ordem superior no so recomendadas. Em certos casos, os
por cento no que respeita a estabilidade a longo prazo; esta espectros podem tambm ser normalizados, por exemplo, em
verificao s necessria se os espectros so utilizados sem funo da absorvncia mxima, da absorvncia mdia ou da
tratamento prvio. rea de absorvncia integrada sob o espectro.

As transformaes matemticas devem ser efectuadas ANLISE QUANTITATIVA

com precauo, pois podem ser introduzidos artefactos
ou perdidas informaes essenciais (importantes para os Criao de uma biblioteca de referncia espectral para um
mtodos de qualificao). Exige-se, para todos os casos, uma modelo de calibrao. A calibrao um processo que consiste
compreenso do algoritmo e deve ser justificada a utilizao em construir um modelo matemtico que relaciona a resposta
de uma transformada. dum instrumento de anlise s propriedades das amostras.
Qualquer algoritmo de calibrao que possa ser claramente
2. Mtodos
Analticos
definido numa expresso matemtica exacta e que d
Avaliao dos dados. A comparao directa do espectro da resultados apropriados pode ser utilizado. Registe os espectros
substncia em anlise faz-se com os espectros de referncia de um nmero apropriado de amostras com teores conhecidos
individuais ou mdios, de todas as substncias presentes no intervalo a medir (por exemplo, teor em gua). Os
na coleco de espectros, com base na sua correlao comprimentos de onda usados no modelo de calibrao podem
matemtica ou em outros algoritmos apropriados. Uma ser comparados s bandas conhecidas da substncia em anlise
srie de espectros mdios de referncia conhecidos e a e s da matriz , para verificar que as bandas da substncia em
variabilidade dessa mdia podem ser utilizados com um anlise foram utilizadas na calibrao. Estabelea o modelo
algoritmo para a classificao. Existem diferentes algoritmos de calibrao com cerca de 2/3 das amostras determinadas.
baseados na ACP (anlise dos componentes principais), Compare o tero restante com a coleco de espectros. Todas
as amostras devem fornecer resultados quantitativos situados
combinada com a anlise de grupo, a modelizao
no intervalo de preciso definido para a utilizao desejada do
independente de analogia de classe (SIMCA), as funes mtodo. Deve ser demonstrada uma quantificao correcta em
COMPARE usando filtros ou a UNEQ (unequal dispersed presena de variaes da matriz compreendidas no intervalo
class) e outros algoritmos utilizados no software dos especificado. A regresso linear mltipla (MLR), o mtodo
aparelhos NIR ou em software fornecido por terceiros. dos mnimos quadrados parciais (PLS) e a regresso do
A fiabilidade do algoritmo escolhido para uma aplicao componente principal (PCR) so vulgarmente utilizados. Para
particular deve ser validada. Por exemplo, o coeficiente de as calibraes por PLS ou por PCR, os coeficientes ou as cargas
correlao, a soma dos quadrados residuais ou a distncia podem ser traados num grfico e as regies dos coeficientes
pela anlise de grupo satisfazem os limites de aceitao elevados comparadas com o espectro da substncia em anlise.
definidos no procedimento de validao. Os dados brutos relativos preparao do modelo de calibrao
devem ser arquivados sem tratamento prvio.
Validao da base de dados.
Tratamento prvio dos dados. Pode ser definido como
Especificidade. A selectividade da classificao utilizando os a transformao matemtica dos dados dos espectros
espectros de uma base de dados, para a identificao positiva de NIR, para melhorar as caractersticas espectrais e/ou
de um determinado material e a adequada diferenciao retirar ou reduzir fontes indesejveis de variao, antes
relativamente a outras substncias presentes na base de do desenvolvimento do modelo de calibrao. Existem
dados, deve ser estabelecida no decurso do procedimento algoritmos apropriados relativos ao tratamento prvio e
aferio dos dados. A escolha baseia-se na compatibilidade
de validao. Devem ser definidos patamares de aceitao.
com a utilizao desejada. A seleco dos comprimentos de
Patamares elevados permitem um poder de diferenciao onda pode permitir melhorar a eficincia dos modelos de
elevado, mas podem conduzir a erros devidos prpria calibrao, tais como a MLR (por exemplo, na determinao
variabilidade dos materiais. Patamares mais baixos da dimenso de partcula). Em certos casos, como na
permitem resolver este problema, mas podem conduzir a determinao da gua de hidratao, til suprimir certos
resultados ambguos. Os materiais em ensaio devem ser intervalos de comprimentos de onda. A compresso dos
comparados com a base de dados espectral. Estes materiais comprimentos de onda pode ser aplicada aos dados.
podem ser recebidos no local e serem semelhantes, quanto
ao seu aspecto, estrutura qumica ou nome, a substncias Parmetros de validao. As caractersticas analticas a
da base de dados. A identificao destes materiais de prova considerar para demonstrar a validao dos mtodos de NIR
deve ser negativa. Amostras independentes dos materiais so semelhantes s exigidas para qualquer procedimento
representados na base de dados, mas que no foram analtico. Os critrios de aceitao especficos para cada
usados para a sua criao (por exemplo, lotes diferentes parmetro de validao so compatveis com a utilizao
ou misturas) devem dar identificao positiva quando desejada do mtodo.
analisados. Especificidade. O poder de diferenciao relativo e a selectividade
respeitantes determinao quantitativa devem concordar com
Robustez. A robustez do processo qualitativo deve ser as indicaes que figuram na Anlise qualitativa. A conduo
efectuada para testar o efeito de modificaes menores das dos ensaios de especificidade depende da aplicao e dos riscos a
condies normais de execuo da anlise. Os parmetros controlar. As variaes nas concentraes da matriz no intervalo
dos algoritmos de calibrao e de pr-tratamento, no devem de funcionamento do mtodo no afectam a medida quantitativa
sofrer qualquer alterao. As provas tpicas so de modo significativo.
o efeito das diferenas entre os operadores nas variaes Linearidade. A validao da linearidade implica a correlao
das condies ambientais (por exemplo, temperatura e dos resultados do NIR calculados a partir das respostas
humidade), no infravermelho prximo com os algoritmos utilizados,
com os resultados do mtodo de referncia repartidos no
o efeito da temperatura da amostra, do posicionamento da intervalo definido do modelo de calibrao. As respostas no
amostra na janela ptica e da profundidade da sonda, da infravermelho prximo que no so lineares podem, mesmo
compresso ou batimentos da substncia, assim, ser validadas.
substituies de componentes do aparelho ou Intervalo. O intervalo dos valores de referncia da substncia
de dispositivos de apresentao das amostras. em anlise define o intervalo do mtodo de NIR e os limites de

2.2.41. Dicrosmo circular
quantificao do mtodo. Devem ser efectuados controlos para CONSERVAO DOS DADOS
garantir a excluso de resultados fora do intervalo validado.
Conserve os espectros electrnicos do NIR, as coleces de
Exactido. A exactido pode ser determinada por comparao
espectros e os dados de acordo com a regulamentao em uso.
com o mtodo de validao ou com amostras conhecidas
Conserve os espectros de NIR com o pr-tratamento
(amostras em branco e quantidades acrescentadas da
necessrio dos dados para uso especial (por exemplo, a
substncia examinada). A exactido pode ser indicada pelo
identificao, a anlise de dimenso de partcula, o teor em
2. Mtodos
Analticos
erro padro de previso (SEP) do mtodo do NIR, que deve

gua, etc.), de acordo com as especificaes em uso.
ser muito prximo dos dados do mtodo validado. O SEP
o desvio padro residual obtido comparando os resultados
do NIR com os dados analticos de referncia relativos s
amostras especificadas. A exactido demonstrada pela 2.2.41. DICROSMO CIRCULAR
correlao dos resultados do NIR com os dados analticos
de referncia, por comparao do SEP com o mtodo de O dicrosmo circular a propriedade que possuem as
referncia utilizado na validao. Podem ser utilizados outros substncias opticamente activas de, a um dado comprimento
mtodos estatsticos para comparar os resultados do NIR com de onda, absorverem diferentemente a luz polarizada
os valores de referncia (teste de t com dados emparelhados, circular esquerda e a luz polarizada circular direita.
avaliao do erro sistemtico (bias). A determinao directa d um valor algbrico mdio:
Preciso. Expressa a proximidade da concordncia de uma
srie de determinaes, nas condies prescritas. avaliada
pelo menos em 6 medies, de acordo com o mtodo
analtico. Consideram-se 2 nveis de preciso: a repetibilidade
(medidas repetidas de uma mesma amostra, com ou sem A = absorvncia circular dicroica,
variao do posicionamento da amostra) e a preciso AL = absorvncia da luz polarizada circular esquerda,
intermdia (medidas repetidas por analistas diferentes, em
dias diferentes). AR = absorvncia da luz polarizada circular direita.
Robustez. A robustez compreende o efeito das variaes O dicrosmo circular exprime-se pela equao:
de temperatura e humidade, o efeito do manuseamento da
amostra e a influncia das alteraes no aparelho.
Resultados aberrantes. Quando os resultados aberrantes
obtidos por NIR, sobre uma amostra, contendo um analito, se
situam fora do intervalo de calibrao, indica a necessidade
de efectuar ensaios suplementares. Se os resultados dos = dicrosmo circular molar ou absortividade dicrica molar
diferencial, expressa em litro.mole1. cm1,
ensaios suplementares efectuados na amostra por um mtodo
analtico apropriado, indicam que o contedo do analito no L = absorvncia molar (2.2.25) da luz polarizada circular esquerda,
sai das especificaes, estes resultados podem ser aceites e a R = absorvncia molar da luz polarizada circular direita,
amostra considerada conforme as especificaes. Assim, um
resultado aberrante obtido por NIR, pode estar conforme as c = concentrao da soluo problema em mole.litro1,
especificaes relativas ao elemento em causa. l = caminho ptico da clula, em centmetros.
As unidades seguintes so igualmente utilizadas para

AVALIAO CONTNUA DO MODELO caracterizar a absoro dicrica:
Os modelos de NIR validados para utilizao so sujeitos Factor de dissimetria:

a uma avaliao contnua do desempenho e a uma
monitorizao dos parmetros de validao. Se forem
encontradas discrepncias, necessrio tomar medidas
correctivas. O grau de revalidao necessrio depende absorvncia molar (2.2.25).
da natureza das alteraes. A revalidao de um modelo
qualitativo necessria sempre que se acrescenta uma nova Elipticidade molar
substncia coleco de referncia e poder ser necessria
se houver alterao das propriedades fsicas da substncia Alguns tipos de instrumentos determinam directamente
ou da fonte de aprovisionamento. A revalidao de um o valor da elipticidade , expressa em graus. Quando
modelo quantitativo necessria em caso de alterao da este tipo de instrumento utilizado, a elipticidade molar
composio do produto acabado, do processo de fabrico ou [] pode ser calculada atravs da expresso:
da origem/qualidade das matrias-primas.
TRANSFERNCIA DAS BASES DE DADOS

[] = elipticidade molar, expressa em graus. cm2. decimole1,
Quando as bases dados so transferidas para outro aparelho, o = elipticidade, lida no instrumento,
intervalo espectral, o nmero de dados, a resoluo espectral e
outros parmetros, tm de ser tidos em considerao. Devem M = massa molecular relativa da substncia problema,
ser aplicados procedimentos e critrios suplementares para
c = concentrao da soluo problema em gramas por mililitro,
demonstrar que o modelo continua vlido com a nova coleco
de espectros ou com o novo aparelho. l = caminho ptico da clula, em centmetros.

2.2.42. Massa volmica de um slido
2. Mtodos
Analticos
A elipticidade molar tambm pode ser obtida a partir do 304 nm de 3,3. A soluo do cido (1S)-()-10-
dicrosmo molar atravs da expresso: -canforsulfnico R, descrito adiante, pode igualmente ser
utilizada.
Linearidade da modulao. Dissolva 10,0 mg do cido
(1S)-()-10-canforsulfnico R em gua R e complete
A elipticidade molar habitualmente utilizada para a 10,0 ml com o mesmo solvente. Determine a concentrao
anlise das protenas e dos cidos nucleicos. Neste caso, a exacta da soluo em cido (1S)-()-10-canforsulfnico
concentrao molar exprime-se em resduo monomrico, por espectrofotometria de absoro no ultravioleta (2.2.25),
calculado pela expresso: tomando 1,49 como valor da absorvncia especfica em
285 nm.
massa molecular
Registe o espectro do dicrosmo circular entre 185 e
nmero de aminocidos
340 nm. Determinado no mximo em 290,5 nm, est
compreendido entre 2,2 e 2,5. Determinado no mximo
A massa mdia do resduo monomrico de 100 a 120
em 192,5 nm, est compreendida entre -4,3 e -5.
(geralmente 115) para as protenas e de cerca de 330 para os
mononucleotidos sob a forma de sais sdicos. O (1S)-() ou o (1R)-(-)-10-canforsulfonato de amnio R
podem igualmente ser utilizados.
Aparelhagem. A fonte luminosa (S) (figura 11) uma
lmpada de xnon: a luz passa atravs de um monocromador
duplo (M) equipado com prismas de quartzo (P1P2). 2.2.42. MASSA VOLMICA
O feixe luminoso linear, proveniente do primeiro
DE UM SLIDO
monocromador, divide-se, no segundo monocromador, em 2 (impropriamente designada DENSIDADE DE UM SLIDO)
componentes polarizados em ngulo direito.
A massa volmica de um slido corresponde sua massa
A fenda de sada do monocromador elimina o raio luminoso
mdia por unidade de volume e exprime-se frequentemente
extraordinrio.
em gramas por centmetro cbico (g/cm3), se bem que a
A luz monocromtica polarizada atravessa de seguida um unidade internacional seja o quilograma por metro cbico
modelador (Cr) birrefringente: o resultado a obteno de (1 g/cm3 = 1000 kg/m3).
uma luz circular alternada.
Ao contrrio dos gases e dos lquidos, cuja massa volmica
O raio luminoso passa seguidamente atravs da amostra (C) depende apenas da temperatura e da presso, a massa
e atinge um fotomultiplicador (PM), seguido de um circuito volmica de uma partcula slida depende tambm do arranjo
amplificador que produz dois sinais elctricos: um constitudo molecular, variando, por isso, com a estrutura cristalina e
por uma corrente contnua Vc e o outro por uma corrente com o grau de cristalinidade.
alterna com uma frequncia de modulao Vac caracterstica Se uma partcula slida amorfa ou parcialmente amorfa,
da amostra em ensaio. A fase d o sinal do dicrosmo circular. a sua massa volmica pode ainda depender das condies
A relao Vac/Vc proporcional absoro diferencial A de preparao e dos tratamentos subsequentes.
responsvel pelo sinal. A regio dos comprimentos de onda Deste modo, e ao contrrio dos fluidos, dois slidos
cobertos por um dicrgrafo habitualmente de 170 a 800 nm. quimicamente equivalentes podem apresentar uma massa
volmica diferente, reflectindo este desvio diferenas da
Calibrao da aparelhagem estrutura no estado slido. A massa volmica das partculas
que os constituem uma caracterstica fsica importante
Preciso da escala de dicrosmo circular. Dissolva 10,0 mg
dos ps farmacuticos.
de isoandrosterona R em dioxano R e complete 10,0 ml com
o mesmo solvente. Registe o espectro do dicrosmo circular A massa volmica de uma partcula slida pode apresentar
entre 280 nm e 360 nm. Determinado no mximo em valores diferentes consoante o mtodo utilizado para medir

2.2.43. Espectrometria de massa
o volume dessa partcula. o mercrio no penetra nos poros de dimenso muito

reduzida que so acessveis ao hlio. Para a mesma
Convm distinguir trs nveis de expresso da massa volmica:
amostra possvel obter vrios valores de massa volmica
a massa volmica cristalina, na qual se considera apenas granular, pois para cada presso de intruso aplicada,
a fraco slida do produto; a massa volmica cristalina pode determinar-se uma massa volmica correspondente
tambm denominada massa volmica verdadeira, ao dimetro mnimo de acesso para essa presso.
2. Mtodos
Analticos
a massa volmica das partculas, na qual se considera

tambm o volume dos poros intraparticulares, III. MASSA VOLMICA EM BRUTO E MASSA VOLMICA
APS COMPACTAO
a massa volmica em bruto, na qual se considera ainda
o volume dos espaos interparticulares formados no seio
A massa volmica em bruto de um p inclui o contributo dos
da camada do p; a massa volmica em bruto tambm espaos interparticulares. Por isso depende simultaneamente
denominada massa volmica aparente. da massa volmica das partculas e do seu arranjo espacial na
camada do p.
I. MASSA VOLMICA CRISTALINA A massa volmica em bruto de um p muitas vezes difcil
de avaliar, pois a mais pequena perturbao da camada do
A massa volmica cristalina de uma substncia a massa p pode originar uma variao da massa volmica. Por isso
mdia por unidade de volume, excluindo todos os espaos essencial indicar em qualquer medio da massa volmica
vazios que no constituem parte integrante do arranjo em bruto, o processo utilizado para efectuar a determinao.
molecular. uma propriedade intrnseca da substncia
A. A massa volmica em bruto determinada medindo
e por isso normalmente independente do mtodo de
o volume ocupado por uma massa conhecida de p
determinao utilizado. A massa volmica cristalina pode
introduzida numa proveta graduada aps tamisao
ser determinada por clculo ou por simples medio.
(2.9.15).
A. A massa volmica cristalina calculada determinada a
partir dos dados cristalogrficos (dimenso e composio B. A massa volmica aps compactao determinada
da unidade da estrutura cristalina) obtidos para um provocando a compactao de uma amostra de p
cristal perfeito, por exemplo por difraco de raios X, e a introduzida numa proveta graduada. Depois da leitura
massa molecular da substncia. do volume inicial, a proveta submetida a uma srie de
pancadas, realizando-se novas leituras at que a variao
B. A massa volmica cristalina medida a relao de volume observada seja mnima (2.9.15).
massa/volume obtida aps medio da massa e do
volume do monocristal.
2.2.43. ESPECTROMETRIA DE MASSA
II. MASSA VOLMICA DAS PARTCULAS
A espectrometria de massa baseia-se na medio directa da
A massa volmica das partculas considera simultaneamente relao entre a massa e o nmero de cargas elementares
a massa volmica cristalina e a porosidade intraparticular (m/z), positivas ou negativas, de ies em fase gasosa obtidos
(poros abertos e/ou fechados). Depende por isso do valor do a partir de uma amostra. Esta relao exprime-se em
volume obtido, o qual, por sua vez, funo do mtodo de unidades de massa atmica (1 u.m.a. = dcima segunda
determinao utilizado. A massa volmica das partculas parte da massa do 12C) ou em daltons (1 Da = massa do
pode ser determinada por qualquer um dos mtodos a seguir tomo de hidrognio).
descritos. Os ies, formados na fonte do aparelho, so acelerados
A. A massa volmica picnomtrica determinada medindo e depois separados pelo analisador antes de atingirem o
o volume ocupado por uma massa conhecida de p e detector. Estas operaes ocorrem num local onde um
que equivalente ao volume de gs deslocado pelo p sistema de bombas mantm um grau de vazio de 103 a
num picnmetro de deslocao de gs (2.9.23). Nas 106 Pa.
determinaes da massa volmica picnomtrica, o O espectro obtido representa a abundncia relativa das
volume medido inclui o volume ocupado pelos poros diferentes espcies inicas existentes, como uma funo de
abertos e no inclui o volume ocupado pelos poros m/z. O sinal correspondente a um io inclui vrios picos
fechados ou no acessveis ao gs. Devido elevada correspondentes distribuio estatstica dos diferentes
difusibilidade do hlio, que o gs preferencialmente istopos que o constituem. Fala-se de perfil isotpico e,
utilizado, a maior parte dos poros abertos so acessveis pelo menos para o caso das molculas de pequena dimenso,
ao gs, pelo que a massa volmica picnomtrica de um p o pico correspondente aos istopos mais abundantes de cada
finamente dividido difere em regra muito pouco da massa tomo chamado pico monoisotpico.
volmica cristalina.
Em espectrometria de massa as informaes obtidas so
B. Na massa volmica por porosimetria com mercrio, qualitativas (determinao da massa molecular, informaes
tambm denominada massa volmica granular, o volume sobre a estrutura aps anlise dos fragmentos observados) ou
determinado tambm exclui o volume ocupado pelos quantitativas (com padres internos ou externos), com limites
poros fechados, mas inclui o volume dos poros abertos de de deteco respectivos compreendidos entre o picomole e o
dimenso superior a um valor limite. Esta dimenso fentomole.
limite dos poros, ou dimetro mnimo de acesso, funo
da presso mxima de intruso aplicada ao mercrio Introduo das amostras. A primeira fase da anlise
durante a determinao. s presses de trabalho normais, consiste em introduzir a amostra no aparelho sem

alterar demasiado o grau de vazio existente. No limitao desta tcnica consiste na necessidade de vaporizar
mtodo mais clssico, denominado introduo lquida a amostra. Assim, no adequada para compostos polares,
directa, a amostra colocada na extremidade de um termossensveis ou de massa molecular elevada. O impacto
tubo cilndrico (num cadinho de quartzo, sobre um electrnico compatvel com o acoplamento cromatografia
filamento ou sobre uma superfcie metlica). Este tubo em fase gasosa/espectrometria de massa e, por vezes, com a
introduzido no espectrmetro depois de ter atravessado cromatografia lquida.
um compartimento no qual mantido um grau de vazio
2. Mtodos
Analticos
primrio intermdio e compreendido entre a presso Ionizao qumica. Neste caso, a ionizao implica a
atmosfrica e o grau de vazio secundrio do aparelho. interveno de um gs reagente como o metano, o amonaco,
Outros sistemas de introduo permitem analisar o monxido de azoto, o dixido de azoto ou o oxignio. O
sequencialmente os constituintes de uma mistura espectro caracteriza-se por ies do tipo (M + H)+ ou (M - H),
medida que vo sendo separados por equipamento ou ainda por outros ies formados entre o analito e o gs
apropriado e ligado ao espectrmetro de massa: utilizado. Apresenta fragmentos menos abundantes do
que a tcnica por impacto electrnico. Quando o produto
Cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massa.
termossensvel pode recorrer-se a uma variante desta
A utilizao de colunas apropriadas (capilares ou semi- tcnica: a amostra, depositada num filamento, vaporizada
-capilares) permite introduzir directamente a extremidade da muito rapidamente pelo efeito de Joule-Thomson (ionizao
coluna na fonte do aparelho, sem utilizar um separador. qumica por dessoro).
Cromatografia em fase lquida/espectrometria de massa. Ionizao por bombardeamento de tomos rpidos (fast
Este conjunto particularmente til na anlise de compostos atom bombardment, FAB) ou de ies rpidos (liquid
polares, pouco volatis ou demasiado instveis termicamente secondary ion mass spectrometry, LSIMS). A amostra,
para serem analisados por cromatografia em fase gasosa/ dissolvida numa matriz viscosa, como a glicerina,
/espectrometria de massa. A dificuldade de execuo consiste depositada numa superfcie metlica e depois ionizada
na obteno de ies em fase gasosa a partir de uma fase por um feixe de tomos neutros como o rgon ou o xnon,
lquida, o que requer interfaces muito especficas como ou ies csio de elevada energia cintica. Da resulta a
introduo lquida directa: a fase mvel nebulizada e o formao de ies do tipo (M + H)+ e (M - H) ou ainda de
solvente evaporado entrada da fonte do aparelho, outros ies provenientes da matriz ou da amostra. Este
modo de ionizao, apropriado para compostos polares e
interface de feixe de partculas: a fase mvel, cujo dbito termossensveis, permite atingir massas moleculares at
pode atingir 0,6 ml/min, nebulizada numa cmara de 10 000 Da. possvel conjug-la com a cromatografia
dessolvatao, de modo que apenas os analitos, na forma lquida juntando 1 a 2 por cento de glicerina fase mvel;
neutra, atinjam a fonte do aparelho; esta tcnica aplica- todavia, o dbito mantm-se baixo (alguns microlitros por
-se a compostos relativamente pouco polares e de massa minuto). Estas tcnicas de ionizao permitem tambm
molecular inferior a 1000 Da, a anlise de placas de cromatografia em camada fina
depositando, superfcie, uma fina camada da matriz.
interface de transporte contnuo: a fase mvel, cujo
dbito pode atingir 1 ml/min, depositada superfcie de Dessoro de campo e ionizao de campo. A amostra
um transportador mvel; aps evaporao do solvente, os volatilizada prximo de um filamento de tungstnio revestido
compostos a analisar so sucessivamente introduzidos na por micro-agulhas (ionizao de campo) ou depositada
fonte do aparelho, onde so ionizados; esta tcnica no no prprio filamento (dessoro de campo). A tenso, de
cerca de 10 kV, aplicada entre este filamento e um contra-
adequada para compostos muito polares ou termos-
-elctrodo, permite ionizar a amostra. Estas duas tcnicas
sensveis.
originam principalmente ies moleculares radicalares M+ e
Outros tipos de acoplamento (electro-atomizao, termo- do tipo (M + H)+ e aplicam-se a compostos pouco polares e/ou
-atomizao e ionizao qumica presso atmosfrica) so termossensveis.
considerados tcnicas de ionizao e descritos em Modos de Ionizao por dessoro laser (matrix-assisted laser
ionizao. desorption ionisation, MALDI). A amostra, includa numa
Cromatografia em fase supercrtica/espectrometria de matriz apropriada e depositada num suporte metlico,
massa. A fase mvel, constituda geralmente por dixido de ionizada por um feixe de laser radiaes cujo comprimento
carbono no estado supercrtico, volatilizada por passagem de onda pode estar compreendido entre o UV e o IV
num restritor aquecido e colocado entre a coluna e a fonte (impulsos compreendidos entre um picossegundo e alguns
de ies. nanossegundos). Este mtodo de ionizao desempenha
um papel fundamental na anlise de compostos de massa
Electroforese capilar/espectrometria de massa. O eluente molecular muito elevada (superior a 100 000 Da), mas est
introduzido na fonte aps eventual adio de outro solvente limitada aos analisadores de tempo de vo (ver adiante).
que permite atingir dbitos de alguns microlitros por minuto.
As limitaes desta tcnica relacionam-se principalmente Electro-atomizao. Este mtodo de ionizao decorre
com as baixas quantidades de amostra introduzida e com a presso atmosfrica. As amostras so introduzidas na
obrigatoriedade de utilizar tampes volteis. fonte, sob a forma de soluo, atravs de um capilar
cuja extremidade levada a um potencial da ordem dos
5 kV. A nebulizao, que pode ser auxiliada por um gs,
Modos de ionizao
provoca a formao de microgotculas que originam, por
Impacto electrnico. A amostra, no estado gasoso, ionizada dessolvatao, ies mono ou policarregados na fase gasosa.
por um feixe de electres cuja energia (frequentemente Os dbitos variam entre alguns microlitros por minuto
de 70 eV) superior ao potencial de ionizao da amostra. a 1 ml/min. Esta tcnica apropriada para compostos
Para alm do io molecular radicalar M+, observam-se polares e para o estudo de biomolculas cuja massa
fragmentos caractersticos da sua estrutura. A principal molecular possa atingir 100 000 Da, podendo ser realizada

em conjunto com a cromatografia lquida ou com a entre 2000 Da e 15 000 Da para ies monocarregados. Alguns
electroforese capilar. ies podem decompor-se, espontaneamente (transies
metastveis) ou aps coliso com um gs (decomposies
Ionizao qumica presso atmosfrica (atmospheric
bimoleculares), entre a fonte e o detector nas regies ditas
pressure chemical ionisation, APCI). A ionizao feita
livres do campo. O seu estudo muito interessante, quer
presso atmosfrica por um elctrodo com um potencial
de vrios kilovolts e colocado no trajecto da fase mvel do ponto de vista estrutural, quer para caracterizar um
determinado composto numa mistura, e recorre dupla
2. Mtodos
Analticos
que, por sua vez, nebulizada por efeito trmico e pela

utilizao de uma corrente de azoto. Os ies formados so espectrometria de massa. Existem inmeras tcnicas
monocarregados, do tipo (M + H)+ em modo positivo e deste tipo, consoante a regio em que se produzem estas
do tipo (M - H) em modo negativo. Os dbitos elevados, decomposies:
compatveis com este modo de ionizao (at 2 ml/min), modo filho (determinao dos ies resultantes da
tornam esta tcnica adequada para utilizao em conjunto decomposio de um io pai seleccionado):
com a cromatografia lquida.
B/E constante, MIKES (Mass-analysed Ion Kinetic
Termo-atomizao. A amostra, dissolvida numa fase mvel Energy Spectroscopy),
composta por gua e modificadores orgnicos e contendo
um electrlito voltil (geralmente acetato de amnio) modo pai (determinao de todos os ies que, por
introduzida, sob a forma de nebulizado, passando por decomposio, originam um io com determinada relao
um capilar metlico de temperatura regulvel. Os dbitos m/z): B2/E constante,
aceitveis esto compreendidos entre 1 e 2 ml/min. Os ies modo perda de neutro (deteco de todos os ies que
do electrlito ionizam os compostos a analisar. Este processo perdem um fragmento idntico):
de ionizao pode ser substitudo ou auxiliado por uma
descarga elctrica de cerca de 800 volts, nomeadamente no B/E(1-E/E0)1/2 constante, em que E0 a tenso de base do
caso em que os solventes so totalmente orgnicos. Esta sector electrosttico.
tcnica compatvel com a utilizao da cromatografia
Quadrupolos. O analisador constitudo por quatro barras
lquida/espectrometria de massa.
metlicas paralelas, de seco cilndrica ou hiperblica,
dispostas simetricamente em relao ao eixo da trajectria
Analisadores dos ies, e ligadas electricamente duas a duas, em diagonal,
As diferenas dos seus desempenhos devem-se essencialmente em relao ao eixo de simetria das barras. Os potenciais
a dois factores: aplicados a cada par de barras so apostos e so a resultante
de uma componente contnua e de uma componente
o intervalo em que possvel medir a relao m/z, ou alterna. A transmisso e a separao dos ies formados na
gama de massa, fonte feita fazendo variar as tenses aplicadas nas barras,
o poder de resoluo, caracterizado pela capacidade de de modo que a relao tenso contnua/tenso alterna se
separar dois ies de igual intensidade com relaes m/z mantenha constante. Os quadruplos tm geralmente
diferindo de /M, e que so recuperados a uma dada uma gama de massas compreendida entre 1 e 2000 u.m.a.,
percentagem do vale: por exemplo, um poder de mas alguns podem atingir 4000 u.m.a. Com um poder de
resoluo M/M de 1000, a 10 por cento do vale, permite
resoluo mais baixo do que os analisadores magnticos,
separar as relaes m/z 1000 e 1001 com uma recuperao
permitem no entanto obter um perfil monoisotrpico de
de 10 por cento acima da linha de base. No entanto, em
ies monocarregados em toda a gama de massas. possvel
certos casos (analisadores de tempo de vo, quadruplos,
obter espectros dispondo trs quadruplos em srie, Q1, Q2,
captura de ies) o poder de resoluo por vezes definido
Q3. Neste caso, Q2 constitui uma clula de coliso, no sendo
como a relao entre a massa molecular e a largura do pico
meia-altura (definio a 50 por cento do vale). propriamente um analisador. O gs de coliso mais utilizado
o rgon.
Analisadores magnticos e electrostticos. Os ies formados
na fonte so acelerados por uma tenso elctrica V e depois Os tipos de varrimento mais utilizados so os seguintes:
focados para um analisador magntico (campo magntico B) modo filho: Q1 selecciona um io m/z cujos fragmentos
ou para um analisador electrosttico (campo electrosttico obtidas por coliso em Q2 so analisadas por Q3,
E), consoante a configurao do equipamento. Descrevem
uma trajectria de raio r que obedece lei de Laplace: modo pai: Q3 filtra somente uma relao m/z especfica,
enquanto Q1 percorre uma determinada gama de massas;
apenas os ies que se decampem originando um io
seleccionado por Q3 sero detecteados,
modo perda de neutro: Q1 e Q3 percorrem uma
Podem ser utilizados dois tipos de varrimento para recolher determinada gama de massas, mas com um afastamento
e medir o conjunto de ies formados na fonte: varrimento correspondente perda de um fragmento caracterstico de
de B para um valor fixo de V, ou varrimento de V para um um produto ou de uma famlia de compostos.
valor constante de B. Ao analisador magntico segue-se igualmente possvel obter espectros combinando
em regra um sector electrosttico que actua como filtro de analisadores quadrupolares com analisadores magnticos
energia cintica e que permite aumentar significativamente
ou electrostticos: estes conjuntos so denominados
o poder de resoluo do aparelho. O poder de resoluo
espectrmetros de massa hbridos.
mximo de um aparelho deste tipo, dito de sector duplo,
varia entre 10 000 e 150 000 e permite, na maior parte dos Analisador de captura de ies. O princpio idntico ao das
casos, determinar o valor das relaes m/z com uma preciso quadruplos, sendo neste caso os campos elctricos aplicados
suficiente para calcular a composio elementar dos ies nas trs direces do espao. Este tipo de analisador permite
correspondentes. O intervalo de massas est compreendido obter espectros de decomposio de vrias geraes (MSn).

2.2.44. Carbono orgnico total na gua para uso farmacutico
Analisadores de ressonncia ciclotrnica. Os ies, formados aquisio distinto da anlise) ou interno (o ou os padres so
numa clula, so forados, sob a aco de um campo misturados com a amostra e surgem no mesmo ficheiro de
magntico homogneo e intenso, a descrever um movimento aquisio). O nmero de ies ou de pontos necessrios a uma
circular cuja frequncia pode ser directamente relacionada calibrao fivel depende do tipo de analisador e da preciso
com a respectiva relao m/z, por tratamento matemtico da medida que se quer obter: por exemplo, na caso de um
pela transformada de Fourier. Trata-se da ressonncia analisador magntico, em que a relao m/z varia de modo
ciclotrnica. Este tipo de analisador constitudo por exponencial com o valor do campo magntico, convm ter o
2. Mtodos
Analticos
magnetes supracondutores, permitindo alcanar poderes de maior nmero possvel de pontos.
resoluo muito elevados (at 1 000 000 ou mais) e obter
espectros MSn. Todavia, necessita de presses muito baixas
Deteco do sinal e tratamento dos dados
(da ordem de 107 Pa).
Um sistema de deteco, como um fotomultiplicador ou
Analisadores de tempo de vo. Os ies formados na fonte
um multiplicador de electres, converte os ies separados
so acelerados sob uma tenso V de 10 a 20 kV. Atravessam
pelo analisador em sinais elctricos, que so amplificados
o analisador, constitudo por um tubo de 25 cm a 1,5 m no
antes de serem novamente convertidos em sinais
qual no existe qualquer campo elctrico, que vulgarmente
numricos, permitindo assim o tratamento informtico dos
denominado tubo de vo. O tempo (t) que os ies gastam para
resultados com finalidades to diversas como a calibrao,
atingir o detector proporcional raiz quadrada da relao
m/z. Em teoria, a gama de massas de um ionizadar deste tipo a reconstituio dos espectros, a quantificao automtica
infinita. Na prtica, limitada pelo mtodo de ionizao ou o arquivo, a criao ou a utilizao de bancos de dados
ou dessoro associado. Os analisadores de tempo de vo espectrais. Os diferentes parmetros fsicos necessrios ao
so sobretudo utilizados para compostos com elevada massa funcionamento do aparelho so gerados por computador.
molecular (podendo atingir vrias centenas de milhares de
daltons). Esta tcnica muito sensvel (so suficientes alguns
picomoles de produto). A preciso das medies e o poder de 2.2.44. CARBONO ORGNICO TOTAL
resoluo de um aparelho deste tipo podem ser nitidamente NA GUA PARA USO FARMACUTICO
melhoradas com um espelho electrosttico (reflectro).
A determinao do carbono orgnico total (COT) uma
Aquisio de sinal medio indirecta das substncias orgnicas presentes na
gua para uso farmacutico.
H essencialmente trs modos de aquisio possveis.
Modo do espectro completo. Regista-se a totalidade Este mtodo pode tambm ser usado para controlar o
do sinal obtido numa gama de massas seleccionada. O desenvolvimento de vrias operaes na preparao de
espectro representa a intensidade relativa das diferentes medicamentos.
espcies inicas existentes em funo de m/z. Os resultados H vrios mtodos apropriados para a determinao do
so essencialmente de natureza qualitativa. Para uma COT. Alm de prescrever um mtodo particular, o presente
identificao mais rpida, possivel utilizar bibliotecas de captulo geral descreve os procedimentos a seguir para
espectros de referncia. qualificar o mtodo escolhido e interpretar os resultados
Modo fragmentomtrico (single ion monitoring, SIM, no mbito de um ensaio limite. Analisa-se uma soluo
ou multiple ion monitoring, MIM). A aquisio do sinal padro a intervalos regulares, determinados em funo da
restringida a um (SIM) ou a vrios (MIM) ies caractersticos frequncia das medies. Esta soluo preparada com
da ou das substncias a analisar. Este modo permite diminuir uma substncia pressupostamente, facilmente oxidvel (por
sensivelmente o limite de deteco. Com padres internos exemplo, a sacarose), numa concentrao tal que a resposta
ou externos (padres deuterados, etc.) podem ser realizados instrumental obtida corresponda ao limite do teor fixado de
estudos quantitativos ou semi-quantitativos. Estas anlises COT. A conformidade do sistema verificada atravs de uma
no podem ser realizadas com analisadores de tempo de vo. soluo preparada com uma substncia previsivelmente de
difcil oxidao (por exemplo a 1,4-benzoquinona).
Modo fragmentomtrico em espectrometria de massa
dupla (multiple reaction monitoring, MRM). Neste caso Todo o tipo de aparelhos utilizados para medir o COT contido
trata-se de acompanhar, especificamente, a decomposio na gua para uso farmacutico baseia-se no mesmo princpio:
unimolecular ou bimolecular de um io precursor escolhido, oxidao completa a dixido de carbono das molculas
caracterstico da substncia a analisar. A selectividade e orgnicas contidas na amostra de gua, seguida da anlise
o carcter altamente especfico deste modo de aquisio quantitativa do dixido de carbono produzido e, a partir do
permitem atingir excelentes nveis de sensibilidade e tornam valor obtido, determinao, por clculo, do teor em carbono
esta tcnica particularmente adequada ao estudo quantitativo da gua.
com padres internos apropriados (padres deuterados,
etc.). Este tipo de anlise s pode ser realizada com o auxlio O aparelho utilizado permite diferenciar o carbono orgnico
de aparelhos equipados com trs quadruplos em srie, do carbono inorgnico presente na forma de carbonato. A
ou com analisadores de captura de ies ou de ressonncia distino pode ser efectuada ou determinando o carbono
ciclotrnica. inorgnico e subtraindo o resultado ao teor de carbono
total, ou eliminando da amostra o carbono inorgnico
presente, antes de proceder oxidao. Certas molculas
Calibrao
orgnicas podem tambm ser arrastadas no decurso desta
A calibrao permite atribuir ao sinal detectado o valor operao, mas a gua para uso farmacutico apenas contm
da relao m/z correspondente. Em regra, feita com quantidades negligenciveis de carbono orgnico, susceptvel
um padro. Esta calibrao pode ser externa (ficheiro de de ser assim co-eliminado.

2.2.45. Cromatografia em fase supercrtica
Aparelhagem 2.2.45. CROMATOGRAFIA EM FASE

Utilize um aparelho calibrado, instalado em linha ou SUPERCRTICA
autnomo. Verifique a conformidade do sistema como abaixo
se descreve, a intervalos de tempo apropriados. O limite de A cromatagrafia em fase supercrtica (CFS) uma tcnica
deteco do aparelho, especificado pelo fabricante, inferior de separao cromatogrfica em que a fase mvel um
ou igual a 0,05 mg de carbono por litro. fluido levado ao estado supercrtico ou subcrtico. A fase
2. Mtodos
Analticos
Agua COT. Utilize gua altamente purificada, que satisfaa s estacionria, contida numa coluna, pode ser constituda por
seguintes especificaes: partculas slidas de granulametria fina (slica ou grafite
porosa, por exemplo), ou ser quimicamente modificada
condutividade: no mximo, 1,0 S.cm1 a 25C, como as fases utilizadas em cromatografia lquida, ou por
carbono orgnico total: no mximo, 0,1 mg/l. colunas capilares ou ser constituda por uma pelcula lquida
reticulada que recobre uniformemente as paredes da coluna.
Segundo o tipo de aparelho utilizado, os teores em metais
pesados e em cobre podem ser factores crticos. Atenda-se s A CFS fundamenta-se em mecanismos de adsoro ou de
instrues do fabricante. distribuio de massa.
Preparao do material de vidro. Lave cuidadosamente o

material de vidro por um processo que elimine a matria APARELHAGEM
orgnica. Utilize gua COT na fase final da lavagem.
A aparelhagem consiste geralmente num sistema
Soluo padro. Dissolva sacarose R, previamente seca a 105C de bombagem refrigerado, um injector, uma coluna
durante 3 h, em gua COT, de modo a obter uma soluo a cromatogrfica colocada num forno, um detector, um
1,19 mg de sacarose por litro (0,50 mg de carbono por litro). regulador de presso e um sistema de aquisio de dados (ou
Soluo problema. Recolha a gua a examinar num um integrador ou um registador).
recipiente estanque, tomando precaues para evitar qualquer
contaminao, deixando um mnimo de cmara de ar. Examine Sistemas de bombagem
a gua no mais curto espao de tempo, de modo a reduzir os Os sistemas de bombagem fornecem a fase mvel com um
riscos de contaminao pelo recipiente e pela rolha. dbito constante. conveniente limitar, sempre que possvel,
Soluo de conformidade do sistema. Dissolva 1,4- as flutuaes de presso fazendo, por exemplo, passar o
-benzoquinona R em gua COT, de modo a obter uma soluo solvente sobre presso atravs de um dispositivo amortecedor
a 0,75 mg de 1,4-benzoquinona por litro (0,50 mg de carbono das pulsaes da bomba. Os tubos e ligaes so resistentes s
por litro). presses desenvolvidas pela bomba.
gua COT padro. Utilize gua COT preparada ao mesmo Os sistemas controlados por microprocessador fornecem
tempo que a usada para preparar a soluo padro e a soluo a fase mvel com preciso, em condies constantes ou
de conformidade do sistema. variveis, de acordo com o programa definido. Para as
cromatografias em gradiente de eluio, existem sistemas de
Solues padro. Alm da gua COT padro prepare bombagem que permitem o fornecimento do(s) solvente(s)
solues em branco apropriadas ou quaisquer outras a partir de vrios reservatrios, podendo a sua mistura ser
solues necessrias para definir a linha de base ou efectuada a montante (baixa presso) ou a jusante (alta
proceder calibrao segundo as instrues do fabricante. presso) da(s) bomba(s).
Utilize os brancos apropriados para regular o zero do
aparelho.
Injectores
Conformidade do sistema. Examine as solues seguintes e
A injeco pode ser efectuada directamente na topo da coluna
registe as respostas obtidas: gua COT (rw), soluo padro
atravs de uma vlvula.
(rs), soluo de conformidade do sistema (rss). Calcule a
eficcia do sistema em percentagem, usando a expresso.
Fases estacionrias
rss rw
rs rw 100 As fases estacionrias esto contidas em colunas do mesmo
tipo das descritas nos captulos Cromatografia lquida
O sistema s estar conforme se o valor obtido for, no (2.2.29) (colunas de enchimento) e Cromatografia em fase
mnimo, 85 por cento e, no mximo, 115 por cento do valor gasosa (2.2.28) (colunas capilares). Uma coluna capilar tem
terico. um dimetro interno () mximo de 100 m.
Mtodo. Determine a resposta (ru) do sistema para a soluo
problema. A soluo problema satisfaz o ensaio se ru no for Fases mveis
superior a rs rw.
A fase mvel geralmente constituda por dixido de
O mtodo pode igualmente ser realizado com um aparelho carbono, eventualmente adicionado de um modificador polar,
instalado em linha, que tenha sido convenientemente como por exemplo o metanol, o 2-propanol, ou o acetonitrilo.
calibrado e que satisfaa ao ensaio de conformidade do A composio, a presso (densidade), a temperatura e o
sistema. A localizao do aparelho escolhida de modo a dbito da fase mvel indicado podem ser mantidos constantes
assegurar que os resultados obtidos sejam representativos da durante toda a anlise cromatogrfica (eluio isocrtica,
gua utilizada. isobrica, isotrmica), ou variar de acordo com um programa

2.2.46. Tcnicas de separao cromatogrfica
definido (gradiente de eluio do modificador, de presso podem ser calculados, em alguns aparelhos, recorrendo aos
(densidade), de temperatura ou de dbito). programas informticos fornecidos pelo fabricante. da
responsabilidade do utilizador assegurar que os mtodos
Detectores de clculo utilizados pelos programas informticos so
compatveis com as especificaes da Farmacopeia. Se assim
Os detectores mais utilizados so os espectrofotmetros no acontecer, efectuam-se as correces necessrias.
no ultravioleta/visvel (UV/Vis) e os detectores de ionizao
2. Mtodos
Analticos
de chama. Podem tambm usar-se detectores baseados Cromatograma
na disperso da luz, na espectrofotometria de absoro
Um cromatograma uma representao, grfica ou outra, da
no infravermelho, na condutividade trmica ou noutros
resposta de um detector, da concentrao de um efluente ou
processos mais especficos.
de outra grandeza utilizada como medida da concentrao de
um efluente, em funo do tempo, do volume ou da distncia.
MTODO Idealmente, um cromatograma apresenta-se como uma
sequncia de picos gaussianos sobre uma linha de base.
Prepare a(s) soluo (solues) a examinar e a(s) soluo
(solues) do(s) padro (padres) prescritas. As solues esto
DADOS DE RETENO
isentas de partculas slidas.
Os critrios de conformidade do sistema esto descritos no Tempo de reteno e volume de reteno
captulo Tcnicas de separao cromatogrfica (2.2.46).
Em cromatografia de eluio, as grandezas de reteno
Os limites dentro dos quais possvel fazer variar os
podem ser expressas em termos de tempo de reteno tr,
diferentes parmetros, de modo a satisfazerem os critrios de
definido directamente pela posio do mximo do pico
conformidade do sistema, esto igualmente indicados nesse
cromatogrfico no cromatograma. A partir do tempo de
captulo.
reteno pode calcular-se o volume de reteno Vr,
Vr tr v
2.2.46. TCNICAS DE SEPARAO
CROMATOGRFICA tr = tempo de reteno ou distncia sobre a linha de base entre o
ponto de injeco e a perpendicular obtida a partir do mximo
As tcnicas de separao cromatogrfica correspondem a do pico correspondente ao componente considerado,
mtodos de separao sequencial em que os componentes v = dbito da fase mvel.
da amostra se distribuem por duas fases, uma estacionria e
outra mvel. A fase estacionria pode ser um slido ou um Coeficiente de distribuio mssico
lquido mantido num suporte slido ou um gel. Pode estar
contida numa coluna, espalhada em camada, distribuda O coeficiente de distribuio mssico Dm (ou factor de
sob a forma de pelcula, etc. A fase mvel pode ser gasosa ou capacidade, ou factor de reteno k) definido como:
lquida. A separao pode basear-se em fenmenos como a
adsoro, a distribuio de massa (partilha), a troca de ies,
etc., ou em diferenas nas propriedades fsico-qumicas das
molculas como o tamanho, a massa, o volume, etc.
kc = coeficiente de distribuio no equilbrio (ou constante de
O presente captulo contm as definies e os mtodos distribuio),
de clculo dos parmetros comuns a estas tcnicas, assim
como as exigncias de aplicao geral para a conformidade Vs = volume da fase estacionria,
dos sistemas cromatogrficos. Os princpios da separao, VM = volume da fase mvel.
aparelhagem e mtodos esto descritos nos mtodos gerais
seguintes: O coeficiente de distribuio mssico de um componente
pode ser determinado a partir do cromatograma, usando a
Cromatografia em papel (2.2.26) seguinte expresso:
Cromatografia em camada fina (2.2.27) Dm (tR tM) / tM
Cromatografia em fase gasosa (2.2.28)
tR = tempo (ou volume) de reteno ou distncia sobre a linha
Cromatografia lquida (2.2.29) de base entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada
a partir do mximo do pico correspondente ao componente
Cromatografia de excluso (2.2.30)
considerado,
Cromatografia em fase supercrtica (2.2.45).
t = tempo (ou volume) morto ou distncia sobre a linha de base
M
entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada a partir do
DEFINIES mximo do pico correspondente a um componente no retido.
As definies seguintes foram as usadas para calcular os Coeficiente de partilha

limites que figuram nas monografias.
Em cromatografia de excluso, as caractersticas de eluio
Alguns parmetros, como por exemplo a razo sinal/rudo, de um componente numa determinada coluna podem ser

descritas pelo coeficiente de partilha Kd, calculado usando a d = distncia entre a perpendicular baixada a partir do mximo
seguinte expresso: do pico e o ponto localizado no ramo ascendente do mesmo
pico a um vigsimo da sua altura.
Kd (tr to) / (tt to)
Um valor de 1,0 indica simetria total (ideal).
tr = tempo (ou volume) de reteno ou distncia sobre a linha
de base entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada
2. Mtodos

Analticos
considerado,
to = tempo (ou volume) morto ou distncia sobre a linha de base
entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada a partir
do mximo do pico correspondente a um componente no
retido,
tt = tempo (ou volume) de reteno ou distncia sobre a
linha de base entre o ponto de injeco e a perpendicular
baixada a partir do mximo do pico correspondente a um
componente que tenha acesso a todos os poros da fase
estacionria.
Factor de retardao FIGURA 13
Em cromatografia planar, o factor de retardao RF (tambm

chamado, factor de reteno RF ) a razo entre a distncia Eficincia da coluna e nmero aparente de pratos tericos
que separa o ponto de aplicao do centro da mancha e a
A eficincia de uma coluna (eficcia aparente) pode ser
distncia percorrida pela frente do solvente a partir do ponto
calculada a partir de dados obtidos em condies isotrmicas,
de aplicao.
isocrticas ou isodensas (de acordo com a tcnica utilizada)
e em termos do nmero aparente de pratos tericos N, com
RF b/a
a ajuda da expresso seguinte, onde os valores tr e de wh
esto expressos na mesma unidade (de tempo, volume ou
b = distncia de migrao do componente considerado, distncia):
a = distncia de migrao da frente do solvente.
N 5,54 (tr/wh)2
DADOS CROMATOGRFICOS t = tempo (ou volume) de reteno ou distncia sobre a linha

r
de base entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada
Um pico pode ser definido pela sua rea A ou pela sua altura
h e a sua largura a meia altura Wh, ou pela sua altura e a
considerado,
sua largura nos pontos de inflexo wi ; no caso de um pico
gaussiano (figura 1), possvel estabelecer a seguinte relao: w = largura do pico a meia altura.
h
Wh 1,18 wi
O nmero aparente de pratos tericos depende do
componente considerado, da coluna e do tempo de reteno.
DADOS DA SEPAPAO
Resoluo
A resoluo Rs, entre dois picos de altura semelhante pode ser
calculada usando a expresso:
Rs 1,18 (tr.b tr.a) / wha + whb

tr.b > tr.a
tr.a e tr.b = tempos de reteno ou distncias sobre a linha de base

entre o ponto de injeco e as perpendiculares
FIGURA 12
baixadas a partir dos mximos de dois picos adjacentes,
wha e whb = largura dos picos a meia altura.

Factor de simetria
O factor de simetria As de um pico, (figura 13) dado pela Uma resoluo superior a 1,5 corresponde a uma separao at
expresso: linha de base.
As w0,05 / 2d
A expresso antes apresentada no pode ser aplicada quando os
w0,05 = largura do pico a um vigsimo da sua altura, picos no esto separados at linha de base.

Em cromatografia planar quantitativa, as distncias de A reteno relativa no corrigida rg calculada usando a

migrao substituem os tempos de reteno, e a resoluo expresso
pode ser calculada usando a expresso:
Rs = 1,18zf (RF.b RF.a) / wha + whb
Salvo indicao em contrrio, os valores da reteno relativa
2. Mtodos
RF.a e RF.b = razo entre a distncia que separa o ponto de aplicao
Analticos
do centro da mancha e a distncia percorrida pela indicados na monografia correspondem reteno relativa
frente do solvente a partir do ponto de aplicao,
no corrigida.
Em cromatografia planar, os factores de reteno rf.b e rf.a
wha e whb = largura dos picos a meia altura,
substituem tr2 e tr1.
zf = distncia de migrao da frente do solvente.
PRECISO DA QUANTIFICAO
Relao pico/vale
A relao pico/vale, p/v, pode ser utilizada como critrio Relao sinal/rudo
de conformidade do sistema num ensaio de substncias A relao sinal/rudo, S/N, afecta a preciso da quantificao e
aparentadas, quando no h separao at linha de base pode ser calculada usando a expresso:
entre 2 picos (figura 14).
S/N 2H/h
p/v = hp / hv
H = altura do pico (figura 15) correspondente ao componente
hp altura, acima da linha de base (extrapolada), do pico menor, considerado no cromatograma obtido com a soluo padro
indicada, medido entre o cume do pico e a linha de base
hv altura, acima da linha de base (extrapolada), do ponto mais extrapolada do sinal observado sobre uma distncia igual a
baixo da curva entre os picos menor e maior. 20 vezes a largura do pico a meia altura,
h = amplitude do rudo de fundo num cromatograma obtido
aps injeco ou aplicao de um branco, observado a uma
distncia igual a 20 vezes a largura a meia altura do pico do
cromatograma obtido com a soluo padro indicada, e se
possvel centrada no local onde o pico estaria localizado.
FIGURA 15
Repetibilidade
FIGURA 14 A repetibilidade da resposta expressa. em percentagem,
pelo desvio padro relativo, DPR%, calculado a partir dos
Reteno relativa resultados de uma srie de medies consecutivas efectuadas
A reteno relativa r, um valor calculado usando a por injeco ou aplicao de uma soluo padro, usando a
expresso: seguinte expresso:
tr2 tM
r tr1 tM
tr2 = tempo de reteno do pico considerado,

yi = valores individuais (reas ou alturas de picos, ou razes de
tr1 = tempo de reteno do pico padro (geralmente o reas determinadas pelo mtodo do padro interno),
correspondente substncia em anlise), = mdia dos valores individuais,
tM = tempo de reteno (ou volume) ou distncia sobre a linha de n = nmero de valores individuais.
base entre o ponto de injeco e a perpendicular baixada a
partir do mximo do pico correspondente a um componente O desvio padro relativo mximo admitido, DPRmax,
no retido (hold-up time). calculado a partir de uma srie de injeces da soluo

padro, para os limites de teor definidos, usando a seguinte AJUSTE DAS CONDIES CROMATOGRFICAS
expresso:
Os limites entre os quais possvel fazer variar os diferentes
KB n
ETRmax t90%, n 1
parmetros de um ensaio cromatogrfico, de forma a
satisfazer aos critrios de conformidade do sistema, sem
modificaes fundamentais do mtodo, esto a seguir listadas
constante _com o valor de 0,349, dado como informao. As condies cromatogrficas descritas
K _ pela expresso
2. Mtodos
Analticos
K 0,6/ 2 t90%,5 /6, onde 0,6/ 2 representa o DPR foram validadas durante a elaborao das monografias. Os
requerido para 6 injeces e B = 1,0, ensaios de conformidade do sistema especificados esto
includos de forma a assegurar que a separao requerida
B limite superior do teor especificado na rubrica Definio para a realizao do ensaio ou doseamento conseguida.
da monografia menos 100 por cento, Contudo, podem ser necessrios alguns ajustes das condies
n nmero de injeces da soluo padro (3 n 6), cromatogrficas, para que o sistema responda aos critrios de
conformidade especificados. Isto porque as fases estacionrias
t varivel t de Student ao nvel de probabilidade de 90 por esto descritas em termos gerais e, no mercado, existem
90%, n
cento (bilateral), com n 1 graus de liberdade. disponveis em grande variedade, podendo apresentar
diferenas no comportamento cromatogrfico. Em certos
casos, particularmente com as cromatografias lquidas em
CONFORMIDADE DO SISTEMA fase reversa, o ajuste dos parmetros cromatogrficos nem
sempre conduz a resultados satisfatrios. Pode, ento, ser
Os ensaios de conformidade do sistema fazem parte necessrio substituir a coluna por outra do mesmo tipo (por
integrante do mtodo e visam verificar a eficincia do sistema exemplo, de gel de slica octadecilsililada), apresentando o
cromatogrfico. Os parmetros normalmente utilizados comportamento cromatogrfico pretendido.
para avaliar a eficincia da coluna so a eficcia aparente, o
coeficiente de distribuio mssico, a resoluo, a reteno Para os parmetros crticos, os ajustes que asseguram a
relativa e o factor de simetria. Os factores que podem afectar conformidade do sistema esto definidos de forma clara na
o comportamento cromatogrfico incluem a composio, a monografia.
fora inica, a temperatura e o pH aparente da fase mvel, Evitar-se-o mltiplos ajustes porque podem ter um efeito
o dbito, o comprimento da coluna, a temperatura, a cumulativo e afectar a eficincia do sistema.
presso e algumas caractersticas da fase estacionria como
a porosidade, a granulometria e a natureza das partculas,
Cromatografia em camada fina e cromatografia em papel
a rea especfica e, nos casos de suportes em fase reversa, o
grau de modificao qumica (revestimento final (end- Composio da fase mvel: a quantidade do solvente
-capping), taxa de carbono, etc.). minoritrio pode ser ajustada entre 30 por cento em valor
relativo e 2 por cento em valor absoluto (pode utilizar-se
Os diferentes elementos do equipamento utilizado so
o valor mais elevado); no caso de um solvente minoritrio
qualificados e capazes de atingir a preciso requerida para
que represente 10 por cento da fase mvel, um ajustamento
a realizao do ensaio ou doseamento considerado. de 30 por cento em termos relativos permite um intervalo
As exigncias seguintes esto satisfeitas em todos os casos, de 7-13 por cento enquanto que um ajustamento de 2 por
salvo indicao contrria na monografia. cento em termos absolutos permite um intervalo de 8-12 por
cento, sendo maior o valor relativo; no caso de um solvente
O factor de simetria do pico principal est compreendido minoritrio que represente 5 por cento da fase mvel,
entre 0,8 e 1,5, salvo indicao contrria na monografia. um ajustamento de 30 por cento em termos relativos
Esta exigncia aplicvel ao conjunto dos ensaios e permite um intervalo de 3,5-6,5 por cento enquanto que um
doseamentos descritos nas monografias. ajustamento de 2 por cento em termos absolutos permite um
O desvio padro relativo mximo admitido para uma srie intervalo de 3-7 por cento, ficando o valor absoluto, neste
de injeces da soluo padro indicada no superior aos caso, maior. Para os outros componentes, a variao no
valores especificados no quadro 21. Esta exigncia aplica- superior a 10 por cento em termos absolutos.
-se apenas aos doseamentos e no se aplica aos ensaios das pH do componente aquoso da fase mvel: pH 0,2, salvo
substncias aparentadas. indicao contrria na monografia, ou pH 1,0 quando se
O limite de deteco do pico (correspondente a uma analisam substncias neutras.
relao sinal/rudo de 3) inferior ao limite de excluso do Concentrao de sais no tampo que entra na composio da
ensaio das substncias aparentadas. fase mvel: 10 por cento.
O limite de quantificao do pico (correspondente a uma Volume aplicado: 10-20 por cento do volume prescrito
relao sinal/rudo de 10) inferior ou igual ao limite de quando se utilizam placas de granulometria fina
excluso do ensaio das substncias aparentadas. (2-10 m).
Distncia de migrao da frente do solvente: no inferior a
QUADRO 21 Exigncias respeitantes repetibilidade 50 mm (30 mm para as placas de alta resoluo).
Nmero de injeces individuais
Cromatografia lquida
3 4 5 6
Composio da fase mvel: a quantidade do solvente
B (por cento) Desvio padro relativo mximo
minoritrio pode ser ajustada entre 30 por cento em valor
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85 relativo e 2 por cento em valor absoluto (pode
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06 utilizar-se o valor mais elevado). Os outros componentes no
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27 podem ser alterados em mais do que 10 por cento, em valor
absoluto.

pH do componente aquoso da fase mvel: pH 0,2, salvo Temperatura: 10 por cento.

indicao contrria na monografia, ou pH 1,0 quando se
Volume de injeco: pode ser diminudo, desde que a
analisam substncias neutras.
deteco e a repetibilidade sejam satisfatrias.
Concentrao de sais no tampo que entra na composio da
fase mvel: 10 por cento. QUANTIFICAO
Comprimento de onda de deteco: no permitido qualquer
2. Mtodos
Analticos
ajuste. Resposta do detector. A sensibilidade do detector a
Fase estacionria: intensidade do sinal emitido por unidade de concentrao
ou de massa de uma substncia na fase mvel que entra
comprimento da coluna: 70 por cento, no detector. O factor de resposta relativo de um detector,
dimetro interno da coluna: 25 por cento, comumente chamado factor de resposta, exprime a
sensibilidade deste detector em relao a uma substncia
granulometria: reduo mxima de 50 por cento, no de referncia. O factor de correco inverso do factor de
sendo permitido qualquer aumento. resposta.
Mtodo do padro externo.A concentrao do(s)
Dbito: 50 por cento.
componente(s) em anlise determinada por comparao
Temperatura: 10 por cento, at um mximo de 60C. das resposta(s) (pico(s) obtidos com a soluo problema) e
Volume de injeco: pode ser diminudo, desde que a as resposta(s) (pico(s) obtido(s) com uma soluo padro).
deteco e a repetibilidade do(s) pico(s) em estudo sejam Mtodo do padro interno. Um componente (padro
satisfatrias. interno), perfeitamente separado da substncia a analisar
Gradiente de eluio: a configurao do aparelho utilizado e que no reaja com ela, adicionado, em quantidades
pode alterar significativamente a resoluo, o tempo de iguais, na soluo problema e na soluo padro. O padro
reteno e as retenes relativas, em relao aos valores interno no deve reagir com a amostra; deve ser estvel
descritos no mtodo. Este fenmeno pode ser causado pela e no conter impurezas cujo tempo de reteno seja
existncia de um volume morto excessivo entre o topo da similar ao tempo de reteno da amostra. A concentrao
coluna e o ponto de encontro dos dois eluentes. da substncia em anlise determinada por comparao
da relao das reas ou alturas dos picos da substncia
Cromatografia em fase gasosa a examinar e do padro interno na soluo problema e
a razo das reas ou altura dos picos da substncia em
Fase estacionria: anlise e do padro interno na soluo padro.
comprimento da coluna: 70 por cento, Mtodo da normalizao. O teor percentual de um ou
dimetro interno da coluna: 50 por cento, mais componentes da amostra determinado calculando
a percentagem que representa a rea desse(s) pico(s) em
granulometria: reduo mxima de 50 por cento, no relao rea total dos picos, excluindo os picos devidos
sendo permitido qualquer aumento. aos solventes e reagentes eventualmente adicionados e os
espessura da pelcula: 50 por cento a +100 por cento. picos abaixo do limite de excluso.
Dbito: 50 por cento. Mtodo da funo de calibrao. A relao entre o sinal
y, medido ou calculado, e a quantidade (concentrao,
Temperatura: 10 por cento. massa, etc.) de substncia determinada e a funo de
Volume de injeco: pode ser diminudo, desde que a calibrao calculada. A funo recproca permite, ento,
deteco e a repetibilidade sejam satisfatrias. calcular os resultados analticos a partir do sinal medido ou
calculado da substncia a analisar.
Cromatografia em fase supercrtica
Para os doseamentos e determinao quantitativa dos
Composio da fase mvel: no caso de colunas de
enchimento, a proporo do solvente minoritrio pode componentes, o mtodo descrito na monografia pode
ser ajustada entre 30 por cento em valor relativo e 2 recorrer ao mtodo do padro externo, do padro interno
por cento em valor absoluto (pode utilizar-se o valor mais ou da calibrao. A normalizao no normalmente
elevado). No caso de colunas capilares no permitido utilizada. Para os ensaios das substncias aparentadas,
qualquer ajuste. os procedimentos normalmente aplicados so o mtodo
do padro externo, com uma nica soluo padro, ou a
Comprimento de onda de deteco: no permitido normalizao; contudo, se for utilizada uma diluio da
qualquer ajuste. soluo problema como base de comparao em qualquer
Fase estacionria: destes procedimentos, necessrio que a resposta das
substncias aparentadas seja similar da prpria substncia
comprimento da coluna: 70 por cento, (factor de resposta de 0,8 a 1,2); se assim no for, o texto
dimetro interno da coluna: 25 por cento (colunas de especifica os factores de correco a aplicar.
enchimento), 50 por cento (colunas capilares), O factor de resposta uma grandeza relativa, definida como
granulometria: reduo mxima de 50 por cento, a relao entre a resposta de uma substncia e outra de
no sendo permitido qualquer aumento (colunas de massa igual, analisadas nas condies prescritas.
enchimento).
Quando num ensaio de substncias aparentadas est prescrita
Dbito: 50 por cento. a soma das impurezas ou a quantificao de uma impureza,

2.2.47. Electroforese capilar
importante definir um limite apropriado e condies do fluxo electro-osmtico e as suas velocidades sero maiores
adequadas para a integrao das reas dos picos. O limite de do que a velocidade electro-osmtica. Nas condies em que a
excluso, ou seja, a rea limite abaixo da qual os picos no velocidade electro-osmtica elevada em relao velocidade
so tomados em conta para os clculos, geralmente de electrofortica dos solutos, os caties e os anies podem ser
0,05 por cento. O limite de registo do sistema deve ento ser separados numa nica operao.
ajustado para, pelo menos, metade do limite de excluso. A
integrao da rea dos picos devidos s impurezas, quando no O tempo t que o soluto demora a percorrer a distncia l que
2. Mtodos
Analticos
esto devidamente separados do pico principal, efectua-se, de separa o ponto de injeco do capilar do ponto de deteco
preferncia, por extrapolao vale a vale (tangencial skin). (comprimento eficaz do capilar) dado pela expresso:
Os picos devidos ao(s) solvente(s) utilizado(s) para a dissoluo
da amostra no so tidos em conta para os clculos.
2.2.47. ELECTROFORESE CAPILAR

Em regra, os capilares de slica fundida no revestidos tm
PRINCPIOS GERAIS carga negativa em pH superior a 3 devido presena dos
grupos silanol sobre a parede interna. Consequentemente, o
A electroforese capilar um mtodo fsico de anlise que se fluxo de electro-osmose dirigido do nodo para o ctodo.
baseia na migrao no interior de um capilar, sob o efeito
de um campo elctrico contnuo, de substncias carregadas Para uma reprodutibilidade satisfatria da velocidade
dissolvidas numa soluo de electrlitos. de migrao dos solutos, o fluxo de electro-osmose
permanece constante de uma anlise para a outra. Em
A velocidade de migrao de um composto, sob o efeito de certas aplicaes pode ser necessrio reduzir ou suprimir o
um campo elctrico de intensidade E, determinada pela fluxo de electro-osmose, modificando a parede interna do
mobilidade electrofortica deste composto e pela mobilidade capilar ou modificando a concentrao, a composio e/ou
electro-osmtica do tampo contido dentro do capilar. A o pH da soluo tampo.
mobilidade electrofortica ep de um soluto depende das suas
caractersticas prprias (carga elctrica, tamanho e forma Uma vez introduzida a amostra no capilar, os diferentes
moleculares) e das do tampo no qual se opera a migrao ies que a compem migram no seio do meio (electrlito)
(natureza e fora inica do electrlito, pH, viscosidade, na forma de zonas (bandas) independentes, em funo da
aditivos). A velocidade de migrao electrofortica vep de um sua mobilidade electrofortica. A disperso das zonas, que
soluto, assumindo a forma esfrica, dada pela equao o alargamento de cada banda de soluto, resultado de
diferentes fenmenos. Nas condies ideais, o nico factor
de alargamento da banda do soluto a difuso molecular do
soluto ao longo do capilar (difuso longitudinal). A eficcia
q = carga efectiva do soluto, desta banda, expressa pelo nmero de pratos tericos N,
ento dada por:
= viscosidade da soluo de electrlitos,
r = raio de Stoke do soluto,
V = tenso aplicada,
L = comprimento total do capilar. D = coeficiente de difuso molecular do soluto no tampo.

Quando um campo elctrico aplicado nas extremidades de Na prtica, outros fenmenos podem muitas vezes afectar
um capilar cheio de tampo, induz no capilar a criao de um significativamente a disperso das bandas, nomeadamente
fluxo bruto de solvente chamado fluxo de electro-osmose. A a dissipao de calor, a adsoro da amostra na parede do
velocidade do fluxo de electro-osmose funo da mobilidade capilar, as diferenas de condutividade entre a amostra e o
electro-osmtica eo, que depende da densidade das cargas na
tampo, o comprimento do capilar ocupado pela amostra
parede interna do capilar e das caractersticas do tampo. A
injectada, o tamanho da clula de deteco e uma diferena
velocidade electro-osmtica dada pela expresso:
de nvel entre os reservatrios de tampo.
A separao de duas bandas (expressa pela resoluo Rs)
pode ser obtida modificando a mobilidade electrofortica
das espcies correspondentes, a mobilidade electro-osmtica
= constante dielctrica do tampo,
induzida no capilar e a eficcia associada a cada uma das
= potencial zeta da superfcie do capilar. bandas, segundo a expresso:
A velocidade de migrao V do soluto est descrita pela
expresso:
v = vep + veo
A mobilidade electrofortica e a mobilidade electro-osmtica
podem actuar no mesmo sentido ou em sentidos apostos,
de acordo com a carga do soluto. Em electroforese capilar
normal, os anies migraro em sentido contrrio ao fluxo
electro-osmtico e as suas velocidades sero menores do que
a velocidade electro-osmtica. Os caties migraro no sentido

APARELHAGEM das substncias que apresentam tendncia de adsoro

nas paredes de slica fundida, podem utilizar-se capilares
Um instrumento de electroforese capilar compreende: revestidos.
um gerador de corrente contnua de alta tenso regulvel, A electroforese capilar de zona permite analisar tanto
as molculas de pequeno tamanho (M < 2000) como as
dois reservatrios de tampo, instalados ao mesmo r
de grande tamanho (2000 < M < 100 000). Devido sua
nvel,contendo a soluo andica e a soluo catdica r
2. Mtodos
grande eficcia, permite a separao de molculas que
Analticos
prescritas, apresentem pequenas diferenas na relao carga/massa.
dois elctrodos (ctodo e nodo) imersos nos reservatrios Adicionando selectores quirais ao tampo de separao,
de tampo e conectados fonte de corrente, pode igualmente ser utilizada na separao de compostos
quirais.
um capilar de separao (geralmente de slica fundida)
que para certos tipos de deteco comporta uma janela
ptica alinhada com o detector; as extremidades do capilar Optimizao
imersas nos reservatrios de tampo; o capilar cheio com A optimizao da separao um processo complexo onde
a soluo prescrita na monografia, podem intervir muitos factores. Os principais parmetros
um sistema de injeco apropriado, a considerar no desenvolvimento de uma separao
relacionam-se com a instrumentao e a soluo de
um detector capaz de avaliar as quantidades de electrlitos.
constituintes que atravessam um segmento do capilar de
separao em determinado tempo; os mtodos de deteco
mais comuns so a espectrofotometria de absoro (UV PARMETROS INSTRUMENTAIS
e visvel) ou a fluorimetria; contudo, a condutimetria, a
amperometria ou a espectrometria de massa podem ser Tenso. Para optimizar a tenso aplicada e a temperatura da
utilizados para certas aplicaes especficas; a deteco coluna utilizada uma curva da produo de calor por efeito
indirecta igualmente uma opo possvel para os de Joule. O tempo de separao inversamente proporcional
compostos no fluorescentes e que no absorvam no UV, tenso aplicada. Contudo, a aplicao de uma tenso muito
elevada pode originar a produo excessiva de calor que induz
um sistema termosttico capaz de manter a temperatura
a apario de gradientes de temperatura e, por consequncia,
constante no interior do capilar; o emprego de tal sistema
de gradientes de viscosidade no seio do tampo contido no
recomendado para obter uma boa reprodutibilidade de
capilar. Este efeito traduz-se por um alargamento das bandas
separao,
e uma perda de resoluo.
um registador e um integrador apropriados ou um
Polaridade. A polaridade dos elctrodos pode ser a normal
computador.
(nodo entrada e ctodo sada); neste caso o fluxo
O processo de injeco escolhido e a sua automatizao electro-osmtico dirigido para o ctodo. Se a polaridade
so os factores crticos para a preciso das anlises dos elctrodos est invertida, o fluxo electro-osmtico est
quantitativas. Os diferentes processos utilizados so a dirigido da sada para a entrada e apenas passam pela sada as
injeco, por gravidade, a injeco sob presso ou a presso espcies com carga cuja mobilidade electrofortica superior
reduzida e a injeco electrocintica; nos casos da injeco ao fluxo electro-osmtico.
electrocintica, os diferentes constituintes so introduzidos
Temperatura. A temperatura actua principalmente na
no capilar em quantidade varivel segundo a mobilidade
viscosidade e na condutividade elctrica do tampo e, por
electrofortica que origina uma certa discriminao.
isso, na velocidade de migrao. Em certos casos, o aumento
A monografia da substncia considerada especfica as da temperatura no capilar pode originar uma modificao
condies operatrias a utilizar: tipo de capilar, solues estrutural de algumas protenas, alterando o tempo de
tampo, mtodo de pr-acondicionamento, soluo da migrao e a eficcia de separao.
amostra, condies de migrao. A soluo de electrlitos
Capilar. As dimenses do capilar (comprimento e dimetro
filtrada para eliminar as partculas, desgasificada para evitar
interno) exercem influncia no tempo de anlise, na eficcia
a formao de bolhas que possam interferir na deteco
de separao e na capacidade do capilar. O aumento do
ou na interrupo do contacto elctrico no capilar durante
comprimento eficaz e total pode originar uma diminuio
a separao. Deve ser desenvolvido um procedimento de
da intensidade do campo elctrico (a tenso constante) e por
lavagem rigoroso para cada processo analtico, a fim de
conseguinte um acrscimo do tempo de migrao. Para um
assegurar a obteno de tempos de migrao reprodutveis
tampo e um campo elctrico dados, a dissipao de calor
para os solutos.
e ainda o alargamento das bandas dependem do dimetro
interno do capilar. Este afecta tambm o limite de deteco
ELECTROFORESE CAPILAR DE ZONA que igualmente funo do volume da amostra injectada e
do sistema de deteco usado.
Princpio Como a adsoro dos componentes da amostra na parede
Em electroforese capilar de zona a anlise efectua-se num do capilar limita a eficcia, convm considerar os diferentes
capilar contendo apenas o tampo, sem meio anti- processos para evitar este tipo de interaces durante o
-convectivo. A separao dos constituintes da amostra desenvolvimento de um mtodo de separao. No caso
resulta do facto de migrarem a velocidades diferentes, particular das protenas, tm sido desenvolvidas vrias
em bandas discretas. A velocidade de migrao de cada estratgias de modo a evitar a adsoro na parede. Algumas
banda depende da mobilidade electrofortica do soluto destas estratgias (uso de pH extremos, adio ao tampo de
mas tambm do fluxo de electro-osmose no capilar (ver substncias carregadas positivamente que sero adsorvidas
Princpios gerais). Para melhorar a eficcia de separao preferencialmente) permitem prevenir a adsoro por

simples modificao do tampo. Outras consistem no ELECTROFORESE CAPILAR EM GEL

tratamento da parede interna do capilar com um polmero
que revista a slica por ligao covalente, suprimindo assim Princpio
todas as possibilidades de interaco entre as protenas e a Na electroforese capilar em gel, a separao efectua-se no
parede carregada negativamente. Existem para este propsito interior do capilar cheio de um gel que se comporta como
capilares prontos a usar, revestidos com polmeros neutro- um tamis molecular. As molculas com relao carga/massa
-hidrfilos, catinicos e aninicos. prximas so separadas em funo do tamanho, porque
2. Mtodos
Analticos
as molculas pequenas se deslocam mais facilmente no

seio do gel e migram mais rapidamente que as molculas
PARMETROS ASSOCIADOS SOLUO maiores. A electroforese capilar em gel permite separaes
DE ELECTRLITOS de acordo com a massa molecular de vrias macromolculas
biolgicas (por exemplo, protenas e fragmentos de ADN) que
Natureza e concentrao do tampo. Os tampes para frequentemente possuem relaes carga/massa semelhantes.
electroforese capilar possuem um poder tampo apropriado
no intervalo de pH escolhido, assim como uma fraca Caractersticas dos geles
mobilidade (para limitar a gerao de corrente). Os geles utilizados so de dois tipos: os geles de revestimento
importante adaptar a mobilidade dos ies do tampo dos permanente e os geles de revestimento dinmico. Os geles
solutos, na medida do possvel, para limitar a distoro das de revestimento permanente, tais como a poliacrilamida
bandas. reticulada, so preparados dentro do capilar, por condensao
dos monmeros. Em geral, ligam-se parede de slica
Do mesmo modo, a natureza do solvente utilizado para fundida e no podem ser extrados do capilar sem a
a preparao das amostras importante por permitir a destruio deste. Se os geles so utilizados para uma anlise
focalizao deste ltimo no interior do capilar e assim proteica em condies redutoras, o tampo de separao
melhorar a eficcia de separao e de deteco. contm habitualmente o dodecilsulfato de sdio e as
amostras so desnaturadas antes da injeco aquecendo uma
O aumento da concentrao do tampo (a um dado pH) mistura de dodecilsulfato de sdio e de 2-mercaptoetanol
origina uma diminuio do fluxo de electro-osmose e da ou de ditiotreitol. possvel optimizar a separao nos
velocidade dos solutos. geles reticulados modificando o tampo de separao (como
indicado na seco sobre electroforese capilar de zona) e
pH do tampo. O pH do tampo pode influir na separao controlando a porosidade do gel durante a sua preparao.
modificando a carga da espcie considerada ou dos aditivos, Nos casos dos geles de poliacrilamida reticulada, a porosidade
modificando o fluxo de electro-osmose. No caso das protenas pode ser modificada alterando a concentrao de acrilamida,
e dos peptidos, a diminuio do pH do tampo at um valor e/ou a proporo do agente de reticulao. Regra geral, a
inferior ao ponto isoelctrico (pI) modifica a carga efectiva do diminuio de porosidade do gel conduz diminuio da
soluto de negativa para positiva. Um aumento do valor do pH mobilidade dos solutos. A rigidez deste tipo de geles exclui
do tampo traduz-se geralmente por um aumento do fluxo de todo o modo de injeco excepto o electrocintico.
electro-osmose.
Os geles de revestimento dinmico so constitudos por
Solventes orgnicos. Em certos casos, modificadores polmeros hidrfilos (poliacrilamida linear, derivados da
orgnicos (metanol, acetonitrilo, etc.) so adicionados ao celulose, dextrano, etc.) podendo ser dissolvidos nos tampes
tampo aquoso para aumentar a solubilidade do soluto ou de separao aquosos para dar um meio de separao que actua
de outros aditivos e/ou para afectar o grau de ionizao igualmente como tamis molecular. Estes meios de separao
dos constituintes da amostra. A adio ao tampo de so mais fceis de preparar que os polmeros reticulados.
modificadores orgnicos origina geralmente uma diminuio Podem ser preparados num frasco e depois introduzidos por
presso num capilar revestido (sem fluxo de electro-osmose).
de fluxo electro-osmtico.
A renovao do gel antes de cada injeco melhora geralmente
Aditivos de separao quiral. Para a separao de ismeros a reprodutibilidade da separao. possvel aumentar a
pticos, adicionado um selector quiral ao tampo de porosidade dos geles utilizando polmeros de massa molecular
anlise. Os selectores quirais mais utilizados so as mais elevada (concentrao de polmero constante) ou
ciclodextrinas, mas os teres-coroa, certos polissacaridos e reduzindo a concentrao de polmero (massa molecular
mesmo algumas protenas so igualmente usados em certos constante). Para o mesmo tampo, uma diminuio da
porosidade do gel traduz-se por uma diminuio da mobilidade
casos. Como o reconhecimento quiral assenta nas diferenas
do soluto. Como a dissoluo dos polmeros num tampo
de comportamento de interaco entre o selector quiral e produz solues de baixa viscosidade, a injeco pode ser
cada enantimero, a resoluo obtida para os compostos hidrodinmica ou electrocintica.
quirais depende fortemente do tipo de selector utilizado.
til, para o desenvolvimento de uma separao, testar
ciclodextrinas com tamanhos de cavidade diferentes (, ELECTROFORESE CAPILAR DE FOCALIZAO
ou -ciclodextrinas), ou de ciclodextrinas modificadas por ISOELCTRICA
meio de grupos neutros (metilo, etilo, hidroxialquilo, etc.)
ou ionizveis (aminometilo, carboximetilo, sulfobutilter, Princpio
etc.). Quando se utilizam ciclodextrinas modificadas, tem-se
em considerao as variaes do lote no grau de substituio Na focalizao isoelctrica, as molculas so submetidas a um
das ciclodextrinas porque este influencia a selectividade. campo elctrico num gradiente de pH gerado por anflitos
Outros parmetros que afectam a resoluo das separaes que cobrem um grande intervalo de pI (cidos poliaminocar-
quirais so a concentrao do selector quiral, a composio boxlicos), dissolvidos num tampo de separao, e migram
e o pH do tampo e a temperatura. O emprego de aditivos enquanto esto carregadas.
orgnicos, tais como o metanol ou a ureia, pode igualmente As trs etapas fundamentais da focalizao isoelctrica so o
ter influncia na resoluo. carregamento, a focalizao e a mobilizao.

Carregamento. Dois mtodos podem ser utilizados: anflitos que cubram um largo intervalo de pH para estimar
o ponto isoelctrico e anflitos que cubram um intervalo
carregamento em um tempo: a amostra misturada aos
de pH mais estreito para aumentar a exactido. A calibrao
anflitos e introduzida no capilar por presso ou presso
pode ser efectuada por correlao dos tempos de migrao e
reduzida,
do ponto isoelctrico de uma srie de marcadores proteicos.
carregamento sequencial: introduzir no capilar um
Durante a etapa de focalizao, possvel impedir a
tampo inicial, os anflitos, a amostra misturada nos
2. Mtodos
precipitao das protenas no ponto isoelctrico, se
Analticos
anflitos, novamente os anflitos e, por fim, o tampo
necessrio, juntando ao tampo substncias tais como o
final. O volume da amostra pequeno para no modificar o
gradiente de pH. glicerol, tensioactivos, ureia, ou os tampes zwiterinicos.
Contudo, dependendo da concentrao, a ureia desnatura as
Focalizao. Quando a tenso aplicada, os anflitos migram protenas.
para o ctodo ou para o nodo, de acordo com a sua carga
formal, criando assim um gradiente de pH do nodo (menor
pH) para o ctodo (maior pH). Durante esta etapa, os compo- CROMATOGRAFIA ELECTROCINTICA MICELAR (CECM)
nentes a separar migram at ao nvel do gradiente de pH
correspondente ao seu ponto isoelctrico (pI) e a intensidade Princpio
da corrente desce para valores muito baixos.
Na cromatografia electrocintica micelar, a anlise
Mobilizao. Se a deteco necessitar desta etapa, use um dos efectua-se numa soluo de electrlitos contendo um agente
mtodos seguintes: tensioactivo numa concentrao superior concentrao
primeiro mtodo: a mobilizao realizada durante a etapa micelar crtica (CMC). Em funo do coeficiente de partilha
da focalizao, sob o efeito do fluxo de electro-osmose; este do soluto, as molculas repartem-se entre o tampo aquoso
deve ser suficientemente fraco para permitir a focalizao e a fase pseudo-estacionria composta por micelas. Esta
dos componentes, tcnica pode ser considerada como hbrida da electroforese
e da cromatografia. Permite separar os solutos neutros e os
segundo mtodo: a mobilizao obtida por aplicao de carregados mantendo a eficcia, a velocidade e a preciso
presso positiva aps a etapa da focalizao, instrumental que caracterizam a electroforese capilar. Um
terceiro mtodo: a mobilizao realizada aps a etapa de dos tensioactivos mais utilizados em CECM o tensioactivo
focalizao, por adio de sais no reservatrio catdico ou aninico dodecilsulfato de sdio, mas outros tensioactivos so
andico (segundo a direco da mobilizao escolhida), de igualmente usados, por exemplo os tensioactivos catinicos
modo a alterar o pH no capilar quando a tenso aplicada. tais como o cetiltrimetilamnio.
Esta modificao de pH origina a mobilizao das protenas O mecanismo de separao o seguinte: a pH neutro ou
e dos anflitos para o reservatrio onde foram adicionados alcalino, gerado um forte fluxo de electro-osmose e conduz
os sais e a passagem pelo detector. para o ctodo os ies do tampo de separao. Em presena
O grau de separao obtido, expresso por pI, depende de dodecilsulfato de sdio (tensioactivo), formam-se micelas
do gradiente de pH (dpH/dx), do nmero de anflitos de aninicas cuja migrao electrofortica se efectua em sentido
pI diferentes, do coeficiente de difuso molecular D, da inverso, para o nodo. Como resultado, a velocidade global
intensidade E do campo elctrico e da influncia do pH na de migrao das micelas muito baixa em relao ao fluxo
mobilidade electrofortica da substncia (d/dpH): bruto de deslocao da soluo de electrlitos. Nos casos dos
solutos neutros, em que a substncia pode partilhar-se entre
a fase micelar e o tampo aquoso e no possui mobilidade
electrofortica, a velocidade de migrao depende apenas do
coeficiente de partilha entre a fase micelar e o tampo aquoso;
no electroforegrama, os picos correspondentes a cada soluto
Optimizao no carregado situam-se sempre entre o pico do marcador
Os principais parmetros a considerar no desenvolvimento de de fluxo de electro-osmose e o pico da fase micelar (chama-
uma separao so os seguintes: -se janela de separao ao tempo compreendido entre estes
dois picos). No caso dos solutos carregados electricamente,
Tenso. Os campos utilizados na etapa de focalizao so a velocidade de migrao depende do coeficiente de partilha
muito elevados (da ordem de 300 V/cm a 1000 V/cm). entre a fase micelar e o tampo aquoso e da mobilidade
Capilaridade. O fluxo de electro-osmose reduzido ou electrofortica do soluto na ausncia de micelas.
suprimido, segundo a estratgia de mobilizao adoptada Na CECM dos solutos neutros ou fracamente ionizados, o
(ver atrs). Os capilares revestidos tendem a reduzir o fluxo mecanismo essencialmente cromatogrfico. ento possvel
de electro-osmose. descrever a migrao do soluto e a resoluo em termos do
Solues. O reservatrio andico cheio de soluo de factor de capacidade k do soluto, tambm referido como
pH inferior ao pI do anflito mais cido e o reservatrio coeficiente de distribuio mssica (Dm), o qual a relao
catdico de soluo de pH superior ao pI do anflito mais do nmero de moles do soluto contidas nas micelas e na fase
bsico. frequentemente usado o cido fosfrico para o mvel. No caso de um composto neutro, k dado pela frmula:
nodo e o hidrxido de sdio para o ctodo.
A adio soluo de anflitos de um polmero como
a metilcelulose tende a aumentar a viscosidade,
suprimindo eventuais foras convectivas e o fluxo de
electro-osmose. tr = tempo de migrao do soluto,
Existem no comrcio anflitos que cobrem intervalos de pH to = tempo de anlise do soluto no retido (determinado por
muito diversos que so possveis de misturar, se necessrio, injeco de um marcador de fluxo de electro-osmose, como o
para obter uma gama de valores de pH pretendida. Utilize metanol, que nunca penetra nas micelas),

tm = tempo de migrao das micelas (medido por injeco de um cromatografia) afecta a resoluo modificando a selectividade
marcador micelar, como o vermelho de Sudo III, que migra de separao. Existe uma relao de proporcionalidade
sempre na forma absorvida nas micelas), directa entre a concentrao do tensioactivo na fase mvel e
K = coeficiente de partilha do soluto, o valor de log k de um composto neutro. Como em CECM, a
resoluo atinge um mximo quando k se aproxima do valor
Vs = volume da fase micelar, ( ) e qualquer modificao do teor em tensioactivo
na fase mvel repercute-se na resoluo obtida.
2. Mtodos
Analticos
Vm = volume da fase mvel.

Do mesmo modo, a resoluo Rs entre dois solutos tendo pH do tampo. Embora o pH no influencie o coeficiente de
os tempos de migrao aproximados dada por: partilha dos solutos no ionizados, pode modificar o fluxo de
electro-osmose nos capilares no revestidos. Um abaixamento
do pH do tampo origina uma diminuio do fluxo de electro-
-osmose e por isso aumenta a resoluo para os solutos neutros
e um alongamento do tempo de anlise.
Solventes orgnicos. Para melhorar a separao dos
N = nmero de pratos tericos para um dos solutos, componentes hidrfobos em CECM, podem adicionar-se
modificadores orgnicos (metanol, propanol, acetonitrilo,
= selectividade,
etc.) soluo de electrlitos. Esta adio origina geralmente
ka e kb =factores de reteno respectivos dos dois solutos (kb > ka). uma diminuio do tempo de migrao e da selectividade
da separao. Como afecta a concentrao micelar crtica,
As equaes similares, mas no idnticas, do valores de k respeita-se um equilbrio entre o teor em modificador
e Rs para os solutos carregados electricamente. orgnico e em agente tensioactivo, sob pena de inibir ou
alterar a micelizao e, por conseguinte, impedir a formao
Optimizao de micelas e, portanto, a partilha. A dissociao das micelas
em presena de um grande teor em solvente orgnico no
Os principais parmetros a considerar no desenvolvimento
de uma separao por CECM dizem respeito instrumentao significa necessariamente que a separao seja impossvel:
e soluo de electrlitos. em certos casos, a interaco hidrfoba entre o tensioactivo
inico monmero e os solutos neutros conduz formao
de complexos solvofbicos que podem ser separados por
PARMETROS INSTRUMENTAIS electroforese.
Aditivos de separao quiral. Para a separao de
Tenso. O tempo de separao inversamente proporcional
ismeros pticos utilizando a CECM, um selector quiral
tenso aplicada. Contudo, a utilizao de uma tenso
muito elevada pode originar uma produo excessiva de introduzido no sistema micelar, seja por ligao
calor induzindo a apario de gradientes de temperatura e covalente com o agente tensioactivo, seja por adio ao
de viscosidade no seio do tampo, do centro do capilar para a electrlito de separao. As micelas possuindo grupos com
periferia. Este efeito pode ser significativo no caso de tampes propriedades de discriminao quiral so, nomeadamente,
com condutividade elevada assim como aqueles que contm os sais de N-dodecanoil-L-amino-cidos, sais biliares. etc.
micelas. Se a dissipao trmica insuficiente, traduz-se por A resoluo quiral pode igualmente ser obtida por adio
um alargamento das bandas e uma perda de resoluo. de discriminantes quirais, tais como as ciclodextrinas, s
solues de electrlitos contendo os agentes tensioactivos
Temperatura. As variaes de temperatura do capilar afectam
aquirais micelizados.
o coeficiente de partilha do soluto entre o tampo e as
micelas, a concentrao micelar crtica e a viscosidade do Outros aditivos. Existem muitas estratgias para modificar
tampo. Estes parmetros actuam no tempo de migrao a selectividade por adio de substncias qumicas ao
dos solutos. O emprego de um bom sistema de refrigerao tampo. O emprego de diferentes tipos de ciclodextrinas pode
melhora a reprodutibilidade do tempo de migrao. igualmente permitir a reduo de interaces micelas-
Capilar. Como na electroforese em soluo livre, as -solutos hidrfobos e ainda aumentar a selectividade para
dimenses do capilar (comprimento e dimetro interno) este tipo de substncias.
exercem influncia nos tempos de anlise e eficcia de
Outra estratgia para aumentar a selectividade de separao
separao.
em CECM a adio de substncias capazes de modificar
O aumento do comprimento eficaz e total pode originar as interaces soluto-micela por adsoro nesta ltima.
uma diminuio da intensidade do campo elctrico (tenso Os aditivos podem ser um segundo tensioactivo (inico ou
constante) e por consequncia um aumento do tempo no) que origina micelas mistas ou caties metlicos que se
de migrao e melhoramento da eficcia de separao. O dissolvem na micela e originam complexos de coordenao
dimetro interno condiciona a dissipao do calor (para um com os solutos.
tampo e um campo elctrico dados) e, assim, a largura das
bandas.
QUANTIFICAO
PARMETROS ASSOCIADOS SOLUO
A rea dos picos dividida pelo tempo de migrao
DE ELECTRLITOS
correspondente, para obter a rea corrigida e poder assim:
Natureza e concentrao do agente tensioactivo. A natureza compensar o desvio do tempo de migrao de uma anlise
do agente tensioactivo utilizado (como a fase estacionria em para outra e assim reduzir a variabilidade da resposta,

2.2.48. Espectrometria de raman
compensar as diferenas de resposta entre constituintes da Factor de simetria

amostra com velocidades de migrao diferentes.
O factor de simetria As de um pico pode ser calculado
Quando se usa um padro interno, deve garantir-se que usando a expresso:
nenhum dos picos da amostra mascarado pelo pico do As = wh/2d
padro interno.
wh = largura do pico no vigsimo da altura,
2. Mtodos
Analticos
Clculos d = distncia entre a perpendicular no mximo do pico e o bordo de
A partir dos valores obtidos, calcule o teor do componente ou entrada do pico no vigsimo da altura.
componentes a analisar. Se a monografia o prescreve, calcule Os testes de repetibilidade das reas (desvio padro das
o teor por cento de um ou vrios dos constituintes da reas ou relaes rea/tempo de migrao) e os tempos
amostra determinando a percentagem representada pela de migrao (desvio padro dos tempos de migrao) so
rea corrigida do(s) pico(s) correspondente(s) em relao efectuados como parmetros de conformidade do sistema.
rea corrigida total de todos os picos, excluindo os devidos A repetibilidade dos tempos de migrao permite verificar
aos solventes ou aos reagentes eventualmente adicionados se o procedimento de lavagem dos capilares foi adequado.
(mtodo de normalizao). A utilizao de um sistema de Em electroforese capilar, um outro mtodo igualmente
integrao automtica (integrador ou sistema informtico) utilizado para evitar defeitos de repetibilidade dos tempos
recomendada. de migrao: o emprego do tempo de migrao relativo em
relao a um padro interno. Um teste de verificao da
relao sinal/rudo, efectuado numa preparao padro, ou a
CONFORMIDADE DO SISTEMA determinao do limite de quantificao podem igualmente
ser utilizados na determinao das substncias aparentadas.
Para verificar o comportamento do sistema, utilize os
parmetros de conformidade cuja escolha depende do tipo de Relao sinal/rudo
electroforese capilar utilizada Estes parmetros so: o factor
de capacidade k (apenas em cromatografia electrocintica O limite de deteco e o limite de quantificao
micelar), o nmero aparente de pratos tericos N; o factor de correspondem, respectivamente, a uma relao sinal/rudo
simetria As e a resoluo Rs. As seces precedentes contm de 3 e 10. A relao sinal/rudo S/R calculada usando a
as expresses tericas dos parmetros N e Rs, mas outras expresso:
equaes mais prticas, dadas a seguir, permitem calcular S/R = 2H/h
estes parmetros a partir dos electroforegramas.
H = altura do pico correspondente ao composto considerado do
electroforegrama obtido com a soluo padro indicada, medida
Nmero aparente de pratos tericos
entre o mximo do pico e a linha de base extrapolada do sinal
O nmero aparente de pratos tericos N pode ser calculado observado numa distncia igual a 20 vezes a largura do pico no
usando a expresso: meio da altura,
h = amplitude do rudo de fundo de um electroforegrama obtido
N 5,54 (tr /h)2 aps injeco de um branco, observada numa distncia
igual a 20 vezes a largura no meio da altura do pico do
electroforegrama obtido com a soluo padro indicada e, se
tr = tempo de migrao ou distncia ao longo da linha de base,
possvel, centrada no local onde este pico ser observado.
entre o ponto de injeco e a perpendicular no mximo do pico
correspondente ao componente considerado,
r= largura do pico no meio da altura. 2.2.48. ESPECTROMETRIA DE RAMAN
A espectrometria de Raman um mtodo de anlise baseado
Resoluo
na difuso da luz atravs de uma substncia submetida a uma
A resoluo Rs entre dois picos similares pode ser calculada radiao luminosa monocromtica de grande intensidade
usando a expresso: (geralmente fornecida por uma fonte laser) e na anlise
dos deslocamentos de frequncia no espectro de difuso
(princpio da difuso luminosa inelstica).
A espectrometria de Raman complementar da espectrometria
no infravermelho na medida em que as duas tcnicas assentam
no estudo das vibraes moleculares verificadas no seio de
um material; por outro lado, diferem na sensibilidade relativa
tra e trb = tempos de migrao ou distncias ao longo da linha de dos diferentes grupos funcionais. A espectrometria de Raman
base entre o ponto de injeco e a perpendicular nos uma tcnica particularmente sensvel para as ligaes no
mximos dos picos adjacentes, polares (por exemplo ligaes C C simples ou mltiplas), mas
menos sensvel para as ligaes polares. A gua, que possui
wha e whb = largura dos picos a meia altura.
um espectro de absoro intenso no infravermelho, um
mau difusor Raman e constitui, por esse motivo, um solvente
Nos casos apropriados, a resoluo calculada pela medida
adequado para esta tcnica.
da altura ht do ponto mais baixo da curva entre dois picos
parcialmente separados numa preparao padro e da altura Equipamento. Os espectrmetros utilizados para registar
hp do mais pequeno dos dois picos e calculando a relao espectros de Raman so tipicamente constitudos pelos
pico/vale p/v = hp/hv. elementos seguintes:

2.2.48. Espectrometria de raman
uma fonte de luz monocromtica, geralmente laser, cujo A lei de Lambert-Beer no vlida para a espectrometria
comprimento de onda pode situar-se no ultravioleta, no Raman, a no ser que a intensidade do sinal Raman seja
visvel ou no infravermelho prximo, directamente proporcional concentrao da substncia
na origem da difuso Raman. Como para as outras tcnicas
elementos pticos apropriados (lentes, espelhos ou espectroscpicas, pode efectuar-se uma determinao
elementos de fibras pticas) que permitem dirigir a luz quantitativa recorrendo a quantidades ou concentraes
incidente e captar a luz difundida pela amostra, conhecidas de substncias de referncia. Devido baixa
2. Mtodos
Analticos
um dispositivo ptico (monocromador ou filtro) resoluo espacial da tcnica, necessrio um cuidado

responsvel pela transmisso ao detector da radiao de particular de forma a assegurar a representatividade dos
difuso Raman, separada em frequncia, interrompendo a padres e das amostras, por exemplo, garantindo que estejam
intensa radiao de difuso que coincide com a frequncia todas no mesmo estado fsico ou utilizando um padro
de incidncia (difuso Rayleigh), interno no caso de amostras lquidas.
um sistema de disperso (monocromador de prisma ou de

rede) combinado com fendas de seleco de comprimento IDENTIFICAO E QUANTIFICAO COM AJUDA
de onda e com um detector (geralmente um tubo DE BIBLIOTECAS DE ESPECTROS E DE MTODOS
fotomultiplicador),
ESTATISTCOS DE CLASSIFICAO E CALIBRAO
ou
um sistema de disperso (monocromador de prisma ou de Verificao da eficcia dos instrumentos. Use o aparelho
rede) combinado com um detector multicanal (geralmente seguindo as instrues do fabricante e efectue a intervalos
um detector de transferncia de carga [CCD]), regulares as operaes prescritas de calibrao e verificao
da eficcia do sistema, de acordo com a utilizao do
ou aparelho e das amostras em anlise. E conveniente efectuar
um interfermetro munido de um detector que regista a as correces ou tomar as medidas necessrias de modo
radiao de difuso em termos de intensidade e de tempo e a compensar a variabilidade do nmero de onda e da
um dispositivo de tratamento de dados que converte estes intensidade de resposta dos aparelhos, particularmente
dados em funo da frequncia ou do nmero de onda, por quando a espectrometria Raman utilizada com fins
uma transformada de Fourier. quantitativos, ou quando se trata de construir bibliotecas de
espectros de referncia (espectrotecas) com fins de calibrao
ou de classificao (quimiomtrica).
PREPARAO DA AMOSTRA Verificao da escala dos nmeros de onda. Verifique a escala
dos nmeros de onda do deslocamento Raman (normalmente
Os espectros de Raman podem ser registados a partir de expressa em cm1) com a ajuda de um padro apropriado que
slidos, lquidos e gases directamente, em recipientes ou tubos apresente os mximos caractersticos nos nmeros de onda
de vidro, geralmente sem preparao ou diluio prvia. considerados, por exemplo, uma substncia orgnica, uma
+
Uma limitao importante da espectrometria Raman resulta lmpada de Ne ou raios do plasma Ar de um laser de ies de
da eventual presena de impurezas que emitem uma radiao rgon.
de fluorescncia, a qual interfere na deteco do sinal Raman, Quando se efectua a calibrao, necessrio ter em conta a
que muito mais fraco. A fluorescncia pode ser evitada natureza da amostra, quer dizer que se utiliza uma amostra
escolhendo uma fonte de laser de maior comprimento de de calibrao slida para amostras em ensaio slidas e uma
onda, por exemplo no infravermelho prximo, para feixe de amostra de calibrao lquida para amostras em ensaio
excitao. H vrios processos de aumentar a intensidade lquidas. Escolha uma substncia apropriada (por exemplo,
de certos sinais Raman, por exemplo as tcnicas ditas de o indeno, o ciclo-hexano ou o naftaleno) para a qual foram
Ressonncia Raman (RR) e a Difuso Raman Amplificada de estabelecidos com exactido os deslocamentos de nmero de
Superfcie (DRAS). onda. conveniente colocar o indeno num tubo para RMN,
fazer o vazio, selar sob gs inerte e conservar a amostra no
Devido extrema focalizao do feixe laser de excitao,
frigorfico e ao abrigo da luz para evitar a sua degradao.
o espectro registado normalmente a partir de amostras
de baixo volume, da ordem do microlitro. A no ser que
se aumente o volume, necessrio ter em conta a falta QUADRO 22 Deslocamento de nmero de onda (e tolerncias)
de homogeneidade da amostra, efectuando, por exemplo, do ciclo-hexano, do indeno e do naftaleno.
rotaes da amostra.
Ciclo-hexanoA indenoB naftalenoA
2938,3 (1,5) 3056,4 (1,5)
IDENTIFICAO E QUANTIFICAO 2923,8 (1,5)
COM SUBSTNCIAS DE REFERNCIA 2852,9 (1,5)
1609,7 (1,0) 1576,6 (1,0)
Prepare a amostra e a substncia de referncia da mesma 1444,4 (1,0) 1552,6 (1,0) 1464,5 (1,0)
maneira e registe os espectros nas mesmas condies. Os 1266,4 (1,0) 1205,2 (1,0) 1382,2 (1,0)
mximos do espectro obtido com a amostra correspondem, 1157,6 (1,0) 1147,2 (1,0)
na posio e na intensidade relativa, aos do espectro obtido 1028,3 (1,0) 1018,6 (1,0) 1021,6 (1,0)
com a substncia de referncia (SQR). 801,3 (10) 730,5 (1,0) 763,8 (1,0)
533,9 (1,0) 513,8 (1,0)
Quando os espectros registados no estado slido
apresentarem diferenas quanto posio dos mximos, A Standard guide for Raman shift standards for spectrometric
submeta a amostra e a substncia de referncia a tratamento calibration (American Society for testing and Materials ASTM E
idntico, recristalizando-as ou conferindo-lhes a mesma 1840).
forma, ou proceda como o descrito na monografia e registe B D.A. Carter, W. R. Thompson, C. E. Taylor and J. E. Pemberton,
novamente os espectros. Applied Spectroscopy, 1995, 49 (11), 1561-1576.

2.2.54. Focalizao isoelctrica
Verificao da escala de intensidade da resposta. A apropriado efectuada a 20 0,1C, excepto se existir

intensidade absoluta e a intensidade relativa dos raios Raman indicao contrria na monografia. Determina-se o
dependem de vrios factores: tempo necessrio para a esfera percorrer, na amostra, a
estado de polarizao da luz de excitao, distncia entre as 2 marcas. O resultado vlido quando
a diferena entre 2 leituras consecutivas no superior a
estado de polarizao da ptica de deteco, 1,5 por cento, caso no exista definido limite menor para
intensidade da luz de irradiao, o aparelho usado.
2. Mtodos
Analticos
diferenas de resposta instrumental, Aparelho. O viscosmetro de queda de esfera constitudo
diferenas de focalizao e de geometria da montagem, por um tubo de vidro revestido permitindo um controlo
preciso da temperatura e por 6 esferas de vidro, nquel-ferro
no caso de amostras slidas, diferenas de densidade de ou ao, de diferentes densidades e dimetros. O tubo fixado
compactao. de modo que o eixo fique com uma inclinao de 10 1 em
relao vertical. A distncia do percurso da esfera definida
Os critrios de aceitao adequados dependem da aplicao por 2 anis marcados no tubo.
mas, no dia a dia, na maior parte dos casos, pode aceitar-se uma
variao de 10 por cento nas intensidades relativas das bandas. O aparelho disponvel no mercado fornece tabelas
indicando as constantes, a densidade das esferas e a sua
Construo de uma biblioteca de espectros de referncia. utilizao conveniente, segundo os valores de viscosidade
Registe o espectro de um nmero adequado de substncias esperados.
que foram submetidas a todos os ensaios requeridos (por
exemplo, os prescritos numa monografia) e que reflitam Mtodo. Sem fazer bolhas, encha o tubo do viscosmetro
a variabilidade tipo da substncia a analisar (fabricante, previamente seco com a amostra a uma temperatura de
lote, modificao cristalina, tamanho das partculas, etc.). 20 0,1C. Coloque a esfera apropriada viscosidade do
O conjunto de espectros assim obtidos constitui a base lquido de modo a obter um tempo de queda de, pelo menos,
de dados a partir da qual so definidas as fronteiras de 30 s. Feche o tubo e mantenha o lquido a 20 0,1C
semelhana e/ou os limites quantitativos que podero ser
durante, pelo menos, 15 min. Deixe a esfera percorrer a
utilizados, por exemplo, para identificar ou controlar a
quantidade de substncia gerada no decurso de um processo distncia entre as 2 marcas uma primeira vez sem efectuar
de produo. O nmero de substncias a incluir na base de a leitura. Deixe cair de novo e faa a leitura com um
dados depender da aplicao especfica que se pretende. cronmetro com aproximao ao quinto de segundo desde
A coleco de espectros de uma base de dados pode ser a marca superior marca inferior. Repita esta operao
representada de diversos modos, definidos pela tcnica pelo menos 3 vezes. Calcule a viscosidade dinmica em
matemtica utilizada para a classificao ou quantificao. milipascal. segundos, utilizando a expresso:
A selectividade da base de dados para a identificao k (p1 p2 ) t
inequvoca de uma dada substncia e sua discriminao
de outras substncias que figurem na base de dados um
aspecto que estabelecido no decurso da validao. k = constante, expressa em milmetros quadrados por segundo
conveniente verificar esta selectividade a intervalos regulares, quadrado,
para confirmar a validade da base de dados, especialmente
em caso de modificaes relevantes de uma substncia (por p1 = massa volmica da esfera utilizada, expressa em gramas por
exemplo, mudana de fornecedor ou modificao do processo centmetro cbico,
de produo), ou durante a regulao do espectrmetro p2 = massa volmica da amostra, expressa em gramas por
Raman (por exemplo, para verificar a repetibilidade do
centmetro cbico, obtido multiplicando a sua densidade
nmero de onda e da resposta).
d por 0,9982,
A validao da base de dados s serve para o instrumento com t = tempo de queda da esfera, em segundos.
o qual foi efectuada, ou para um instrumento similar, na
condio que fique demonstrado que a transferncia da base
de dados no afectou a sua validade. 2.2.54. FOCALIZAO ISOELCTRICA
Mtodo. Prepare e examine a amostra seguindo o mesmo
procedimento que foi utilizado para a constituio da PRINCPIOS GERAIS
base de dados. Pode ser calculada uma transformao
matemtica apropriada do espectro Raman para facilitar a
A focalizao isoelctrica (FIE) um mtodo de electroforese
comparao de espectros ou a avaliao quantitativa.
que permite a separao das protenas de acordo com o
A comparao de espectros ou das transformadas espectrais respectivo ponto isoelctrico (pI). A separao feita em
ou a avaliao quantitativa de certas propriedades ou placa de gel de poliacrilamida ou de agarose contendo uma
quantidades na amostra pode requerer a utilizao de mistura de electrlitos anfotricos (anflitos). Sob o efeito
tcnicas apropriadas de calibrao ou de classificao de um campo elctrico, os anflitos migram no gel criando
quimiomtrica ou estatstica.
um gradiente de pH. Em certos casos, utilizam-se geles
de gradiente de pH imobilizado, obtidos por incorporao
de cidos e de bases fracas em zonas especficas do gel,
2.2.49. VISCOSIDADE MTODO DO durante a sua preparao. Quando as protenas depositadas
VISCOSMETRO DE QUEDA DE ESFERA atingem a regio de pH que corresponde ao respectivo ponto
isoelctrico, a sua carga neutralizada e a sua migrao pra.
A determinao da viscosidade dinmica de lquidos De acordo com a mistura de anflitos escolhida possvel
newtonianos usando um viscosmetro de queda de esfera criar gradientes em vrios intervalos de pH.

ASPECTOS TERICOS O gel de FIE pode ser usado num ensaio de identificao,
comparando o perfil de migrao no gel com o de uma prepa-
Quando uma protena se encontra na posio que rao padro apropriada e com as protenas de calibrao
corresponde ao seu ponto isoelctrico, a sua carga nula FIE; pode ser usado num ensaio limite, se a densidade de
e a migrao na matriz do gel cessa por efeito do campo uma banda em FIE comparada subjectivamente densidade
elctrico, sendo, no entanto, possvel o deslocamento por
das bandas que aparecem na preparao padro; pode ainda
difuso. O gradiente de pH fora a protena a permanecer na
2. Mtodos
Analticos
ser usado como ensaio quantitativo, sujeito a validao, se a

posio que corresponde ao seu ponto isoelctrico ficando,
por conseguinte, concentrada. A este efeito de concentrao densidade determinada com auxlio de um densmetro ou
chama-se focalizao. O aumento de potencial elctrico instrumento semelhante para determinao da concentrao
aplicado ou a reduo da quantidade da amostra depositada proteica relativa.
resulta numa melhor separao das bandas. Contudo, o
potencial elctrico aplicado limitado pelo calor gerado que
deve ser dissipado. O emprego de camadas finas de gele e APARELHAGEM
de um sistema eficaz de arrefecimento da placa, controlado
por um banho com circulao e termostatado, evita que o Um aparelho de FIE consta de:
gel aquea e permite uma focalizao fina. A separao um gerador regulvel capaz de fornecer uma corrente
calculada por determinao da diferena mnima de pI (pI),
constante em potencial elctrico, intensidade e potncia,
que necessria para a separao de 2 bandas vizinhas:
em geral, opera-se a um potencial de 2 500 V, que o con-
siderado ptimo para determinadas condies operatrias;
recomendado operar com uma potncia constante que
pode ir at 30 W,
uma tina de FIE de plstico rgido contendo, como suporte
do gel, uma placa de material apropriado e refrigerada,
uma tampa de plstico com os elctrodos de platina que
se pem em contacto com o gel por intermdio de tiras de
papel de largura, comprimento e espessura apropriados,
impregnadas de solues de electrlitos andicos e catdicos.
duas maneiras possveis de melhorar a separao reduzir FOCALIZAO ISOELCTRICA EM GEL

o intervalo de pH ou aumentar a intensidade do campo DE POLIACRILAMIDA: DESCRIO DETALHADA
elctrico. DO PROCEDIMENTO
A resoluo entre as bandas proteicas em gel de FIE
O mtodo descrito a seguir um processo de FIE em gel
preparado com anflitos transportadores pode ser satisfatria.
Pode ainda melhorar-se a resoluo utilizando gradientes de poliacrilamida em camada espessa; salvo indicao em
de pH imobilizados, onde as espcies tampo, anlogas aos contrrio, o que se utiliza na monografia.
anflitos transportadores, se copolimerizam no seio da matriz
de gel. Um gel preparado com anflitos transportadores PREPARAO DOS GELES
permite separar protenas apresentando uma diferena de pI
de 0,02 unidades de pH, enquanto que os gradientes de pH Molde. O molde (ver figura) constitudo por uma placa de
imobilizados permitem separar protenas cujos pI diferem vidro (A), sobre a qual colocada uma pelcula de polister
cerca de 0,001 unidades de pH. (B) destinada a facilitar a manipulao do gel, por um ou
vrios separadores (C), de uma segunda placa de vidro (D) e
ASPECTOS PRTICOS por pinas que servem para manter a estrutura em conjunto.
Deve prestar-se uma ateno particular s caractersticas

e/ou preparao da amostra. A presena de sais na amostra
pode trazer problemas e, se possvel, prefervel preparar a
amostra em gua desionizada ou em soluo de anflitos a
2 por cento, usando dilise ou, se necessrio, uma filtrao
sobre gel.
O tempo requerido para realizar a focalizao em gel de
poliacrilamida em camada fina determinado por aplicao
de uma protena corada (hemoglobina, por exemplo) em
diferentes pontos da superfcie do gel seguida de aplicao
do campo elctrico: o equilbrio atingido quando os perfis
electroforticos obtidos com as diferentes aplicaes so
todos idnticos. Em certos protocolos, o ponto final da
focalizao determinado pelo tempo decorrido aps a
aplicao da amostra. Molde

Gel de poliacrilamida a 7,5 por cento. Dissolva 29,1 g de o emprego de geles cilndricos,
acrilamida R e 0,9 g de metileno-bisacrilamida R em 100 ml
o emprego de geles em placas com outras dimenses,
de gua R. A 2,5 volumes desta soluo, junte a mistura de
nomeadamente de geles ultrafinos (0,2 mm),
anflitos indicada na monografia e complete 10 volumes com
gua R. Misture com precauo e desgasifique a soluo. alteraes no procedimento de aplicao das amostras,
designadamente nos volumes depositados ou na utilizao
de matrizes de aplicao ou de tiras de outro material que
2. Mtodos
Analticos
Preparao do molde. Estenda a pelcula de polister sobre
no o papel,
a placa de vidro inferior, coloque o separador e, depois,
a segunda placa de vidro e fixe com as pinas. Antes do alteraes nas condies de desenvolvimento, incluindo
emprego, coloque a soluo num agitador magntico e junte o campo elctrico, em funo das dimenses do gel e do
0,25 volumes de uma soluo de persulfato de amnio R a equipamento e utilizando tempos de migrao fixos, de
100 g/l e 0,25 volumes de tetrametiletilenodiamina R. Verta preferncia a uma interpretao subjectiva da estabilidade
imediatamente entre as placas de vidro do molde. das bandas,
a introduo de uma etapa de pr-focalizao,
MTODO
o emprego de instrumentalizao automatizada,
Desmonte o molde e, com o auxlio da pelcula de polister, o emprego de geles de agarose.
transfira o gel para o suporte refrigerado, humedea com
alguns mililitros de um lquido apropriado, tendo o cuidado
de evitar a formao de bolhas de ar. Prepare as solues VALIDAO DOS PROCEDIMENTOS
problema e as solues padro como se indica na monografia. DE FOCALIZAO ISOELCTRICA
Coloque sobre o gel tiras de aplicao em papel com
dimenses de cerca de 10 mm 5 mm e, depois, impregne-
Qualquer mtodo alternativo utilizado em substituio
-as com a soluo problema e com a soluo padro, nas
do procedimento descrito deve ser validado. Os critrios
quantidades prescritas. Deposite igualmente a quantidade
seguintes podem ser utilizados para validar a separao:
prescrita de uma soluo contendo diferentes protenas de
ponto isoelctrico conhecido que serviro de marcadores de formao de um gradiente de pH estvel que apresente as
pH para padronizar o gel. Em certos protocolos prev-se que caractersticas pretendidas, avaliadas por exemplo com
se faam cavidades no gel onde sero aplicadas as solues da marcadores corados de ponto isoelctrico conhecido,
amostra em vez de se usarem as tiras de papel impregnado.
comparao com o electroforegrama fornecido com a
Corte 2 tiras de papel com o comprimento do gel e impregne-
substncia qumica de referncia (SQR) correspondente
-as com solues de electrlitos (cida para o nodo e
preparao problema,
alcalina para o ctodo). A composio das solues andica e
catdica indicada na monografia. Coloque as tiras de papel qualquer outro critrio de validao descrito na
de cada lado do gel, a alguns milmetros do bordo. Coloque monografia.
a tampa no lugar, de tal modo que os elctrodos estejam em
contacto com as tiras respectivamente nos polos andico
e catdico. Proceda focalizao isoelctrica aplicando os ALTERAES ESPECIFICADAS
parmetros elctricos indicados na monografia. Desligue a EM RELAO AO MTODO GERAL
corrente quando a migrao da mistura de protenas padro
est estabilizada. Utilize a pina para retirar do gel as tiras Algumas alteraes ao mtodo geral, necessrias para a
de aplicao e as 2 tiras ligadas aos elctrodos. Mergulhe o anlise de determinadas substncias, so expressamente
gel na soluo de fixao para focalizao isoelctrica em especificadas na monografia. Estas alteraes compreendem:
gel de poliacrilamida R e incube temperatura ambiente
com agitao moderada durante 30 min. Verta a soluo, a adio de ureia no gel de migrao (a concentrao 3 M
junte 200 ml de soluo de descolorao R e incube com muitas vezes suficiente para manter a protena em soluo
agitao durante 1 h. Seque o gel, junte soluo de colorao de modo satisfatrio mas pode ser utilizada uma concen-
de Coomassie R e incube durante 30 min. Descore o gel trao at 8 M), para certas protenas que precipitam no
por difuso passiva na soluo de descolorao R at que as seu ponto isoelctrico: a ureia contida no gel permite
bandas apaream nitidamente em fundo claro. Localize a manter a protena em soluo. Quando se utiliza a ureia,
posio e a intensidade das bandas do electroforegrama como s se utilizam as solues preparadas recentemente, para
se indica na monografia. prevenir a carbamilao da protena,
o emprego de outros mtodos de colorao,
ALTERAES EM RELAO AO PROCEDIMENTO a incorporao de aditivos no gel, tais como detergentes
(SUJEITAS A VALIDAO) no-inicos (por ex., octilglucosido) ou detergentes
zwiterinicos (por ex., CHAPS ou CHAPSO), e a adio
Quando se faz referncia ao mtodo geral de focalizao de anflitos amostra, para impedir a agregao ou a
isoelctrica, so admitidas algumas alteraes da metodologia precipitao das protenas.
ou do procedimento, sujeitas a validao. Estas alteraes
compreendem:
PONTOS A CONSIDERAR
o emprego de geles em placas disponveis no comrcio
e prontas a usar e de conjuntos de colorao e de
As amostras podem ser aplicadas em qualquer ponto do gel
descolorao tambm disponveis no mercado,
mas, para proteger as protenas de zonas de pH extremo,
o emprego de gradientes de pH imobilizados, no devem ser aplicadas nas proximidades dos elctrodos.

2.2.55. Cartografia peptdica
Durante o desenvolvimento do mtodo, o analista pode substncia de referncia. A obteno de uma clivagem
aplicar a protena em 3 pontos diferentes do gel (por ex., completa das ligaes peptdicas mais fcil com enzimas do
no centro e nas 2 extremidades); o comportamento de uma tipo das endoproteases (por exemplo, a tripsina) do que com
protena aplicada nas extremidades do gel pode variar. agentes qumicos de clivagem.
Se a focalizao durar muito tempo pode ocorrer fenmeno Uma carta peptdica deve conter um nmero suficiente de
conhecido pelo nome de derivada catdica, no decurso peptidos se bem que, no entanto, os fragmentos no devam
2. Mtodos
Analticos
do qual o gradiente de pH vai decaindo. Embora este ser muitos numerosos, pois a carta corre o risco de perder
fenmeno seja ainda mal compreendido, a electroendosmose a sua especificidade, uma vez que um grande nmero de
e a absoro do dixido de carbono podem ser os factores protenas apresentar o mesmo perfil.
responsveis pela derivada catdica. A derivada catdica
observa-se no momento em que a protena focalizada
migra da extremidade catdica do gel. Podem utilizar-se os ISOLAMENTO E PURIFICAO
gradientes de pH imobilizados para resolver este problema.
O isolamento e a purificao so necessrias para anlise de
Durante a focalizao importante um arrefecimento eficaz preparaes a granel ou de formas farmacuticas contendo
(cerca de 4C) da camada em que repousa o gel. O elevado excipientes ou vectores de protenas susceptveis de interferir
campo elctrico a que submetido o gel de focalizao na anlise. Estas fases so descritas nas monografias
durante a FIE pode originar um sobreaquecimento e afectar a especficas sempre que necessrio. A recuperao quantitativa
qualidade desta ltima. da protena a partir da forma farmacutica deve ser validada.
2.2.55. CARTOGRAFIA PEPTDICA CLIVAGEM SELECTIVA DAS LIGAES PEPTDICAS

A cartografia peptdica um mtodo de identificao de A escolha da via a utilizar para a clivagem das ligaes
protenas, nomeadamente as obtidas pelo mtodo do ADN peptdicas depende da protena a analisar. Esta escolha
recombinante (ADNr). O ensaio envolve o tratamento envolve a determinao do tipo de clivagem (enzimtica ou
qumico ou enzimtico da protena para a fraccionar em qumica) e do agente de clivagem da categoria pretendida.
fragmentos peptdicos, seguido da separao e identificao Vrios agentes de clivagem esto indicados no quadro I,
destes fragmentos por uma tcnica reprodutvel. Este mtodo bem assim como a respectiva especificidade. Esta listagem
permite identificar quase todas as alteraes da sequncia dos no exaustiva e ir sendo completada medida que forem
aminocidos que resultem de erros de leitura da sequncia identificados outros agentes de clivagem.
do ADN complementar (ADNc) ou de mutaes pontuais. A
cartografia peptdica um mtodo comparativo, porque se
baseia na comparao dos dados obtidos com a amostra e Pr-tratamento da amostra. possvel ensaiar diferentes
com uma substncia de referncia, tendo ambas sido sujeitas vias para o pr-tratamento das amostras, conforme o
ao mesmo tratamento. Esta comparao permite confirmar a tamanho ou a configurao da protena. Se se utiliza a
estrutura primria da protena, detectar eventuais alteraes tripsina como agente de clivagem para protenas de massa
estruturais e demonstrar a reprodutibilidade do processo de molecular superior a 100 000 Da, necessrio proteger os
produo e da estabilidade gentica. Cada protena apresenta resduos de lisina por citraconilao ou maleilao, para no
caractersticas nicas que preciso conhecer bem para se se gerar um grande nmero de peptidos.
poder, cientfica e analiticamente, desenvolver e validar
um mtodo cartogrfico que apresente uma especificidade Pr-tratamento do agente de clivagem. Para se garantir a
suficiente. reprodutibilidade das cartas, pode ser necessrio proceder a
uma purificao dos agentes de clivagem, especialmente se
O presente captulo constitui uma til ajuda para aplicar e
se tratar de agentes enzimticos. A tripsina, por exemplo,
validar a cartografia peptdica na caracterizao de uma dada
pode ser tratada pela tosil-l-fenilalaninaclorometilcetona
protena; determinar a estabilidade dos vectores de expresso
para inactivar a quimotripsina. Outros mtodos como, por
das clulas utilizadas para obteno dos produtos do ADNr;
exemplo, a purificao da tripsina por cromatografia lquida
calcular a reprodutibilidade de todo o processo de produo;
de alta eficincia (High performance liquid chromatography
determinar a estabilidade da protena; verificar a sua identidade;
HPLC) ou a imobilizao do enzima num suporte de gel,
ou, ainda, detectar a presena de variantes proteicas.
do bons resultados quando se dispe apenas de pequenas
A cartografia peptdica, no sendo um mtodo geral, quantidades de protena.
destina-se obteno de uma carta peptdica especfica
para cada protena. Se bem que esta tecnologia esteja a Pr-tratamento da protena. Em certas condies, pode ser
evoluir rapidamente, existe um certo nmero de mtodos necessrio concentrar a amostra ou separar a protena dos
aceites na generalidade. Nas monografias especficas, e excipientes ou estabilizantes que entram na formulao do
sempre que necessrio, sero indicadas as modificaes a produto, se estes forem susceptveis de interferir no processo
esses mtodos. de cartografia. Para este efeito so utilizados diferentes
A carta peptdica de uma protena constitui a sua impresso mtodos fsicos como, por exemplo, a ultrafiltrao,
digital. o resultado final de um conjunto de processos a cromatografia em coluna e a liofilizao. Antes da
qumicos, atravs do qual se obtm um conhecimento muito cartografia, podem utilizar-se outros pr-tratamentos
preciso da protena analisada. O desenvolvimento do mtodo para desmembrar a cadeia proteica, como, por exemplo, a
faz-se em 4 fases principais: isolamento e purificao da adio de um agente caotrpico, como a ureia. Para facilitar
protena, se a protena faz parte de uma formulao; clivagem o acesso do enzima aos pontos de clivagem e permitir
selectiva das ligaes peptdicas; separao cromatogrfica o desmembramento parcial da protena, muitas vezes
dos peptidos obtidos; anlise e identificao dos peptidos. necessrio reduzir e alquilar as pontes de dissulfureto antes
A amostra hidrolisada e doseada em paralelo com uma da hidrlise.

QUADRO I Exemplos de agentes de clivagem
Tipo Agente Especificidade
Enzimtico Tripsina (EC 3.4.21.4) lado do C-terminal de Arg e Lis

Quimotripsina (EC 3.4.21.1) lado do C-terminal de resduos hidrfobos (p. ex., Leu,
Met, Ala, compostos aromticos)
2. Mtodos
Analticos
Pepsina (EC 3.4.23.1 e 2) hidrlise no especfica
Lisil-endopeptidase (Lis-C endopeptidase) (EC 3.4.21.50) lado do C-terminal de Lis
Glutamil-endopeptidase (da estirpe V8 de S. aureus) (EC 3.4.21.19) lado do C-terminal de Glu e Asp
Peptidil-Asp metalo-endopeptidase (endopeptidade Asp-N) lado do N-terminal de Asp
Clostripana (FC 3.4.22.8) lado do C-terminaI de Arg
Qumico Brometo de cianognio lado do C-terminal de Met
cido 2-nitro-5-tio-cianobenzico lado do N-terminal de Cis
cido O-iodosobenzico lado do C-terminal de Trp e Tir
cidos diludos Asp e Pro
Brometo de [2-(2-nitrofenilsulfenil)-3-metilindol] (BNPS-escatol) Trp
A hidrlise pela tripsina pode introduzir ambiguidades congelao ou adicionando um cido que no interfira com a
na carta peptdica, devido a reaces secundrias que se cartografia.
produzem durante a hidrlise. Estas reaces podem ser
Quantidade de agente de clivagem utilizado. Se bem que
de diversa natureza: clivagem no especfica, desamidao,
o agente de clivagem seja usado em excesso, para permitir
isomerizao dos dissulfuretos, oxidao dos resduos
uma reaco razoavelmente rpida (entre 6 h a 20 h),
da metionina, formao de grupos piroglutmicos por
conveniente utilizar a menor quantidade possvel para
desamidao da glutamina pelo lado do N-terminal de um
evitar interferncias na imagem cromatogrfica. Opera-se,
peptido. Podem, tambm, aparecer picos resultantes da auto-
geralmente, com uma relao protena/protease de 20:1 a
-hidrlise da tripsina. A sua intensidade depende da relao
200:1 e prudente juntar o agente de clivagem por 2 ou mais
da concentrao tripsina/protena. Para se evitar a auto-
vezes, para optimizar o processo. Deve ter-se em ateno
-hidrlise, podem preparar-se solues de protease com um
que se deve manter pequeno o volume final da reaco para
valor de pH que no seja o ptimo (por exemplo, pH 5 para a
facilitar a fase seguinte da cartografia peptdica que a da
tripsina): o enzima no se tornar activo seno aps diluio
separao. Para verificar que j no artefactos da hidrlise,
com o tampo de hidrlise.
que seriam susceptveis de perturbar o prosseguimento
da anlise, efectua-se um ensaio em branco, usando uma
Definio das condies ptimas de hidrlise. Os factores soluo testemunha que contenha todos os reagentes com
que afectam o grau e a eficcia da hidrlise das protenas so excepo da protena a analisar.
os mesmos que podem afectar qualquer reaco qumica ou
enzimtica.
SEPARAO CROMATOGRFICA
pH do meio reaccional. Para se optimizar a aco do
agente de clivagem, escolhe-se empiricamente o pH da
mistura reagente. Se, por exemplo, se tratar de brometo de Existem numerosas tcnicas de separao dos peptidos com
cianognio, necessrio um meio de reaco fortemente vista cartografia. A escolha ser feita em funo da protena
cido (por exemplo, pH 2, usando cido frmico), pelo considerada. O quadro II d uma panormica das tcnicas
contrrio, no caso da tripsina, o meio ptimo ligeiramente utilizadas com sucesso na separao de peptidos. A HPLC em
alcalino (pH 8). Regra geral, o pH do meio no deve nem fase inversa, que se descreve nesta seco, constitui um dos
alterar a integridade qumica da protena no decurso da mtodos possveis de separao cromatogrfica.
hidrlise, nem variar durante a reaco de fragmentao.
Temperatura. Na maior parte dos casos a temperatura conve- QUADRO II Tcnicas usadas na separao de peptidos
niente est compreendida entre 25C e 37C. A temperatura
escolhida de modo a limitar, tanto quanto possvel, o risco Cromatografia lquida de alta resoluo (HPLC) em fase inversa
de reaces qumicas secundrias. A temperatura ptima
Cromatografia de troca inica (IEC)
da reaco depende do tipo de protena considerada, uma
vez que umas protenas so mais susceptveis que outras de Cromatografia de interaco hidrfoba (HIC)
sofrer desnaturao quando a temperatura aumenta. Por
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), em condies no
exemplo, a hidrlise da somatropina bovina recombinante desnaturantes
efectuada a 4C, porque, a temperaturas mais elevadas,
Electroforese em gel de dodecilsulfato de sdio-poliacrilamida
ocorre precipitao durante a hidrlise. (SDS-PAGE)
Tempo. Se se dispe de uma quantidade da amostra Electroforese capilar (CE)
suficiente, pode efectuar-se um ensaio experimental para
determinar o tempo ptimo necessrio para se obter uma Cromatografia em papel sob alta tenso (PCHV)
carta reprodutvel e evitar a hidrlise incompleta. A durao Electroforese em papel sob alta tenso (HVPE)
da hidrlise pode variar de 2 h a 30 h. Pra-se a reaco por

A pureza dos solventes e das fases mveis um factor ps-coluna), mas no so to bons nem to universais como a
crtico da separao cromatogrfica. recomendado deteco por UV.
para a HPLC em fase inversa o emprego de solventes e de
gua de qualidade para HPLC disponveis no mercado. A Validao. Esta seco descreve os meios experimentais
presena de gases dissolvidos constitui um problema nos destinados a avaliar as capacidades globais do mtodo.
sistemas de gradiente, porque a solubilidade de um gs Os critrios de aceitao para a conformidade do sistema
no solvente pode ser menor na mistura que no solvente. A baseiam-se na identificao de parmetros crticos que
2. Mtodos
Analticos
desgasificao a baixa presso e o tratamento por ultra-sons afectam a interpretao e a aceitao dos resultados. Estes
so mtodos usados para desgasificar. Quanto s partculas parmetros crticos intervm igualmente no seguimento
slidas, eventualmente contidas nos solventes, podem, das diferentes fases da hidrlise e da anlise dos peptidos.
uma vez entradas no sistema cromatogrfico, alterar a Para assegurar que o ponto final da hidrlise pretendida
estanquicidade das vlvulas da bomba ou colmatar a cabea atingido, usa-se como indicador uma substncia de
da coluna. Por isso recomendvel que se faam filtraes referncia qual se aplica o mesmo tratamento da protena
antes e depois das bombas. considerada. A anlise paralela da amostra e da substncia de
referncia constitui um aspecto chave do desenvolvimento e
Coluna cromatogrfica. A escolha da coluna cromatogrfica do estabelecimento dos limites da conformidade do sistema.
feita de maneira emprica para cada protena. A separao Para facilitar a comparao fornecido um cromatograma-
pode ser ptima com colunas cheias com gel de slica com -tipo da substncia de referncia. Existem outros indicadores
um dimetro de poros de 10 nm ou 30 nm. Para os peptidos possveis: determinao visual da solubilidade da protena ou
pequenos o gel de slica octadecilsililada para cromatografia do peptido; verificao da ausncia de protena intacta; ou
R (3-10 m) esto melhor adaptados que o gel de slica determinao das respostas de um peptido provocado pela
butilsililada para cromatografia R (5-10 m). hidrlise. Os parmetros crticos da conformidade do sistema
para uma anlise peptdica dependem do modo particular da
Solvente. O solvente mais utilizado a gua que tem, separao e deteco dos peptidos e da exigncia em relao
como modificador orgnico, o acetonitrilo adicionado, anlise dos dados.
no mximo, de 0,1 por cento de cido trifluoroactico. Se Quando a cartografia peptdica utilizada para identificao,
necessrio, pode juntar-se lcool isoproplico ou lcool os critrios de conformidade do sistema para os peptidos
n-proplico para solubilizar os produtos da hidrlise desde identificados compreendem a selectividade e a preciso. Neste
que isso no provoque um aumento excessivo da viscosidade caso, tal como para a identificao de formas variantes, a
do hidrolisado. identificao na carta da estrutura primria dos fragmentos
peptdicos permite tanto confirmar uma estrutura primria
Fase mvel. Utilizam-se fases mveis com tampo de conhecida, como identificar as formas variantes de uma
fosfato para permitir uma certa flexibilidade na seleco das protena por comparao com a carta peptdica da substncia
condies de pH, porque as variaes de pH no intervalo de referncia correspondente a essa protena. O emprego de
3,0-5,0 favorecem a separao dos peptidos que contm tal substncia de referncia, submetida ao mesmo processo
resduos cidos (cido glutmico e cido asprtico, por de hidrlise, o mtodo recomendado para determinar a
exemplo). O fosfato de sdio ou o fosfato de potssio, o resoluo entre os peptidos. Para anlise de uma protena
acetato de amnio e o cido fosfrico a um pH compreendido variante, possvel utilizar uma mistura conhecida de uma
entre 2 e 7 (ou superior, para os suportes base de polmeros) variante e de uma substncia de referncia, nomeadamente
com um gradiente de concentrao em acetonitrilo so se o peptido variante est situado numa regio da carta onde
igualmente utilizados. O acetonitrilo adicionado de cido a resoluo no a melhor. O indicador de reprodutibilidade
trifluoroactico correntemente usado. do perfil peptdico pode ser o nmero de peptidos
principais detectados, mas a reprodutibilidade melhor
Gradiente. O gradiente pode ser linear, no linear, ou em definida pela resoluo dos picos peptdicos. Para definir a
escada. Recomenda-se um gradiente lento para a separao resoluo dos peptidos podem ser usados vrios parmetros
de misturas complexas. Procede-se a uma optimizao do cromatogrficos: resoluo entre os picos, largura mxima
gradiente de modo a obter-se uma boa resoluo para 1 ou 2 dos picos, rea dos picos, factor de simetria dos picos,
picos que serviro de marcadores do ensaio. eficincia da coluna. De acordo com a natureza da protena
considerada e o mtodo de separao utilizado, pode ser
necessrio especificar as exigncias de resoluo para um s
Eluio isocrtica. Pela comodidade do emprego e para uma ou vrios peptidos.
melhor resposta do detector, podem escolher-se sistemas
de HPLC de eluio isocrtica, utilizando uma nica fase A repetio da anlise do hidrolisado obtido a partir da
mvel. Por vezes difcil determinar a melhor composio substncia de referncia da protena considerada fornece
da fase mvel para se obter uma boa resoluo de todos os indicaes sobre a preciso e a taxa de recuperao. Os
picos. Para os sistemas de HPLC de eluio isocrtica, no ensaios de recuperao de peptidos identificados so
aconselhvel a utilizao de fases mveis em que ligeiras geralmente efectuados por meio de padres peptdicos,
variaes da proporo dos seus componentes ou do pH internos ou externos. A preciso expressa como desvio
afectam significativamente os tempos de reteno dos picos padro relativo (Relalive standard deviation RSD). Como
da carta peptdica. a recuperao dos peptidos identificados e a preciso
so susceptveis de apresentar diferenas, conveniente
estabelecer limites de conformidade do sistema, quer para
Outros parmetros. geralmente necessrio regular a
a recuperao, quer para a preciso. Estes limites so
temperatura da coluna para se obter uma reprodutibilidade
especficos da protena considerada e sero indicados na
satisfatria. O dbito da fase mvel da ordem de 0,1 ml//min a
monografia dessa protena.
2,0 ml/min e a deteco dos peptidos feita com um detector
de UV entre 200 nm a 230 nm. So igualmente utilizados Procede-se ao exame visual dos cromatogramas, sob
outros mtodos de deteco (por exemplo, a derivatizao diferentes aspectos: retenes relativas, amplitude das

2.2.56. Anlise de aminocidos
respostas (rea ou altura dos picos), nmero de picos, perfil O emprego da cartografia peptdica na anlise qualitativa
geral da eluio. Esta verificao , em seguida, completada e no requer a caracterizao completa de cada um dos picos
confirmada por anlise matemtica dos factores de resposta peptdicos. No entanto, a validao da cartografia peptdica
e pela avaliao do perfil cromatogrfico de uma mistura no quadro dos pedidos de autorizao de introduo no
1:1 (V/V) dos hidrolisados da amostra e da substncia de mercado requer rigorosa caracterizao de cada um dos
referncia. Se todos os picos obtidos com os 2 hidrolisados picos na carta peptdica. Os mtodos de caracterizao dos
apresentarem as mesmas retenes relativas e os mesmos picos vo da sequenciao N-terminal de cada pico, seguida
2. Mtodos
Analticos
factores de resposta, a identidade da amostra est confirmada. de anlise dos aminocidos por espectrometria de massa
Pelo contrrio, a observao de um nico pico naquela (mass spectroscopy MS).
mistura 1:1, quando, inicialmente, tinham sido observados No caso de caracterizao por sequenciao N-terminal
vrios picos de retenes relativas significativamente seguida de anlise dos aminocidos, a separao analtica
diferentes, indica variabilidade do sistema. A obteno de efectua-se em larga escala. Uma vez que esta mudana
picos separados, com a mistura 1:1, constitui prova da de escala pode afectar a resoluo dos picos peptdicos,
no equivalncia dos peptidos contidos em cada pico. A necessria a utilizao de dados empricos para assegurar
observao, com a mistura 1:1, de um pico significativamente que no h perda de resoluo. Os eluatos, correspondentes
mais largo que o pico correspondente inicialmente obtido aos diferentes picos peptdicos, so recolhidos, concentrados
com a amostra e a substncia de referncia, pode indicar a presso reduzida e, depois, submetidos a nova
a presena de peptidos diferentes. Foi proposto e aplicado cromatografia. A anlise dos fragmentos pode ser limitada
o emprego de modelos computorizados com programas pelo tamanho dos peptidos. Se o lado do N-terminal est
informticos para anlise dos dados da cartografia peptdica, bloqueado, pode ser necessrio libert-lo antes de se
mas os problemas que se levantam em relao validao proceder sequenciao. Pode tambm ser til para a
do programa informtico excluem qualquer possibilidade da caracterizao a sequenciao C-terminal das protenas em
sua utilizao a curto prazo nos ensaios das farmacopeias. combinao com a carboxipeptidase e anlise por MS do
Existem outras vias automatizadas que utilizam expresses tipo ionizao por desoro laser com anlise em tempo de
matemticas, modelos e programas informticos como, voo (Matrix-assisted laser desorption ionisation coupled to
por exemplo, a identificao automtica de compostos por time-of-flight MALDI-TOF).
espectrofotometria de absoro no infravermelho ou a
aplicao de anlise espectral com dodos de UV anlise dos No caso da caracterizao dos fragmentos peptdicos
peptidos. Mesmo assim, estes mtodos apresentam certas por MS, procede-se anlise da estrutura, quer pela
limitaes ligadas insuficiente resoluo, co-eluio introduo directa dos peptidos isolados, quer pela
de fragmentos ou a grandes diferenas de resposta entre conjugao em linha de cromatografia lquida-
os fragmentos produzidos pela hidrlise da amostra e da -espectrometria de massa (Liquid chromatography-
substncia de referncia. -mass spectroscopy LC-MS). As diferentes tcnicas de
MS utilizadas so a ionizao por electronebulizao
A comparao dos tempos de reteno, assim como da rea (electrospray), ionizao do tipo MALDI-TOF e a ionizao
ou da altura dos picos, pode ser fornecida para um grupo por bombardeamento de tomos (Fast atom bombardment
seleccionado de picos principais que estejam correctamente FAB). Utiliza-se igualmente a M5 em tandem MS-MS
identificados nas cartas peptdicas. A rea dos picos pode para sequenciar uma protena modificada e determinar
ser calculada em relao a um pico que apresente variaes o tipo de modificao que ocorreu na sequncia. A
relativamente pequenas, utilizado como padro interno, comparao dos espectros de massa obtidos antes e
contudo a integrao dos picos sensvel s flutuaes depois da reduo do hidrolisado permite assinalar as
da linha de base e susceptvel de introduzir erros no pontes de dissulfureto e os peptidos com grupos sulfidrilo
resultado. Outra possibilidade consiste em relacionar a altura
correspondentes.
de cada pico com a altura total do conjunto dos picos do
cromatograma obtido com a amostra e, depois, comparar as Se certas regies da estrutura primria ficarem mal
percentagens assim calculadas com as obtidas com os picos determinadas na carta peptdica, pode ser necessrio elaborar
correspondentes da substncia de referncia. A possibilidade uma carta peptdica secundria. O objectivo de um mtodo
de auto-hidrlise da tripsina monitorizada por uma carta validado de caracterizao de uma protena por cartografia
peptdica obtida com uma soluo em branco tratada com peptdica encontrar e confirmar, pelo menos, 95 por cento
tripsina. da composio terica da protena.
A exigncia mnima para a qualificao de uma cartografia
peptdica a utilizao de um mtodo de ensaio aprovado que
inclua critrios de conformidade do sistema como meio de
2.2.56. ANLISE DE AMINOCIDOS
controlo. Em regra, para os primeiros passos dos processos
A anlise de aminocidos refere-se metodologia utilizada
regulamentares de autorizao, suficiente a qualificao
de uma protena por cartografia. medida que o processo de para determinar a composio ou o teor em aminocidos
autorizao for avanando, a qualificao do ensaio pode ser de protenas, peptidos e outras preparaes farmacuticas.
completada pela validao parcial do mtodo analtico, com As protenas e os peptidos so macromolculas compostas por
vista a demonstrar que a segurana do mtodo est de acordo resduos de aminocidos, associados por ligaes covalentes,
com os resultados previstos no desenvolvimento da carta organizados de forma a originar um polmero de estrutura
peptdica para a protena considerada. linear.
A sequncia de aminocidos que compem uma protena
ANLISE E IDENTIFICAO DE PEPTIDOS ou um peptido determina as propriedades da molcula.
As protenas so normalmente consideradas molculas de
Esta seco constitui um guia para utilizao da cartografia grande dimenso, que apresentam em geral uma estrutura
peptdica na fase de produo, como suporte das aplicaes tridimensional de conformao especfica enquanto que
regulamentares. os peptidos so molculas mais pequenas e muitas vezes

compostas por um nmero reduzido de aminocidos. A A boa manuteno do equipamento fundamental para a
anlise de aminocidos pode ser utilizada para diversos obteno de resultados aceitveis. Se o equipamento for
fins: quantificao de protenas e de peptidos, identificao utilizado de forma rotineira, deve ser controlado diariamente,
de protenas e de peptidos com base na sua composio verificando a existncia de fugas, a estabilidade do detector e
em aminocidos, contribuio para a anlise estrutural das fontes luminosas e a capacidade da coluna para separar os
de protenas e de peptidos, avaliao das estratgias de aminocidos. Os filtros e outros elementos devem ser limpos
fragmentao com vista cartografia peptdica, deteco da ou substitudos regularmente.
2. Mtodos
Analticos
eventual presena de aminocidos atpicos nas protenas e

nos peptidos. A anlise de uma protena ou de um peptido
exige previamente a sua hidrlise, originando os respectivos MATERIAL DE REFERNCIA
aminocidos constitutivos. Uma vez efectuada a hidrlise,
o procedimento a seguir para a anlise dos aminocidos Para a anlise de aminocidos existem no comrcio
o mesmo que utilizado na anlise dos aminocidos preparaes padro apropriadas, que so geralmente
livres noutras preparaes farmacuticas. Para analisar os constitudas por uma mistura de aminocidos em soluo
aminocidos presentes na amostra em ensaio frequente aquosa. Para alm disso, durante uma determinao de
proceder a uma derivatizao. composio em aminocidos, analisam-se ao mesmo tempo
padres proteicos ou peptdicos como controles para
demonstrar a integridade do procedimento no seu conjunto.
EQUIPAMENTO Por exemplo, para este efeito utiliza-se albumina srica
bovina altamente purificada como padro proteico.
Os mtodos utilizados para a anlise de aminocidos baseiam-
-se, geralmente, na separao cromatogrfica dos
aminocidos presentes na amostra a examinar. As tcnicas CALIBRAO DO EQUIPAMENTO
actuais beneficiam da automatizao dos sistemas
cromatogrficos concebidos para procedimentos analticos. A calibrao do equipamento destinado anlise de
Uma aparelhagem--tipo para anlise de aminocidos aminocidos efectua-se, classicamente, pela anlise de
compreende um sistema de cromatografia lquida (de alta uma soluo padro de aminocidos, constituda por uma
ou baixa presso) com capacidade para gerar gradientes de mistura de aminocidos em concentraes variadas, que
composio da fase mvel, de forma a permitir a separao permite determinar o factor de resposta e a gama de validade
dos aminocidos ao longo da coluna cromatogrfica. Deve da anlise para cada aminocido. A concentrao de cada
tambm possuir um sistema de derivatizao ps-coluna, a aminocido nesta preparao conhecida. Para a calibrao
no ser que a anlise da amostra recorra derivatizao pr-
efectuam-se vrias diluies da soluo padro, de forma
coluna. A deteco geralmente efectuada por um detector
a obter para cada aminocido diferentes concentraes na
ultravioleta-visvel ou um detector fluorimtrico, dependendo
zona de linearidade esperada da tcnica utilizada. Para cada
do mtodo de derivatizao utilizado. Usa-se um sistema de
concentrao, a anlise repetida vrias vezes. Para cada
registo (por exemplo, um integrador) para a transformao
aminocido, constri-se o grfico das reas dos picos obtidos
do sinal analgico do detector e para a quantificao. De
em funo da concentrao (conhecida) nas diluies da
preferncia, deve utilizar-se para a anlise de aminocidos
equipamento especialmente concebido para esse efeito. soluo padro. assim possvel determinar, para um dado
aminocido, o intervalo de concentraes em que a rea
dos picos proporcional concentrao. Para assegurar
PRECAUES GERAIS a exactido e a repetibilidade dos resultados importante
preparar as amostras a analisar para que se situem nos
A contaminao residual uma preocupao permanente limites analticos da tcnica utilizada (por exemplo, no
na anlise de aminocidos. necessrio utilizar reagentes intervalo de linearidade).
de elevada pureza (por exemplo, o cido clordrico de baixo A anlise de 4 a 6 valores de concentrao necessria para
grau de pureza pode contribuir para uma contaminao pela a determinao do factor de resposta de cada aminocido,
glicina). Os reagentes devem ser renovados frequentemente,
o qual calculado pela mdia das reas ou das alturas dos
com um intervalo de algumas semanas, e todos os solventes
picos por nanomole de aminocido presente na amostra.
utilizados devem ser de qualidade para HPLC. Para reduzir
Para calcular a concentrao de cada aminocido presente
os riscos de contaminao microbiana e da presena de
na amostra, prepara-se um ficheiro de calibrao contendo
substncias estranhas nos solventes estes devem ser filtrados
o factor de resposta de cada aminocido. Para efectuar o
antes de serem usados e conservados em recipientes
fechados. Deve tambm evitar-se a exposio directa do clculo, divide-se a rea do pico obtido pelo aminocido
equipamento luz solar. em causa pelo factor de resposta correspondente, de modo
a obter a quantidade de aminocido em nanomoles. Nas
Os procedimentos laboratoriais podem condicionar a anlises de rotina pode ser suficiente um nico ponto de
qualidade da anlise. O material de laboratrio deve ser calibrao, mas o ficheiro de calibrao deve ser actualizado
colocado em zonas de pouca circulao. As instalaes devem frequentemente e a sua validade controlada pela anlise de
ser mantidas limpas. As pipetas devem ser limpas e calibradas padres analticos.
de acordo com um esquema de manuteno previamente
estabelecido. As pontas das pipetas devem ser conservadas
numa caixa fechada e no devem ser manipuladas REPETIBILIDADE
directamente com as mos; para o efeito podem ser usadas
luvas em ltex sem p, ou qualquer proteco equivalente. A repetibilidade do procedimento analtico um factor
Deve-se evitar a abertura desnecessria dos frascos das importante para obter de forma consistente resultados
amostras, pois o p pode ser fonte de contaminao com analticos de qualidade. O cromatograma obtido por
glicina, serina e alanina. separao cromatogrfica dos aminocidos ou dos seus

derivados pode mostrar numerosos picos, correspondentes aminocidos livres no tm o mesmo comportamento que
aos diferentes aminocidos. Devido ao elevado nmero os aminocidos constitutivos de uma protena, cuja taxa
de picos necessrio dispor de um sistema analtico que de libertao ou destruio durante a hidrlise varivel.
permita realizar, com boa repetibilidade, a identificao Assim, a utilizao de um padro interno para avaliar as
dos picos com base no tempo de reteno e a respectiva perdas durante a hidrlise e a aplicao das rectificaes
quantificao por integrao das reas. O mtodo clssico necessrias no origina necessariamente resultados fiveis
para avaliar a repetibilidade consiste em analisar repetidas havendo necessidade de tomar em considerao estes
2. Mtodos
Analticos
vezes (por exemplo, 6 ou mais vezes) uma soluo padro aspectos na interpretao dos resultados. Pode-se igualmente
de aminocidos. Determina-se, para cada aminocido, o adicionar padres internos mistura de aminocidos depois
desvio padro relativo (DPR) dos tempos de reteno e da hidrlise para controlar as variaes na aplicao das
das reas dos picos obtidos. A avaliao da repetibilidade amostras, na estabilidade dos reagentes e do fluxo e efectuar
implica a realizao de vrias anlises, em dias diferentes as rectificaes necessrias. Idealmente, um padro interno
e por operadores diferentes. Estas anlises mltiplas um aminocido primrio que no exista na natureza,
incluem a preparao de diluies padro a partir da disponvel comercialmente e de baixo custo. Deve tambm
tomada de ensaio para permitir o estudo da variabilidade ser estvel hidrlise, responder proporcionalmente
associada s manipulaes da amostra. A avaliao da concentrao e eluir a um determinado tempo de reteno
repetibilidade tambm inclui frequentemente a anlise da sem interferir com os outros aminocidos. Os padres
composio em aminocidos de uma protena padro (por internos mais correntemente utilizados so a norleucina a
exemplo, de albumina bovina). A avaliao da variabilidade nitrotirosina e o cido -aminobutrico.
associada s repeties (DPR) permite assim estabelecer
limites de variao que garantem que as anlises foram
efectuadas sob controlo. desejvel, para garantir os HIDRLISE DA PROTENA OU DO PEPTIDO
melhores resultados, que os limites de variao assim
estabelecidos sejam o mais baixos possvel. Os aspectos A anlise de amostras de protenas ou de peptidos exige
crticos a considerar para reduzir a variabilidade nas a sua hidrlise prvia. O material de vidro utilizado deve
anlises so a preparao das amostras, as interferncias estar bem limpo para no afectar os resultados. A presena
espectrais (rudo de fundo) devidas qualidade dos de impresses digitais ou vestgios de p proveniente das
reagentes e/ou s prticas de laboratrio, a eficincia luvas nos tubos de hidrlise pode levar contaminao das
e a manuteno do material, a anlise e interpretao amostras. Os tubos de hidrlise de vidro devem ser fervidos
dos dados, a qualidade e os hbitos de procedimento do em cido clordrico 1 M durante 1 hora, ou mergulhados em
operador. Todos os parmetros em jogo so objecto de cido aztico concentrado, ou numa mistura de 1 volume de
estudo aprofundado no mbito dos trabalhos de validao. cido clordrico concentrado e 1 volume de cido aztico. Os
tubos devem ser limpos com gua de elevado grau de pureza
e depois com metanol de qualidade para HPLC, secos em
PREPARAO DAS AMOSTRAS estufa durante uma noite e armazenados fechados at serem
usados. A descontaminao pode igualmente ser efectuada
A obteno de resultados exactos na anlise de aminocidos por pirlise dos tubos limpos a 500C durante 4 h. Pode-se
exige a purificao prvia das amostras proteicas igualmente utilizar material descartvel.
e peptdicas. Os constituintes tampo (sais, ureia, A hidrlise cida a mais frequentemente utilizada na anlise
detergentes, etc.) podem interferir na anlise e devem ser de aminocidos. Constitui, porm, uma potencial fonte de
previamente eliminados. Estes constituintes afectam menos variabilidade por ser responsvel pela destruio total ou
os mtodos que se baseiam numa derivatizao ps-coluna parcial de vrios aminocidos: destruio total do triptofano,
dos aminocidos do que os que utilizam uma derivatizao destruio parcial da serina e da treonina, risco de oxidao
pr-coluna. desejvel limitar ao mnimo o nmero da metionina, transformao da cistena em cistina (mas
de manipulaes das amostras para reduzir os riscos de a recuperao da cistina em geral medocre devido sua
rudo de fundo, melhorar a recuperao dos aminocidos destruio parcial ou sua reduo a cistena). possvel
e simplificar o trabalho. Utilizam-se correntemente vrias limitar a destruio oxidativa por aplicao de um vazio
tcnicas para eliminar os constituintes tampo: (1) injeco apropriado (menos de 200 m de mercrio ou 26,7 Pa) ou
da amostra proteica num sistema de HPLC em fase inversa, por introduo de um gs inerte (rgon) na parte superior
remoo da protena com um solvente voltil contendo um do recipiente onde decorre a reaco. A clivagem das ligaes
componente orgnico em quantidade suficiente e secagem peptdicas envolvendo a isoleucina e a valina (Ile-Ile, Val-Val,
da amostra por centrifugao a presso reduzida; (2) dilise Ile-Val, Val-Ile) apenas parcial e verifica-se a desaminao
contra um tampo voltil ou gua; (3) ultrafiltrao com da asparagina e da glutamina originando, respectivamente,
centrifugao para substituir o tampo por outro tampo cido asprtico e cido glutmico. A perda de triptofano, de
voltil ou gua; (4) separao da protena e do tampo asparagina e de glutamina durante uma hidrlise cida reduz
por precipitao com ajuda de um solvente orgnico (por para 17 o nmero de aminocidos quantificveis. Vrios dos
exemplo, acetona); (5) filtrao por gel. outros mtodos de hidrlise descritos a seguir permitem
evitar estes problemas. Alguns destes mtodos (por exemplo,
Mtodos 4 a 11) podem, contudo, levar a modificaes
PADRES INTERNOS
que afectam outros aminocidos. Convm, ento, antes de
adoptar uma tcnica diferente de hidrlise cida, verificar as
Para controlar as perdas e as variaes qumicas e fsicas
suas vantagens e inconvenientes.
verificadas ao longo da anlise recomendvel a utilizao de
um padro interno. Para isso, adiciona-se soluo proteica, Recorre-se frequentemente a um estudo ao longo do tempo
antes da hidrlise, uma quantidade exactamente conhecida (anlise de aminocidos aps 24 h, 48 h e 72 h de hidrlise)
de um padro interno. A recuperao obtida para este padro para determinar a concentrao inicial dos aminocidos que
interno permite uma avaliao geral da recuperao dos sofrem uma destruio parcial ou cuja clivagem lenta. A
aminocidos presentes na soluo proteica. Contudo, os representao grfica das concentraes encontradas para

os aminocidos instveis (por exemplo, serina e treonina) amostras secas dentro de um recipiente onde foi previamente
em funo da durao da hidrlise permite, prolongando a colocada uma quantidade apropriada da soluo de hidrlise.
recta at origem, determinar a sua concentrao inicial. Esta no entra em contacto com a amostra. Aplique vazio
No caso dos aminocidos cuja clivagem lenta (por exemplo, parcial (menos de 200 m de mercrio ou de 26,7 Pa) ou
isoleucina e valina), a curva do estudo ao longo do tempo introduza uma atmosfera inerte e aquea aproximadamente a
apresenta uma plataforma cujo valor de ordenadas representa 110C durante 24 h. Os vapores cidos hidrolisam a amostra
a concentrao do resduo em estudo. Se a hidrlise for muito seca. A eventual condensao do cido no frasco contendo a
2. Mtodos
Analticos
prolongada, a concentrao comea a diminuir, o que indica amostra deve ser reduzida ao mnimo. Aps a hidrlise, seque
uma destruio provocada pelas condies da hidrlise. a amostra a presso reduzida para eliminar os eventuais
Uma alternativa aceitvel a estes estudos ao longo do resduos de cido.
tempo consiste em submeter uma preparao padro de
aminocidos s mesmas condies de hidrlise da amostra Mtodo 2
em estudo. A taxa de destruio dos aminocidos livres no
Para limitar a oxidao do triptofano durante a hidrlise,
decurso da hidrlise pode, contudo, no ser totalmente
usa-se cido mercaptoetanossulfnico (MESA) como agente
representativa da dos mesmos aminocidos constitutivos
redutor.
de uma protena ou de um pptido. Isto verifica-se,
nomeadamente, no caso das ligaes peptdicas cuja clivagem
lenta (por exemplo, ligaes Ile-Val). Apesar disso, esta Soluo de hidrlise. Soluo de cido mercaptoetanos-
tcnica permite tomar parcialmente em conta a destruio sulfnico 2,5 M.
do resduo. A hidrlise cida por micro-ondas, igualmente
utilizada, uma tcnica rpida, exigindo, porm, equipamento Hidrlise em fase de vapor. Num tubo de hidrlise seque
especial e precaues adicionais. As condies ptimas de cerca de 1 g a 100 g da protena ou do peptido a analisar.
hidrlise devem ser determinadas para cada amostra proteica/ Coloque o tubo de hidrlise num tubo maior contendo cerca
/peptdica. O tempo requerido para a hidrlise , em geral, de 200 l da soluo de hidrlise. Sele o tubo exterior a
de alguns minutos, mas desvios de um minuto podem ser presso reduzida (cerca de 50 m de mercrio ou de 6,7 Pa)
suficientes para falsear os resultados (hidrlise incompleta ou para vaporizar a soluo de hidrlise. Aquea a 170-185C
destruio dos aminocidos lbeis). Por vezes recorre-se durante cerca de 12,5 min. Aps a hidrlise, seque o tubo de
tambm a uma protelise total com uma mistura de hidrlise com ajuda de presso reduzida durante 15 min para
proteases, mas esta tcnica pode ser complicada, exigindo eliminar o cido residual.
a utilizao de controlos apropriados e , em geral, mais
adequada para a anlise dos peptidos do que das protenas.
Mtodo 3
Durante a anlise inicial de uma protena desconhecida
procede-se a um estudo experimental, fazendo variar a Para limitar a oxidao do triptofano durante a hidrlise, usa-
durao e a temperatura da hidrlise, para determinar as -se cido tiogliclico (TGA) como agente redutor.
condies ptimas.
Soluo de hidrlise. Acido clordrico 7 M contendo 10
Mtodo 1 por cento de cido trifluoroactico, 20 por cento de cido
A hidrlise cida com cido clordrico contendo fenol a tiogliclico e 1 por cento de fenol.
tcnica mais correntemente utilizada para a hidrlise das
protenas/peptidos, que precede a anlise dos aminocidos. A Hidrlise em fase de vapor. Num tubo de amostras, seque
presena de fenol impede a halogenao da tirosina. cerca de 10 g a 50 g da protena ou do peptido a analisar.
Coloque o tubo de amostras num tubo maior contendo cerca
Soluo de hidrlise. cido clordrico 6 M, contendo 0,1 a de 200 l da soluo de hidrlise. Sele o tubo exterior a
1,0 por cento de fenol. presso reduzida (cerca de 50 m de mercrio ou de
6,7 Pa) para vaporizar o cido. Aquea a 166C durante
15-30 min. Aps a hidrlise, seque o tubo de hidrlise, com
Procedimento ajuda de presso reduzida, durante 5 min para eliminar o
Hidrlise em fase lquida. Coloque a amostra proteica/ cido residual. A recuperao do triptofano por este mtodo
/peptdica num tubo de hidrlise e seque (a secagem da pode depender da quantidade de amostra utilizada.
amostra evita a diluio do cido utilizado na hidrlise pela
gua contida na amostra). Adicione a soluo de hidrlise Mtodo 4
na proteco de 200 l de soluo de hidrlise por 500 g de
protena liofilizada. Congele o tubo num banho de acetona- Procede-se oxidao da cistena/cistina e da metionina pelo
-gelo seco e sele-o sob vazio chama. A hidrlise das cido perfrmico antes da hidrlise da protena.
amostras geralmente efectuada a 110C durante 24 h, a
presso reduzida ou sob atmosfera inerte para impedir a Soluo de oxidao. Use cido perfrmico recentemente
oxidao. Se se suspeita de uma hidrlise incompleta da preparado misturando 9 volumes de cido frmico anidro
protena so efectuados estudos com duraes de hidrlise com 1 volume de soluo a 30 por cento de perxido de
mais longas (por exemplo, 48 h e 72 h). hidrognio e incubando a soluo temperatura ambiente,
Hidrlise em fase de vapor. Trata-se de um dos durante 1 h.
procedimentos de hidrlise cida mais utilizados e
frequentemente utilizada em micro-anlises, quando a Procedimento. Dissolva a amostra proteica/peptdica em
amostra s est disponvel em pequena quantidade. Permite 20 l de cido frmico anidro, aquea a 50C durante 5 min
igualmente reduzir os riscos de contaminao da amostra e adicione 100 l da soluo de oxidao. Deixe decorrer a
com o reagente cido. Coloque os frascos contendo as oxidao durante 10-30 min. Esta reaco converte a cistena

em cido cisteico e a metionina em metionina-sulfona. 15 min para eliminar os resduos dos reagentes. A amostra
Elimine o excesso de reagente por centrifugao a presso piridiletilada pode ento ser submetida hidrlise cida por
reduzida. A protena oxidada pode ento ser submetida um dos mtodos descritos anteriormente. Simultaneamente,
hidrlise seguindo o Mtodo 1 ou o Mtodo 2. Esta tcnica submeta uma protena padro contendo 1-8 mol de cistena
pode causar modificaes nos resduos de tirosina quando reaco de piridiletilao, para melhorar a exactido da
esto presentes halogenetos. recuperao da piridiletilcistena. Tempos de incubao
longos durante a reaco de piridiletilao podem originar
2. Mtodos
Analticos
Mtodo 5 modificaes no grupo -terminal e no grupo -amino da
lisina contida na protena.
Procede-se oxidao da cistena/cistina pelo azeto de sdio
durante a hidrlise em fase lquida.
Mtodo 8
Soluo de hidrlise. Junte a uma soluo de cido clordrico Procede-se reduo-alquilao da cistena/cistina por
6 M, contendo 0,2 por cento de fenol, azeto de sdio at uma piridiletilao em fase lquida.
concentrao final de 2 g/l. A presena de fenol impede a
halogenao da tirosina. Solues-me. Prepare e filtre 3 solues: uma soluo
tampo de tris-cloridrato de pH 8,5 (1 M) contendo 4 mM de
Hidrlise em fase lquida. Proceda hidrlise da amostra edetato dissdico (soluo-me A), uma soluo de cloridrato
proteica/peptdica a cerca de 110C durante 24 h. Durante a de guanidina 8 M (soluo-me B) e uma soluo a 10 por
hidrlise, a cistena/cistina contida na amostra convertida cento de 2-mercaptoetanol (soluo-me C).
em cido cisteico pelo azeto de sdio presente na soluo
de hidrlise. Esta tcnica fornece melhores recuperaes
Soluo redutora. Prepare uma mistura de 3 volumes da
da tirosina do que o Mtodo 4, mas no permite recuperar
soluo-me B e de 1 volume da soluo-me A de forma
quantitativamente a metionina. Esta convertida numa
mistura de metionina original e os seus 2 produtos de a obter uma soluo tamponada a 6 M de cloridrato de
oxidao, a metionina-sulfxido e a metionina-sulfona. guanidina e a 0,25 M de tris-cloridrato.
Mtodo 6 Procedimento. Dissolva cerca de 10 g da protena ou do

peptido a analisar em 50 l da soluo redutora e junte cerca
Procede-se oxidao da cistena/cistina pelo dimetilsulfxido de 2,5 l da soluo-me C. Coloque em atmosfera de azoto
(DMSO). ou de rgon durante 2 h temperatura ambiente e ao abrigo
da luz. Para proceder piridiletilao, junte cerca de 2 ul
Soluo de hidrlise. Junte a uma soluo de cido clordrico de 4-vinilpiridina soluo proteica e incube durante mais
6 M, contendo 0,1 por cento a 1,0 por cento de fenol, 2 h temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Dessalinize
dimetilsulfxido at uma concentrao final de 2 por cento V/V. separando a fraco proteica/peptdica por HPLC em fase
inversa. A amostra recolhida pode ser seca por centrifugao
Hidrlise em fase de vapor. Proceda hidrlise da amostra a presso reduzida antes da hidrlise cida.
proteica/peptdica a cerca de 110C durante 24 h. Durante a
hidrlise, a cistena/cistina contida na amostra convertida Mtodo 9
em cido cisteico pelo dimetilsulfxido presente na soluo
de hidrlise. Para limitar a variabilidade e compensar a Procede-se reduo-alquilao da cistena/cistina por
destruio parcial do cido cisteico, conveniente avaliar a carboximetilao em fase lquida.
recuperao de cido cisteico a partir da hidrlise oxidativa
de protenas padro contendo 1-8 moles de cistena. Os Solues-me. Prepare as solues-me conforme o descrito
factores de resposta dos hidrolisados proteicos/peptdicos no Mtodo 8.
so tipicamente inferiores em cerca de 30 por cento aos
dos padres de cido cisteico no hidrolisados. Como a Soluo de carboximetilao. Prepare uma soluo de
histidina, a metionina, a tirosina e o triptofano tambm so iodoacetamida a 100 g/l em etanol a 96 por cento.
modificados, no possvel efectuar uma anlise completa da
composio por esta tcnica.
Soluo tampo. Utilize a soluo redutora descrita no
Mtodo 8.
Mtodo 7
Procede-se reduo-alquilao da cistena/cistina por Procedimento. Dissolva a amostra proteica/peptdica em
piridiletilao em fase de vapor. 50 l da soluo tampo e junte cerca de 2,5 l da soluo-
-me C. Coloque em atmosfera de azoto ou de rgon durante
Soluo redutora. Introduza num recipiente apropriado 2 h temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Junte a
83,3 l de piridina, 16,7 l de 4-vinilpiridina, 16,7 l de soluo de carboximetilao numa quantidade 1,5 vezes o
tributilfosfina e 83,3 l de gua. Misture. teor terico total em tiis e incube durante mais 30 min
temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Se o teor em
Procedimento. Num tubo de hidrlise, introduza 1-100 g de grupos tiol da protena for desconhecido, junte 5 l de
protena ou peptido a analisar e coloque este tubo num tubo iodoacetamida 100 mM por cada 20 nmol de protena.
maior. Transvaze a soluo redutora para o tubo externo, sele Pare a reaco adicionando 2-mercaptoetanol em excesso.
a presso reduzida (cerca de 50 m de mercrio ou de 6,7 Pa) Dessalinize separando a fraco proteica/peptdica por HPLC
e incube a cerca de 100C durante 5 min. Retire o tubo de em fase inversa. A amostra recolhida pode ser seca por
hidrlise e seque num exsicador, a presso reduzida, durante centrifugao a presso reduzida antes da hidrlise cida.

A 5-(carboxiamidometil)cistena formada convertida em MTODOS DE ANLISE DOS AMINOCIDOS:

5-(carboximetil)cistena durante a hidrlise cida. PRINCPIOS GERAIS
Mtodo 10 Existem numerosas tcnicas de anlise de aminocidos e

a escolha de qualquer uma delas depende muitas vezes da
Faz-se reagir a cistena/cistina com o cido ditiodigliclico
sensibilidade requerida para a anlise. Mais ou menos metade
ou com o cido ditiodipropinico para produzir dissulfuretos
2. Mtodos
das tcnicas de anlise utilizadas baseia-se na separao

Analticos
mistos. A escolha de um ou do outro cido depende da

resoluo requerida para a anlise dos aminocidos. dos aminocidos livres por cromatografia de troca inica,
seguida de uma derivatizao ps-coluna (com ninidrina ou
com o-ftalaldedo, por exemplo). As tcnicas que requerem
Soluo redutora. Soluo de cido ditiodigliclico (ou de derivatizao ps-coluna podem ser utilizadas com amostras
cido ditiodipropinico) a 10 g/l em hidrxido de sdio 0,2 M. contendo pequenas quantidades de tampo (sais e ureia,
por exemplo) e necessitam, geralmente, de 5 a 10 g de
Procedimento. Introduza num tubo de hidrlise cerca de amostra proteica por anlise. As outras tcnicas de anlise
20 g da protena ou do peptido a analisar. Junte 5 l da envolvem, geralmente, uma derivatizao pr-coluna dos
soluo redutora e depois 10 l de lcool isoproplico. Em aminocidos livres (com isotiocianato de fenilo, carbamato
seguida elimine a totalidade da fase lquida por centrifugao de 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo, o-ftalaldedo,
a presso reduzida e proceda hidrlise pelo Mtodo 1. Este cloreto de (dimetialamino)azobenzenossulfonilo,
mtodo tem a vantagem de outros resduos de aminocidos metilcloroformato de 9-fluorenilo, 7-fluoro-4-nitrobenzo-
no serem derivatizados por reaces secundrias e de no -2-oxa-1,3-diazol, etc.) seguida de anlise por HPLC em
exigir a dessalinizao da protena antes da hidrlise. fase inversa. As tcnicas de derivatizao pr-coluna so
muito sensveis, no necessitam mais do que 0,5 a 1,0 g de
Mtodo 11 amostra proteica por anlise, mas podem ser influenciadas
Converte-se a asparagina e a glutamina, respectivamente, pelos sais tampo da amostra. A derivatizao pr-coluna
em cido asprtico e em cido glutmico durante a hidrlise pode, para alm disso, produzir vrios derivados de um dado
cida. Adicionam-se resduos de asparagina e de cido aminocido, o que dificulta a interpretao dos resultados. As
asprtico, representados por Asx. e resduos de glutamina tcnicas de derivatizao ps-coluna so, geralmente, menos
e de cido glutmico, representados por Glx. Pode-se fazer sensveis s variaes inerentes execuo do ensaio.
reagir a amostra proteica/peptdica com bis(1,1- Todos os mtodos seguintes podem ser utilizados para
-trifluoroacetoxi)iodobenzeno (BTI) para converter os a anlise de aminocidos. Os instrumentos e reagentes
resduos de asparagina e de glutamina em resduos de cido requeridos esto disponveis no comrcio. Por outro
diaminopropinico e de cido diaminobutrico durante a lado, so possveis modificaes utilizando reagentes,
hidrlise cida. Estas converses permitem determinar o teor procedimentos e sistemas cromatogrficos diferentes. Certos
em asparagina e em glutamina de uma protena ou de um
parmetros especficos podem variar com o equipamento
peptido na presena de resduos de cido asprtico e de cido
e os procedimentos utilizados. Alguns laboratrios optam
glutmico.
pela execuo paralela de vrias tcnicas de anlise afim
de beneficiar das vantagens de cada uma delas. Em todos
Solues redutoras. Prepare e filtre 3 solues: uma soluo estes mtodos o sinal analgico visualizado atravs de um
10 mM de cido trifluoroactico (soluo A); uma soluo 5 M sistema de aquisio de dados e a quantificao efectuada
de cloridrato de guanidina e 10 mM de cido trifluoroactico pela integrao da rea dos picos cromatogrficos.
(soluo B); uma soluo recentemente preparada de bis(1,1-
-trifluoroacetoxi)iodobenzeno a 36 mg/ml em
dimetilformamida (soluo C). MTODO 1 DERIVATIZAO PS-COLUNA
COM NINIDRINA
Procedimento. Introduza num tubo de hidrlise limpo cerca
de 200 g da protena ou peptido a analisar e junte 2 ml A cromatografia de troca inica com derivatizao ps-
da soluo A ou da soluo B e 2 ml da soluo C. Sele o tubo
-coluna com ninidrina um dos mtodos mais
de hidrlise a presso reduzida. Aquea a 60C durante 4 h
correntemente utilizados para a anlise quantitativa dos
ao abrigo da luz. Proceda de seguida a uma dilise com gua
para eliminar o excesso de reagentes, efectue 3 extraces aminocidos. Regra geral, a anlise de amostras fisiolgicas
sucessivas com volumes iguais de acetato de butilo e complexas realizada com sistemas trocadores de caties
liofilize. A hidrlise cida pode ento ser efectuada por um base de ltio, enquanto que as solues de aminocidos
dos mtodos descritos anteriormente. Os resduos de cido mais simples, obtidas a partir de hidrolisados proteicos
,-diamino-propinico e de cido ,-aminobutrico no (tipicamente compostos por 17 aminocidos), so analisadas
so separados dos resduos de lisina quando a anlise dos com sistemas trocadores de caties base de sdio, mais
aminocidos se fundamenta na cromatografia de troca inica. rpidos. A separao dos aminocidos em coluna trocadora
Assim, quando se utiliza a troca inica como processo de de ies ocorre devido a uma combinao de variaes do pH e
separao, o teor em asparagina e em glutamina obtm-se da fora catinica. Aplica-se frequentemente um gradiente de
por clculo da diferena entre os teores em cido asprtico e temperatura para favorecer a separao.
em cido glutmico obtidos, respectivamente, por hidrlise
cida e por hidrlise cida com derivatizao pelo BTI. Este Os produtos da reaco dos aminocidos com a ninidrina
mtodo de derivatizao pode afectar os resultados obtidos apresentam uma colorao arroxeada ou amarelada
para os teores em treonina, metionina, cistena, tirosina e caracterstica. excepo dos iminocidos, os aminocidos do
histidina. Por isso, necessrio efectuar uma hidrlise sem uma colorao arroxeada com um mximo de absoro em
BTI se se quiser determinar o teor destes resduos na protena 570 nm. Os iminocidos, tais como a prolina, do uma
ou no peptido. colorao amarelada, com um mximo de absoro em 440 nm.

Os produtos da reaco ps-coluna da ninidrina com os significativa. Se a soluo a injectar for mantida a baixa
aminocidos eludos so detectados em 440 nm e 570 nm e temperatura, no se verificam perdas significativas na
o cromatograma obtido utilizado para a determinao da resposta cromatogrfica at 3 dias aps a reaco.
composio em aminocidos. O limite de deteco usual
A separao dos derivados feniltiocarbamilo-aminocido
de 10 pmol para a maior parte dos aminocidos e de 50 pmol
por HPLC em fase inversa numa coluna octadecilsililada
para o derivado da prolina. Obtm-se uma resposta linear
(ODS), ocorre devido a uma combinao de variaes da
para o intervalo 20-500 pmol, com coeficientes de correlao
2. Mtodos
Analticos
concentrao de acetonitrilo e da fora inica do tampo.
superiores a 0,999. Para obter resultados analticos da
Os derivados feniltiocarbamilo-aminocido eluidos so
composio satisfatrios, conveniente utilizar tomadas de
detectados sada da coluna em 254 nm.
ensaio superiores a 1 g.
O limite de deteco usual de 1 pmol para a maior parte
dos derivados feniltiocarbamilo-aminocido. Obtm-se
MTODO 2 DERIVATIZAO PS-COLUNA uma resposta linear para o intervalo de 20-500 pmol,
COM O-FTLALALDEDO (OPA) com coeficientes de correlao superiores a 0,999. Para
obter resultados analticos da composio satisfatrios,
O o-ftalaldedo (OPA) reage com as aminas primrios na conveniente utilizar tomadas de ensaio iniciais (antes da
presena de um tiol para formar produtos isoindlicos hidrlise) superiores a 500 ng de protena ou do peptido.
fortemente fluorescentes. Esta reaco utilizada para
a derivatizao ps-coluna, depois da separao dos
aminocidos por cromatografia de troca inica. O princpio MTODO 4 DERIVATIZAO PR-COLUNA COM
da separao idntico ao do Mtodo 1. CARBAMATO DE 6-AMINOQUINOLIL-N-
-HIDROXISSUCCINIMIDILO (AQC)
O o-ftalaldedo no reage, para formar substncias
fluorescentes, com as animas secundrias (iminocidos como
Procede-se por derivatizao pr-coluna dos aminocidos
a prolina). Porm, a oxidao pelo hipoclorito de sdio ou
com carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo
a cloramina T torna possvel esta reaco. O procedimento
(AQC), seguida de separao por HPLC em fase inversa e
consiste na separao dos aminocidos livres numa coluna
deteco fluorimtrica.
trocadora de caties fortemente cida, seguida de uma oxidao
ps-coluna pelo hipoclorito de sdio ou a cloramina T e O carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo
de uma derivatizao ps-coluna pelo o-ftalaldedo em reage com os aminocidos para formar derivados da ureia,
presena de um tiol, tal como a N-acetil-L-cistena ou o assimtricos e fluorescentes (derivados carbamato de
2-mercaptoetanol. A derivatizao dos aminocidos primrios 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo-aminocido),
no muito afectada pela adio contnua de hipoclorito de estveis e facilmente analisveis por HPLC em fase inversa.
sdio ou da cloramina T. Esta reaco utilizada para a anlise da composio em
aminocidos, procedendo derivatizao pr-coluna com
A separao dos aminocidos em coluna trocadora de ies o carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo,
ocorre devido a uma combinao de variaes do pH e da fora seguida de separao por HPLC em fase inversa e deteco
catinica. Depois da derivatizao ps-coluna dos aminocidos fluorimtrica.
eludos, os derivados o-ftalaldedo-aminocido passam num
detector fluorimtrico que mede a intensidade de fluorescncia A separao dos derivados carbamato de 6-aminoquinolil-N-
num comprimento de onda de excitao de 348 nm e num -hidroxissuccinimidilo-aminocido por HPLC em fase inversa
comprimento de onda de emisso de 450 nm. numa coluna octadecilsililada (ODS) ocorre devido a uma
combinao de variaes da concentrao de acetonitrilo e
O limite de deteco usual da ordem das dezenas de da fora inica do tampo. A deteco fluorimtrica selectiva
picomoles para a maior parte dos derivados o-ftalaldedo- dos derivados, num comprimento de onda de excitao
-aminocido. Obtm-se uma resposta linear para o intervalo de 250 nm e num comprimento de onda de emisso de
de algumas picomoles a algumas dezenas de nanomoles. 395 nm, permite a injeco directa da mistura reaccional
Para obter resultados analticos da composio satisfatrios, sem interferncia significativa do principal subproduto
conveniente utilizar tomadas de ensaio iniciais (antes da fluorescente do reagente, a 6-aminoquinolina. O reagente
hidrlise) superiores a 500 ng de protena ou de peptido. em excesso hidrolisa-se rapidamente (t1/2 < 15 s) em
6-aminoquinolina, N-hidroxissuccinimida e dixido de
carbono, no ocorrendo, aps 1 min, mais derivatizao.
MTODO 3 DERIVATIZAO PR-COLUNA COM
FENILISOTIOCIANATO (PITC) Os derivados aminoquinolil-N-hidroxissuccinimidilo-
-aminocido podem ser conservados durante, pelo menos
O fenilisotiocianato (PITC) reage com os aminocidos para uma semana, temperatura ambiente, sem que a rea dos
formar derivados feniltiocarbamilo (PTC) que podem ser picos correspondentes varie de forma significativa. A sua
detectados, com sensibilidade elevada, em 254 nm. estabilidade permite, assim, a anlise automatizada durante
a noite.
Esta reaco utilizada para a anlise da composio em
O limite de deteco usual de cerca de 40 - 320 fmol para
aminocidos, procedendo derivatizao pr-coluna com o
todos os aminocidos, excepto a cistena, para a qual aumenta
fenilisotiocianato, seguida da separao por HPLC em fase
para cerca de 800 fmol. Obtm-se uma resposta linear para o
inversa e deteco no UV.
intervalo 2,5-200 M, com coeficientes de correlao superiores
Aps eliminar o reagente a presso reduzida, os aminocidos a 0,999. possvel obter resultados analticos da composio
derivatizados podem ser conservados no estado seco e satisfatrios a partir de hidrolisados proteicos derivatizados
congelados, durante vrias semanas, sem haver degradao partindo de apenas 30 ng de protena ou de peptido.

MTODO 5 DERIVATIZAO PR-COLUNA p-toluenossulfnico ou o cido metanossulfnico, como o

COM O-FTALALDEDO(OPA) descrito para a hidrlise da protena ou do peptido no Mtodo
2. Os outros resduos instveis durante a hidrlise cida,
Procede-se por derivatizao pr-coluna dos aminocidos como a asparagina e a glutamina, podem ser igualmente
com o-ftalaldedo, seguida de separao por HPLC em fase analisados depois de previamente convertidos nos cidos
inversa e deteco fluorimtrica. Esta tcnica no permite diaminopropinico e diaminobutrico, respectivamente, por
a deteco dos aminocidos que so aminas secundrias tratamento da protena ou do peptido com bis(1,1-
2. Mtodos
Analticos
(prolina, por exemplo). -trifluoroacetoxi)iodobenzeno, como o descrito na hidrlise

da protena no Mtodo 11.
O o-ftalaldedo reage com as aminas primrias na presena
de um tiol para formar produtos isoindlicos fortemente O aminocido no proteinognico, norleucina, no pode ser
fluorescentes. O tiol utilizado como reagente pode ser o utilizado como padro interno neste mtodo, uma vez que
2-mercaptoetanol ou o cido 3-mercaptopropinico. O elui na mesma regio do cromatograma em que surgem os
o-ftalaldedo no fluorescente, pelo que no origina picos aminocidos primrios. A nitrotirosina pode ser usada como
interferentes. Para alm disso, a sua solubilidade, a sua padro interno pois elui numa zona em que no aparecem
estabilidade em soluo aquosa e a cintica rpida da reaco outros picos cromatogrficos.
fazem com que seja adequado derivatizao e anlise O limite de deteco dos derivados (dimetilamino)-
automatizadas utilizando um dispositivo automtico para azobenzenossulfonilo-aminocido cerca de 1 pmol. Podem
misturar a amostra e o reagente. A ausncia de reactividade ser analisadas de forma quantitativa e fivel quantidades
com os aminocidos secundrios constitui a principal da ordem de 2 a 5 pmol de cada derivado (dimetilamino)-
desvantagem do mtodo, no permitindo a deteco dos azobenzenossulfonilo-aminocido e, para cada anlise,
aminocidos que so aminas secundrias (a prolina, por suficiente dispor de 10 a 30 ng de hidrolisado proteico tratado
exemplo). Para compensar esta desvantagem pode-se combinar com cloreto de (dimetilamino)azobenzenossulfonilo.
esta tcnica com as descritas no Mtodo 7 ou no Mtodo 8.
A derivatizao pr-coluna seguida por uma separao por
HPLC em fase inversa. Devido instabilidade dos derivados MTODO 7 DERIVATIZAO PR-COLUNA COM
o-ftalaldedo-aminocido, a separao e a anlise por HPLC CLOROFORMATO DE 9-FLUORENILMETILO (FMOC-Cl)
so efectuadas imediatamente aps a derivatizao. O
cromatgrafo est equipado com um detector fluorimtrico Procede-se por derivatizao pr-coluna dos aminocidos
que permite a deteco dos aminocidos derivatizados. A com cloroformato de 9-fluorenilmetilo seguida de separao
intensidade de fluorescncia dos derivados o-ftalaldedo- por HPLC em fase inversa e deteco fluorimtrica.
aminocido medida a um comprimento de onda de
O cloroformato de 9-fluorenilmetilo reage com os aminocidos
excitao de 348 nm e a um comprimento de onda de
primrios e secundrios para formar produtos fortemente
emisso de 450 nm.
fluorescentes. A reaco cloroformato de 9-fluorenilmetilo-
Esto descritos limites de deteco fluorimtrica de apenas aminocido decorre em condies suaves, em soluo aquosa
50 fmol, embora o limite de deteco na prtica seja de 1 pmol. e est completa ao fim de 30 s. Os derivados so estveis,
com excepo da histidina que pode sofrer degradao. O
reagente fluorescente, mas possvel eliminar o seu excesso
MTODO 6 DERIVATIZAO PR-COLUNA COM e os subprodutos fluorescentes sem haver perda de derivados
CLORETO DE (DIMETILAMINO)AZOBENZENOSSULFONILO cloroformato de 9-fluorenilmetiloaminocido.
Os derivados cloroformato de 9-fluorenilmetilo-aminocido
Procede-se por derivatizao pr-coluna dos aminocidos so separados por HPLC em fase inversa, numa coluna
com cloreto de (dimetilamino)azobenzenossulfonilo seguida octadecilsililada (ODS). A separao ocorre usando um
de separao por HPLC em fase inversa e deteco no visvel. gradiente linear de eluio, que se inicia com uma mistura
O cloreto de (dimetilamino)azobenzenossulfonilo um de 10 volumes de acetonitrilo, 40 volumes de metanol e 50
reagente cromofrico utilizado para a marcao dos volumes de cido actico e termina com uma mistura de 50
aminocidos. Os aminocidos marcados com o cloreto volumes de acetonitrilo e 50 volumes de cido actico. Nestas
de (dimetilamino)azobenzenossulfonilo (derivados condies possvel separar 20 derivados de aminocidos
(dimetilamino)azobenzenossulfoniloaminocido) so muito em 20 min. Cada um dos derivados eludos analisado
estveis e tm um mximo de absoro em 436 nm. sada da coluna por um detector fluorimtrico, regulado
para um comprimento de onda de excitao de 260 nm e um
Os derivados (dimetilamino)azobenzenossulfonilo- comprimento de onda de emisso de 313 nm.
-aminocido, provenientes dos 19 aminocidos naturais
podem ser separados por HPLC em fase inversa, numa coluna O limite de deteco da ordem dos fmol. O intervalo
octadecilsililada (ODS) usando um gradiente de eluio de de linearidade de 0,1-50 M para a maior parte dos
acetonitrilo e de tampo aquoso. Os derivados (dimetilamino) aminocidos.
azobenzenossulfonilo-aminocido eludos so detectados
sada da coluna, no visvel, em 436 nm.
MTODO 8 DERIVATIZAO PR-COLUNA COM
Este mtodo permite a anlise dos iminocidos, tais
7-FLUORO-4-NITROBENZ-2-OXA-1,3-DIAZOL (NBD-F)
como a prolina e outros aminocidos do mesmo nvel
de sensibilidade, e a derivatizao com cloreto de
Procede-se por derivatizao pr-coluna dos aminocidos
(dimetilamino)-azobenzenossulfonilo permite tambm
com 7-fluoro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol seguida de
a quantificao simultnea dos resduos triptofano
separao por HPLC em fase inversa e deteco fluorimtrica.
hidrolisando previamente a protena ou o peptido com cidos
sulfnicos, tais como o cido mercatoetanossulfnico, o cido O 7-fluoro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol reage com os

aminocidos primrios e secundrios para formar produtos Amostras proteicas desconhecidas. Este mtodo de anlise
fortemente fluorescentes. A derivatizao efectuada a 60C dos dados experimentais pode ser utilizado para avaliar
durante 5 min. a concentrao em protena de uma amostra proteica
desconhecida. Calcule a massa, em microgramas, de cada um
Os derivados 7-fluoro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-amino-
dos aminocidos recuperados com ajuda da frmula
cido so separados por HPLC em fase inversa, numa coluna
octadecilsililada (ODS), por um gradiente de eluio numa
m Mr / 1000
2. Mtodos
Analticos
mistura de acetonitrilo e de tampo aquoso. Desta forma
separam-se 17 derivados de aminocidos em 35 min. O cido
em que m a quantidade recuperada do aminocido em
-aminocaprico pode ser utilizado como padro interno
ensaio, em nanomoles, e Mr a massa molecular mdia
pois elui numa zona em que no aparecem outros picos
deste aminocido, diminuda da massa da molcula de
cromatogrficos. Cada um dos derivados eluidos analisado
gua que eliminada durante a formao da ligao
sada da coluna por um detector fluorimtrico regulado
peptdica. A soma das massas assim obtidas para os
para um comprimento de onda de excitao de 480 nm e um diferentes aminocidos, depois de aplicadas as correces
comprimento de onda de emisso de 530 nm. necessrias para ter em conta a destruio completa
A sensibilidade deste mtodo equivalente do mtodo de ou parcial de alguns aminocidos, d uma estimativa
derivatizao pr-coluna com o-ftalaldedo (Mtodo 5) excepto da massa total da protena analisada. Se for possvel
para a prolina que no reage com o o-ftalaldedo, o que se traduz determinar a massa molecular da protena desconhecida
numa vantagem da derivatizao com 7-fluoro-4-nitrobenz-2- (por SDS-PAGE ou espectrometria de massa), tambm
-oxa-1,3-diazol. O limite de deteco cerca de 10 fmol para cada possvel prever a sua composio em aminocidos. Calcule
aminocido. Uma anlise de perfil pode ser realizada com cerca de o nmero de resduos de cada aminocido com ajuda da
1,5 mg de hidrolisado proteico na mistura reagente pr-coluna. frmula
m / (1000 M / Mrt)
CLCULO E ANLISE DOS DADOS
em que m a quantidade recuperada do aminocido
necessrio ter em conta que, durante a determinao do considerado, em nanomoles, M a massa total da protena,
teor em aminocidos de um hidrolisado proteico/peptdico, em microgramas, e Mrt a massa molecular da protena
a etapa de hidrlise cida provoca a destruio do triptofano desconhecida.
e da cistena. A serina e a treonina tambm so parcialmente
destrudas e os resduos de isoleucina e de valina podem Amostras proteicas conhecidas. Este mtodo de anlise
sofrer clivagem apenas parcial. A metionina pode sofrer dos dados experimentais pode ser utilizado para verificar a
oxidao e tambm frequente haver contaminao com composio em aminocidos e determinar a concentrao
certos aminocidos como a glicina e a serina. A utilizao em protena de uma amostra proteica de massa molecular
de uma presso reduzida adequada (menos de 200 m de e composio em aminocidos conhecidas. Conhecendo a
mercrio ou de 26,7 Pa) ou a introduo de um gs inerte composio da protena a analisar, pode utilizar-se o facto
(rgon) na parte superior do recipiente onde decorre a de que certos aminocidos do boas recuperaes, enquanto
reaco de hidrlise em fase de vapor podem limitar a que a recuperao de outros pode ser afectada pela destruio
destruio por oxidao. Assim, os resultados quantitativos total ou parcial (triptofano, cistena, treonina, serina,
obtidos a partir de um hidrolisado proteico/peptdico para metionina, por exemplo), pela clivagem incompleta das
a cistena, o triptofano, a treonina, a isoleucina, a valina, ligaes peptdicas (isoleucina e valina, por exemplo) ou pela
a metionina, a glicina e a serina podem ser variveis e contaminao por aminocidos livres (glicina e serina, por
requererem um estudo mais apurado. exemplo).
Como os aminocidos que so melhor recuperados so os
Percentagem molar de um aminocido. Corresponde ao mais representativos da protena, a quantificao baseia-
nmero de resduos especficos de um dado aminocido -se nestes aminocidos. Tipicamente so o aspartato/
por 100 resduos presentes na protena. O clculo desta /asparagina, o glutamato/glutamina, a alanina, a leucina,
percentagem pode ser til para avaliar os resultados de a fenilalanina, a lisina e a arginina, mas esta lista pode ser
uma anlise de aminocidos quando a massa molecular da modificada de acordo com a experincia adquirida com
protena em estudo desconhecida. Esta informao pode ser um determinado sistema de anlise. Divida a quantidade,
utilizada para confirmar a identidade de uma protena ou de em nanomoles, de cada um dos aminocidos com boa
um peptido e ainda pode ter outras aplicaes. Identifique e recuperao pelo nmero de resduos esperado para este
integre cuidadosamente os picos dos cromatogramas obtidos aminocido, afim de obter o teor em protena tendo como
de acordo com cada um dos mtodos e calcule a percentagem base os aminocidos que apresentam boas recuperaes.
molar de cada um dos aminocidos presentes na amostra Calcule a mdia dos teores em protena assim calculados.
com ajuda da frmula Os teores em protena obtidos a partir de cada aminocido
com boa recuperao devem apresentar uma distribuio
100 ru / r uniforme volta desta mdia. Rejeite os teores individuais
que apresentam um desvio mdia que no seja aceitvel.
em que ru a resposta, em nanomoles, obtida para cada Considera-se, geralmente, como no sendo aceitvel um
aminocido considerado e r a soma, em nanomoles, das desvio superior a 5 por cento. Recalcule o teor mdio em
respostas obtidas para o conjunto dos aminocidos presentes protena a partir dos valores restantes para obter o teor em
na amostra. A comparao das percentagens molares assim protena da amostra. Divida o teor de cada aminocido pelo
obtidas pode ajudar a estabelecer ou a confirmar a identidade teor mdio em protena assim calculado para obter uma
da amostra proteica. estimativa da composio em aminocidos da amostra.

2.2.57. Espectrofotometria de emisso atmica com plasma de acoplamento indutivo (icp-aes)
Calcule o erro relativo da composio, em percentagem, com e acelerados pelo campo magntico. A adio de energia aos
ajuda da frmula: electres por intermdio da bobina chama-se acoplamento
indutivo. Os electres carregados de energia entram, por sua
100 m / ms vez, em coliso com outros tomos do gs plasmognico, aos
quais so arrancados outros electres. A ionizao por coliso
em que m a quantidade de aminocido em ensaio produz, assim, uma reaco em cadeia e transforma o gs
determinada experimentalmente, em nanomoles por resduo num plasma fsico composto por uma mistura de electres,
2. Mtodos
Analticos
ms o valor do resduo conhecido para este aminocido. O tomos e ies desse gs. O plasma , ento, mantido na tocha
erro relativo mdio da composio a mdia dos valores e na bobina de induo, graas alimentao contnua de
absolutos dos erros de composio relativos dos aminocidos energia pela potncia de radiofrequncia, de acordo com o
individuais, com excepo do triptofano e da cistena que processo de acoplamento indutivo.
normalmente so excludos nestes clculos. O erro relativo
O plasma tem a forma de penacho, de aspecto muito intenso
mdio da composio pode fornecer informaes importantes
e brilhante. sua base, de forma toroidal, chama-se regio de
sobre a estabilidade no tempo em que decorre a anlise. A
induo (IR), porque a regio em que a energia indutiva
comparao da composio em aminocidos obtida para
transferida da bobina para o plasma. A amostra introduzida
a protena a analisar e a composio em aminocidos
no seio do plasma atravs da regio de induo.
conhecida pode ser utilizada para confirmar a identidade e/ou
a pureza da protena contida na amostra.
APARELHAGEM
A aparelhagem consiste, essencialmente, nos elementos

2.2.57. ESPECTROFOTOMETRIA seguintes:
DE EMISSO ATMICA COM PLASMA
um sistema de introduo das amostras constitudo por
DE ACOPLAMENTO INDUTIVO (ICP-AES) uma bomba peristltica que fornece a soluo a caudal
constante a um nebulizador,
A espectrometria de emisso atmica com plasma
um gerador de radiofrequncia (RF),
de acoplamento indutivo (ICP-AES) um mtodo de
espectrometria de emisso atmica (AES) que usa um plasma uma tocha,
acoplado indutivamente (ICP inductively coupled plasma) um sistema ptico de transferncia de radiao que
como fonte de ionizao. assegure a focalizao de imagem do plasma sobre a fenda
de entrada do espectrmetro. A viso radial prefervel
O plasma acoplado indutivamente um gs inerte para matrizes complexas (alcalinas, orgnicas); a viso axial
(geralmente, rgon) num estado altamente ionizado, com um d maior intensidade e melhores limites de deteco para
nmero igual de electres e de ies, mantido por um campo matrizes simples,
de radiofrequncia (RF). As altas temperaturas atingidas no
interior do plasma levam os tomos presentes na amostra, sistemas dispersivos de comprimentos de onda constitudos
por redes de difraco, prismas, filtros ou interfermetros,
sucessivamente, dessolvatao, vaporizao, excitao
detectada por espectrometria de emisso atmica (AES) detectores que convertam a energia do raio em energia
e ionizao detectada por espectrometria de massa (MS). elctrica,
Os limites de deteco so, em geral da ordem de alguns uma unidade de aquisio de dados.
nanogramas (em ICP-MS) a alguns microgramas (em ICP-
AES) por litro.
INTERFERNCIAS
A formao do plasma resulta da passagem de um fluxo
tangencial do gs plasmognico atravs de uma tocha,
Interferncia qualquer fenmeno que ocorre quando um
sistema composto por 3 tubos concntricos de quartzo, com
analito produz sinais diferentes conforme est contido, com
entradas independentes. A extremidade da tocha envolvida
idntica concentrao, numa amostra ou numa soluo
por uma bobina de induo em metal, ligada a um gerador de
de calibrao. As interferncias qumicas mais vulgares
radiofrequncia. A potncia (geralmente de 700-1500 W)
em espectrometria de absoro atmica tm, geralmente,
aplicada bobina, gera um campo magntico oscilante
pouca importncia em ICP-AES. Nos raros casos em que
correspondente frequncia do gerador (geralmente
tais interferncias so observadas, pode ser necessrio, para
27 MHz a 40 MHz). O plasma forma-se quando o gs as eliminar, aumentar a potncia da radiofrequncia ou
plasmognico se torna condutor por aplicao de uma reduzir o dbito do fluxo gasoso no tubo interno da tocha. As
descarga elctrica que produz electres e ies-semente. O interferncias que se podem observar em IPC-AES so ou de
campo magntico induzido confina as partculas com carga origem espectral ou resultantes da forte concentrao
(electres e ies) a um percurso anelar fechado. Quando de certos elementos ou constituintes da matriz. As
encontram resistncias, produz-se aquecimento, que conduz interferncias fsicas (devidas a diferenas de viscosidade
a uma ionizao suplementar. O processo ocorre quase e de tenso de superfcie entre a amostra e as solues de
instantaneamente e o plasma atinge rapidamente o seu pleno calibrao) podem ser reduzidas por diluio da amostra,
desenvolvimento em potncia e dimenses. A oscilao da ajustamento da matriz, utilizao de padres internos ou
potncia de radiofrequncia aplicada bobina cria, na zona aplicao do mtodo das adies sucessivas.
situada sada da tocha, campos elctrico e magntico de Outro tipo de interferncias que, por vezes se observa em
radiofrequncia. Se uma fasca (produzida por uma bobina ICP-AES, o efeito devido a elementos facilmente ionizveis
de Tesla ou qualquer outro dispositivo capaz de semear (EIE easily ionised elements), isto , elementos como
electres) aplicada ao fluxo gasoso que atravessa a tocha, os metais alcalinos ou os alcalino-terrosos cuja passagem
alguns electres so arrancados dos tomos do gs, captados ao estado ionizado particularmente fcil. Nas amostras

2.2.57. Espectrofotometria de emisso atmica com plasma de acoplamento indutivo (icp-aes)
que contm altas concentraes de EIE (superior a 0,1 por nebulizadores de fluxo cruzado, combinados com uma
cento) pode ocorrer uma supresso ou, pelo contrrio, uma cmara de nebulizao e uma tocha, respondem maioria
amplificao do sinal da emisso. dos requisitos. As bombas peristlticas em ICP-AES libertam,
habitualmente, as solues com um dbito da ordem de
Interferncias espectrais. Estas interferncias podem ser 1 ml//min ou menor.
devidas presena de linhas interferentes ou a alteraes Quando se utilizam solventes orgnicos deve ser considerada
na intensidade do rudo de fundo. As linhas interferentes a introduo de oxignio, de modo a evitar a formao de
2. Mtodos
Analticos
podem corresponder ao rgon (acima de 300 nm), a bandas fases orgnicas.
de HO devidas decomposio da gua (a cerca de 300 nm),
a bandas de NO devidas interaco do plasma com o ar
ambiente (entre 200 nm e 300 nm), ou a outros elementos ESCOLHA DAS CONDIES OPERATRIAS
presentes na amostra, sobretudo se em concentrao elevada.
As interferncias espectrais correspondem a 4 grandes conveniente trabalhar nas condies padronizadas e
categorias: variao contnua do rudo de fundo, recuperao prescritas pelo fabricante do equipamento. Regra geral,
parcial do rudo de fundo, recuperao total do rudo de utilizam-se condies diferentes para solues aquosas e para
fundo e variao complexa do rudo de fundo. solues orgnicas. Os parmetros operatrios devem ser
escolhidos de forma adequada:
Interferncias de absoro. Verifica-se interferncia seleco dos comprimentos de onda,
de absoro quando uma parte da emisso do analito
absorvida antes de atingir o detector. Este efeito observado dbito do gs plasmognico (tubos externo, mdio e
particularmente quando a concentrao de um elemento interno da tocha),
fortemente emissor to elevada que os tomos ou ies deste
elemento, que se encontram no mais baixo nvel de energia, potncia da radiofrequncia,
absorvem uma quantidade significativa da radiao emitida posio de viso (radial ou axial),
pelas espcies no estado excitado. Este efeito, designado
de auto-absoro, marca o limite superior do intervalo de velocidade da bomba,
linearidade para um determinado raio de emisso. condies aplicveis ao detector (ganho/tenso para os
tubos detectores fotomultiplicadores, outras condies
Anlise espectral multicomposta. A anlise de vrias linhas para detectores estado slido),
de emisso uma tcnica correntemente utilizada para
resolver o problema das interferncias espectrais. Um outro intervalo de tempo de integrao (tempo fixado para
mtodo de correco destas interferncias, mais correcto e a determinao da intensidade de emisso em cada
exacto, consiste em submeter a informao fornecida pelos comprimento de onda).
sistemas de deteco a uma tcnica de anlise espectral
multicomposta que quantifica no s a interferncia, mas CONTROLO DO FUNCIONAMENTO DO APARELHO
tambm a contribuio da matriz para o rudo de fundo e,
por outro lado, cria uma frmula de correco. A anlise Conformidade do sistema
espectral multicomposta utiliza um modelo de ajustamento
preciso (mtodo dos mnimos quadrados) mltiplo que se Os seguintes ensaios, efectuados com uma soluo padro
baseia na anlise do analito puro, da matriz e do branco multi-elementar, permitem verificar a adequabilidade das
e na criao de um modelo matemtico de correco da capacidades do equipamento do sistema ICP-AES:
interferncia. Isto permite determinar a emisso do analito
transferncia de energia (gerador, tocha, plasma):
numa matriz complexa com uma sensibilidade de deteco e
uma exactido acrescidas. utilizao, por exemplo, da determinao da relao
Mg II (280,270 nm)/Mg I (285,213 nm),
transferncia da amostra: verificao da eficcia e da
MODO OPERATRIO estabilidade de nebulizao,
PREPARAO E INTRODUO DAS AMOSTRAS resoluo (sistema ptico): determinao da largura dos
picos a meia altura, por exemplo, para As (189,042 nm),
A preparao das amostras obedece a 2 objectivos fundamentais: Mn (257,610 nm), Cu (324,754 nm) ou Ba (455,403 nm),
a concentrao do analito deve situar-se dentro do intervalo capacidades analticas : clculo do limite de deteco
de anlise do equipamento, recorrendo para o efeito a
de vrios elementos seleccionados, no intervalo de
diluio ou a pr-concentrao, e a soluo da amostra deve
comprimentos de onda.
poder ser nebulizada de modo reprodutvel.
Alguns sistemas de introduo das amostras toleram
concentraes de cidos elevadas, mas o emprego de
cido sulfrico ou de cido fosfrico pode contribuir para VALIDAO DO MTODO
o rudo de fundo observado nos espectros ICP. Por isso
prefervel utilizar cido ntrico ou cido clordrico. Existem A satisfao das capacidades dos mtodos prescritos
ainda sistemas de introduo das amostras e tochas (por nas monografias so verificadas a intervalos de tempo
exemplo, constitudos por polmero de alcxido perfluorado) apropriados.
resistentes ao cido fluordrico, possibilitando a utilizao
deste cido. Na seleco de um processo de introduo LINEARIDADE
das amostras devem ser considerados diversos requisitos:
sensibilidade, estabilidade, caudal, tamanho da amostra, Prepare e analise, no mnimo, 4 solues de referncia
resistncia corroso, resistncia ao entupimento. Os com concentraes que cubram o intervalo de calibrao

2.2.58. Espectrometria de massa com plasma de acoplamento indutivo (icp-ms)
e uma soluo em branco. Repita a anlise 5 vezes, no emisso atmica com plasma de acoplamento indutivo
mnimo. Construa a curva de calibrao usando o mtodo (ICP-AES).
dos mnimos quadrados a partir do conjunto dos valores
Em ICP-MS, utilizada a capacidade do ICP para gerar ies
determinados. Represente graficamente a curva de regresso, carregados a partir de espcies qumicas presentes numa
as mdias, os valores determinados e o intervalo de confiana amostra contendo o elemento em estudo. Esses ies so de
da curva de calibrao. O mtodo s vlido se: seguida dirigidos para um espectrmetro de massa que se
2. Mtodos
Analticos
o coeficiente de correlao for igual ou superior a 0,99, comporta como um filtro de massa e os separa em funo
da razo massa/carga (m/z). Para essa separao, a maior
os resduos obtidos para cada valor de concentrao de parte dos espectrmetros de massa utiliza um quadripolo ou
calibrao apresentarem uma distribuio aleatria volta um sector magntico. Os ies so transportados do plasma
da curva de calibrao. para a ptica inica atravs de uma interface constituda
por 2 cones (amostrador e coador (skimmer)). A ptica
Calcule a mdia e o desvio padro relativo para as inica constituda por uma lente electrosttica, que
concentraes mais baixa e mais alta do intervalo de dirige os ies de uma zona presso atmosfrica para o
calibrao. filtro de massa, que se encontra a presso muito reduzida,
Se a relao entre os desvios padro calculados para as de 10-8 Pa ou menos, mantida custa de uma bomba
concentraes de calibrao mais baixa e mais alta for turbomolecular. Aps filtrao, os ies que possuem a razo
massa/carga seleccionada so dirigidos para um detector
inferior a 0,5 ou superior a 2,0, pode obter-se uma avaliao
(canal electromultiplicador, gaiola de Faraday, multiplicador
mais precisa da curva de calibrao por regresso linear
de dodos), que converte as correntes inicas em sinais
ponderada. As funes de ponderao de 1 e 2 graus so
elctricos. A quantificao do elemento efectuada com base
aplicadas aos dados para determinar a funo de ponderao no nmero de ies que chegam ao detector e geram impulsos
mais apropriada. elctricos por unidade de tempo.
Se as mdias resultarem numa curva de calibrao no linear, O sistema de introduo das amostras e as tcnicas de
utilizada uma regresso linear bidimensional. tratamento dos dados que se utilizam em ICP-AES so
tambm utilizados em ICP-MS.
EXACTIDO
Verifique a exactido usando, de preferncia, um material APARELHAGEM

de referncia certificado (CRM - certified raw material). Em
caso de impossibilidade, efectue um ensaio de recuperao. A aparelhagem consiste essencialmente nos elementos
seguintes:
Recuperao. Para os doseamentos, deve obter-se um um sistema de introduo das amostras constitudo por
valor de recuperao de 90 por cento a 110 por cento. Para uma bomba peristltica que fornece a soluo a caudal
outras determinaes, como por exemplo a determinao constante a um nebulizador,
de vestgios de elementos, o ensaio s vlido se o valor um gerador de radiofrequncia (RF),
de recuperao se situar no intervalo de 80 por cento a
120 por cento do valor terico. A recuperao pode ser uma tocha,
determinada com uma soluo de referncia apropriada uma zona de interface que inclui os cones que asseguram o
(matriz) adicionada de uma quantidade conhecida do analito transporte dos ies para a ptica inica,
(intervalo de concentrao apropriado amostra a analisar).
um espectrmetro de massa,
um detector,
REPETIBILIDADE
uma unidade de aquisio de dados.
A repetibilidade , no mximo, de 3 por cento para um
doseamento e de 5 por cento para um ensaio de pureza.
INTERFERNCIAS
LIMITE DE QUANTIFICAO O principal problema em ICP-MS a interferncia de
massa causada por espcies isobricas que se sobrepem
Verifique que o limite de quantificao (determinado, significativamente ao sinal de massa dos ies em anlise,
por exemplo, pela aproximao 10 ) inferior ao valor a especialmente na regio central do intervalo de massas
determinar. (4O-8O u.m.a.). A combinao de vrios ies atmicos produz
interferncias poliatmicas ou moleculares (por exemplo,
40Ar16O com 56Fe ou 40Ar40Ar com 80Se). Com certos analitos
2.2.58. ESPECTROMETRIA DE MASSA podem tambm ocorrer interferncias causadas pela matriz.
A composio das amostras pode ter impacto por afectar a
COM PLASMA DE ACOPLAMENTO formao de gotculas ou a temperatura do plasma. Estes
INDUTIVO (ICP-MS) fenmenos podem levar supresso do sinal analtico.
possvel evitar as interferncias fisicas utilizando um padro
A espectrometria de massa com plasma de acoplamento interno ou o mtodo das adies de padro. O elemento
indutivo (ICP-MS) um mtodo de espectrometria de massa utilizado como padro interno depende do elemento a
que usa um plasma acoplado indutivamente (ICP) como fonte dosear. Elementos como o 59Co e o 115In so frequentemente
de ionizao. Os princpios bsicos da formao de um ICP utilizados como padres internos. O aspecto principal dos
esto descritos no captulo 2.2.57 sobre espectrometria de instrumentos ICP-MS a sua capacidade de resoluo, ou

seja, a eficcia que demonstram na separao de 2 massas isobricas e interferncias devidas a ies poliatmicos de
vizinhas. Os analisadores quadripolares so, neste aspecto, diferentes tipos (hidretos, xidos, cloretos, etc).
inferiores aos analisadores com sector magntico.
CONTROLO DO FUNCIONAMENTO DO APARELHO

MODO OPERATRIO
Conformidade do sistema
2. Mtodos
Analticos
PREPARAO E INTRODUO DAS AMOSTRAS A regulao do aparelho permite verificar e ajustar as
condies de medio antes da anlise das amostras. A
A preparao das amostras inclui habitualmente uma etapa exactido das massas em ICP-MS verificada recorrendo a
de digesto da matriz recorrendo a um procedimento uma soluo contendo vrios istopos que cobrem toda a
apropriado, por exemplo num forno de micro-ondas. gama de massas, por exemplo 9Be, 59Co, 89Y, 115In, 140Ce e
Para alm disso, necessrio garantir que a concentrao 209Bi.
do analito se situe na gama de anlise do equipamento,
recorrendo para o efeito a diluies ou a pr-concentrao, A sensibilidade e a estabilidade a curto e a longo prazo
e ainda que as solues possam ser nebulizadas de modo so registadas. Os parmetros instrumentais (condies
reprodutvel. do plasma, lentes inicas e parmetros do quadripolo) so
optimizados de modo a obter o nmero de contagens mais
Alguns sistemas de introduo das amostras toleram elevado possvel.
concentraes de cidos elevadas, mas o emprego de cido
sulfrico ou de cido fosfrico pode contribuir para o Os ajustes da resoluo e do eixo das massas efectuado
com uma soluo de Li, Y e Tl, de forma a garantir uma
rudo de fundo. por isso prefervel utilizar cido ntrico
resposta aceitvel num grande intervalo de massas.
ou clordrico. Existem ainda sistemas de introduo das
amostras e tochas (por exemplo, constitudos por polmero A eficincia do plasma para decompor xidos avaliada
de alcxido perfluorado) resistentes ao cido fluordrico, para minimizar essas interferncias. A razo Ce/CeO e/ou
possibilitando a utilizao deste cido. Na seleco de um Ba/BaO, um bom indicador e menor do que 3 por cento.
processo de introduo das amostras devem ser considerados
A diminuio da formao de ies duplamente carregados
diversos requisitos: sensibilidade, estabilidade, caudal, feita com Ba e Ce. A razo dos sinais do io duplamente
tamanho da amostra, resistncia corroso, resistncia ao carregado e do elemento em causa menor do que 2 por
entupimento. Os nebulizadores de fluxo cruzado combinados cento.
com uma cmara de nebulizao e uma tocha respondem
maioria destes requisitos. As bombas peristlticas fornecem A estabilidade a longo prazo avaliada pela introduo de
habitualmente caudais de 20-1000 l/min das solues. um padro no incio e no fim de uma srie de medies
Quando se utilizam solventes orgnicos, deve ser considerada com as amostras, verificando se o depsito de sais nos
a introduo de oxignio, de modo a evitar a formao de cones no conduziu a uma diminuio progressiva do sinal.
fases orgnicas.
VALIDAO DO MTODO
ESCOLHA DAS CONDIES DE OPERAO
O desempenho adequado dos mtodos prescritos nas
E conveniente trabalhar nas condies padronizadas e monografias verificado a intervalos de tempo apropriados.
prescritas pelo fabricante do equipamento. Regra geral,
utilizam-se condies diferentes para solues aquosas e
para solues orgnicas. Os parmetros de procedimento que LINEARIDADE
devem ser escolhidos de forma adequada so
Prepare e analise, no mnimo, 4 solues de referncia com
seleco dos cones (material que constitui o amostrador e o
concentraes que cubram o intervalo de calibrao e uma
coador (skimmer)),
soluo em branco. Repita a anlise 5 vezes, no mnimo.
caudal do gs plasmognico (tubos externo, mediano e
Construa a curva de calibrao usando o mtodo dos
interno da tocha),
mnimos quadrados a partir do conjunto dos valores
potncia da radiofrequncia, medidos. Represente graficamente a curva de regresso, as
mdias, os valores determinados e o intervalo de confiana
velocidade da bomba, da curva de calibrao. O mtodo s vlido se:
seleco de um ou mais istopo(s) do elemento a medir o coeficiente de correlao for igual ou superior a 0,99,
(massa).
os resduos obtidos para cada valor de concentrao de
calibrao apresentarem uma distribuio aleatria volta
SELECO DOS ISTOPOS da curva de calibrao.
Calcule a mdia e o coeficiente de variao para as
A seleco dos istopos feita com base em diversos critrios.
concentraes mais baixa e mais alta do intervalo de
Para obter a sensibilidade mxima seleccionado o istopo
calibrao.
mais abundante de um determinado elemento. Alm disso, deve
ser seleccionado o istopo que apresentar menor interferncia Se a relao entre os desvios padro calculados para as
com outras espcies presentes na matriz da amostra ou no gs concentraes mais baixa e mais alta da calibrao for
plasmognico. Nos programas informticos que acompanham inferior a 0,5 ou superior a 2,0, pode obter-se uma avaliao
o equipamento ICP-MS podem encontrar-se habitualmente mais precisa da curva de calibrao por regresso linear
informaes fornecidas pelos fabricantes sobre as interferncias ponderada. As funes de ponderao do l e 2 graus so

aplicadas aos dados para determinar a funo de ponderao situar no intervalo de 80 por cento a 120 por cento do valor
mais apropriada. terico. A recuperao pode ser determinada com uma soluo
de referncia apropriada (matriz) adicionada de uma quantidade
Se as mdias resultarem numa curva de calibrao no linear,
utilizada uma regresso linear bidimensional. conhecida do analito (intervalo de concentrao apropriado
amostra a analisar).
EXACTIDO
2. Mtodos
Analticos
REPETIBILIDADE
Verifique a exactido usando, de preferncia, um material de
referncia certificado (CRM, certified raw material). Em caso A repetibilidade , no mximo, de 3 por cento para um
de impossibilidade, efectue um ensaio de recuperao. doseamento e de 5 por cento para um ensaio de pureza.
Recuperao. Para os doseamentos, deve obter-se um valor LIMITE DE QUANTIFICAO

de recuperao de 90 por cento 110 por cento. Para outras
determinaes, como por exemplo a determinao vestgios Verifique que o limite de quantificao (determinado, por
de elementos, o ensaio s vlido se o valor de recuperao se exemplo, pela aproximao 10 ) inferior ao valor a determinar.

2.3. IDENTIFICAO
2.3. Identificao 115 2.3.3. Identificao de fenotiazinas por
2. Mtodos
2.3.1. Identificao dos ies e dos grupos cromatografia em camada fina 119
Analticos
funcionais 115 2.3.4. Cheiro 119
2.3.2. Identificao dos leos gordos por
cromatografia em camada fina 118

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.3 IDENTIFICAO (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.3 IDENTIFICAO (NDICE)
2.3.1. Identificao dos ies e dos grupos funcionais
2.3. IDENTIFICAO AMINAS PRIMRIAS AROMTICAS

Acidule a soluo prescrita com cido clordrico diludo R e
junte 0,2 ml de soluo de nitrito de sdio R. Aps 1 a 2 min,
2.3.1. IDENTIFICAO DOS IES junte 1 ml de soluo de -naftol R. Aparece intensa colorao
E DOS GRUPOS FUNCIONAIS alaranjada ou vermelha e geralmente forma-se um precipitado
da mesma cor.
2. Mtodos
Analticos
ACETATOS
AMNIO (SAIS DE)
a) Aquea a amostra com uma quantidade igual de cido
oxlico R. Libertam-se vapores de reaco cida (2.2.4) e soluo prescrita, junte 0,2 g de xido de magnsio R.
com o cheiro caracterstico do cido actico. Faa borbulhar ar na mistura e receba o gs que se liberta na
superfcie duma mistura de 1 ml de cido clordrico 0,1 M e
b) Dissolva cerca de 30 mg da amostra em 3 ml de gua R ou 0,05 ml de soluo de vermelho de metilo R. A cor vira para
utilize 3 ml da soluo prescrita. Junte sucessivamente amarelo e forma-se precipitado amarelo pela adio de 1 ml
0,25 ml de soluo de nitrato de lantnio R, 0,1 ml de duma soluo recentemente preparada de cobaltinitrito de
iodo 0,05 M e 0,05 ml de amnia diluda R2. Aquea sdio R a 100 g/l.
cuidadosamente ebulio. Em poucos minutos aparece
precipitado azul ou colorao azul escura.
AMNIO (SAIS DE) E SAIS DE BASES VOLTEIS
ACETILO Dissolva cerca de 20 mg da amostra em 2 ml de gua R ou

utilize 2 ml da soluo prescrita. Junte 2 ml de soluo
Num tubo de ensaio com cerca de 18 mm de dimetro diluda de hidrxido de sdio R e aquea. Libertam-se vapores
exterior e cerca de 180 mm de comprimento, introduza identificveis pelo seu cheiro e reaco alcalina (2.2.4).
cerca de 15 mg da amostra ou a quantidade prescrita e
0,15 ml de cido fosfrico R. Feche o tubo de ensaio com
ANTIMNIO
uma rolha atravessada por um pequeno tubo de ensaio com
cerca de 100 mm de comprimento e 10 mm de dimetro Dissolva, aquecendo ligeiramente, cerca de 10 mg da amostra
exterior. Este tubo pequeno, cheio de gua, serve de numa soluo de 0,5 g de tartarato de sdio e potssio R em
refrigerante. 10 ml de gua R e arrefea. A 2 ml desta soluo ou da soluo
Na parede exterior deste ltimo tubo suspenda uma gota prescrita, junte, gota a gota, soluo de sulfureto de sdio R.
de soluo de nitrato de lantnio R. Excepto no caso de Forma-se precipitado vermelho alaranjado que se dissolve pela
substncias dificilmente hidrolisveis, coloque o aparelho adio de soluo diluda de hidrxido de sdio R.
num banho de gua durante 5 min, depois retire o tubo de
ensaio pequeno, recolha a gota suspensa e misture-a, sobre ARSNIO
uma placa de porcelana, com 0,05 ml de iodo 0,01 M. Junte Aquea em banho de gua 5 ml da soluo prescrita com
sobre o bordo da gota 0,05 ml de amnia diluda R2. Aps um volume igual de reagente hipofosforoso R. Forma-se
1 a 2 min, desenvolve-se na zona limite colorao azul, precipitado castanho.
tornando-se pouco a pouco mais carregada e persistindo um
certo tempo.
BARBITRICOS NO SUBSTITUDOS NO AZOTO
No caso de substncias dificilmente hidrolisveis, aquea
Dissolva cerca de 5 mg da amostra em 3 ml de metanol R.
lentamente a mistura a fogo directo at ebulio e continue
Junte 0,1 ml duma soluo contendo 100 g/l de nitrato de
segundo as indicaes anteriores.
cobalto R e 100 g/l de cloreto de clcio R. Misture e junte,
agitando, 0,1 ml de soluo diluda de hidrxido de sdio R.
ALCALIDES Aparece colorao e precipitado azul violceo.
Dissolva alguns miligramas da amostra ou a quantidade
prescrita em 5 ml de gua R e junte cido clordrico BENZOATOS
diludo R at reaco cida (2.2.4). Junte 1 ml de soluo
de iodobismutato de potssio R. Forma-se imediatamente a) A 1 ml da soluo prescrita, junte 0,5 ml de soluo de
precipitado alaranjado ou vermelho-alaranjado. cloreto frrico R1. Forma-se precipitado amarelo claro,
solvel no ter R.
ALUMNIO b) Num tubo de ensaio, introduza 0,2 g da amostra tratada
eventualmente segundo as indicaes da monografia.
Dissolva cerca de 15 mg da amostra em 2 ml de gua R ou
Humedea a substncia com 0,2 ml a 0,3 ml de cido
utilize 2 ml da soluo prescrita. Junte cerca de 0,5 ml de
sulfrico R. Aquea ligeiramente o fundo do tubo. Sobre a
cido clordrico diludo R e cerca de 0,5 ml de reagente de
parede interior do tubo deposita-se sublimado branco.
tioacetamida R. No se forma precipitado. Junte, gota a gota,
soluo diluda de hidrxido de sdio R. Forma-se precipitado c) Dissolva 0,5 g da amostra em 10 ml de gua R ou
branco gelatinoso que se dissolve pela adio de soluo utilize 10 ml da soluo prescrita. Junte 0,5 ml de cido
diluda de hidrxido de sdio R. Junte pouco a pouco soluo clordrico R. Cristalizado da gua R quente e depois de
de cloreto de amnio R; o precipitado branco gelatinoso seco a presso reduzida, o precipitado obtido apresenta um
reaparece. ponto de fuso (2.2.14 ) de 120C a 124C.

BISMUTO CARBONATOS E BICARBONATOS

a) A 0,5 g da amostra, junte 10 ml de cido clordrico diludo Num tubo de ensaio, introduza 0,1 g da amostra e suspenda
R ou utilize 10 ml da soluo prescrita. Aquea ebulio em 2 ml de gua R ou utilize 2 ml da soluo prescrita. Junte
durante 1 min. Arrefea e filtre, se necessrio. 3 ml de cido actico diludo R e feche imediatamente o tubo
A 1 ml da soluo obtida, junte 20 ml de gua R. com uma rolha atravessada por um tubo em vidro dobrado
Forma-se precipitado branco ou ligeiramente amarelo 2 vezes em ngulo recto. A soluo ou a suspenso torna-
2. Mtodos
Analticos
que, por adio de 0,05 ml a 0,1 ml de soluo de sulfureto -se efervescente e liberta um gs incolor e inodoro. Aquea
de sdio R, vira para castanho. ligeiramente e recolha o gs em 5 ml de soluo de hidrxido
de brio R. Forma-se precipitado branco que se dissolve por
b) A cerca de 45 mg da amostra, junte 10 ml de cido ntrico
adio de cido clordrico R1 em excesso.
diludo R ou utilize 10 ml da soluo prescrita. Aquea
ebulio durante 1 min. Arrefea e filtre, se necessrio.
A 5 ml da soluo obtida, junte 2 ml duma soluo de CHUMBO
tioureia R a 100 g/l. Aparece colorao amarela alaranjada a) Dissolva 0,1 g da amostra em 1 ml de cido actico R ou
ou precipitado alaranjado. Junte 4 ml duma soluo de utilize 1 ml da soluo prescrita. Junte 2 ml de soluo de
fluoreto de sdio R a 25 g/l. A soluo no descora nos cromato de potssio R. Forma-se precipitado amarelo que
30 min seguintes. se dissolve por adio de 2 ml de soluo concentrada de
hidrxido de sdio R.
BROMETOS
b) Dissolva cerca de 50 mg da amostra em 1 ml de cido
a) Dissolva uma quantidade da amostra correspondendo a actico R ou utilize 1 ml da soluo prescrita. Junte
cerca de 3 mg de brometo (Br) em 2 ml de gua R ou 10 ml de gua R e 0,2 ml de soluo de iodeto de potssio
utilize 2 ml da soluo prescrita. Acidule com cido ntrico R. Forma-se precipitado amarelo. Aquea ebulio
diludo R e junte 0,4 ml de soluo de nitrato de prata R1. durante 1 min a 2 min. O precipitado dissolve-se. Deixe
Agite e deixe em repouso. Forma-se precipitado caseoso arrefecer. O precipitado reaparece sob a forma de palhetas
amarelo plido. Centrifugue e lave 3 vezes com 1 ml de brilhantes amarelas.
gua R de cada vez, Efectue esta operao rapidamente,
ao abrigo de luz intensa, sem ter em conta o facto de o CITRATOS
lquido sobrenadante no ficar perfeitamente lmpido.
Suspensa o precipitado em 2 ml de gua R e junte 1,5 ml Dissolva uma quantidade da amostra correspondendo a cerca
de amnia R. O precipitado dissolve-se dificilmente. de 50 mg de cido ctrico em 5 ml de gua R ou utilize 5 ml
da soluo prescrita. Junte 0,5 ml de cido sulfrico R e
b) Num tubo de ensaio pequeno, introduza uma quantidade 1 ml de soluo de permanganato de potssio R. Aquea at
da amostra correspondendo a cerca de 5 mg de brometo desaparecimento da colorao do permanganato. Junte 0,5 ml
(Br) ou quantidade prescrita. Junte 0,25 ml de gua R, duma soluo de nitroprussiato de sdio R a 100 g/l em cido
cerca de 75 mg de dixido de chumbo R, 0,25 ml de cido sulfrico diludo R e 4 g de cido sulfmico R. Alcalinize
actico R e agite suavemente. Seque a parede interior da a soluo adicionando, gota a gota, amnia concentrada R
parte superior do tubo de ensaio com papel de filtro e deixe at dissoluo completa do cido sulfmico. A adio dum
em repouso durante 5 min. Prepare uma tira de papel de excesso de amnia concentrada R provoca o aparecimento de
filtro apropriado de dimenses convenientes. Impregne-a colorao violcea virando para o azul violceo.
por capilaridade mergulhando uma das extremidades numa
gota de soluo descorada de fucsina R.
CLORETOS
Introduza imediatamente no tubo a parte impregnada.
A partir da extremidade desta, aparece em 10 s colorao a) Dissolva uma quantidade da amostra correspondente
violeta. Esta ltima distingue-se nitidamente da a cerca de 2 mg de cloreto (Cl) em 2 ml de gua R ou
colorao vermelha da fucsina que pode ser visvel sobre utilize 2 ml da soluo prescrita. Acidifique com cido
uma pequena zona na extremidade superior da parte ntrico diludo R. Junte 0,4 ml de soluo de nitrato de
impregnada do papel. prata R1. Agite e deixe em repouso. Forma-se precipitado
branco caseoso. Centrifugue e lave 3 vezes com 1 ml de
gua R de cada vez. Efectue esta operao rapidamente, ao
CLCIO
abrigo de luz intensa, sem ter em conta o facto do lquido
a) A 0,2 ml duma soluo neutra contendo uma quantidade sobrenadante no ficar perfeitamente lmpido. Suspenda
da amostra correspondendo a cerca de 0,2 mg de clcio o precipitado em 2 ml de gua R e junte 1,5 ml de amnia
(Ca2+) por mililitro ou a 0,2 ml da soluo prescrita, junte R. O precipitado dissolve-se facilmente excepo de
0,5 ml duma soluo de glioxal-hidroxianilo R a 2 g/l, eventuais partculas de maior dimenso que se dissolvem
em etanol a 96 por cento R, 0,2 ml de soluo diluda de lentamente.
hidrxido de sdio R e 0,2 ml de soluo de carbonato de
b) Num tubo de ensaio, introduza uma quantidade da
sdio R. Agite com 1 ml a 2 ml de clorofrmio R e junte
amostra correspondente a cerca de 15 mg de cloreto (Cl)
1 ml a 2 ml de gua R. A fase clorofrmica cora de vermelho.
ou a quantidade prescrita. Junte 0,2 g de dicromato de
b) Dissolva cerca de 20 mg da amostra ou a quantidade potssio R e 1 ml de cido sulfrico R. Coloque sobre
prescrita em 5 ml de cido actico R. Junte 0,5 ml de a boca do tubo de ensaio uma tira de papel de filtro
soluo de ferrocianeto de potssio R. A soluo fica impregnada com 0,1 ml de soluo de difenilcarbazida R.
lmpida. Junte cerca de 50 mg de cloreto de amnio R. O papel cora de vermelho-violeta. O papel impregnado no
Forma-se precipitado cristalino branco. entra em contacto com o dicromato de potssio.

STERES LACTATOS
A cerca de 30 mg da amostra ou quantidade prescrita, junte Dissolva uma quantidade da amostra correspondendo a cerca
0,5 ml de soluo de cloridrato de hidroxilamina R a 70 g/l em de 5 mg de cido lctico em 5 ml de gua R. A esta soluo,
metanol R e 0,5 ml de soluo de hidrxido de potssio R a ou a 5 ml da soluo prescrita, junte 1 ml de gua de bromo
100 g/l em etanol a 96 por cento R. Aquea ebulio, arrefea, R e 0,5 ml de cido sulfrico diludo R. Aquea em banho
acidifique com cido clordrico diludo R e junte 0,2 ml de de gua at desaparecimento da colorao, agitando de vez
2. Mtodos
Analticos
soluo de cloreto frrico R1 diluda 10 vezes. Desenvolve-se em quando com uma vareta de vidro. Junte 4 g de sulfato de
colorao vermelha ou vermelho-azulada. amnio R e misture. Junte, gota a gota e sem misturar,
0,2 ml de uma soluo de nitroprussiato de sdio R a 100 g/l
FERRO em cido sulfrico diludo R. Sempre sem misturar, junte
a) Dissolva uma quantidade da amostra correspondente a cerca 1 ml de amnia concentrada R. Deixe em repouso durante
de 10 mg de ferro (Fe2+) em 1 ml de gua R ou utilize 1 ml 30 min. Aparece um anel verde carregado na interfase dos
da soluo prescrita. Junte 1 ml de soluo de ferricianeto de 2 lquidos.
potssio R. Forma-se precipitado azul que no se dissolve por
adio de 5 ml de cido clordrico diludo R. MAGNSIO
b) Dissolva uma quantidade da amostra correspondente a Dissolva cerca de 15 mg da amostra em 2 ml de gua R ou
cerca de 1 mg de ferro (Fe3+) em 30 ml de gua R. A 3 ml utilize 2 ml da soluo prescrita. Junte 1 ml de amnia
desta soluo ou a 3 ml da soluo prescrita, junte 1 ml de diluda R1. Forma-se precipitado branco que se dissolve pela
cido clordrico diludo R e 1 ml de soluo de tiocianato de adio de 1 ml de soluo de cloreto de amnio R. Junte
potssio R. Desenvolve-se colorao vermelha. 1 ml de soluo de fosfato dissdico R. Forma-se precipitado
Tome 2 fraces de 1 ml. A uma delas junte 5 ml de lcool branco cristalino.
isoamlico R ou 5 ml de ter R. Agite e deixe em repouso. A fase
orgnica cora de rseo. outra fraco, junte 2 ml de soluo MERCRIO
de cloreto mercrico R. A colorao vermelha desaparece.
a) Deposite 0,1 ml duma soluo da amostra sobre uma
c) Dissolva uma quantidade da amostra correspondendo, lmina de cobre bem decapada. Forma-se uma mancha
pelo menos, a 1 mg de ferro (Fe3+) em 1 ml de gua R, ou cinzenta escura que se torna brilhante por frico. Seque a
utilize 1 ml da soluo prescrita; junte 1 ml de soluo lmina de cobre e depois aquea-a num tubo de ensaio.
de ferrocianeto de potssio R. Forma-se precipitado azul A mancha desaparece.
que no se dissolve por adio de 5 ml de cido clordrico
diludo R. b) soluo prescrita, junte soluo diluda de hidrxido de
sdio R at reaco fortemente alcalina (2.2.4). Forma-se
um precipitado amarelo e denso (sais mercricos).
FOSFATOS (ORTOFOSFATOS)
a) A 5 ml da soluo prescrita, neutralizada se necessrio, NITRATOS
junte 5 ml de soluo de nitrato de prata R1. Forma-se
precipitado amarelo, cuja colorao no modificada por A uma mistura de 0,1 ml de nitrobenzeno R e de 0,2 ml
ebulio e que se dissolve por adio de amnia R. de cido sulfrico R, junte uma quantidade da amostra
pulverizada correspondente a cerca de 1 mg de nitrato (NO3)
b) Misture 1 ml da soluo prescrita com 2 ml de reagente ou a quantidade prescrita. Apos 5 min de repouso, arrefea
molibdovandico R. Desenvolve-se colorao amarela. em gua com gelo, junte lentamente e agitando 5 ml de gua
R e depois 5 ml de soluo concentrada de hidrxido de sdio
IODETOS R. Junte 5 ml de acetona R, agite e deixe em repouso. A fase
a) Dissolva uma quantidade da amostra correspondendo a superior fica corada de violeta escuro.
cerca de 4 mg de iodeto (I) em 2 ml de gua R ou utilize
2 ml da soluo prescrita. Acidifique com cido ntrico POTSSIO
diludo R e junte 0,4 ml de soluo de nitrato de prata R1.
a) Dissolva 0,1 g da amostra em 2 ml de gua R ou utilize
Agite e deixe em repouso. Forma-se precipitado caseoso
amarelo plido. Centrifugue e lave 3 vezes com 1 ml de 2 ml da soluo prescrita. Junte 1 ml de soluo de
gua R de cada vez. Efectue esta operao rapidamente, carbonato de sdio R e aquea. No se forma precipitado.
ao abrigo de luz intensa, sem ter em conta o facto de o Junte soluo quente 0,05 ml de soluo de sulfureto de
lquido sobrenadante no ficar perfeitamente lmpido. sdio R. No se forma precipitado. Arrefea em gua com
Suspenda o precipitado em 2 ml de gua R e junte 1,5 ml gelo e junte 2 ml duma soluo de cido tartrico R a
de amnia R. O precipitado no se dissolve. 150 g/l. Deixe em repouso. Forma-se precipitado cristalino
branco.
b) A 0,2 ml duma soluo da amostra contendo cerca de
5 mg de iodeto (I) por mililitro, ou a 0,2 ml da soluo b) Dissolva cerca de 40 mg da amostra em 1 ml de gua
prescrita, junte 0,5 ml de cido sulfrico diludo R, R ou utilize 1 ml da soluo prescrita. Junte 1 ml de
0,1 ml de soluo de dicromato de potssio R, 2 ml de cido actico diludo R e 1 ml de soluo extempornea
gua R e 2 ml de clorofrmio R. Agite durante alguns de cobaltinitrito de sdio R a 100 g/l. Forma-se
segundos e deixe em repouso. A fase clorofrmica fica imediatamente precipitado amarelo ou amarelo
corada de violeta ou vermelho-violceo. alaranjado.

2.3.2. Identificao dos leos gordos por cromatografia em camada fina
PRATA TARTARATOS
Dissolva cerca de 10 mg da amostra em 10 ml de gua R,
a) Dissolva cerca de 15 mg da amostra em 5 ml de gua R ou
ou utilize 10 ml da soluo prescrita. Junte 0,3 ml de cido
utilize 5 ml da soluo prescrita. Junte 0,05 ml de soluo
clordrico R1. Forma-se precipitado branco caseoso que se
de sulfato ferroso R a 10 g/l e 0,05 ml de soluo diluda
dissolve por adio de 3 ml de amnia diluda R1.
de perxido de hidrognio R. Aparece colorao amarela
fugaz. Aps o desaparecimento desta, junte, gota a gota,
2. Mtodos
Analticos
SALICILATOS soluo diluda de hidrxido de sdio R. Desenvolve-se

a) A 1 ml da soluo prescrita junte 0,5 ml de soluo de colorao violeta ou prpura.
cloreto frrico R1. Desenvolve-se colorao violeta que b) A 0,1 ml duma soluo contendo uma quantidade da
persiste aps adio de 0,1 ml de cido actico R. amostra correspondendo a cerca de 15 mg de cido
tartrico por mililitro, ou a 0,1 ml da soluo prescrita,
b) Dissolva 0,5 g da amostra em 10 ml de gua R ou utilize
junte 0,1 ml de soluo de brometo de potssio R a
10 ml da soluo prescrita. Junte 0,5 ml de cido
100 g/l, 0,1 ml de soluo de resorcinol R a 20 g/l e 3 ml
clordrico R. Cristalizado da gua R quente, e depois seco a
de cido sulfrico R. Aquea em banho de gua durante
presso reduzida, o precipitado obtido apresenta um ponto
5 min a 10 min. Desenvolve-se colorao azul escura.
de fuso (2.2.14) de 156C a 161C.
Deixe arrefecer e verta a soluo em gua R. A colorao
vira para vermelha.
SILICATOS
Num cadinho de chumbo ou de platina, misture com o XANTINAS
auxlio dum fio de cobre a quantidade prescrita da amostra
A alguns miligramas da amostra ou quantidade prescrita,
com cerca de 10 mg de fluoreto de sdio R e algumas junte 0,1 ml de soluo concentrada de perxido de
gotas de cido sulfrico R para formar uma goma fluida. hidrognio R e 0,3 ml de cido clordrico diludo R. Evapore
Feche o cadinho com uma lmina fina de matria plstica em banho de gua secura at obteno de resduo
transparente cuja face inferior retm uma gotcula de gua vermelho amarelado. Junte 0,1 ml de amnia diluda R2; o
R e aquea ligeiramente. Forma-se rapidamente um anel resduo cora de vermelho violceo.
branco em volta da gotcula de gua.
ZINCO
SDIO
Dissolva 0,1 g da amostra em 5 ml de gua R ou utilize 5 ml
a) Dissolva 0,1 g da amostra em 2 ml de gua R ou utilize da soluo prescrita. Junte 0,2 ml de soluo concentrada
2 ml da soluo prescrita. Junte 2 ml de soluo de de hidrxido de sdio R. Forma-se precipitado branco que
carbonato de potssio R a 150 g/l e aquea ebulio. se dissolve por adio de 2 ml de soluo concentrada de
No se forma precipitado. Junte 4 ml de soluo de hidrxido de sdio R. Junte 10 ml de soluo de cloreto de
piroantimoniato de potssio R e aquea ebulio. Deixe amnio R. A soluo fica lmpida. Junte 0,1 ml de soluo
arrefecer em gua com gelo e friccione, se necessrio, de sulfureto de sdio R; forma-se precipitado flocoso
a parede do tubo com uma vareta de vidro. Forma-se branco.
precipitado branco, denso.
b) Dissolva uma quantidade da amostra correspondente

a cerca de 2 mg de sdio (Na+) em 0,5 ml de gua R
2.3.2. IDENTIFICAO DOS LEOS
ou utilize 0,5 ml da soluo prescrita. Junte 1,5 ml de GORDOS POR CROMATOGRAFIA EM
reagente metoxifenilactico R e arrefea em gua com CAMADA FINA
gelo durante 30 min. Forma-se um volumoso precipitado
branco cristalino. Mantenha na gua a 20C durante Proceda por cromatografia em camada fina (2.2.27)
5 min, agitando. O precipitado no desaparece. Junte utilizando uma placa de gel de slica octadecilsililada para
1 ml de amnia diluda R1. O precipitado dissolve-se cromatografia de alta resoluo apropriada.
inteiramente. Junte 1 ml de soluo de carbonato de
Soluo problema. Salvo indicao em contrrio, dissolva
amnio R. No se forma precipitado.
cerca de 20 mg (1 gota) da amostra em 3 ml de cloreto de
metileno R.
SULFATOS Soluo padro. Dissolva cerca de 20 mg (1 gota) de leo de
milho R em 3 ml de cloreto de metileno R.
a) Dissolva cerca de 45 mg da amostra em 5 ml de gua R
Aplique, separadamente, na placa 1 l de cada soluo.
ou utilize 5 ml da soluo prescrita. Junte 1 ml de cido
Desenvolva 2 vezes no percurso de 0,5 cm com ter R.
clordrico diludo R e 1 ml de soluo de cloreto de brio Desenvolva de seguida 2 vezes no percurso de 8 cm com
R1. Forma-se precipitado branco. uma mistura de 20 volumes de cloreto de metileno R,
b) suspenso final obtida na reaco (a), junte 0,1 ml 40 volumes de cido actico glacial R e 50 volumes de
de iodo 0,05 M. A suspenso fica amarela (distino acetona R. Deixe secar a placa ao ar. Pulverize com soluo de
dos sulfitos e ditionitos). Junte, gota a gota, soluo de cido fosfomolbdico R a 100 g/l em etanol a 96 por cento R.
cloreto estanoso R. A colorao da suspenso desaparece Aquea a placa a 120C durante cerca de 3 min. Examine
(distino dos iodatos). Aquea ebulio. No se luz do dia.
forma precipitado corado (distino dos seleniatos e dos O cromatograma apresenta manchas comparveis s
tungstatos). reproduzidas na figura.

2.3.4. Cheiro
2. Mtodos
Analticos
1. leo de amendoim 6. leo de colza (isento de cido ercico) 11. leo de grmen de trigo
2. leo de ssamo 7. leo de linhaa 12. leo de borragem
3. leo de milho 8 Azeite 13. leo de onagra
4. leo de colza 9. leo de girassol 14. leo de crtamo (tipo I)
5. leo de soja 10. leo de amndoas 15. leo de crtamo (tipo II)
FIGURA 1 Cromatograma-tipo para identificao dos leos gordos
2.3.3. IDENTIFICAO percurso de 15 cm, com uma mistura de 50 ml de

ter de petrleo R e 1 ml de dietilamina R, saturada
DE FENOTIAZINAS POR com fenoxietanol R (adicione cerca de 3 ml a 4 ml de
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA fenoxietanol mistura dos dois solventes indicados, at
obter por agitao uma turvao persistente, decante e
Proceda por cromatografia em camada fina (2.2.27), utilizando utilize o lquido sobrenadante, ainda que turvo). Aps o
uma placa de kieselguhr G R. Impregne a placa, colocando-a desenvolvimento, observe a placa, durante alguns minutos,
numa cmara fechada contendo o volume necessrio da luz ultravioleta de 365 nm. A mancha do cromatograma
mistura constituda por soluo a 10 por cento V/V de obtido com a soluo problema semelhante, quanto
fenoxietanol R e macrogol 300 R a 50 g/l em acetona R, de posio, fluorescncia e dimenses, mancha do
forma a que a superfcie do lquido atinja cerca de 5 mm da cromatograma obtido com a soluo padro. Pulverize com
camada de adsorvente. Quando a mistura de impregnao tiver soluo de cido sulfrico R a 10 por cento V/V em etanol
percorrido, pelo menos, 17 cm da camada, retire a placa da a 96 por cento R. A colorao da mancha do cromatograma
cmara e proceda imediatamente ao ensaio cromatogrfico, obtido com a soluo problema semelhante da mancha
efectuando o desenvolvimento, no mesmo sentido do cromatograma obtido com a soluo padro e apresenta
Soluo problema. Dissolva 20 mg da amostra em a mesma estabilidade durante 20 min, pelo menos.
clorofrmio R e complete 10 ml com o mesmo solvente
Soluo padro. Dissolva 20 mg da substncia qumica
de referncia (SQR) correspondente em clorofrmio R e
2.3.4. CHEIRO
complete 10 ml com o mesmo solvente.
Num vidro de relgio de 6 cm a 8 cm de dimetro coloque,
Aplique na placa, separadamente, 2 l da cada soluo em camada fina, 0,5 g a 2 g da amostra. Aps 15 min, procure
e proceda ao desenvolvimento, ao abrigo da luz, e no definir o cheiro ou verifique a sua ausncia.

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.3 IDENTIFICAO (NDICE)
Analticos

2.4. ENSAIOS LIMITE

DAS IMPUREZAS
2. Mtodos
Analticos
INORGNICAS
2.4. Ensaios limite das impurezas inorgnicas 123 2.4.19. Impurezas de reaco alcalina nos leos
2.4.1. Amnio 123 gordos 130
2.4.2. Arsnio 123 2.4.21. leos estranhos nos leos gordos por
2.4.3. Clcio 123 cromatografia em camada fina 130
2.4.4. Cloretos 124 2.4.22. leos estranhos nos leos gordos por
2.4.5. Fluoretos 124 cromatografia em fase gasosa 130
2.4.6. Magnsio 124 2.4.23. Esteris nos leos gordos 132
2.4.7. Magnsio e metais alcalino-terrosos 124 2.4.24. Identificao e controlo dos solventes residuais 134
2.4.8. Metais pesados 124 2.4.25. xido de etileno e dioxano 138
2.4.9. Ferro 128 2.4.26. N,N-Dimetilanilina 140
2.4.10. Chumbo nos acares 128 2.4.27. Metais pesados nos frmacos vegetais e nos
2.4.11. Fosfatos 128 leos gordos 140
2.4.12. Potssio 128 2.4.28. cido 2-etil-hexanico 141
2.4.13. Sulfatos 128 2.4.29. Composio em cidos gordos dos leos ricos
2.4.14. Cinzas sulfricas 128 em cidos mega-3 142
2.4.15. Nquel nos poliis 129 2.4.30. Etilenoglicol e dietilenoglicol em substncias
2.4.16. Cinzas totais 129 etoxiladas 143
2.4.17. Alumnio 129 2.4.31. Niquel nos leos vegetais hidrogenados 144
2.4.18. Formaldedo livre 129 2.4.32. Colestrol total nos leos ricos em cidos
mega-3 144

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.4 ENSAIOS LIMITE DAS IMPUREZAS INORGNCIAS (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.4 ENSAIOS LIMITE DAS IMPUREZAS INORGNCIAS (NDICE)
2.4.3. Clcio
2.4. ENSAIOS LIMITE DAS No matrs, dissolva a quantidade prescrita da amostra em

25 ml de gua R ou, no caso duma soluo, complete o
IMPUREZAS INORGNICAS volume prescrito com gua R at 25 ml. Junte 15 ml de cido
clordico R, 0,1 ml de soluo de cloreto estanoso R, 5 ml de
soluo de iodeto de potssio R e aguarde durante 15 min.
2.4.1. AMNIO Introduza 5 g de zinco activado R. Ligue imediatamente as
duas partes do aparelho e mergulhe o matrs num banho de
2. Mtodos
Analticos
Salvo indicao em contrrio, utilize o mtodo A. gua a uma temperatura que permita uma libertao regular
do gs. Prepare o padro nas mesmas condies, utilizando
1 ml de soluo a 1 ppm de arsnio (As) R diludo at 25 ml
MTODO A com gua R.
Aps 2 h, pelo menos, a mancha eventual obtida no papel no
Num tubo de ensaio, dissolva a quantidade da amostra
mais intensa que a obtida com o padro.
prescrita em 14 ml de gua R, alcalinize, se necessrio,
com soluo diluda de hidrxido de sdio R e complete
15 ml com gua R. Junte 0,3 ml de soluo alcalina de
tetraiodomercurato de potssio R. Prepare o padro juntando
a 10 ml de soluo a 1 ppm de amnio (NH4) R, 5 ml de gua
R e 0,3 ml de soluo alcalina de tetraiodomercurato de
potssio R. Rolhe os tubos de ensaio.
Aps 5 min, a eventual colorao amarela da soluo da
amostra no mais intensa que a do padro.
MTODO B
Num frasco para ps de 25 ml munido de uma cpsula

de polietileno, coloque a quantidade prescrita da amostra
finamente pulverizada e dissolva ou suspenda em 1 ml de
gua R. Junte 0,30 g de xido de magnsio pesado R. Coloque
um papel de mangansio-prata R de 5 5 mm com o auxlio
de algumas gotas de gua R sob a cpsula de polietileno
e feche imediatamente. Agite circularmente evitando
projeces do lquido. Aquea a 40C durante 30 min. O papel
de mangansio-prata no fica mais corado de cinzento que
um papel de magansio-prata colocado sobre um padro,
preparado simultaneamente e nas mesmas condies, com o
volume prescrito da soluo padro de amnio a 1 ppm (NH4)
R, 1 ml de gua R e 0,30 g de xido de magnsio pesado R.
2.4.2. ARSNIO FIGURA 1 Aparelho para o ensaio A do arsnio

MTODO A
O aparelho (ver figura 1) constitudo por um matrs de MTODO B

100 ml fechado com uma rolha esmerilada munida dum
tubo de vidro de cerca de 200 mm de comprimento e de Num tubo de ensaio contendo 4 ml de cido clordrico R e
5 mm de dimetro interno. A parte inferior deste tubo cerca de 5 mg de iodeto de potssio R, introduza a quantidade
afilada de modo que o dimetro interior seja de 1,0 mm; prescrita da amostra. Junte 3 ml de reagente hipofosforoso
15 mm acima desta extremidade, o tubo tem um orifcio R. Aquea a mistura num banho de gua durante 15 min,
lateral de 2 a 3 mm de dimetro. Quando o tubo colocado agitando de vez em quando. Prepare o padro nas mesmas
na rolha, o orifcio lateral fica, pelo menos, 3 mm abaixo condies, utilizando 0,5 ml de soluo a 10 ppm de arsnio
da superfcie inferior da rolha. Na parte superior do tubo, a (As) R.
espessura do vidro cuidadosamente rebordada limita uma
Aps aquecimento em banho de gua, a colorao eventual da
superfcie perfeitamente plana perpendicular ao eixo do tubo.
soluo da amostra no mais intensa que a do padro.
Um outro tubo do mesmo dimetro interno e de 30 mm
de comprimento preparado nas mesmas condies. As
partes planas rebordadas so aplicadas uma contra a outra e
fixadas com duas molas. O tubo inferior tem uma camada no 2.4.3. CLCIO
comprimida de algodo de acetato de chumbo R pesando de
50 mg a 60 mg, ou um pequeno tampo de algodo e um rolo Todas as solues utilizadas neste ensaio so preparadas
de papel de acetato de chumbo R de 50 mg a 60 mg. Entre com gua destilada R.
as duas partes rebordadas planas dos tubos, coloque um A 0,2 ml de soluo alcolica a 100 ppm de clcio (Ca) R,
disco ou um quadrado de papel de brometo mercrico R, de junte 1 ml de soluo de oxalato de amnio R. Aps
superfcie suficiente para cobrir o orifcio do tubo 1 min, junte uma mistura de l ml de cido actico diludo R
(15 mm 15 mm). e 15 ml duma soluo contendo a quantidade prescrita da

2.4.8. Metais pesados
amostra, agitando em seguida. Prepare o padro nas mesmas Introduza no tubo interior do aparelho (ver figura 2) a
condies, utilizando uma mistura de 10 ml de soluo quantidade prescrita da amostra, 0,1 g de areia lavada R e
aquosa a 10 ppm de clcio (Ca) R, 1 ml de cido actico 20 ml duma mistura em volumes iguais de cido sulfrico
diludo R e 5 ml de gua R. R e gua R. Aquea a manga contendo o tetracloroetano R,
Aps 15 min, se a soluo da amostra apresentar mantido ebulio (146C). Aquea igualmente o gerador
opalescncia, esta no mais pronunciada que a do padro. de vapor de gua e destile, recolhendo o destilado num
balo marcado de 100 ml contendo 0,3 ml de hidrxido de
2. Mtodos
Analticos
sdio 0,1 M e 0,1 ml de soluo de fenolftalena R. Durante a

2.4.4. CLORETOS destilao, mantenha o volume constante de 20 ml no tubo e
mantenha igualmente a alcalinidade do destilado por adio
A 15 ml da soluo prescrita, junte 1 ml de cido ntrico de hidrxido de sdio 0,1 M. Complete o volume do destilado
diludo R e introduza esta mistura duma s vez num tubo para 100 ml com gua R (soluo problema). Prepare o padro
de ensaio contendo 1 ml de soluo de nitrato de prata R2. nas mesmas condies substituindo a amostra por 5 ml de
Prepare o padro nas mesmas condies, utilizando uma soluo a 10 ppm de fluoreto (F) R. Em duas provetas de rolha
mistura de 10 ml de soluo a 5 ppm de cloreto (Cl) R e esmerilada, introduza respectivamente 20 ml da soluo
5 ml de gua R. Observe lateralmente os tubos de ensaio problema e 20 ml da soluo padro. Junte em cada proveta 5
sobre fundo escuro. ml de reagente de cido aminometilalizarinodiactico R.
Aps 5 min ao abrigo da luz, se a soluo da amostra Aps 20 min, a colorao azul eventual da soluo problema
apresentar opalescncia, no mais pronunciada que a do (primitivamente corada de vermelho) no mais intensa que
padro. a do padro.
2.4.5. FLUORETOS 2.4.6. MAGNSIO

A 10 ml da soluo prescrita, junte 0,1 g de tetraborato
dissdico R e acerte o pH para 8,8-9,2, se for necessrio, com
cido clordrico diludo R ou soluo diluda de hidrxido de
sdio R.
Agite 2 vezes com 5 ml de cada vez duma soluo de
hidroxiquinolena R a 1 g/l em clorofrmio R, durante 1 min
cada. Deixe em repouso, separe e rejeite a fase orgnica. Repita
a operao. fase aquosa, junte 0,4 ml de butilamina R e
0,1 ml de trietanolamina R. Acerte o pH da soluo para
10,5-11,5, se for necessrio. Junte 4 ml da soluo
clorofrmica de hidroxiquinolena, agite durante 1 min,
deixe em repouso, separe e utilize a fase inferior para a
comparao. Prepare o padro nas mesmas condies,
utilizando uma mistura de 1 ml de soluo a 10 ppm de
magnsio (Mg) R e 9 ml de gua R.
A colorao eventual da soluo obtida a partir da amostra
no mais intensa que a do padro.
2.4.7. MAGNSIO E METAIS

ALCALINO-TERROSOS
A 200 ml de gua R, junte 0,1 g de cloridrato de
hidroxilamina R, 10 ml de soluo tampo de cloreto de
amnio de pH 10,0 R, 1 ml de soluo de sulfato de zinco
0,1 M e cerca de 15 mg de mistura composta de mordente
negro 11 R. Aquea a 40C e titule a esta temperatura com
edetato de sdio 0,01 M at viragem de violeta para azul
ntido. A esta soluo junte a tomada de ensaio prescrita
dissolvida em 100 ml de gua R ou a soluo prescrita. Se a
colorao virar para violeta, titule com edetato de sdio
0,01 M at reaparecer a colorao azul.
O volume de edetato de sdio 0,01 M utilizado na segunda
titulao no excede a quantidade prescrita.
2.4.8. METAIS PESADOS

Os mtodos descritos a seguir requerem o uso de reagente de
FIGURA 2 Aparelho para o ensaio fluoretos tioacetamida R. Como alternativa, pode ser usado reagente
Dimenses em milmetros de sulfito de sdio R1 (0,1 ml). Se o ensaio prescrito na

monografia tiver sido desenvolvido usando o reagente de MTODO C

sulfito de sdio R1, necessrio introduzir uma soluo de
monitorizao nos mtodos A e B, preparada adicionando Soluo problema. Num cadinho de slica introduza a tomada
quantidade da amostra prescrita um volume de soluo de ensaio prescrita (2 g, no mximo) e 4 ml de soluo de
de chumbo (Pb) R igual ao prescrito para a preparao sulfato de magnsio R a 250 g/l em cido sulfrico diludo R.
da soluo padro. O ensaio no vlido se a soluo de Misture com auxlio de uma vareta de vidro fina. Aquea com
monitorizao no for, pelo menos, to intensa como a precauo. Se a mistura for lquida, evapore lentamente em
2. Mtodos
Analticos
soluo padro. banho de gua at obteno de um resduo seco. Aquea em
seguida progressivamente at carbonizao e calcine at
obteno de cinzas praticamente brancas ou, quando muito,
MTODO A acinzentadas, no devendo a temperatura ultrapassar 800C.
Deixe arrefecer. Humedea o resduo com algumas gotas de
Soluo problema. 12 ml da soluo aquosa da amostra cido sulfrico diludo R. Evapore, calcine de novo e deixe
prescrita. arrefecer. A durao total da calcinao no excede 2 h. Tome
Soluo padro (standard). Mistura de 10 ml de soluo a o resduo, por 2 vezes, com 5 ml de cido clordrico diludo
1 ppm ou a 2 ppm de chumbo (Pb) R, conforme o prescrito, e R de cada vez. Junte 0,1 ml de soluo de fenolftalena R e
2 ml da soluo da amostra. depois amnia concentrada R at colorao rsea. Arrefea,
junte cido actico glacial R at descolorao e um excesso
Ensaio em branco. 10 ml de gua R e 2 ml de soluo de 0,5 ml. Se necessrio, filtre e lave o filtro. Complete 20 ml
amostra. com gua R. A 12 ml da soluo obtida junte 2 ml de soluo
Junte a cada uma das solues 2 ml de soluo tampo de pH tampo de pH 3,5 R. Misture e junte 1,2 ml de reagente de
3,5 R. Misture e junte 1,2 ml de reagente de tioacetamida R. tioacetamida R, misturando imediatamente.
Misture imediatamente. Examine aps 2 min. Soluo padro (standard). Prepare como descrito para a
O ensaio no vlido se o padro, comparado com o ensaio soluo problema, usando o volume prescrito de soluo a
em branco, no apresentar uma ligeira colorao castanha. 10 ppm de chumbo (Pb) R em vez da amostra. A 10 ml da
soluo obtida junte 2 ml da soluo problema.
A colorao castanha eventual da soluo problema no
mais intensa que a do padro. Soluo de monitorizao. Prepare do mesmo modo que
a soluo problema, juntando amostra o mesmo volume
Se for difcil concluir o resultado, filtre as solues por
prescrito para a preparao da soluo padro de soluo a
membrana filtrante (dimenso de poro 3 m; ver figura 3,
10 ppm de chumbo (Pb) R. A 10 ml da soluo obtida junte
sem o pr-filtro). Filtre lenta e regularmente, aplicando
2 ml de soluo problema.
uma presso moderada no mbolo. Compare as manchas
apresentadas pelos filtros com as diferentes solues. Ensaio em branco. Mistura de 10 ml de gua R e 2 ml da
soluo da amostra.
MTODO B A 12 ml de cada uma das solues junte 2 ml de soluo

tampo de pH 3,5 R. Misture e junte 1,2 ml de reagente de
Soluo problema. 12 ml da soluo prescrita da amostra tiocetamida R. Misture imediatamente. Examine aps 2 min.
num solvente orgnico que contenha uma percentagem O ensaio no vlido se a soluo padro, comparada com
mnima de gua (por exemplo, dioxano com 15 por cento de o ensaio em branco, no apresentar uma ligeira colorao
gua R ou acetona R com 15 por cento de gua R). castanha ou se a soluo de monitorizao no for, pelo
Soluo padro (standard). Mistura de 10 ml de soluo a menos, to intensa como a soluo padro.
1 ppm ou a 2 ppm de chumbo (Pb) R, conforme o prescrito, e A amostra satisfaz ao ensio se a colorao castanha eventual
2 ml da soluo da amostra. A soluo a 1 ppm ou a 2 ppm de da soluo problema no for mais intensa que a do padro.
chumbo (Pb) R obtida por diluio da soluo a 100 ppm de
chumbo (Pb) R com o solvente utilizado para a amostra. Se for difcil concluir o resultado, filtre as solues por
membrana filtrante (dimenso de poro 3 m: ver figura 3,
Ensaio em branco. Mistura de 10 ml do solvente utilizado sem o pr-filtro).
para a soluo e 2 ml de soluo da amostra.
Filtre lenta e regularmente, aplicando uma presso moderada
Junte a cada uma das solues 2 ml de soluo tampo de pH no mbolo. Compare as manchas apresentadas pelos filtros
3,5 R. Misture e junte 1,2 ml de reagente de tiocetamida R. com as diferentes solues.
Misture imediatamente. Examine aps 2 min.
O ensaio no vlido se o padro, comparado com o ensaio METODO D

em branco, apresentar uma ligeira colorao castanha.
Soluo problema. Num cadinho de slica introduza a
A colorao castanha eventual da soluo problema no
tomada de ensaio prescrita e misture-a intimamente com
mais intensa que a do padro.
0,5 g de xido de magnsio R1. Calcine ao rubro sombrio
Se for difcil concluir o resultado, filtre as solues por at obteno de uma massa branca ou branco-acinzentada
membrana filtrante (dimenso de poro 3 m, ver figura 3, homognea. Se, aps 30 min de calcinao, a mistura
sem o pr-filtro). Filtre lenta e regularmente, aplicando permanecer corada, deixe arrefecer, misture com auxlio de
uma presso moderada no mbolo. Compare as manchas uma vareta de vidro e calcine de novo. Se necessrio, repita a
apresentadas pelos filtros com as diferentes solues. operao.

Aquea at 800C, mantendo esta temperatura durante antes do pr-filtro (Figura 3). Esta filtrao efectuada lenta
aproximadamente 1 h. Tome o resduo por 2 vezes com 5 ml e regularmente por presso moderada e constante sobre o
duma mistura de volumes iguais de cido clordrico R1 e mbolo da seringa. Aps filtrao completa, abra o suporte,
gua R de cada vez. Junte 0,1 ml de soluo de fenolftalena R tire a membrana filtrante e seque-a sobre papel de filtro.
e depois amnia concentrada R at colorao rsea. Arrefea,
junte cido actico glacial R at descolorao e um excesso Em paralelo trate a soluo padro nas mesmas condies da
de 0,5 ml. Se necessrio, filtre e lave o filtro. Complete 20 ml soluo problema.
2. Mtodos
Analticos
com gua R. Tome 12 ml da soluo obtida. A colorao da mancha obtida com a soluo problema no
Soluo padro (standard). Prepare como descrito para a mais intensa que a da mancha obtida com o padro.
soluo problema, usando o volume prescrito de soluo a
10 ppm de chumbo (Pb) R em vez da amostra e seque na
MTODO F
estufa a 100-105 C. A 10 ml da soluo obtida junte 2 ml da
soluo problema.
Soluo problema. Passe para um matrs de mineralizao
Soluo de monitorizao. Prepare do mesmo modo que de 100 ml limpo e seco a quantidade ou o volume prescrito da
a soluo problema, juntando amostra o mesmo volume amostra (pode usar-se um balo de 300 ml se a quantidade de
de soluo a 10 ppm de chumbo (Pb) R prescrito para a espuma que se forma for muito abundante). Fixe o balo com
preparao da soluo padro e aquea secura em estufa a um ngulo de 45 e, se a amostra for slida, junte um volume
100-105C. A 10 ml da soluo obtida junte 2 ml da soluo suficiente de uma mistura de 8 ml de cido sulfrico R e
problema. 10 ml de cido ntrico R, de modo a humedecer
Ensaio em branco. Mistura de 10 ml de gua R e 2 ml da completamente a substncia. Se a amostra for lquida,
soluo da amostra. junte alguns mililitros de uma mistura de 8 ml de cido
sulfrico R e 10 ml de cido ntrico R. Aquea suavemente
Junte a cada uma das solues 2 ml de soluo tampo de at incio da reaco, deixe a reaco estabilizar e junte doses
pH 3,5 R. Misture e junte 1,2 ml de reagente de tiocetamida suplementares da mesma mistura de cidos, aquecendo aps
R. Misture imediatamente. Examine aps 2 min. cada adio, at que o volume total adicionado seja igual a
O ensaio no vlido se a soluo padro comparada com 18 ml. Aumente a temperatura e leve suavemente ebulio
o ensaio em branco, no apresentar uma ligeira colorao at que a soluo se torne mais escura. Arrefea, junte 2 ml
castanha eventual, ou se a da soluo de monitorizao no de cido ntrico R e aquea de novo at ao escurecimento
for, pelo menos, to intensa como a da soluo padro. da soluo. Continue a operao de aquecimento seguida
de adio de cido ntrico R at que a soluo no escurea
A amostra atisfaz ao ensaio se a colorao castanha eventual mais e aquea ento fortemente at obter libertao de fumos
da soluo preparada a partir da soluo da amostra no for brancos e densos. Arrefea, junte com precauo 5 ml de
mais intensa que a do padro.
gua R e leve cuidadosamente ebulio at obter fumos
Se for difcil concluir o resultado, filtre as solues por brancos e densos. Prossiga o aquecimento para reduzir
membrana filtrante (dimenso de poro 3 m: ver figura 3, a soluo a 2-3 ml. Arrefea, junte com precauo 5 ml
sem o pr-filtro). de gua R e examine a colorao da soluo. Se a soluo
tiver colorao amarela, junte com precauo 1 ml de
Filtre lenta e regularmente, aplicando uma presso moderada
soluo concentrada de perxido de hidrognio R e evapore
no mbolo. Compare as manchas apresentadas pelos filtros
de novo at obter libertao de fumos brancos e densos e
com as diferentes solues.
reduza o volume a 2-3 ml. Se a cor da soluo se mantiver
amarela, repita a juno de 5 ml de gua R e 1 ml de soluo
MTODO E concentrada de perxido de hidrognio R at que a soluo
se torne incolor. Arrefea, dilua com precauo com gua
Soluo problema. Dissolva a quantidade prescrita da R e transfira a soluo para um tubo de 50 ml para ensaio
amostra em 30 ml de gua R ou no volume prescrito. colorimtrico comparativo, lavando de modo a obter um
volume total que no ultrapasse 25 ml. Ajuste a soluo para
Soluo padro (standard). Salvo indicao em contrrio, pH 3,0-4,0 com amnia concentrada R1, utilizando como
dilua o volume prescrito da soluo a 1 ppm de chumbo (Pb)
indicador externo um papel indicador de curto intervalo
R para o mesmo volume da soluo problema.
(pode utilizar-se amnia diluda R1 medida que o intervalo
Prepare a aparelhagem de filtrao adaptando o bico duma especfico se aproximar) complete 40 ml com gua R e
seringa de 50 ml, sem mbolo, a um suporte contendo, sobre misture. Junte 2 ml de soluo tampo de pH 3,5 R misture
a placa, uma membrana filtrante (dimetro dos poros 3 m) e e junte 1,2 ml de reagente de tioacetamida R. Misture
por cima um pr-filtro (Figura 3). imediatamente. Complete 50 ml com gua R e misture.
Verta a soluo da amostra no corpo da seringa, adapte o Soluo padro (standrad). Prepare a soluo padro ao
mbolo e em seguida exera uma presso regular sobre este mesmo tempo e do mesmo modo que a soluo problema,
at filtrao completa. Abra o suporte e retire o pr-filtro; utilizando o volume prescrito de soluo a 10 ppm de
verifique se a membrana filtrante ficou isenta de impurezas chumbo (Pb) R.
e, caso contrrio, substitua-a e recomece a operao nas
mesmas condies. Soluo de monitorizao. Prepare do mesmo modo que
a soluo problema, juntando amostra o mesmo volume
Ao pr-filtrado ou ao volume prescrito do pr-filtrado junte
prescrito para a preparao da soluo padro de soluo a
2 ml de soluo tampo de pH 3,5 R e 1,2 ml de reagente de
10 ppm de chumbo (Pb) R.
tioacetamida R. Misture, deixe em repouso durante
10 min, filtre como anteriormente mas invertendo a ordem Soluo em branco. Prepare a soluo em branco do mesmo
dos filtros, atravessando o lquido a membrana filtrante modo que a soluo problema, mas sem a amostra.

Examine as solues verticalmente sobre fundo branco. Se de perxido de hidrognio. Deixe a amostra reagir com cada
aps 2 min. se desenvolver colorao castanha na soluo reagente adicionado antes de adicionar o prximo. Transfira
problema, no mais intensa que a colorao da soluo a mistura para um recipiente de digesto resistente a presso
padro. elevada, seco (fluoropolmero ou quartzo).
O ensaio no vlido se a soluo padro no apresentar uma Soluo padro (standard). Prepare a soluo nas mesmas
colorao castanha quando comparada com a soluo em condies da soluo problema, usando o volume prescrito de
branco ou se a soluo de monitorizao no for, pelo menos, soluo a 10 ppm de chumbo (Pb) em vez da amostra.
2. Mtodos
Analticos
to intensa como a soluo padro.
Soluo de monitorizao. Prepare do mesmo modo que a
Se for difcil concluir o resultado, filtre as solues por soluo problema, juntando amostra o volume de soluo
membrana filtrante (dimenso de poro 3 m; ver figura 3, a 10 ppm de chumbo (Pb) R prescrito para a preparao de
sem o pr-filtro). Filtre lenta e regularmente, por presso soluo padro.
moderada e constante sobre o mbolo. Compare as manchas
Soluo em branco. Prepare a soluo do mesmo modo que a
obtidas nos filtros com as diferentes solues.
soluo problema, mas sem a amostra.
Feche os recipientes e coloque-os num forno micro-ondas
MTODO G de laboratrio. Efectue a digesto usando uma sequncia
de dois programas adequados. Desenhe os programas com
CUIDADO: devem ser respeitadas as precaues de segurana vrias etapas de modo a controlar a reaco, monitorizar a
recomendadas pelo fabricante e as instrues de utilizao, presso, a temperatura ou a energia, consoante o forno de
sempre que se usam recipiente de alta presso. Os ciclos de micro-ondas utilizado. Depois do primeiro programa, deixe
digesto tm que ser executados de acordo com o tipo de arrefecer o recipiente de digesto antes de o abrir. Junte
forno micro-ondas utilizados (por exemplo, fornos de micro- a cada um dos recipientes 2,0 ml de soluo concentrada
-ondas controlo de energia; ou controlo de temperatura ou de perxido de hidrognio R e digira usando o segundo
fornos com alta presso). O ciclo deve estar de acordo com programa. Depois deste segundo programa deixe o recipiente
as instrues do fabricante. O ciclo de digesto adequado de digesto arrefecer antes de o abrir. Para obter uma soluo
quando se obtm uma soluo transparente. lmpida, pode ser necessrio repetir a adio de soluo
Soluo problema. Tome uma quantidade prescrita da concentrada de perxido de hidrognio R e submet-la
amostra (no mais do que 0,5 g) num matrs limpo novamente ao segundo programa de digesto.
apropriado. Junte sucessivamente 2,7 ml de cido sulfrico Arrefea, dilua com precauo com gua R, lavando de modo
R, 3,3 ml de cido aztico R e 2,0 ml de soluo concentrada a obter um volume total que no ultrapasse 25 ml.
(Mtodo E)
(Mtodo E)
FIGURA 3 Aparelho para o ensaio E dos metais pesados


2.4.14. Cinzas sulfricas
Ajuste para pH 3,0-4,0 com amnia concentrada R1, 2.4.11. FOSFATOS

utilizando como indicador externo um papel indicador de
curto intervalo (pode usar-se amnia diluda R1 medida que A 100 ml da soluo preparada e eventualmente neutralizada
o intervalo especfico se aproximar), complete 40 ml com conforme o prescrito, junte 4 ml de reagente sulfomolbdico
gua R e misture. Junte 2 ml de soluo tampo de pH 3,5 R R3.
misture e junte 1,2 ml de reagente de tiocetamida R. Misture
imediatamente. Complete 50 ml com gua R, misture, deixe Agite e junte 0,1 ml de soluo de cloreto estanoso R1.
2. Mtodos
Analticos
em repouso durante 2 min. Prepare o padro nas mesmas condies utilizando 2 ml de

soluo a 5 ppm de fosfato (PO4) R e 98 ml de gua R. Aps
Filtre as solues por membrana filtrante (dimenso de 10 min, compare as coloraes, utilizando 20 ml de cada uma
poro 3 m; ver figura 3, sem o pr-filtro). Filtre lenta e delas.
regularmente, aplicando uma presso moderada no mbolo.
Compare as manchas obtidas nos filtros com as diferentes A colorao eventual da soluo da amostra no mais
intensa que a do padro.
solues.
Examine as manchas nos filtros. A mancha castanha da
soluo problema no mais intensa que a obtida com a 2.4.12. POTSSIO
soluo padro.
A 10 ml da soluo prescrita, junte 2 ml duma soluo
O ensaio no vlido se a soluo padro no revelar uma recentemente preparada de tetrafenilborato de sdio R a
colorao castanha quando comparada com a mancha 10 g/l.
correspondente soluo em branco, ou se a da soluo Prepare o padro nas mesmas condies utilizando uma
de monitorizao no for, pelo menos, to intensa como a mistura de 5 ml de soluo a 20 ppm de potssio (K) R e 5 ml
mancha da soluo padro. de gua R.
Aps 5 min, se a soluo da amostra apresentar opalescncia,
no mais pronunciada que a do padro.
2.4.9. FERRO
Dissolva a quantidade prescrita da amostra em gua R e 2.4.13. SULFATOS
complete 10 ml com o mesmo solvente ou utilize 10 ml da
soluo prescrita. Junte 2 ml duma soluo de cido ctrico R Todas as solues utilizadas neste ensaio so preparadas
a 200 g/l e 0,1 ml de cido tiogliclico R. Misture, alcalinize com gua destilada R.
com amnia R e complete 20 ml com gua R. Prepare o
A 4,5 ml de soluo a 10 ppm de sulfato (SO4) R1, junte 3 ml
padro nas mesmas condies utilizando 10 ml de soluo a
duma soluo de cloreto de brio R a 250 g/l. Agite e deixe em
1 ppm de ferro (Fe) R. repouso durante 1 min. A 2,5 ml desta soluo junte 15 ml
Aps 5 min, a colorao rsea eventual da soluo da amostra da soluo problema e 0,5 ml de cido actico R. Prepare o
no mais intensa que a do padro. padro nas mesmas condies utilizando 15 ml de soluo a
10 ppm de sulfato (SO4) R em vez da soluo problema.
Aps 5 min, se a soluo problema apresentar opalescncia,
2.4.10. CHUMBO NOS ACARES no mais pronunciada que a do padro.
Determine a quantidade de chumbo por espectrometria de

absoro atmica (2.2.23, Mtodo II).
2.4.14. CINZAS SULFRICAS
Aquea num cadinho apropriado (de slica, de platina, de
Soluo problema. Dissolva 20,0 g da amostra numa mistura
porcelana ou de quartzo) a 600 50C durante 30 min.
de volumes iguais de cido actico diludo R e gua R e Deixe arrefecer em exsicador em presena de gel de slica
complete 100,0 ml com a mesma mistura de solventes. anidro e pese. No cadinho introduza a tomada de ensaio
Junte 2,0 ml duma soluo de pirrolidinaditiocarbamato de e pese. Humedea a amostra com um pouco de cido
amnio R a 10 g/l lmpida e 10,0 ml de metilisobutilcetona sulfrico R (geralmente 1 ml) e aquea suavemente, a uma
R, agitando em seguida, ao abrigo de luz intensa, temperatura to baixa quanto possvel, at carbonizao
durante 30 s. Deixe separar as duas fases e utilize a fase completa da amostra. Aps arrefecimento, humedea
metilisobutilcetnica. o resduo com um pouco de cido sulfrico R. Aquea
suavemente at que no haja mais libertao de fumos
Solues padro. Prepare 3 solues padro nas mesmas brancos e, de seguida, calcine a 600 50C at completa
condies da soluo da amostra, mas adicionando-lhe incinerao do resduo. Tome as precaues convenientes
respectivamente 0,5 ml, 1,0 ml e 1,5 ml de soluo a 10 ppm para que no haja emisso de chamas durante todo o
de chumbo (Pb) R, alm dos 20,0 g da amostra. processo. Deixe arrefecer o cadinho em exsicador em
presena de gel de slica anidro, pese de novo e calcule a
Acerte o aparelho em zero, utilizando a metilisobutilcetona
massa do resduo.
R tratada nas mesmas condies que a soluo problema,
mas sem a amostra. Determine a absorvncia em 283,3 nm Se a massa do resduo assim obtido ultrapassar o limite
utilizando uma lmpada de ctodo oco de chumbo como indicado, repita a adio de cido sulfrico, depois a
fonte de radiao e uma chama de ar-acetileno. calcinao como anteriormente durante perodos de 30 min
at que 2 pesagens no difiram de mais de 0,5 mg ou que
A amostra no contm mais de 0,5 ppm de chumbo, salvo a percentagem de resduo esteja conforme com o limite
indicao em contrrio na monografia. prescrito.

2.4.18. Formaldedo livre
A quantidade de substncia utilizada para o ensaio A fluorescncia (I1-I3) da soluo problema no superior
(habitualmente 1-2 g) escolhida de modo a obter, no limite fluorescncia (I2-I3) da soluo padro.
prescrito, um resduo (habitualmente na ordem de 1 mg) que
possa ser pesado com uma suficiente exactido.
2.4.18. FORMALDEDO LIVRE
2.4.15. NQUEL NOS POLIIS Salvo indicao em contrrio, utilize o mtodo A. O mtodo
2. Mtodos
Analticos
B est indicado para vacinas quando se juntou metabissulfito
Determine a quantidade de nquel por espectrometria de de sdio para neutralizar o excesso da formaldedo.
absoro atmica (2.2.23, Mtodo II).
Soluo problema. Dissolva 20,0 g da amostra numa MTODO A
mistura em volumes iguais de cido actico diludo R
e gua R e complete 100,0 ml com a mesma mistura Nas vacinas para uso humano, prepare uma diluio a 1/10
de solventes. Junte 2,0 ml duma soluo saturada de da amostra. Nas anatoxinas bacterianas para uso veterinrio,
pirrolidinaditiocarbamato de amnio R (a cerca de 10 g/l) prepare uma diluio a 1/25 da amostra.
e 10,0 ml de metilisobutilcetona R e agite ao abrigo de luz
intensa durante 30 s. Deixe separar as duas fases e utilize a A 1 ml da diluio junte 4 ml de gua R e 5 ml de reagente de
acetilacetona R1. Mantenha o tubo em banho de gua a 40C
fase metilisobutilcetnica.
durante 40 min. Examine as solues segundo o eixo vertical
Solues padro. Prepare 3 solues de comparao nas dos tubos. A soluo no mais corada que uma soluo
mesmas condies da soluo da amostra, mas adicionando- padro preparada, simultaneamente e nas mesmas condies,
-lhes, respectivamente, 0,5 ml, 1 ml e 1,5 ml da soluo a substituindo a diluio da amostra por 1 ml de uma diluio
10 ppm de nquel (Ni) R, alm dos 20,0 g da amostra. Acerte de formaldedo R que contenha 20 g de formaldedo (CH2O)
o aparelho em zero, utilizando a metilisobutilcetona R por mililitro.
tratada como foi indicado na preparao da soluo problema
mas sem a adio desta. Determine a absorvncia em 232 nm
utilizando uma lmpada de ctodo oco de nquel como fonte MTODO B
de radiao e uma chama ar-acetileno.
Soluo problema. Prepare uma diluio da amostra a
A amostra no contm mais de 1 ppm de nquel, salvo 1/200 com gua R. Se a amostra apresentada na forma de
indicao em contrrio na monografia. emulso, prepare uma diluio equivalente utilizando a fase
aquosa previamente separada por um processo apropriado
(ver adiante). Se utilizado um dos mtodos descritos a
2.4.16. CINZAS TOTAIS seguir para separar a fase aquosa, utilize uma diluio a 1/20
desta ltima.
Aquea ao rubro um cadinho de slica ou de platina durante Solues padro. Prepare solues que contenham 0,25 g/l,
30 min. Deixe arrefecer em exsicador e pese. Salvo indicao 0,50 g/l, 1,00 g/l e 2,00 g/l de CH2O diluindo a soluo de
em contrrio, introduza no cadinho 1,00 g da substncia ou formaldedo R com gua R. Prepare diluies a 1/200 com
do frmaco vegetal pulverizado. Distribua uniformemente a gua R de cada uma das solues.
tomada de ensaio no interior do cadinho. Seque durante 1 h
a 100-105C e incinere numa mufla a 600 25C, A amostra Passe para tubos de ensaio, respectivamente, 0,5 ml da soluo
no se inflama durante a operao. Continue a incinerao problema e 0,5 ml de cada uma das solues padro e junte
at massa constante. Depois de cada incinerao deixe em cada 5,0 ml de uma soluo recentemente preparada de
cloridrato de metilbenzotiazolona-hidrazona R a 0,5 g/l. Feche
arrefecer o cadinho em exsicador. Se as cinzas contiverem
os tubos, agite e deixe em repouso durante 60 min. Junte 1 ml
ainda partculas negras depois de uma incinerao
de reagente de cloreto frrico-cido sulfmico R e deixe em
prolongada, retome-as com gua quente e filtre por um filtro
repouso durante 15 min. Determine a absorvncia (2.2.25) das
sem cinzas. Incinere de novo o resduo com o filtro. Rena solues em 628 nm. Calcule o teor de formaldedo na amostra
o filtrado e as cinzas, evapore cautelosamente secura e a partir da curva de calibrao construda com as solues
incinere at massa constante. padro. O ensaio no vlido se o coeficiente de correlao (r)
da curva de calibrao inferior a 0,97.
2.4.17. ALUMNIO Emulses. Se a amostra se apresenta na forma de emulso,

separe a fase aquosa por um processo apropriado e utilize
Numa ampola de decantao introduza a soluo indicada essa fase para preparar a soluo problema. Os processos a
e agite 2 vezes com 20 ml de cada vez e 1 vez com 10 ml de seguir descritos revelaram-se apropriados.
soluo clorofrmica de hidroxiquinolena R a 5 g/l. Rena as (a) Junte 1,0 ml da amostra a 1,0 ml de miristato de
solues clorofrmicas e complete 50,0 ml com clorofrmio isopropilo R e misture. Junte 1,3 ml de cido clordrico 1 M,
R (soluo problema). Prepare o padro nas mesmas 2,0 ml de clorofrmio R e 2,7 ml de soluo de cloreto de
condies, usando a soluo de referncia. Prepare um ensaio sdio R a 9 g/l. Misture cuidadosamente. Centrifugue a
em branco nas mesmas condies, usando a soluo indicada. 15 000 g durante 60 min. Transfira a fase aquosa para um
balo marcado de 10 ml e complete o volume com gua R.
Determine a intensidade de fluorescncia (2.2.21) da soluo Se este processo no permite separar a fase aquosa, junte
problema (I1), do padro (I2)e do ensaio em branco (I3), soluo de cloreto de sdio 100 g/l de polissorbato 20 R e
utilizando um feixe de luz excitadora de 392 nm e um filtro repita a operao de centrifugao, desta vez a 22 500 g.
secundrio cuja zona de permeabilidade esteja centrada em
518 nm ou um monocromador regulado para este mesmo (b) Junte 1,0 ml da amostra a 1,0 ml de soluo de cloreto de
comprimento de onda. sdio R a 100 g/l e misture. Centrifugue a 1000 g durante

2.4.22. Composio em cidos gordos por cromatografia em fase gasosa
15 min. Transfira a fase aquosa para um balo marcado de manchas castanhas ou amarelo-acastanhadas. Retire a placa
10 ml e complete o volume com gua R. da cmara e aguarde alguns minutos. Quando a colorao
de fundo castanha da camada desaparecer, pulverize com
(c) Junte 1,0 ml da amostra a 2,0 ml de soluo de cloreto soluo de amido R; aparecem, ento, manchas azuis que,
de sdio R a 100 g/l e 3,0 ml de clorofrmio R e misture. quando secam, podem passar a castanhas e voltam de novo
Centrifugue a 1000 g durante 5 min. Transfira a fase aquosa a azuis aps pulverizao com gua R. O cromatograma
para um balo marcado de 10 ml e complete o volume com obtido com a soluo problema apresenta sempre as manchas
2. Mtodos
Analticos
gua R. seguintes, correspondentes s manchas do cromatograma

obtido com a soluo padro: uma com RF prximo de
0,5 (cido oleico) e outra com RF prximo de 0,65 (cido
2.4.19. IMPUREZAS DE REACO linoleico). Em certos leos pode aparecer uma mancha com
ALCALINA NOS LEOS GORDOS RF prximo de 0,75 (cido linolnico). Por comparao com
o cromatograma obtido com a soluo padro, verifique a
Num tubo de ensaio introduza 10 ml de acetona R ausncia, no cromatograma obtido com a soluo problema,
recentemente destilada, 0,3 ml de gua R e 0,05 ml de uma da mancha com RF 0,25 (cido ercico).
soluo de azul de bromofenol R a 0,4 g/l em etanol a 96 por
cento R. Neutralize, se necessrio, com cido clordrico
0,01 M ou hidrxido de sdio 0,01 M. Adicione 10 ml da 2.4.22. COMPOSIO EM CIDOS
amostra, agite e deixe em repouso. A viragem para amarelo GORDOS POR CROMATOGRAFIA
da fase superior no necessita de mais de 0,1 ml de cido
clordrico 0,01 M. EM FASE GASOSA
A pesquisa de leos estranhos efectuada sobre os steres
2.4.21. LEOS ESTRANHOS NOS metlicos dos cidos gordos do leo em anlise por
cromatografia em fase gasosa (2.2.28).
LEOS GORDOS POR CROMATOGRAFIA
EM CAMADA FINA MTODO A
Proceda por cromatografia em camada fina (2.2.27),
utilizando uma placa de kieselguhr G R. Impregne a placa, Este mtodo no se aplica aos leos contendo gliceridos de
colocando-a numa cmara fechada contendo a quantidade cidos gordos com grupos epoxi, hidroepoxi, hidroperoxi,
necessria da mistura constituda por 90 volumes de ter de ciclopropilo ou ciclopropenilo, nem aos que contm uma
petrleo R e 10 volumes de parafina lquida R, de forma a grande quantidade de cidos gordos cujo nmero de tomos
que a superfcie do lquido atinja cerca de 5 mm da camada de carbono na cadeia seja inferior a 8, nem queles cujo
de absorvente. Quando a mistura de impregnao tiver ndice de cido seja superior a 2,0.
percorrido, pelo menos, 12 cm da camada, retire a placa da Soluo problema. Se a monografia o indicar, seque a
cmara e deixe evaporar o solvente durante 5 min. Efectue o amostra antes da metilao. Pese 1,0 g da amostra em balo
desenvolvimento na mesma direco da impregnao. de colo esmerilado de 25 ml munido de refrigerante de
refluxo e de um dispositivo que permita fazer passar uma
Preparao da mistura de cidos gordos. Aquea com
corrente de gs. Junte 10 ml de metanol anidro R e 0,2 ml
refluxo durante 45 min 2 g da amostra com 30 ml de soluo
alcolica de hidrxido de potssio 0,5 M. Junte 50 ml de de soluo de hidrxido de potssio R a 60 g/l em metanol
gua R, deixe arrefecer e transfira para uma ampola de R. Adapte o refrigerante e faa passar uma corrente de azoto
decantao. Agite 3 vezes com 50 ml de ter R de cada vez. R com um dbito de cerca de 50 ml/min, agite e aquea
Rejeite as solues etreas, acidifique a fase aquosa com cido ebulio. Logo que a soluo se torne lmpida, o que demora
clordrico R e agite 3 vezes com 50 ml de ter R de cada vez. normalmente cerca de 10 min, continue o aquecimento por
Rena as solues etreas e lave-as 3 vezes com 10 ml de mais 5 min. Arrefea em gua corrente e transfira para uma
gua R de cada vez. Rejeite as guas de lavagem, desidrate ampola de decantao. Lave o balo com 5 ml de heptano R,
o ter com sulfato de sdio anidro R e filtre. Evapore o ter introduza na ampola de decantao e agite. Junte 10 ml de
em banho de gua. Utilize o resduo para preparar a soluo soluo de cloreto de sdio R a 200 g/l e agite vigorosamente.
problema. Os cidos gordos podem igualmente ser obtidos a Deixe separar as fases e transfira a fase orgnica para um
partir da soluo de sabo preparada quando da determinao balo contendo sulfato de sdio anidro R. Deixe em repouso
do insaponificvel. e filtre.
Soluo problema. Dissolva, em 4 ml de clorofrmio R, Soluo padro (a). Prepare 0,50 g de mistura de substncias
40 mg da mistura de cidos gordos obtida da amostra. de padronizao cuja composio indicada numa das
tabelas, como prescrito nas monografias individuais (se a
Soluo padro. Dissolva, em 4 ml de clorofrmio R, 40 mg da monografia no indicar uma soluo padro especial, utilize
mistura de cidos gordos obtida a partir de uma mistura de 19 uma das que se descreve na tabela 1). Dissolva em heptano R
volumes de leo de milho R e 1 volume de leo de colza R.
e complete 50,0 ml com o mesmo solvente.
Aplique, separadamente, na placa 3 l de cada soluo.
Soluo padro (b). Tome 1,0 ml da soluo padro (a) e
Desenvolva no percurso de 8 cm com uma mistura de 90
complete 10,0 ml com heptano R.
volumes de cido actico glacial R e 10 volumes de gua
R. Seque a placa a 110C durante 10 min. Deixe arrefecer Soluo padro (c). Prepare 0,50 g de uma mistura de steres
e introduza a placa, salvo indicao em contrrio, numa metlicos de cidos gordos cuja composio corresponda
cmara de cromatografia estanque saturada de vapores de mistura de cidos gordos indicada na monografia da amostra.
iodo; para tal, coloque iodo num cristalizador de forma Dissolva em heptano R e complete 50,0 ml com o mesmo
baixa no fundo da cmara. Aps um certo tempo, aparecem solvente. Podem igualmente utilizar-se misturas de steres

2.4.22. Composio em cidos gordos por cromatografia em fase gasosa
metlicos de cidos gordos disponveis no mercado. QUADRO 1 Mistura de substncias de calibrao (para a
cromatografia em fase gasosa em coluna capilar com diviso,
Coluna:
recomenda-se juntar mistura de calibrao aqueles compostos
material: slica fundida, vidro ou quartzo, da mistura problema que possuam a cadeia mais longa, quando a
anlise qualitativa realizada utilizando as curvas de calibrao)
dimenses: l = 10 m a 30 m; = 0,2 mm a 0,8 mm,
fase estacionria: macrogol 20 000 R (espessura da pelcula Mistura da seguinte composio Composio (por cento m/m)
2. Mtodos
Analticos
0,1 m a 0,5 m) ou outra fase estacionria apropriada. Laurato de metilo R 5
Miristato de metilo R 5
Gs vector: hlio para cromatografia R ou hidrognio para
cromatografia R. Palmitato de metilo R 10
Estearato de metilo R 20
Dbito: 1,3 ml/min (para uma coluna de = 0,32 mm). Araquidato de metilo R 40
Relao de diviso: 1:100 ou menos de acordo com o Oleato de metilo R 20
dimetro da coluna (1:50 se = 0,32 mm).
Temperatura:
coluna: em condies isotrmicas, 160C a 200C segundo QUADRO 2 Mistura de substncias de calibrao (para a
o comprimento da coluna e o tipo de coluna utilizada cromatografia em fase gasosa em coluna capilar com diviso,
(200C para uma coluna de 30 m de comprimento revestida recomenda-se juntar mistura de calibrao aqueles compostos
com uma pelcula de macrogol 20 000 R; se necessria ou da mistura problema que possuam a cadeia mais longa, quando a
prescrito uma programao linear de temperatura, eleve a anlise qualitativa realizada utilizando as curvas de calibrao)
temperatura da coluna de 170C a 230C razo de 3C/min
Mistura da seguinte composio Composio (por cento m/m)
por exemplo,
Caproato de metilo R 10
cmara de injeco: 250C, Caprilato de metilo R 10
detector: 250C. Caprato de metilo R 20
Deteco: ionizao de chama. Laurato de melilo R 20
lnjeco: 1 l.
Sensibilidade: soluo padro (a): a altura do pico principal
representa 50 por cento a 70 por cento da escala total do Determine o tempo de reteno reduzido (tR) de cada pico do
registador. cromatograma obtido com a soluo padro (a). tR o tempo
Conformidade do sistema: misturas de calibrao 1 e 3: de reteno determinado a partir do solvente e no a partir do
momento da injeco. Construa a curva:
resoluo: soluo padro (a): no mnimo, 1,8 entre os
picos devidos ao oleato de metilo e ao estearato de metilo, log (tR) = f (comprimento da cadeia equivalente)
relao sinal/rudo do pico devido ao miristato de metilo: no
mnimo, 5, determinada com a soluo padro (b), Os logaritmos dos tR dos cidos insaturados situam-se sobre
esta curva em pontos correspondendo a um nmero no
nmero de pratos tericos: soluo padro (a), calculado inteiro de tomos de carbono, chamado comprimento de
para o pico devido ao estearato de metilo: mnimo, 30 000. cadeia equivalente; comprimento de cadeia equivalente o
Conformidade do sistema: quando a mistura de substncias comprimento da cadeia saturada terica que teria o mesmo
do quadro 2 utilizada: tR que a do cido gordo a identificar. Por exemplo, o cido
linoleico tem o mesmo tR que o cido gordo terico com 18,8
resoluo: no mnimo, 4,0 entre os picos devidos
tomos de carbono.
ao caprilato de metilo e ao caprato de metilo do
cromatograma obtido com a soluo padro (a), Identifique os picos do cromatograma obtido com a soluo
relao sinal/rudo: no mnimo, 5 para o pico devido ao problema com a ajuda da recta obtida e do tR. Comprimentos
caproato de metilo do cromatograma obtido com a soluo de cadeia equivalente so indicados no quadro 4.
padro (b),
nmero de pratos tericos: no mnimo, 15 000, calculado QUADRO 3 Mistura de substncias de calibrao (para a
para o pico devido ao caprato de metilo do cromatograma cromatografia em fase gasosa em coluna capilar com diviso,
obtido com a soluo padro (a). recomenda-se juntar mistura de calibrao aqueles compostos
da mistura problema que possuam a cadeia mais longa, quando a
Avaliao dos cromatogramas anlise qualitativa realizada utilizando as curvas de calibrao)
Evite as condies que dem picos mascarados (presena Mistura da seguinte composio Composio (por cento m/m)
de constituintes com tempos de reteno prximos como, por
exemplo, os cidos linolnico e araqudico).
Palmitato de metilo R 10
Estearato de metilo R 15
Anlise qualitativa. Identifique os picos do cromatograma
obtido com a soluo padro (c) (cromatografia isotrmica Araquidato de metilo R 20
ou cromatografia com programao linear de temperatura). Oleato de metilo R 20
Quando e utilizada uma cromatografia isotrmica, os picos Eicosenoato de metilo R 10
podem igualmente ser identificados construindo as curvas de Be-henato de metilo R 10
calibrao com o auxlio do cromatograma obtido com a soluo Lignocerato de metillo R 10
padro (a) e informaes indicadas nos quadros 1, 2 ou 3.

2.4.23. Esteris nos leos gordos
Anlise quantitativa. Utilize o mtodo de normalizao Solues padro e avaliao dos cromatogramas. Na
no qual a soma das reas dos picos do cromatograma, ausncia de indicao especfica na monografia individual,
com excepo do pico do solvente, considerada como proceda como se descreve no Mtodo A.
sendo igual a 100 por cento. O teor de cada composto Coluna:
calculado determinando a rea do pico correspondente,
em percentagem de soma da rea de todos os picos. No material: slica fundida,
2. Mtodos
Analticos
considere picos cuja rea seja inferior a 0,05 por cento de dimenses: l = 30 m; = 0,25 mm,
rea total.
fase estacionria: macrogol 20 000 R (espessura da pelcula
Em certos casos, por exemplo quando o comprimento da 0,25 m).
cadeia dos cidos gordos inferior ou igual a 12 tomos Gs vector: hlio para cromatografia R.
de carbono, podem ser prescritos nas monografias factores
de correco de modo a converter a rea dos picos em Dbito: 0,9 ml/min.
percentagem m/m. Relao de diviso: 1:100.
Temperatura:
QUADRO 4 Comprimentos de cadeia equivalente (este valor, que
ser determinado a partir das curvas de calibrao, fornecido a Intervalo Temperatura
ttulo indicativo para uma coluna de macrogol 20 000 R) (min) (C)
Coluna 0-15 100
cido gordo Comprimento de cadeia equivalente
15-36 100 225
cido caprico 6,0 36-61 225
cido caprlico 8,0 Cmara de injeco 250
cido cprico 10,0
Detector 250
cido lurico 12,0
cido mirstico 14,0 Deteco: ionizao de chama.
cido palmtico 16,0
Injeco: 1 l.
cido palmitoleico 16,3
cido margrico 17,0
cido esterico 18,0 MTODO C
cido oleico 18,3
cido linoleico 18,8 Este mtodo no se aplica aos leos que contenham
cido gama-linolnico 19,0 gliceridos de cido gordos com grupos epoxi, hidroepoxi,
cido -linoleico 19,2 hidroperoxi, aldedo, cetona, ciclopropilo e ciclopropenilo
cido araqudico 20,0
bem como aos leos com grupos polinsaturados conjugados
ou com grupos acetilnicos por causa da destruio parcial
cido eicosenico 20,2
ou total destes grupos.
cido araquidnico 21,2
cido be-hnico 22,0 Soluo problema. Num matrs de 25 ml dissolva 0,10 g
cido ercico 22,2 da amostra em 2 ml de soluo de hidrxido de sdio R a
cido 12-oxosterico 22,7 20 g/l em metanol R e aquea com refluxo durante 30 min.
cido ricinoleico 23,9 Atravs do refrigerante, junte 2,0 ml de soluo metanlica
cido 12-hidroxisterico 23,9 de trifluoreto de boro R e aquea durante 30 min. Atravs
cido lignocrico 24,0
do refrigerante, junte 4 ml de heptano R e aquea durante
5 min. Arrefea a mistura e junte 10,0 ml de soluo
cido nervnico 24,2
saturada de cloreto de sdio R, agite durante 15 s e junte
uma quantidade de soluo saturada de cloreto de sdio R
suficiente para fazer chegar a fase superior ao colo do matrs.
MTODO B Tome 2 ml da fase superior, lave 3 vezes com 2 ml de gua R
de cada vez e seque com sulfato de sdio anidro R.
Este mtodo no se aplica nem aos leos que contenham
gliceridos de cido gordos com grupos epoxi, hidroepoxi, Solues padro, condies cromatogrficas e avaliao
hidroperoxi, ciclopropilo ou ciclopropenilo, nem aos leos dos cromatogramas. Na ausncia de indicao especfica
na monografia individual, proceda como se descreve no
cujo ndice de cido seja superior a 2,0.
Mtodo A.
Soluo problema. Num tubo de centrfuga de 10 ml com
rolha introduza 0,100 g da amostra. Dissolva com 1 ml de
heptano R e 1 ml de dimetilcarbonato R e agite energica- 2.4.23. ESTERIS NOS LEOS GORDOS
mente, aquecendo a calor brando (50-60C). Junte soluo
ainda quente 1 ml de soluo de sdio R a 12 g/l em metanol SEPARAO DA FRACO ESTERLICA
anidro R, preparada com as precaues necessrias, e agite
energicamente durante cerca de 5 min. Junte 3 ml de gua Prepare o insaponificvel e separe a fraco esterlica do leo
destilada R e agite energicamente durante cerca de 30 s. gordo por cromatografia em camada fina (2.2.27), utilizando
Centrifugue durante 15 min a 1 500 g. Injecte 1 l da fase uma placa de gel de slica R (espessura da camada entre 0,2 mm
orgnica. e 0,5 mm).

2.4.23. Esteris nos leos gordos
Soluo problema (a). Num balo de 150 ml munido de um os produtos de lavagem obtidos, respectivamente, para cada
refrigerante de refluxo introduza um volume de soluo filtro. Evapore em corrente de azoto R at obter um volume
de betulina R a 2 g/l em cloreto de metileno R escolhido de cerca de 5-10 ml. Passe para um tubo de hemlise e
de tal modo que contenha uma quantidade de betulina evapore secura em corrente de azoto R.
correspondente a cerca de 10 por cento do teor em esteris da
amostra utilizada para o doseamento (por exemplo, o volume
DOSEAMENTO DOS ESTERIS
2. Mtodos
de soluo de betulina ser de 500 l no caso do azeite e de
Analticos
1500 l no caso de outros leos vegetais). Se a monografia
exigir o clculo do teor por cento de cada esterol na fraco Cromatografia em fase gasosa (2.2.28). Efectue o doseamento
esterlica, a adio da betulina pode ser omitida. Evapore ao abrigo da humidade e prepare os solues
secura em corrente de azoto R. Junte 5,00 g (m) da amostra. extemporaneamente.
Junte 50 ml de hidrxido de potssio alcolico 2 M R e aquea Soluo problema. Aos esteris separados a partir da amostra
em banho de gua durante 1 h, agitando frequentemente por cromatografia em camada fina junte uma mistura
com movimentos circulares. Arrefea at uma temperatura recentemente preparada de 0,04 ml de clorotrimetilsilano R,
inferior a 25C e passe o contedo do balo para uma ampola 0,1 ml de hexametildissilazano R e 0,5 ml de piridina anidra
de decantao com o auxlio de 100 ml de gua R. Agite com R. Deixe em repouso durante, pelo menos, 5 min e utilize a
precauo 3 vezes com 100 ml de ter isento de perxidos R fase lquida.
de cada vez. Rena as fraces etreas numa outra ampola de
decantao que contenha 40 ml de gua R, agite suavemente Soluo padro (a). A 9 partes dos esteris separados do
durante alguns minutos, deixe separar e rejeite a fase aquosa. leo de colza R por cromatografia em camada fina, junte
Lave a fase etrea vrias vezes com 40 ml de gua R de cada 1 parte de colesterol R. Junte a esta mistura uma mistura
vez at que a fase aquosa no apresente reaco alcalina recentemente preparada de 0,04 ml de clorotrimetilsilano R,
fenolftalena. Passe a fase etrea para um balo tarado 0,1 ml de hexametildissilazano R e 0,5 ml de piridina anidra
lavando a ampola de decantao com ter isento de perxidos R. Deixe em repouso durante, pelo menos, 5 min e utilize a
R. Destile o ter com precauo e junte ao resduo 6 ml de fase lquida.
acetona R. Elimine cuidadosamente o solvente com uma Soluo padro (b). Aos esteris separados do leo de girassol
corrente de azoto R. Seque a 100-105C at massa constante, R por cromatografia em camada fina junte uma mistura
deixe arrefecer em exsicador e pese. Transfira o resduo para recentemente preparada de 0,04 ml de clorotrimetilsilano R,
um tubo de hemlise com cloreto de metileno R. Evapore 0,1 ml de hexametildissilazano R e 0,5 ml de piridina anidra
em corrente de azoto at obter um volume de cerca de 1 ml. R. Deixe em repouso durante, pelo menos, 5 min e utilize a
De acordo com o teor de insaponificvel do leo, adapte a fase lquida.
concentrao final da soluo a 25-50 mg/ml.
Coluna:
Soluo problema (b). Trate 5,00 g de leo de colza R do
mesmo modo que a soluo problema (a) a partir de Junte material: slica fundida,
50 ml de hidrxido de potssio alcolico 2 M R. dimenses: l = 20-30 m; = 0,25-0,32 mm,
Soluo problema (c). Trate 5,00 g de leo de girassol R do fase estacionria: poli[metil(95)fenil(5)]siloxano R ou
mesmo modo que a soluo problema (a) a partir de Junte poli(cianopropil)(7)(fenil)(7)(metil)(86)-siloxano R
50 ml de hidrxido de potssio alcolico 2 M R. (espessura da pelcula 0,25 m).
Soluo padro. Dissolva 25 mg de colesterol R e 10 mg de Gs vector: hidrognio para cromatografia R ou hlio para
betulina R em 1 ml de cloreto de metileno R. cromatografia R.
Utilize uma placa diferente para cada soluo problema. Velocidade linear: 30-50 cm/s (hidrognio) ou 20-35 cm/s
Aplique 10 l da soluo padro num trao de 10 mm, a (hlio).
20 mm da base da placa e 10 mm da borda esquerda, e
0,5 ml das solues problema (a), (b) ou (c), em traos de Relao de diviso: 1:50 ou 1:100.
150 mm, a 20 mm da base da placa. Desenvolva no percurso Temperatura:
de 17 cm com uma mistura de 35 volumes de ter R e 65
coluna: 260C,
volumes de hexano R. Seque as placas numa corrente de azoto
R. Pulverize com soluo de diclorofluorescena R a 2 g/l em cmara de injeco: 280C,
etanol anidro R e examine luz ultravioleta de 254 nm.
detector: 290C.
Os cromatogramas obtidos com as solues problema
apresentam bandas de RF prximos correspondendo aos Deteco: ionizao de chama.
esteris. De cada um dos cromatogramas tome uma zona
Injeco: 1 l.
da camada correspondente banda dos esteris bem como
da zona situada 2-3 mm acima e abaixo das zonas visveis Resultados: o cromatograma obtido com a soluo padro (a)
correspondendo soluo padro. Coloque estas zonas apresenta 4 picos principais correspondentes ao colesterol,
em 3 bales de 50 ml, junte a cada um 15 ml de cloreto de ao brassicasterol, ao campesterol e ao -sitosterol. O
metileno R e aquea com refluxo mantendo permanente cromatograma obtido com a soluo padro (b) apresenta
agitao durante 15 min. Filtre separadamente cada soluo 4 picos principais correspondentes ao campesterol, ao
por um filtro de vidro poroso (40) ou por papel de filtro estigmasterol, ao -sitosterol e ao 7-estigmastenol. Os
apropriado. Lave cada filtro com 3 vezes 15 ml de cloreto de tempos de reteno relativos dos diferentes esteris em
metileno R de cada vez. Introduza em 3 bales o filtrado e relao ao -sitosterol esto indicados no quadro 1.

2.4.24. Identificao e controlo dos solventes residuais
QUADRO 1 Tempos de reteno relativos dos esteris Os solventes das classes 1, 2 e 3 so indicados no captulo
em relao ao -sitosterol, obtidos com 2 colunas 5.4. Solventes residuais.
Poli(cianopropil)(7)- Poli[metil(95)- Especificam-se trs diluentes possveis para a preparao

fenil(7)(metil)(86)- fenil(5)]- das solues-me da amostra e as condies operatrias
siloxano, siloxano correspondentes para head-space da amostra gasosa
no sistema cromatogrfico. Descrevem-se dois sistemas
2. Mtodos
Analticos
Colesterol 0,64 0,63 cromatogrficos, mas deve de preferncia utilizar-se o

Brassicasterol 0,70 0,71 sistema A, ficando o sistema B normalmente reservado para
24-Metilenocolesterol 0,79 0,80 a confirmao da identidade do solvente residual. A escolha
Campesterol 0,82 0,81 de um dos trs mtodos descritos para a preparao das
Campestanol 0,83 0,82 solues-me funo das propriedades de solubilidade
Estigmasterol 0,87 0,87 da amostra e, em certos casos, da natureza dos solventes
7-Campesterol 0,93 0,92 residuais a verificar.
5,23-Estigmastadienol 0,95 0,95
Clerosterol 0,96 0,96 As condies operatrias mencionadas (head-space)
-Sitosterol 1 1 no permitem detectar com eficcia os solventes residuais
Sitostanol 1,01 1,02 seguintes: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol,
5-Avenasterol 1,03 1,03
etilenoglicol, N-metilpirrolidona e sulfolano. conveniente
5,24-Estigmastadienol 1,09 1,08 utilizar outros processos apropriados para o ensaio destes
7-Estigmastenol (1) 1,13 1,12 solventes.
A7-Avenasterol 1,18 1,16 Quando o mtodo que permite verificar os solventes residuais
Betulina 1,4 1,4 presentes numa substncia utilizado com fins quantitativos,
(1) Este esterol chamado 7-estigmasterol na literatura.
validado para a substncia em ensaio.
Examine o cromatograma obtido com a soluo problema. MTODO

Identifique os picos e calcule o teor por cento de cada esterol
na fraco esterlica usando a expresso Proceda por cromatografia em fase gasosa com injeco do
vapor em equilbrio com a amostra (head-space esttico)
A (2.2.28).
100
S
Preparao da soluo-me 1. Este mtodo de preparao
A = rea do pico correspondente ao composto a dosear, destina-se verificao dos solventes residuais nas
S = soma das reas dos picos correspondentes aos compostos substncias hidrossolveis.
indicados na tabela. Soluo-me da amostra (1). Dissolva 0,200 g da amostra em
Se a monografia o exigir, calcule o teor de cada esterol na gua R e complete 20,0 ml com o mesmo solvente,
amostra, em miligramas por 100 gramas, usando a expresso:
Preparao da soluo-me 2. Este mtodo de preparao
A ms 100 destina-se verificao dos solventes residuais nas
As m substncias insolveis na gua R.
A = rea do pico correspondente ao composto a dosear, Soluo-me da amostra (2). Dissolva 0,200 g da amostra em
N,N-dimetilformamida R (DMF) e complete 20,0 ml com o
As = rea do pico correspondente betulina, mesmo solvente.
m = massa da tomada de ensaio da amostra, em gramas,
Preparao da soluo-me 3, Este mtodo de preparao
ms = massa, em miligramas, da betulina R adicionada.
destina-se verificao da N,N-dimetilacetamida e/ou da
N,N-dimetilformamida quando se supeita ou conhecida a
presena na amostra de uma destas substncias, ou das duas.
2.4.24. IDENTIFICAO E CONTROLO
Soluo-me da amostra (3). Dissolva 0,200 g da amostra em
DOS SOLVENTES RESIDUAIS 1,3-dimetil-2-imidazolidinona R (DMI) e complete 20,0 ml
com o mesmo solvente.
Os mtodos a seguir descritos podem utilizar-se:
Em certos casos, nenhum dos trs mtodos de preparao
I. Para identificar a maioria dos solventes residuais se mostra apropriado. Deve, ento, ser demonstrado que a
(pertencentes s classes 1 e 2), presentes numa substncia natureza do diluente a utilizar e as condies de head-
activa, num excipiente ou num medicamento, quando so -space esttico a aplicar so apropriadas.
desconhecidos.
Soluo de solventes (a). Junte 9 ml de dimetilsulfxido R
II. Como ensaio limite para os solventes residuais a 1,0 ml de soluo de solventes residuais da classe 1 SQR e
(pertencentes s classes 1 e 2), presentes numa complete 100,0 ml com gua R. Tome 1,0 ml desta soluo e
substncia activa, num excipiente ou num medicamento. complete 10,0 ml com gua R.
III. Para dosear os solventes pertencentes classe 2 quando As solues de referncia correspondem aos limites seguintes:
os limites so superiores a 1000 ppm (0,1 por cento) ou
benzeno: 2 ppm,
para dosear, quando necessrio, os solventes residuais da
classe 3. tetracloreto de carbono: 4 ppm,

1,2-diclorometano: 5 ppm, cento de policianopropilfenilsiloxano e 94 por cento de

polidimetilsiloxano (1,8 a 3 m de espessura),
1,1-diclorometano: 8 ppm,
como gs vector, azoto para cromatografia R ou hlio para
1,1,1-triclorometano: 10 ppm. cromatografia R, com uma relao de diviso de 1:5 e uma
Soluo de solventes (b). Dissolva quantidades apropriadas velocidade linear de cerca de 35 cm/s,
de solventes residuais da classe 2 em dimetilsulfxido R um detector de ionizao de chama (pode ser igualmente
2. Mtodos
Analticos
e complete 100,0 ml com gua R. Dilua para obter uma utilizado um espectrmetro de massa ou um detector de
concentrao de 1/20 dos limites indicados no quadro 2 (ver captura de electres para os solventes clorados da classe 1).
5.4 Solventes residuais).
Mantenha a temperatura da coluna em 40C durante 20 min
Soluo de solventes (c). Dissolva 1,00 g do(s) solvente(s) e aumente-a depois 10C por minuto at 240C, mantendo a
presente(s) na amostra em dimetilsulfxido R ou em gua esta temperatura durante 20 min. Mantenha a temperatura
R, conforme o caso, e complete 100,0 ml com gua R. Dilua da cmara de injeco em 140C e a do injector em 250C.
esta soluo de modo a obter uma concentrao de 1/20 do(s)
limite(s) indicado(s) no quadro 1 ou 2 (ver 5.4. Solventes Em caso de interferncia da matriz, use o sistema seguinte:
residuais).
Soluo em branco. Proceda como para a soluo de Sistema B
solventes (c) mas sem adio do(s) solventes(s) (esta uma coluna capilar ou semi-capilar de slica fundida de
soluo serve para verificar a ausncia de picos que possam 30 m de comprimento e 0,32 ou 0,53 mm de dimetro
interferir). interno, recoberta com uma pelcula de macrogol
Soluo problema. Introduza num frasco para injeco 5,0 ml 20 000 R (espessura 0,25 m),
da soluo-me da amostra e 1,0 ml da soluo em branco. como gs vector, azoto para cromatografia R ou hlio para
Soluo padro (a) (classe 1). Introduza num frasco para cromatografia R, com uma relao de diviso de 1:5 e uma
injeco, 1,0 ml da soluo de solventes (a) e 5,0 ml do velocidade linear de cerca de 35 cm/s,
diluente apropriado. um detector de ionizao de chama (pode ser igualmente
Soluo padro (a1) (classe 1). Introduza num frasco para utilizado um espectrmetro de massa ou um detector de
injeco, 5,0 ml da soluo-me da amostra e 1,0 ml da captura de electres para os solventes clorados da classe 1).
soluo de solventes (a). Mantenha a temperatura da coluna em 50C durante 20 min
Soluo padro (b) (classe 2). Introduza num frasco para e aumente-a depois 6C por minuto at 165C, mantendo a
injeco, 1,0 ml da soluo de solventes (b) e 5,0 ml do esta temperatura durante 20 min. Mantenha a temperatura
diluente apropriado. da cmara de injeco em 140C e a do injector em 250C.
Soluo padro (c) Introduza num frasco para injeco, Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (a) na coluna
5,0 ml da soluo-me da amostra e 1,0 ml da soluo de descrita no Sistema A e registe o cromatograma em
solventes (c). condies que permitam medir a relao sinal/rudo do pico
do 1,1,1-tricloroetano. Esta relao igual ou superior a 5.
Soluo padro (d). Introduza num frasco para injeco, Apresenta-se um cromatograma tipo na figura 4.
1,0 ml da soluo em branco e 5,0 ml do diluente apropriado.
Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (a1) na
Feche os frascos de forma estanque com uma membrana coluna descrita no Sistema A. possvel detectar os picos
de borracha revestida de politetrafluoroetileno e capsule correspondentes aos solventes residuais da classe 1.
com uma cpsula de alumnio. Agite de modo a obter uma
soluo homognea. Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (b) na coluna
descrita no Sistema A e registe o cromatograma em condies
Podem ser utilizadas as condies de head-space esttico que permitam determinar a resoluo entre os picos do
seguintes: acetonitrilo e do cloreto de metileno. O sistema s vlido
Mtodo de preparao da se o cromatograma obtido for semelhante ao cromatograma
soluo-me representado na figura 5 e se a resoluo entre os picos do
Condies operatrias 1 2 3 acetonitrilo e do cloreto de metileno no for inferior a 1,0.
Temperatura de equilibrao (C) 80 105 80 Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo problema na coluna descrita
Tempo de equilibrao (min) 60 45 45 no Sistema A. Se, no cromatograma obtido, no aparecer nenhum
Temperatura de transferncia (C) 85 110 105 pico correspondente a um dos picos dos cromatogramas obtidos
Gs vector: azoto para cromatografia R ou hlio para cromatografia R,
com as solues padro (a) ou (b), a amostra satisfaz ao ensaio. Se
a uma presso apropriada o cromatograma obtido apresentar um pico correspondente a um
dos picos dos cromatogramas obtidos com as solues padro (a)
Durao da pressurizao (s) 30 30 30 ou (b), empregue o sistema B.
Volume injectado (ml) 1 1 1
Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (a) na coluna
descrita no Sistema B e registe o cromatograma em
A cromatografia pode ser realizada utilizando: condies que permitam determinar a relao sinal/rudo
do pico do benzeno. Esta relao igual ou superior a 5
Sistema A (um cromatograma tipo est representado na figura 6).
uma coluna capilar ou semi-capilar de slica fundida de Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (a1) na
30 m de comprimento e 0,32 ou 0,53 mm de dimetro coluna descrita no Sistema B. ainda possvel detectar
interno, recoberta com uma mistura reticulada de 6 por picos correspondentes aos solventes residuais da classe 1.


2. Mtodos
Analticos
1: l,1-dicloroetileno; 2: 1,1,1-tricloroetano 3: tetracloreto de carbono; 4: benzeno; 5: 1,2-dicloroetano;
FIGURA 4 Cromatograma-tipo dos solventes da classe 1 nas condies descritas para o sistema A e procedimento 1.
Detector de ionizao de chama.
FIGURA 5 Cromatograma-tipo dos solventes da classe 2 nas condies descritas para o sistema A e procedimento 1.

2. Mtodos
Analticos
1: l,1-dicloroetileno; 2: 1,1,1-tricloroetano; 3: tetracloreto de carbono; 4: benzeno; 5: 1,2-dicloroetano.
FIGURA 6 Cromatograma-tipo dos solventes da classe 1 nas condies descritas para o sistema B e procedimento 1.
FIGURA 7 Cromatograma-tipo dos solventes da classe 2 nas condies descritas para o sistema B e procedimento 1.

2.4.25. xido de etileno e dioxano

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 8 Esquema relativo identificao dos solventes residuais e aplicao dos ensaios limite.
Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (b) na superior a metade da rea mdia do pico correspondente do
coluna descrita no Sistema B e registe o cromatograma cromatograma obtido com a soluo padro (c). O ensaio s
em condies que permitam determinar a resoluo entre vlido se, aps 3 injeces sucessivas da soluo problema
os picos do acetonitrilo e do tricloroetileno. O sistema e da soluo padro (c), o desvio padro relativo da diferena
s vlido se o cromatograma obtido for semelhante ao entre as reas dos picos obtidos, respectivamente, com as
cromatograma representado na figura 7 e se a resoluo duas solues, no for superior a 15 por cento.
entre os picos do acetonitrilo e do tricloroetileno no for A figura 8 representa um diagrama ilustrativo do processo.
inferior a 1,0.
Quando o solvente residual (classe 2 ou 3) est presente em
Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo problema na coluna concentrao igual ou superior a 0,1 por cento, pode ser
descrita no Sistema B. Se, no cromatograma obtido, no objecto de uma anlise quantitativa pelo mtodo das adies,
aparecer nenhum pico correspondente a um dos picos dos por meio do sistema A ou do sistema B.
cromatogramas obtidos com as solues padro (a) ou (b),
a amostra satisfaz ao ensaio. Se o cromatograma obtido
apresentar um (uns) pico(s) correspondente(s) a um dos 2.4.25. XIDO DE ETILENO E DIOXANO
picos dos cromatogramas obtidos com as solues padro (a)
ou (b) e se esta correspondncia entre os picos confirmar a Este ensaio destinado ao controlo dos resduos de
observada com o sistema A, proceda do seguinte modo: oxido de etileno em amostras solveis em gua ou na
Injecte 1 ml da fase gasosa da soluo padro (c) na coluna dimetilacetamida.
descrita no Sistema A ou no Sistema B. Se necessrio, ajuste Para as substncias insolveis ou insuficientemente solveis
a sensibilidade do sistema de modo que a altura do pico nestes solventes, a preparao da soluo me e as condies
correspondente ao solvente residual identificado represente, do head-space so indicadas nas monografias especficas.
no mnimo, 50 por cento da escala total do registador.
Proceda por cromatografia em fase gasosa com injeco do
Injecte na coluna 1 ml da fase gasosa da soluo padro (d). vapor em equilbrio com a amostra (head-space) (2.2.28).
No se observa qualquer pico interferente.
A. Para as amostras solveis em gua ou com ela miscveis,
Injecte na coluna 1 ml da fase gasosa da soluo problema e proceda do seguinte modo:
1 ml da fase gasosa da soluo padro (c). Repita estas duas
Soluo problema. Para um matrs de 10 ml (outras
injeces mais 2 vezes.
capacidades podero ser usadas, em conformidade com as
A rea mdia do pico devido ao(s) solvente(s) residual(ais) condies operatrias correspondentes) pese 1,00 g (MT)
dos cromatogramas obtidos com a soluo problema no da substncia em anlise e junte 1,0 ml de gua R. Tape e

2.4.25. xido de etileno e dioxano
misture para obter soluo homognea. Deixe em repouso mantido durante 5 min; a temperatura da cmara de injeco
a 70C durante 45 min. mantida a 150C e a do detector a 250C.
Soluo padro (a). Para idntico matrs de 10 ml pese Injecte um volume apropriado, por exemplo 1,0 ml, da
1,00 g (MR) da substncia em anlise. Junte 0,5 ml de fase gasosa da soluo padro (b). Ajuste a sensibilidade do
soluo de xido de etileno R3 e 0,50 ml de soluo sistema de modo que a altura dos picos do cromatograma
de dioxano R1. Tape e misture para obter soluo obtido, correspondentes ao xido de etileno e ao acetaldedo,
2. Mtodos
Analticos
homognea. Deixe em repouso a 70C durante 45 min. representem, no mnimo, 15 por cento da escala total do
Soluo padro (b). A 0,50 ml de soluo de xido de registador.
etileno R3, contidos num matrs de 10 ml, junte 0,1 ml de O ensaio s vlido se:
uma soluo recentemente preparada de acetaldedo R a
0,01 g/l e 0,1 ml da soluo de dioxano Rl. Tape e misture no cromatograma obtido com a soluo padro (b), a
para obter soluo homognea. Deixe em repouso a 70C resoluo entre os picos correspondentes, respectivamente,
durante 45 min. ao acetaldedo e ao xido de etileno no for inferior a 2,0,
B. Para as amostras solveis em dimetilacetamida ou com no cromatograma obtido com a soluo padro (b), a
ela miscveis proceda como segue: relao sinal-rudo do pico correspondente ao dioxano no
for inferior a 5.
Soluo problema. Para um matrs de 10 ml (podero
ser usadas outras capacidades em conformidade com as Injecte, separadamente, volumes apropriados, por exemplo
condies operatrias correspondentes) pese 1,00 g (MT) da 1,0 ml [ou volumes idnticos aos utilizados para a soluo
substncia em anlise e junte 1,0 ml de dimetilacetamida R padro (b) das fases gasosas da soluo em anlise e da
e 0,20 ml de gua R. Tape e misture para obter soluo soluo padro (a)]. Repita mais duas vezes.
homognea. Deixe em repouso a 90C durante 45 min.
Verificao da preciso
Soluo padro (a). Para um matrs idntico pese
1,00 g (MR) da substncia em anlise, junte 1,0 ml de Para cada uma das repeties e para o xido de etileno e para
dimetilacetamida R, 0,10 ml de soluo de dioxano R e o dioxano, calcule a diferena entre as reas dos picos
0,10 ml de soluo de xido de etileno R2. Tape e misture obtidos, respectivamente, com a soluo problema e a
para obter soluo homognea. Deixe em repouso a 90C soluo padro (a). O doseamento s vlido se o desvio
durante 45 min. padro relativo dos 3 valores obtidos para o xido de etileno
Soluo padro (b). Mea 0,10 ml de xido de etileno R2 no for superior a 15 por cento e se o desvio padro relativo
para um matrs de 10 ml de capacidade, junte 0,1 ml de dos 3 valores obtidos para o dioxano no for superior a 10
uma soluo recentemente preparada de acetaldedo R a por cento. Se as massas das tomadas de ensaio usadas para as
0,01 g/l e 0,10 ml de soluo de dioxano R. Tape e misture solues padro se afastarem de 1,00 g mais de 0,5 por cento,
para obter soluo homognea. Deixe em repouso a 70C proceda s correces apropriadas.
durante 45 min.
O teor em xido de etileno, em partes por milho, calculado
Poder utilizar as condies seguintes para o ensaio por atravs da expresso:
head-space
AT C
temperatura de equilibrao: 70C, no mnimo (90C para
(AR MT) (AT MR)
as solues em dimetilacetamida),
durao da equilibrao: 45 min,
AT = rea do pico correspondente ao xido de etileno do
temperatura da via de transferncia: 75C (150C para as
cromatograma obtido com a soluo problema,
solues em dimetilcetamida),
AR = rea do pico correspondente ao xido de etileno do
vector: hlio para cromatografia R, cromatograma obtido com a soluo padro (a),
durao da pressurizao: 1 min, MT = massa (em gramas) da substncia na soluo problema,
durao da injeco: 12 segundos. MR = massa (em gramas) da substncia na soluo padro (a),
A cromatografia pode ser realizada utilizando: C = quantidade de xido de etileno (em g) adicionada soluo
padro (a).
uma coluna de vidro ou de slica fundida, de 30 m de
comprimento e 0,32 mm de dimetro interno, revestida O teor em dioxano, em partes por milho, calculado atravs
com uma camada de polidimetilsiloxano R de 1,0 m de da expresso:
espessura,
DT C
como gs vector, hlio para cromatografia R ou azoto para (DR MT) (DT MR)
cromatografia R, com uma velocidade linear de cerca de
20 cm/s e com uma relao de diviso de 1:20,
um detector de ionizao de chama. DT = rea do pico correspondente ao dioxano do cromatograma
obtido com a soluo problema,
Programe a temperatura da coluna como segue: isotrmica
inicial a 50C durante 5 min, seguida de uma primeira rampa DR = rea do pico correspondenle ao dioxano do cromatograma
de elevao da temperatura, a 5C por minuto, at aos 180C: obtido com a soluo padro (a),
de imediato, segunda rampa de elevao de temperatura, a C = quantidade (em g) da soluo de dioxano adicionada
30C por minuto, at ao patamar isotrmico final de 230C, soluo padro (a).

2.4.27. Metais pesados nos frmacos vegetais e nos leos gordos
2.4.26. N,N-DIMETILANILINA hidrxido de sdio 1 M e 1,0 ml da soluo do padro interno.

Rolhe e agite energicamente durante 1 min. Centrifugue, se
Mtodo A. Proceda por cromatografia em fase gasosa (2.2.28) necessrio. Utilize a fase superior.
utilizando a N,N-dimetilanilina R como padro interno. A cromatografia pode ser realizada utilizando:
Soluo do padro interno. Dissolva 50 mg de N,N- uma coluna de vidro de 2 m de comprimento e 2 mm de
-dimetilanilina R em 4 ml de cido clordrico 0,1 M e complete dimetro interno, cheia com terra de infusrios silanizada
2. Mtodos
Analticos
50 ml com gua R. Tome 1 ml da soluo e complete 100 ml para cromatografia em fase gasosa R, impregnada com 3
com gua R.
por cento m/m de polimetilfenilsiloxano R,
Soluo problema. Num tubo de ensaio com rolha, dissolva
como gs vector, azoto para cromatografia R com um
0,50 g da amostra em 30,0 ml de gua R. Junte 1,0 ml da
soluo do padro interno. Leve a soluo a uma temperatura dbito de 30 ml/min,
compreendida entre 26C e 28C. Junte 1,0 ml de soluo um detector de ionizao de chama.
concentrada de hidrxido de sdio R. Misture at dissoluo
completa. Junte 2.0 ml de trimetilpentano R. Agite durante Mantenha a temperatura da coluna em 120C e a da cmara
2 min. Deixe separar as fases. Utilize a fase superior. de injeco e a do detector em 150 C.
Soluo padro. Dissolva 50,0 mg de N,N-dimetilanilina R lnjecte 1 l da soluo problema e 1 l da soluo padro.
em 4,0 ml de cido clordrico 0,1 M e complete 50,0 ml com
gua R. Tome 1,0 ml desta soluo e complete 100,0 ml com
gua R. Tome 1,0 ml desta soluo e complete 30,0 ml com 2.4.27. METAIS PESADOS NOS
gua R. Junte 1,0 ml da soluo do padro interno e 1,0 ml FRMACOS VEGETAIS E NOS LEOS
de soluo concentrada de hidrxido de sdio R. Junte 2,0 ml
de trimetilpentano R. Agite durante 2 min. Deixe separar as GORDOS
fases. Utilize a fase superior.
Proceda por espectrometria de absoro atmica (2.2.23).
A cromatografia pode ser realizada utilizando:
Ateno: Convm que se familiarize com as instrues de
uma coluna de slica fundida de 25 m de comprimento segurana e de utilizao, fornecidas pelos fabricantes dos
e 0,32 mm de dimetro interno, com a parede interna recipientes fechados para mineralizao a alta presso e do
revestida de polimetilfenilsiloxano R reticulado (espessura forno de micro-ondas de laboratrio.
da pelcula 0,52 m),
como gs vector, hlio para cromatografia R com uma
APARELHAGEM
relao de diviso de 1:20, uma presso cabea da coluna
de 50 kPa e um dbito de 20 ml/min,
A aparelhagem inclui:
um detector de ionizao de chama,
recipientes para mineralizao em politetrafluoroetileno
um tubo alinhador da diviso (split-liner) de cerca de 1 cm com um volume de cerca de 120 ml, com fecho hermtico,
de comprimento, cheio de terra de infusrios para providos de uma vlvula para regular a presso interior
cromatografia em fase gasosa R impregnado com 10 por do recipiente e um tubo em politetrafluoroetileno para
cento m/m de polidimetilsiloxano R. descarga do gs,
Mantenha a temperatura da coluna a 150C durante 5 min um sistema para fechar o recipiente hermeticamente
e depois aumente-a, a 20C por min, at 275C e mantenha aplicando a mesma fora de torso,
esta temperatura durante 3 min; mantenha a temperatura da
cmara de injeco em 220C e a do detector em 300C. um forno de micro-ondas com a frequncia megnatron de
2450 MHz com um sistema para seleccionar os aumentos
Os tempos de reteno so de cerca de 3,6 min para a N,N- de potncia de 1 por cento de 0 W a 630 70 W, um
-dimetilanilina e de cerca de 5,0 min para a N,N-dietilanilina. computador programvel, uma cmara de mineralizao
Injecte 1 l da soluo problema e 1 l da soluo padro. em que as paredes so revestidas de politetrafluoroetileno
e providas de um sistema plano rotativo, um ventilador de
Mtodo B. Proceda por cromatografia em fase gasosa velocidade regulvel e um tubo para descarga de gs,
(2.2.28), utilizando o naftaleno R como padro interno. um espectrmetro de absoro atmica equipado com
Soluo do padro interno. Dissolva 50 mg de naftaleno R lmpadas de ctodo oco como fonte de radiao, uma
em ciclo-hexano R e complete 50 ml com o mesmo solvente. lmpada de deutrio como corrector de fundo; o sistema
Tome 5 ml da soluo e complete 100 ml com ciclo-hexano R. munido de:
Soluo problema. Num tubo de ensaio com rolha coloque (a) um forno de grafite como dispositivo de atomizao
1,00 g da amostra. Junte 5 ml de hidrxido de sdio 1 M e 1,0 ml para o cdmio, cobre, ferro, nquel, chumbo e zinco,
da soluo do padro interno. Rolhe e agite energicamente
durante 1 min. Centrifugue, se necessrio. Utilize a fase (b) um sistema automtico de gerao de vapores de
superior. hidretos em fluxo contnuo para o arsnio e mercrio.
Soluo padro. A 50,0 mg de N,N-dimetilanilina R, junte

2 ml de cido clordrico R e 20,0 ml de gua R. Agite at MODO OPERATRIO
dissoluo e complete 50,0 ml com gua R. Tome 5,0 ml da
soluo e complete 250,0 ml com gua R. Coloque 1,0 ml Lave todo o material de vidro e aparelhos de laboratrio antes
desta soluo num tubo de ensaio com rolha. Junte 5 ml de do emprego com soluo de cido ntrico R a 10 g/l em gua R.

2.4.28. cido 2-etil-hexanico
Soluo problema. Num recipiente para mineralizao Arsnio

introduza a tomada de ensaio prescrita (cerca de 0,50 g da
Soluo problema. A 19,0 ml da soluo problema ou da
amostra pulverizada (1400) ou 0,50 g de leo gordo). Junte
soluo em branco como descrito anteriormente, junte 1 ml
6 ml de cido ntrico R e 4 ml de cido clordrico R. Feche o
de soluo de iodeto de potssio R a 200 g/l. Deixe em
recipiente hermeticamente. repouso a soluo problema cerca de 50 min temperatura
Coloque os recipientes para mineralizao no forno de ambiente ou cerca de 4 min a 70C.
2. Mtodos
Analticos
micro-ondas. Efectue a mineralizao em 3 etapas, segundo o Reagente cido. cido cloridrico R, isento de metais pesados.
programa seguinte previsto para 7 recipientes contendo cada
um a soluo problema: 80 por cento de potncia durante Reagente de reduo. Uma soluo de tetra-hidroborato de
15 min, 100 por cento de potncia durante 15 min, 80 por sdio R a 6 g/l numa soluo de hidrxido de sdio R a 5 g/l.
cento de potncia durante 20 min. Podem ser utilizados os parmetros instrumentais indicados
No fim do ciclo, deixe arrefecer os recipientes ao ar, junte na tabela.
a cada recipiente 4 ml de cido sulfrico R. Repita uma vez
mais o programa de mineralizao. Aps arrefecer ao ar, abra Mercrio
cada recipiente e verta a soluo lmpida e incolor obtida
num balo marcado de 50 ml. Lave cada recipiente com 2 Soluo problema. Soluo problema ou soluo em branco,
vezes 15 ml de gua R e verta os lquidos de lavagem no balo como o descrito anteriormente.
marcado. Junte 1,0 ml de soluo de nitrato de magnsio R a Reagente cido. Soluo de cido clordrico R a 515 g/l,
10 g/l e 1,0 ml de soluo de di-hidrogenofosfato de amnio R isento de metais pesados.
a 100 g/l e complete 50,0 ml com gua R.
Reagente de reduo. Soluo a 10 g/l de cloreto estanhoso R
Soluo em branco. Misture 6 ml de cido ntrico R e 4 ml em cido clordrico diludo R.
de cido clordrico R num balo de digesto. Efectue a
mineralizao do mesmo modo que utilizou na preparao da Podem ser utilizados os parmetros instrumentais indicados
soluo problema. na tabela.
CDMIO, COBRE, FERRO, NQUEL, CHUMBO E ZINCO
Determine o teor em cdmio, cobre, ferro, nquel, chumbo e

zinco pelo mtodo das adies (2.2.23, Mtodo II) utilizando
as solues padro de cada um dos elementos a dosear e
regulando o aparelho segundo os parmetros instrumentais
indicados na tabela seguinte.
O valor da absorvncia da soluo em branco
automaticamente subtrado ao valor obtido com a soluo
problema.
2.4.28. CIDO 2-ETIL-HEXANICO

Proceda por cromatografia em fase gasosa (2.2.28), utilizando
cido 3-ciclo-hexilpropinico R como padro interno.
Soluo do padro interno. Dissolva 100 mg de cido 3-ciclo-
-hexilpropinico R em ciclo-hexano R e complete 100 ml com
o mesmo solvente.
Soluo problema. A 0,300 g da amostra junte 4,0 ml de
soluo de cido clordrico R a 33 por cento V/V. Agite
energicamente durante 1 min com 1,0 ml da soluo
do padro interno. Deixe separar as fases (centrifugue,
se necessrio, para melhorar a separao). Utilize a fase
superior.
ARSNIO E MERCRIO Soluo padro. Dissolva 75,0 mg de cido 2-etil-hexanico

R na soluo do padro interno e complete 50,0 ml com a
Determine o teor em arsnio e mercrio pelo mtodo da mesma soluo. A 1,0 ml da soluo junte 4,0 ml de soluo
curva de calibrao (2.2.23, Mtodo I) por comparao com de cido clordrico R a 33 por cento V/V. Agite energicamente
as solues padro para cada um dos elementos utilizando durante 1 min. Deixe separar as fases (centrifugue se
um sistema automtico de gerao de vapores de hidretos em necessrio, para melhorar a separao). Utilize a fase
fluxo contnuo. superior.
O valor da absorvncia do lquido de compensao (branco)
automaticamente subtrado ao valor obtido com a soluo uma coluna semi-capilar de slica fundida, de 10 m de
problema. comprimento e 0,53 mm de dimetro interno, cheia com

2.4.29. Composio em cidos gordos dos leos ricos em cidos mega-3
2-nitrotereftalato de macrogol 20 000 R (espessura da (AEP; 20:5 n-3) e do cido (todo-Z)-docosa-4,7,10,13,16,19-

pelcula 1,0 m), -hexanico) (ADH; 22:6 n-3) da amostra.
hlio para cromatografia R, como gs vector, com um Padro interno: tricosanoato de metilo R.
dbito de 10 ml/min,
Soluo problema (a)
um detector de ionizao de chama.
A. Dissolva uma quantidade da amostra de acordo com as
2. Mtodos
Analticos
Utilize a programao de temperatura seguinte: indicaes do quadro junto e cerca de 70,0 mg do padro
interno numa soluo de butil-hidroxitolueno R a 50 mg/l em
trimetilpentano R e complete 10,0 ml com a mesma soluo.
Soma AEP + ADH Quantidade da amostra a

aproximada (por cento) (gramas)
30-50 0,4-0,5
50-70 0,3
70-90 0,25
Os steres etlicos esto ento prontos para a anlise.

Injecte 1 l da soluo problema e 1 l da soluo padro.
Para os trigliceridos, prossiga como se descreve para a
O ensaio s vlido se a resoluo entre os picos etapa B.
correspondentes ao cido 2-etil-hexanico (primeiro pico) e
ao padro interno no for inferior a 2,0. B. Introduza 2,0 ml da soluo obtida num tubo de quartzo e
evapore o solvente numa corrente fraca de azoto R. Junte
Calcule o teor em cido 2-etil-hexanico usando a expresso 1,5 ml de soluo de hidrxido de sdio R a 20 g/l
em metanol R, cubra com uma camada de azoto R,
AT IR mr 2 tape hermeticamente com uma cpsula dupla de
AR IT mT politetrafluoreto de etileno, misture e aquea em banho
de gua durante 7 min. Deixe arrefecer. Junte 2 ml de
AT = rea do pico correspondente ao cido 2-etil-hexanico soluo metanlica de tricloreto de boro R, cubra com
do cromatograma obtido com a soluo problema,
uma camada de azoto R, feche hermeticamente, misture
AR = rea do pico correspondente ao cido 2-etil-hexanico do e aquea em banho de gua durante 30 min. Arrefea a
cromatograma obtido com a soluo padro, 40-50C, junte 1 ml de trimetilpentano R, feche e agite
energicamente durante 30 s. Junte imediatamente 5 ml
IR = rea do pico correspondente ao padro interno do
de uma soluo saturada de cloreto de sdio R, cubra
cromatograma obtido com a soluo padro,
com uma camada de azoto R, feche, agite energicamente
IT = rea do pico correspondente ao padro interno do durante, pelo menos, 15 s. Transfira a fase superior para um
cromatograma obtido com a soluo problema, outro tubo. Agite ainda uma vez a fase metanlica com 1 ml
de trimetilpentano R. Lave os extractos de trimetilpentano
mT = massa da amostra na soluo problema, em gramas, combinados com 2 vezes 1 ml de gua R de cada vez e
mr = massa do cido 2-etil-hexanico na soluo padro, em gramas. seque com sulfato de sdio anidro R. Prepare 3 solues
para cada amostra.
Soluo problema (b). Dissolva 0,300 g da amostra
2.4.29. COMPOSIO EM CIDOS numa soluo de butil-hidroxitolueno R a 50 mg/l em
GORDOS DOS LEOS RICOS EM trimetilpentano R e complete 10,0 ml com a mesma
soluo. Proceda como descrito para a soluo problema
CIDOS MEGA-3 (a).
O doseamento pode ser utilizado para a determinao Soluo padro (a). Dissolva 60,0 mg do ster etlico
quantitativa do teor em AEP e em ADH nos produtos do cido docosa-hexanico SQR, cerca de 70,0 mg
com base em leo de peixe contendo cidos mega-3 em do padro interno e 90,0 mg do ster etlico do
diferentes concentraes. O mtodo aplica-se aos trigliceridos cido eicosapentanico SQR numa soluo de butil-
ou aos steres etlicos e os resultados so expressos, -hidroxitolueno R a 50 mg/l em trimetilpentano R e
respectivamente, em trigliceridos ou em steres etlicos. complete 10,0 ml com a mesma soluo. Proceda como
descrito para a soluo problema (a), etapa A, para a
anlise dos steres etlicos. Para a anlise dos trigliceridos
AEP e ADH proceda da mesma maneira que para a soluo problema
(a) (etapa B). Prepare 3 solues para cada amostra.
Cromatografia em fase gasosa (2.2.28). Efectue as operaes
Soluo padro (b). Num balo marcado de 10 ml dissolva
to rapidamente quanto possvel, evitando qualquer
0,3 g de palmitato de metilo R, 0,3 g de estearato de
exposio luz solar, aos agentes e catalisadores da
metilo R, 0,3 g de araquidato de metilo R e 0,3 g de be-
oxidao (por exemplo, cobre e ferro) e ao ar.
-henato de metilo R numa soluo de butil-hidroxitolueno
O doseamento efectuado sobre os steres metlicos ou R a 50 mg/l em trimetilpentano R e complete 10,0 ml com
etlicos do cido (todo-Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentanico a mesma soluo.

2.4.30 Etilenoglicol e dietilenoglicol em substncias etoxiladas
Soluo padro (c). Num balo marcado de 10 ml dissolva m3 = massa do padro interno na soluo padro (a), em
uma amostra contendo cerca de 55,0 mg do ster metlico miligramas,
do cido docosa-hexanico R e cerca de 5,0 mg do ster mx,r = massa do ster etlico do cido eicosapentanico SQR
metlico do cido tetracos-15-enico R numa soluo de ou do ster etlico do cido docosa-hexanico SQR na
butil-hidroxitolueno R a 50 mg/l em trimetipentano R e soluo padro (a), em miligramas,
complete 10,0 ml com a mesma soluo.
Ax = rea do pico devido ao ster do cido eicosapentanico
2. Mtodos
Analticos
Coluna: SQR ou ao ster do cido docosa-hexanico do
material: slica fundida, cromatograma obtido com a soluo problema (a),
dimenses: l = no mnimo, 25 m; = 0,25 mm, Ax,r = rea do pico devido ao ster do cido eicosapentanico
SQR ou ao ster do cido docosa-hexanico do
fase estacionria: macrogol 20 000 R tratado cromatograma obtido com a soluo padro (a),
(end-capped) (espessura da pelcula 0,2 m).
A1 = rea do pico devido ao padro interno do cromatograma
Gs vector: hidrognio para cromatografia R ou hlio para obtido com a soluo problema (a),
cromatografia R.
A3 = rea do pico devido ao padro interno do cromatograma
Relao de diviso: 1:200 ou sem diviso com controlo obtido com a soluo padro (a),
da temperatura ( necessrio diluir as solues a 1/200
com soluo de butil-hidroxitolueno R a 50 mg/l em C = factor de converso entre ster etlico e trigliceridos,
trimetilpentano R antes da injeco). C = 1,00 para os steres etlicos;
Temperatura: C = 0,954 para o AEP,
C = 0,957 para o ADH.
Intervalo (min) Temperatura (C)
0-2 170 CIDOS MEGA-3 TOTAIS

Coluna 2-25,7 170 240
25,7-28 240 A partir do doseamento de AEP e ADH calcule o teor por
Cmara de injeco 250
cento em cidos mega-3 totais usando a expresso seguinte
e identificando os picos com o auxlio dos cromatogramas
Detector 270
Deteco: ionizao de chama.

Injeco: 1 l, 2 vezes.
Conformidade do sistema: AEP = teor por cento em AEP,
no cromatograma obtido com a soluo padro (b) a ADH = teor por cento em ADH,
composio em percentagem da rea aumenta segundo An-3 = soma das reas dos picos devidos aos steres metlicos
a ordem seguinte: palmitato de metilo, estearato de de C18:3 n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3 e C22:5 n-3
metilo, araquidato de metilo e be-henato de metilo; a do cromatograma obtido com a soluo problema (b),
diferena entre a percentagem da rea do palmitato de
metilo e a rea do be-henato de metilo inferior a 2 AAEP = rea do pico devido ao ster do AEP do cromatograma
unidades de percentagem da rea, obtido com a soluo problema (b),
resoluo: no mnimo, 1,2 entre os picos devidos ao AADH = rea do pico devido ao ster do ADH do cromatograma
ster metlico do cido docosa-hexanico e ao ster obtido com a soluo problema (b).
metlico do cido tetracos-15-enico do cromatograma
obtido com a soluo padro (c),
no cromatograma obtido com a soluo problema (a)
2.4.30 ETILENOGLICOL E
os picos devidos ao tricosanoato de metilo e ao ster DIETILENOGLICOL EM SUBSTNCIAS
metlico ou etlico do cido heneicosapentanico ETOXILADAS
(C21:5) por comparao com o cromatograma obtido
com a soluo problema (b) esto nitidamente As substncias etoxiladas podem conter quantidades
separados (no caso contrrio, deve aplicar-se um factor variveis de etilenoglicol e de dietilenoglicol como
de correco), consequncia do processo de fabricao. O mtodo a
Calcule os teores por cento em AEP e ADH usando a seguir prescrito pode ser utilizado para o doseamento
expresso seguinte e tendo em conta o teor declarado das destas substncias particularmente em: ricinoleato de
substncias de referncia macrogolglicerilo, hidroxistearato de macrogolglicerilo,
hidroxistearato de macrogol 15, nonoxinol 9 e ter
cetostearlico de macrogol.
Cromatografia em fase gasosa (2.2.28).
Soluo do padro interno. Dissolva 30,0 mg de 1,2-
m1 = massa do padro interno na soluo problema (a), em
-pentanodiol R em acetona R e complete 30,0 ml com o
miligramas,
mesmo solvente. Tome 1,0 ml desta soluo e complete
m2 = massa da amostra na soluo problema (a), em miligramas, 20,0 ml com acetona R.

2.4.32. Colesterol total nos leos ricos em cidos mega-3
Soluo problema. Dissolva 0,500 g da amostra na soluo do os recipientes antes de os abrir. Junte 2,0 ml de soluo
padro interno e complete 10,0 ml com a mesma soluo. concentrada de perxido de hidrognio R e repita a etapa
de mineralizao. Deixe arrefecer os recipientes antes de
Soluo padro (a). Misture 30,0 mg de etilenoglicol R com
os abrir. Transfira quantitativamente o contedo de cada
acetona R e complete 100,0 ml com o mesmo solvente. Tome recipiente para um balo de 25 ml, junte 0,5 ml de soluo
1,0 ml da soluo e complete 10,0 ml com a soluo do de nitrato de magnsio R a 10 g/l e 0,5 ml de soluo de di-
padro interno. -hidrogenofosfato de amnio R a 100 g/l, complete 25,0 ml
2. Mtodos
Analticos
Soluo padro (b). Prepare uma soluo de dietilenoglicol R com gua para cromatografia R e misture.
cuja concentrao corresponda ao limite prescrito, utilizando Solues padro. Passe para 4 bales marcados,
os mesmos solventes que foram usados para a preparao da respectivamente, 25 l, 50 l, 75 l e 100 l de soluo a
soluo padro (a). 5 ppm de nquel (Ni) R. Junte a cada um dos bales 0,5 ml
Coluna: de soluo de nitrato de magnsio a 10 g/l, 0,5 ml de soluo
de di-hidrogenofosfato de amnio R a 100 g/l, 6,0 ml de
material: slica fundida, cido ntrico isento de nquel R, complete 25,0 ml com gua
dimenses: l = 30 m; = 0,53 mm, para cromatografia R e misture. As solues padro obtidas
contm, respectivamente, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 15 ng/ml e
fase estacionria: macrogol 20 000 R (espessura de pelcula 20 ng/ml (ppb) de nquel.
1 m).
Soluo de acerto do zero. Passe para um balo marcado
Gs vector: hlio para cromatografia R. 1,0 ml de uma soluo de nitrato de magnsio R a 10 g/l,
Dbito: 30 ml/min. 1,0 ml de soluo de di-hidrogenofosfato de amnio R a
100 g/l e 12,0 ml de cido ntrico isento de nquel R,
Relao de diviso: 1:3. complete 50,0 ml com gua para cromatografia R e misture.
Temperatura: Mtodo. Determine a absorvncia de todas as solues em
232,0 nm, utilizando um espectrmetro de absoro atmica
Intervalo Temperatura munido de um forno de grafite apropriado e equipado
(min) (C)
com um sistema de compensao apropriado, um tubo
Coluna
0-40 80 200 recoberto por pirlise e uma lmpada de ctodo oco de
40-45 200 230 nquel. Mantenha a temperatura de secagem do forno em
45-65 230 120C durante 35 s aps uma subida da temperatura em
Cmara de injeco 250 5 s, a temperatura de calcinao em 1100C durante 10 s
aps uma subida da temperatura em 30 s, a temperatura de
Detector 250
arrefecimento em 800C durante 5 s aps uma descida em
Deteco: ionizao de chama. 5 s e a temperatura de atomisao em 2600C durante 7 s.
Utilize a soluo de regulao do zero para calibrar o zero do
Injeco: 2 l. aparelho. Com o auxlio da curva de calibrao, determine as
Retenes relativas em relao ao 1,2-pentanodiol (tempo de concentraes da soluo problema e da soluo em branco a
reteno = cerca de 19 min): etilenoglicol = cerca de 0,7; partir das absorvncias obtidas. Se necessrio, dilua a soluo
dietilenoglicol = cerca de 1,3. problema com soluo de regulao do zero de modo a obter
uma absorvncia situada entre os extremos da curva de
calibrao (f: factor de diluio).
2.4.31. NQUEL NOS LEOS VEGETAIS Calcule o teor em microgramas por grama (ppm) de nquel
HIDROGENADOS na amostra usando a expresso
Espectrometria de absoro atmica (2.2.23, Mtodo I).

ATENO: convm familiarizar-se com as instrues de
segurana e de utilizao fornecidas pelos fabricantes dos
recipientes fechados para mineralizao a alta presso e do
forno de micro-ondas de laboratrio. c = concentrao determinada, em nanogramas por mililitro,
O teor em nquel dos reagentes nitrato de magnsio R e f = factor de diluio da soluo problema,
di-hidrogenofosfato de amnio R deve ser controlado antes m = massa da amostra, em gramas.
da utilizao e o seu teor em nquel deve ser tomado em
considerao no clculo do teor em nquel da amostra.
Soluo problema. Num recipiente para mineralizao 2.4.32. COLESTEROL TOTAL NOS
resistente a altas presses (paredes de fluoropolmero ou
de quartzo), pese 0,250 g (m) da amostra, junte 6,0 ml
LEOS RICOS EM CIDOS MEGA-3
de cido ntrico isento de nquel R e 2,0 ml de soluo
Este mtodo pode servir para a determinao quantitativa
concentrada de perxido de hidrognio R. Prepare uma
da soma do colesterol livre e do colesterol esterificado nos
soluo em branco nas mesmas condies. Disponha os
produtos derivados dos leos de peixe ricos em cidos
recipientes num forno de micro-ondas de laboratrio e
mega-3 (steres etlicos ou trigliceridos).
proceda mineralizao seguindo um programa apropriado,
por exemplo, 1000 W durante 40 min. Deixe arrefecer Cromatografia em fase gasosa (2.2.28).

Soluo-me do padro interno. Dissolva 0,15 g de (5)- Quadro 1. Preparao da soluo problema
-colestano R em heptano R e complete 50,0 ml com o mesmo e das solues padro
solvente.
Soluo de trabalho do padro interno. Prepare a soluo
extemporaneamente. Tome 1,0 ml da soluo-me do padro
interno e complete 10,0 ml com heptano R.
2. Mtodos
Analticos
Soluo-me do colesterol. Dissolva 30,0 mg de colesterol
R em heptano R e complete 10,0 ml com o mesmo solvente.
A soluo acondicionada em frascos para cromatografia
gasosa e pode ser conservada no congelador durante 6 meses.
Soluo de trabalho do colesterol. Prepare a soluo
extemporaneamente. Tome 1,0 ml da soluo-me do
colesterol e complete 10,0 ml com heptano R.
Soluo de -tocoferol. Tome 15,0 mg de -tocoferol SQR e
complete 10,0 ml com heptano R.
Soluo problema. Pese 0,100 g da amostra para um tubo de
quartzo de 15 ml. Junte 1,0 ml de soluo-me ou de soluo
de trabalho do padro interno, conforme o teor suposto em
colesterol da amostra (ver o quadro 1).
Evapore secura numa placa de aquecimento a 50C, numa Coluna:
ligeira corrente de azoto, misturando. Junte 0,5 ml de dimenses: l = 30 m, = 0,25 mm (espessura da pelcula
soluo de hidrxido de potssio R a 50 por cento e 3,0 ml 0,25 m),
de etanol a 96 por cento R. Encha o tubo com azoto R e
feche-o. Aquea de novo na placa de aquecimento a 100C fase estacionria: poli(dimetil)(difenil)siloxano R.
durante 1 h, agitando. Arrefea durante cerca de 10 min e Gs vector: hlio para cromatografia R.
junte 6 ml de gua destilada R. Extraia com 4 vezes 2,5 ml de
ter R de cada vez. Agite de cada vez durante 1 min usando Dbito: 1,3 ml/min.
um misturador vrtex. Passe a fase etrea para um grande Temperatura:
tubo de centrfuga ou para uma ampola de decantao e
lave os extractos reunidos com 5 ml de gua destilada R,
agitando cuidadosamente com um determinado nmero de
movimentos, por exemplo, 60. Elimine a fase aquosa, junte
fase etrea 5 ml de soluo de hidrxido de potssio R a 3 por
cento e misture cuidadosamente, agitando o tubo 20 vezes.
Elimine a fase aquosa, junte de novo 5 ml de gua destilada R
e misture cuidadosamente agitando, de novo, o tubo 20 vezes.
Passe a fase etrea para um pequeno tubo de centrifugao
evitando qualquer passagem de gua. Se se formar uma
emulso, junte uma pequena quantidade de cloreto de sdio
R para separar as fases. Deteco: ionizao de chama.
Evapore secura numa leve corrente de azoto, aquecendo com Injeco: 1 l.

precauo. Dissolva o resduo em 600 l de acetato de etilo R. Conformidade do sistema: soluo padro (b):
Segundo o presumvel teor em colesterol do leo, a soluo resoluo: no mnimo, 1,2 entre os picos devidos ao
de novo diluda do seguinte modo: colesterol e ao -tocoferol.
teor inferior a 3 mg/g: tome 200 l da soluo e complete Calcule o teor em colesterol total, expresso em miligramas de
2,0 ml com acetato de etilo R, colesterol por grama de leo, usando a expresso
teor superior ou igual a 3 mg/g: tome 20 l da soluo e A1 x m2 x F
complete 2,0 ml com acetato de etilo R.
A2 x m1 x R
Soluo padro (a). Num tubo de quartzo de 15 ml coloque
A1 = rea do pico devido ao colesterol do cromatograma obtido com
1,0 ml da soluo-me ou da soluo de trabalho do padro
a soluo problema,
interno e 1,0 ml da soluo-me ou da soluo de trabalho
do colesterol, dependendo do teor presumido do leo em A2 = rea do pico devido ao (5)-colestano do cromatograma
colesterol (ver quadro 1) e prossiga como descrito para a obtido com a soluo problema,
soluo problema a partir de Evapore secura numa placa m1 = massa da amostra na soluo problema, em gramas,
de aquecimento....
m2 = massa do ()-colestano na soluo-me do padro interno, em
Soluo padro (b). Misture num balo apropriado 1,0 ml da gramas,
soluo-me do colesterol e 2,0 ml da soluo de -tocoferol.
F = 20 para os leos com um teor presumido em colesterol
Evapore secura numa leve corrente de azoto, aquecendo
superior ou igual a 3 mg/g; 2 para os leos com um teor
com precauo; dissolva o resduo em acetato de etilo R e
presumido em colesterol inferior a 3 mg/g,
complete 50,0 ml com o mesmo solvente. A soluo pode ser
conservada no congelador durante 6 meses. R = factor de resposta.

Calcule o teor de resposta R usando a expresso: A4 = rea do pico devido ao (5)-colestano do cromatograma obtido
com a soluo padro (a),
A3 m2
m3 = massa do colesterol na soluo-me do colesterol, em gramas.
A4 m3 5
A3 = rea do pico devido ao colesterol do cromatograma obtido com
a soluo padro (a),
2. Mtodos
Analticos

2.5. MTODOS

DE DOSEAMENTO
2. Mtodos
Analticos
2.5. Mtodos de doseamento 149 2.5.18. Fsforo nas vacinas poliosdicas 154
2.5.1. ndice de cido 149 2.5.19. O-Acetilo nas vacinas poliosdicas 155
2.5.2. ndice de ster 149 2.5.20. Hexosaminas nas vacinas poliosdicas 155
2.5.3. ndice de hidroxilo 149 2.5.21 Metilpentoses nas vacinas poliosdicas 156
2.5.4. ndice de iodo 149 2.5.22. cidos urnicos nas vacinas poliosdicas 156
2.5.5. ndice de perxido 150 2.5.23. cido silico nas vacinas poliosdicas 156
2.5.6. ndice de saponificao 151 2.5.24. Dixido de carbono nos gases 157
2.5.7. Insaponificvel 151 2.5.25. Monxido de carbono nos gases 157
2.5.8. Doseamento do azoto em aminas 2.5.26. Monxido de azoto e dixido de azoto
primrias aromticas 151 nos gases 158
2.5.9. Doseamento do azoto aps mineralizao 2.5.27. Oxignio nos gases 159
pelo cido sulfrico 152 2.5.28. gua nos gases 159
2.5.10. Combusto em oxignio 152 2.5.29. Dixido de enxofre 159
2.5.11. Titulaes complexomtricas 152 2.5.30. Substncias oxidantes 159
2.5.12. Doseamento da gua pelo 2.5.31. Ribose nas vacinas poliosdicas 160
semi-micromtodo 153 2.5.32. Micromtodo titulao coulomtrica
2.5.13. Alumnio nas vacinas adsorvidas 154 da gua 160
2.5.14. Clcio nas vacinas adsorvidas 154 2.5.33. Protenas totais 161
2.5.15. Fenol nos soros e vacinas 154 2.5.34. cido actico nos peptidos sintticos 164
2.5.16. Protenas nas vacinas poliosdicas 154 2.5.35. Protxido de azoto nos gases 165
2.5.17. cidos nucleicos nas vacinas poliosdicas 154 2.5.36. ndice de anisidina 165

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.5 MTODOS DE DOSEAMENTO (NDICE)
1. Prescries gerais
2. Mtodos
Analticos

2.5.4. ndice de iodo
2.5. MTODOS Aquea o balo em banho de gua durante 1 h, tendo o

cuidado de manter o nvel da gua cerca de 2,5 cm acima
DE DOSEAMENTO do nvel do lquido contido no balo. Retire o balo e deixe
arrefecer. Junte 5 ml de gua R atravs da extremidade
superior do refrigerante. Se a adio da gua R originar uma
2.5.1. NDICE DE CIDO turvao, junte a quantidade necessria de piridina R para a
2. Mtodos
fazer desaparecer e anote o volume adicionado. Agite, aquea,
Analticos
O ndice de cido IA o nmero que exprime, em miligramas, de novo, o balo em banho de gua, durante 10 min. Retire
a quantidade de hidrxido de potssio necessria para o balo e deixe arrefecer. Lave o refrigerante e as paredes
neutralizar os cidos livres existentes em 1 g de substncia. do balo com 5 ml de etanol a 96 por cento R previamente
Dissolva 10,00 g da amostra ou a quantidade indicada na neutralizado em presena de soluo de fenolftalena R1.
respectiva monografia (m g), em 50 ml de uma mistura de Titule com soluo alcolica de hidrxido de potssio 0,5 M,
volumes iguais de etanol a 96 por cento R e ter de petrleo em presena de 0,2 ml de soluo de fenolftalena R1 (n1 ml).
R3. Salvo indicao em contrrio, o solvente previamente Faa um ensaio em branco, nas mesmas condies (n2 ml).
neutralizado com hidrxido de potssio 0,1 M em presena de
0,5 ml de soluo de fenoltalena R1. Aps dissoluo, titule 28,05 (n2 n1)
com hidrxido de potssio 0,1 M ou hodrxido de sdio 0,1 M. IOH = + IA
Se a preparao foi aquecida para dissolver a amostra, m
mantenha a temperatura a cerca de 90C durante o ensaio. A
titulao considera-se terminada quando a cor rsea formada MTODO B
persista, pelo menos, durante 15 s (n ml).
Num matrs de 5 ml, perfeitamente seco, munido de rolha
5,610 n
IA = esmerilada ou de material plstico apropriado, introduza
m
a tomada de ensaio (m g), Junte 2,0 ml de reagente de
anidrido propinico R, rolhe o matrs e agite suavemente, at
2.5.2. NDICE DE STER dissoluo.
Aps 2 h de repouso, salvo indicao em contrrio, retire a
O ndice de ster IE o nmero que exprime, em miligramas,
a quantidade de hidrxido de potssio necessria para a rolha do matrs e introduza este, com o seu contedo, num
saponificao dos steres existentes em 1 g de substncia. matrs de boca larga, de 500 ml contendo 25,0 ml de soluo
Calcula-se a partir do ndice de saponificao IS e do ndice de de anilina R a 9 g/l em ciclo-hexano R e 30 ml de cido actico
cido IA. glacial R. Agite e aps 5 min de repouso adicione 0,05 ml de
soluo de violeta de cristal R e titule com cido perclrico
IE = IS IA 0,1 M at viragem para verde esmeralda (n1 ml). Efectue um
ensaio em branco nas mesmas condies (n2 ml)
2.5.3. NDICE DE HIDROXILO
5,610 (n2 n1)
O ndice de hidroxilo IOH o nmero que exprime, em IOH =
miligramas, a quantidade de hidrxido de potssio necessria m
para a neutralizao do cido que se combina, por acilao
com 1 g de substncia. A fim de ter em conta a presena eventual de gua, determine
o seu contedo na amostra (y por cento), pelo semi-micro-
MTODO A -mtodo (2.5.12).
O ndice de hidroxilo dado ento pela equao:
Num balo de acetilao de 150 ml, munido de um
refrigerante de ar, introduza uma tomada de ensaio (m g), IOH = (ndice encontrado) 31,1 y
de acordo com a quantidade indicada no quadro junto, salvo
indicao diferente que figure na respectiva monografia.
Junte o volume de soluo de anidrido actico R1 indicado no 2.5.4. NDICE DE IODO
quadro e adapte o refrigerante de ar.
O ndice de iodo Ii , o nmero que exprime, em gramas, a
ndice presumvel Tomada de ensaio em Volume de reagente quantidade de halognio, calculada em iodo, susceptvel de
IOH gramas (de acetilao) ser fixada, nas condies descritas, por 100 g de substncia.
em mililitros
Se a monografia no indicar o mtodo a utilizar, use o
10 100 2,0 5,0 mtodo A. A substituio do mtodo A pelo mtodo B deve
100 150 l,5 5,0 ser objecto de uma validao.
150 200 1,0 5,0
200 250 0,75 5,0
250 300 0,60 ou 1,20 5,0 ou 10,0 MTODO A
300 350 1,0 10,0
350 700 0,75 15,0 Salvo indicao em contrrio, utilize a tomada de ensaio
700 950 0,5 15,0 indicada no quadro 1.

2.5.5. ndice de perxido
QUADRO 1 Junte muito lentamente o volume de soluo de cloreto de

iodo R indicado no quadro 2. Tape o recipiente e coloque-o
ndice presumvel Tomada de ensaio no escuro durante 30 min, salvo indicao em contrrio,
Ii em gramas
agitando frequentemente. Junte 10 ml de soluo de iodeto
inferior a 20 1,0 de potssio R a 100 g/l e 100 ml de gua R. Titule com
20 60 0,5 0,25 tiossulfato de sdio 0,1 M, agitando energicamente at que a
60 100 0,25 0,15 colorao amarela quase desaparea. Junte 5 ml de soluo
2. Mtodos
Analticos
superior a 100 0,15 0,10

de amido R e continue a titulao juntando, gota a gota, o
tiossulfato de sdio 0,1 M at desaparecimento da colorao
Num recipiente de 250 ml, munido de rolha, seco ou lavado com (n1 ml de tiossulfato de sdio 0,1 M). Efectue um ensaio em
cido actico glacial R, introduza a tomada de ensaio branco nas mesmas condies (n2 ml de tiossulfato de sdio
(m g) e dissolva-a em 15 ml de clorofrmio R, salvo indicao 0,1 M).
em contrrio que figure na respectiva monografia. Junte
25,0 ml de soluo de brometo de iodo R. Rolhe o recipiente e 1,269 (n2 n1)
Ii
conserve-o na obscuridade durante 30 min, salvo indicao cm m
contrrio, agitando-o frequentemente. Aps adio de 10 ml de
soluo de iodeto de potssio R a 100 g/l e 100 ml de gua R,
titule com tiossulfato de sdio 0,1 M agitando energicamente at 2.5.5. NDICE DE PERXIDO
que a colorao amarela quase tenha desaparecido. Junte
5 ml de soluo de amido R e continue a titulao, adicionando O ndice de perxido Ip o nmero que exprime, em
o tiossulfato de sdio 0,1 M, gota a gota, agitando, at ao miliequivalentes de oxignio activo, a quantidade de perxido
desaparecimento da colorao (n1 ml). Faa um ensaio em contida em 1000 g de substncia, determinado pelos mtodos
branco nas mesmas condies (n2 ml) a seguir descritos.
Se a monografia no indicar o mtodo a utilizar, executado
1,269 (n2 n1)
Ii o mtodo A. A substituio do mtodo A pelo mtodo B
m
sempre objecto de validao.
MTODO B MTODO A
Salvo indicao em contrrio, utilize a tomada de ensaio Num matrs de 250 ml com rolha introduza 5,00 g da
indicada no quadro 2. amostra (m g). Junte 30 ml de uma mistura de 3 volumes de
cido actico glacial R e 2 volumes de clorofrmio R. Agite
QUADRO 2 at dissoluo da amostra e junte 0,5 ml de soluo saturada
de iodeto de potssio R. Agite durante exactamente 1 min e
ndice de Massa (g) Massa (g) Soluo junte 30 ml de gua R. Titule com tiossulfato de sdio 0,01 M,
iodo correspondente a correspondente a de cloreto
provvel Ii um excesso de um excesso de iodo adicionado lentamente sem cessar de agitar energicamente
150 por cento de 100 por cento (ml) at que a colorao amarela quase tenha desaparecido. Junte

de ICl de ICl 5 ml de soluo de amido R. Continue a titulao agitando
<3 10 10 25 energicamente, at desaparecimento da colorao (n1 ml de
3 8,4613 10,5760 25 tiossulfato de sdio 0,01 M). Faa um ensaio em branco nas
5 5,0770 6,3460 25 mesmas condies (n2 ml de tiossulfato de sdio 0,01 M). O
10 2,5384 3,1730 20 ensaio em branco no consome mais de 0,1 ml de tiossulfato
20 0,8461 1,5865 20 de sdio 0,1 M.
40 0,6346 0,7935 20
10 (n2 n1)
60 0,4321 0,5288 20 Ip
m
80 0,3173 0,3966 20
100 0,2538 0,3173 20
MTODO B
120 0,2115 0,2644 20
140 0,1813 0,2266 20
Opere ao abrigo da luz.
160 0,1587 0,1983 20
180 0,1410 0,1762 20 Num matrs com rolha introduza 50 ml de uma mistura
200 0,1269 0,1586 20 de 3 volumes de cido actico glacial R e 2 volumes de
trimetilpentano R. Rolhe e agite at dissoluo da amostra
A massa da amostra tal que h um excesso de soluo de (m g; ver quadro). Com a ajuda de uma pipeta volumtrica
cloreto de iodo R de 50 por cento a 60 por cento da apropriada junte 0,5 ml de soluo saturada de iodeto de
quantidade adicionada, quer seja 100 por cento, quer 150 por potssio R e rolhe. Deixe a soluo em repouso durante
cento da quantidade absorvida. 60 1 s misture intimamente pelo menos 3 vezes e junte
30 ml de gua R.
Num recipiente de 250 ml com rolha esmerilada previamente
lavado com cido actico glacial R ou seco, introduza a Titule com soluo de tiossulfato de sdio 0,01 M (V1 ml),
tomada de ensaio (m g) e dissolva em 15 ml de uma mistura adicionado lentamente, com agitao enrgica e constante,
de volumes iguais de ciclo-hexano R e cido actico glacial R, at desaparecimento quase total da colorao amarela devida
salvo indicao em contrrio. Se necessrio, funda ao iodo. Junte cerca de 0,5 ml de soluo de amido R1 e
previamente a substncia (ponto de fuso superior a 50C). continue a titulao sem cessar de agitar energicamente,

2.5.8. Doseamento do azoto em aminas primrias aromticas
em especial perto do ponto de equivalncia, para libertar estiver quente e titule imediatamente com cido clordico
completamente o iodo do solvente. Junte, gota a gota, a 0,5 M (n1 ml). Efectue um ensaio em branco nas mesmas
soluo de tiossulfato de sdio at que a cor azul comece a condies (n2 ml).
desaparecer.
28,05 (n1 n2)
Dependendo do volume consumido de tiossulfato de sdio Is
m
0,01 M, pode ser necessrio titular com tiossulfato de sdio
2. Mtodos
Analticos
0,1 M.
2.5.7. INSAPONIFICVEL
Nota: Se o ndice de perxido for igual ou superior a 70,
devido tendncia do trimetilpentano para sobrenadar na O termo insaponificvel aplica-se s substncias no
fase aquosa e ao tempo necessrio para obter uma mistura volteis a 100-105C, obtidas por extraco, com um solvente
adequada entre o solvente e o titulante aquoso orgnico, de uma soluo da substncia a ensaiar, aps
o que permite libertar vestgios de iodo a neutralizao do saponificao.
indicador de amido necessita de 15 a 30 segundos de espera.
O resultado calculado em perentagem m/m.
Para ndices de perxido superiores a 150 utiliza-se
tiossulfato de sdio 0,1 M. Pode adicionar-se mistura Utilize material de vidro esmerilado e desengordurado.
uma pequena quantidade (0,5 a 1,0 por cento m/m)de Num balo de 250 ml, munido de refrigerante de refluxo,
emulsificante apropriado para retardar a separao das fases introduza a quantidade prescrita (m g) da amostra. Junte
e diminuir o tempo de libertao do iodo (por exemplo 50 ml de soluo alcolica de hidrxido de potssio 2 M
polissorbato 60). e aquea a banho de gua, durante 1 h, agitando a balo
com movimentos circulares repetidos. Aps arrefecimento
Efectue um ensaio em branco (V0 ml). Se este consumir mais
a uma temperatura inferior a 25C, transfira o contedo
de 0,1 ml de reagente titulante, substitua os reagentes e
do balo para uma ampola de decantao, com 100 ml de
repita a titulao. gua R e agite cautelosamente 3 vezes com 100 ml de ter
1000 (V1 V0) c isento de perxidos R de cada vez. Rena os lquidos etreos
Ip
m noutra ampola de decantao contendo 40 ml de gua R,
agite suavemente durante alguns minutos, deixe separar
c = concentrao da soluo de tiossulfato de sdio em moles por as fases e rejeite a fase aquosa. Lave a fase etrea duas
litro. vezes com 40 ml de gua R de cada vez. Lave em seguida,
sucessivamente, com 40 ml de hidrxido de potssio R a
ndice de perxido esperado Massa da amostra (g) 30 g/l e com 40 ml de gua R; repita 3 vezes esta operao.
0 12 2,00 5,00 Continue a lavar repetidamente a fase etrea com 40 ml de
12 20 1,20 2,00 gua R de cada vez, at que a fase aquosa no d reaco
20 30 0,80 1,20 alcalina fenolftalena. Transfira a fase etrea para um
30 50 0,500 0,800 balo tarado, lavando a ampola de decantao com ter
50 90 0,300 0,500 isento de perxidos R. Destile o ter com as precaues
usuais e junte ao resduo 6 ml de acetona R. Elimine
cuidadosamente o solvente custa de uma corrente de ar.
Seque a 100-105C, at massa constante, deixe arrefecer
2.5.6. NDICE DE SAPONIFICAO num exsicador e pese (a g).
100 a
O ndice de saponificao Is o nmero que exprime, em Insaponificvel por cento =
m
miligramas, a quantidade de hidrxido de potssio necessria
para neutralizar os cidos livres e saponificar os steres
existentes em 1 g da substncia. Dissolva o resduo em 20 ml de etanol a 96 por cento R,
neutralizados previamente em presena de soluo de
Salvo indicao em contrrio, utilize a tomada de ensaio fenotftalena R, e titule com soluo etanlica de hidrxido
correspondente indicada no quadro. de sdio 0,1 M. Se o volume de soluo etanlica de hidrxido
de sdio 0,1 M gasto nesta titulao for superior a 0,2 ml, isso
Valor esperado de Is Tomada de ensaio (gramas) indica que houve uma separao incompleta das duas fases
3 20 pelo que o resduo obtido no pode ser considerado como
3-10 12-15 insaponificvel e o ensaio ser repetido.
10-40 8-12
40-60 5-8
60-100 3-5 2.5.8. DOSEAMENTO DO AZOTO
100-200 2,5-3
200-300 1-2
EM AMINAS PRIMRIAS AROMTICAS
300-400 0,5-1
Dissolva a quantidade indicada da amostra em 50 ml de cido
Num balo de vidro borossilcico de 250 ml e munido de clordrico diludo R ou outro reagente indicado e adicione
refrigerante de refluxo, introduza a tomada de ensaio (m g). 3 g de brometo de potssio R. Arrefea em gua com gelo e
Junte 25,0 ml de soluo alcolica de hidrxido de potssio titule com nitrito de sdio 0,1 M, adicionado lentamente e
mantendo uma agitao constante.
0,5 M e algumas esferas de vidro. Adapte o refrigerante e
aquea com refluxo durante 30 min, salvo indicao em Determine o ponto de equivalncia por potenciometria
contrrio. Junte 1 ml de soluo de fenolftalena R1 enquanto ou utilize o indicador prescrito na monografia.

2.5.11. Titulaes complexomtricas
2.5.9. DOSEAMENTO DO AZOTO APS indicao em contrrio, retire a rolha, com as precaues
devidas. Lave com gua R a zona esmerilada, as paredes
MINERALIZAO PELO CIDO do recipiente e o suporte da amostra. Rena as solues e
SULFRICO proceda de acordo com as indicaes da monografia.
SEMI-MICROMTODO
2.5.11. TITULAES
2. Mtodos
Analticos
Em balo de mineralizao, introduza uma quantidade da COMPLEXOMTRICAS

amostra (m g) contendo cerca de 2 mg de azoto. Junte 4 g
da mistura pulverizada de 100 g de sulfato dipotssico R,
ALUMNIO
5 g de sulfato de cobre R e 2,5 g de selnio R e 3 esferas de
vidro. Arraste quaisquer partculas aderentes ao colo do Num matrs de 500 ml, introduza 20,0 ml de soluo da
balo com 5 ml de cido sulfrico R e misture o contedo amostra indicada na monografia, 25,0 ml de edetato de
efectuando um movimento de rotao. Feche o balo de sdio 0,1 M e 10 ml de uma mistura de volumes iguais de
modo no hermtico, por exemplo com o auxlio de uma soluo de acetato de amnio R a 155 g/l e cido actico
ampola piriforme de vidro, para evitar uma perda excessiva diludo R. Aquea ebulio durante 2 min e arrefea.
de cido sulfrico. Aquea progressivamente e aumente a Adicione 50 ml de etanol anidro R e 3 ml de uma soluo
temperatura at ebulio forte com condensao do cido recentemente preparada de ditizona R a 0,25 g/l em etanol
sulfrico no colo do balo; tome precaues para evitar anidro R. Titule o excesso de edetato de sdio com soluo
que a parte superior do balo seja sobreaquecida. Continue de sulfato de zinco 0,1 M at viragem da colorao azul-
o aquecimento durante 30 minutos, salvo indicao em -esverdeada para vermelho violceo.
contrrio. Retire o balo, deixe arrefecer, junte 25 ml de
gua R com precauo, para dissolver a parte slida, 1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 2,698 mg de Al.
e arrefea novamente. Adapteo balo a um dispositivo
apropriado de destilao com arrastamento pelo vapor de BISMUTO
gua. Junte 30 ml de hidrxido de sdio concentrado R e
destile imediatamente, fazendo passar o vapor de gua atravs Num matrs de 500 ml, introduza a soluo da amostra
da mistura. Recolha cerca de 40 ml do destilado em 20,0 ml indicada na monografia, complete 250 ml com gua R
de cido clordrico 0,01 M, adicionados previamente de e, salvo indicao em contrrio, adicione, gota a gota e
um volume de gua R que permita que a parte terminal do agitando, amnia concentrada R at aparecimento de
refrigerante mergulhe no lquido. Perto do fim da destilao, opalescncia e depois junte 0,5 ml de cido ntrico R.
baixe o recipiente colector de forma a que a parte terminal Aquea a cerca de 70C at que a soluo fique de novo
do refrigerante deixe de mergulhar no lquido. Evite que a lmpida. Adicione cerca de 50 mg da mistura composta de
gua condensada no exterior do refrigerante se misture com alaranjado de xilenol R e titule com edetato de sdio 0,1 M
o contedo do recipiente colector. Titule o destilado com at viragem da colorao violeta-rosada para amarela.
hidrxido de sdio 0,01 M, utilizando, como indicador, soluo 1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 20,90 mg de Bi.
mista de vermelho de metilo R (n ml). Repita o ensaio,
substituindo a amostra por cerca 1de 50 mg de glicose R (n ml)
2 CLCIO
Num matrs de 500 ml, introduza a soluo da amostra
0,01401 (n2 n1)
Teor em azoto, por cento = indicada na monografia e complete 300 ml com gua R.
m Adicione 6,0 ml de soluo concentrada de hidrxido de
sdio R e cerca de 15 mg de mistura composta de cido
calconocarboxlico R. Titule com edetato de sdio 0,1 M at
viragem da colorao violeta para azul ntido.
2.5.10. COMBUSTO EM OXIGNIO
1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 4,008 mg de Ca.
Salvo indicao contrria, o recipiente de combusto
constitudo por um matrs de vidro borossilcico, com a CHUMBO
capacidade mnima de 500 ml, a cuja rolha se encontra Num matrs de 500 ml, introduza a soluo da amostra
adaptado um suporte, de platina ou platina iridiada, por indicada na monografia e complete 200 ml com gua
exemplo, destinado a conter a amostra a analisar. Pulverize
R. Adicione cerca de 50 mg da mistura composta de
finamente a amostra, coloque a quantidade indicada no
alaranjado de xilenol R e hexametilenotetramina R at
centro de um pedao de papel de filtro com cerca de
colorao rosa-violeta. Titule com edetato de sdio 0,1 M
30 mm por 40 mm, com uma tira com 10 mm de largura
at viragem para amarelo.
e 30 mm de comprimento, aproximadamente. Quando
for indicado, humedea o centro do papel com soluo 1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 20,72 mg de Pb.
saturada de carbonato de ltio R e seque-o na estufa antes da
utilizao. Envolva a amostra no papel e coloque o conjunto MAGNSIO
no suporte. Introduza no recipiente gua R ou a soluo
indicada para absorver os produtos de combusto, substitua Num matrs de 500 ml, introduza a soluo da amostra
o ar por oxignio, utilizando um tubo cuja extremidade se indicada na monografia e complete 300 ml com gua R.
encontre junto da superfcie do lquido, humedea com gua Junte 10 ml da soluo tampo de cloreto de amnio
R o colo do recipiente e tape-o rapidamente com a rolha de pH 10,0 R e cerca de 50 mg da mistura composta de
respectiva, depois de inflamar a tira de papel por um processo
mordente negro 11 R. Aquea a cerca de 40C e titule a esta
apropriado, tomando as precaues necessrias. Mantenha o
temperatura com edetato de sdio 0,1 M at viragem da
recipiente perfeitamente fechado durante a combusto. Agite
colorao violeta para azul ntido.
fortemente para obter a dissoluo completa dos produtos
de combusto. Arrefea e, decorridos cerca de 5 min, salvo 1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 2,431 mg de Mg.

2.5.12. Doseamento da gua pelo semi-micromtodo
ZINCO Mtodo A. No vaso de titulao introduza ou metanol R, ou o

solvente indicado na monografia, ou o solvente recomendado
Num matrs de 500 ml, introduza a soluo da amostra
indicada na monografia e complete 200 ml com gua R. Junte pelo fornecedor do reagente titulante. De acordo com o
cerca de 50 mg da mistura composta de alaranjado de xilenol aparelho utilizado, realize a secagem da clula de medida
R e hexametilenotetramina R at colorao rosa-violeta. ou uma pr-titulao. Introduza rapidamente a tomada de
Adicione um excesso de 2 g de hexametilenotetramina R. ensaio e efectue a titulao respeitando o tempo de extraco
2. Mtodos
necessrio.
Analticos
Titule com edetato de sdio 0,1 M at viragem para amarelo.
1 ml de edetato de sdio 0,1 M corresponde a 6,54 mg de Zn.
Mtodo B. No vaso de titulao introduza ou metanol R, ou o
solvente indicado no monografia, ou o solvente recomendado
pelo fornecedor do reagente titulante. De acordo com o
2.5.12. DOSEAMENTO DA GUA aparelho utilizado, realize a secagem da clula de medida ou
PELO SEMI-MICROMTODO realize uma pr-titulao. Introduza rapidamente a tomada
de ensaio da amostra num grau de diviso conveniente. Junte
O semi-micromtodo de doseamento da gua baseia-se na um volume, exactamente medido, do titulante, suficiente
reaco quantitativa da gua com um reagente contendo para ter um excesso de cerca de 1 ml, ou o volume prescrito.
dixido de enxofre e iodo num meio anidro apropriado, em Deixe em repouso ao abrigo da luz durante 1 min ou o tempo
presena de uma base que apresenta uma capacidade tampo prescrito, agitando de vez em quando. Titule o excesso de
suficiente. reagente com metanol R, ou um outro solvente prescrito,
Aparelhagem contendo uma quantidade exactamente conhecida de gua.
O aparelho constitudo por um vaso de titulao munido
de: Conformidade. A exactido do ensaio com o reagente
titulante escolhido deve ser verificada para cada amostra.
2 elctrodos idnticos de platina, O processo aqui includo, fornecido a ttulo de exemplo,
aberturas estanques permitindo a introduo do solvente e conveniente para amostras contendo 2,5-25 mg de gua.
do reagente titulante,
O teor em gua da amostra determinado utilizando o
uma abertura que permita a introduo do ar atravs de sistema reagente/solvente escolhido. De seguida, quantidades
uma substncia exsicadora, conhecidas de gua R, na forma apropriada, so adicionadas
de forma sequencial (no mnimo, 5 adies) e o teor em
uma abertura para introduo da amostra munida de uma
rolha ou, para a introduo de lquidos, de um septo. gua acumulado determinado aps cada adio. Calcule
a percentagem da recuperao r em cada ponto, usando a
Podem igualmente ser instalados sistemas de admisso de expresso seguinte:
azoto seco e de aspirao do solvente. W2
r = 100
O ensaio efectuado seguindo as instrues do fornecedor W1
do aparelho. As precaues necessrias so tomadas
durante a determinao de modo a preservar os reagentes e W1 = quantidade de gua adicionada, em miligramas,
solventes da humidade atmosfrica. O ponto de equivalncia
determinado por meio de 2 elctrodos indicadores W2 = quantidade de gua obtida, em miligramas.
idnticos ligados a uma fonte elctrica que mantm entre
os elctrodos uma intensidade de corrente constante ou Calcule a recta de regresso da gua acumulada determinada
um potencial constante. Quando se executa um ensaio em relao agua adicionada.
directo (mtodo A), a adio do titulante provoca ou uma Calcule o declive b, a ordenada na origem a e a interseco
diminuio do potencial quando a intensidade da corrente entre a recta de calibrao extrapolada e o eixo das abcissas.
mantida constante, ou um aumento da intensidade
da corrente quando o potencial mantido constante, Calcule a percentagem de recuperao mdia r: Calcule as
at atingir o ponto de equivalncia da reaco. So percentagens de erro e1 e e2, usando as expresses:
correntemente utilizados aparelhos munidos de um sistema
de deteco automtica do ponto de equivalncia. e1 = 100 a-M
M
Padronizao. Num vaso de titulao introduza ou metanol e2 = 100 |d|-M

R, dessecado, se necessrio, ou o solvente recomendado M
pelo fornecedor do reagente. De acordo com o aparelho
a = ordenada na origem, em miligramas de gua,
utilizado, realize a secagem da clula de medida ou realize
uma pr-titulao. Introduza uma quantidade adequada d = interseco com o eixo das abcissas, em miligramas de gua,
de gua na forma apropriada (gua R ou um material de M = teor em gua da substncia, em miligramas de gua.
referncia certificado) e efectue o ensaio respeitando o tempo
de agitao necessrio. O equivalente em gua do reagente O sistema reagente/solvente considerado aceitvel se:
no inferior a 80 por cento do equivalente indicado pelo
[e1] e [e2] so, no mximo, 2,5 por cento,
fornecedor. Estabelea o equivalente em gua do reagente
titulando antes da primeira utilizao e depois a intervalos b se situa entre 0,975 e 1,025 (desvio padro de 2,5 por
apropriados. cento),
Salvo indicao em contrrio, utilize o mtodo A. r se situa entre 97,5 por cento e 102,5 por cento.

2.5.18. Fsforo nas vacinas poliosdicas
2.5.13. ALUMNIO NAS VACINAS 1 ml da soluo problema e junte 0,15 ml de uma soluo
de cido tricloroactico R a 400 g/l. Agite, deixe repousar
ADSORVIDAS durante 15 min, centrifugue a 5 000 r/min durante 10 min
e rejeite o sobrenadante. Ao resduo obtido na centrifugao
Homogenize a amostra; retire uma quantidade que presuma adicione 0,4 ml de hidrxido de sdio 0,1 M.
conter 5 mg a 6 mg de alumnio e introduza-a num matrs de
mineralizao de 50 ml. Adicione 1 ml de cido sulfrico R, Solues padro. Dissolva 0,100 g de albumina bovina R em
2. Mtodos
100 ml de hidrxido de sdio 0,1 M (soluo-me contendo

Analticos
0,1 ml de cido ntrico R e algumas esferas de vidro. Aquea

o equivalente a 1 g de protenas por litro). Tome 1 ml da
a soluo at libertao de vapores brancos espessos. Se se
soluo-me e complete 20 ml com hidrxido de sdio 0,1 M
produzir carbonizao, junte algumas gotas de cido ntrico
(soluo padro (1) contendo o equivalente a 50 mg de
R e mantenha a ebulio at descolorao. Deixe arrefecer
protenas por litro). Tome 1 ml da soluo-me e complete
durante alguns minutos, junte com precauo 10 ml de
4 ml com hidrxido de sdio 0,1 M (soluo padro (2)
gua R e ferva at obteno de uma soluo lmpida. Deixe contendo o equivalente a 250 mg de protenas por litro). Em
arrefecer, junte 0,05 ml de soluo de alaranjado de metilo 6 tubos de vidro introduza respectivamente 0,10 ml, 0,20 ml,
R e neutralize com uma soluo concentrada de hidrxido 0,40 ml da soluo padro (1) e 0,15 ml, 0,20 ml, 0,25 ml da
de sdio R (6,5 ml a 7 ml). Caso se produza precipitado, soluo padro (2). Em cada tubo complete o volume de
dissolva-o adicionando, gota a gota, cido sulfrico diludo R. 0,40 ml com hidrxido de sdio 0,1 M.
Introduza a soluo num matrs de 250 ml e lave o matrs de
mineralizao com 25 ml de gua R. Junte 25,0 ml de edetato Prepare um ensaio em branco a partir de 0,40 ml
de sdio 0,02 M, 10 ml de soluo tampo de acetato de de hidrxido de sdio 0,1 M.
pH 4,4 R, algumas esferas de vidro e ferva suavemente A todos os tubos, junte 2 ml da soluo de cpri-tartrica R3.
durante 3 min. Junte 0,1 ml de soluo de piridilazonaftol R Agite, deixe em repouso durante 10 min e junte 0,2 ml de
e titule a soluo quente com sulfato de cobre 0,02 M at uma mistura com volumes iguais, preparada imediatamente
viragem para castanho-prpura. Efectue um ensaio em antes do uso, de reagente de fosfomolibdotngstico R e
branco. gua R. Feche os tubos, agite-os por inverso e deixe-os em
repouso, no escuro, e durante 30 min. A colorao azul
1 ml de edetato de sdio 0,02 M corresponde a 0,5396 mg de Al. estvel durante 60 min. Se necessrio, centrifugue para obter
solues lmpidas.
Determine a absorvncia (2.2.25) de cada soluo em
2.5.14. CLCIO 760 nm, utilizando o ensaio em branco como lquido de
NAS VACINAS ADSORVIDAS compensao. Construa um grfico com as absorvncias das
6 solues padro em funo das respectivas quantidades de
Todas as solues utilizadas neste ensaio so preparadas protenas e depois, a partir da curva de calibrao encontrada,
com gua destilada R. calcule a quantidade de protenas contidas na soluo
problema.
Determine o teor em clcio por espectrometria de emisso
atmica (2.2.22, Mtodo I). Homogenize a amostra e a 1,0 ml
adicione 0,2 ml de cido clordrico diludo R e complete
3,0 ml com gua R. Determine a absorvncia em 620 nm. 2.5.17. CIDOS NUCLEICOS
NAS VACINAS POLIOSDICAS
2.5.15. FENOL NOS SOROS E VACINAS Soluo problema. Para um balo marcado com um
volume apropriado, que permita obter a preparao de uma
Homogenize a amostra. Retire um volume apropriado e dilua soluo contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco,
com gua R de maneira a obter uma soluo que presuma transfira quantitativamente o contedo dum recipiente e
conter 15 g de fenol por mililitro. Prepare uma srie de complete o volume com gua R.
solues padro com fenol R, contendo respectivamente Se necessrio, dilua a soluo de modo que o seu valor
5 g, 10 g, 15 g, 20 g e 30 g de fenol por mililitro. da absorvncia se ajuste ao aparelho utilizado. Determine
A 5 ml da soluo problema e a 5 ml de cada uma das solues a absorvncia (2.2.25) em 260 nm utilizando a gua R
padro, adicione, respectivamente 5 ml de soluo tampo como lquido de compensao.
de pH 9,0 R, 5 ml de soluo de aminopirazolona R e 5 ml
de soluo de ferrocianeto de potssio R. Deixe em repouso A absorvncia de uma soluo de cidos nucleicos a 1 g/l,
durante 10 min e determine a absorvncia em 546 nm. determinada em 260 nm, igual a 20.
Construa a curva de calibrao e calcule a concentrao em

fenol da soluo problema. 2.5.18. FSFORO
NAS VACINAS POLIOSDICAS
2.5.16. PROTENAS Soluo problema. Para um balo marcado com um volume
NAS VACINAS POLIOSDICAS apropriado que permita obter a preparao de uma soluo
contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco, transfira
Soluo problema. Para um balo marcado com um volume quantitativamente o contedo dum recipiente e complete o
apropriado, que permita obter a preparao de uma soluo volume com gua R. Dilua a soluo problema de modo que o
contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco, transfira volume utilizado no ensaio (1 ml) contenha cerca de 6 g de
quantitativamente o contedo dum recipiente e complete o fsforo. Para um tubo de combusto de 10 ml, transfira
volume com gua R. Para um tubo de vidro, transfira 1,0 ml da soluo problema.

2.5.20. Hexosaminas nas vacinas poliosdicas
Solues padro. Dissolva 0,2194 g de fosfato Determine a absorvncia (2.2.25) de cada soluo em 540 nm,
monopotssico R em 500 ml de gua R de modo a obter utilizando o ensaio em branco como lquido de compensao.
uma soluo contendo o equivalente a 0,1 mg de fsforo por Para cada soluo problema, subtraia o valor da absorvncia
mililitro. Tome 5,0 ml dessa soluo e complete da correspondente soluo padro. Construa um grfico a
100,0 ml com gua R. Para 3 tubos de combusto, transfira, partir das diferenas de absorvncia calculadas das 4 solues
respectivamente, 0,5 ml, 1,0 ml e 2,0 ml da soluo diluda. padro em funo das respectivas quantidades de cloridrato
de acetilcolina e depois, a partir da curva de calibrao
2. Mtodos
Analticos
Prepare um ensaio em branco com 2,0 ml de gua R num
encontrada, calcule a quantidade de cloridrato de acetilcolina
tubo de combusto.
contida na soluo problema para cada um dos volumes
A todos os tubos, junte 0,2 ml de cido sulfrico R. Aquea ensaiados. Determine a mdia de 3 valores.
todos em banho de leo a 120C durante 1 h, e depois a
1 mole de cloridrato de acetilcolina (181,7 g) corresponde a
160C at aparecimento de fumos brancos (cerca de 1 h).
1 mole de O-acetilo (43,05 g).
Adicione 0,1 ml de cido perclrico R e aquea a 160C at
descolorao (cerca de 90 min). Arrefea os tubos e junte
a cada um deles, 4 ml de gua R e 4 ml de reagente de
molibdato de amnio R. Aquea em banho de gua a 37C 2.5.20. HEXOSAMINAS
durante 90 min, arrefea e complete 10,0 ml com gua R. NAS VACINAS POLIOSDICAS
A colorao azul estvel durante vrias horas.
Soluo problema. Para um balo marcado com um
Determine a absorvncia (2.2.25) de cada soluo em
volume apropriado, que permita obter a preparao de uma
820 nm, utilizando o ensaio em branco como lquido de
soluo contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco,
compensao. Construa um grfico das absorvncias das
transfira quantitativamente o contedo dum recipiente e
3 solues padro em funo das respectivas quantidades de
complete o volume com gua R. Dilua a soluo de modo
fsforo e depois, a partir da curva de calibrao encontrada,
que os volumes utilizados contenham entre 125 g a 500 g
calcule a quantidade de fsforo contida na soluo
de glucosamina (hexosamina). Para um tubo graduado,
problema.
transfira 1,0 ml da soluo diluda.
Solues padro. Dissolva 60 mg de cloridrato de
2.5.19. O-ACETILO glucosamina R em 100 ml de gua R (soluo padro
contendo o equivalente a 0,500 g de glucosamina por litro).
NAS VACINAS POLIOSDICAS Para 4 tubos graduados, transfira, respectivamente, 0,25 ml,
0,50 ml, 0,75 ml e 1,0 ml da soluo padro.
Soluo problema. Para um balo marcado com um
volume apropriado, que permita obter a preparao de uma Prepare um ensaio em branco a partir de 1 ml de gua R.
soluo contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco,
Em cada tubo, complete 1 ml com gua R. A todos os tubos,
transfira quantitativamente o contedo dum recipiente e
adicione 1 ml de cido clordrico R a 292 g/l de HCl. Feche os
complete o volume com gua R. Dilua a soluo problema
tubos e coloque-os em banho de gua durante 1 h. Arrefea
de modo que os volumes utilizados contenham entre
at temperatura ambiente. Adicione 0,05 ml de soluo de
30 g e 600 g de cloreto de acetilcolina (O-acetilo). Para
timolftalena R a 5 g/l em etanol a 96 por cento R e hidrxido
6 tubos (3 padro e 3 de problema) transfira em duplicado
de sdio a 200 g/l at obteno de colorao azul. Junte cido
respectivamente 0,3 ml, 0,5 ml e 1,0 ml da soluo diluda.
clordrico 1 M at descolorao da soluo. Em cada tubo
Solues padro. Dissolva 0,150 g de cloreto de acetilcolina R complete 10 ml com gua R (hidrolizados neutralizados).
em 10 ml de gua R (soluo-me contendo 15 g de
Para uma 2 srie de tubos graduados de 10 ml, transfira
cloridrato de acetilcolina por litro). Imediatamente antes do
1 ml de cada um dos hidrolisados neutralizados. Adicione
uso, tome 1 ml da soluo-me em 50 ml de gua R (soluo
a cada tubo 1 ml de reagente acetilacetona (uma mistura,
padro (1) contendo o equivalente a 300 g de cloridrato de
preparada imediatamente antes do uso, de 1 volume
acetilcolina por mililitro). Dilua extemporaneamente
de acetilacetona R e de 50 volumes de uma soluo de
1 ml da soluo me em 25 ml de gua R (soluo padro (2)
carbonato de sdio anidro R a 53 g/l). Feche os tubos e
contendo o equivalente a 600 g de cloridrato de acetilcolina
coloque-os em banho de gua a 90C, durante 45 min.
por mililitro). Para 4 tubos, transfira, respectivamente, 2
Arrefea at temperatura ambiente. A cada tubo, adicione
vezes 0,1 ml (problema e padro), 2 vezes 0,4 ml (problema
2,5 ml de etanol a 96 por cento R e 1,0 ml de soluo de
e padro) da soluo padro (1) e para outros 4, transfira,
dimetilaminobenzaldedo (preparada, imediatamente antes
respectivamente 2 vezes 0,6 ml e 2 vezes 1,0 ml da soluo
do emprego, dissolvendo 0,8 g de dimetilaminobenzaldedo R
padro (2).
em 15 ml de etanol a 96 por cento R e adicionando 15 ml
Prepare um ensaio em branco com 1 ml de gua R. de cido clordrico R) e, em cada tubo, complete 10 ml com
etanol a 96 por cento R. Feche os tubos, agite por inverso
Em todos os tubos complete o volume de 1 ml com gua R.
e deixe em repouso, no escuro durante 90 min. Determine a
A cada um dos tubos contendo soluo padro assim como
absorvncia (2.2.25) de cada soluo em 530 nm, utilizando
soluo em branco, junte 1,0 ml de cido clordrico 4 M.
o ensaio em branco como lquido de compensao.
A todos junte 2,0 ml de soluo alcalina de hidroxilamina
R. Deixe em repouso durante exactamente 2 min e depois, Construa um grfico com as absorvncias das 4 solues
a cada um dos tubos, junte 1,0 ml de cido clordrico 4 M. padro em funo das respectivas quantidades de
Junte 1,0 ml de uma soluo de cloreto frrico R a 100 g/l hexosaminas e depois, a partir da curva de calibrao
em cido clordrico 0,1 M. Feche os tubos e agite-os encontrada, calcule a quantidade de hexosamina contida na
vigorosamente para remoo de bolhas. soluo problema.

2.5.23. cido silico nas vacinas poliosdicas
2.5.21. METILPENTOSES boratada R. Feche os tubos, coloque-os num banho de gua

durante 15 min e arrefea-os at temperatura ambiente.
NAS VACINAS POLIOSDICAS A todos os tubos, adicione 0,20 ml de soluo a de carbazol
R a 1,25 g/l em etanol anidro R. Feche os tubos, coloque-
Soluo problema. Para um balo marcado com um volume -os num banho de gua durante 15 min e arrefea-os at
apropriado, que permita obter a preparao de uma soluo temperatura ambiente. Determine a absorvncia (2.2.25) de
contendo 5 mg por mililitro de polissacarido seco, transfira cada soluo em 530 nm utilizando o ensaio em branco como
2. Mtodos
Analticos
quantitativamente o contedo dum recipiente e complete o lquido de compensao.

volume com gua R. Dilua a soluo de modo que os volumes
analisados contenham entre 2 g a 20 g de ramnose Construa um grfico com as absorvncias das 5 solues
(metilpentoses). Para 3 tubos, transfira, respectivamente padro em funo das respectivas quantidades de cido
0,25 ml, 0,50 ml e 1,0 ml da soluo diluda. glucornico e depois, a partir da curva de calibrao obtida,
calcule a quantidade de cido glucornico contido na soluo
Solues padro. Dissolva 0,100 g de ramnose R em 100 ml problema para cada um dos volumes analisados. Calcule a
de gua R (soluo me contendo o equivalente a 1 g mdia dos 3 valores.
de metilpentose por litro). Imediatamente antes do uso,
tome 1 ml da soluo-me em 50 ml com gua R (soluo
padro contendo 20 mg de metilpentose por litro). Para 5 2.5.23. CIDO SILICO
tubos, transfira, respectivamente 0,10 ml, 0,25 ml, 0,50 ml,
0,75 ml e 1,0 ml da soluo padro. NAS VACINAS POLIOSDICAS
Prepare um ensaio em branco a partir de 1 ml de gua R. Soluo problema. Para um balo marcado de capacidade
Em cada tubo, complete 1 ml com gua R. Coloque os tubos apropriada que permita obter uma concentrao conhecida
num banho de gua com gelo e, a cada um deles, gota-a- correspondente a cerca de 250 g de polissacarido por
-gota e com agitao constante junte 4,5 ml de uma mistura mililitro, transfira quantitativamente o contedo de um ou
arrefecida de 1 volume de gua R e 6 volumes de cido vrios recipientes e complete o volume com gua R. Com o
sulfrico R. Num banho de gua mantido temperatura auxlio de uma seringa, introduza 4,0 ml da soluo numa
clula de ultrafiltrao de 10 ml de capacidade que s permita
ambiente, aquea os tubos at esta temperatura. A todos os
a passagem de molculas de massa molecular relativa inferior
tubos adicione 0,10 ml de soluo a 30 g/l de cloridrato de
a 50 000. Lave 2 vezes a seringa com gua R e passe as
cistena R preparada imediatamente antes do uso. Agite os
guas de lavagem para a clula de ultrafiltrao. Efectue a
tubos e deixe-os em repouso durante 2 h.
ultrafiltrao com azoto R a uma presso de cerca de
Determine a absorvncia (2.2.25) de cada soluo em 396 nm 150 kPa, agitando continuamente. De cada vez que o volume
e em 430 nm utilizando o ensaio em branco como lquido de de lquido na clula se reduza a 1 ml, dilua com gua R e
compensao. Para cada soluo, calcule a diferena entre obtenha 200 ml de filtrado. O volume final que fica na clula
a absorvncia determinada em 396 nm e a determinada de cerca de 2 ml, Com uma seringa, transfira este lquido
em 430 nm. Construa um grfico com as diferenas de residual para um balo marcado de 10 ml. Lave a clula 3
absorvncia das 5 solues padro em funo das respectivas vezes com 2 ml de gua R de cada vez, transfira as guas de
quantidades de metilpentoses e depois, a partir da curva lavagem para o balo marcado e complete 10,0 ml com gua R
de calibrao obtida, calcule a quantidade de metilpentose (soluo problema). Para 2 tubos de ensaio passe 2,0 ml da
contida na soluo problema para cada um dos volumes soluo problema.
ensaiado. Calcule a mdia de 3 valores. Solues padro. Utilize as solues padro prescritas na
monografia.
Prepare 2 sries de 3 tubos de ensaio. Junte, respectivamente,
2.5.22. CIDOS URNICOS aos tubos de cada srie 0,5 ml, 1,0 ml e 1,5 ml de uma
NAS VACINAS POLIOSDICAS das solues padro correspondentes ao tipo da amostra.
Complete 2,0 ml em cada tubo com gua R.
Soluo problema. Para um balo marcado de volume
Prepare um ensaio em branco introduzindo em 2 tubos de
adequado que permita a preparao de uma soluo contendo
ensaio 2,0 ml de gua R.
aproximadamente 5 mg por mililitro de polissacarido seco,
transfira quantitativamente o contedo dum recipiente Junte a todos os tubos 5,0 ml de reagente de resorcinol R.
e complete com gua R. Dilua a soluo de modo que Aquea a 105C durante 15 min, arrefea com gua fria e
os volumes analisados contenham 4 g a 40 g de cido coloque os tubos num banho de gua com gelo. Junte a cada
glucornio (cidos urnicos). Para 3 tubos, transfira, tubo 5 ml de lcool isoamlico R, misture cuidadosamente
respectivamente, 0,25 ml, 0,50 ml e 1,0 ml da soluo diluda. e deixe no banho de gua com gelo durante 15 min.
Centrifugue e mantenha depois os tubos no banho de gua
Soluo padro. Dissolva 50 mg de glucoronato de sdio R
com gelo at ao momento do exame por espectrofotometria
em 100 ml de gua R (soluo-me contendo 0,4 g de cido
de absoro. Determine a absorvncia (2.2.25) do lquido
glucornico por litro). Imediatamente antes do uso, tome
sobrenadante de cada tubo em 580 nm e 450 nm, utilizando
5 ml da soluo me e complete 50 ml com gua R (soluo
como lquido de compensao lcool isoamlico R. Tome
padro contendo o equivalente a 40 mg de cido glucornico
como absorvncia para cada um dos 2 comprimentos de
por litro). Para 5 tubos, transfira, respectivamente, 0,10 ml,
onda a mdia das leituras obtidas com 2 solues idnticas.
0,25 ml, 0,50 ml, 0,75 ml e 1,0 ml da soluo padro.
Subtraia de cada destes valores a absorvncia mdia dos 2
Prepare um ensaio em branco a partir de 1 ml de gua R. ensaios em branco.
Em cada tubo, complete 1 ml com gua R. Coloque os tubos Construa um grfico com os valores das absorvncias em
num banho de gua com gelo e, a cada um deles, gota a 580 nm e em 450 nm das solues padro em funo
gota e sob agitao constante, adicione 5,0 ml duma soluo do seu teor em cido N-acetilneuramnico e determine

2.5.25. Monxido de carbono nos gases
por interpolao na curva a quantidade de cido um tubo em U (U3) contendo pentxido de difsforo
N-acetilneuramnico (cido silico) da soluo problema. R disperso em pedra porosa previamente granulada e
calcinada,
um tubo em U (U4) contendo 30 g de anidrido idico
2.5.24. DIXIDO recristalizado R granulado, previamente seco a 200C e
DE CARBONO NOS GASES mantido a 120C (T) durante a operao. O reagente
2. Mtodos
Analticos
disposto em discos de 1 cm de espessura separados por
O dixido de carbono nos gases determinado usando um discos de l de vidro da mesma espessura de modo a formar
analisador de infravermelho (ver figura 1). uma coluna de anidrido idico de 5 cm de comprimento
O analisador compreende um sistema emissor de 2 feixes efectivo,
infravermelhos idnticos, constitudo por espirais um frasco de reaco (F2) contendo 2,0 ml de soluo de
electricamente aquecidas incandescncia vermelha escura iodeto de potssio R adicionado de 0,15 ml de soluo de
e equipado com reflectores. Um dos feixes atravessa a clula
amido R.
da amostra e o outro feixe atravessa a clula de referncia. A
clula da amostra recebe um jacto da amostra e a clula de Mtodo. Purgue o aparelho com 5,0 litros de rgon R e, se for
referncia contm azoto R1. caso disso, elimine a cor azul da soluo de iodeto por adio
As 2 cmaras do detector esto cheias com dixido de do volume estritamente necessrio de soluo recentemente
carbono R1 e a radiao selectivamente recebida em preparada de tiossulfato de sdio 0,002 M. Prossiga a purga
automtico. A absoro desta radiao produz calor com at que o valor obtido com 5,0 litros de rgon R no
expanso varivel do gs nas duas cmaras, devido absoro ultrapasse 0,045 ml de tiossulfato de sdio 0,002 M.
pelo dixido de carbono contido na amostra de uma parte da Em seguida, faa passar a amostra no aparelho utilizando o
radiao emitida. volume e o dbito indicados. Recolha os ltimos vestgios
O desequilbrio das presses nas 2 cmaras do detector de iodo libertados no frasco de reaco purgando o aparelho
provoca uma deformao da membrana metlica que com 1,0 litro de rgon R. Titule o iodo libertado com
as separa. Esta membrana faz parte de um condensador tiossulfato de sdio 0,002 M. Prepare um ensaio em branco
elctrico, cuja capacidade varia em funo da variao da utilizando o volume prescrito de rgon R. A diferena entre
presso que tambm funo do teor do dixido de carbono os volumes de tiossulfato de sdio 0,002 M utilizados nas 2
da amostra. Sendo a emisso infravermelha periodicamente titulaes no superior ao limite indicado.
interrompida pela rotao de um obturador, o sinal elctrico
modulado em frequncia.
MTODO II
O monxido de carbono nos gases determinado usando um

2.5.25. MONXIDO analisador de infravermelho (ver figura 1).
DE CARBONO NOS GASES
O analisador compreende um sistema emissor de 2 feixes
infravermelhos idnticos, que constitudo por espirais
MTODO I electricamente aquecidas incandescncia vermelha escura
e equipado com reflectores. Um dos feixes atravessa a clula
Aparelhagem. A aparelhagem (ver figura 2) constituda da amostra e o outro feixe atravessa a clula de referncia. A
pelos seguintes dispositivos, ligados em srie: clula da amostra recebe um jacto da amostra e a clula de
referncia contm azoto R1.
um tubo em U (U1) contendo gel de slica anidra R
impregnada com trixido de crmio R, As 2 cmaras do detector esto cheias com monxido
de carbono R e a radiao selectivamente recebida em
um frasco lavador (F1) contendo 100 ml de soluo de
automtico. A absoro desta radiao produz calor com
hidrxido de potssio R a 400 g/l,
expanso desigual do gs nas 2 cmaras, devido absoro
um tubo em U (U2) contendo pastilhas de hidrxido de pelo monxido de carbono contido na amostra de uma parte
potssio R, da radiao emitida.

2.5.26. Monxido de azoto e dixido de azoto nos gases
O desequilbrio das presses nas 2 cmaras do detector um conversor que permite reduzir o dixido de azoto
provoca uma deformao da membrana metlica que a monxido de azoto, para determinar o contedo
as separa. Esta membrana faz parte de um condensador combinado de monxido de azoto e dixido de azoto.
elctrico, cuja capacidade varia em funo da variao A eficincia do conversor tem de ser verificada antes da
da presso que tambm funo do teor do monxido utilizao,
de carbono da amostra. Sendo a emisso infravermelha
periodicamente interrompida pela rotao de um obturador, um sistema gerador de ozono de dbito controlado.
2. Mtodos
Analticos
o sinal elctrico modulado em frequncia. O ozono produzido por descarga elctrica de alta
tenso entre 2 elctrodos. O ozonizador alimentado
pelo oxignio puro ou pelo ar ambiente desidratado.
A concentrao em ozono obtida excede largamente o
2.5.26. MONXIDO DE AZOTO contedo mximo em xidos de azoto susceptvel de ser
E DIXIDO DE AZOTO NOS GASES medido,
uma cmara de reaco entre o monxido de azoto e o
O monxido e o dixido de azoto so determinados nos gases
ozono,
usando um analisador de quimioluminescncia (ver figura 3).
um sistema de deteco da radiao luminosa emitida no
O aparelho compreende:
comprimento de onda de 1,2 m, consistindo num filtro
um dispositivo para filtrao, verificao e regulao do ptico selectivo e num tubo fotomultiplicador.
dbito da amostra,
FIGURA 2 Analisador do monxido de carbono (Dimenses em milmetros)
FIGURA 3 Analisador de quimioluminescncia

2.5.30. Substncias oxidantes
2.5.27. OXIGNIO NOS GASES

O oxignio nos gases determinado usando um analisador
paramagntico.
O princpio do mtodo tem o seu fundamento na elevada
sensibilidade paramagntica da molcula do oxignio. O
2. Mtodos
Analticos
oxignio exerce uma forte interaco nos campos magnticos,
que medida electronicamente, amplificada e convertida em
unidades de concentrao de oxignio. A determinao da
concentrao em oxignio depende das condies de presso
e temperatura: se o analisador no dispuser de compensao
automtica para as variaes de temperatura e de presso,
calibrado imediatamente antes do emprego.
Uma vez que o efeito paramagntico do oxignio linear, o
instrumento dispe de uma escala apropriada que permite
intervalos de leitura de 0,1 por cento ou ainda mais estreitos.
Calibrao do aparelho. Proceda do seguinte modo
respectiva calibrao:
acerte o zero fazendo passar, atravs do aparelho um
adequado dbito de azoto R1, e at estabilizao da leitura.
O acerto do zero feito de acordo com as instrues do
fabricante,
acerte ao limite apropriado fazendo passar atravs do
instrumento um dbito adequado de ar (20,9 por cento
V/V de O2), at estabilizao da leitura. O limite regulado
para 20,9 por cento V/V de acordo com as instrues do
fabricante.
DOSEAMENTO
FIGURA 4 Aparelho para determinao de dixido de enxofre
Faa passar o ar atravs do aparelho, com dbito constante,
at estabilizao da leitura. No tubo (D) introduza 10 ml de soluo diluda de perxido
de hidrognio R e junte 0,15 ml de soluo de azul de
bromofenol R a 1 g/l em etanol a 20 por cento V/V R. Junte
hidrxido de sdio 0,1 M at obter colorao azul violcea
2.5.28. GUA NOS GASES e sem ultrapassar o ponto de viragem. Sem interromper a
corrente de dixido de carbono, retire o funil (B)e introduza
A gua nos gases determinada atravs de um higrmetro no balo (A), atravs da abertura, 25,0 g da amostra (m g)
electrltico em conformidade com a seguinte descrio: com o auxlio de 100 ml de gua R. Junte atravs do funil
A clula de medio constituda por uma fina pelcula 80 ml de cido clordrico diludo R e aquea ebulio
de pentxido de difsforo colocada entre 2 fios de platina durante 1 h. Abra a torneira do funil, suspenda a corrente de
enrolados em serpentina, os quais actuam como elctrodos. dixido de carbono, o aquecimento e a refrigerao. Passe o
O vapor de gua contido no gs em anlise absorvido pelo contedo do tubo com um pouco de gua R para um matrs
pentxido de difsforo, que se transforma em cido fosfrico, de colo largo de 200 ml. Aquea em banho de gua durante
que condutor elctrico. Uma voltagem contnua aplicada 15 min e deixe arrefecer. Junte 0,1 ml de soluo de azul de
aos elctrodos produz electrlise da gua e a regenerao do bromofenol R a 1 g/l em etanol a 20 por cento V/V R. Titule
pentxido de difsforo. determinada a corrente elctrica com hidrxido de sdio 0,1 M at viragem de amarelo para
resultante, a qual proporcional ao contedo em gua do gs azul violceo (V1 ml). Efectue um ensaio em branco (V2 ml).
em anlise. O sistema autocalibra-se, uma vez que obedece
lei de Faraday. Calcule o teor em dixido de enxofre em partes por milho
usando a expresso:
Tome uma amostra do gs em anlise. Deixe-o estabilizar
temperatura ambiente. Purgue continuamente a clula at n
obter uma leitura estvel. Determine o contedo em gua do 32 030 (V1 V2)
m
gs em anlise, assegurando-se que a temperatura se mantm
constante ao longo do dispositivo usado para introduzir o gs n = molaridade da soluo de hidrxido de sdio usada como
no aparelho. titulante.
2.5.29. DIXIDO DE ENXOFRE 2.5.30. SUBSTNCIAS OXIDANTES

No balo (A) (ver figura 4) introduza 150 ml de gua R. Faa Num matrs de 125 ml com rolha de vidro introduza 4,0 g
passar uma corrente de dixido de carbono R atravs do da amostra e junte 50,0 ml de gua R. Tape e agite com
aparelho com um dbito de 100 ml/min durante 15 min. movimento de rotao durante 5 min. Transfira para um tubo

2.5.32. Micromtodo titulao coulomtrica da gua
de centrfuga de 50 ml com rolha de vidro e centrifugue. ponto de equivalncia da titulao. Quando toda a gua existente
Passe 30,0 ml do sobrenadante lmpido para um matrs na clula consumida, o ponto de equivalncia atingido e
de 125 ml com rolha de vidro. Junte 1 ml de cido actico aparece um excesso de iodo.
glacial R e 0,5 g a 1,0 g de iodeto de potssio R. Rolhe, agite e
1 mole de iodo corresponde a 1 mole de gua, a quantidade de
deixe em repouso no escuro durante 25 min a 30 min. Junte
electricidade 10,7 C corresponde a 1 mg de gua.
1 ml de soluo de amido R e titule com tiossulfato de sdio
0,002 M at desaparecimento da colorao azul. Efectue um A humidade eliminada do sistema por pr-electrlise.
2. Mtodos
Analticos
ensaio em branco. A viragem do indicador no necessita de

Podem realizar-se determinaes individuais sucessivas, na
mais de 1,4 ml de tiossulfato de sdio 0,002 M (0,002 por
mesma mistura de reagentes, desde que:
cento, calculado em H2O2).
cada componente da mistura a analisar seja compatvel
1 ml de tiossulfato de sdio 0,002 M corresponde a 34 g
com os outros componentes,
de substncias oxidantes, calculadas em perxido de
hidrognio. no haja qualquer outra reaco,
o volume e a capacidade de reaco com a gua do reagente
electroltico utilizado sejam suficientes.
2.5.31. RIBOSE
A titulao coulomtrica destina-se unicamente
NAS VACINAS POLIOSDICAS determinao quantitativa de pequenas quantidades de gua
(a quantidade recomendada est compreendida entre 10 g e
Soluo problema. Para um balo marcado de volume 10 mg).
apropriado que permita obter uma soluo de concentrao
conhecida correspondente a cerca de 5 mg de polissarido seco A exactido e a preciso do mtodo so fortemente
por mililitro, transfira quantitativamente o contedo de um dependentes da humidade atmosfrica, a qual excluda do
recipiente e complete o volume com gua R. Dilua a soluo sistema. A inclinao da linha de base permite controlar o
de modo que os volumes ensaiados contenham 2,5 g a 25 g sistema.
de ribose. Introduza em tubos, respectivamente, 0,20 ml e
0,40 ml de soluo diluda ao triplo.
APARELHAGEM
Soluo padro. Dissolva 25 mg de ribose R em gua R e
complete 100,0 ml com o mesmo solvente (soluo-me O aparelho composto por uma clula de reaco, elctrodos
contendo 0,25 g/l de ribose). Dilua extemporaneamente e um agitador magntico. A clula de reaco constituda
1 ml da soluo-me com 10,0 ml de gua R (soluo por um grande compartimento (nodo) e um compartimento
padro contendo 25 mg/l de ribose). Em 6 tubos, introduza, (ctodo) mais pequeno. Dependendo da concepo do
respectivamente. 0,10 ml, 0,20 ml, 0,40 ml, 0,60 ml, 0,80 ml aparelho, os dois compartimentos podem ser separados por
e 1,0 ml da soluo padro. um diafragma. Cada compartimento contm um elctrodo
de platina. As amostras lquidas ou solubilizadas so
Prepare um ensaio em branco a partir de 2 ml de gua R.
introduzidas atravs de uma membrana com uma seringa.
Complete com gua R o volume de 2 ml em cada tubo e agite.
Em alternativa, igualmente possvel recorrer a uma tcnica
Junte a cada tubo 2 ml de soluo de cloreto frrico R a 0,5 g/l
de evaporao em que a amostra aquecida num tubo
em cido clordrico R e agite. Junte a cada tubo 0,2 ml de
(estufa) e a gua de evaporao conduzida para a clula
soluo de orcinol R a 100 g/l em etanol anidro R. Coloque
atravs de uma corrente de gs seco e inerte. Deve evitar-
os tubos em banho de gua durante 20 min e em seguida em
-se a introduo de amostras slidas, na clula. Contudo,
banho de gua com gelo. Determine a absorvncia (2.2.25)
se necessrio, efectua-se por uma cmara susceptvel de ser
de cada soluo em 670 nm utilizando como lquido de
obturada. Para evitar a introduo de humidade atmosfrica,
compensao o ensaio em branco. Construa um grfico com as
aconselhvel tomar medidas apropriadas, trabalhando, por
absorvncias da 6 solues padro em funo das quantidades exemplo, em cmara com atmosfera de gs seco e inerte.
de ribose a contidas e em seguida determine na curva de O processo analtico controlado por um equipamento
calibrao a quantidade de ribose na soluo problema para electrnico apropriado.
cada volume ensaiado. Determine a mdia dos 3 valores.
TCNICA
2.5.32. MICROMTODO TITULAO
COULOMTRICA DA GUA Encha os compartimentos da clula de reaco com reagente
electroltico para o micromtodo da gua R conforme as
instrues do fabricante e efectue a titulao coulomtrica
PRINCPIO at estabilizao do ponto de equivalncia. Introduza, na
clula de reaco, a quantidade prescrita da amostra, agite
A titulao coulomtrica da gua baseia-se na reaco durante 30 s, salvo indicao contrria na monografia, e
quantitativa da gua com o dixido de enxofre e o iodo, em meio efectue novamente a titulao at estabilizao do ponto de
anidro, em presena de uma base que apresente capacidade equivalncia. No caso de utilizao de uma estufa, introduza
tampo suficiente. Ao contrrio do mtodo volumtrico descrito a quantidade prescrita da amostra num tubo e aquea. A
em (2.5.12), o iodo produzido electroquimicamente, na clula titulao comea depois da evaporao da gua contida na
de reaco, por oxidao do iodeto. O iodo produzido no nodo amostra e a sua transferncia para a clula de titulao.
reage imediatamente com a gua e o dixido de enxofre contido Leia o valor e calcule, se necessrio, o teor por cento da
na clula de reaco. A quantidade de gua na substncia substncia. Efectue uma titulao em branco se o tipo e
directamente proporcional quantidade de electricidade at ao preparao da amostra o exigirem.

2.5.33. Protenas totais
VERIFICAO DA EXACTIDO regresso linear, a curva de calibrao que melhor se ajuste

aos diferentes pontos inscritos no grfico.
Entre duas titulaes sucessivas junte uma quantidade
Determine por extrapolao o logaritmo da absorvncia em
de gua rigorosamente pesada e da mesma ordem de
280 nm. A absorvncia devida ao efeito de difuso o
grandeza da quantidade de gua da amostra, quer seja sob a
forma de gua R, quer sob a forma de soluo padro para antilogaritmo deste valor. Corrija os valores observados
micromtodo da gua R, e efectue a titulao coulomtrica. subtraindo absorvncia total em 280 nm a absorvncia devida
2. Mtodos
Analticos
A recuperao situa-se entre 97,5 por cento a 102,5 por cento ao efeito de difuso para obter o valor da absorvncia devida
para uma quantidade de 1000 g de H O adicionada e entre protena em soluo. Com o fim de reduzir os efeitos da difuso
2
90,0 por cento e 110,0 por cento para uma quantidade de da luz, nomeadamente quando a soluo turva, possvel
100 g de H O adicionada. efectuar uma filtrao usando um filtro de 0,2 m que no
2 absorva as protenas, ou uma clarificao por centrifugao.
2.5.33. PROTENAS TOTAIS Clculos. Utilize os valores corrigidos para os clculos. Calcule o
teor em protena da soluo problema (Cu), usando a expresso:
Muitos dos mtodos de doseamento descritos neste captulo
podem ser realizados com dispositivos disponveis no CU = CS (AU /AS)
mercado.
Em que
CS = teor em protena da soluo padro,
MTODO 1
AU = valor da absorvncia corrigida da soluo problema,
As protenas em soluo absorvem a luz ultravioleta no AS = valor da absorvncia corrigida da soluo padro.
comprimento de onda de 280 nm, devido presena na sua
estrutura de cidos aminados aromticos, especialmente a
tirosina e o triptofano. Esta propriedade pode ser utilizada MTODO 2
para dosear as protenas. Se o tampo utilizado para dissolver
a protena possuir uma absorvncia elevada, em relao Este mtodo, comumente chamado mtodo de Lowry,
gua, produz-se uma interferncia que possvel remediar baseia-se na propriedade que as protenas possuem de
utilizando o tampo como lquido de compensao. Todavia, reduzir cidos fosfomolibdotngsticos contidos no reagente
se a absorvncia associada a esta interferncia for elevada, o fosfomolibdotngstico; esta reaco cromognica e traduz-se
resultado das determinaes pode ficar comprometido. Em pela existncia de um pico de absoro em 750 nm. O reagente
baixas concentraes, a protena adsorvida sobre a clula fosfomolibdotngstico reage principalmente com os resduos
pode provocar uma diminuio significativa do teor proteico tirosina da protena. O desenvolvimento da colorao atinge
da soluo. possvel prevenir este fenmeno preparando um mximo ao fim de 20-30 min temperatura ambiente;
amostras de teor elevado ou utilizando um detergente no produz-se de seguida uma descolorao progressiva. Sendo o
inico na preparao. mtodo sensvel a substncias interferentes, pode utilizar-se
Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada da um tratamento que produza a precipitao das protenas da
amostra no tampo escolhido de modo a obter uma soluo amostra. A maior parte das substncias interferentes reduzem
cuja concentrao proteica se situe entre 0,2 mg/ml e 2 mg/ml. a intensidade da colorao obtida, mas alguns detergentes
aumentam-na ligeiramente. Uma forte concentrao salina
Soluo padro. Prepare uma soluo da substncia de pode provocar a formao de um precipitado. Porque a
referncia apropriada correspondente protena a dosear, intensidade da colorao obtida pode variar segundo a espcie
no mesmo tampo que se usa para a soluo problema e de proteica considerada, a protena a dosear e a protena padro
modo a obter a mesma concentrao. so as mesmas. Se for necessrio separar as substncias
interferentes da protena da amostra, proceda como indicado
Tcnica. Mantenha a soluo problema, a soluo padro a seguir em Substncias interferentes antes de preparar
e o lquido de compensao mesma temperatura durante a soluo problema. possvel minimizar o efeito das
todo o ensaio. Determine a absorvncia (2.2.25) da soluo substncias interferentes por diluio, desde que o teor em
problema e da soluo padro em 280 nm em tinas (clulas) protena a dosear se mantenha suficientemente elevado para
de quartzo, utilizando o tampo especfico como lquido de permitir uma determinao exacta.
compensao. Para a exactido dos resultados, a resposta Utilize a gua destilada R para a preparao de todos os
linear no intervalo das concentraes proteicas a dosear. tampes e reagentes utilizados neste mtodo.
Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada
Difuso da luz. A difuso da luz pela amostra pode afectar a
da amostra no tampo especificado de modo a obter uma
exactido do doseamento das protenas. Se as protenas em
concentrao compreendida no intervalo abrangido pela
soluo formam partculas cujo tamanho da mesma ordem
curva de calibrao. O pH de uma soluo preparada com um
de grandeza do comprimento de onda do feixe de medida
tampo apropriado estar compreendido entre 10,0 e 10,5.
(250-300 nm), a difuso do feixe luminoso traduz-se por um
aumento da absorvncia aparente da amostra. Para calcular Solues padro. Dissolva a substncia de referncia
a contribuio deste efeito de difuso na absorvncia lida em correspondente protena a dosear no tampo especificado.
280 nm, determine a absorvncia da soluo problema em Tome amostras desta soluo e complete-as com o mesmo
vrios comprimentos de onda (320 nm, 325 nm, 330 nm, tampo de modo a obter, pelo menos, cinco solues padro
335 nm, 340 nm, 345 nm e 350 nm). Inscreva num grfico diferentes de concentraes compreendidas entre 5 g/ml
o logaritmo da absorvncia lida em funo do logaritmo do e 100 g/ml e uniformemente repartidas no intervalo
respectivo comprimento de onda e determine, por anlise de escolhido.

Soluo em branco. Utilize o mesmo tampo que foi utilizado A protena utilizada como substncia de referncia deve,
para preparar a soluo problema e as solues padro. portanto, ser a mesma que a protena a dosear. Existem
relativamente poucas substncias interferentes, mas
Reagente de sulfato de cobre. Dissolva 100 mg de sulfato de
prefervel evitar os detergentes e os anflitos na amostra
cobre R e 0,2 g de tartarato de sdio R em gua destilada R
a dosear. Amostras muito alcalinas podem provocar
e complete 50 ml com o mesmo solvente. Dissolva 10 g de
interferncias com o reagente cido.
carbonato de sdio anidro R em gua destilada R e complete
2. Mtodos
Analticos
50 ml com o mesmo solvente. Verta lentamente a soluo Utilize a gua destilada R para a preparao de todos os
de carbonato de sdio na soluo de sulfato de cobre, tampes e reagentes a usar neste mtodo.
misturando sempre. Esta soluo utilizada nas 24 horas que
se seguem sua preparao. Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada
da amostra no tampo indicado de modo a obter uma
Reagente alcalino de cobre. Prepare uma mistura de concentrao compreendida no intervalo coberto pela curva
1 volume de reagente de sulfato de cobre, 2 volumes de de calibrao.
soluo de dodecilsulfato de sdio R a 50 g/l e 1 volume
de soluo de hidrxido de sdio R a 32 g/l. Conserve esta Solues padro. Dissolva a substncia de referncia
mistura temperatura ambiente. A mistura utilizada nas 2 correspondente protena a dosear no tampo indicado.
semanas que se seguem sua preparao. Tome amostras desta soluo e complete com o mesmo
tampo de modo a obter pelo menos cinco solues padro de
Reagente fosfomolibdotngstico diludo. Misture 5 ml concentraes proteicas compreendidas entre 0,1 mg/ml e
de reagente fosfomolibdotngstico R com 55 ml de gua 1 mg/ml e uniformemente repartidas no intervalo escolhido.
destilada R. Conserve o reagente temperatura ambiente em
frasco de vidro mbar. Soluo em branco. Utilize o mesmo tampo que foi utilizado
para preparar a soluo problema e as solues padro.
Tcnica. A 1,0 ml de cada soluo padro, da soluo Reagente azul cido 90. Dissolva 0,10 g de azul cido 90 R
problema e da soluo em branco junte 1,0 ml do reagente em 50 ml de etanol a 96 por centro R. Junte 100 ml de cido
alcalino de cobre e misture. Deixe em repouso durante fosfrico R, complete 1000 ml com gua destilada R
10 min. Junte 0,5 ml do reagente fosfomolibdotngstico e misture. Filtre a soluo e conserve-a temperatura
diludo, misture e deixe em repouso temperatura ambiente ambiente em frasco de vidro mbar. Produz-se uma
durante 30 min. Determine a absorvncia (2.2.25) das lenta precipitao do corante durante a armazenagem. O
solues em 750 nm, utilizando a soluo em branco como precipitado eliminado por filtrao antes de se utilizar o
lquido de compensao. reagente.
Clculos. A relao entre a absorvncia e o teor em protena Tcnica. A 0,100 ml de cada soluo padro, da soluo
no linear; entretanto, se o intervalo de concentraes problema e da soluo em branco junte 5 ml do reagente
abrangido pela curva de calibrao for suficientemente azul cido 90. Homogenize a mistura por inverso,
estreito, a curva obtida ser sensivelmente linear. Registe evitando a formao de espuma que pode criar problemas
num grfico a absorvncia das solues padro em funo de reprodutibilidade. Determine a absorvncia (2.2.25) das
do teor em protena destas solues e construa a curva de solues padro e da soluo problema em 595 nm,
calibrao por anlise de regresso linear. A partir da curva de utilizando a soluo em branco como lquido de
calibrao e da absorvncia da soluo problema determine o compensao. Evita-se o uso de tinas de quartzo (slica) j
teor em protena da soluo problema. que o corante se liga a este material.
Substncias interferentes. Neste mtodo junta-se cido Clculos. A relao entre a absorvncia e o teor em protena
desoxicolatotricloractico amostra para precipitar as no linear. Entretanto, se o intervalo de concentrao
protenas e separ-las das substncias interferentes, antes coberto pela curva de calibrao for suficientemente estreito,
de as dosear. Esta tcnica pode igualmente ser utilizada a curva obtida ser sensivelmente linear. Registe num grfico
para concentrar as protenas contidas numa soluo muito a absorvncia das solues padro em funo do teor em
diluda. A 1 ml de uma soluo da amostra junte 0,1 ml protena destas solues e construa a curva de calibrao por
de soluo de desoxicolato de sdio R a 1,5 g/l. Agite com anlise de regresso linear. A partir da curva de calibrao
um agitador tipo vortex e deixe em repouso temperatura e da absorvncia da soluo problema determine o teor em
ambiente durante 10 min. Junte 0,1 ml de soluo de cido protena da soluo problema.
tricloractico R a 720 g/l. Agite com um agitador tipo vortex e
centrifugue a 3000 g durante 30 min. Rejeite o sobrenadante
lquido e elimine o lquido residual com uma pipeta. Dissolva MTODO 4
o cogulo em 1 ml do reagente alcalino de cobre.
Este mtodo, comumente chamado mtodo do cido
bicinchonnico (BCA) baseia-se na propriedade que as
MTODO 3 protenas possuem de reduzir o io cprico (Cu2+) a io
cuproso (Cu+). O reagente de cido bicinchonnico serve
Este mtodo, comumente chamado mtodo de Bradford, para detectar os ies cuprosos. Existem poucas substncias
baseia-se na propriedade que as protenas possuem de interferentes. Se estiverem presentes substncias
deslocar de 470 nm para 595 nm o mximo de absoro do interferentes, possvel minimizar os seus efeitos por
azul cido 90 quando se ligam ao corante. O corante azul diluio, desde que o teor em protenas a dosear se mantenha
cido 90 apresenta uma afinidade marcada para os resduos suficientemente elevado para permitir uma determinao
de arginina e de lisina na protena o que pode provocar exacta. A tcnica de precipitao das protenas descrita no
variaes da resposta ao doseamento de diferentes protenas. Mtodo 2 pode ser utilizada para eliminar as substncias

interferentes. A intensidade da colorao obtida pela reaco de IgG do que com amostras de albumina. O tratamento com
com o reagente pode variar de um tipo de protena para outro cido tricloractico utilizado para reduzir as interferncias
e, por isso, a protena a dosear e a protena de referncia so pode igualmente permitir quantificar a protena quando a sua
as mesmas. concentrao na amostra for inferior a 500 g/ml.
Utilize a gua destilada R para a preparao de todos os Utilize a gua destilada R para a preparao de todos os
tampes e reagentes a usar neste mtodo. tampes e reagentes a usar neste mtodo.
2. Mtodos
Analticos
Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada da
da amostra no tampo indicado de modo a obter uma amostra em soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l de modo
concentrao compreendida no intervalo das concentraes a obter uma concentrao compreendida no intervalo da
das solues padro. concentrao das solues padro.
Solues padro. Dissolva a substncia de referncia Solues padro. Dissolva a substncia de referncia
correspondente protena a dosear no tampo indicado. correspondente protena a dosear em soluo de cloreto de
Tome amostras desta soluo e complete com o mesmo sdio R a 9 g/l. Tome amostras desta soluo e complete com
tampo de modo a obter pelo menos cinco solues padro de soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l de modo a obter pelo
concentraes compreendidas entre 10 g/ml e 1200 g/ml e menos trs solues padro de concentraes compreendidas
uniformemente repartidas no intervalo escolhido. entre 0,5 mg/ml e 10 mg/ml e uniformemente repartidas no
intervalo escolhido.
Soluo em branco. Utilize o mesmo tampo que foi utilizado
para preparar a soluo problema e as solues padro. Soluo em branco. Utilize soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l.
Reagente BCA. Dissolva 10 g de bicinchoninato dissdico R, Reagente de biureto. Dissolva 3,46 g de sulfato de cobre R
20 g de carbonato de sdio mono-hidratado R, 1,6 g de em 10 ml de gua destilada R quente e deixe arrefecer
tartarato de sdio R, 4 g de hidrxido de sdio R e 9,5 g de (soluo A). Dissolva 34,6 g de citrato de sdio R e 20,0 g de
bicarbonato de sdio R em gua destilada R. Se necessrio, carbonato de sdio anidro R em 80 ml de gua destilada R
ajuste o pH para 11,25 com soluo de hidrxido de sdio R quente e deixe arrefecer (soluo B). Misture as solues A e
ou bicarbonato de sdio R. Complete 1000 ml com gua B e complete 200 ml com gua destilada R. Este reagente
destilada R e misture. utilizado dentro dos 6 meses que se seguem sua preparao;
no utilize se se desenvolver turvao ou precipitado.
Reagente de cobre-BCA. Misture 1 ml de soluo de sulfato
de cobre R a 40 g/l com 50 ml de reagente BCA.
Tcnica. A 1 volume da soluo problema junte 1 volume
de soluo de hidrxido de sdio R a 60 g/l e misture. Junte
Tcnica. Misture 0,1 ml de cada soluo padro, da soluo
imediatamente 0,4 volumes (calculado em relao amostra
problema e da soluo em branco com 2 ml de reagente de
da soluo problema) de reagente de biureto e misture
cobre-BCA. Incube as solues a 37C durante 30 min, tome
rapidamente. Mantenha as amostras durante, pelo menos,
nota da hora e deixe arrefecer at temperatura ambiente.
15 min a uma temperatura compreendida entre 15C e 25C.
Nos 60 min a seguir ao perodo de incubao, determine
Nos 90 min que se seguem adio do reagente, determine
a absorvncia (2.2.25) em 562 nm das solues padro
a absorvncia (2.2.25), no mximo em 545 nm, das solues
e da soluo problema em tinas de quartzo, utilizando a
padro e da soluo problema, usando a soluo em branco
soluo em branco como lquido de compensao. Quando a
temperatura das solues voltou a descer para a temperatura como lquido de compensao. Se as solues apresentarem
ambiente, a intensidade da colorao continua a aumentar turvao ou precipitado, no so usadas para o clculo do
progressivamente. teor em protena.
Clculos. A relao entre a absorvncia e o teor em protena Clculos. A relao entre a absorvncia e o teor em protena
no linear. Entretanto, se o intervalo de concentrao sensivelmente linear no intervalo de concentraes indicado
coberto pela curva de calibrao for suficientemente estreito, para as solues padro. Registe num grfico a absorvncia
a curva obtida ser sensivelmente linear. Registe num grfico das solues padro em funo do teor em protena destas
a absorvncia das solues padro em funo do teor em solues e construa a curva de calibrao por anlise de
protena destas solues e construa a curva de calibrao por regresso linear. Calcule o coeficiente de correlao para
anlise de regresso linear. A partir da curva de calibrao a curva de calibrao. O sistema satisfaz se se obtiver um
e da absorvncia da soluo problema determine o teor em recta cujo coeficiente de correlao for, pelo menos, de 0,99.
protena da soluo problema. A partir da curva de calibrao e da absorvncia da soluo
problema determine o teor em protena da soluo problema.
MTODO 5 Substncias interferentes. possvel limitar o efeito das

substncias interferentes precipitando, como se indica a
Este mtodo, comumente chamado mtodo do biureto, baseia- seguir, a protena da amostra: junte 0,1 volumes de soluo
-se na propriedade que as protenas possuem de interagir com de cido tricloractico R a 500 g/l a 1 volume de soluo da
o io cprico (Cu2+), em meio alcalino, dando um produto de amostra, elimine o sobrenadante e dissolva o precipitado
reaco que apresenta absorvncia em 545 nm. Este mtodo num pequeno volume de hidrxido de sdio 0,5 M. Utilize a
permite obter um desvio mnimo entre amostras equivalentes soluo assim obtida para preparar a soluo problema.
de IgG e de albumina. Pelo contrrio, a adio simultnea
de hidrxido de sdio e do reagente de biureto (na forma de
mistura), uma homogeneizao insuficiente aps a adio do MTODO 6
hidrxido de sdio ou um intervalo de tempo muito longo
entre a adio do hidrxido de sdio e do reagente de biureto Este mtodo fluorimtrico baseia-se numa derivatizao da
conduz obteno de uma resposta mais elevada com amostras protena pelo o-ftalaldedo que reage com as aminas primrias

2.5.34. cido actico nos peptidos sintticos
da protena, isto , o cido aminado N-terminal e a funo MTODO 7

-amina dos resduos de lisina. A sensibilidade do doseamento
pode ser melhorada por uma hidrlise prvia da protena, Este mtodo baseia-se na quantificao das protenas por
antes da adio do o-ftalaldedo. A hidrlise liberta a funo doseamento do azoto. A presena na amostra de outras
-amina dos cidos aminados constituintes da protena e substncias azotadas pode afectar o resultado do doseamento
que lhe permitem reagir com o reagente de ftalaldedo. Este das protenas. As tcnicas utilizadas para dosear o azoto
mtodo aplicvel a quantidades muito pequenas de protena.
2. Mtodos
conduzem destruio da amostra durante a anlise mas no

Analticos
As aminas primrias contidas, por exemplo, nos tampes de

tris(hidroximetil)aminometano e nos tampes de aminocidos se limitam determinao das protenas em meio aquoso.
reagem com o ftalaldedo e so, portanto, de evitar ou
eliminar. A amnia em elevada concentrao reage igualmente Tcnica A. Proceda como indicado para o doseamento do
com o ftalaldedo. A fluorescncia resultante da reaco azoto aps mineralizao pelo cido sulfrico (2.5.9) ou
amina-ftalaldedo pode ser instvel. O emprego de processos utilize instrumentos disponveis no mercado adaptados ao
automatizados para padronizar o mtodo pode permitir doseamento do azoto pelo mtodo de Kjeldahl.
melhorar-lhe a exactido e a fiabilidade.
Utilize a gua destilada R para a preparao de todos os Tcnica B. Existem no mercado instrumentos adaptados
tampes e reagentes a usar neste mtodo. para o doseamento do azoto. A maior parte deles utiliza a
Soluo problema. Dissolva uma quantidade apropriada da pirlise (combusto da amostra em presena do oxignio
amostra em soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l de modo a temperaturas prximas de 1000C), que provoca a
a obter uma concentrao compreendida no intervalo das formao de monxido de azoto (NO) e outros xidos de
concentraes das solues padro. Ajuste o pH da soluo forma NOx a partir do azoto existente na amostra. Certos
para 8-10,5 antes de juntar o reagente de ftalaldedo. instrumentos convertem esses xidos de azoto em azoto
Solues padro. Dissolva a substncia de referncia gasoso que quantificado por condutimetria trmica. Outros
correspondente protena a dosear em soluo de cloreto misturam o monxido de azoto (NO) com ozono (O3) para
de sdio R a 9 g/l. Tome amostras desta soluo e complete produzir dixido de azoto no estado excitado (NO*2) que
com soluo de cloreto de sdio a 9 g/l de modo a obter emite uma radiao luminosa quando do seu decaimento
pelo menos cinco solues padro de concentraes e quantificado por quimioluminiscncia. Um produto de
compreendidas entre 10 g/ml e 200 g/ml e uniformemente referncia relativamente puro e semelhante, quanto sua
repartidas no intervalo escolhido. Ajuste o pH das solues composio, protena a dosear utilizado para optimizar
para 8-10,5 antes de juntar o reagente de ftalaldedo. os parmetros de injeco e de pirlise e para avaliar a
Soluo em branco. Utilize soluo de cloreto de sdio a 9 g/l. reprodutibilidade da anlise.
Soluo tampo de borato. Dissolva 61,83 g de cido brico R
em gua destilada R e ajuste o pH para 10,4 com soluo Clculos. O teor em protena calcula-se dividindo o teor em
de hidrxido de potssio R. Complete 1000 ml com gua azoto da amostra pelo teor em azoto (conhecido) da protena
destilada R e misture. que pode ser determinado quer a partir da estrutura qumica
da protena, quer por comparao com uma substncia de
Soluo-me de ftalaldedo. Dissolva 1,20 g de ftalaldedo R
em 1,5 ml de metanol R, junte 100 ml de soluo de tampo referncia apropriada.
de borato e misture. Junte 0,6 ml de soluo de ter lurico
de macrogol 23 R a 300 g/l e misture. Conserve a soluo
temperatura ambiente e utilize-a dentro das 3 semanas que 2.5.34. CIDO ACTICO
se seguem sua preparao. NOS PEPTIDOS SINTTICOS
Reagente de ftalaldedo. A 5 ml da soluo-me de ftalaldedo
junte 15 l de 2-mercaptoetanol R. Prepare o reagente Cromatografia lquida (2.2.29).
30 min, pelo menos, antes de o utilizar. Utilize dentro das 24
horas aps a sua preparao. Soluo problema. Prepare a soluo problema como
descrito na monografia. A concentrao do peptido na
soluo pode ser adaptada, dependendo da quantidade
Tcnica. Misture 10 l da soluo problema e de cada uma
das solues padro com 0,1 ml de reagente de ftalaldedo e esperada de cido actico na amostra.
deixe em repouso temperatura ambiente durante 15 min. Soluo padro. Prepare uma soluo de cido actico glacial
Junte 3 ml de hidrxido de sdio 0,5 M e misture. Determine R a 0,10 g/l numa mistura de 5 volumes da fase mvel B e 95
a intensidade da fluorescncia (2.2.21) das amostras das volumes da fase mvel A.
solues padro e da soluo problema no comprimento de
onda de excitao de 340 nm e no comprimento de onda de Coluna:
emisso de 440 nm a 455 nm. Determine a intensidade da
fluorescncia de uma amostra uma s vez porque a irradiao dimenses: l 0,25 m ; 4,6 mm,
provoca uma diminuio da intensidade da fluorescncia. fase estacionria: gel de slica octadecilsililada para
cromatografia R (5 m)
Clculos. A relao entre a intensidade de fluorescncia e o
teor em protena linear. Registe num grfico as intensidades Fase mvel:
de fluorescncia obtidas com as solues padro em funo Fase mvel A: tome 0,7 ml de cido fosfrico R e complete
do teor em protena destas solues e construa a curva de 1000 ml com gua R; ajuste o pH para 3,0 com soluo
calibrao por anlise de regresso linear. A partir da curva concentrada de hidrxido de sdio R,
de calibrao e da intensidade de fluorescncia da soluo
problema determine o teor em protena da soluo problema. Fase mvel B: metanol R,

2.5.36. ndice de anisidina
Intervalo Fase mvel A Fase mvel B capacidade varia em funo da variao da presso, esta ltima
(min) (por cento V/V) (por cento V/V) funo do teor em protxido de azoto da amostra. Sendo a
05 95 5 emisso infravermelha interrom-pida periodicamente pela
5 10 95 50 5 50 rotao de um obturador, o sinal elctrico modulado em
10 20 50 50 frequncia.
20 22 50 95 50 5
22 30 95 5
2. Mtodos
Analticos
2.5.36. NDICE DE ANISIDINA
Dbito: 1,2 ml/min.
Deteco: espectrofotmetro em 210 nm O ndice de anidisina definido como sendo 100 vezes a
densidade ptica determinada em 1 cm de espessura, de uma
Injecco: 10 l. soluo contendo 1 g da amostra em 100 ml de uma mistura
Tempo de reteno do cido actico: 3-4 min. de solventes e de reagentes conforme o mtodo a seguir
descrito.
Resultado: aps o incio do gradiente linear, a linha de base
apresenta uma brusca ascenso que corresponde eluio do Efectue as manipulaes o mais rapidamente possvel
peptido da coluna. evitando a exposio luz actnica.
Determine o teor em cido actico no peptido. Soluo problema (a). Dissolva 0,500 g da amostra em
trimetilpentano R e complete 25,0 ml com o mesmo
solvente.
2.5.35. PROTXIDO DE AZOTO NOS Soluo problema (b). A 5,0 ml da soluo problema (a) junte
1,0 ml de soluo de p-anisidina R a 2,5 g/l em cido actico
GASES glacial R, agite e mantenha ao abrigo da luz.
O protxido de azoto determinado nos gases com um Soluo padro. A 5,0 ml de trimetilpentano R junte 1,0 ml
analisador de infravermelho (ver a figura 1). de soluo de p-anisidina R a 2,5 g/l em cido actico glacial R,
agite e mantenha ao abrigo da luz.
O analisador de infravermelho (ver a figura) inclui um
sistema emissor de 2 feixes idnticos de raios infravermelhos, Determine a absorvncia da soluo problema (a) no mximo
constitudo por espirais aquecidas electricamente at ao em 350 nm utilizando trimetilpentano R como lquido de
rubro sombrio e munido de reflectores. As radiaes emitidas compensao. Exactamente aps 10 min da sua preparao,
atravessam, separadamente, uma cmara de anlise e uma determine a absorvncia da soluo problema (b) em 350 nm
cmara de referncia. A clula de anlise varrida pela amostra utilizando a soluo padro como lquido de compensao.
e a clula de referncia contm azoto R1. A recepo selectiva
da radiao automaticamente realizada nas 2 cmaras do Calcule o ndice de anisidina utilizando a seguinte expresso:
detector cheias com protxido de azoto R. A absoro desta 25 (1,2 A1 A2)
radiao provoca um aquecimento e uma dilatao do gs
m
de amplitude desigual nas 2 cmaras dada a absoro pelo
protxido de azoto contido na amostra de uma parte da radiao A1 = absorvncia da soluo problema (b) em 350 nm,
emitida. O desequilbrio das presses nas 2 cmaras do detector
A2 = absorvncia da soluo problema (a) em 350 nm,
provoca uma deformao da membrana metlica que as separa.
Esta membrana faz parte de um condensador elctrico cuja m = massa da amostra na soluo problema (a), em gramas.

1. Prescries gerais
2. Mtodos
Analticos

2.6. MTODOS
BIOLGICOS
2. Mtodos
Analticos
2.6. Mtodos biolgicos 169 2.6.17. Ensaio da actividade anticomplementar
2.6.1. Esterilidade 169 da imunoglobulina 210
2.6.2. Micobactrias 173 2.6.18. Ensaio de neurovirulncia em vacinas
2.6.7. Micoplasmas 173 com vrus vivo 212
2.6.8. Pirognios 179 2.6.19. Ensaio de neurovirulncia da vacina oral
2.6.9. Toxicidade anormal 180 contra a poliomielite 213
2.6.10. Histamina 181 2.6.20. Ttulo em hemaglutininas anti-A e anti-B
2.6.11. Substncias hipotensoras 181 (mtodo indirecto) 214
2.6.12. Controlo microbiolgico de produtos no 2.6.21. Tcnicas de amplificao dos cidos
estreis (determinao do nmero total nucleicos 214
de germes aerbios viveis) 182 2.6.22. Factores de coagulao activados 218
2.6.13. Controlo microbiolgico de produtos no 2.6.24. Vacinas vricas avirias: pesquisa de agentes
estreis (pesquisa dos microrganismos agentes estranhos nos lotes semente 218
especficos) 189 2.6.25. Vacinas vricas vivas avirias: pesquisa de
2.6.14. Endotoxinas bacterianas 200 agentes estranhos nos lotes de produto final 222
2.6.15. Activador da pr-calicrena 208 2.6.26. Ensaio de anticorpos anti-D na imunoglubina
2.6.16. Ensaio de agentes estranhos em vacinas humana para via intravenosa 226
vricas para uso humano 209 2.6.27. Controlo microbiolgicos dos produtos
celulares 226

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.6 MTODOS BIOLGICOS (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.6 MTODOS BIOLGICOS (NDICE)
2.6. Mtodos biolgicos
2.6. MTODOS BIOLGICOS a soluo, sem levar ebulio, e filtre a quente por papel
de filtro humedecido. Junte a soluo de resazurina sdica,
misture e distribua o meio em recipientes que apresentem
entre a superfcie e a profundidade uma relao tal que,
2.6.1. ESTERILIDADE durante a incubao, a zona que apresenta uma viragem do
indicador do potencial de oxidao-reduo no sentido da
O ensaio aplica-se s substncias, preparaes e produtos oxidao no ultrapasse metade da altura do meio. Esterilize
2. Mtodos
Analticos
que, segundo a Farmacopeia, so estreis. Todavia, por um mtodo validado. Se o meio for conservado, conserve
um resultado favorvel significa apenas que nenhum a uma temperatura compreendida entre 2C e 25C num
microrganismo contaminante foi detectado na amostra recipiente estril estanque. Se mais do que o tero superior
examinada nas condies de ensaio. As indicaes do meio tiver cor rosada, o meio pode voltar a ser regenerado
complementares sobre as regras a aplicar para estabelecer a quer aquecendo os recipientes em banho de gua quer com
esterilidade de um lote so dadas no fim deste texto. vapor circulante at a cor rosada desaparecer, arrefecendo
depois rapidamente de modo a evitar a introduo de ar no
estril no recipiente. No utilize meio para alm do perodo de
PRECAUES CONTRA AS CONTAMINAES MICROBIANAS conservao validado.
O ensaio de esterilidade realizado em condies asspticas.

Meio de hidrolisado de casena e de soja
Para que se consigam estas condies, o ambiente do ensaio
deve ser adaptado s modalidades de realizao do ensaio Hidrolisado pancretico de casena 17,0 g
de esterilidade. As precaues tomadas para evitar uma Hidrolisado papanico de farinha de soja 3,0 g
contaminao no tm influncia sobre os microrganismos Coreto de sdio 5,0 g
a revelar por este ensaio. As condies em que realizado Fosfato dipotssico 2,5 g
o ensaio so regularmente verificadas por procedimentos Glucose mono-hidratada/glucose anidra 2,5 g/2,3 g
efectuados na zona de trabalho e por controlos apropriados gua R 1000 ml
(tais como os especificados nas Directivas comunitrias pH do meio aps esterilizao: 7,3 0,2
europeias e nos guias associados relativos s BPF).
Dissolva os diferentes produtos na gua R, aquecendo
suavemente. Arrefea a soluo temperatura ambiente.
MEIOS DE CULTURA E TEMPERATURAS DE INCUBAO Determine o pH ajustando, se necessrio, com hidrxido de
sdio 1 M, de forma a que depois da esterilizao o meio tenha
Os meios de cultura utilizados podem ser preparados pH 7,3 0,2. Filtre, se necessrio, para obter uma soluo
como se indica a seguir; podem tambm utilizar-se meios lmpida, distribua em recipientes apropriados e esterilize por
equivalentes disponveis no mercado desde que satisfaam ao um mtodo validado. Conserve o meio num recipiente estril
ensaio de crescimento. bem fechado, a menos que seja para uso imediato, a uma
Para os ensaios de esterilidade convm utilizar os meios de temperatura compreendida entre 2C e 25C. No utilize o
cultura que abaixo se indicam. O meio liquido de tioglicolato meio fora do perodo de conservao validado.
destina-se principalmente pesquisa de bactrias anaerbias A temperatura de incubao do meio com hidrolisado de
mas capaz de revelar bactrias aerbias. O meio de casena e de soja de 20-25C.
hidrolisado de casena e soja destina-se tanto pesquisa de
fungos e leveduras como de bactrias aerbias. Os meios utilizados satisfazem aos ensaios seguintes,
efectuados antes do ensaio da amostra ou em paralelo.
Podem ser utilizados outros meios, com a condio de
satisfazerem aos ensaios de crescimento e de validao. Esterilidade.Proceda incubao de amostras dos meios
durante 14 dias. No apresentam qualquer desenvolvimento
Meio lquido de tioglicolato microbiano.
L-Cistina 0,5 g
Gelose, em grnulos (teor em gua no superior a 15 por cento) 0,75 g Ensaio de crescimento de bactrias anaerbias e aerbias
Cloreto de sdio 2,5 g e leveduras e fungos. Efectue o ensaio em cada lote de
Glucose mono-hidratada/glucose anidra 5,5 g/5,0 g
meio preparado quer de meio desidratado, quer a partir
dos ingredientes descritos. As estirpes de microrganismos
Extracto de levedura (solvel em gua) 5,0 g
apropriadas esto indicadas no quadro 1.
Hidrolisado pancretico de casena 15,0 g
Tioglicolato de sdio 0,5 g Semeie amostras do meio lquido de tioglicolato com um
ou pequeno nmero (no mximo 100 UFC) dos microrganismos
cido tiogliclico 0,3 ml seguintes, utilizando uma fraco separada de meio para
Soluo de resazurina sdica a 1 por mil, preparada cada espcie de microrganismos: Clostridium sporogenes,
recentemente 1,0 ml Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Semeie
gua R 1000 ml
amostras do meio hidrolisado de casena e de soja com um
pequeno nmero (no mximo 100 UFC) dos microrganismos
pH do meio aps esterilizao: 7,1 0,2
seguintes, utilizando uma fraco separada de meio para
Misture a L-cistina, a gelose, o cloreto de sdio, a glucose, o cada espcie de microrganismos: Aspergillus niger, Bacillus
extracto de levedura hidrossolvel e o hidrolisado pancretico subtilis, Candida albicans. Incube durante um mximo de 3
dias para as bactrias e 5 dias para as leveduras e fungos.
de casena com gua R e aquea at dissoluo. Dissolva
o tioglicolato de sdio ou o cido tiogliclico na soluo e As culturas so efectuadas segundo um sistema de lotes
determine o pH ajustando, se necessrio, com hidrxido de semente, tais que os microrganismos utilizados para a
sdio 1M de forma a que, depois da esterilizao, o meio tenha inoculao no tenham mais do que 5 passagens a partir do
pH 7,1 0,2. Se for necessria filtrao, aquea novamente lote semente primrio.

QUADRO 1 Microrganismos de ensaio apropriados para os ensaios de crescimento e de validao
Bactrias aerbias
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10.788, NCIMB 9518
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118
2. Mtodos
Analticos
Bactrias anaerbias
Clostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 ou ATCC 11437
Fungos e leveduras
Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179

Aspergillus niger ATCC 16404, IP 143.83, IMI 149007
Os meios so apropriados se se observar um crescimento ENSAIO DE ESTERILIDADE DA AMOSTRA

ntido dos microrganismos.
O ensaio pode ser realizado utilizando quer a tcnica
da filtrao atravs de membrana, quer pela tcnica de
ENSAIO DE VALIDAO sementeira directa do meio nutritivo com a amostra. Inclui
em todos os casos padres negativos apropriados. A tcnica
Proceda como descrito no ensaio de esterilidade da amostra da filtrao atravs de membrana utilizada sempre que
aplicando exactamente o mesmo mtodo, com as seguintes a natureza do produto o permita (preparaes aquosas
modificaes: filtrveis, alcolicas ou oleosas, preparaes solveis em
solventes aquosos ou oleosos ou miscveis com esses
Filtrao atravs de membrana. Aps transferir para a solventes desde que no exeram efeito antimicrobiano nas
membrana o contedo do(s) recipiente(s) a examinar, condies do ensaio).
junte um inoculo contendo um pequeno nmero de
microrganismos viveis (no mximo 100 UFC) ao volume Filtrao atravs de membrana. Utilize membranas filtrantes
final do diluente estril utilizado para lavar o filtro. com um dimetro nominal de poro de 0,45 m, no mximo,
e cuja eficcia para reter os microrganismos foi estabelecida.
Por exemplo, as membranas de nitrato de celulose so
Sementeira directa. Aps transferir para um meio de utilizadas para as solues aquosas, oleosas ou ligeiramente
cultura o contedo do(s) recipiente(s) a examinar, semeie alcolicas e as de acetato de celulose para as solues
o meio com um inculo contendo um pequeno nmero de fortemente alcolicas. O uso de membranas especiais pode
microrganismos viveis (no mximo 100 UFC). ser necessrio para certos produtos, como, por exemplo, os
Nos dois casos utilize os mesmos microrganismos como se antibiticos.
descreve em Ensaio de crescimento de bactrias anaerbias A tcnica seguidamente descrita corresponde ao emprego
e aerbias e leveduras e fungos e efectue em paralelo um de membranas com cerca de 50 mm de dimetro. Se forem
ensaio de crescimento (padro positivo). Incube todos os utilizadas membranas de diferente dimetro, os volumes
recipientes contendo o meio durante 5 dias no mximo. de lquido para a diluio e lavagem so modificados em
conformidade. O aparelho de filtrao e a membrana so
Aps a inoculao, se se obtiver um crescimento microbiano esterilizados por meios apropriados. O aparelho tal que
ntido, comparvel visualmente ao observado com o padro a amostra possa ser introduzida e filtrada em condies de
positivo, o produto no possui actividade antimicrobiana assepsia e permite a remoo assptica da membrana para
nas condies do ensaio ou a sua actividade microbiana foi os meios de cultura ou a adio de meios de cultura e a
eliminada de forma satisfatria. O ensaio de esterilidade pode incubao no prprio aparelho.
ento ser efectuado sem outra modificao.
Solues aquosas. Se necessrio, introduza num aparelho
Se na presena da amostra no se obtiver um crescimento munido de membrana adequada uma pequena quantidade de
microbiano ntido, comparvel visualmente ao observado no diluente estril apropriado, como seja uma soluo neutra
padro positivo, este contm uma actividade antimicrobiana (pH 7,1 0,2) de peptona de carne ou de casena a 1 g/l,
que no foi eliminada de forma satisfatria nas condies e filtre. O diluente pode conter substncias neutralizantes
de ensaio utilizadas. Modifique neste caso as condies de e/ou inactivantes apropriadas, por exemplo no caso dos
ensaio, para eliminar a actividade antimicrobiana, e repita o antibiticos.
ensaio de validao. Transfira o contedo do ou dos recipientes a examinar para
Esta validao efectuada: um ou vrios aparelhos assim preparados, se necessrio
aps diluio at ao volume utilizado no ensaio de validao,
a) quando o ensaio de esterilidade aplicado a um novo com o diluente estril utilizado, mas em qualquer caso
produto, utilizando, no mnimo, a quantidade prescrita no quadro
b) cada vez que sejam modificadas as condies 2. Filtre imediatamente. Se o produto tiver propriedades
antimicrobianas, lave a membrana, pelo menos 3 vezes,
experimentais do ensaio.
filtrando de cada vez o mesmo volume de diluente estril
A validao pode ser realizada ao mesmo tempo que o ensaio utilizado no ensaio de validao. No exceda um ciclo de
de esterilidade da amostra. lavagem de 5 vezes 200 ml, mesmo se durante a validao

tiver sido demonstrado que esse ciclo no elimina As pomadas de excipiente gordo e as emulses do tipo gua
completamente a actividade anitimicrobiana. Transfira em leo podem ser diludas a 1/100 em miristato de isopropilo
a membrana inteira para o meio de cultura ou corte-a que satisfaa s condies precedentemente mencionadas,
assepticamente em duas partes iguais e coloque cada uma aquecendo, se necessrio, a uma temperatura que no
delas num meio diferente. Utilize de cada vez o mesmo ultrapasse 40C. Em certos casos excepcionais, aquea, se
volume de meio que o utilizado para o ensaio de validao. O necessrio, at 44C. Filtre to rapidamente quanto possvel e
meio tambm pode ser transvasado no aparelho munido de proceda como foi descrito para os leos e solues oleosas.
2. Mtodos
Analticos
membrana. Promova a incubao dos meios durante 14 dias,
pelo menos. Sementeira directa no meio de cultura. Semeie directamente
o meio de cultura com a quantidade de preparao indicada
Slidos solveis. Utilize para cada meio de cultura uma
no quadro 2 de tal modo que o volume do produto utilizado
quantidade de produto pelo menos igual que indicada
no ultrapasse 10 por cento do volume do meio, salvo
no quadro 2, em soluo num solvente apropriado, como,
indicao em contrrio.
por exemplo, uma soluo neutra de peptona de carne ou
de casena a 1 g/l, e proceda como precedentemente foi Se a amostra tem actividade antimicrobiana efectue o ensaio
descrito para as solues aquosas, utilizando uma membrana aps t-la neutralizado por meio de uma substncia adequada
adequada ao solvente escolhido. ou por diluio numa quantidade suficiente do meio de
cultura. Quando se voltar a examinar grandes volumes do
leos e solues oleosas. Utilize para cada meio de cultura produto pode ser prefervel a utilizao de meios de cultura
uma quantidade de produto pelo menos igual que concentrados, preparados de modo a tomar em conta a
indicada no quadro 2. Os leos e as solues oleosas de diluio que vai seguir-se. Em certos casos, o meio de cultura
viscosidade suficientemente fraca podem ser filtrados concentrado pode ser adicionado directamente amostra no
sem diluio atravs da membrana seca. Os leos viscosos seu recipiente.
podem ser diludos com um diluente estril apropriado,
como, por exemplo, o miristato de isopropilo, cuja ausncia Lquidos oleosos. Utilize meios aos quais foi adicionado um
de aco antimicrobiana, nas condies de ensaio, tenha agente emulsionante apropriado numa concentrao validada
sido demonstrada. Deixe penetrar o leo na membrana por (por exemplo polissorbato 80 numa concentrao de 10 g/l).
gravidade e filtre aplicando lentamente suco ou presso. Pomadas e cremes. Emulsione numa quantidade de um
Lave a membrana pelo menos 3 vezes, filtrando de cada diluente estril apropriado, como seja uma soluo neutra
vez 100 ml de uma soluo estril apropriada, como seja de peptona de carne ou de casena a 1 g/l contendo o agente
uma soluo neutra de peptona de carne ou de casena a emulsionante para obter uma diluio de cerca de 1/10.
1 g/l adicionada de um emulsionante apropriado numa Semeie a emulso obtida em meio sem agente emulsionante.
concentrao demonstrada como adequada no ensaio de
Promova a incubao dos meios semeados, durante 14 dias,
validao, por exemplo o polissorbato 80 numa concentrao
no mnimo. Observe as culturas vrias vezes no decurso do
de 10 g/l. Transfira a ou as membranas para o ou os meios de
perodo de incubao. As culturas contendo as preparaes
cultura, ou inversamente, como foi descrito para as solues
oleosas so agitadas suavemente em cada dia. Todavia,
aquosas, e promova a incubao mesma temperatura, sempre que um meio de tioglicolato ou um meio semelhante
durante o mesmo tempo. seja utilizado para a deteco de anaerbios, a agitao
Pomadas e cremes. Utilize para cada meio de cultura uma limitada ao mnimo, a fim de manter as condies de
quantidade pelo menos igual que indicada no quadro 2. anaerobiose.
QUADRO 2 Quantidades mnimas a serem utilizadas em cada meio
Quantidade mnima a utilizar em cada meio,

Quantidade por recipiente
salvo excepo justificada e autorizada
Lquidos
< 1 ml Contedo total do recipiente
1-40 ml; Metade do contedo do recipiente, mas pelo menos 1 ml
> 40 ml e < 100 ml: 20 ml
> 100 ml 10 por cento do contedo do recipiente de modo a obter pelo
menos 20 ml
Lquidos antibiticos 1 ml
Outras preparaes solveis em gua ou no miristato de isopropilo Contedo total do recipiente de modo a obter pelo menos 200 mg
Preparaes insolveis, cremes e pomadas a converter em suspenso

Contedo total do recipiente de modo a obter pelo menos 200 mg
ou emulso
Slidos
< 50 mg Contedo total do recipiente
50 mg e < 300 ml: Metade do contedo total do recipiente, mas pelo menos 50 mg
300 mg a 5 g 150 mg
>5g 500 g
Catgut e outros fios cirrgicos para uso veterinrio 3 segmentos de fio (de 30 cm de comprimento cada um)

Catgut e outros fios cirrgicos para uso veterinrio. Para em qualquer caso as quantidades mnimas indicadas no
cada meio de cultura utilize, no mnimo, a quantidade quadro 2. Se for caso disso, dilua at cerca de 100 ml com um
de produto indicada no quadro 2. Proceda abertura diluente estril apropriado, (como, por exemplo, uma soluo
da embalagem selada em condies de assepsia e retire, neutra de peptona de carne ou de casena a 1 g/l).
para cada meio de cultura, 3 segmentos de fio com um
comprimento de 30 cm, cortados da parte inicial, do centro Para a tcnica por sementeira directa do meio utilize as
e da parte final do fio. Utilize segmentos de fio inteiros de quantidades indicadas no quadro 2, salvo excepo justificada
2. Mtodos
Analticos
embalagens abertas recentemente. Semeie cada segmento e autorizada. A pesquisa das contaminaes bacterianas e
no meio de cultura escolhido para o ensaio. Utilize uma fngicas efectuada sobre a mesma amostra do produto a
quantidade de meio suficiente para imergir completamente a examinar. Quando o contedo de cada recipiente no for
amostra (20 ml a 150 ml). suficiente para estes ensaios, utilize o contedo de vrios
recipientes para a sementeira dos diferentes meios.
OBSERVAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
INDICAES PARA APLICAO DO ENSAIO
Durante e no fim do perodo de incubao, examine os DE ESTERILIDADE
meios que podem revelar macroscopicamente proliferao
microbiana. Se a amostra indica turvao do meio que O objectivo do ensaio de esterilidade, como todos os
torne difcil a deteco visual dum eventual crescimento ensaios inscritos na Farmacopeia, permitir ao operador,
microbiano 14 dias aps a incubao, transfira volumes independentemente dos meios, verificar que um determinado
apropriados do meio (no mnimo de 1 ml cada um) para produto corresponde aos requisitos da Farmacopeia
novos recipientes contendo o mesmo meio fresco e incube Portuguesa. Um fabricante no obrigado a efectuar o ensaio,
durante 4 dias, pelo menos, o meio inicial e os meio nem impedido de aplicar variantes do mtodo especificado
transferidos. ou mtodos alternativos, desde que tenha comprovado que o
Se no houver qualquer manifestao de crescimento produto em questo, quando controlado pelo mtodo oficial,
microbiano o produto satisfaz ao ensaio. Se for observado satisfaz aos requisitos da Farmacopeia Portuguesa.
crescimento microbiano, o produto no satisfaz ao ensaio,
a no ser que se demonstre nitidamente que tal ensaio no Precaues para impedir a contaminao microbiana. As
vlido por motivos independentes do produto. O ensaio condies de assepsia necessrias para se efectuar o ensaio
s pode ser considerado no vlido se pelo menos uma das
de esterilidade podem ser conseguidas, por exemplo, em
seguintes condies for observada:
cmaras de fluxo laminar de classe A situadas numa sala
a) os resultados do controlo microbiolgico dos prpria de classe B, ou num isolador.
equipamentos utilizados nos ensaios de esterilidade
apresentarem uma anomalia,
Indicaes aos fabricantes. O nvel de segurana que
b) o exame do mtodo experimental utilizado para efectuar o conseguido, quanto a qualidade global do lote, obteno de
ensaio em questo apresentar uma anomalia, um resultado que satisfaa ao ensaio de esterilidade (ausncia
c) os padres negativos apresentarem crescimento de unidades contaminadas na amostra controlada), funo
microbiano, da homogeneidade das condies de fabrico e da eficcia do
esquema de amostragem adoptado. Por essa razo e para as
d) aps identificao dos microrganismos isolados no final necessidades do presente texto, o lote definido como um
do ensaio, for demonstrado que o crescimento de esta(s) conjunto homogneo de recipientes fechados preparados de
espcie(s) sem qualquer dvida imputvel aos materiais tal forma que o risco de contaminao seja o mesmo para
e/ou s tcnicas usadas para a realizao do ensaio de cada uma das unidades componentes.
esterilidade.
No caso de produtos que sejam objecto de esterilizao final,
Se o ensaio considerado no vlido, repetido sobre o
a qualidade assegurada pelas provas fsicas, biologicamente
mesmo nmero de unidades que o ensaio inicial.
fundamentadas e registadas automaticamente demonstrando
Se no forem observados sinais de crescimento microbiano que o tratamento de esterilizao foi correctamente aplicado
aquando da repetio do ensaio, a amostra satisfaz ao ensaio. totalidade do lote, superior conseguida pelo ensaio de
Se um crescimento microbiano observado aquando da esterilidade. As circunstncias nas quais permitido recorrer
repetio do ensaio, a amostra no satisfaz ao ensaio. libertao paramtrica so descritas no captulo Mtodos
de preparao de produtos estreis (5.1.1). A simulao com
meios padro pode ser utilizada para avaliar a assepsia dum
APLICAO DO ENSAIO S PREPARAES PARENTRICAS processo de fabrico. Para alm disto, o ensaio de esterilidade
E S PREPARAES OFTLMICAS OU OUTRAS o nico mtodo analtico adequado aos produtos preparados
PREPARAES NO INJECTVEIS OBRIGATORIAMENTE em condies asspticas; por outro lado, constitui em
ESTREIS todos os casos o nico mtodo analtico disposio das
autoridades que tm de controlar a esterilidade da amostra
Para a tcnica de filtrao atravs de membrana, utilize, dum produto.
sempre que possvel, o contedo total do recipiente, mas em A probabilidade de detectar microrganismos pelo ensaio
qualquer caso as quantidades mnimas indicadas no quadro de esterilidade aumenta com o seu nmero na amostra
2. Se for caso disso, dilua at cerca de 100 ml com um controlada e varia segundo a capacidade de crescimento
diluente estril apropriado, (como, por exemplo, uma das espcies microbianas presentes. A probabilidade de
soluo neutra de peptona de carne ou de casena a 1 g/l). deteco de muito baixos nveis de contaminao, mesmo
Para a tcnica de filtrao atravs de membrana, utilize, repartida uniformemente no seio do lote, muito reduzida.
sempre que possvel, o contedo total do recipiente, mas A interpretao dos resultados pelo ensaio de esterilidade

2.6.7. Micoplasmas
QUADRO 3 Nmero mnimo de unidades a examinar
Nmero mnimo de unidades a examinar por meio,

Nmero de unidades por lote
salvo excepo justificada e autorizada*
Preparaes parentricas
2. Mtodos
Analticos
100 10 por cento, mas no menos de 4
> 100 e 500 10
> 500 2 por cento, mas no de mais de 20
Preparaes oftlmicas e outras prepraraes no injectveis

200 5 por cento, mas no de menos de 2
> 200 10
Se o produto for acondicionado em recipientes unitrios, aplique o
esquema de amostragem das preparaes parentricas
Catgut e outros fios cirrgicos para uso veterinrio 2 por cento das embalagens, mas no mnimo 5 e no mximo 20
Produtos slidos a granel

4 Todos os recipientes
> 4 e 50 20 por cento, mas no menos de 4
> 50 2 por cento, mas no menos de 10
Antibiticos a granel acondicionados em oficina (mais de 5 g) 6
* Se o contedo de um s recipiente suficiente para semear os dois meios, esta coluna indica o nmero de recipientes a utilizar para o conjunto dos dois meios.
reside na hiptese de que todos os recipientes que constituem 2.6.2 MICOBACTRIAS

o lote dariam o mesmo resultado se o seu contedo
fosse controlado. Como impossvel controlar cada um Se a amostra for susceptvel de ser contaminada por outros
dos recipientes, conveniente aplicar um esquema de microrganismos que no as micobactrias, trate-a com uma
amostragem apropriado. No caso de produo em condies soluo de descontaminao apropriada, tal como soluo
asspticas, recomenda-se examinar as amostras de recipientes de acetilcisteina e hidrxido de sdio ou uma soluo de
do princpio e do fim do lote e aps qualquer interveno laurilsulfato de sdio.
importante.
Inocule em triplicado 0,2 ml da amostra em 2 meios slidos
As indicaes sobre o nmero mnimo de unidades a apropriados (considera-se que os meios Lwenstein-Jensen
controlar, em funo do tamanho do lote e supondo que e Middlebrook 7H10 so apropriados). Inocule 0,5 ml em
a preparao foi fabricada em condies visando excluir triplicado num meio lquido apropriado. Deixe incubar todos
qualquer contaminao, so dadas no quadro 3. A aplicao os meios a 37C durante 56 dias.
destas recomendaes tem em conta o volume de preparao Verifique a fertilidade dos meios nutritivos em presena
contido em cada recipiente a validao do mtodo de da preparao inoculando uma cultura apropriada de uma
esterilizao e qualquer outra considerao particular no que espcie do gnero Mycobacterium, tal como a BCG, e, se
concerne aos objectivos de esterilidade do produto. necessrio, use uma substncia neutralizante apropriada.
Se durante os primeiros 8 dias de incubao se
Observao e interpretao dos resultados. As desenvolverem microrganismos contaminantes, repita o
tcnicas microbiolgicas/bioqumicas convencionais ensaio e efectue ao mesmo tempo um ensaio suplementar de
geralmente satisfazem para se proceder identificao esterilidade bacteriolgica.
dos microrganismos isolados no ensaio de esterilidade. Se ao fim do tempo de incubao no ocorrer crescimento de
Contudo, quando o fabricante pretende utilizar a micobactrias em nenhum dos meios de prova, a preparao
condio (d) como critrio nico para invalidar um satisfaz ao ensaio.
ensaio de esterilidade, pode ser necessrio recorrer a
tcnicas de tipificao sensveis para demonstrar que
um microrganismo isolado no produto idntico ao do
microrganismo isolado do material e/ou do ambiente do
2.6.7. MICOPLASMAS
ensaio. Com efeito, se as tcnicas microbiolgicas/
Quando o ensaio dos micoplasmas prescrito a um banco
/bioqumicas de identificao de rotina permitem de clulas primrio, um banco de clulas de trabalho, um
demonstrar a identidade de 2 isolados, elas no so sempre lote semente vrico ou a culturas de clulas testemunhas,
suficientemente sensveis ou fiveis para provar com certeza o ensaio efectuado por fluorescncia em cultura celular.
absoluta que 2 isolados so da mesma origem. Pode ser Quando o ensaio dos micoplasmas prescrito a uma
necessrio recorrer a mtodos mais sensveis (por exemplo a colheita vrica, uma vacina a granel ou a um lote final,
tipificao molecular baseada na percentagem de homologia utilizado o mtodo cultural. Para o controlo dos meios, se
ARN/ADN) para estabelecer o parentesco clonal e a origem necessrio, pode igualmente ser utilizada a fluorescncia
comum dos microrganismos. em cultura celular.

2.6.7. Micoplasmas
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos podem ser (atmosfera de azoto contendo 5 a 10 por cento de dixido de
utilizadas como alternativa a um ou aos dois mtodos aps carbono e com uma taxa de humidade suficiente de modo a
apropriada validao. evitar a secagem da superficie da placa) a 35-38 C.
PROPRIEDADES NUTRITIVAS
MTODO CULTURAL
2. Mtodos
Analticos
Efectue o ensaio de propriedades nutritivas para cada

ESCOLHA DOS MEIOS DE CULTURA lote de meio novo. Semeie os meios escolhidos com os
microrganismos de ensaio apropriados; utilize, no mximo,
Efectue o ensaio utilizando um nmero suficiente de 100 UFC (unidades formadoras de colnias) por placa com
meios slidos e lquidos; utilize um nmero suficiente um dimetro de 60 mm, contendo 9 ml de meio slido e
de meios para permitir o crescimento dos micoplasmas por 100 ml de meio lquido, utilizando uma placa e um
potencialmente presentes na amostra, mesmo em pequeno recipiente para cada espcie de microrganismo. Incube os
nmero. Os meios lquidos devem conter vermelho de fenol. meios e efectue subculturas de 0,2 ml dos meios lquidos
Convm demonstrar, pelo menos, para os microrganismos para os meios slidos em intervalos especficos (ver a seguir
descritos a seguir, que os meios escolhidos possuem em Pesquisa de micoplasmas na amostra). O meio slido
propriedades nutritivas satisfatrias para o seu crescimento. satisfaz ao ensaio se for observado um crescimento adequado
As propriedades nutritivas de cada novo lote de meio so em cada microrganismo do ensaio (o crescimento obtido no
verificadas para microrganismos apropriados contidos na
difere em mais de um factor 5 do valor calculado em relao
lista. Quando se efectua a pesquisa dos micoplasmas na
ao inculo). O meio lquido satisfaz ao ensaio se for registado
amostra, pelo menos, 1 das seguintes espcies utilizada
crescimento aps subcultura em meio slido em, pelo menos,
como testemunha positiva:
1 das subculturas para cada microrganismo de ensaios.
Acheloplasma laidlawii (quando utilizado um antibitico
durante a produo nas vacinas para uso humano e SUBSTNCIAS INIBIDORAS
veterinrio),
Mycoplasma gallisepticum (quando utilizada na produo Efectue o ensaio de substncias inibidoras 1 vez para um
uma substncia de origem aviria ou quando a vacina determinado produto e repita todas as vezes que houver uma
destinada a aves), modificao do mtodo de produo que possa ter influncia
na deteco dos micoplasmas.
Mycoplasma hyorhinis (vacinas para uso veterinrio, no
avirias), Para demonstrar a ausncia de efeito inibidor, efectue o
ensaio das propriedades nutritivas na presena e na ausncia
Mycoplasma orale (vacinas para uso humano ou veterinrio),
da amostra. Se o crescimento de um microrganismo de
Mycoplasma pneumoniae (vacinas para uso humano) ou uma ensaio se manifesta mais de 1 subcultura mais cedo na
outra espcie apropriada que utilize a D-glucose como o ausncia do que na presena da amostra, ou se as placas
M. fermentans, em que a amostra directamente inoculada apresentarem
Mycoplasma synoviae (quando utilizada na produo uma menos de 1/5 do nmero de colnias que nas inoculadas
substncia de origem aviria ou quando a vacina destinada sem a amostra, esta contm substncias inibidoras que
a aves). devem ser neutralizadas ou o seu efeito eliminado por outros
meios, por exemplo, atravs de passagens em substratos
As estirpes utilizadas so isolados primrios que sofreram um que no contenham substncias inibidoras ou atravs da
nmero limitado de subculturas (no mximo 15); diluio antes do ensaio com um volume grande de meio.
conservam-se congeladas ou liofilizadas. Os isolados so Se se efectua uma diluio, podem ser utilizados volumes de
identificados segundo a espcie, aps a clonagem, por meio maiores ou o volume a inocular repartido em vrios
comparao com estirpes de coleco como por exemplo: recipientes de 100 ml. Verifique a eficcia do mtodo de
neutralizao, repetindo o ensaio das substncias inibidoras
A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75.27 ATCC 23206 aps neutralizao.
M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989 PESQUISA DOS MICOPLASMAS NA AMOSTRA
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714 Semeie 100 ml de cada meio lquido com 10 ml da amostra.
M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531 No caso de se produzir uma significativa modificao do
pH, na altura da adio da amostra, ajuste o pH do meio
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204
lquido para o seu valor inicial por adio de uma soluo de
hidrxido de sdio ou de cido clordrico. Semeie 0,2 ml da
O Acholeplasma laidlawii BRP, Mycoplasma fermentans
amostra em cada placa de cada meio slido.
BRP, Mycoplasma hyorhinis BRP, Mycoplasma orale BRP
e o Mycoplasma synoviae BRP servem como estirpes de Incube os meios lquidos durante 20-21 dias. Incube os meios
referncia quando submetidas a poucas passagens. slidos durante, pelo menos, 14 dias, salvo os referentes s
subculturas do 20 ou 21 dias que so incubadas durante 7
CONDIES DE INCUBAO dias. Incube ao mesmo tempo 100 ml de cada meio lquido e
as placas de meio slido, sem os semear, como testemunhas
Incube os meios lquidos em recipientes bem fechados a negativas. Entre o 2 e o 4 dias aps inoculao, efectue
35-38 C. Incube os meios slidos em microaerofilia uma subcultura de cada meio lquido, inoculando 0,2 ml em,

2.6.7. Micoplasmas
pelo menos, 1 placa de cada meio slido. Repita esta operao MEIOS DE CULTURA DE FREY (RECOMENDADOS PARA
entre o 6 e o 8 dias, novamente entre o 13 e o 15 dias e DETECTAR O MYCOPLASMA SYNOVIAE)
entre o 19 e o 21 dias do ensaio. Observe os meios lquidos
cada 2 ou 3 dias e efectue uma subcultura se for observada Meio lquido
uma alterao de colorao. Se o meio lquido apresentar Caldo de infuso de corao de boi (1) 90,0 ml
uma contaminao bacteriana ou fngica, o ensaio no Mistura de vitaminas essenciais (2) 0,025 ml
2. Mtodos
Analticos
vlido. O ensaio vlido se, pelo menos, 1 placa puder ser Glucose mono-hidratada (soluo a 500 gil) 2,0 ml
lida por meio e por dia de inoculao. Inclua no ensaio Soro de porco (inactivado a 56C durante 30 mm) 12,0 ml
testemunhas positivas preparadas pela inoculao no meio Dinucleotido de -nicotinamida-adenina (soluo a 10 g/l) 1,0 ml
slido e lquido de 100 UFC, no mximo, de, pelo menos 1 Cloridrato de cisteina (soluo a 10 g/l) 5,0 ml
microrganismo de ensaio. Se o ensaio dos micoplasmas for Penicilina (20 000 U.I. por mililitro) 0,25 ml
realizado regularmente, recomenda-se, caso seja possvel,
a rotao de diferentes microrganismos de ensaio na Misture a soluo de dinucleotido de -nicotinamida-adenina
preparao das testemunhas positivas. Os microrganismos de do cloridrato de cistena. Deixe em repouso durante 10 mm e
ensaio utilizados so os que figuram na lista em Escolha dos depois junte-a aos outros ingredientes. Ajuste o pH para 7,8.
meios de cultura.
Meio slido
Caldo de infuso de corao de boi (1) 90,0 ml
INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Gelose purificada (3) 1,4 g
No final do perodo de incubao prescrito, examine ao Ajuste o pH para 7,8 e depois esterilize na autoclave.
microscpio todos os meios slidos semeados para pesquisa Junte em seguida os seguintes ingredientes:
de colnias de micoplasma. A amostra satisfaz ao ensaio se
Vitaminas essenciais (2) 0,025 ml
no for observada nenhuma colnia tpica de micoplasmas.
Glucose mono-hidratada (soluo a 500 g/1) 2,0 mi
A amostra no satisfaz ao ensaio se for observado em 1
Soro de porco (no aquecido) 12,0 ml
ou em vrios meios o crescimento de colnias tpicas de
Dinucleotido de -nicotinamida-adenina (soluo a 10 g/l) 1,0 ml
micoplasmas. O ensaio no vlido se 1 ou vrias das
Cloridrato de cistena (soluo a 10 g/l) 1,0 ml
testemunhas positivas no apresentarem crescimento de Vermelho de fenol (soluo a 0,6 g/l) 5,0 ml
micoplasmas numa das placas de subcultura. O ensaio Penicilina (20 000 U.I. por mililitro) 0,25 ml
no vlido se uma ou vrias das testemunhas negativas
apresentarem crescimento de micoplasmas. Se houver
MEIOS DE CULTURA DE FRIIS (RECOMENDADOS PARA A
dvidas sobre a natureza das colnias observadas, pode ser
DETECO DE MICOPLASMAS NO AVIRIOS)
utilizado um mtodo validado apropriado para determinar se
se trata de micoplasmas. Meio lquido
A seco seguinte dada a titulo de informao. Soluo equilibrada de electrlitos de Hanks (modificada (4) 800 ml
gua destilada 67 ml
Infuso corao-crebro (5) 135 ml
MEIOS ACONSELHADOS PARA O MTODO CULTURAL
Caldo PPLO (6) 248 ml
Extracto de levedura (170 g/1) 60 ml
Os meios a seguir descritos so os recomendados. Contudo,
Bacitracina 250 mg
podem ser utilizados outros meios na condio de que a Meticilina 250 mg
sua aptido para assegurar o crescimento dos micoplasmas Vermelho de fenol (5 g/1) 4,5 ml
tenha sido demonstrada para cada lote de meio escolhido em Soro de cavalo 165 ml
presena ou ausncia da amostra. Soro de porco 165 ml
Ajuste o pH para 7,4-7,45.
MEIOS DE CULTURA DE HAYFLICK (RECOMENDADOS
PARA A DETECO DE MICOPLASMAS EM GERAL) Meio Slido
Meio lquido Soluo equilibrada de electrlitos de Hanks modificada (4) 200 ml

DEAE-Dextrano 200 mg
Caldo de infuso de corao de boi (1) 90,0 ml Gelose purificada (3) 15,65 ml
Soro de cavalo (no aquecido) 20,0 ml
Extracto de levedura a 250 g/l 10,0 ml Misture cuidadosamente e esterilize no autoclave. Arrefea
Vermelho de fenol (soluo a 0,6 g/1) 5,0 ml a soluo a 100C e em seguida junte-a a 1740 ml do meio
Penicilina (20 000 U.I. por mililitro) 0,25 ml lquido descrito a seguir.
cido desoxirribonucleico (soluo a 2 g/1) 1,2 ml
Ajuste o pH para 7,8 (1) Caldo de infuso de corao de boi
Corao de boi (destinado a preparar a infuso) 500 g
Meio slido
Peptona 10 g
Prepare como indicado anteriormente, substituindo o caldo Cloreto de sdio 5 g
de infuso de corao de boi pela gelose de infuso de corao gua destilada q.b.p. 1000 ml
de boi contendo 15 g/l de gelose. Esterilize no autoclave

2.6.7. Micoplasmas
(2) Vitamina essenciais Se, no caso de suspenses vricas, a interpretao dos

resultados prejudicada devido existncia de efeitos
Biotina 100 mg
citopatognicos importantes, pode ser aceitvel neutralizar
Pantotenato de clcio 100 mg
o vrus com um soro especfico sem efeito inibidor para os
Cloreto de colina 100 mg
micoplasmas ou utilizar um substrato de cultura celular
cido flico 100 mg
que no permita a proliferao do vrus. Para demonstrar a
i-Inositol 200 mg
ausncia de efeito inibidor, efectue o ensaio com testemunhas
2. Mtodos
Analticos
Nicotinamida 100 mg
Cloridrato de piridoxina 100 mg
positivas na ausncia e na presena do soro a utilizar.
Riboflavina 10 mg
Cloridrato de tiamina 100 mg VERIFICAO DO SUBSTRATO
gua destilada q.b.p. 1000 ml
Utilize clulas Vero ou uma outra cultura celular (por
(3) Gelose purficada. exemplo, a linha de produo) que possua uma capacidade
equivalente para detectar micoplasmas. A capacidade
Gelose altamente purificada, utilizada em microbiologia e em das clulas para detectar os micoplasmas demonstra-se
imunologia, preparada por um processo de troca de ies que com o mtodo de ensaio descrito a seguir, semeando, no
permite obter um produto muito puro, lmpido, susceptvel mximo, 100 UFC ou um nmero de microrganismos
de formar um gel coerente. Contm cerca de: equivalente a 100 UFC de estirpes de referncia apropriadas
gua 12,2 por cento de M. hyorhinis e de M. orale. As seguintes estirpes foram
Cinzas 1,5 por cento comprovadas como apropriadas:
Cinzas insolveis no cido 0,2 por cento M hyorhinis ATCC 29052
Cloro 0 por cento
Fosfatos (expressos em P2O5) 0,3 por cento M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714
Azoto total 0,3 por cento As clulas utilizadas so consideradas como apropriadas se
Cobre 8 ppm as 2 estirpes de referncia forem novamente encontradas no
Ferro 170 ppm ensaio.
Clcio 0,28 por cento
Magnsio 0,32 por cento Efectue uma subcultura das clulas indicadoras sem
antibiticos antes de as utilizar no ensaio.
(4) Soluo equilibrada de electrlitos de Hanks (modificada)
Mtodo
Cloreto de sdio 6,4 g
Cloreto de potssio 0,32 g 1. Prepare culturas com uma densidade apropriada (2104 a
Sulfato de magnsio hepta-hidratado 0,08 g 2105 clulas/mililitro, 4103 a 2,5104 clulas/cm) que
Sulfato de magnsio hexa-hidratado 0,08 g atingem a confluncia aps 3 dias de crescimento. Semeie
Cloreto de clcio anidro 0,112 g 1 ml da amostra num recipiente com cultura celular e
Fosfato dissdico di-hidratado 0,0596 g incube a 35-38 C.
Fosfato monopotssio anidro 0,048 g
2. Decorridos, no mnimo, 3 dias de incubao, efectue uma
gua destilada q.b.p. 800 ml
subcultura em lamelas ou numa outra superficie (por
exemplo, lminas com cmaras) conveniente ao mtodo
(5) Infuso de corao-crebro de anlise. Semeie as clulas com uma fraca densidade
Infuso de crebro de vitelo 200 g de modo a que atinjam 50 por cento da confluncia
Infuso de corao de boi 250 g decorridos 3-5 dias de incubao. Uma confluncia
Protease de peptona 10 g completa prejudica a visualizao dos micoplasmas aps
Glucose monohidratada 2 g colorao e deve ser evitada.
Cloreto de sdio 5 g 3. Elimine o meio, lave as clulas com a soluo salina
Fosfato dissdico anidro 2,5 g tamponada de fosfato de pH 7,4 R e, em seguida, adicione
gua destilada q.b.p. 1000 ml uma soluo de fixao apropriada (uma mistura
extempornea de 1 volume de cido actico glacial R e
(6) Caldo PPLO 3 volumes de metanol R conveniente se a colorao se
Infuso de corao de boi 50 g
efectua com bisbenzimida R).
Peptona 10 g 4. Elimine a soluo de fixao e lave as clulas com gua R
Cloreto de sdio 5 g estril. Seque as lminas completamente se forem para ser
gua destilada q.b.p. 1000 ml coradas mais de 1 hora depois ( necessrio uma ateno
particular se se pretende corar as lminas aps a secagem,
pois podem produzir-se artefactos),
FLUORESCNCIA EM CULTURA CELULAR
5. Adicione um corante apropriado do ADN e deixe repousar
As culturas celulares so coradas com um produto durante um perodo apropriado (a soluo de trabalho
fluorescente que se liga ao ADN. Os micoplasmas so de bisbenzimida R e um tempo de repouso de 10 min so
detectados devido ao aspecto caracterstico (partculas ou convenientes).
filamentos) da fluorescncia observado superficie das
6. Elimine o corante e lave o tapete celular com gua R.
clulas e se houver uma grande contaminao, em redor das
clulas. As mitocndrias no citoplasma podem estar coradas 7. Proceda montagem de cada lamela, consoante o
mas facilmente possvel distinguir dos micoplasmas. caso (uma mistura com volumes iguais de glicerol R

2.6.7. Micoplasmas
e de soluo tampo de fosfato-citrato de pH 5,5 R Para a validao do limite de deteco, a gama de espcies
conveniente para montar as lamelas). Examine por seguintes constitui uma seleco ptima em termos
fluorescncia com uma ampliao de 400 ou mais (se de frequncia de ocorrncia como contaminantes e de
for utilizado a bisbenzimida como corante, um filtro de parentesco filogentico:
luz de excitao 330 nm/380 nm e um filtro de luz de
excitao no absorvida LP 440 nm so convenientes) A. laidlawil,
M fermentans,
2. Mtodos
Analticos
8. Compare o aspecto microscpico das culturas do ensaio
ao das testemunhas positivas e negativas. Pesquise uma M hyorhinis (no caso de enriquecimento em cultura celular,
fluorescncia extranuclear. Os micoplasmas aparecem na deve ser includa uma estirpe exigente como o ATCC 29052),
forma de pontos ou de filamentos no espao intercelular.
Examine vrios campos microscpicos consoante o M. orale,
protocolo estabelecido durante a validao. M. pneumoniae ou M. gallisepticum,
M. synoviae (em caso de utilizao de material de origem
INTERPRETAO DOS RESULTADOS aviria ou de exposio a este tipo de material durante a
produo),
A amostra satisfaz ao ensaio se no estiver presente uma
fluorescncia tpica dos micoplasmas nas culturas celulares Mycoplasma arginini
inoculadas. O ensaio s vlido se as testemunhas positivas
Spiroplasma citri ( no caso de utilizao de material
apresentarem fluorescncia tpica dos micoplasmas. O ensaio
proveniente de insectos ou de plantas ou de exposio a este
no vlido se as testemunhas negativas apresentarem uma
tipo de material durante a produo).
fluorescncia tpica dos micoplasmas.
A demonstrao da especificidade requer a utilizao de
uma gama apropriada de espcies bacterianas que no os
AMPLIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOS micoplasmas. Os gneros de bactrias que apresentam um
estreito parentesco filogentico com os micoplasmas so os
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21) mais apropriados para esta validao; so nomeadamente os
podem ser utilizadas na deteco dos micoplasmas por gneros Clostridium, Lactobacillus e Streptococcus.
amplificao dos cidos nucleicos extrados de uma amostra
com os iniciadores especficos que permitem revelar a Estudos de comparabilidade para a utilizao da
presena do cido nucleico alvo. Elas do uma indicao amplificao dos cidos nucleicos como mtodo alternativo.
sobre a presena de uma sequncia do cido nucleico necessrio demonstrar para cada espcie micoplsmica de
particular, mas no necessariamente sobre se os micoplasmas ensaio:
so viveis. Esto disponveis vrias tcnicas. O presente que o sistema de amplificao permite a deteco de
captulo geral no prescreve a utilizao de um mtodo de 10 UFC/ml, se o mtodo alternativo substitui o mtodo
ensaio particular. O procedimento utilizado validado como cultural,
se descreve, tendo em conta as recomendaes apresentadas
no final desta seco. Quando se utiliza um kit comercial, que o sistema de amplificao permite a deteco de
alguns aspectos da validao podem estar assegurados pelo 100 UFC/ml, se o mtodo alternativo substitui o mtodo de
fabricante e serem comunicados ao utilizador, mas preciso fluorescncia em cultura celular,
recordar que a informao completa relativa aos iniciadores
ou que tem um limite de deteco equivalente em termos
pode no estar disponvel e que a produo de kits pode ser
do nmero de cpias de cido nucleico micoplsmico na
modificada ou interrompida.
amostra (utilizando padres de referncia apropriados de
A pesquisa de micoplasmas por amplificao de cidos cidos nucleicos micoplsmicos).
nucleicos efectuada quando prescrita na monografia.
Pode igualmente ser utilizada aps validao apropriada, em
substituio do mtodo cultural e do mtodo de fluorescncia TESTEMUNHAS
em cultura celular.
Testemunhas internas. As testemunhas internas intervm na
A amplificao directa pode ser aplicada na presena de
verificao de rotina da ausncia de inibio. A testemunha
material citotxico e quando necessrio recorrer a um
interna pode ser uma sequncia nucleotdica que contm os
mtodo rpido
locais de ligao dos iniciadores, ou uma outra sequncia
A amplificao aps enriquecimento em cultura apropriada. De preferncia adicionada amostra antes
celular consiste em cultivar conjuntamente a amostra do isolamento do cido nucleico e tem por consequncia
e um substrato celular apropriado, durante um perodo um papel polivalente no controlo do processo (extraco,
conveniente (como descrito no mtodo de fluorescncia transcrio inversa, amplificao, deteco).
em cultura celular): a deteco efectua-se depois por
amplificao dos cidos nucleicos extrados das clulas e do Testemunhas externas. A testemunha externa positiva
sobrenadante. contm um nmero definido de cpias da sequncia alvo ou
de UFC de I ou vrias espcies micoplsmicas apropriadas
VALIDAO escolhidas entre as que so utilizadas para validar as
condies do ensaio. Uma das testemunhas positivas,
So necessrios padres de referncia nas diversas fases da prximo do limite de resposta positiva, serve para demonstrar
validao, e intervm tambm como testemunhas quando da que a sensibilidade esperada atingida. A testemunha externa
aplicao em rotina do ensaio. Podem ser constitudos por negativa no contm a sequncia alvo; no necessariamente
micoplasmas ou por cidos nucleicos. constituda pela mesma matriz que a amostra.

2.6.7. Micoplasmas
INTERPRETAO DOS RESULTADOS 2. RECOMENDAES PARA A VALIDAO DAS TCNICAS

DE AMPLIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOS PARA A
Os iniciadores utilizados podem tambm amplificar os cidos DETECO DOS MICOPLASMAS
nucleicos bacterianos no micoplsmicos, da poder obter-se
resultados falsamente positivos. Se necessrio, estabelecem- Devem ser avaliados 3 parmetros: a especificidade, o limite
-se procedimentos no momento da validao para confirmar de deteco e a robustez.
2. Mtodos
os resultados positivos.
Analticos
A seco seguinte publica-se a ttulo informativo. 2-1 Especificidade. A especificidade da tcnica a capacidade
de permitir avaliar inequivocamente o cido nucleico
procurado, na presena de componentes susceptveis de
Recomendaes para a validao das tcnicas estarem presentes.
de amplificao dos cidos nucleicos para a A especificidade das tcnicas de amplificao dos cidos
deteco dos micoplasmas. nucleicos, depende da escolha dos iniciadores, das sondas
utilizadas para anlise do produto final e do rigor das
condies operatrias (para ambas as fases de amplificao e
1. OBJECTIVO de deteco).
A aptido das tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos so ensaios para detectar uma gama importante de espcies de
qualitativos ou quantitativos que visam detectar a presena micoplasmas est dependente da escolha dos iniciadores, das
de cidos nucleicos. Os ensaios qualitativos servem para sondas e dos parmetros operatrios. Convm demonstrar
detectar contaminaes por micoplasmas em diversas esta aptido atravs de coleces de referncia caracterizadas
amostras tais como vacinas ou substratos celulares e podem (estirpes de referncia fornecidas pelo EDQM, por exemplo).
ser considerados como ensaios limite. Uma vez que os sistemas de amplificao dos cidos nucleicos
se baseiam geralmente numa mistura de iniciadores, no se
As presentes recomendaes descrevem os mtodos de recomenda a anlise terica dos iniciadores e das sondas pela
validao dos procedimentos de amplificao dos cidos comparao com as bases de dados, porque a interpretao
nucleicos aplicveis aos procedimentos qualitativos dos resultados pode ser muito complexa e no reflectir os
destinados deteco dos micoplasmas. Podem tambm ser resultados experimentais.
aplicveis s tcnicas de amplificao de cidos nucleicos
Por outro lado, dado que provvel que os iniciadores
em tempo real servindo de ensaios limite no controlo dos
detectem outras espcies bacterianas, a potencial deteco
contaminantes.
cruzada dever ser documentada com um estudo de
Os 2 parmetros de validao considerados mais importantes validao. Os gneros bacterianos com relao filogentica
so a especificidade e o limite de deteco. Convm tambm estreita com os micoplasmas, como as bactrias gram-
avaliar a robustez. positivas, so as mais apropriadas para esta validao:
compreendem os gneros Clostridium, Lactobacilius e
No final do presente documento, define-se um procedimento Streptococcus. Esta lista no no entanto exaustiva e
analtico como o conjunto de operaes efectuadas aps a as espcies a analisar iro depender da aptido terica
extraco do cido nucleico at deteco dos produtos de (baseada nas sequncias iniciadores/sondas) do sistema de
amplificao. amplificao dos cidos nucleicos para detectar estas outras
Quando o procedimento analtico posto em prtica, na espcies.
totalidade ou em parte, com um kit comercial, os aspectos Com base nos resultados desta validao da especificidade,
da validao j realizados a cargo do fabricante, com se for identificada uma falha na especificidade do mtodo
documentao de apoio, podem ser omitidos pelo utilizador. (como a deteco de cidos nucleicos bacterianos no
Contudo, o utilizador deve demonstrar o desempenho do micoplsmicos), dever ser proposta uma estratgia
kit relativamente utilizao prevista (limite de deteco, apropriada no estudo de validao para permitir na rotina a
robustez, deteco cruzada de outras classes de bactrias, por interpretao dos resultados positivos. Por exemplo, poder
exemplo) ser efectuado um segundo ensaio utilizando um mtodo
alternativo sem esta falha de especificidade ou utilizando o
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos podem ser mtodo oficial.
utilizadas como:
um ensaio complementar (para as suspenses vnicas 2-2 Limite de deteco. O limite de deteco do mtodo a
citotxicas, por exemplo) ou para fins de controlo durante mais pequena quantidade de cido nucleico pesquisado que
a produo; pode ser detectado na amostra, sem necessariamente poder
ser quantificado de forma exacta.
um mtodo alternativo em substituio de um mtodo
oficial (fluorescncia em cultura celular ou mtodo Para estabelecer o limite de deteco, deve ser determinado
cultural). um limite de resposta positiva do mtodo analtico utilizando
as tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos. O limite
As presentes recomendaes separam assim estes 2 de resposta positiva (como vem definido no captulo geral
objectivos, apresentando primeiro uma recomendao da tcnica 2.6.21) o nmero mnimo de sequncias alvo
relativa validao das tcnicas de amplificao dos cidos por unidade de volume que pode ser detectado em 95
nucleicos, e uma segunda recomendao relativa ao estudo por cento dos ensaios. A influncia no limite de resposta
de comparabilidade entre tcnicas de amplificao dos cidos positiva da repartio dos genomas micoplsmicos nas
nucleicos e os mtodos oficiais. amostras individuais analisadas, e de factores como a eficcia

2.6.8. Pirognios
enzimtica, pode conduzir obteno de diferentes valores 3. RECOMENDAES PARA O ESTUDO

limite a 95 por cento entre os ensaios analticos individuais. DE COMPARABILIDADE
Para determinar o limite de resposta positiva, deve ser
analisada em dias diferentes, uma srie de diluies de As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos podem ser
estirpes de trabalho caracterizadas e calibradas (em UFC ou utilizadas para substituir os mtodos oficiais (fluorescncia
em cpias de cido nucleico) ou de padres do EDQM, para em cultura celular e/ou mtodo cultural). Neste caso, deve
ser realizado um estudo de comparabilidade. Este estudo
2. Mtodos
Analticos
analisar a variao entre os ensaios.
deve incluir uma comparao dos limites de deteco
Para a validao do limite de deteco, as seguintes espcies respectivamente do mtodo alternativo e dos mtodos
constituem uma seleco ptima em termos de frequncia da oficiais. No entanto, convm igualmente ter em considerao
presena como contaminantes e de relao filogentica: a especificidade (gama de micoplasmas detectados, putativos
A. laidiawii, falsos positivos).
M fermentans, No que respeita ao limite de deteco, os critrios de

aceitao so definidos como se segue:
M hyorhinis
se o mtodo alternativo proposto para substituir o
M. pneumoniae ou M. gallisepticum, mtodo cultural deve ser demonstrado que o sistema de
tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos permite
M. synoviae (em caso de utilizao de material de origem
detectar 10 UFC/ml para cada uma das espcies de
aviria ou de exposio a este tipo de material durante a
micoplasmas a analisar descritos no pargrafo 2-2;
produo),
se o mtodo alternativo proposto para substituir o de
M. arginini,
fluorescncia em cultura celular, deve ser demonstrado que
S. citri (no caso de utilizao de material proveniente de o sistema de tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
insectos ou de plantas ou de exposio a este tipo de material permite detectar 100 UFC/ml para cada uma das espcies
durante a produo). de micoplasmas a analisar descritos no pargrafo 2-2.
Para cada estirpe, devem ser controladas, pelo menos 3 sries Nestes 2 casos, podem ser utilizados padres apropriados
independentes de diluies 1/10 com um nmero suficiente calibrados em funo do nmero de cpias de cido nucleico
de exemplares por diluio para atingir um nmero total de e do nmero de UFC para demonstrar que respeitam os
24 resultados de ensaio para cada diluio e permitir uma critrios de aceitao. A relao entre UFC e as cpias de
anlise estatstica dos resultados. cidos nucleicos nas preparaes de referncia, dever ser
previamente estabelecida para comparar o desempenho do
A ttulo de exemplo, um laboratrio pode analisar 3 sries de
mtodo alternativo utilizando as tcnicas de amplificao dos
diluies em dias diferentes com 8 exemplares por diluio,
cidos nucleicos com o desempenho dos mtodos oficiais.
ou 4 sries de diluies em dias diferentes com 6 exemplares
por diluio, ou 6 sries de diluies em dias diferentes com O estudo de comparabilidade pode ser efectuado segundo 2
4 exemplares por diluio. Para que o nmero de diluies estratgias:
utilizadas permanea manusevel, convm efectuar um
quer efectuando em paralelo o mtodo alternativo
ensaio preliminar para se ter uma primeira estimativa do
utilizando as tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
limite de resposta positiva (quer dizer a mais elevada diluio
e ou/os mtodos oficiais para avaliar simultaneamente o
que d um sinal positivo). Pode-se ento proceder s diluies
limite de deteco dos 2 mtodos, utilizando as mesmas
de forma a enquadrar este valor estimado anteriormente. O
amostras de estirpes calibradas;
teor em micoplasmas (UFC ou cpias) que pode ser detectado
em 95 por cento das anlises pode depois ser calculado por quer comparando o desempenho do mtodo alternativo
mtodos estatsticos apropriados. utilizando tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
com os dados obtidos previamente quando da validao
Os resultados podem tambm servir para estabelecer a
do mtodo oficial. Neste caso, dever-se- detalhar em
variabilidade do mtodo analtico.
documentao, a calibrao dos padres utilizados
nas 2 validaes e assim como a sua estabilidade. Os
2-3 Robustez. A robustez do mtodo mede a sua capacidade relatrios do estudo de comparabilidade devem descrever
em no ser afectado por pequenas modificaes, mas todos os elementos de validao descritos na seco 2
deliberadas, dos parmetros operatrios d uma indicao (especificidade, limite de deteco e variabilidade, assim
da fiabilidade do procedimento nas condies normais de como a robustez) para se poder avaliar todas as vantagens e
aplicao. desvantagens do mtodo alternativo utilizando as tcnicas
A avaliao da robustez um aspecto a considerar na fase de de amplificao dos cidos nucleicos em relao aos
desenvolvimento. Permite estabelecer a fiabilidade do mtodo mtodos oficiais.
analtico em face a variaes deliberadas dos parmetros
operatrios. Nas tcnicas de amplificao dos cidos
nucleicos, podem ter importncia crucial, ligeiras alteraes 2.6.8. PIROGNIOS
de alguns parmetros. Contudo, possvel demonstrar
a robustez do mtodo durante o seu desenvolvimento, O ensaio consiste em medir a elevao da temperatura
quando se estuda a influncia de pequenas variaes de provocada no coelho pela injeco intravenosa de uma
concentrao de alguns reagentes (MgCl2, iniciadores ou soluo estril da substncia a examinar.
dexoxiribonucletidos por exemplo).
Seleco dos animais. O ensaio realizado em coelhos
Por fim, a avaliao da robustez do mtodo pode ser feita adultos, saudveis, machos ou fmeas, com massa no
atravs de estudos colaborativos. inferior a 1,5 kg, alimentados com um regime completo,

2.6.9. Toxicidade anormal
equilibrado e isento de antibiticos, e cuja massa corporal que seguem a injeco dessa soluo. Mea a temperatura
no tenha sofrido qualquer diminuio no decurso da semana de cada coelho com intervalos regulares de 30 min, no
que precede a experincia. No utilizar os coelhos: mximo, a partir de, pelo menos, 90 min antes da injeco
da soluo a examinar e durante as 3 h seguintes. A resposta
a) que tenham sido utilizados numa pesquisa negativa de
do animal definida pela diferena entre a temperatura
pirognios durante os 3 dias precedentes,
mxima e a temperatura inicial mdia de cada coelho.
b) que tenham sido utilizados nas 3 semanas precedentes Quando esta diferena de temperatura negativa, o resultado
2. Mtodos
Analticos
numa pesquisa positiva de pirognios. considerado como zero.

Estabulao dos animais. Mantenha os coelhos Exclua do ensaio os coelhos que acusem uma variao de
individualmente num lugar tranquilo a uma temperatura temperatura ultrapassando 0,2C entre 2 leituras sucessivas
uniforme apropriada. Mantenha os coelhos em jejum durante na determinao da temperatura inicial e utilize somente os
a noite anterior ao ensaio e at ao fim deste; igualmente coelhos cujas temperaturas iniciais no se afastem mais de
no d gua durante o ensaio. Efectue o ensaio num local 1C umas das outras. Todo o coelho cuja temperatura inicial
tranquilo em que nenhuma perturbao possa excitar os superior a 39,8C ou inferior a 38C excludo do ensaio.
animais e cuja temperatura ambiente no se afaste de mais de
3C do local onde os coelhos estiveram durante, pelo menos, Interpretao dos resultados. Consoante os resultados
as 18 horas que antecederam o ensaio. obtidos, o ensaio efectuado inicialmente em 3 coelhos
pode ser repetido noutros grupos de 3 coelhos at atingir o
Aparelhagem. Material de vidro, seringas e agulhas. O nmero de 4 grupos.
material de vidro, as seringas e agulhas utilizados no ensaio
so cuidadosamente lavados com gua para preparaes A amostra satisfaz ao ensaio se a soma das respostas do
injectveis e esterilizados numa estufa de ar quente, a 250C primeiro grupo no for superior ao valor indicado na segunda
durante 30 min ou a 200C durante 1h. coluna do quadro seguinte. Se a soma das respostas estiver
compreendida entre os valores indicados na segunda e na
Dispositivo de fixao. Os coelhos, cuja temperatura terceira coluna do quadro, repita o ensaio conforme se indica
medida por meio de um aparelho elctrico, so colocados em anteriormente. Se a soma das respostas for superior ao valor
caixas munidas de um dispositivo que segura o animal pelo referido na terceira coluna, a amostra no satisfaz ao ensaio.
pescoo com a ajuda de uma coleira especial no fechada.
Este dispositivo, que deixa livre o resto do corpo do coelho,
A amostra satisfaz ao A amostra no satisfaz
permite-lhe manter uma posio normal. Os animais no so Nmero
ensaio se a soma das ao ensaio se a soma
imobilizados por correias ou processos anlogos, susceptveis de coelhos
respostas no excede: das respostas superior a:
de representar um perigo para eles. So colocados nas caixas 3 1,15C 2,65C
1 h antes do ensaio e a se mantm at que este esteja 6 2,80C 4,30C
concludo. 9 4,45C 5,95C
Termmetros. O termmetro ou o dispositivo elctrico 12 6,60C 6,60C
utilizado indica a temperatura com uma preciso de 0,1C.
introduzido no recto do coelho profundidade aproximada Os animais utilizados num ensaio de pirognios cuja
de 5 cm, mantendo-se constante esta profundidade para cada aumento de temperatura seja superior a 1,2C so eliminados
coelho num dado ensaio. No caso de se tratar de um dispositivo definitivamente.
elctrico, ser introduzido antes da injeco da soluo a
examinar e mantido em posio durante toda a experincia.
Ensaio preliminar. Um a trs dias antes do ensaio do produto,
2.6.9. TOXICIDADE ANORMAL
trate, de entre os animais previamente escolhidos, os que no
foram utilizados durante as 2 ltimas semanas, injectando- ENSAIO GERAL
-lhes por via intravenosa, por quilograma de massa corporal,
10 ml de uma soluo apirognica de cloreto de sdio a 9 g/l Dissolva a substncia em 0,5 ml de gua para preparaes
a uma temperatura prxima de 38,5C. Proceda medio da
injectveis R ou numa soluo de cloreto de sdio a 9 g/l.
temperatura de cada coelho a partir de, pelo menos, 90 min
antes da injeco e durante as 3 h seguintes. O animal que acuse Injecte por via endovenosa em 5 murganhos sos,
uma variao de temperatura superior a 0,6C no utilizado. pesando cada um 17 a 24 g, a quantidade de substncia a
examinar indicada na monografia. A durao da injeco
Ensaio definitivo. Efectue o ensaio num grupo de 3 coelhos.
normalmente de cerca de 15 a 30 s, salvo indicao contrria
Preparao e inoculao da amostra. Aquea previamente contida na monografia.
a cerca de 38,5C os lquidos a examinar. A amostra pode
ser dissolvida ou diluda numa soluo apirognica de O resultado satisfatrio se nenhum dos animais morre no
cloreto de sdio a 9 g/l ou outro lquido prescrito. Injecte espao de 24 h ou durante o perodo de observao indicado
lentamente a soluo na veia marginal da orelha do coelho, na monografia. Se algum dos animais morrer, repita o ensaio.
no ultrapassando a durao da injeco 4 min, salvo outra O resultado satisfatrio se nenhum dos animais do segundo
indicao na monografia. O volume a injectar varia consoante grupo morrer no decurso do perodo prescrito.
o produto a examinar e vem indicado na monografia. Este
volume no inferior a 0,5 ml nem superior a 10 ml por
quilograma de massa corporal do animal. ENSAIO EM SOROS E VACINAS PARA USO HUMANO
Determinao das temperaturas inicial e mxima. A
temperatura inicial de cada coelho a mdia de 2 valores Salvo indicao em contrrio na monografia, injecte por via
determinados com um intervalo de 30 min nos 40 min que intraperitoneal em 5 murganhos sos, pesando cada um entre
precedem a injeco da soluo a examinar; a temperatura 17 e 24 g, uma dose humana da preparao (a dose humana
mxima a temperatura mais elevada registada nas 3 h a dose da preparao a examinar indicada no rtulo ou na

2.6.11. Substncias hipotensoras
literatura que acompanha a embalagem) sem ultrapassar reprodutvel e que as respostas do leo s doses superior
1,0 ml por animal. Observe os animais durante 7 dias. O e inferior de histamina permanecem constantes. Calcule
ensaio satisfaz se nenhum dos animais manifestar sintomas a actividade da amostra em equivalente de microgramas
da doena. Se mais de um animal morrer, o produto em de histamina base a partir da diluio determinada na
ensaio rejeitado. Se um dos animais morrer ou manifestar experincia atrs referida. A quantidade assim calculada no
sintomas da doena, repita o ensaio. O produto satisfaz ao superior ao limite prescrito na monografia.
ensaio se nenhum dos animais do segundo grupo morrer
2. Mtodos
Se a soluo da amostra no provocar contraco do leo,
Analticos
ou manifestar sintomas da doena durante o perodo de
prepare uma nova soluo, adicionando uma quantidade
observao prescrito.
de histamina que corresponda ao mximo tolerado na
Efectue igualmente um ensaio sobre 2 cobaios saudveis monografia e verifique se a contraco desencadeada por esta
pesando cada um entre 250 g e 400 g, injectando em cada ltima soluo corresponde quantidade de histamina que
um por via intraperitoneal uma dose humana sem, contudo, contm. Se assim no acontecer ou se as contraces do leo
ultrapassar 5,0 ml por animal. Observe os animais durante 7 provocadas pela soluo da amostra no so reprodutveis
dias. ou se as respostas do leo s doses superiores e inferiores
de histamina diminuem, os resultados da experincia no
O ensaio satisfaz se nenhum dos animais manifestar sintomas so significativos. Proceda ento pesquisa das substncias
da doena. Se mais de um animal morrer, o produto em hipotensores (2.6.11).
ensaio rejeitado. Se um dos animais morrer ou manifestar
sintomas da doena, repita o ensaio. O produto satisfaz ao Soluo A
ensaio se nenhum dos animais do segundo grupo morrer Cloreto de sdio 160,0 g
ou manifestar sintomas da doena durante o perodo de Cloreto de potssio 4,0 g
observao prescrito. Cloreto de clcio anidro 2,0 g
Cloreto de magnsio anidro 1,0 g
Fosfato dissdico 0,10 g
2.6.10. HISTAMINA gua para preparaes injectveis q.b.p. 1000 ml
Soluo B
Sacrifique um cobaio, com peso compreendido entre 250 g Soluo A 50,0 ml
e 350 g, em jejum desde h 24 h. Retire um fragmento com Sulfato de atropina 0,5 mg
2 cm de comprimento da parte distal do intestino delgado e Bicarbonato de sdio 1,0 g
esvazie-o do seu contedo, lavando-o cuidadosamente por Glicose mono-hidratada 1,5 g
meio de uma seringa com a soluo B descrita mais abaixo. gua para preparaes injectveis q.b.p. 1000 ml
Com a ajuda de um fio delgado ligue as 2 extremidades do
segmento e faa uma ligeira inciso transversal a meia altura. A soluo B utilizada nas 24 h que se seguem sua
Introduza ento o segmento num banho de rgos com 10 ml preparao.
a 20 ml de capacidade, cheio da soluo B mantida a uma
temperatura constante de 34 a 36C e percorrida por ar ou
uma mistura de 95 partes de oxignio e 5 partes de dixido de 2.6.11. SUBSTNCIAS HIPOTENSORAS
carbono. Fixe um dos fios perto do fundo do banho de rgos.
Prenda o outro fio a um migrafo isotnico que inscreva Efectue o ensaio num gato que pese, pelo menos, 2 kg
as contraces sobre um quimgrafo ou outro dispositivo anestesiado com cloralose ou com um barbitrico que
capaz de registar os dados de forma permanente. No caso permita manter presso sangunea uniforme. Proteja o
de se utilizar uma alavanca o seu comprimento tal que as animal contra eventuais perdas de calor, a fim de conservar
contraces se encontrem ampliadas cerca de 20 vezes. A a sua temperatura rectal dentro dos limites fisiolgicos.
tenso exercida sobre o rgo de cerca de 9,8 mN (1 g) e Introduza um tubo na traqueia do gato e uma cnula cheia
modificada de acordo com a sua sensibilidade. Renove a de uma soluo heparinizada de cloreto de sdio a 9 g/l no
soluo B no banho de rgos. Deixe durante 10 min e depois tronco comum da artria cartida e ligue-a a um dispositivo
substitua 2 ou 3 vezes a soluo B. Provoque uma srie de susceptvel de dar um registo contnuo da presso sangunea.
contraces por adio de volumes de 0,2 a 0,5 ml de soluo Introduza na veia jugular ou femural outro tubo cheio de
de dicloridrato de histamina R em concentrao adequada, soluo heparinizada de cloreto de sdio a 9 g/l, atravs do
de forma a obter respostas submximas e reprodutveis. qual podem ser injectadas as solues de histamina e da
Esta dose a dose superior. Antes de cada adio de substncia a analisar. Determine a sensibilidade do animal
histamina, lave o banho de rgos 3 vezes consecutivas histamina injectando por via intravenosa, com intervalos
com a soluo B (de preferncia deixando-a transbordar regulares, doses de soluo de histamina R que correspondam
em vez de a deixar esvaziar). Adicione as doses sucessivas a 0,1 e a 0,15 g de histamina base por quilograma de massa
de histamina segundo o mesmo ritmo (cerca de 2 min). corporal. Repita pelo menos 3 vezes a injeco da dose
Adicione volumes iguais de uma soluo de dicloridrato de inferior. Proceda segunda injeco e s seguintes com
histamina R em concentrao menor que a j mencionada, intervalos no inferiores a 1 min aps a presso sangunea
de modo a desencadear respostas reprodutveis com cerca de ter regressado ao nvel que ocupava imediatamente antes
metade da amplitude das provocadas pela dose superior. Esta da injeco precedente. O animal s utilizado para o
dose a dose inferior. Continue a juntar, com intervalos ensaio se nele se obtiver uma queda da presso sangunea
regulares, as doses superior e inferior como foi indicado facilmente discernvel e constante para a dose inferior e
anteriormente e, entre cada adio acrescente o mesmo se uma dose mais elevada provocar reaces mais fortes.
volume de uma diluio da soluo a examinar, sendo a Dissolva a substncia a ensaiar num volume suficiente de
concentrao ajustada de maneira que a eventual contraco soluo de cloreto de sdio a 9 g/l ou em qualquer outro
provocada no leo seja mais fraca que a desencadeada pela solvente prescrito na monografia, para obter a concentrao
dose superior da histamina. necessrio ter a certeza que nela indicada. Injecte por via intravenosa por quilograma
a eventual contraco provocada pela substncia em estudo de massa corporal 1,0 ml de soluo de histamina R seguida

2.6.12. Controlo microbiolgico de produtos no estreis (determinao do nmero total de germes aerbios viveis)
de 2 injeces sucessivas da quantidade indicada da soluo as modalidades de realizao dos ensaios, nomeadamente
problema e finalmente 1,0 ml da soluo de histamina R. nmero de amostras a colher e o modo de interpretao
Efectue a segunda, terceira e quarta injeces 1 min, no dos resultados, so objecto de acordo entre o fabricante e a
mnimo, aps a presso sangunea ter voltado ao nvel que Autoridade competente.
apresentava imediatamente antes da injeco precedente.
Realize o ensaio em condies que permitam evitar qualquer
Repita 2 vezes esta srie de injeces e, para terminar, injecte risco de contaminao acidental da amostra. As precaues
1,5 ml de soluo de histamina R por quilograma de massa
2. Mtodos
que se tomam para evitar a contaminao no devem afectar

Analticos
corporal. os microrganismos susceptveis de serem encontrados. Se

O ensaio s significativo se a resposta obtida aps a injeco o produto possuir actividade antimicrobiana, esta deve ser
de 1,5 ml de soluo de histamina R por quilograma de convenientemente neutralizada. Quando se utilizam para
massa corporal do animal for maior do que a obtida aps este efeito inactivadores da actividade antimicrobiana, deve
administrao de 1,0 ml. A amostra no satisfaz ao ensaio se demonstrar-se a sua eficcia e a ausncia de toxicidade para
a mdia das sries de respostas da sua soluo superior os microrganismos considerados.
mdia das respostas a 1,0 ml de soluo de histamina R por A determinao do nmero total de germes aerbios viveis
quilograma de massa corporal ou se uma das doses utilizadas realiza-se pelo mtodo de filtrao por membrana ou por
provocar uma hipotenso mais acentuada do que a produzida contagem em placas, conforme prescrito na monografia.
pela ltima dose de histamina. Neste ltimo caso, o animal
j no utilizado nas pesquisas das substncias hipotensores. O mtodo denominado de determinao do nmero mais
O mesmo acontecer quando a resposta do animal dose provvel (NMP), reserva-se para as contagens de bactrias
superior de histamina injectada aps a amostra for inferior que no podem ser realizadas por qualquer dos outros
mdia das respostas s doses inferiores de histamina mtodos. A escolha do mtodo determinada por factores
administradas anteriormente. como a natureza do produto e o nmero esperado de
microrganismos. Qualquer que seja o mtodo escolhido, ele
deve ser convenientemente validado.
2.6.12. CONTROLO MICROBIOLGICO Quando o ensaio se aplica em associao com as tcnicas
5.1.3 ou 5.1.4, pode ser efectuado quer por contagem em
DE PRODUTOS NO ESTREIS placas (sementeira em profundidade ou espalhamento
(DETERMINAO DO NMERO TOTAL superfcie), quer por filtrao por membrana.
DE GERMES AERBIOS VIVEIS)
PREPARAO DAS AMOSTRAS
Este captulo geral tem dois conjuntos de ensaios. O
primeiro inclui os mtodos de referncia a utilizar Plano de amostragem. A colheita de amostras de produto
para se provar a conformidade com as monografias. A realiza-se de acordo com um plano de amostragem bem
referncia a este captulo em qualquer monografia implica definido. Este plano de amostragem determinado por
obrigatoriamente a conformidade com o primeiro conjunto factores como o tamanho dos lotes, os riscos sanitrios
de ensaios a no ser que o segundo conjunto de ensaios seja associados utilizao de produtos que apresentam um
autorizado. Estes ltimos ensaios tambm tm o estatuto grau de contaminao no aceitvel, as caractersticas
de mtodos oficiais da Farmacopeia Europeia e podem do produto e o grau de contaminao esperado. Salvo
ser referidos como tal, nomeadamente nos processos de indicao em contrrio, utilize amostras de 10 g ou 10 ml
AIM (Autorizao de Introduo no Mercado). Prev-se da substncia ou da amostra, colhidas com as precaues
que substituam o primeiro conjunto de ensaios quando mencionadas anteriormente. Efectue as colheitas ao acaso no
as respectivas monografias forem revistas. Este segundo produto a granel ou nos recipientes nos quais a preparao
conjunto de ensaios foi desenvolvido em conjunto com a acondicionada. Para obter a quantidade pretendida, se for
Farmacopeia do Japo e a Farmacopeia dos Estados Unidos necessrio de acordo com a natureza da substncia ou da
no mbito do processo de harmonizao internacional. amostra, misture o contedo de um nmero suficiente de
recipientes para formar a amostra.
A. MTODO DA FARMACOPEIA EUROPEIA Um exemplo de plano de amostragem aplicvel aos
produtos nos quais a homogeneidade da distribuio dos
Os ensaios descritos a seguir permitem a contagem das microrganismos pode ser um problema, o plano de
bactrias mesfilas e dos fungos e leveduras capazes de amostragem de trs nveis. Neste caso, so colhidas cinco
crescerem em aerobiose. amostras de cada lote que so examinadas separadamente; os
trs nveis so definidos da forma seguinte:
Os ensaios destinam-se em primeiro lugar a determinar se
um produto objecto de uma monografia da Farmacopeia (i) amostras aceitveis, quer dizer que contm menos de m
satisfaz s exigncias microbiolgicas especificadas nessa UFC (unidades formadoras de colnia) por grama ou por
monografia; convm neste caso seguir as indicaes dadas a mililitro, sendo m o limite especificado na monografia do
seguir, nomeadamente as relativas ao nmero de amostras a produto,
colher e interpretao dos resultados. Os ensaios descritos (ii) amostras marginais, quer dizer que contm mais de
podem tambm ser utilizados no ensaio de Eficcia dos m UFC mas menos que 10m UFC por grama ou por
conservantes antimicrobianos (5.1.3). Alm disso, podem mililitro,
ser utilizados para controlar a qualidade microbiolgica
das matrias-primas e serem utilizados em conjunto com a (iii) amostras no conformes, quer dizer que contm mais
tcnica Qualidade microbiolgica das preparaes farmacu- que 10m UFC por grama ou mililitro.
ticas (5.1.4). Nestes casos, quando, por exemplo, so
utilizados pelo fabricante para controlar as matrias-primas Produtos hidrossolveis. Prepare uma soluo ou uma
e/ou um produto final ou para a validao de um mtodo, diluio de 10 g ou de 10 ml da amostra numa soluo

de peptona tamponada com cloreto de sdio de pH 7,0 ou solues fortemente alcolicas. Os aparelhos de filtrao
noutro diluente apropriado. A razo de diluio utilizada utilizados devem permitir a transferncia da membrana para
geralmente 1/10, mas as caractersticas do produto ou a os meios de cultura.
sensibilidade pretendida podem exigir o emprego de outras
Transfira uma quantidade apropriada da amostra preparada
diluies. Se conhecida a actividade antimicrobiana do
como se descreve em Preparao das amostras (de
produto, pode adicionar-se um agente de inactivao ao
preferncia o equivalente a 1 g de produto, ou menos, se
diluente. Se necessrio, ajuste o pH para cerca de 7 e prepare
o nmero esperado de unidades formadoras de colnia
2. Mtodos
Analticos
as diluies seguintes de base 10 com o mesmo diluente.
for elevado) para cada um de dois filtros de membrana e
filtre imediatamente. Lave cada membrana com 3 vezes
Produtos de natureza no lipdica insolveis em gua. 100 ml de um lquido apropriado, por exemplo, soluo
Prepare uma suspenso de 10 g ou de 10 ml da amostra numa de peptona tamponada com cloreto de sdio de pH 7,0.
soluo de peptona tamponada com cloreto de sdio de pH A esta soluo pode adicionar-se um agente tensioactivo
7,0 ou noutro diluente apropriado. A quantidade de diluente como o polissorbato 80 ou um inactivador apropriado
utilizada geralmente de 10 para 1, mas as caractersticas do da actividade antimicrobiana. Sob reserva de validao,
produto podem exigir o emprego de volumes maiores. Para o nmero de lavagens efectuadas pode ser inferior a 3.
facilitar a suspenso de substncias dificilmente miscveis, Deposite uma das membranas, destinada principalmente
pode ser adicionado um agente tensioactivo apropriado como contagem de bactrias, na superfcie de um meio gelosado
o polissorbato 80 numa concentrao de 1 g/l. Se conhecida apropriado (meio gelosado B, por exemplo), e a outra,
a actividade antimicrobiana do produto, pode adicionar-se destinada principalmente contagem de fungos e leveduras,
um agente de inactivao ao diluente. Se necessrio, ajuste o superfcie de um outro meio gelosado apropriado (meio
pH para cerca de 7 e prepare as diluies seguintes de base 10 gelosado C, por exemplo). Incube a placa de meio gelosado
com o mesmo diluente. B a 30-35C e a placa de meio gelosado C a 20-25C durante
5 dias, a no ser que um tempo de incubao mais curto
Produtos de natureza lipdica. Homogenize 10 g ou 10 ml da permita obter uma contagem fivel. Seleccione as placas
amostra com, no mximo, metade da massa de polissorbato que apresentam o maior nmero de colnias inferior a 100
80 estril ou de um outro agente tensioactivo apropriado e calcule o nmero de unidades formadoras de colnias por
estril, aquecido se necessrio a uma temperatura que no grama ou por mililitro de produto.
ultrapasse 40C ou em alguns casos excepcionais 45C. No exame dos adesivos transdrmicos, utilize 2 membranas
Misture cuidadosamente e mantenha, se necessrio, estreis e filtre separadamente por cada uma delas 50 ml da
temperatura pretendida, em banho de gua ou numa preparao A. Transfira uma das membranas, para a determi-
incubadora. Adicione a soluo de peptona tamponada nao do nmero total de germes aerbios viveis, para a
com cloreto de sdio de pH 7,0, previamente aquecida, superfcie do meio gelosado B e a outra para a determinao
em quantidade suficiente para obter uma diluio 1/10 do de fungos e leveduras, para a superfcie do meio gelosado C.
produto inicial. Misture cuidadosamente, mantendo sempre
mesma temperatura durante o tempo mnimo necessrio
para formar uma emulso, mas em qualquer caso nunca CONTAGEM EM PLACAS
mais de 30 min. As diluies seguintes de base 10 podem ser
preparadas com a soluo de peptona tamponada com cloreto a. Sementeira em profundidade. Utilize placas de Petri com
de sdio de pH 7,0, contendo uma quantidade apropriada um dimetro de 9 cm. Introduza em cada uma delas 1 ml
de polissorbato 80 estril ou outro agente tensioactivo da amostra preparada como se descreve em Preparao
apropriado estril. das amostras e 15-20 ml de um meio gelosado liquefeito
adaptado cultura de bactrias (meio gelosado B, por
exemplo), ou de um meio gelosado liquefeito adaptado
Adesivos transdrmicos. Com pinas estreis, retire a
cultura de fungos e leveduras (meio gelosado C, por
pelcula protectora de 10 adesivos transdrmicos e coloque-
exemplo), a uma temperatura que no ultrapasse 45C. Se as
-os, numa placa de vidro ou de plstico estril, com a face
placas utilizadas forem maiores, aumente proporcionalmente
adesiva virada para cima; se necessrio, cubra a face adesiva
o volume de meio. Prepare, pelo menos, 2 placas de Petri
com gaze estril (ou filtro de tecido de malha de polmero
por meio e por diluio. Incube as placas a 30-35C (20-25C
de um filamento) e transfira os 10 dispositivos para 500 ml,
para fungos e leveduras) durante 5 dias, a no ser que um
no mnimo, de soluo de peptona tamponada com cloreto
tempo de incubao mais curto permita obter uma contagem
de sdio de pH 7,0, contendo inactivadores apropriados
fivel. Seleccione as placas que apresentam o maior nmero
como o polissorbato 80 e/ou a lecitina; agite energicamente
de colnias inferior a 300 (100 para os fungos e leveduras).
durante, no mnimo, 30 min (preparao A). Prepare da
Efectue a mdia aritmtica das contagens e calcule o nmero
mesma maneira mais 10 adesivos, coloque-os em 500 ml, no
de unidades formadoras de colnias por grama ou por
mnimo, de meio liquido D e agite energicamente durante,
mililitro de produto.
no mnimo, 30 min (preparao B).
b. Sementeira por espalhamento superfcie. Utilize placas
de Petri com um dimetro de 9 cm. Introduza em cada uma
EXAME DAS AMOSTRAS delas 15-20 ml de um meio gelosado liquefeito adaptado
cultura de bactrias (meio gelosado B, por exemplo), ou de
Filtrao por membrana. Utilize membranas filtrantes com um meio gelosado liquefeito adaptado cultura de fungos e
porosidade nominal de 0,45 m, no mximo, com provada leveduras (meio gelosado C, por exemplo) a uma temperatura
eficcia de reteno bacteriana. O material constituinte das de cerca de 45C e depois deixe solidificar. Se as placas
membranas escolhido de modo que a eficcia de reteno utilizadas forem maiores, aumente proporcionalmente o
bacteriana no seja afectada pelos constituintes da amostra. volume de meio. Deixe secar as placas, por exemplo numa
As membranas de nitrato de celulose podem, por exemplo, cmara de fluxo laminar ou numa incubadora. Espalhe na
ser utilizadas para solues aquosas, oleosas ou ligeiramente superfcie do meio um volume de, pelo menos, 0,1 ml da
alcolicas e as membranas de acetato de celulose para as amostra preparada como se descreve em Preparao das

amostras. Prepare, pelo menos, 2 placas de Petri por meio EFICCIA DOS MEIOS DE CULTURA E VALIDADE
e por diluio. Proceda incubao e ao clculo do nmero DO MTODO DE CONTAGEM
de unidades formadoras de colnias como se descreve na
sementeira em profundidade. Cultive separadamente as estirpes bacterianas de referncia
em recipientes com meio liquido apropriado (meio liquido
Mtodo do nmero mais provvel A, por exemplo) a 30-35 entre 18 h e 24 h, e as estirpes
fngicas de referncia num meio gelosado apropriado
2. Mtodos
Analticos
O mtodo do nmero mais provvel (NMP) apresenta uma (meio gelosado C sem antibiticos, por exemplo) a 20-25C
preciso e uma exactido inferiores aos mtodos de filtrao durante 48 h para a Candida albicans e a 20-25C durante 7
por membrana e aos mtodos de contagem em placas. dias para o Aspergillus niger.
Nomeadamente, do resultados pouco fiveis na contagem
de fungos. , pois, reservado s contagens bacterianas para Staphylococcus aureus por exemplo ATCC 6538 (NCIMB 9518,
as quais impossvel o recurso aos outros mtodos. Quando CIP 4.83)
se justificar a utilizao deste mtodo, proceda do modo Escherichia coli por exemplo ATCC 8739 (NCIMB 8545,
descrito a seguir. CIP 53.126)
Prepare, pelo menos, 3 diluies sucessivas de razo 1/10, Bacilius subtilis por exemplo ATCC 6633 (NCIMB 8054,
como se descreve em Preparao das amostras. Utilize 3 CIP 52.62)
partes alquotas de 1 g ou 1 ml de cada diluio e transfira
para 3 tubos contendo cada um 9-10 ml de um meio liquido Candida albicans por exemplo ATCC 1023 (NCPF 3179, IP
apropriado (meio liquido A, por exemplo), se necessrio 48.72)
adicionado de um agente tensioactivo como o polissorbato 80 Aspergilius niger por exemplo ATCC 16404 (IMI 149007,
ou de um inactivador de actividade antimicrobiana. Para uma
IP 1431.83)
srie de 3 diluies, , pois, preciso semear 9 tubos. Incube
todos os tubos a 30-35C durante 5 dias Para cada diluio, Utilize a soluo de peptona tamponada com cloreto de sdio
registe o nmero de tubos que apresentam crescimento de pH 7,0 para preparar as suspenses testemunhas contendo
microbiano. Quando a natureza da amostra tornar a leitura cerca de 100 unidades formadoras de colnias por mililitro.
dos resultados difcil ou duvidosa, efectue uma subcultura no Utilize separadamente as suspenses dos diferentes microrga-
mesmo meio liquido ou num meio gelosado apropriado (meio nismos como testemunhas para os mtodos de contagem, na
gelosado B, por exemplo), incube mesma temperatura entre presena e ausncia da amostra. Quando se utiliza o mtodo
18 h e 24 h e utilize os resultados assim obtidos. Atravs do de filtrao por membrana e os mtodos de contagem em
quadro 1 determine o nmero mais provvel de bactrias por placas, o nmero de colnias obtidas no deve diferir mais do
grama ou mililitro da amostra. que 5 vezes do valor calculado a partir do inculo para cada
microrganismo de referncia. Quando se utiliza o mtodo
QUADRO 1 Valores do nmero mais provvel do nmero mais provvel, o valor calculado a partir do
inculo deve estar compreendido no intervalo de confiana
de 95 por cento dos resultados obtidos. Para controlar a
esterilidade do meio e do diluente e a eficcia das condies
de assepsia aplicadas, efectue o mtodo utilizando a soluo
de peptona tamponada com cloreto de sdio de pH 7,0 estril
como preparao de controlo. No deve haver crescimento
microbiano.
INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Considera-se o nmero de bactrias igual mdia do nmero

de unidades formadoras de colnias nas culturas em meio
gelosado B. Considera-se o nmero de fungos e leveduras
igual mdia do nmero de unidades formadoras de
colnias nas culturas em meio gelosado C. O nmero total
de germes aerbios viveis a soma do nmero de bactrias
e do nmero de fungos e leveduras tal como descrito
anteriormente. Se for evidente que alguns microrganismos
crescem nos dois meios, o valor obtido pode ser corrigido
devido a este facto. Quando a contagem efectuada pelo
mtodo do nmero mais provvel, o valor calculado o
nmero de bactrias.
Os limites de contaminao microbiana prescritos nas
monografias interpretam-se como se segue:
102 microrganismos: valor mximo aceitvel 5 102,
103 microrganismos: valor mximo aceitvel 5 103, e assim
por diante.

Quando se utiliza um plano de amostragem como o plano de estar melhor adaptado a alguns grupos de produtos que
3 nveis, por exemplo, deve proceder-se como se indica. apresentam uma carga microbiana muito baixa.
Calcule separadamente o nmero total de germes aerbios A escolha do mtodo determinada por factores como a
viveis para cada uma das 5 amostras. A substncia ou a natureza da amostra e o limite especificado para o nmero
amostra satisfaz ao ensaio se forem preenchidas as seguintes de microrganismos. Qualquer que seja o mtodo escolhido,
condies: deve permitir efectuar o ensaio numa amostra de tamanho
2. Mtodos
Analticos
suficiente para permitir a avaliao da conformidade com
(i) nenhum dos resultados individuais obtidos superior a
as especificaes. Convm estabelecer a aplicabilidade do
10 vezes (ou mais) o limite prescrito (nenhuma amostra
mtodo escolhido.
no conforme),
(ii) o nmero de resultados individuais que se situam entre o
limite prescrito e 10 vezes este limite no superior a 2 4. FERTILIDADE DOS MEIOS E APLICABILIDADE DO
(no mais do que 2 amostras marginais). MTODO DE CONTAGEM
As solues e os meios de cultura recomendados esto
descritos no mtodo geral 2.6.13. 4-1. CONSIDERAES GERAIS
Deve ser provada a aptido do mtodo em detectar os
B. MTODO HARMONIZADO: CONTROLO microrganismos na presena do produto.
MICROBIOLGICO DOS PRODUTOS NO ESTREIS: A aplicabilidade do mtodo de ensaio deve ser confirmada
ENSAIO DE CONTAGEM MICROBIANA sempre que se faz uma alterao no procedimento ou no
produto que seja susceptvel de afectar os resultados.
1. INTRODUO
4-2. PREPARAO DAS ESTIRPES DE REFERNCIA
Os ensaios descritos a seguir permitem a contagem das Utilize suspenses das estirpes de referncia normalizadas
bactrias mesfilas e dos fungos e leveduras capazes de estveis ou prepare suspenses como se indica a seguir.
crescer em aerobiose. As culturas so efectuadas segundo um sistema de lote
Os ensaios destinam-se em primeiro lugar a determinar se semente de modo que os microrganismos viveis utilizados
uma substncia ou preparao satisfaz a uma especificao para a inoculao no tenham sido submetidos a mais de
pr-estabelecida em matria de qualidade microbiolgica. 5 passagens a partir do lote semente primrio de origem.
Convm neste caso seguir as instrues dadas a seguir, Cultive separadamente cada uma das estirpes bacterianas e
incluindo o nmero de amostras a serem colhidas e a fngicas de referncia como se indica no quadro 2.
interpretao dos resultados. Utilize a soluo de peptona tamponada com cloreto de
Estes mtodos no so aplicveis aos produtos que contm sdio de pH 7,0 ou a soluo tampo de fosfatos de pH 7,2
microrganismos viveis como substncias activas. para preparar as suspenses testemunhas; para suspender os
esporos do A. niger, pode juntar-se ao tampo 0,05 por cento
Mtodos microbiolgicos alternativos, incluindo mtodos de polissorbato 80. Utilize as suspenses dentro de 2 horas,
automatizados, podem ser utilizados desde que a sua ou 24 h se forem conservadas a 2-8C. Pode-se tambm,
equivalncia aos mtodos da Farmacopeia tenha sido
em vez de preparar e depois diluir uma suspenso fresca de
demonstrada.
clulas vegetativas de A. niger ou de B. subtilis, preparar uma
suspenso estvel de esporos e depois utilizar um volume
2. PRECAUES GERAIS apropriado para a inoculao. Esta suspenso pode ser
mantida a 2-8C durante um prazo validado.
Efectue as contagens em condies que permitam evitar
qualquer contaminao extrnseca amostra. As precaues 4-3. TESTEMUNHA NEGATIVA
tomadas para evitar a contaminao no devem afectar os Para verificar as condies do ensaio, efectue um controlo
microrganismos susceptveis de serem encontrados. numa testemunha negativa preparada substituindo a
Quando a amostra possui actividade antimicrobiana, esta amostra pelo diluente escolhido. No se observa crescimento
, sempre que possvel, eliminada ou neutralizada. Quando microbiano.
se utilizam para este efeito inactivadores da actividade
antimicrobiana, deve ser demonstrada a sua eficcia e a 4-4. FERTILIDADE DOS MEIOS
ausncia de toxicidade para os microrganismos considerados.
Efectue este controlo em cada lote de meio, quer seja
Quando se utilizam na preparao das amostras agentes comprado pronto a usar ou preparado a partir de um meio
tensioactivos, deve demonstrar-se a ausncia de toxicidade desidratado ou com os ingredientes descritos.
para os microrganismos considerados e a sua compatibilidade
com os inactivadores utilizados. Semeie as fraces/placas de meio lquido com peptonas de
casena de soja e de meio gelosado com peptonas de casena
e de soja com um pequeno nmero (100 UFC, no mximo)
3. MTODOS DE CONTAGEM dos microrganismos indicados no quadro 2, utilizando uma
fraco/placa separada de meio para cada um. Inocule placas
Utilize a filtrao por membrana ou a contagem em placas de meio de Sabouraud glucosado e gelosado com um pequeno
consoante seja prescrito um ou outro mtodo. O mtodo do nmero (100 UFC, no mximo) dos microrganismos indicados
nmero mais provvel (NMP), embora menos exacto que no quadro 2, utilizando uma placa separada de meio para cada
os outros mtodos de contagem microbiana, pode contudo um. Incube nas condies especificadas no quadro 2.

Nos meios slidos, o crescimento obtido no deve diferir Se nenhum dos procedimentos descritos a seguir satisfizer,
mais do que 2 vezes do valor calculado para o inculo necessrio desenvolver um outro procedimento.
normalizado. Para os inculos preparados recentemente, o Produtos hidrossolveis. Dissolva ou dilua a amostra
crescimento deve ser comparvel ao observado com o lote de (normalmente prepara-se uma diluio a 1/10) numa soluo
meio anteriormente controlado e aprovado. Os meios lquidos de peptona tamponada com cloreto de sdio de pH 7,0, numa
servem quando se observa um crescimento claramente visvel soluo tampo de fosfatos de pH 7,2 ou em meio lquido
dos microrganismos, comparvel ao obtido com um lote de
2. Mtodos
Analticos
com peptonas de casena e de soja. Ajuste para pH 6-8. Nos

meio anteriormente controlado e aprovado. casos apropriados, as diluies seguintes so preparadas com
o mesmo diluente.
4-5. APLICABILIDADE DO MTODO DE CONTAGEM
Produtos de natureza no lipdica insolveis em gua.
EM PRESENA DO PRODUTO Suspenda a amostra (prepara-se tambm uma diluio a 1/10)
numa soluo de peptona tamponada com cloreto de sdio
4-5-1. Preparao das amostras. O mtodo de preparao de pH 7,0, numa soluo tampo de fosfatos de pH 7,2 ou em
das amostras depende das caractersticas fsicas da amostra. meio lquido com peptonas de casena e de soja. Para facilitar

a suspenso de substncias dificilmente miscveis pode por exemplo, consistir no (1) aumento do volume do diluente
adicionar-se um agente tensioactivo como o polissorbato 80 ou do meio de cultura, (2) incorporao no diluente de
a uma concentrao de 1 g/l. Ajuste para pH 6-8. Nos casos agentes neutralizantes especficos ou gerais, (3) filtrao por
apropriados, as diluies seguintes so preparadas com o membrana ou (4) combinao das modificaes atrs citadas.
mesmo diluente.
Agentes neutralizantes. Podem ser utilizados agentes para
Produtos de natureza lipdica. Dissolva a amostra em neutralizar a actividade de substncias antimicrobianas
miristato de isopropilo esterilizado por filtrao, ou misture-a
2. Mtodos
interferentes (Quadro 3). Podem ser adicionados ao diluente
Analticos
com a quantidade mnima necessria de polissorbato 80 escolhido ou ao meio, de preferncia antes da esterilizao.
estril ou de um outro agente tensioactivo no inibidor A eficcia de qualquer neutralizante utilizado e a ausncia da
estril, aquecido se necessrio a uma temperatura que no sua toxidade para os microrganismos deve ser demonstrada
ultrapasse 40C ou em alguns casos excepcionais 45C. na amostra em branco contendo o neutralizante mas no o
Misture cuidadosamente e mantenha, se necessrio, produto.
temperatura pretendida, em banho de gua ou numa
incubadora. Adicione o diluente escolhido, previamente QUADRO 3 Agentes usuais de neutralizao de substncias
aquecido, em quantidade suficiente para obter uma diluio a interferentes
1/10 do produto inicial. Misture cuidadosamente, mantendo
sempre mesma temperatura durante o tempo mnimo Substncia interferente Mtodo de neutralizao possvel
necessrio para formar uma emulso. As diluies seguintes Glutaraldedo, mercuriais Hidrogenossulfito de sdio
a 1/10 podem ser preparadas com o diluente escolhido, (bissulfito de sdio)
adicionado de uma quantidade apropriada de polissorbato Fenlicos, lcool, aldedos, sorbato Diluio
80 estril ou de um outro agente tensioactivo no inibidor Aldedos Glicina
estril. Amnios quaternrios (CAQ),
Produtos liquidos ou slidos na forma de aerossol. Transfira para-Lecitina -hidroxibenzoatos
aos outros, e transfira os dispositivos para um volume (parabenos), bis-biguanidos
assepticamente o produto para um filtro de membrana ou CAQ, iodo, parabenos Polissorbato
apropriado do diluente escolhido contendo inactivadores Mercuriais Tioglicolato
para um recipiente estril para posteriores colheitas. Para Mercuriais, halognios, aldedos Tiossulfato
como o polissorbato 80 e/ou a lecitina. Agite energicamente EDTA (edetato) Ies de Mg ou Ca
cada recipiente da amostra, utilize a totalidade do contedo
durante, no mnimo, 30 min. ou um nmero definido de Se no for identificado nenhum outro mtodo apropriado
doses (aerossol com vlvula doseadora). de neutralizao, presume-se que a impossibilidade de
Adesivos transdrmicos. Com pinas estreis, retire a pelcula isolar o microrganismo inoculado imputvel actividade
protectora dos dispositivos transdrmicos e coloque-os microbicida do produto. Esta informao serve para indicar
numa placa de vidro ou de plstico estril, com a face adesiva que o produto no susceptvel de ser contaminado pela
virada para cima; se necessrio, cubra a face adesiva com espcie considerada de microrganismo. No entanto, possvel
gaze estril, para evitar que os dispositivos se colem uns aos que o produto iniba alguns microrganismos aqui especifica-
outros, e transfira os dispositivos para um volume apropriado dos, mas no iniba outros que no figuram entre as estirpes
do diluente escolhido contendo inactivadores como o de referncia ou ento estes ltimos no so representativos.
polissorbato 80 e/ou a lecitina. Agite energicamente durante, Convm efectuar o ensaio com o mais elevado factor de
no mnimo, 30 min. diluio que seja compatvel com o crescimento microbiano e
o critrio de aceitao especfico.
4-5-2. Inoculao e diluio. Adicione amostra preparada
como descrito anteriormente (4-5-1) e a uma testemunha 4-5-4. Reisolamento de microrganismos em presena do
(que no contm a amostra), um volume da suspenso produto. Efectue ensaios separados para cada um dos micror-
microbiana suficiente para obter um inculo de 100 UFC, ganismos citados. Apenas so contados os microrganismos da
no mximo. O volume da suspenso utilizada no deve estirpe de sementeira.
ultrapassar 1 por cento do volume do produto diludo.
4-5-4-1. Filtrao por membrana. Utilize membranas
Para se demonstrar que o reisolamento bacteriano filtrantes com porosidade nominal de 0,45 m, no mximo.
aceitvel, preciso efectuar o ensaio na amostra preparada O material constituinte das membranas escolhido de
com o mais baixo factor de diluio possvel. Se a actividade modo que a eficcia de reteno bacteriana no seja afectada
antimicro-biana ou a fraca solubilidade do produto impedir, pelos constituintes da amostra. utilizada uma membrana
deve ser desenvolvido um protocolo especfico. Se for filtrante para cada microrganismo citado.
impossvel evitar uma inibio do crescimento provocada
pela amostra, pode proceder-se a uma neutralizao, diluio Transfira uma quantidade apropriada da amostra preparada
ou filtrao antes da adio da suspenso bacteriana. como se descreve de 4-5-1 a 4-5-3 (de preferncia o
equivalente a 1 g de produto, ou menos, se o nmero
4-5-3. Neutralizao/eliminao da actividade esperado de unidades formadoras de colnia for elevado) filtre
antimicrobiana. Compare o reisolamento microbiano obtido imediatamente e lave o filtro com um volume apropriado de
respectivamente com a amostra preparada diluda como diluente.
descrito em 4-5-2 e incubada de acordo com o procedimento Para a determinao do nmero total de germes aerbios
descrito em 4-5-4 e com a preparao testemunha. viveis, transfira a membrana para o meio gelosado com
Nos casos de inibio de crescimento (reduo superior peptonas de casena e de soja. Para determinao do nmero
a 2 vezes) introduza no procedimento seguido no ensaio total de fungos e leveduras, transfira a membrana para o
de contagem em causa as modificaes necessrias para meio de Sabouraud glucosado e gelosado. Incube as placas
garantir a validade dos resultados. As modificaes podem, como se indica no quadro 2. Proceda contagem.

4-5-4-2. Contagem em placas. Efectue a contagem em placas, QUADRO 4 Valores do nmero mais provvel de microrganismos
pelo menos 2 vezes para cada meio e utilize a mdia dos dois
resultados.
4-5-4-2-1. Sementeira em profundidade. Para placas de Petri

com um dimetro de 9 cm, introduza na placa 1 ml da amostra
preparada como se descreve de 4-5-1 a 4-5-3, e 15-20 ml de
2. Mtodos
Analticos
meio gelosado com peptonas de casena e de soja ou de meio de

Sabouraud glucosado e gelosado a uma temperatura que no
ultrapasse 45C. Se as placas utilizadas forem maiores, aumente
proporcionalmente o volume de meio. Utilize, pelo menos, 2
placas de Petri para cada microrganismo mencionado no quadro
2. Incube as placas como indicado no quadro 2. Efectue a mdia
aritmtica das contagens por meio e calcule o nmero de UFC no
inculo inicial.
4-5-4-2-2. Sementeira por espalhamento superfcie. Para

placas de Petri com um dimetro de 9 cm, introduza 15-20
ml de meio gelosado com peptonas de casena e de soja ou de
meio de Sabouraud glucosado e gelosado a uma temperatura
que no ultrapasse 45C e depois deixe solidificar. Se as placas
utilizadas forem maiores, aumente proporcionalmente o volume
de meio. Deixe secar as placas, por exemplo, numa cmara de
fluxo laminar ou numa incubadora. Utilize, pelo menos, 2 placas
de Petri para cada microrganismo mencio-nado no quadro 2.
Espalhe na superfcie do meio um volume de, pelo menos,
0,1 ml da amostra preparada como se descreve de 4-5-1 a 4-5-3.
Proceda incubao e contagem como indicado em 4-5-4-2-1.
4-5-4-3. Mtodo do nmero mais provvel (NMP). O mtodo

do NMP apresenta uma preciso e uma exactido inferiores
aos mtodos de filtrao por membrana e aos mtodos
de contagem em placas. Nomeadamente, do resultados
pouco fiveis na contagem de fungos. , pois, reservado
s determinaes do nmero total de aerbios viveis para
os quais impossvel o recurso aos outros mtodos. Se
for justificada a utilizao deste mtodo, proceda do modo
descrito a seguir.
Prepare, pelo menos, 3 diluies sucessivas de razo 1/10,
como se descreve de 4-5-1 a 4-5-3. Utilize partes alquotas de
1 g ou 1 ml de cada diluio e transfira para 3 tubos contendo
cada um 9-10 ml de meio lquido com peptonas de casena e
de soja, se necessrio adicionado de um agente tensioactivo
como o polissorbato 80 ou de um neutralizante de actividade
antimicrobiana. Para uma srie de 3 diluies, , pois, preciso
semear 9 tubos. Se os critrios forem impossveis de satisfazer para um ou
vrios microrganismos submetidos ao ensaio por um dos
Incube todos os tubos a 30-35 durante 3 dias, no mximo.
mtodos descritos, o mtodo e as condies de ensaio que se
Quando a natureza da amostra tornar a leitura dos resultados
aproximam dos critrios utilizam-se para analisar o produto.
difcil ou duvidosa, efectue uma subcultura no mesmo meio
lquido ou no meio gelosado com peptonas de casena e de
soja, incube mesma temperatura durante 1-2 dias e utilize 5. CONTROLO DOS PRODUTOS
os resultados assim obtidos. Atravs do quadro 4 determine o
nmero mais provvel de bactrias por grama ou mililitro da
amostra. 5-1. QUANTIDADE UTILIZADA NO ENSAIO
Salvo indicao em contrrio, utilize 10 g ou 10 ml
4-6. RESULTADOS E INTERPRETAO da amostra, colhidos com as precaues mencionadas
Quando da verificao da aplicao do mtodo de filtrao anteriormente. Para os lquidos ou slidos em aerossol, colha
amostra de 10 recipientes. Para os adesivos transdrmicos,
por membrana ou da contagem em placas, o numero mdio
efectue a amostragem em 10 dispositivos.
obtido para cada microrganismo de referncia no deve
diferir mais do que 2 vezes do valor obtido na ausncia do A tomada de ensaio pode ser reduzida para as substncias
produto para a testemunha definida em 4-5-2. Quando da activas que vo ser formuladas nas seguintes condies:
verificao da aplicao do mtodo do NMP, o valor calculado quantidade por unidade (por ex., comprimido, cpsula,
a partir do inculo deve estar compreendido no intervalo preparao injectvel) igual ou inferior a 1 mg, ou
de confiana de 95 por cento dos resultados obtidos com a quantidade por grama ou mililitro (nas preparaes que no
testemunha. se apresentam em unidades) inferior a 1 mg. Neste caso, a

2.6.13. Controlo microbiolgico de produtos no estreis (pesquisa de microrganismos
tomada de ensaio deve ser, pelo menos, igual quantidade 5-2-3. Mtodo do nmero mais provvel. Prepare a amostra
contida em 10 unidades ou em 10 g ou 10 ml de produto. por um mtodo cuja aplicabilidade tenha sido provada como
No caso de produtos utilizados como substncias activas e se descreve em 4. Incube os tubos a 30-35C durante 3-5 dias.
nas quais a quantidade da amostra limitada ou o tamanho Efectue, se necessrio, uma subcultura, pelo procedimento
do lote extremamente pequeno (menos de 1000 ml ou estabelecido previamente. Para cada diluio, registe o
1000 g), a tomada de ensaio dever representar 1 por nmero de tubos que apresentam crescimento microbiano.
Determine o nmero mais provvel de microrganismos por
2. Mtodos
cento do lote, a no ser que seja prescrita ou justificada e
Analticos
autorizada uma quantidade inferior. grama ou mililitro da amostra atravs do quadro 2.
No caso de produtos em que o nmero total de unidades
5-3. INTERPRETAO DOS RESULTADOS
do lote seja inferior a 200 (por ex., amostras utilizadas nos
ensaios clnicos), o tamanho da amostra pode ser reduzido a O nmero total de germes aerbios viveis considera-se
2 unidades, ou a 1 unidade se o tamanho do lote for inferior igual ao nmero de UFC obtidas com o meio gelosado com
a 100. peptonas de casena e de soja; se so detectadas colnias
Efectue a colheita de amostras ao acaso no produto a granel de fungos e leveduras neste meio, estas so contadas na
ou nos recipientes nos quais a preparao acondicionada. determinao do nmero total de germes aerbios viveis. O
Para obter a quantidade necessria, misture o contedo de nmero total de fungos e leveduras considera-se o nmero
um nmero suficiente de recipientes para formar a amostra. de UFC obtidas com o meio de Sabouraud glucosado e
gelosado; se so detectadas colnias de bactrias neste meio,
5-2. EXAME DO PRODUTO contabilizam-se no nmero total de fungos e leveduras.
Quando se prev que o nmero total de fungos e leveduras
5-2-1. Filtrao por membrana. Utilize um aparelho de corre o risco de ultrapassar os critrios de aceitao devido
filtrao que permita a transferncia da membrana para o ao crescimento bacteriano, pode ser utilizado o meio de
meio. Prepare a amostra por um mtodo cuja aplicabilidade Sabouraud glucosado e gelosado com antibiticos. Se a
tenha sido demonstrada como se descreve em 4 e introduza a contagem efectuada pelo mtodo NMP, o valor calculado o
quantidade apropriada de amostra em 2 filtros de membrana. nmero total de germes aerbios viveis.
Filtre imediatamente. Lave cada membrana conforme o
procedimento estabelecido previamente. Quando est prescrito um critrio de aceitao em matria de
qualidade microbiolgica, interpreta-se como se segue:
Transfira uma das membranas para o meio gelosado com
peptonas de casena e de soja, para a determinao do 101 UFC: nmero mximo aceitvel = 20,
nmero total de germes aerbios, e a outra para o meio
de Sabouraud glucosado e gelosado para determinao do 102 UFC: nmero mximo aceitvel = 200,
nmero total de fungos e leveduras. Incube a placa de meio 103 UFC: nmero mximo aceitvel = 2000, e assim por diante.
gelosado com pep-tonas de casena e de soja a 30-35C
durante 3-5 dias a placa de meio de Sabouraud glucosado e As solues e meios recomendados so os descritos no
gelosado a 20-25C durante 5-7 dias. Calcule o nmero de mtodo geral 2.6.13 Parte B: Mtodo harmonizado.
UFC por grama ou mililitro.
No exame dos adesivos transdrmicos, filtre separadamente
10 por cento do volume da preparao descrita em 4-5-1. por 2.6.13. CONTROLO MICROBIOLGICO
2 membranas estreis. Transfira uma das membranas para DE PRODUTOS NO ESTREIS
o meio gelosado com peptonas de casena e de soja, para a
determinao do nmero total de germes aerbios viveis e
(PESQUISA DE MICRORGANISMOS
a outra para o meio de Sabouraud glucosado e gelosado para ESPECFICOS)
determinao do nmero total de fungos e leveduras.
Este captulo geral tem dois conjuntos de ensaios. O
5-2-2. Contagem em placas primeiro inclui os mtodos de referncia a utilizar
para se provar a conformidade com as monografias. A
5-2-2-1. Sementeira em profundidade. Prepare a amostra por referncia a este captulo em qualquer monografia implica
uma mtodo cuja aplicabilidade tenha sido provada como obrigatoriamente a conformidade com o primeiro conjunto
se descreve em 4. Prepare, pelo menos, 2 placas de Petri por de ensaios a no ser que o segundo conjunto de ensaios seja
meio e por diluio. Incube as placas de meio gelosado com autorizado. Estes ltimos ensaios tambm tm o estatuto
peptonas de casena e de soja a 30-35C durante 3-5 dias e as de mtodos oficiais da Farmacopeia Europeia e podem
placas de meio de Sabouraud glucosado e gelosado a ser referidos como tal, nomeadamente nos processos de
20-25C durante 5-7 dias. Seleccione as placas AIM (Autorizao de Introduo no Mercado). Prev-se
correspondentes diluio que apresenta o mais elevado que substituam o primeiro conjunto de ensaios quando
nmero de colnias inferior a 250 na determinao as respectivas monografiasforem revistas. Este segundo
do nmero total de germes aerbios viveis e a 50 na conjunto de ensaios foi desenvolvido em conjunto com a
determinao do nmero total de fungos e leveduras. Efectue Farmacopeia do Japo e a Farmacopeia dos Estados unidos
a mdia aritmtica das contagens e calcule o nmero de UFC no mbito do processo de harmonizao internacional.
por grama ou mililitro de produto.
5-2-2-2. Sementeira por espalhamento superfcie. Prepare

A. MTODO DA FARMACOPEIA EUROPEIA
a amostra por uma mtodo cuja aplicabilidade tenha sido
estabelecida como se descreve em 4. Prepare, pelo menos, 2 No presente captulo prope-se o emprego de certos
placas de Petri por meio e por diluio. Proceda incubao meios selectivos. Todos os meios selectivos tm em
e ao calculo do nmero de UFC como se descreve na comum a particularidade de no permitirem a deteco de
sementeira em profundidade. microrganismos que tenham sofrido leses subletais. Como

2.6.13. Controlo microbiolgico de produtos no estreis (pesquisa de microrganismos especficos)
estes microrganismos so importantes do ponto de vista da Homogenize e incube a 35-37C durante 18 h a 48 h. Agite o
qualidade do produto, os procedimentos experimentais que se recipiente e transfira 1 ml do seu contedo para semear em
apoiem no emprego de meios selectivos compreendem uma 100 ml de meio lquido G. Incube a 43-45C durante 18 h a
etapa de revivificao. 24 h. Efectue subculturas em meio gelosado H e incube a
35-37C durante 18 h a 72 h. O crescimento de colnias
Se a amostra possuir actividade antimicrobiana, esta
vermelhas, geralmente no mucosas, de bactrias gram-
convenientemente neutralizada.
-negativas em forma de bastonete, indica a presena provvel
2. Mtodos
Analticos
Enterobactrias e outras bactrias gram-negativas de E. coli que pode ser confirmada por ensaios bioqumicos
apropriados (por exemplo, o da formao de indol). A amostra
Este ensaio foi planeado para a pesquisa de bactrias da
satisfaz ao ensaio se no se observarem tais colnias ou se as
famlia das Enterobactericeas; apesar disso, reconhece-se
reaces bioqumicas de confirmao forem negativas.
que pode igualmente permitir a pesquisa de outros tipos de
bactrias (por exemplo, Aeromonas e Pseudomonas).
Salmonelas
Pesquisa de bactrias. Prepare a amostra como se indica em
(2.6.12), mas utilizando meio lquido D em vez da soluo Prepare a amostra como se descreve no captulo 2.6.12, mas
de peptona tamponada, com cloreto de sdio, de pH 7,0. utilizando meio lquido A em vez de soluo de peptona
Homogenize a mistura e incube a 35-37C durante um tamponada, com cloreto de sdio, de pH 7,0. Homogenize e
intervalo de tempo, habitualmente compreendido entre 2 e incube a 35-37C durante 18 h a 24 h. Tome 1 ml da cultura
5 h, suficiente para revivificar as bactrias sem, no entanto, enriquecida e semeie em 10 ml de meio lquido I. Incube a
favorecer a sua multiplicao. Homogenize o lquido por 41-43C durante 18 h a 24 h. Efectue subculturas em, pelo
agitao e transfira um volume de lquido (homogenizado menos, 2 meios gelosados diferentes escolhidos de entre os
A) correspondente a 1 g ou 1 ml da amostra para 100 ml de seguintes: meio gelosado J, meio gelosado K, meio gelosado
meio de enriquecimento E. Incube a 35-37C durante 18 a L. Incube a 35-37C durante 18 h a 72 h. O aparecimento
48 h. Efectue subculturas em placas de meio gelosado F e de culturas cujas caractersticas sejam as seguintes indica a
incube a 35-37C durante 18 a 24 h. A amostra satisfaz ao presena provvel de salmonelas:
ensaio se no se desenvolver nenhuma colnia de bactrias em meio gelosado J: colnias bem desenvolvidas incolores,
gram-negativas em qualquer das placas.
em meio gelosado K: colnias bem desenvolvidas,
Determinao quantitativa. Semeie quantidades apropriadas vermelhas, apresentando ou no um centro negro,
de meio de enriquecimento E com o lquido homogenizado
A e/ou com diluies deste contendo, respectivamente, em meio gelosado L: pequenas colnias transparentes,
0,1; 0,01 e 0,001 g (ou 0,1; 0,01 e 0,001 ml) da amostra. incolores ou com colorao entre rsea e branca opaca,
Incube a 35-37C durante 24 a 48 h. A partir de cada cultura muitas vezes rodeadas de uma zona rsea a vermelha.
efectue subculturas em meio gelosado F a fim de isolar Prepare subculturas em meio gelosado M, inoculando
selectivamente as colnias que se desenvolveram. Incube a separadamente algumas colnias suspeitas em superfcie
35-37C durante 18 ha 24 h. Um crescimento de colnias e em profundidade. Aps incubao, o aparecimento
bem desenvolvidas debactrias gram-negativas, geralmente de uma cultura que provoque em profundidade, e no
vermelhas ou avermelhadas,revela contaminao (resultado em superfcie, uma mudana de cor de vermelha para
positivo). Anote aquantidade mnima da amostra que d amarela, acompanhada geralmente de formao de gs na
resultado positivo e a quantidade mxima que d resultado gelose com ou sem produo de sulfureto de hidrognio,
negativo. A partir doquadro determine o nmero provvel constitui um indicativo da presena de salmonelas. Esta
de bactrias por grama ou mililitro de produto a partir do pode ser confirmada por reaces bioqumicas e serolgicas
quadro 1. apropriadas. A amostra satisfaz ao ensaio se no se
Para o exame de adesivos transdrmicos, filtre sobre uma observarem tais colnias ou se as reaces bioqumicas e
membrana estril 50 ml da preparao B obtida como serolgicas de confirmao forem negativas.
descrito no mtodo geral 2.6.12 e transfira a membrana para
100 ml de meio enriquecido E. Incube a 35-37C durante Pseudomonas aeruginosa
18 h a 24 h, depois em meio gelosado F para a pesquisa de
Prepare a amostra conforme descrito no mtodo geral 2.6.12.
enterobactericeas e outras bactrias gram-negativas.
Semeie 100 ml de meio de cultura lquido A com 10 ml da
QUADRO 1 amostra preparada de acordo com as indicaes dadas para
a preparao da amostra (2.6.12) ou com uma quantidade
Resultados para quantidades de produto de correspondente a 1 g ou a 1 ml da amostra. Misture e incube
0,1 g 0,01 g 0,001 g Nmero provvel de a 35-37C durante 18 h a 48 h. Prepare subculturas em
o u 0,1 ml ou 0,01 ml ou 0,001 ml bactrias por grama meio gelosado N e incube a 35-37C durante 18 h a 72 h.
de produto Na ausncia de crescimento de microrganismos a amostra
satisfaz ao ensaio. Se aparecerem colnias de bastonetes
+ + + Mais de 103 gram-negativos, semeie meio lquido A com uma parte das
+ + Menos de 103 e mais de 102
colnias morfologicamente diferentes isoladas e incube a
+ Menos de 102 e mais de 10
41-43C durante 18 h a 24 h. A amostra satisfaz ao ensaio se
Menos de 10
no se observar crescimento a 41-43C.
Para a anlise dos adesivos transdrmicos, filtre 50 ml da
Escherichia coli
preparao A como se descreve no captulo geral 2.6.12 por
Prepare a amostra com se descreve no captulo geral 2.6.12 uma membrana estril e transfira a membrana para 100 ml
e semeie 100 ml do meio lquido A com 10 ml da amostra ou de meio lquido A. Incube a 35-37C durante 18 h a 48 h e, de
com a quantidade correspondente a 1 g ou 1 ml do produto. seguida, passe para meio gelosado N.

Staphylococcus aureus 1. Pesquisa de clostrdeos.

Prepare a amostra como se descreve no captulo 2.6.12 e Tome 2 fraces iguais da amostra, obtida segundo as
semeie 100 ml de meio lquido A com 10 ml da amostra ou indicaes dadas em 2.6.12 para a preparao da amostra, e
com a quantidade correspondente a 1 g ou 1 ml de produto. que correspondam a 1 g ou a 1 ml do produto em anlise.
Homogenize e incube a 35-37C durante 18 h a 48 h. Prepare Aquea uma das fraces a 80C durante 10 min e arrefea
subculturas em meio gelosado O e incube a 35-37C durante rapidamente. No aquea a outra fraco. Inocule 10 ml de cada
fraco de homogenizado em 2 tubos (38 200 mm) ou em
2. Mtodos
18 h a 72 h. O aparecimento de colnias negras de cocos
Analticos
gram-positivos, por vezes rodeadas de uma zona clara, pode outros recipientes apropriados que contenham 100 ml de meio
constituir indcio da presena de S. aureus. Esta pode ser de cultura P. Incube em anaerobiose a 35-37C durante 48 h.
confirmada por ensaios bioqumicos apropriados tais como os Efectue subculturas a partir de cada um dos tubos em meio de
da coagulase e da desoxirribonuclease. A amostra satisfaz ao cultura Q adicionado de gentamicina. Incube em anaerobiose a
ensaio se no se observarem as colnias descritas para o meio 35-37C durante 48 h. Se no se verificar qualquer crescimento,
gelosado O ou se os ensaios bioqumicos de confirmao a amostra satisfaz ao ensaio.
forem negativos. Se se verificar crescimento, efectue subculturas de cada
uma das diferentes formas de colnias em meio de cultura Q
Para a anlise dos adesivos transdrmicos, filtre 50 ml da
sem gentamicina e incube em aerobiose e em anaerobiose.
preparao A como se descreve no captulo geral 2.6.12 por
Um crescimento s em anaerobiose e uma reaco de
uma membrana estril e transfira a membrana para 100 ml catalase negativa em colnias de bacilos gram-positivos
de meio lquido A. Incube a 35-37C durante 18 h a 48 h e, de com ou sem endosporos, indica a presena de estirpes de
seguida, passe para meio gelosado O. Clostridium. Verifique se houve crescimento de colnias
nas 2 placas e efectue a reaco da catalase para excluir a
Avaliao das propriedades nutritivas e selectivas dos meios possibilidade da existncia de estirpes de bacilos aerbios e
e da validade do mtodo utilizado anaerbios facultativos mas com reaco de catalase positiva.
Efectue o teste da catalase quer directamente nas placas, se
Os ensaios que se descrevem a seguir so realizados, no estas apresentarem colnias espaadas e uniformes, quer
mnimo, para cada lote de meio desidratado. indirectamente depois de ter passado para uma lmina
Quando necessrio, proceda do seguinte modo: cultive, porta-objectos de vidro e juntado 1 gota de soluo diluda
separadamente, cada estirpe padro indicada abaixo em tubos de perxido de hidrognio R. O desenvolvimento de bolhas
contendo o meio prescrito a 30-35C durante 18 h a 24 h. gasosas significa uma reaco de catalase positiva.
Staphylococcus aureus por ex.: ATCC 6538 P 2. Contagem de Clostridium perfringens.

(NCIMB 9518, CIP 4.83)
Meio lquido A A partir da amostra obtida segundo as indicaes dadas
em 2.6.12 para a preparao da amostra, prepare diluies
Pseudomonas aeruginosa por ex.: ATCC 9027 a 1/100 e 1/1000 em soluo de peptona tamponada, com
(NCIMB 8626, CIP 82.118) cloreto de sdio, de pH 7,0. Com estas diluies determine
Meio lquido A o nmero mais provvel de bactrias como se descreve
em 2.6.12 para a contagem de germes aerbios viveis totais,
Escherichia coli por ex.: ATCC 8739
semeando de cada vez 1 ml de homogenizado num tubo
(NCIMB 8545, CIP 53.126) (16 160 mm) ou noutro recipiente apropriado contendo 9 ml
Meio lquido A de meio de cultura R e um pequeno tubo de Durham. Misture,
Salmonella typhimurium Meio lquido A agitando o menos possvel. Incube a 45,5-46,5C durante 24 h a
48 h.
No caso da S. typhimurium nenhuma estirpe recomendada. Os tubos apresentam enegrecimento devido ao sulfureto de
Uma salmonela no patognica para o homem pode ser ferro e a formao abundante de gs no tubo de Durham
igualmente escolhida como, por exemplo, Samonella Abony (pelo menos, 1/10 do volume) indica a presena de C.
(NCTC 6017, CIP 80.39). perfringens. Determine o nmero mais provvel de C.
perfringens por meio do quadro 2.
Faa diluies de cada uma das culturas com soluo de
peptona tamponada, com cloreto de sdio, de pH 7,0 de
modo a obter suspenses padro que contenham cerca de Padres
1000 microrganismos viveis por mililitro. Misture volumes
Utilize as estirpes padro seguintes:
iguais de cada suspenso e utilize 0,4 ml (correspondente
aproximadamente a 100 microrganismos de cada estirpe) Mtodo 1: Clostridium sporogenes por exemplo ATCC 19404,
como inculo na pesquisa de E. coli, de P. aeruginosa e de S. (NCTC 532) ou CIP 79.3,
aureus e salmonelas, se necessrio na presena e na ausncia
da amostra. O mtodo utilizado permite a deteco do Mtodo 2: Clostridium perfringens, por exemplo ATCC 13124,
microrganismo pesquisado. (NCIMB 6125 e NCTC 8237, CIP 103409).
Se necessrio, combinar com C. sporogenes para o controlo
Clostrdeos da selectividade e das condies de anaerobiose.
Os ensaios descritos a seguir so estabelecidos para fins A seco seguinte fornecida a ttulo de informao; no
distintos. O primeiro mtodo est indicado para os produtos constitui parte obrigatria da Farmacopeia.
em que essencial excluir os clostrdeos patognicos e para
os quais necessrio comprovar esta ausncia. Estes produtos
do, em geral, uma baixa determinao total. O segundo SOLUO E MEIOS DE CULTURA RECOMENDADOS
mtodo um ensaio semiquantitativo para o Clostridium
perfringens destinado aos produtos em que o nmero destes A soluo e os meios de cultura que seguidamente se
microrganismos constitui um critrio de qualidade. descrevem foram considerados satisfatrios para realizar os

ensaios limite de contaminao microbiana prescritos na Meio gelosado B (meio gelosado com peptonas de casena e
Farmacopeia. No entanto, podem ser utilizados outros meios de soja)
que possuam propriedades nutritivas e selectivas similares Peptona pancretica de casena 15,0 g
para as espcies microbianas pesquisadas. Peptona papanica de soja 5,0 g
QUADRO 2 Valores do nmero mais provvel (NMP) de bactrias Cloreto de sdio 5,0 g
Gelose 15,0 g
2. Mtodos
gua purificada 1000 ml

Analticos
Ajuste o pH para 7,3 0,2, aps a esterilizao. Realize esta

por aquecimento em autoclave a 121C durante 15 min.
Meio gelosado C (meio de Sabouraud glucosado e gelosado

com antibiticos)
Peptonas de carne e de casena 10,0 g
Glucose mono-hidratada 40,0 g
Gelose 5,0 g

Imediatamente antes da utilizao, adicione, por litro de
meio, 0,10 g de benzilpenicilina sdica e 0,10 g de tetraciclina
sob a forma de solues estreis. Estes antibiticos podem
ser substitudos por cloranfenicol na proporo de 50 mg
por litro de meio. O cloranfenicol adicionado antes da
esterilizao em autoclave.
Meio lquido D (meio lquido lactosado)

Extracto de carne 3,0 g
Hidrolisado pancretico de gelatina 5,0 g
Lactose mono-hidratada 5,0 g

por aquecimento em autoclave a 121C durante 15 min e
arrefea imediatamente.
Meio de enriquecimento E (meio de enriquecimento para as

Soluo de peptona tamponada, com cloreto de sdio, enterobactrias Mossel)
de pH 7,0
Fosfato monopotssico 3,6 g Glucose mono-hidratada 5,0 g
Fosfato dissdico di-hidratado 7,2 g (1) Blis de boi desidratada 20,0 g
Cloreto de sdio 4,3 g Fosfato monopotssico 2,0 g
Peptona de carne ou de casena 1,0 g Fosfato dissdico di-hidratado 8,0 g
gua purificada 1000 ml Verde brilhante 15 mg
A esta soluo podem adicionar-se agentes tensioactivos ou
inactivadores de agentes antimicrobianos, por exemplo: Ajuste o pH para 7,2 0,2, aps a esterilizao. Realize
esta por aquecimento a 100C durante 30 min e arrefea
Polissorbato 80 1 g/l a 10 g/l
imediatamente.
Proceda esterilizao por aquecimento em autoclave a
121C durante 15 min. Meio gelosado F (meio gelosado com blis, violeta de cristal,
vermelho neutro e glucose)
Meio lquido A (meio com peptonas de casena e de soja) Extracto de levedura 3,0 g
Peptona pancretica de casena 17,0 g Hidrolisado pancretico de gelatina 7,0 g
Sais biliares 1,5 g
Peptona papanica de soja 3,0 g
Lactose 10,0 g
Fosfato dipotssico 2,5 g
Gelose 15,0 g
Vermelho neutro 30 mg
Ajuste o pH para 7,3 0,2, aps a esterilizao. Realize esta Violeta de cristal 2 mg
por aquecimento em autoclave a 121C durante 15 min. gua purificada 1000 ml
Ajuste o pH para 7,4 0,2, aps aquecimento. Aquea

(1) Equivalente a 0,067 M de fosfato. ebulio, mas no em autoclave.

Meio lquido G (meio lquido de Mac Conkey) Gelose 13,5 g

Desoxicolato de sdio 2,5 g
Tiossulfato de sdio 6,8 g
Citrato frrico e de amnio 0,8 g
Blis de boi desidratada 5,0 g gua purificada 1000 ml
Prpura de bromocresol 10 mg
gua purificada 1000 ml Ajuste o pH para 7,4 0,2, aps o aquecimento. Aquea
2. Mtodos
Analticos
ebulio, arrefea at 50C e distribua em caixas de Petri. No
Ajuste o pH para 7,3 0,2, aps a esterilizao. Realize esta aquea em autoclave.
Meio gelosado L (meio gelosado com verde brilhante,
Meio gelosado H (meio gelosado de Mac Conkey) vermelho de fenol, lactose e sacarose)
Hidrolisado pancretico de gelatina 17,0 g Peptonas de carne e de casena 10,0 g
Peptonas de carne e de casena 3,0 g Extracto de levedura 3,0 g
Lactose mono-hidratada 10,0 g Cloreto de sdio 5,0 g
Cloreto de sdio 5,0 g Lactose mono-hidratada 10,0 g
Sais biliares 1,5 g Sacarose 10,0 g
Gelose 13,5 g Gelose 20,0 g
Vermelho neutro 30 mg Vermelho de fenol 80 mg
Violeta de cristal 1 mg Verde brilhante 12,5 mg
gua purificada 1000 ml gua purificada 1000 ml
Ajuste o pH para 7,1 0,2, aps a esterilizao em autoclave. Aquea ebulio e mantenha durante 1 min. Ajuste o pH
Aquea ebulio e mantenha esta durante 1 min, agitando para 6,9 0,2, aps a esterilizao. Esterilize imediatamente,
constantemente; proceda esterilizao por aquecimento em antes do uso, por aquecimento em autoclave a 121C durante
autoclave a 121C durante 15 min. 15 min. Arrefea a 50C e distribua em caixas de Petri.
Meio gelosado I (meio com tetrationato, blis e verde Meio gelosado M (meio gelosado com ferro e trs acares)
brilhante) Extracto de carne de boi 3,0 g
Extracto de levedura 3,0 g
Peptona 8,6 g
Peptonas de casena e de carne 20,0 g
Blis de boi seca 8,0 g
Carbonato de clcio 20,0 g
Sacarose 10,0 g
Tetrationato de potssio 20,0 g
Verde brilhante 70 mg
Tiossulfato de sdio 0,3 g
Ajuste o pH para 7,0 0,2, aps o aquecimento. Aquea at Vermelho de fenol 25 mg
ebulio. No reaquea. Gelose 12,0 g
Meio gelosado J (meio gelosado com citrato e desoxicolato) Aquea ebulio e mantenha durante 1 min, agitando.
Ajuste o pH para 7,4 0,2, aps a esterilizao em autoclave.
Distribua o meio em tubos at um tero da sua altura;
Peptona de carne 10,0 g
esterilize por aquecimento em autoclave a 121C durante
15 min e arrefea em posio oblqua de modo a obter uma
Citrato de sdio 20,0 g
parte profunda e uma superfcie inclinada.
Citrato frrico 1,0 g
Desoxicolato de sdio 5,0 g
Gelose 13,5 g Vermelho neutro 20 mg Meio gelosado N (meio gelosado com cetrimida)
gua purificada 1000 ml Hidrolisado pancretico de gelatina 20,0 g
Cloreto de magnsio 1,4 g
Ajuste o pH para 7,3 0,2, aps o aquecimento.
Sulfato dipotssico 10,0 g
Aquea lentamente ebulio e deixe ferver durante 1 min. Cetrimida 0,3 g
Arrefea at 50C e distribua em caixas de Petri. No aquea Gelose 13,6 g
em autoclave. Agua purificada 1000 ml
Glicerina 10,0 ml
Meio gelosado K (meio gelosado com xilose, lisina e
desoxicolato) Aquea ebulio e mantenha durante 1 min, agitando.
Xilose 3,5 g por aquecimento em autoclave a 121C durante 15 min.
l-Lisina 5,0 g
Meio gelosado O (meio de Baird-Parker)
Sacarose 7,5 g
Cloreto de sdio 5,0 g Peptona pancretica de casena 10,0 g
Extracto de levedura 3,0 g Extracto de carne 5,0 g
Vermelho de fenol 80 mg Extracto de levedura 1,0 g

Cloreto de ltio 5,0 g Meio gelosado S (R2A)

Gelose 20,0 g
Glicina 12,0 g
Peptona proteose 0,5 g
Piruvato de sdio 10,0 g
Glucose 0,5 g
Amido 0,5 g
Aquea ebulio e mantenha durante 1 min, agitando Fosfato dipotssico 0,3 g
2. Mtodos
Analticos
frequentemente. Ajuste o pH para 6,8 0,2, aps a Sulfato de magnsio anidro 0,024 g
esterilizao. Realize esta por aquecimento em autoclave a Piruvato de sdio 0,3 g
121C durante 15 min, arrefea at 45-50C e adicione 10 ml Gelose 15,0 g
de uma soluo estril de telurito de potssio a 10 g/l e 50 ml gua purificada 1000 ml
de emulso de gema de ovo.
Ajuste o pH para 7,2 0,2 aps a esterilizao. Proceda
esterilizao por aquecimento na autoclave a 121C durante
Meio P (meio reforado para clostrdeos) 15 min.
Extracto de carne de boi 10,0 g
Peptona 10,0 g
AGENTES NEUTRALIZANTES
Amido solvel 1,0 g
Podem adicionar-se agentes neutralizantes para neutralizar
uma eventual actividade antimicrobiana. Podem ser
Cloridrato de cistena 0,5 g
adicionados soluo de peptona tamponada, com cloreto de
sdio, de pH 7,0, de preferncia antes da esterilizao. A sua
Acetato de sdio 3,0 g
eficcia e no toxicidade em relao aos microrganismos em
Gelose 0,5 g
causa tem sido demonstrada.
Deixe intumescer a gelose e dissolva aquecendo ebulio, Composio de uma soluo neutralizante tipo.
agitando continuamente. Se necessrio, ajuste o pH para
Polissorbato 80 30 g
que fique prximo de 6,8 depois da esterilizao. Proceda
Lecitina da gema de ovo 3 g
esterilizao em autoclave a 121C durante 15 min.
Cloridrato de histidina 1 g
Peptona de carne ou de casena 1 g
Meio Q (gelose Colmbia) Cloreto de sdio 4,3 g
Peptona pancretica de casena 10,0 g Fosfato monopotssico 3,6 g
Peptona pptica de carne 5,0 g Fosfato dissdico di-hidratado 7,3 g
Extracto de levedura 5,0 g Agua purificada 1000 ml
Amido de milho 1,0 g Cloreto de sdio 5,0 g
Esterilize por aquecimento em autoclave a 121C durante 15 min.
Gelose, segundo o poder gelificante 10,0 a 15,0 g
gua purificada 1000 ml Se o poder neutralizante da soluo no suficiente, pode
aumentar-se o teor em polissorbato 80 ou em lecitina, ou
Deixe intumescer a gelose e dissolva aquecendo ebulio ainda, adicionar os agentes neutralizantes que constam no
agitando continuamente. Se necessrio, ajuste o pH para quadro 3.
que fique prximo de 6,8 depois da esterilizao. Proceda
esterilizao em autoclave a 121C durante 15 min. Deixe
QUADRO 3 Inactivadores dos agentes antimicrobianos a adicionar
arrefecer at 45-50C; se necessrio, junte sulfato de
soluo tampo peptonada com cloreto de sdio de pH 7,0
gentamicina correspondente a 20 mg de gentamicina base e
distribua em caixas de Petri.
Meio R (meio de lactose sulfito)

Peptona pancretica de casena 5,0 g
Lactose 10,0 g
Dissolva, ajuste o pH para 7,1 0,1 e distribua em tubos

de 16 160 mm, contendo um pequeno tubo de Durham,
razo de 8 ml em cada tubo. Proceda esterilizao em
autoclave a 121C durante 15 min e conserve a 4C.
Antes da utilizao, aquea o meio em banho de gua durante
5 min e arrefea. Em seguida, junte a cada tubo 0,5 ml de
soluo a 12 g/l de metabissulfito de sdio e 0,5 ml de soluo
a 10 g/l de citrato frrico e de amnio, solues preparadas
extemporaneamente e filtradas por membrana de 0,45 m de
porosidade.

B. METODO HARMONIZADO Salmonella enterica ssp. enterica serotipo typhimurium:

por exemplo ATCC 14028; ou Salmonella enterica ssp.
enterica serotipo abony: por exemplo NBRC 100797, NCTC
1. INTRODUO 6017, CIP 80.39,
Os ensaios descritos a seguir permitem controlar a ausncia Candida alhicans: por exemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP
ou a presena limitada de microrganismos especficos que 48.72, NBRC 1594.
2. Mtodos
podem ser evidenciados nas condies descritas.
Analticos
Utilize a soluo de peptona tamponada com cloreto de sdio
Os ensaios destinam-se em primeiro lugar a determinar se de pH 7,0 ou a soluo tampo de fosfatos de pH 7,2 para
uma substncia ou preparao satisfaz a uma especificao preparar as suspenses testemunhas. Utilize as suspenses
pr-estabelecida em matria de qualidade microbiolgica. dentro de 2 horas, ou 24 h se forem conservadas a 2-8C.
Convm neste caso seguir as instrues dadas a seguir,
incluindo o nmero de amostras a serem colhidas e a 3-1-2. Clostrdeos. Utilize a estirpe de Clostridium
interpretao dos resultados. sporogenes, por exemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB
12343, C7P 100651)ou ATCC 19404 (NCTC 532 ou CIP 79.03)
Mtodos microbiolgicos alternativos, incluindo mtodos ou NBRC 14293. Cultive a estirpe clostridiana de referncia
automatizados, podem ser utilizados desde que a sua em condies anaerbias no meio reforado para clostrdeos,
equivalncia aos mtodos da Farmacopeia tenha sido a 30-35C durante 18-24 h. Pode-se tambm em vez de
demonstrada. preparar e depois diluir uma suspenso fresca de clulas
vegetativas de Cl. sporogenes, utilizar para a inoculao
uma suspenso estvel de esporos. Esta suspenso pode ser
2. PRECAUES GERAIS
mantida a 2-8C durante um perodo validado.
Prepare as amostras como se descreve em 2.6.12 Parte B.
3-2. TESTEMUNHA NEGATIVA
Mtodo harmonizado.
Para verificar as condies do ensaio, efectue um controlo
Quando a amostra possui actividade antimicrobiana, sempre
numa testemunha negativa preparada substituindo a
que possvel esta eliminada ou neutralizada como se
amostra pelo diluente escolhido. No se observa crescimento
descreve em 2.6.12 Parte B. Mtodo harmonizado.
microbiano.
Quando se utilizam na preparao das amostras agentes
tensioactivos, deve demonstrar-se a ausncia de toxicidade 3-3. FERTILIDADE E PROPRIEDADES INIBIDORAS
para os microrganismos considerados e a sua compatibilidade DOS MEIOS
com os inactivadores utilizados, como se descreve em 2.6.12
Parte B. Mtodo harmonizado. Efectue este controlo em cada lote de meio, quer seja
comprado pronto a usar ou preparado a partir de um meio
desidratado ou com os ingredientes descritos.
3. FERTILIDADE E PROPRIEDADES INIBIDORAS Verifique se os meios apresentam as propriedades pretendidas
DOS MEIOS, APLICABILIDADE DO MTODO DE ENSAIO (ver quadro 4).
Controlo da fertilidade, meios lquidos: Semeie uma
Deve ser demonstrada a aptido do mtodo em detectar os amostra do meio apropriado com um pequeno nmero (100
microrganismos na presena do produto. A aplicabilidade UFC, no mximo) do microrganismo apropriado.Incube
do mtodo de ensaio deve ser confirmada sempre que se temperatura especificada durante um perodo inferior ou
faz uma alterao no procedimento ou no produto que seja igual ao perodo mnimo especificado para o ensaio. Observa-
susceptvel de afectar os resultados. -se um crescimento claramente visvel do microrganismo,
comparvel ao obtido com um lote de meio anteriormente
3-1. PREPARAO DAS ESTIRPES DE REFERNCIA controlado e aprovado.
Utilize suspenses das estirpes de referncia normalizadas Controlo da fertilidade, meios slidos: proceda pelo mtodo
estveis ou prepare suspenses como se indica a seguir. de sementeira superfcie, semeando um pequeno nmero
As culturas so efectuadas segundo um sistema de lote (100 UFC, no mximo) do microrganismo apropriado. Incube
semente de modo que os microrganismos viveis utilizados temperatura especificada durante um perodo inferior ou
para a inoculao no tenham sido submetidos a mais de 5 igual ao perodo mnimo especificado para o ensaio. Observa-
passagens a partir do lote semente primrio de origem. se um crescimento comparvel ao obtido com um lote de
meio anteriormente controlado e aprovado.
3-1-1. Microrganismos aerbios. Cultive separadamente Controlo das propriedades inibidoras, meios lquidos ou
cada uma das estirpes bacterianas e fngicas de referncia slidos: semeie o meio apropriado com, pelo menos,
em meio lquido com peptonas de casena e de soja ou em 100 UFC do microrganismo apropriado. Incube
meio gelosado com peptonas de casena e de soja, a 30-35C temperatura especificada durante um perodo igual ou
durante 18-24 h, e a estirpe de Candida albicans em meio superior ao perodo mximo especificado para o ensaio. No
de Sabouraud glucosado e gelosado ou em meio lquido de se observa nenhum crescimento do microrganismo.
Sabouraud glucosado a 20-25C durante 2-3 dias.
Controlo das propriedades indicativas: proceda pelo mtodo
Staphylococcus aureus: por exemplo ATCC 6538, NCIMB de sementeira superfcie, semeando um pequeno nmero
9518, CIP 4.83, NBRC 13276, (100 UFC, no mximo) do microrganismo apropriado.
Incube temperatura especificada durante um perodo
Pseudomonas aeruginosa: por exemplo ATCC 9027, NCIMB
compreendido no intervalo especificado para o ensaio. As
8626, CIP 82.118, NBRC 13275, colnias so comparveis, quanto ao aspecto e s reaces
Escherichia coli: por exemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, indicativas observadas, s obtidas com um lote de meio
CIP 53.126, NBRC 3972, anteriormente controlado e aprovado.

QUADRO 4 Fertilidade, propriedades inibidoras e indicativas dos meios

2. Mtodos
Analticos
3-4. APLICABILIDADE DO MTODO DE ENSAIO 4. CONTROLO DOS PRODUTOS
Para cada amostra, proceda sua preparao como se 4-1. BACTRIAS GRAM-NEGATIVAS RESISTENTES AOS
descreve no pargrafo apropriado da seco 4. Na altura SAIS BILIARES
da mistura, adicione cada estirpe de referncia, no meio
prescrito. Efectue o ensaio individualmente com cada estirpe 4-1-1. Preparao da amostra e pr-incubao.
de referncia. Utilize na amostra, aps a sementeira, um
Prepare uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12
nmero de microrganismos equivalente, no mximo, a Parte B. Mtodo harmonizado, utilizando uma diluio a 1/10
100 UFC. de, pelo menos, 1 g da amostra, mas tendo como diluente o
Efectue o ensaio como se descreve no pargrafo apropriado meio lquido de peptonas de casena e de soja. Misture, depois
da seco 4 incubando durante o perodo mnimo prescrito. incube a 20-25C durante um perodo de tempo suficiente
para assegurar a revivificao das bactrias, mas insuficiente
As reaces indicativas descritas no pargrafo para permitir a sua multiplicao (geralmente 2 h mas no
apropriado da seco 4 demonstram a presena dos mais do que 5 h).
microrganismosespecificados.
4-1-2. Ausncia destas bactrias. Salvo indicao em
Se o produto apresenta uma actividade antimicrobiana, contrrio, utilize o volume de inculo correspondente a
necessrio introduzir as alteraes necessrias ao 1 g do produto preparado como se descreve em 4-1-1, para
procedimento do ensaio (ver captulo 2.6.12 Parte B. Mtodo semear o meio de enriquecimento para enterobactrias
harmonizado, pargrafo 4-5-3). Mossel. Incube a 30-35C durante 24-48 h. Repique para
Se for difcil neutralizar a actividade antimicrobiana exercida meio gelosado com blis, violeta de cristal e glucose e incube
por um determinado produto sobre um microrganismo a 30-35C durante 18-24 h.
em que seja prescrita a sua pesquisa, presume-se que o O produto satisfaz ao ensaio se no for observado o
microrganismo nunca estar presente no produto. crescimento de colnias.

QUADRO 5 Interpretao dos resultados 4-3-3. Interpretao. O crescimento de colnias vermelhas

Resultados para quantidades de produto de
bem desenvolvidas, com ou sem centro negro, indica a
presena possvel de salmonelas, para ser confirmado com
0,1 g 0,01 g 0,001 g Nmero provvel de ensaios de identificao.
ou 0,1 ml ou 0,01 ml ou 0,001 ml bactrias por grama ou
O produto satisfaz ao ensaio se no se observar a presena
mililitro de produto
de qualquer colnia do tipo descrito ou se os ensaios de
confirmao de identificao forem negativos.
2. Mtodos
+ + + > 103
Analticos
+ + < 103 e > 102
4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
+ < 102 e > 10
4-4-1. Preparao da amostra e pr-incubao. Prepare
< 10 uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12 (Parte
B. Mtodo harmonizado, pargrafo 4-5-3), utilizando uma
4-1-3. Ensaio quantitativo diluio a1/10 de, pelo menos, 1 g da amostra, e semeie uma
quantidade apropriada (determinada como se descreve em
4-1-3-1. Seleco e subcultura. Semeie quantidades 3-4) de meio lquido de peptonas de casena e de soja com
apropriadas de meio de enriquecimento para enterobactrias 10 ml da amostra ou a quantidade correspondente a 1 g ou
Mossel com a preparao descrita em 4-1-1 e/ou diluies 1 ml de produto. Misture. Para os dispositivos transdrmicos,
desta preparao contendo respectivamente 0,1 g, 0,01 g e filtre atravs de uma membrana estril o volume de amostra
0,001 g (ou 0,1 ml, 0,01 ml e 0,001 ml) da amostra. Incube a correspondente a 1 adesivos, preparado como se descreve
30-35C durante 24-48 h. Repique cada uma destas culturas no captulo 2.6.12 (Parte B. Mtodo harmonizado, pargrafo
para meio gelosado com blis, violeta de cristal e glucose. 4-5-1), e depois transfira a membrana para 100 ml de meio
Incube a 30-35C durante 18-24 h. lquido de peptonas de casena e de soja. incube a 30-35C
durante 18-24 h.
4-1-3-2. Interpretao. O crescimento de colnias constitui
um resultado positivo. Registe a mais pequena quantidade de 4-4-2. Seleco e subcultura. Repique para meio gelosado de
produto que d um resultado positivo e a maior quantidade cetrimida e incube a 30-35C durante 18-72 h.
de produto que d um resultado negativo. Calcule o nmero
provvel de bactrias atravs do quadro 5.
4-4-3. Interpretao. O crescimento de colnias indica a
presena possvel de P. aeruginosa para ser confirmado com
4-2. ESCHERICHIA COLI ensaios de identificao.
4-2-1. Preparao da amostra e pr-incubao. Prepare O produto satisfaz ao ensaio se no se observar a presena
uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12 (Parte de qualquer colnia ou se os ensaios de confirmao de
B. Mtodo harmonizado), utilizando uma diluio a 1/10 identificao forem negativos.
de, pelo menos, 1 g da amostra, e semeia uma quantidade
apropriada (determinada como se descreve em 3-4) de 4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
meio lquido de peptonas de casena e de soja com 10 ml da
amostra ou a quantidade correspondente a 1 g ou 1 ml de 4-5-1. Preparao da amostra e pr-incubao. Prepare
produto. Misture e incube a 30-35C durante 18-24 h. uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12 Parte B.
Mtodo harmonizado, utilizando uma diluio a 1/10 de, pelo
4-2-2. Seleco e subcultura. Agite o recipiente, e depois menos, 1 g da amostra, e semeie uma quantidade apropriada
transfira 1 ml do meio lquido de peptonas de casena e de (determinada como se descreve em 3-4) de meio lquido
soja para 100 ml de meio lquido de Mac Conkey e incube de peptonas de casena e de soja com 10 ml da amostra ou
a 42-44C durante 24-48 h. Repique para meio gelosado de a quantidade correspondente a 1 g ou 1 ml de produto.
Mac Conkey e incube a 30-35C durante 18-72 h. Misture. Para os adesivos transdrmicos, filtre atravs de uma
membrana estril o volume de amostra correspondente a 1
4-2-3. Interpretao. O crescimento de colnias indica adesivo, preparado como se descreve no captulo 2.6.12 (Parte
a presena possvel de E. coli, para ser confirmado com B. Mtodo harmonizado, pargrafo 4-5-1), e depois transfira
ensaios de identificao. O produto satisfaz ao ensaio se a membrana para 100 ml de meio lquido de peptonas de
no se observar a presena de qualquer colnia ou se os casena e de soja. Incube a 30-35C durante 18-24 h.
ensaios de confirmao de identificao forem negativos.
4-5-2. Seleco e subcultura. Repique para meio gelosado de
4-3. SALMONELAS manitol-sal e incube a 30-35C durante 18-72 h.
4-3-1. Preparao da amostra e pr-incubao. Prepare 4-5-3. Interpretao. O crescimento de colnias amarelas/
uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12 (Parte B. /brancas envolvidas por uma zona amarela indica a presena
Mtodo harmonizado), e semeia uma quantidade apropriada possvel de S. aureus, para ser confirmada com ensaios de
(determinada como se descreve em 3-4) de meio lquido identificao.
de peptonas de casena e de soja com uma quantidade de
O produto satisfaz ao ensaio se no se observar a presena
amostra correspondente, pelo menos, a 10 g ou 10 ml de
produto. Misture e incube a 30-35C durante 18-24 h.
4-3-2. Seleco e subcultura. Transfira 0,1 ml do meio
4-6. CLOSTRDEOS
lquido de peptonas de casena e de soja para 10 ml de meio
lquido de enriquecimento para salmonelas Rappaport- 4-6-1. Preparao da amostra e tratamento pelo calor.
-Vassiliadis e incube a 30-35C durante 18-24 h. Repique para Prepare uma amostra como se descreve no captulo 2.6.12
meio gelosado com xilose, lisina e desoxicolato e incube a (Parte B. Mtodo harmonizado). Colha 2 fraces iguais da
30-35C durante 18-48 h. amostra correspondentes cada uma a, pelo menos, 1 g ou

1 ml de produto. Aquea uma delas a 80C durante 10 min e Meio lquido com peptonas de casena e de soja
arrefea rapidamente. No aquea a outra.
4-6-2. Seleco e subcultura. Transfira 10 ml de cada uma Peptona papanica de soja 3,0 g
das fraces homogeneizadas para 2 recipientes apropriados Cloreto de sdio 5,0 g
contendo 100 ml de meio reforado para clostrdeos. Incube Fosfato dipotssico 2,5 g
em anaerobiose a 30-35C durante 48 h. Aps incubao, Glucose mono-hidratada 2,5 g
2. Mtodos
Analticos
efectue a partir de cada recipiente uma repicagem para meio gua purificada 1000 ml
gelosado Colmbia, e depois incube em anerobiose a 30-35 C
durante 48h. Ajuste o pH para 7,3 0,2 a 25C, aps esterilizao.
Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
4-6-3. Interpretao. O crescimento anaerbio de bastonetes
(com ou sem endosporos) dando uma reaco negativa da Meio gelosado com peptonas de casena e de soja
catalase indica a presena de clostrdeos. O produto satisfaz
ao ensaio se no se observar qualquer crescimento bacteriano Peptona pancretica de casena 15,0 g
anaerbio no meio gelosado Colmbia ou se o teste da Peptona papanica de soja 5,0 g
catalase for positivo. Cloreto de sdio 5,0 g
Gelose 15,0 g
4-7. CANDIDA ALBICANS gua purificada 1000 ml
4-7-1. Preparao da amostra e pr-incubao. Prepare uma
amostra como se descreve no captulo 2.6.12 Parte B. Mtodo Ajuste o pH para 7,3 0,2 a 25C, aps esterilizao.
harmonizado e semeia 100 ml de meio lquido de Sabouraud Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
glucosado com 10 ml da amostra ou uma quantidade
correspondente a 1 g ou 1 ml de produto. Misture e depois
incube a 30-35C durante 3-5 dias. Meio de Sabouraud glucosado e gelosado
Glucose 40,0 g
4-7-2. Seleco e subcultura. Repique para meio gelosado Mistura de peptona pptica de tecido animal e de peptona
Sabouraud glucosado e incube a 30-35C durante 24-48 h. pancretica de casena (1:1) 1,0 g
Gelose 15,0 g
4-7-2. Interpretao. O crescimento de colnias brancas gua purificada 1000 ml
indica a presena de C. albicans, para ser confirmado com
ensaios de identificao. Ajuste o pH para 5,6 0,2 a 25C, aps esterilizao.
O produto satisfaz ao ensaio se no se observar a presena Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
Meio glucosado e gelosado com batata
A seco descrita a seguir dada a ttulo informativo.
Infuso de batata 200,0 g
Glucose 20,0 g
5. SOLUES E MEIOS DE CULTURA RECOMENDADOS Gelose 15,0 g
As solues e os meios de cultura seguintes so considerados
satisfatrios para a realizao dos ensaios de contaminao Ajuste o pH para 5,6 0,2 a 25C. aps esterilizao.
microbiana prescritos na Farmacopeia. Podem ser utilizados Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
outros meios se possurem as propriedades de fertilidade e
inibio de crescimento equivalentes.
Meio lquido de Sabouraud glucosado
Soluo tampo-me. Transfira para um balo graduado de
1000 ml, 34 g de fosfato monopotssico, dissolva em 500 ml Glucose 20,0 g
de gua purificada, ajuste com hidrxido de sdio o pH para Mistura de peptona pptica de tecido
7,2 0,2, complete 1000,0 ml com gua purificada e misture. animal e de peptona pancretica de casena (1:1) 10,0 g
Distribua em recipientes e esterilize. Conserva a temperatura gua purificada 1000 ml
em 2-8C.
Ajuste o pH para 5,6 0,2 a 25C, aps esterilizao.
Soluo tampo de fosfato de pH7.2 Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
Prepare uma mistura de soluo tampo me e de gua
destilada (1:800 V/V) e esterilize. Meio de enriquecimento para as enterobactrias Mossel
Soluo de peptona tamponada, com cloreto de sdio, Glucose mono-hidratada 5,0 g
de pH 7,0 Blis de boi desidratada 20,0 g
Fosfato monopotssico 3,6 g Fosfato monopotssico 2,0 g
Fosfato dissdico di-hidratado 7,2 g equivalente a 0,067 M de fosfato Fosfato dissdico di-hidratado 8,0 g
Cloreto de sdio 4,3 g Verde brilhante 15 mg
Peptona de carne ou de casena 1,0 g gua purificada 1000 ml
Ajuste o pH para 7,2 0,2 a 25C, aps aquecimento. Aquea
Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado. a 100C durante 30 min e arrefea imediatamente.

Meio gelosado com blis, violeta de cristal e glucose Tiossulfato de sdio 6,8 g
Sais biliares 1,5 g Ajuste o pH para 7,4 0,2 a 25C, aps o aquecimento.
Cloreto de sdio 5,0 g Aquea ebulio, arrefea at 50C e distribua em placas.
Glucose mono-hidratada 10,0 g No aquea em autoclave.
2. Mtodos
Analticos
Gelose 15,0 g
Vermelho neutro 30 mg
Meio gelosado com cetrimida
Violeta de cristal 2 mg
gua purificada 1000 ml Hidrolisado pancretico de gelatina 20,0 g
Cloreto de magnsio 1,4 g
Ajuste o pH para 7,1 0,2 a 25C, aps aquecimento. Aquea Sulfato dipotssico 10,0 g
ebulio, mas no em autoclave. Cetrimida 0,3 g
Gelose 13,6 g
Meio lquido de Mac Conkey gua purificada 100 ml
Glicerina 10,0 ml
Lactose mono-hidratada 10,0 g Aquea ebulio e mantenha durante 1 min, agitando.
Blis de boi desidratada 5,0 g Ajuste o pH para 7,2 0,2 a 25C, aps a esterilizao.
Prpura de bromocresol 10 mg Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado.
Ajuste o pH para 7,3 0,2 a 25C, aps esterilizao. Meio gelosado manitol-sal
Esterilize em autoclave segundo um ciclo validado. Peptona pancretica de casena 5,0 g
Peptona pptica de tecido animal 5,0 g
Meio gelosado de Mac Conkey Extracto de carne de boi 1,0 g
D-Manito1 10,0 g
Peptonas de carne e de casena 3,0 g
Gelose 15,0 g
Vermelho de fenol 0,025 g
Sais biliares 1,5 g
Gelose 13,5 g Aquea ebulio e mantenha durante 1 min, agitando.
Vermelho neutro 30 mg Ajuste o pH para 7,4 0,2 a 25 C, aps esterilizao.
Violeta de cristal 1 mg Esterilize em autoclave segundo um ciclo calibrado.
Ajuste o pH para 7,1 0,2, aps esterilizao. Aquea Meio reforado para clostrdeos
ebulio e mantenha esta durante 1 min, agitando Extracto de carne de boi 10,0 g
constantemente, depois esterilize em autoclave segundo um Peptona 10,0 g
ciclo validado. Peptona pancretico de corao 3,0 g
Meio lquido de enriquecimento para salmonelas Rappaport- Amido solvel 1,0 g
Vassiliadis Glucose mono-hidratada 5,0 g
Peptona de soja 4,5 g
Cloreto de magnsio hexa-hidratado 29,0 g
Acetato de sdio 3,0 g
Fosfato dipotssico 0,4 g Gelose 0,5 g
Fosfato monopotssico 0,6 g gua purificada 1000 ml
Verde de malaquite 0,036 g
Deixe intumescer a gelose e dissolva aquecendo ebulio,
agitando continuamente. Se necessrio, ajuste o pH para
Dissolva aquecendo ligeiramente. Esterilize em autoclave 6,8 0,2 a 25C, aps a esterilizao. Esterilize em autoclave
segundo um ciclo validado, a uma temperatura que segundo um ciclo validado.
no ultrapasse 115C. O pH deve ser de 5,20,2 aps
aquecimento e autoclavagem. Meio gelosado Colmbia
Meio gelosado com xilose, lisina e desoxicolato Peptona pptica de carne 5,0 g
Xilose 3,5 g Peptona pancretica de corao 3,08 g
L-Lisina 5,0 g Extracto de levedura 5,0 g
Lactose mono-hidratada 7,5 g Amido de milho 1,0 g
Sacarose 7,5 g Cloreto de sdio 5,0 g
Cloreto de sdio 5,0 g Gelose, consoante o poder gelificante 10,0 a 15,0 g
Extracto de levedura 3,0 g gua purificada 1000 ml
Vermelho de fenol 80 mg
Gelose 13,5 g Deixe intumescer a gelose e dissolva, aquecendo ebulio
Desoxicolato de sdio 2,5 g agitando continuamente. Se necessrio, ajuste o pH para

2.6.14. Endotoxinas bacterianas
7,3 0,2 a 25C, aps a esterilizao. Esterilize em autoclave Preparao das solues padro de endotoxina
segundo um ciclo validado. Deixe arrefecer at 45-50C; se
necessrio, junte sulfato de gentamicina correspondente a Aps agitar energicamente a soluo me padro de
20 mg de gentamicina base e distribua em caixas de Petri. endotoxina, prepare as sries de diluies apropriadas a
partir da soluo me com gua para ensaio de endotoxinas
bacterianas (gua EEB).
2.6.14. ENDOTOXINAS BACTERIANAS Utilize estas solues to rapidamente quanto possvel para
2. Mtodos
Analticos
evitar uma eventual perda de actividade por adsoro.

O ensaio das endotoxinas bacterianas destina-se deteco
ou quantificao das endotoxinas produzidas por bactrias
gram-negativas por meio de um lisado de amebcitos de Preparao das solues problema
lmulo (Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus). Prepare as solues problema dissolvendo ou diluindo a
Pode ser realizado por meio de uma de trs tcnicas: amostra (substncia activa ou preparao farmacutica) em
gelificao (induo da formao de um gel), turbidimetria gua EEB. Para a dissoluo ou diluio de certas substncias
(desenvolvimento de uma turvao por libertao de um ou preparaes pode ser mais apropriado o emprego de
substrato endgeno), colorimetria (desenvolvimento de outras solues aquosas. Se necessrio, ajuste o pH da
uma colorao por libertao de um complexo peptdeo soluo problema ou da diluio utilizada de modo que a
cromognico sinttico). mistura desta soluo e do lisado tenha um pH dentro do
No presente captulo descrevem-se seis mtodos: intervalo especificado pelo fabricante do lisado. Normalmente
produtos de pH compreendido entre 6,0 e 8,0 satisfazem a
Mtodo A. Gelificao: ensaio limite esta exigncia. O ajuste do pH pode ser efectuado por meio de
um cido, uma base ou um tampo apropriado, segundo as
Mtodo B. Gelificao: ensaio semiquantitativo
recomendaes do fabricante do lisado. Os cidos e as bases
Mtodo C. Turbidimetria cintica podem ser preparados a partir de solues concentradas ou de
slidos com gua EEB em recipientes isentos de endotoxinas
Mtodo D. Colorimetria cintica detectveis. comprovada nos tampes a ausncia de
Mtodo E. Colorimetria no ponto de equivalncia endotoxinas detectveis e de factores de interferncia.
Mtodo F. Turbidimetria no ponto de equivalncia
Determinao da Diluio Mxima Significativa
Efectue o ensaio por um dos mtodos descritos. Em caso
de dvida ou litgio, a deciso final tomada com base A Diluio Mxima Significativa (DMS) a diluio mxima
nos resultados obtidos pelo mtodo A salvo indicao em de uma amostra na qual ainda se pode determinar o limite
contrrio na monografia. em endotoxinas. calculada usando a expresso:
O ensaio efectuado em condies que permitam evitar DMS = limite em endotoxinas concentrado da soluo problema
qualquer contaminao por endotoxinas.
limite em endotoxinas: o limite em endotoxinas de uma
Aparelhagem substncia para administrao por via parentrica, definido
numa base
Despirogene numa estufa de ar quente por um mtodo K
validado, todo o material de vidro e outros elementos da posolgica, igual a em que
M
aparelhagem resistentes ao calor. A durao e a temperatura
mnimas de aquecimento so geralmente 30 mm a 250C. Se K = dose limiar de endotoxinas com efeito pirognico, por
for utilizada aparelhagem de plstico (por exemplo, placas quilograma de massa corporal e por hora
de microtitulao ou pontas de pipetas para distribuidores M = dose mxima recomendada para a substncia, por quilograma
automticos), verificada a ausncia detectvel de da massa corporal e por hora.
contaminao por endotoxinas e a ausncia de interferncias
deste material no ensaio. O limite em endotoxinas para os produtos para administrao
por via parentrica especificado em U.I./ml. U.I./mg.
NOTA. Neste captulo o termo tubo emprega-se para U.I./Unidade de actividade biolgica, etc., nas monografias.
designar todos os tipos de recipientes, por exemplo as
Concentrao da soluo problema:
cavidades das placas de microtitulao.
em mg/ml se o limite em endotoxinas for especificado em
Preparao da soluo me padro de endotoxina relao massa (U.I./mg),
Prepare uma soluo me padro de endotoxina a partir de em Unidades/ml se o limite em endotoxinas for especificado
uma preparao padro de endotoxina calibrada em relao em relao actividade biolgica (U.I./Unidade),
ao padro internacional, por exemplo o padro de endotoxina em ml/ml se o limite em endotoxinas for especificado em
PBR. relao ao volume (U.I./ml).
O teor em endotoxinas exprime-se em Unidades = para a tcnica de gelificao, sensibilidade declarada do lisado
Internacionais (U.I.). A correspondncia entre a Unidade (U.I./ml); para as tcnicas turbidimtricas e colorimtricas,
Internacional e o padro internacional indicada pela ponto mais baixo utilizado na curva de calibrao.
Organizao Mundial de Sade.
NOTA: uma Unidade Internacional (U.I.) de endotoxina
TCNICA DE GELIFICAO (MTODOS A e B)
equivale a uma Unidade de Endotoxina (U.E).
Para a preparao e conservao da soluo me padro de A tcnica de gelificao permite a deteco ou a quantificao
endotoxina, siga as instrues que figuram no rtulo e na das endotoxinas graas propriedade que o lisado possui de
literatura. coagular em presena de endotoxinas. A concentrao de

endotoxinas necessria para produzir a coagulao do lisado logaritmos das concentraes no ponto de equivalncia e
nas condies normalizadas a sensibilidade declarada do depois o antilogaritmo deste valor, usando a expresso:
lisado. Para assegurar a fidelidade e a validade do ensaio,
Mdia geomtrica da concentrao no ponto de
efectuam-se os ensaios de controlo preliminares descritos
em 1 para confirmar a sensibilidade declarada e verificar a e
ausncia de factores de interferncia. equivalncia = antilog
f
2. Mtodos
Analticos
1. CONTROLOS PRELIMINARES e = soma das concentraes no ponto de equivalncia em valores
logartmicos, obtidas nas sries de diluies utilizadas,
(i) Confirmao da sensibilidade declarada do lisado
f = nmero de exemplares.
Antes de utilizar o lisado para a realizao do ensaio,
confirme a sensibilidade declarada da soluo do lisado, O valor assim obtido a sensibilidade determinada da soluo
expressa em U.I./ml com uma srie de solues preparada do lisado em U.I./ml. Se este valor estiver compreendido
em quadriplicado. Este controlo efectuado cada vez que entre 0,5 e 2 , a sensibilidade declarada est confirmada e
um novo lote de lisado utilizado ou que so realizadas utilizada para os ensaios realizados com o mesmo lisado.
modificaes nas condies experimentais do ensaio
(ii) Pesquisa de factores de interferncia
susceptveis de afectar o resultado do ensaio.
Prepare as solues A, B, C e D como se indica no quadro
Prepare em quadriplicado uma srie de solues padro que,
1 e utilize solues problema de diluio inferior DMS
no mnimo, compreenda concentraes equivalentes a 2 , ,
0,5 e 0,25 diluindo a soluo me padro de endotoxina no contendo endotoxinas detectveis. Proceda como se
com gua EEB. descreve em 1. Controlos preliminares (i) Confirmao da
sensibilidade declarado do lisado.
Misture em cada um dos tubos um volume igual (0,1 ml, por
exemplo) da soluo do lisado e uma das solues padro. Determine a mdia geomtrica da concentrao no ponto
Se o lisado utilizado foi liofilizado em ampolas ou frascos de equivalncia para as solues B e C usando a expresso
unidose, junte directamente as solues nos frascos ou indicada em 1. Controlos preliminares (i) Confirmao da
nas ampolas. Incube a mistura durante um certo tempo, sensibilidade declarada do usado.
de acordo com as recomendaes do fabricante do lisado A pesquisa de factores de interferncia efectuada cada vez
(geralmente 37 1C durante 60 2 min), evitando qualquer que modificaes susceptveis de afectar o resultado do ensaio
vibrao. Verifique a integridade dos geles: para os tubos, se efectuam nas condies experimentais.
retire-os um a um do incubador e inverta-os fazendo uma
volta de 180 com um s movimento sem sacudidelas. Se se O ensaio s ser vlido se nenhuma das solues A e D der
formou um gel slido que no se desloca quando da inverso reaco positiva e se o resultado obtido com a soluo C
do tubo, registe o resultado como positivo. No caso contrrio, confirmar a sensibilidade declarada do lisado.
o resultado negativo. Se a sensibilidade do lisado, determinada com a soluo B,
O resultado s ser vlido se um resultado negativo for obtido estiver compreendida entre 0,5 e 2, a soluo problema no
com cada exemplar da soluo padro de concentrao mais contm factores de interferncia nas condies experimentais
baixa. utilizadas. No caso contrrio, h interferncia da soluo no
ensaio.
O ponto de equivalncia o ltimo resultado positivo
obtido nas sries de solues padro, examinadas por Se a amostra contiver factores de interferncia numa diluio
ordem decrescente das concentraes. Calcule a mdia dos inferior DMS, repita a pesquisa dos factores de
QUADRO 1

interferncia a uma diluio mais elevada mas que no 3. ENSAIO SEMIQUANTITATIVO (MTODO B)
ultrapasse a DMS. O emprego de um lisado mais sensvel
permite uma diluio mais alta da amostra e pode, assim, (i) Mtodo
contribuir para a eliminao de eventuais interferncias. Este ensaio permite quantificar as endotoxinas bacterianas
Os factores de interferncia podem ser eliminados com um presentes na soluo problema por titulao no ponto de
tratamento apropriado como filtrao, neutralizao, dilise equivalncia. Prepare as solues A, B, C e D como indicado
2. Mtodos
no quadro 3 e efectue o ensaio em condies determinadas

Analticos
ou aquecimento. Para verificar se o tratamento escolhido

segundo o mtodo descrito em 1. Controlos preliminares, (i)
permite eliminar a interferncia detectada sem provocar
Confirmao da sensibilidade declarada do lisado.
a perda das endotoxinas, repita a pesquisa dos factores de
interferncia na amostra adicionada de padro de endotoxina (ii) Clculo e interpretao
e submetida ao tratamento escolhido. O ensaio s ser vlido se as 3 condies seguintes forem
satisfeitas:
2. ENSAIO LIMITE (MTODO A) (a) os 2 resultados obtidos para a soluo D (testemunha
negativa) forem negativos,
(i) Mtodo (b) os 2 resultados obtidos para a soluo B (testemunha
Prepare as solues A, B, C e D como indicado no quadro positiva-produto) forem positivos,
2 e efectue o ensaio nestas solues segundo o mtodo (c) a mdia geomtrica da concentrao no ponto de
descrito em 1. Controlos preliminares, (i) Confirmao da equivalncia obtida para a soluo C estiver compreendida
sensibilidade declarada do lisado. entre 0,5 e 2.
Prepare a soluo A e a soluo B (testemunha positiva- Para determinar a concentrao em endotoxinas da soluo
-produto) utilizando uma diluio inferior ou igual DMS e A calcule a concentrao no ponto final para cada uma das
tratando como descrito em 1. Controlos preliminares, 2 sries de diluies, multiplicando o factor de diluio no
ponto final por .
A concentrao em endotoxinas da soluo problema a mdia
QUADRO 2 geomtrica das concentraes no ponto final obtidas para as 2
Concentrao em sries de diluies, calculada usando a expresso indicada em
Soluo endotoxinas/soluo qual
Nmero de

1 Controlos perliminares, (i) Confirmao da sensibilidade
so adicionadas as endotoxinas
exemplares do lisado. Se o ensaio for efectuado na soluo problema
pr-diluda, calcule a concentrao em endotoxinas da soluo
A Nula / Soluo problema diluda 2 inicial multiplicando o resultado pelo factor de diluio.
B 2 / Soluo problema diluda 2 Se nenhuma das diluies da soluo problema der resultado
positivo e as condies de validade do ensaio tiverem sido
C 2 / gua EEB 2
satisfeitas, tome a concentrao em endotoxinas como
D Nula / gua EEB 2 inferior a (ou, se o ensaio foi realizado com a soluo pr-
-diluda, a o mais pequeno factor de diluio utilizado).
Se todas as diluies derem resultado positivo, tome a
concentrao em endotoxinas como superior ou igual a o
(ii) Pesquisa de factores de interferncia. As solues B e maior factor de diluio utilizado (por exemplo, no quadro 3,
C (testemunhas positivas) contm o padro de endotoxina o factor de diluio inicial 8 .
numa concentrao equivalente a duas vezes a sensibilidade
A amostra satisfaz ao ensaio se a concentrao em
declarada do lisado. A soluo D (testemunha negativa)
endotoxinas for inferior ao limite especificado na monografia
constituda por gua EEB. correspondente.
(ii) Interpretao
O ensaio s ser vlido se os resultados obtidos com cada TCNICAS FOTOMTRICAS (MTODOS C, D, E e F)
um dos exemplares das testemunhas positivas (solues B
e C) forem positivos e se os dois resultados obtidos com a 1. TCNICA TURBIDIMTRICA (MTODOS C e F)
testemunha negativa (soluo D) forem negativos.
Esta tcnica consiste em determinar o aumento da turvao
A amostra satisfaz ao ensaio se os dois resultados obtidos com por fotometria. Segundo o princpio experimental posto em
a soluo A forem negativos. prtica, os mtodos utilizados so chamados de turbidimetria
Quando os dois resultados obtidos com a soluo A forem no ponto de equivalncia ou de turbidimetria cintica.
positivos: A turbidimetria no ponto de equivalncia (mtodo F) baseia-se
na existncia de uma relao quantitativa entre a concentrao
se a amostra foi diluda at DMS, no satisfaz ao ensaio,
em endotoxinas e a turvao (absorvncia ou transmisso)
se a diluio da amostra foi inferior DMS, repita o ensaio atingida na mistura no fim de um perodo de incubao.
com uma diluio mais elevada mas que no ultrapasse a A turbidimetria cintica (mtodo C) baseia-se na determinao
DMS. do tempo necessrio para atingir uma absorvncia pr-
Se um dos resultados obtidos com a soluo A for positivo e -definida na mistura, ou na determinao da velocidade de
o outro negativo, repita o ensaio. A amostra satisfaz ao ensaio desenvolvimento da turvao.
se os dois resultados obtidos na repetio com a soluo A O ensaio efectuado temperatura de incubao recomendada
forem negativos. pelo fabricante do lisado (geralmente, 37 1C).

QUADRO 3
2. Mtodos
Analticos
2. TCNICA COLORIMTRICA (MTODOS D e E) de modo a enquadrar cada aumento logartmico do intervalo
coberto pela curva de calibrao. O valor absoluto do coeficiente
Esta tcnica consiste em determinar a quantidade de de correlao |r| superior ou igual a 0,980 no intervalo de
cromforo libertada por um peptdeo cromognico concentrao em endotoxinas indicado pelo fabricante do lisado.
apropriado quando da reaco das endotoxinas com o lisado.
(ii) Pesquisa de factores de interferncia
Segundo o princpio experimental posto em prtica, os
mtodos utilizados so chamados de colorimetria no ponto Escolha uma concentrao em endotoxinas coincidente com
de equivalncia ou de colorimetria cintica. o meio da curva de calibrao, ou prxima deste.
A colorimetria no ponto de equivalncia (mtodo E) Prepare as solues A, B, C e D como indicado no quadro 4.
assenta na existncia de uma relao quantitativa entre a Efectue o ensaio em, pelo menos, 2 exemplares de cada uma
concentrao em endotoxinas e a quantidade de cromforo da solues seguindo as instrues fornecidas pelo fabricante
libertada no fim de um perodo de incubao. do lisado (volumes da amostra e da soluo do lisado, relao
A colorimetria cintica (mtodo D) determina o tempo destes volumes, tempos de incubao, etc.).
necessrio para atingir uma absorvncia pr-definida
na mistura ou na determinao da velocidade de QUADRO 4
desenvolvimento da colorao.
Soluo Concentrao Soluo qual so Nmero de
O ensaio efectuado temperatua de incubao em endotoxinas adicionadas exempares
recomendada pelo fabriante do lisado (geralmente 371C). as endotoxinas
A Nula Soluo problema >2
3. CONTROLOS PRELIMINARES B Concentrao mdia Soluo problema >2
da curva de calibrao
Para assegurar a fiabilidade da validao dos ensaios
turbidimtricos e colorimtricos efectuam-se controlos C Pelo menos, 3 gua EEB >2
preliminares para verificar que os critrios de validao da concentraes (a mais para cada
curva de calibrao so satisfeitos e que a soluo problema baixa designada) diluio
no interfere com o ensaio. necessrio validar o mtodo D Nula gua EEB >2
de ensaio cada vez que modificaes susceptveis de afectar o
resultado do ensaio se efectuam nas condies experimentais. Soluo A = soluo problema eventualmente diluda at DMS, no
(i) Verificao dos critrios de validade da curva de mximo,
calibrao Soluo B = amostra mesma diluio que a soluo A, contendo
endotoxinas adicionadas em concentrao coincidente
A partir da soluo padro de endotoxina prepare pelo menos 3
com o meio da curva de calibrao ou prxima deste,
solues de concentraes diferentes para construir uma curva
de calibrao. Efectue o ensaio pelo menos em trs exemplares Soluo C = solues padro de endotoxina nas mesmas
de cada uma das solues padro, seguindo as instrues concentraes que as utilizadas para a validao
fornecidas pelo fabricante do lisado (propores em volume, descrita em 3. Controlos preliminares, (i) Verificao
tempos de incubao, temperatura, pH, etc.). Se, pelos mtodos dos critrios de validade da curva de calibrao (srie de
cinticos, o intervalo de concentrao esperado for superior a testemunhas positivas),
2 log, conveniente preparar solues padro suplementares Soluo D = gua EEB (testemunha negativa).

Calcule a recuperao mdia das endotoxinas adicionadas polyphemus ou Tachypleus tridentatus) de acordo com as
subtraindo (se for o caso) a concentrao mdia em disposies definidas pela Autoridade competente.
endotoxinas da soluo da concentrao obtida para a soluo
contendo as endotoxinas adicionadas. O lisado de amebcitos reage no s com as endotoxinas
mas tambm com certas -glicanos. Existem preparaes de
A soluo problema considerada como isenta de lisado de amebcitos que no reagem com os glicanos; so
factores de interferncia nas condies do ensaio se a obtidas por eliminao do factor G (responsvel pela reaco
2. Mtodos
concentrao determinada em endotoxinas adicionadas com os glicanos) do lisado de amebcitos ou por inibio do
Analticos
estiver compreendida entre 50 por cento e 200 por cento sistema reactivo do factor G. Estas preparaes podem ser
da concentrao conhecida em endotoxinas adicionadas, utilizadas para efectuar o ensaio das endotoxinas bacterianas
aps deduo das endotoxinas eventualmente detectadas na em presena de glicanos.
soluo no adicionada de endotoxinas.
(iii) gua EEB (gua para ensaio das endotoxinas
Se a taxa de recuperao em endotoxinas no estiver bacterianas)
compreendida no intervalo especificado, os factores de
interferncia so eliminados como se descreve na seco A gua EEB gua para preparaes injectveis R, ou gua
Tcnica de gelificao, em 1. Controlos preliminares, produzida por outro processo, que no apresente reaco
(ii) Pesquisa de factores de interferncia. A eficcia do com o lisado at ao limite de deteco do reagente.
tratamento aplicado verificada repetindo a pesquisa dos A seco seguinte fornecida a ttulo de informao.
factores de interferncia.
4. ENSAIO Recomendaes para a realizao

do ensaio das endotoxinas
(i) Mtodo
bacterianas
Proceda como descrito em 3. Controlos preliminares, (ii),
Pesquisa de factores de interferncia.
1. INTRODUO
(ii) Clculo
Calcule a concentrao em endotoxinas de cada exemplar da As endotoxinas provenientes de bactrias Gram-negativas
soluo A a partir da curva de calibrao construda com as so as principais responsveis pelos efeitos txicos atribudos
solues C (srie de testemunhas positivas). contaminao de medicamentos por pirognios. A sua
O ensaio s ser vlido se forem satisfeitas as 3 condies actividade pirognica muito mais elevada que a da maioria
seguintes: das outras substncias pirognicas. Estas endotoxinas so
polissacardeos. Apesar de existirem alguns pirognios com
(a) o resultado obtido para a soluo D (testemunha uma estrutura qumica diferente, pode-se, quase sempre
negativa) no for superior ao limite especificado para o justificadamente, concluir que a ausncia de endotoxinas
branco na descrio do lisado utilizado, bacterianas num produto equivale ausncia de pirognios,
(b) os resultados obtidos para a soluo C (sries de desde que a eventualidade da presena de outros pirognios
testemunhas positivas) satisfazerem s exigncias que no sejam endotoxinas possa ser excluda.
de validade definidas em 3. Controlos preliminares, A presena de endotoxinas num produto pode ser mascarada
(i) Verificao dos critrios de validade da curva de pela existncia de factores que interfiram na reaco entre
calibrao, as endotoxinas e o lisado de amebcitos. Quando o analista
(c) a recuperao em endotoxinas, calculada a partir da pretender substituir o ensaio de pirognios em coelhos
concentrao em endotoxinas obtida para a soluo B prescrito na monografia da Farmacopeia pelo ensaio de
aps deduo da concentrao em endotoxinas obtida endotoxinas bacterianas, demonstra que este pode ser realizado
para a soluo A, estiver compreendida entre 50 por satisfatoriamente no produto considerado. Pode ser necessrio
cento e 200 por cento. eliminar os factores de interferncia por um mtodo apropriado.
(iii) interpretao De acordo com o indicado antes no ensaio de endotoxinas
bacterianas, para que o ensaio efectuado numa amostra possa
A amostra satisfaz ao ensaio se a concentrao mdia em
ser considerado vlido, dispe-se de informao sobre os dois
endotoxinas das solues A, aps correco da diluio
seguintes aspectos:
e concentrao, for inferior ao limite em endotoxinas
especificado para o produto. 1.1. estabelecida a conformidade do material utilizado no
ensaio. assegurada a ausncia de endotoxinas na gua
EEB e nos outros reagentes utilizados e verificada a
5. REAGENTES sensibilidade do lisado de modo a confirmar-se o valor
declarado pelo fabricante.
(i) Soluo de lisado
1.2. Como a amostra pode interferir no ensaio, determina-se
Dissolva lisado de amebcitos em gua EEB ou num a sensibilidade do lisado de amebcitos em presena e
tampo conforme recomendado pelo fabricante do lisado, ausncia da amostra. No h diferena significativa entre
com agitao moderada. Conserve o lisado reconstitudo os dois valores obtidos.
no frigorfico ou no congelador, conforme a indicao do
fabricante. O texto Endotoxinas bacterianas (2.6.14) indica os mtodos
que permitem eliminar os factores de interferncia. Se for
(ii) Lisado de amebcitos detectada alguma interferncia, repete-se novamente o
O lisado de amebcitos um produto liofilizado obtido ensaio para verificar se os factores de interferncia foram
a partir de um lisado de amebcitos de lmulo (Limulus efectivamente neutralizados ou eliminados.

O presente anexo explica, em primeiro lugar, os fundamentos resultado do ensaio considerado positivo porque, como se
das exigncias especificadas no ensaio de endotoxinas trata de um ensaio de tudo ou nada, impossvel diferenar
bacterianas, tratando depois da leitura e interpretao dos uma concentrao exactamente igual do limite de uma
resultados. concentrao superior. S na ausncia de gelificao que
possvel concluir que a concentrao de endotoxinas no
Quando uma monografia da Farmacopeia prescreve o ensaio
superior do limite definido.
de pirognios no coelho, a sua substituio pelo ensaio com
2. Mtodos
lisado de amebcitos constitui um recurso a um mtodo
Analticos
No caso de produtos no estado slido, a concentrao limite em
alternativo, necessitando por isso de uma validao; so endotoxinas por unidade de massa ou por unidade internacional
indicadas no presente anexo algumas recomendaes sobre de produto, convertida em concentrao de endotoxinas por
os procedimentos a seguir. mililitro de soluo da amostra, uma vez que o ensaio no pode
ser efectuado a no ser numa soluo. Tratar-se- mais adiante o
Quando uma monografia prescreve um ensaio de endotoxinas
caso de produtos que j existem no estado lquido (por exemplo,
baterianas indicando o mtodo a utilizar, o mtodo
preparaes lquidas para perfuso).
especificado na monografia que constitui o mtodo de
referncia; se no especificado qualquer mtodo, o mtodo Limite em endotoxinas: o limite em endotoxinas de uma
de gelificao A constitui, ento, o mtodo de referncia. Se substncia activa a administrar por via parentrica, definido
em lugar do mtodo de referncia um analista deseja utilizar numa base posolgica, igual a
um dos outros mtodos, tem de demonstrar que esse mtodo
K
apropriado para o produto e que d resultados conformes , em que:
com os obtidos com o mtodo de referncia (ver igualmente M
a seco 13).
K = dose mnima de endotoxinas que produz efeito pirognico, por
quilograma de massa corporal e por hora,
2. MTODO
M = dose humana mxima recomendada para o princpio activo,
A adio de endotoxinas a um lisado de amebcitos pode por quilograma de massa corporal e por hora.
provocar turvao, precipitao ou gelificao. S o O limite em endotoxinas estabelece-se em funo do
mtodo de gelificao foi de incio utilizado como critrio princpio activo e da sua via de administrao. indicado nas
de avaliao no ensaio das endotoxinas bacterianas respectivas monografias. No quadro 5 so propostos valores
da Farmacopeia. As vantagens deste mtodo so a sua para K.
simplicidade e o facto da deciso de declarar o resultado do
ensaio positivo ou negativo assentar na presena ou ausncia Para as outras vias, o critrio de aceitao para as
de gelificao, visvel a olho nu. Os mtodos quantitativos concentraes em endoxinas bacterianas normalmente
(C, D, E e F) desenvolveram-se posteriormente; necessitam estabelecido a partir dos resultados obtidos durante o
de um aprecivel instrumental mas so mais fceis de desenvolvimento do produto.
automatizar para o controlo de rotina de um grande nmero
de amostras de um mesmo produto. QUADRO 5
As endotoxinas podem ser adsorvidas superfcie de tubos Via de K (unidades internacionais

ou pipetas feitos a partir de certos tipos de plstico ou administrao de endotoxina por quilograma
vidro. Podem igualmente ter interferncia com substncias recomendada de massa corporal e por hora)
libertadas a partir de matrias plsticas. Convm, pois,
verificar o material utilizado. A constituio dos tubos ou Endovenosa 5,0
pipetas pode variar ligeiramente de um lote para outro, Endovenosa, preparaes
de modo que se aconselha que sejam repetidos os ensaios radiofarmacuticas 2,5
sempre que se utiliza novo lote de material.
Intrarraquideana 0,2
A deciso de utilizar o ensaio de endotoxinas bacterianas
como ensaio limite implica em primeiro lugar que se Qual a diluio do produto a utilizar no ensaio, que permite
defina uma concentrao limite em endotoxinas para a assegurar com nvel mximo de segurana, que um resultado
amostra, e em segundo lugar que o analista tenha como negativo significa que a concentrao em endotoxinas
objectivo determinar se a concentrao em endotoxinas inferior ao limite de endotoxinas, e que um resultado positivo
na amostra inferior ou superior ao limite definido. Os significa que o lisado reagiu com uma concentrao de
mtodos quantitativos C, D, E e F permitem determinar o endotoxinas pelo menos igual ao limite de endotoxinas? Esta
teor de endotoxinas da amostra mas, para a conformidade diluio depende do limite de endotoxinas e da sensibilidade
Farmacopeia e os controlos de rotina, a questo final saber do lisado: denomina-se diluio mxima significativa
se este teor ultrapassa ou no um limite definido. (DMS), e pode ser calculada a partir da frmula:
Para fixar a concentrao limite de endotoxinas na amostra,
conveniente ter em conta a posologia do produto. O objectivo limite de endotoxinas concentrao de soluo problema
DMS =
assegurar que a concentrao de endotoxinas no produto
inferior ao limite definido, e que mesmo que se administre a
Concentrao da soluo problema:
dose mxima horria do produto por uma determinada via,
este no contm uma quantidade de endotoxinas suficiente em mg/ml, se o limite em endotoxinas for especificado em
para provocar um efeito txico. relao massa (U.I./mg),
Quando a concentrao de endotoxinas no produto em Unidades/ml, se o limite em endotoxinas for
exactamente igual ao valor limite h gelificao, como se a especificado em relao unidade de actividade biolgica
concentrao de endotoxinas fosse muito mais elevada, e o (U.I./Unidade),

em ml/ml, se o limite em endotoxinas for especificado em a sua actividade seja expressa em unidades internacionais de
relao ao volume (U.I./ml). endotoxina.
= para a tcnica de gelificao, sensibilidade declarada do lisado NOTA: uma unidade internacional (U.I.) de endotoxina
(U.l./ml); para as tcnicas turbidimtrica e colorimtrica ponto equivale a uma unidade de endotoxina (U.E.)
mais baixo utilizado da curva de calibrao.
Quando a diluio mxima significativa no corresponde a 4. GUA EEB

2. Mtodos
Analticos
um nmero inteiro, admite-se, por rotina, a utilizao de

um nmero inteiro apropriado inferior DMS (que significa A verificao da ausncia de endotoxinas bacterianas neste
preparar uma soluo do produto menos diluda que a DMS). reagente atravs da tcnica derivada do ensaio de pirognios
Neste caso, um resultado negativo indica que a concentrao em coelhos foi rejeitada por razes prticas e tericas:
em endotoxinas do produto inferior ao limite especificado. o ensaio em coelhos no suficientemente sensvel para
Contudo, um resultado pode ser positivo se a concentrao permitir a deteco de endotoxinas na gua EEB destinada
em endotoxinas do produto, embora inferior ao limite em aos ensaios de produtos que tenham uma concentrao
endotoxinas, for suficientemente elevada para que a reaco limite em endotoxinas muito fraca,
com o lisado provoque gelificao. Quando se verificar um
resultado positivo com um ensaio conduzido com um factor a relativamente baixa preciso da resposta (elevao de
de diluio apropriado, convm diluir o produto at temperatura) no coelho torna necessrio a realizao de
DMS e repetir o ensaio. Em caso de dvida ou de litgio, numerosos ensaios de repetio,
necessrio tambm utilizar a DMS. os termos pirognios e endotoxinas dizem respeito a
Este facto reala a importncia da confirmao da grupos de entidades que no so exactamente coincidentes.
sensibilidade do lisado. O texto de endotoxinas bacterianas indica que para preparar
gua EEB podem ser utilizados outros mtodos sem ser a
tripla destilao. A osmose inversa tem sido utilizada com
EXEMPLO bons resultados. Alguns analistas preferem destilar a gua
mais do que trs vezes. Qualquer que seja o mtodo utilizado,
Tomemos para ensaio uma soluo de fenitona sdica a o produto resultante est isento de endotoxinas detectveis.
50 mg/ml, para injeco endovenosa. Trata-se de determinar
a DMS, a partir do valor das seguintes variveis:
M = dose humana mxima = 15 mg por quilograma de massa
5. pH DA MISTURA
corporal e por hora,
No ensaio de endotoxinas bacterianas, a gelificao mxima
c = 50 mg/ml, quando a mistura tem um pH compreendido entre 6,0 e 8,0.
K = 5 unidades internacionais de endotoxina por quilograma de
No entanto, a adio do lisado amostra pode fazer baixar o
pH.
massa corporal e por hora,
= 0,4 unidades internacionais de endotoxina por mililitro.

6. VALIDAO DO LISADO
Soluo:
5 50 1
importante que a preparao das solues do lisado seja
DMS = = 41,67 efectuada seguindo as instrues do fabricante.
15 0,4
Para os mtodos de gelificao A e B os factores de diluio
elevados que do resultados positivos so convertidos em
Nas anlises de rotina deste produto, pode ser mais logaritmos. Com efeito, a curva de distribuio de frequncia
prtico colher 1 ml da amostra e completar 20 ml (DMS/2 destes valores logartmicos est mais prxima de uma curva
arredondado ao nmero inteiro imediatamente inferior). No normal do que a distribuio de frequncia dos prprios
entanto, se o resultado for positivo, ser necessrio diluir factores de diluio; de facto o mesmo que aceitar a
1 ml da soluo completando 41,67 ml e repetir o ensaio. utilizao da distribuio normal de frequncia como modelo
Em caso de dvida deve-se igualmente preparar para ensaio a matemtico e calcular os limites de confiana com o teste t
mesma diluio 1/41,67. de Student.
3. PREPARAO DE REFERNCIA 7. ESTUDO PRELIMINAR DOS FACTORES

DE INTERFERNCIA
O padro de endotoxinas PBR destina-se a servir como
preparao de referncia. aferida com o padro Alguns produtos no podem ser directamente submetidos ao
internacional de endotoxinas da OMS, e a sua actividade ensaio de endotoxinas bacterianas porque no so miscveis
expressa em unidades internacionais de endotoxina por com os reagentes, porque o seu pH no pode ser ajustado a
ampola. A unidade internacional de endotoxina definida 6,5-8,0, ou porque inibem ou activam a gelificao. Neste
como actividade especfica de uma determinada massa do caso, necessrio fazer um estudo preliminar dos factores de
padro internacional. interferncia. Uma vez identificados, preciso demonstrar a
eficcia do mtodo utilizado para os eliminar.
Para os ensaios de rotina, admite-se a utilizao de uma outra
preparao de endotoxinas, desde que tenha sido aferida com O objectivo deste estudo preliminar o de ensaiar a hiptese
o padro internacional de endotoxina, ou com o PBR, e que nula, isto , verificar se a sensibilidade do lisado em presena

da amostra no difere significativamente da sensibilidade do lisado durante o ensaio podem no ser detectadas se no
lisado na ausncia do produto. Os mtodos A e B utilizam atingirem o limite de sensibilidade do lisado. No entanto,
para este efeito um critrio simples: a hiptese nula aceite podem aumentar a quantidade de endotoxina na soluo
quando a sensibilidade do lisado em presena do produto no que contm a amostra para alm do limite de sensibilidade e
nem 0,5 vezes inferior nem 2 vezes superior sensibilidade provocar uma reaco positiva.
do lisado isolado.
Pode-se reduzir este risco controlando a gua EEB e os
2. Mtodos
Analticos
A abordagem clssica teria sido determinar a sensibilidade outros reagentes e materiais utilizados, com o lisado mais
do lisado em presena e ausncia do produto, calculando sensvel de que se dispuser ou pelo menos com um lisado
em cada caso a mdia dos logaritmos do factor de diluio, mais sensvel do que o utilizado no ensaio do produto.
e aplicando o teste t de Student diferena entre as duas Mesmo assim, no se consegue eliminar totalmente o risco
mdias. de se obter um resultado falso positivo. Convm, no
A pesquisa dos factores de interferncia, nos ensaios de entanto, sublinhar que este protocolo de ensaio nos d todas
gelificao A e B, exige o emprego de uma amostra que as garantias de segurana, ao contrrio do que aconteceria
no contenha endotoxinas detectveis. Esta circunstncia com um protocolo que permitisse a obteno de falsos
levanta um problema terico quando se trata de controlar negativos, que permitiria a libertao de um produto no
um produto inteiramente novo. Por isso se tem adoptado um satisfatrio apresentando risco para os doentes.
processo diferente para os mtodos quantitativos C. D, E e F.
11. SUBSTITUIO DO ENSAIO DE PIROGNIOS

8. ELIMINAO DOS FACTORES DE INTERFERNCIA EM COELHOS PELO ENSAIO DAS ENDOTOXINAS
BACTERIANAS
Os mtodos utilizados para eliminar os factores de
interferncia no provocam nem o aumento nem a As monografias dos produtos farmacuticos para uso
diminuio (por exemplo, por adsoro) da concentrao em parentrico susceptveis de conter endotoxinas bacterianas
endotoxinas da amostra. A melhor maneira de o verificar em doses txicas so submetidos quer ao ensaio dos
utilizar o mtodo numa amostra de produto contaminada pirognios, quer ao ensaio das endotoxinas bacterianas. De
com uma quantidade conhecida de endotoxinas, e determinar modo geral:
a quantidade de endotoxina recuperada.
11.1. Quando uma monografia prescreve a realizao de
Mtodos C e D. Se a natureza do produto em anlise um ensaio, especifica um s, o de endotoxinas ou o de
apresentar uma interferncia que no possa ser eliminada pirognios,
recorrendo aos mtodos clssicos, possvel estabelecer a
curva de calibrao com o mesmo tipo de produto tornado 11.2. Salvo prova em contrrio, o ensaio das endotoxinas
isento de endotoxinas por um tratamento apropriado ou por bacterianas utilizado de preferncia ao dos pirognios
diluio. O ensaio das endotoxinas , ento, realizado em porque, regra geral, considerado que garante ao
relao a esta curva de calibrao. paciente uma proteco equivalente ou superior,
A ultrafiltrao com filtros de membrana assimtrica de 11.3. Para introduzir um ensaio de endotoxinas bacterianas
triacetato de celulose demonstrou ser adequada na maioria numa monografia tem-se a prova que um dos ensaios
dos casos. Os filtros so adequadamente validados, porque descritos no captulo 2.6.14 pode ser aplicado ao
em algumas situaes os derivados da celulose (-d-glicanos) produto considerado, com resultados satisfatrios,
podem conduzir a resultados falsos positivos.
11.4. As informaes necessrias so obtidas junto dos
Pelo contrrio, os filtros de polissulfona consideram-se fabricantes. As firmas so convidadas a fornecer todos
inadequados, tendo dado a alguns utilizadores resultados os dados de validao de que disponham dizendo
falsos positivos. respeito aplicabilidade do ensaio das endotoxinas
bacterianas s substncias e formulaes consideradas.
Estes dados compreendem nomeadamente a descrio
9. FUNO DAS PREPARAES DE CONTROLO
pormenorizada do modo de preparao das amostras
e de todo o processo necessrio para eliminar os
A funo do controlo positivo composto por gua EEB e pela
factores de interferncia. Tambm fornecem os dados
preparao de referncia de endotoxina numa concentrao
paralelos eventualmente disponveis sobre o ensaio de
dupla da sensibilidade declarada do lisado, o de permitir
a verificao da actividade do lisado no momento e nas pirognios que possam contribuir para estabelecer que
condies do ensaio. A funo do controlo negativo a de a substituio do ensaio de pirognios pelo ensaio de
permitir a verificao da ausncia de endotoxinas detectveis endotoxinas bacterianas apropriada.
na gua EEB. Nas seces que se seguem so definidas exigncias
O segundo controlo positivo, que contm a amostra na complementares.
concentrao utilizada no ensaio, serve para demonstrar a
ausncia de factores de inibio no momento e nas condies
do ensaio. 12. UTILIZAO DE UM ENSAIO DE ENDOTOXINAS
BACTERIANAS DIFERENTE DO PRESCRITO NA
MONOGRAFIA
10. LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Quando se prescreve um ensaio de endotoxinas bacterianas
Pequenas quantidades de endotoxina na gua EEB ou em mas a monografia no especifica qual dos 6 mtodos (A a
qualquer outro reagente ou material em contacto com o F) descritos no captulo 2.6.14 se utiliza, tal significa que o

2.6.15. Activador da pr-calicrena
mtodo A (ensaio limite de gelificao) foi validado para o O activador de pr-calicrena na albumina PBR aferido
produto em causa. Se o emprego de um dos outros mtodos em Unidades Internacionais por comparao com o padro
(B a F) for prescrito, esse mtodo que foi validado. internacional.
13. VALIDAO DE MTODOS ALTERNATIVOS REAGENTES

2. Mtodos
Analticos
A substituio do ensaio de pirognios no coelho por um O activador da pr-calicrea na albmina PBR calibrado
ensaio de endotoxinas bacterianas ou a substituio de em Unidades Internacionais por comparao com o padro
um mtodo prescrito (explicita ou implicitamente) para o internacional
ensaio de endotoxinas bacterianas por um outro mtodo,
considerado como mtodo alternativo podendo substituir Soluo Tampo A. Dissolva 6,055 g de tris(hidroximetil)-
o ensaio da farmacopeia nas condies descritas nas -aminometano R, 1,17 g de cloreto de sdio R, 50 mg de
Prescries gerais. brometo de hexadimetrina R e 0,100 g de azida de sdio R
em gua R. Ajuste para pH 8,0 com cido clordrico 2 M e
Os ensaios e doseamentos descritos so os mtodos oficiais a complete 1000 ml com gua R.
partir dos quais so estabelecidas as normas da Farmacopeia.
Podem ser utilizados outros mtodos de anlise para fins Soluo Tampo B. Dissolva 6,055 g de tris(hidroximetil)-
de controlo com o acordo das Autoridades competentes, -aminometano R, 8,77 g de cloreto de sdio R em gua R.
com a condio de que esses mtodos permitam afirmar Ajuste para pH 8,0 com cido clordrico 2 M e complete
inequivocamente que as normas das monografias seriam 1000 ml com gua R.
satisfeitas se fossem aplicados os mtodos oficiais. Em caso
de dvida ou litgio, s fazem f os mtodos de anlise da
PREPARAO DO SUBSTRATO DE PR-CALICRENA.
Farmacopeia.
Para validar um outro mtodo de pesquisa das endotoxinas Para evitar a activao resultante da coagulao, o
que o explcita ou implicitamente especificado na monografia, sangue ou o plasma usados para a preparao da pr-
prope-se que se apliquem os procedimentos seguintes: -calicrena contactam apenas com materiais de plstico
ou de vidro siliconado.
13.1. Validao do mtodo de ensaio e dos materiais e
reagentes utilizados como descrito no ensaio em causa, Misture 9 volumes de sangue humano com 1 volume de
13.2. Evidenciar os eventuais factores de interferncia (e, se soluo anti-coagulante (ACD, CPD ou uma soluo de
necessrio, validao do processo de eliminao empre- citrato de sdio R a 38 g/l) adicionada de 1 mg por mililitro de
gado) nas amostras provenientes de, pelo menos, trs brometo de hexadimetrina R. Centrifugue a 3 600 g durante
lotes de fabricao. De notar que os mtodos D e E, 5 min. Separe o plasma e centrifugue a 6 000 g durante 20 min
que utilizam um peptdeo cromognico, necessitam do para separar as plaquetas. Separe o plasma pobre em plaquetas
emprego de reagentes que no se usam nos mtodos e proceda dilise contra 10 volumes de soluo tampo A
A, B, C e F; a extrapolao para o mtodo D ou E dos durante 20 h. Aps a dilise, deposite o plasma numa coluna
resultados obtidos com os mtodos A, B, C ou F, quanto de cromatografia contendo 2 vezes o seu volume de agarose-
ausncia de factores de interferncia, no , portanto, -DEAE para cromatografia de troca inica R previamente
admissvel sem a realizao de ensaios suplementares. equilibrada com soluo tampo A. Proceda eluio com
2
soluo tampo A com um dbito de 20 ml/cm /h. Recolha o
eludo por fraces e registe a absorvncia em 280 nm (2.2.25).
14. VALIDAO DO ENSAIO PARA NOVOS PRODUTOS Rena as fraces que contm o primeiro pico de protenas de
modo a obter um volume de cerca de 1,2 vezes o do plasma
Convm aplicar os processos descritos em 13.1 e 13.2 a pobre em plaquetas.
qualquer produto novo destinado administrao por via 172
parentrica que deva ser objecto de um ensaio de deteco de Para verificar que o substrato no apresenta calicrena
endotoxinas bacterianas como se prescreve na Farmacopeia. activa, misture 1 volume com 20 volumes de soluo de
substrato cromognico que ser utilizado no doseamento,
previamente aquecido a 37C, e mantenha a mistura a 37C
2.6.15. ACTIVADOR DA PR-CALICRENA durante 2 min. O substrato apropriado se a absorvncia
no aumentar mais de 0,001 por minuto. Junte soluo
O activador da pr-calicrena (PKA) transforma a pr- de substrato 7 g por litro de cloreto de sdio R e filtre por
-calicrena em calicrena e pode ser titulado por apresentar a membrana (porosidade = 0,45 m). Congele o filtrado em
capacidade de cindir o cromforo de um substrato peptdico partes alquotas e conserve a -25C; pode tambm liofilizar o
sinttico, determinando-se a velocidade da reaco por filtrado antes da conservao.
espectrofotometria. A concentrao em PKA calculada
por comparao com a preparao padro cuja actividade Efectue as operaes compreendidas entre a cromatografia e
expressa em Unidades Internacionais. a congelao em partes alquotas no mesmo dia.
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma

determinada quantidade de padro internacional constitudo AFERIO
por activador da pr-calicrena liofilizado. A correspondncia
entre a Unidade Internacional e a preparao padro De preferncia, a aferio efectuada num analisador
internacional indicada pela Organizao Mundial de enzimtico automtico, ou num sistema de microtitulao de
Sade. placas apropriado que permita leituras cinticas e associado

2.6.16. Ensaio de agentes estranhos em vacinas vricas para uso humano
a uma aplico informtica para clculo dos resultados. Se e intraperitoneal e mantenha-os em observao durante
necessrio, pode diluir os padres, as amostras e o substrato 21 dias. O lote semente satisfaz o ensaio se nenhum dos
de pr-calicrena com soluo tampo B. murganhos apresentar sinais de infeco atribuveis ao lote
Incube os padres ou as amostras diludas com o substrato semente. O ensaio s ser vlido se, pelo menos, 80 por cento
de pr-calicrena durante 10 min; o volume do padro ou da dos primeiros murganhos inoculados sobreviverem durante o
amostra antes da diluio no excede 1/10 do volume total da perodo de observao.
2. Mtodos
mistura a incubar, para evitar erros resultantes das diferenas
Analticos
Murganhos recm-nascidos. Utilize pelo menos 20
de fora inica ou de pH. Incube a mistura ou uma parte da
murganhos com menos de 24 h de idade inocule em cada
mistura com um volume igual ou superior de uma soluo
um deles 0,01 ml do lote semente por via intracerebral
de um substrato cromognico sinttico, reconhecidamente
especfico para a calicrena (por exemplo, acetato de e pelo menos, 0,1 ml por via intraperitoneal. Observe
N-benzoil -L-prolil-L-fenilalanil-L-arginina 4-nitroanilida R ou os murganhos recm-nascidos diariamente pelo menos
dicloridrato de D-propil-L-fenilalanil-L-arginina 4-nitroanilida durante 14 dias. Proceda a autpsia de todos os murganhos
R) e dissolvido em soluo tampo B. recm-nascidos que morram aps as primeiras 24 h ou que
apresentem sintomas de doena, a fim de detectar sinais
Registe o grau de alterao da absorvncia por minuto de infeco vrica, procedendo simultaneamente em, pelo
durante 2-10 min num comprimento de onda especfico menos, mais 5 murganhos recm-nascidos observao
para o substrato utilizado. Prepare um branco para cada macroscpica directa e a subinoculao de suspenses de
mistura da amostra ou do padro utilizando a soluo tampo
tecidos apropriados pelas vias intracerebral e intraperitoneal
B em vez do substrato de pr-calicrena.
e mantenha-os em observao durante 14 dias. O lote
Segundo o mtodo utilizado, convm corrigir A/min por semente satisfaz ao ensaio se nenhum dos murganhos
subtraco do valor obtido para o branco correspondente, recm-nascidos apresentar sinais de infeco atribuveis ao
na ausncia do substrato de pr-calicrena. Os resultados lote semente. O ensaio s ser vlido se, pelo menos, 80 por
podem ser calculados com o auxlio de uma curva de cento dos primeiros murganhos recm-nascidos inoculados
calibrao, modelo de linhas paralelas ou por relao ao ou sobreviverem durante o perodo de observao.
por qualquer outro mtodo estatstico apropriado. Estabelea
uma curva de calibrao em funo dos valores de A/min Cobaios. lnocule por via intraperitoneal 5,0 ml do lote
obtidos para a preparao de referncia e as concentraes semente a, pelo menos, cinco cobaios, pesando cada uma
correspondentes, e determine o teor em PKA da amostra. entre 350 e 450 g. Mantenha os animais em observao
durante, pelo menos, 42 dias a fim de detectar sinais da
doena. Proceda autpsia de todos os cobaios que morram
2.6.16. ENSAIO DE AGENTES aps as primeiras 24 h do ensaio ou que apresentem sinais da
ESTRANHOS EM VACINAS VRICAS doena; para detectar a infeco, examine ao mesmo tempo
os tecidos atravs de microscopia e culturas. Sacrifique os
PARA USO HUMANO animais que sobrevivam durante o perodo de observao
Para os ensaios que exigem uma neutralizao prvia do e examine-os da mesma maneira. O lote semente satisfaz
vrus, utilize anticorpos especficos de origem no humana, ao ensaio se nenhum cobaio apresentar sinais de infeco
no simiana; se a multiplicao do vrus for feita em tecidos atribuveis ao lote semente. O ensaio s ser vlido se, pelo
avirios, os anticorpos devero ser igualmente de origem menos, 80 por cento dos primeiros cobaios inoculados
no aviria. Na preparao dos soros utilize um antignio sobreviverem durante o perodo de observao.
imunizante produzido em culturas celulares provenientes
de uma espcie diferente daquela que foi utilizada para a
produo da vacina e isenta de agentes estranhos. Quando LOTE SEMENTE E RECOLHA DE VRUS
prescrito o uso de ovos SPF, estes satisfazem s exigncias
prescritas no metodo Bandos de frangos isentos de Retire amostras no momento da colheita e, se no forem
microrganismos patognicos especficos para a produo e examinadas imediatamente, conserve-as a uma temperatura
controlo de qualidade das vacinas (5.2.2). inferior a 40C.
Esterilidade bacteriana e fngica. Uma amostra de 10 ml
LOTE SEMENTE DE VRUS satisfaz ao ensaio de esterilidade (2.6.1).
Micoplasmas. Uma amostra de 10 ml satisfaz ao ensaio dos
Retire amostras do lote semente do vrus no momento
da colheita e, se no forem examinadas imediatamente, micoplasmas (2.6.7).
conserve-as a uma temperatura inferior a 40C. Micobactrias (2.6.2). Uma amostra de 5 ml submetida
ao ensaio para detectar a presena de Mycobacterium spp.
Murganhos adultos. Utilize, pelo menos, 10 murganhos pelos mtodos de cultura reconhecidos como sensveis para a
adultos, pesando cada um entre 15 e 20 g. Inocule em cada identificao destes organismos.
um deles 0,03 ml do lote semente por via intracerebral e
0,5 ml por via intraperitoneal. Mantenha os murganhos em Pesquisa de outros agentes estranhos em culturas celulares.
observao durante, pelo menos, 21 dias. Proceda autpsia Inocule as amostras neutralizadas correspondentes,
de todos os murganhos que morram aps as primeiras salvoindicao em contrrio, com 500 doses humanas ou
24 h do ensaio ou que evidenciem sintomas de doena 50 ml davacina, escolhendo a quantidade mais importante
a fim de detectar sinais de infeco vrica, procedendo em culturascelulares contnuas de rim de smio e de
simultaneamente em, pelo menos, mais 5 murganhos clulas humanas. Se o vrus produzido num sistema de
observao macroscpica directa e subinoculao de clulas humanas diplides, a colheita do vrus neutralizado
suspenses de tecidos apropriados pelas vias intracerebral igualmente inoculada numa outra cultura de clulas

2.6.17. Ensaio da actividade anticomplementar da imunoglobulina
diplides. Se o vrus vacinal no produzido num sistema de OVOS TESTEMUNHA

clulas humanas, ou de smio, as clulas destas espcies, mas
provenientes doutro lote, so igualmente inoculadas. Agentes hemaglutinantes. Pesquise a presena de agentes
hemaglutinantes em 0,25 ml do lquido alantide de cada ovo
Incube as clulas a 36 1C e observe-as durante 14 dias. atravs da sua mistura directa com eritrocitos de frango e
O lote semente ou a colheita do vrus satisfaz ao ensaio se aps uma passagem em ovos SPF efectuada como se descreve
nenhuma das culturas celulares evidenciar a presena de
2. Mtodos
a seguir: inocule uma amostra de 5 ml na cavidade alantide

Analticos
qualquer agente estranho que no seja atribudo a uma e na cavidade amnitica de ovos SPF. Os ovos testemunha
contaminao acidental. O ensaio s ser vlido se 50 por satisfazem ao ensaio se no houver sinais de agentes
cento, pelo menos, das culturas celulares permanecerem hemaglutinantes nos 2 ensaios.
viveis.
Vrus da leucose aviria. Utilize uma amostra de 10 ml de
Vrus avirios (ensaio exigido unicamente para vrus uma mistura de lquidos amniticos dos ovos testemunha.
multiplicados em tecidos avirios).Neutralize uma Proceda a uma amplificao efectuando 5 passagens em
amostra correspondente a 100 doses humanas ou a 10 ml culturas celulares de embrio de pinto isentas de leucose.
escolhendo a quantidade mais importante. Inocule a amostra Efectue um ensaio para pesquisa da leucose aviria nas
neutralizada, razo de 0,5 ml por ovo, por via alantide a clulas da 5 passagem. Os ovos testemunha satisfazem ao
um grupo de ovos embrionados SPF de idades compreendidas ensaio se no houver sinais da presena do vrus da leucose.
entre 9 e 11 dias e a um segundo grupo de ovos embrionados
SPF de idades compreendidas entre 5 e 7 dias. Incube-os Agentes estranhos. Inocule uma amostra de 5 ml da mistura
durante 7 dias. O lote semente ou a colheita do vrus satisfaz de lquidos amniticos dos ovos testemunha em culturas
ao ensaio se os lquidos alantides e os sacos vitelinos no celulares de origem humana e smia. Mantenha as culturas
apresentarem sinais de agentes hemaglutinantes e se os em observao durante 14 dias. Os ovos testemunha
embries e as membranas corio-alantides examinadas para satisfazem ao ensaio se no se verificar a presena de vrus
detectar toda a patologia macroscpica se revelarem normais. estranhos. O ensaio s ser considerado vlido se pelo menos
O ensaio s ser vlido se, pelo menos, 80 por cento dos ovos 80 por cento das clulas sobreviver.
inoculados sobreviverem durante os 7 dias do ensaio.
PRODUO DE CULTURAS CELULARES: CLULAS

2.6.17. ENSAIO DA ACTIVIDADE
TESTEMUNHAS ANTICOMPLEMENTAR DA
IMUNOGLOBULINA
As clulas testemunhas so observadas ao microscpio
para verificar a ausncia de vrus que causem uma A determinao da actividade anti-complementar
degenerescncia citopatognica, durante todo o perodo de (AAC) da imunoglobulina efectuada por incubao
incubao das culturas celulares de produo inoculadas de uma determinada quantidade da amostra (10 mg de
ou durante 14 dias aps inoculao das mesmas culturas, imunoglobulina) com uma determinada quantidade de
escolhendo o perodo mais longo. O ensaio s ser vlido complemento de cobaio (20 CH50) seguida de aferio do
se, pelo menos, 80 por cento das culturas testemunhas complemento restante: a actividade anticomplementar
sobreviverem at ao fim do perodo de observao. Ao 14 dia, expressa pela proporo do complemento consumido
ou no momento da ltima colheita do vrus, escolhendo o tomando o complemento testemunho como 100 por cento.
perodo mais longo, efectue as provas seguintes: A unidade hemoltica de actividade complementar (CH50) a
Ensaio dos vrus hemadsorventes. Examine, no mnimo, 25 quantidade de complemento que, nas estipuladas condies
por cento das culturas celulares testemunhas para detectar de reaco, provoca a lise de 2,5 108 de um nmero total
a presena de vrus hemadsorventes utilizando eritrocitos de 5 108 eritrocitos optimamente sensibilizados.
de cobaio. Se os eritrocitos de cobaio forem armazenados, Soluo-me de magnsio e de clcio. Dissolva 1,103 g de
so conservados a uma temperatura de 5 3C e no cloreto de clcio R e 5,083 g de cloreto de magnsio R em
ultrapassam os 7 dias. Proceda leitura de metade das gua R e complete 25 ml com o mesmo solvente.
culturas aps incubao a uma temperatura de 5 3C
Soluo-me de tampo de barbital. Dissolva 207,5 g de
durante 30 min e da outra metade aps incubao a uma
cloreto de sdio R e 25,48 g de barbital sdico R em 4000 ml
temperatura de 20-25C durante 30 min. No apresentam
de gua R e ajuste o pH para 7,3 com cido clordrico
nenhum sinal de agentes hemadsorventes.
1 M. Junte 12,5 ml de soluo me de magnsio e de clcio e
Pesquisa de agentes estranhos em culturas celulares. Junte complete 5000 ml com gua. Filtre por membrana (0,22 m)
os lquidos sobrenadantes das culturas celulares testemunhas e conserve a 4C em recipiente de vidro.
e examine-os para detectar a presena de agentes estranhos
Soluo de gelatina. Dissolva 12,5 g de gelatina R em cerca
atravs da inoculao em culturas celulares de rim de smio
de 800 ml de gua R e aquea ebulio em banho de gua.
e de culturas celulares humanas. Se o vrus da vacina
Arrefea at 20C e complete 10 litros com gua R. Filtre por
produzido num sistema de culturas celulares no smias
membrana (0,22 m) e conserve a 4C. Utilize unicamente
ou humanas, as clulas desta espcie, mas provenientes
uma soluo lmpida.
doutro lote, so igualmente inoculadas. Submeta ao ensaio,
pelo menos, 5 ml de cada sistema celular. Incube as clulas Soluo citratada. Dissolva 8,0 g de citrato de sdio R,
inoculadas a uma temperatura de 36 1C e observe-as 4,2 g de cloreto de sdio R e 20,5 g de glucose R em 750 ml
durante 14 dias. No apresentam nenhum sinal de agentes de gua R. Ajuste para pH 6,1 com uma soluo a 100 g/l de
estranhos. cido ctrico R e complete 1000 ml com gua R.

2.6.17. Ensaio da actividade anticomplementar da imunoglobulina
Soluo tampo de gelatina-barbital. Junte 4 volumes de TABELA 1

soluo de gelatina a 1 volume de soluo me de tampo
barbital e misture. Se necessrio, ajuste o pH para 7,3 com
cido clordrico 1 M ou hidrxido de sdio 1 M e conserve a
4C. Prepare diariamente uma soluo nova.
Sangue de carneiro estabilizado. Recolha 1 volume de
2. Mtodos
Analticos
sanguede carneiro em 1 volume de soluo citratada e
misture.Conserve o sangue estabilizado a 4C durante, pelo
menos, 7 dias e, no mximo, durante 28 dias. (O sangue de
carneiro ou os eritrocitos de carneiro estabilizados podem ser
obtidos de vrios fornecedores comerciais).
Hemolisina. Soro anti-eritrocitos de carneiro, preparado
em coelho. (Tais soros podem ser obtidos junto de vrios
fornecedores comerciais).
Complemento de cobaio. Misture os soros preparados a
partir do sangue de, pelo menos, 10 cobaios. Separe o soro do
sangue coagulado por centrifugao a uma temperatura de
cerca de 4C. Conserve o soro, em pequenas quantidades, a
uma temperatura inferior a 70C.
* Rejeite 1,0 ml da mistura

TCNICA
Prepare 3 tubos testemunhas de clulas totalmente
Padronizao da suspenso de eritrocitos de carneiro a 5 por hemolisadas com 1,4 ml de gua R e 0,1 ml da suspenso de
cento. Separe os eritrocitos de carneiro por centrifugao de eritrocitos de carneiro a 5 por cento.
um volume apropriado de sangue de carneiro estabilizado;
lave as clulas, pelo menos, 3 vezes, com a soluo tampo Incube todos os tubos a 37C durante 60 min e centrifugue
gelatina-barbital e prepare uma suspenso a 5 por cento V/V a 1000 g durante 5 min. Determine a absorvncia (2.2.25) de
na mesma soluo tampo. Determine a concentrao celular cada lquido sobrenadante em 541 nm e calcule a percentagem
pelo mtodo seguinte. Junte 0,2 ml da suspenso a 2,8 ml de hemlise ocorrida em cada tubo, usando a frmula:
de gua R e centrifugue o lisado durante 5 min a 1000 g. A
concentrao celular adequada se a absorvncia (2.2.25) do Aa A
1 100
lquido sobrenadante, determinada a 541 nm, for de Ab A1
0,62 0,01. Corrija a concentrao celular por adio
Aa = absorvncia do tubos contendo as diluies de hemolisina,
da soluo tampo de gelatina-barbital, de acordo com a
frmula: Ab = absorvncia mdia dos 3 tubos com hemlise total,
Vi A A1 = absorvncia mdia dos 3 tubos testemunhas sem hemlise.

Vf =
0,62 Em papel grfico linear, construa um grfico com as
percentagens de hemlise em ordenadas e o inverso da diluio
Vf = volume final,
de hemolisina, em abcissas. Determine a diluio ptima de
hemolisina a partir do grfico, escolhendo uma diluio tal
Vi = volume inicial, que um aumento da quantidade de hemolisina no produza
A = absorvncia determinada em 541 nm para a suspenso original. uma variao aprecivel no grau de hemlise. Esta diluio
considera-se como contendo 1 unidade de hemlise mnima
Uma vez ajustada a concentrao celular, a suspenso contm (1 UHM) em 1,0 ml. Para a preparao dos eritrocitos
cerca de 1 109 clulas por mililitro. de carneiro sensibilizados, a diluio de hemolisina
correspondente hemlise ptima contm 2 UHM por
Aferio de hemolisina
mililitro.
Prepare as diluies de hemolisina de acordo com a tabela 1.
A aferio de hemolisina s vlida se a percentagem de
Junte 1,0 ml da suspenso a 5 por cento de eritrocitos de hemlise total estiver compreendida entre 50 e 70 por cento.
carneiro em cada um dos tubo da srie de diluies de Caso contrrio, se a percentagem de hemlise total no ocorrer
hemolisina a partir da diluio a 1/75 e misture. Incube os dentro desta gama de valores, repita a aferio utilizando uma
tubos a 37C durante 30 min. soluo de complemento mais ou menos diluda.
Transfira 0,2 ml de cada mistura da diluio de hemolisina Preparao ptima de eritrocitos de carneiro sensibilizados
para novos tubos e junte 1,10 ml de soluo tampo de (sistema hemoltico). Prepare uma quantidade apropriada
gelatina-barbital e 0,2 ml de uma diluio de complemento de hemolisina diluda contendo 2 UHM por mililitro e um
de cobaio (por exemplo, 1/150). Efectue estas operaes em volume igual de suspenso padronizada de eritrocitos de
duplicado. carneiro a 5 por cento. Junte a diluio de hemolisina
Prepare 3 tubos testemunhas de clulas no hemolisadas com suspenso padronizada de clulas e misture. Incube a 37C
1,4 ml de soluo tampo gelatina-barbital e 0,1 ml da durante 15 min; conserve temperatura de 2 a 8C e utilize
suspenso de eritrocitos de carneiro a 5 por cento. dentro do perodo de 6 horas.

2.6.18. Ensaio de neurovirulncia em vacinas com vrus vivo
Titulao do complemento Se necessrio, ajuste a amostra para pH 7. Para uma

imunoglobulina contendo 50 mg/ml, prepare as seguintes
Prepare uma diluio apropriada de complemento (por misturas de incubao:
exemplo 1:250) utilizando a soluo tampo de gelatina-
-barbital e efectue a titulao, em duplicado, de acordo com a
tabela 2.
A cada tubo, junte 0,2 ml de eritrocitos de carneiro
2. Mtodos
Analticos
sensibilizados, misture bem e incube todos os tubos a 37C

durante 60 min. Arrefea os tubos em gua com gelo e
centrifugue a 1000 g durante 5 min. Determine a absorvncia
dos sobrenadantes em 541 nm e calcule o grau de hemlise
(Y), usando a frmula: Efectue o ensaio na amostra e prepare testemunha AAC negativa
e positiva a partir de imunoglobulina humana PBR, de acordo
Ac A com as instrues fornecidas no folheto que acompanha a
1 100
Ab A1 preparao de referncia. Se a amostra no contm 50 mg/ml de
imunoglobulina, ajuste os volumes da preparao e da soluo
Ac = absorvncia do tubos 1 a 12, tampo de gelatina-barbital; por exemplo, utilize 0,33 ml de
uma preparao que contm 30 mg/ml de imunoglobulina
Ab = absorvncia mdia dos tubos com 100 por cento de hemlise,
e adicione 0,47 ml de soluo tampo de gelatina-barbital de
A1 = absorvncia mdia dos tubos com 0 por cento de hemlise. modo a obter o mesmo volume total de 0,8 ml. Feche os tubos
e incube a 37C durante 60 min. Junte 0,2 ml de cada mistura
de incubao a 9,8 ml de soluo tampo de gelatina-barbital
TABELA 2
para diluir o complemento. Em cada tubo, efectue as aferies
do complemento tal como acima descrito para determinar a
actividade anti-complementar residual (ver tabela 2). Calcule
a actividade anti-complementar da amostra, por referncia ao
complemento testemunha considerado como sendo 100 por
cento, de acordo com a frmula:
ab
100
a
a = actividade complementar mdia (CH50/ml) dos testemunhas,
b = actividade complementar (CH50/ml) da amostra.
O ensaio s vlido se:

as actividades anticomplementares encontradas para a
testemunha AAC negativa e testemunha AAC positiva
se situarem entre os limites indicados no folheto que
acompanha a preparao referncia,
a actividade complementar do complemento testemunha
(a) for de 80 CH50/ml a 120 CH50/ml.
Em papel grfico log-log, construa um grfico inscrevendo os
valores de Y (1 Y) em abcissas, e o correspondente volume
em mililitros de complemento diludo em ordenadas. A partir
dos pontos, trace a recta ideal e determine a ordenada da dose
hemoltica a 50 por cento do complemento no ponto onde
2.6.18. ENSAIO DE NEUROVIRULNCIA
Y / ( 1 Y) = 1,0. Calcule a actividade em termos de unidades EM VACINAS COM VRUS VIVO
hemolticas (CH50/ml) de acordo com a frmula:
Cd Utilize para cada ensaio pelo menos 10 macacos seronegativos
5 para a amostra de vrus. Salvo indicao em contrrio, injecte
Ca
em cada macaco na regio talmica de cada hemisfrio, no
mximo, 0,5 ml da amostra. A quantidade total de vrus
Cd = valor inverso da diluio do complemento, inoculada em cada macaco no inferior quantidade contida
Ca = volume em mililitros do complemento diludo que produz na dose nica recomendada para o homem. Para verificar a
50 por cento de hemlise, ausncia de vrus neurovirulento selvagem, mantenha um
grupo de, pelo menos, 4 testemunhas na mesma jaula ou na
5 = factor da escala para ter em conta o nmero de eritrocitos. vizinhana imediata dos macacos inoculados. Mantenha os
macacos inoculados em observao durante 17 a 21 dias para
O ensaio s vlido se, entre 15 e 85 por cento de hemlise, a
verificar sintomas de paralisia ou outras manifestaes do foro
curva obtida for uma recta cuja inclinao se situe entre 0,15
neurolgico; mantenha as testemunhas em observao durante
e 0,40 e, de preferncia, entre 0,18 e 0,30.
o mesmo perodo mais 10 dias. Os animais que morrem nas
Ensaio de actividade anticomplementar 48 h aps a injeco so considerados como mortos devido a
causas no especficas e podem ser substitudos. O ensaio ser
Dilua o complemento de cobaio titulado com a soluo vlido se: menos do que 20 por cento dos macacos inoculados
tampo de gelatina-barbital de modo a obter 100 CH50/ml. morrerem devido a causas no especficas; as amostras de soro

2.6.19. Ensaio de neurovirulncia da vacina oral contra a poliomielite
colhidas das testemunhas na altura da inoculao dos animais aps a inoculao devero ser autopsiados afim de determinar
do ensaio e 10 dias aps estes ltimos terem sido sacrificados se a sua morte devida poliomielite. Aqueles cuja morte
no indicarem que houve uma infeco por vrus selvagem do devida a outras causas que no a poliomielite so excludos
mesmo tipo que o da amostra ou por vrus do sarampo. No fim da avaliao. Sacrifique e proceda autpsia dos animais
do perodo de observao, efectue exame necrpsico e exames moribundos ou gravemente paralisados. Proceda autpsia
histopatolgicos de zonas apropriadas do crebro para detectar de todos os macacos que sobreviverem ao perodo de
eventual envolvimento do sistema nervoso central. A amostra observao. A prova s ser vlida se a proporo de animais
2. Mtodos
Analticos
satisfaz ao ensaio se no for detectado nenhum sinal suspeito, que apresentarem sinais de infeco intercorrente durante o
clnico ou histopatolgico, de envolvimento do sistema perodo de observao no ultrapassar 20 por cento.
nervoso central atribuvel ao vrus inoculado.
Nmero de cortes examinados. Efectue o exame histolgico
pelo menos nas partes lombar e cervical da espinal medula,
nas partes inferior e superior do bolbo raquidiano, no
2.6.19. ENSAIO DE NEUROVIRULNCIA mesencfalo, assim como no tlamo e nas zonas motrizes do
DA VACINA ORAL CONTRA crtex cerebral de cada macaco. Os cortes tm uma espessura
A POLIOMIELITE de 15 m e so corados com a galocianina. O nmero
mnimo de cortes examinados o seguinte:
Os macacos utilizados para os ensaios de neurovirulncia a) 12 cortes representando o conjunto do alargamento
satisfazem s exigncias prescritas na monografia Vacina lombar,
oral contra a poliomielite e pesarem, pelo menos, 1,5 kg.
A patogenicidade avaliada para os macacos Macaca ou b) 10 cortes representando o conjunto do alargamento
Cercopithecus utilizando por comparao uma preparao cervical,
vrica de referncia para os ensaios de neurovirulncia, c) 2 cortes do bolbo raquidiano,
inoculando na regio lombar do sistema nervoso central.
Os macacos so sedados previamente, por exemplo com d) 1 corte ao nvel da ponte de Varole e do cerebelo,
cloridrato de cetamina. igualmente verificado que as
e) 1 corte ao nvel do mesencfalo,
amostras de soro recolhidas de cada macaco antes da injeco
no contm anticorpos neutralizantes quando examinadas na f) 1 corte das partes esquerda e direita do tlamo,
diluio de 1:4 em presena de, no mximo, 1000 DICC50 de
g) 1 corte das zonas motrizes esquerda e direita do crtex
cada um dos trs tipos de vrus da poliomielite.
cerebral.
Nmero de macacos. Utilize o mesmo grupo de macacos
Avaliao da actividade vrica. Para avaliar a actividade
e examine a vacina e o vrus de referncia homotpico
apropriado. Este grupo subdividido em 2 subgrupos iguais, vricanos semi-cortes da espinal medula e do tronco cerebral
um dos quais recebe a preparao de referncia e o outro a dever estabelecer-se uma escala de gravidade das leses,
amostra. Reparta os macacos aleatoriamente entre os dois diferenciando infiltrao celular e destruio dos neurnios
subgrupos e nas jaulas e a sua identificao codificada do seguinte modo:
de modo a que o tratamento recebido por cada animal seja 1. Infiltrao celular isolada (o macaco no considerado
desconhecido dos observadores e daqueles que avaliam os como positivo),
cortes histolgicos. O nmero de macacos dever ser tal que
a avaliao da vacina e a avaliao da preparao de referncia 2. Infiltrao celular com leses neuronais mnimas,
tenham em cada uma pelo menos 11 macacos positivos no 3. Infiltrao celular com leses neuronais extensas,
caso dos vrus tipo 1 e 2 (entende-se por macaco positivo um
macaco que apresente leses neuronais especficas do vrus 4. Leses neuronais macias com ou sem infiltrao celular.
da poliomielite no sistema nervoso central) e pelo menos Os resultados obtidos so registados num formulrio
18 macacos positivos no caso do vrus tipo 3. Vrios lotes normalizado. Um macaco que apresente leses neuronais nos
de vacina podero ser testados com a mesma preparao de cortes, mas sem vestgios de passagem da agulha, dever ser
referncia homotpica. Os macacos so do mesmo grupo considerado positivo. Um macaco que apresente vestgios da
de quarentena; se for impossvel utilizar os macacos do passagem da agulha nos cortes, mas sem leses neuronais,
mesmo grupo de quarentena para a preparao de referncia no dever ser considerado positivo. Um corte que apresente
homotpica e para a amostra, utilize macacos provenientes
leses devidas a um traumatismo, mas que no apresente
de 2 grupos e um nmero igual de cada grupo recebe a
leso especfica do vrus, no dever ser registado.
preparao de referncia e a amostra, respectivamente. Se
o ensaio durar 2 dias, inocule em cada dia com a vacina e a As notas de gravidade relacionam-se com o exame dos semi-
preparao de referncia homotpica um nmero igual de cortes dos cortes histolgicos lombar (L), cervical (C) e do
macacos. cerebro (B). A nota de gravidade (NG) para cada macaco
positivo calculada do seguinte modo:
Concentrao em vrus das vacinas e das preparaes de
referncia inoculadas. A concentrao em vrus da vacina e
da preparao de referncia homotpica ajustado de modo
a estarem o mais prximo possvel um do outro e devero
situar-se entre 105,5 e 106,5 DICC50/0,1 ml.
Observao dos macacos. Mantenha todos os macacos em

observao durante 17 a 22 dias para detectar sintomas de
poliomielite ou de uma outra infeco vrica. Os macacos que Calcule em seguida uma nota de gravidade mdia para cada
sobreviverem mais de 24 h mas que morram antes do 110 dia grupo de macacos positivos.

2.6.21. Tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
Avaliao. A comparao da actividade da vacina e da N1 = Nmero de macacos positivos por vacina a testar,
preparao de referncia baseada na actividade vrica que
N2 = Nmero de macacos positivos para os 2 ensaios,
se manifesta ao nvel do alargamento lombar da espinhal
medula e do seu grau de extenso desde esta regio at ao 2,3 = Desvio normal ao nvel 1 por cento,
alargamento cervical e ao crebro. A deciso de aceitar ou
rejeitar a vacina baseada no conjunto dos resultados obtidos 2,6 = Desvio normal ao nvel 0,5 por cento,
em todos os animais submetidos prova. Se se manifesta em 1,6 = Desvio normal ao nvel 5 por cento.
2. Mtodos
Analticos
certos animais uma actividade de uma amplitude anormal,

seja ao nvel da regio lombar, seja por extenso noutras Um ensaio de neurovirulncia no qual a nota mdia de
regies, ter que se ter em conta para a avaliao definitiva. gravidade das leses obtidas para a preparao de referncia
A suspenso monovalente em granel satisfaz ao ensaio se (Xref) no for compatvel com os resultados previamente
se obtiver o nmero desejado de animais positivos e se obtidos no utilizado para avaliar uma vacina. Se o ensaio
nenhuma das observaes clnicas e histopatolgicas revelar for vlido, a nota mdia de gravidade das leses para a
diferenas significativas entre a patogenicidade da vacina e a da amostra (Xtest) calculada e comparada da vacina de
preparao de referncia. Os critrios de aceitao das vacinas referncia homotpica.
aps a avaliao da neurovirulncia so descritos adiante.
Critrios. Um nmero apropriado (por exemplo, 4) de ensaios
qualificantes efectuado em cada preparao de referncia
(tipos 1, 2 e 3), de maneira a obter dados sobre a actividade 2.6.20. TTULO EM HEMAGLUTININAS
dessas preparaes que iro servir de base aos critrios para as ANTI-A E ANTI-B(MTODO INDIRECTO)
vacinas a examinar. A nota geral mdia de gravidade das leses
(M) para os ensaios efectuados em cada vrus de referncia Prepare 2 sries idnticas de diluies da amostra numa
calculada ao mesmo tempo que a estimativa agrupada da soluo de cloreto de sdio a 9 g/l. A cada diluio da
variao intra-ensaio (s2) e do desvio padro intra-ensaio (s). primeira srie junte um volume igual de uma suspenso a 5
Os critrios de validade dos resultados de um ensaio realizado por cento V/V de glbulos vermelhos A1 lavados previamente
numa preparao de referncia so estabelecidos com base 3 vezes com soluo de cloreto de sdio a 9 g/l.
num conjunto de dados obtidos nos ensaios qualificativos. A cada diluio da segunda srie junte um volume igual de
No portanto possvel definir critrios de aplicabilidade uma suspenso a 5 por cento V/V de glbulos vermelhos
geral. Para os laboratrios que apenas tenham uma B lavados previamente 3 vezes com soluo de cloreto de
experincia limitada do ensaio de neurovirulncia, o mtodo sdio a 9 g/l.Incube a suspenso a 37C durante 30 min e
emprico abaixo descrito sobre o estabelecimento dos limites de seguida lave as clulas com soluo de cloreto de sdio
aceitveis para a nota mdia de gravidade para a vacina de a 9 g/l. Junte a cada suspenso um reagente antiglobulina
referncia (Xref) pode ser til: humana polivalente. Deixe em contacto durante 30 min. Sem
centrifugar as misturas, pesquise por exame microscpico a
Limite inferior Limite superior existncia de eventual aglutinao.
Tipos 1 e 2 M s M+s
Tipo 3 M s M+s
2 2.6.21. TCNICAS DE AMPLIFICAO
Se a nota mdia de gravidade para a vacina a examinar Xtest DOS CIDOS NUCLEICOS
C1 C2 e C3 forem constantes:
1. INTRODUO
A vacina s ser aceitvel se:
As tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos baseiam-se
Xtest Xref > C1 em 2 princpios distintos:
1. Amplificao de uma sequncia nucleotdica especfica
O ensaio pode ser repetido uma vez se: utilizando, por exemplo, a reaco de amplificao em
cadeia pela polimerase (PCR) ou pela ligase (LCR), ou
C1 < Xtest Xref < C2 da amplificao isotrmica de uma sequncia do cido
ribonucleico (ARN),
Se o ensaio for repetido, a mdia das notas de gravidade para
a amostra e para a vacina de referncia reavaliada e a vacina 2. amplificao de um sinal de hibridao utilizando, por
rejeitada se: exemplo, o mtodo chamado de ADN ramificado (ADNr),
para o cido desoxirribonucleico; neste caso a amplificao
do sinal conseguida sem submeter o cido nucleico a
repetitivos ciclos de amplificao.
As constates C1, C2 e C3 calculam-se como se segue: O mtodo de referncia descrito neste captulo a PCR.
Podem ser utilizados outros mtodos na condio de
satisfazerem as exigncias de qualidades especificadas a
seguir.
2. CAMPO DE APLICAO
O presente captulo define as exigncias aplicveis

preparao das amostras, amplificao in vitro de uma
sequncia de ADN e deteco do produto especfico

da reaco da PCR. A reaco da PCR permite detectar pontos a considerar incluem a deslocao do pessoal, o
sequncias definidas do ADN; permite igualmente a deteco vesturio, o fluxo do material, os sistemas de ventilao e os
do ARN aps transcrio inversa em ADN complementar procedimentos de descontaminao.
(ADNc) seguido de amplificao.
conveniente proceder a uma subdiviso do sistema em
reas, como por exemplo:
3. PRINCPIO DO MTODO
rea limpa (master-mix) (onde so manipulados os
2. Mtodos
Analticos
A PCR um mtodo que permite a amplificao especfica, in materiais que no contm a matriz, por exemplo os
vitro, de segmentos de ADN, ou de segmentos de ARN aps iniciadores, os tampes, etc.),
transcrio inversa em ADNc. rea pr-PCR (onde so manipulados os reagentes, as
Aps a desnaturao do ADN de cadeia dupla em ADN de amostras e os controlos),
cadeia simples 2 iniciadores oligonucleotidos sintticos de rea de amplificao pela PCR (os produtos da amplificao
polaridade oposta emparelham com as respectivas sequncias so manipulados em sistema fechado),
complementares do ADN a amplificar. O emparelhamento
dos iniciadores com a sequncia nucleotdica complementar rea de deteco ps-PCR (a nica rea onde so
ao ADN de cadeia simples d origem a pequenas sequncias manipulados os produtos da amplificao em sistema
de cadeias duplas que delimitam o segmento de ADN a aberto).
amplificar e servem de ponto de partida para a sntese do
ADN, realizada in vitro com uma polimerase de ADN termo- 5.2. Preparao das amostras
estvel. A preparao das amostras compreende a extraco ou a
A amplificao do ADN efectua-se em ciclos que consistem libertao da sequncia alvo a partir da amostra; o mtodo
em: utilizado para este efeito eficaz, reprodutvel e compatvel
com a realizao da amplificao nas condies de reaco
desnaturao pelo calor do cido nucleico (sequncia alvo) escolhidas. Podem ser utilizados diferentes mtodos de
em 2 cadeias simples, extraco fisico-qumica e/ou de enriquecimento.
emparelhamento especfico dos iniciadores com a Alguns aditivos presentes na amostra podem interferir na
sequncia alvo em condies de reaco apropriadas, PCR. Os procedimentos descritos no pargrafo 7.3.2. so
extenso, pela polimerase do ADN, dos iniciadores ligados utilizados para verificar a ausncia de inibidores na amostra.
a cada uma das 2 cadeias, a uma temperatura apropriada Quando a cadeia matriz de ARN, importante assegurar a
(sntese do ADN). ausncia de actividade do tipo da ribonuclease.
Os ciclos repetitivos de desnaturao pelo calor,
emparelhamento dos iniciadores e a sntese do ADN, 5.3. Amplificao
conduzem a uma amplificao exponencial do segmento do A amplificao pela PCR da sequncia alvo efectua-
ADN delimitado pelos iniciadores. -se em condies operatrias optimizadas (perfil da
O produto desta reaco especfica de amplificao, chamado temperatura para a desnaturao do ADN de cadeia dupla,
produto amplificado (amplicon), pode ser detectado emparelhamento e extenso dos iniciadores; tempos de
por diversos mtodos de especificidade e sensibilidade incubao para as temperaturas seleccionadas; variaes
apropriadas. de temperatura). Estas condies dependem de vrios
parmetros, tais como:
Os ensaios pela PCR multiplex utilizam vrios pares de
iniciadores concebidos para uma amplificao simultnea de tamanho e composio nucleotdica do iniciador e da
diferentes alvos numa s reaco. sequncia alvo,
tipo de polimerase do ADN, composio do tampo e
4. AMOSTRA volume de reaco utilizados na amplificao,
tipo de aparelho de ciclos trmicos (aparelho da PCR)
Devido grande sensibilidade da PCR, protegem-se utilizado e coeficiente de transmisso trmica entre o
convenientemente as amostras de qualquer contaminao aparelho, o tubo da reaco e o fludo de reaco.
externa pela sequncia alvo. A amostragem, a conservao
e o transporte das amostras, efectuam-se em condies 5.4. Deteco
que permitam reduzir ao mnimo os riscos de degradao
da sequncia alvo. No caso de sequncias alvo constitudas O produto amplificado (amplicon) produzido pela reaco
por ARN, so necessrias precaues especiais devido sua da PCR, pode ser identificado pelo seu tamanho, pela sua
elevada sensibilidade degradao pelas ribonucleases. sequncia, pela modificao qumica ou pela combinao
Tomam-se igualmente precaues especiais relativamente destes parmetros. A caracterizao pelo tamanho pode ser
a alguns aditivos (anticoagulantes ou conservantes, por efectuada por gel de electroforese (placas de agarose ou de
exemplo) que podem interferir no ensaio. poliacrilamida, ou electroforese capilar ou por cromatografia
em coluna (por exemplo, HPLC). A caracterizao pela
sequncia pode ser efectuada por hibridao especfica com
5. MTODO DO ENSAIO
sondas complementares da sequncia alvo, ou por clivagem
com enzima de restrio em locais especficos da sequncia
5.1. Preveno de contaminao
alvo. A caracterizao pela modificao qumica pode ser
O risco de contaminao tornam necessria uma eficiente efectuada, por exemplo, pela incorporao de um fluorforo
segregao das reas de trabalho, de acordo com os materiais nos produtos amplificados (amplicons) e posterior deteco
utilizados e as metodologias postas em prtica. Os principais da fluorescncia obtida aps excitao.

A deteco dos produtos amplificados (amplicons) pode 7.3. Controlos do ensaio

tambm ser realizada com sondas marcadas que permitem a
7.3.1. Controlos externos
subsequente deteco radioisotpica ou imunoenzimtica.
Para detectar eventuais contaminaes e controlar a
sensibilidade, convm incluir em todos os ensaios da PCR
6. AVALIAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS vrios tipos de controlos externos:
2. Mtodos
Analticos
O ensaio s vlido quando o(s) controlo(s) positivo(s) (so) um controlo positivo com um nmero definido de cpias
claramente positivo(s) e o(s) controlo(s) negativo(s) (so) da sequncia alvo, sendo este nmero prximo do limiar de
claramente negativo(s). Devido grande sensibilidade da resposta positiva e determinado especificamente para cada
PCR e dos riscos inerentes de contaminao, necessrio sistema de ensaio e expresso como um mltiplo do limiar
confirmar resultados positivos repetindo todo o ensaio de resposta positiva do sistema em questo,
2 vezes, se possvel com uma nova amostra. A amostra um controlo negativo constitudo por uma amostra da
declarada como positiva se, pelo menos, uma das repeties mesma matriz que demonstrou estar isenta de sequncias
der um resultado positivo. necessrio um sistema de ensaio alvo.
quantitativo desde que se defina um limite alvo mensurvel.
7.3.2. Controlos internos
7. GARANTIA DA QUALIDADE Os controlos internos so sequncias nucleotdicas

definidas contendo, salvo indicao em contrrio, os locais
7.1. Validao do sistema de ensaio da PCR de ligao do iniciador. Devem ser amplificados com a
mesma eficcia que a sequncia alvo, mas os respectivos
O programa de validao inclui uma validao de todos produtos amplificados (amplicons) podem ser claramente
os instrumentos e do mtodo PCR utilizado. Para este diferenciados. Estes controlos internos pertencem ao
efeito, seguem-se como guia, as Normas ICH (tpico Q2B): mesmo tipo de cido nucleico ADN/ARN) que a amostra. De
Validao analtica: metodologia. preferncia adicionam-se amostra, antes do isolamento do
cido nucleico, e tm por consequncia, um papel polivalente
indispensvel efectuar esta validao com preparaes de
no controlo do processo (extraco, transcrio inversa,
referncia de trabalho oficiais ou preparaes de referncia
amplificao, deteco).
de trabalho internas das sequncias alvo apropriadas,
calibradas por comparao com Padres Internacionais.
7.3.3. Controlo quantitativo
7.1.1. Determinao do limiar de resposta positiva
O padro utilizado nos ensaios quantitativos uma amostra
A validao inclui uma determinao do limiar de resposta contendo o produto analtico na concentrao definida
positiva, quer dizer, o nmero mnimo de sequncias alvo como limite mximo. O seu teor convenientemente
por unidade de volume que pode ser detectada em 95 por calibrado, em U.I., e analisado em paralelo em cada srie de
cento dos ensaios. Este valor depende de vrios factores determinaes quantitativas.
interdependentes, por exemplo, do volume da amostra
submetida a extraco e da eficcia do mtodo de extraco, 7.4. Avaliao externa da qualidade
da transcrio do ARN alvo em ADN complementar, do
Para cada laboratrio e cada operador, a participao em
processo de amplificao e da deteco.
programas externos da avaliao de qualidade constitui um
Para definir o limite de deteco do sistema utilizado, aspecto importante da garantia de qualidade em matria da
convm considerar o limiar de resposta positiva para cada PCR.
sequncia alvo e o comportamento do ensaio para cima ou
Esta seco dada a ttulo de informao.
para baixo do limiar de resposta positiva.
7.1.2. Sistema de ensaio quantitativo

Recomendaes para a validao das tcnicas
Para os ensaios quantitativos, a validao inclui a
determinao dos seguintes parmetros: exactido, preciso, de amplificao dos cidos nucleicos
especificidade, limite de quantificao, linearidade, intervalo para a deteco do arn do vrus da hepatite c
de medida e robustez. (vhc) nas misturas de plasma.
7.2. Controlo de qualidade dos reagentes

1. OBJECTIVO
Todos os reagentes que tm um papel importante na
metodologia posta em prtica so objecto de um controlo
antes de serem utilizados na rotina. A sua aceitao/rejeio A maioria das tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos
assenta em critrios de qualidade pr-definidos. so ensaios analticos qualitativos destinados a detectar
a presena de cidos nucleicos, havendo alguns ensaios
Os iniciadores constituem um dos componentes essenciais quantitativos, desenvolvidos internamente pelos laboratrios
da PCR e exigem por isso uma ateno particular na sua ou comercializados. Para detectar a contaminao de ARN
concepo, pureza e validao da sua aptido para utilizao do VHC nas misturas de plasma, so adequados os ensaios
num ensaio da PCR. Os iniciadores podem ser modificados qualitativos e podem ser considerados como ensaios limite
(por exemplo por conjugao com um fluorforo ou um para controlo de impurezas, como vem descrito no Guia
antignio) de forma a permitirem a utilizao de um mtodo Tcnico para elaborao das monografias, Pharmeuropa,
especfico de deteco do produto amplificado (amplicon), Dezembro de 1999, Captulo III Validao Analtica. Estas
desde que aquelas modificaes no inibam a preciso e a recomendaes descrevem os mtodos de validao das
eficcia da amplificao da sequncia alvo. tcnicas de amplificao dos cidos nucleicos aplicveis

apenas aos ensaios qualitativos destinados a detectar o O processo de amplificao utilizado para a deteco do
ARN do VHC nas misturas de plasma. Por conseguinte, ARN do VHC nas misturas de plasmas fornece geralmente
os 2 parmetros de validao considerados como os mais resultados.qualitativos. O nmero de resultados possveis
importantes so a especificidade e o limite de deteco. A limita-se a 2 respostas, positiva ou negativa. Embora seja
robustez tambm avaliada. recomendada a determinao do limite de deteco, por
razes prticas, determinado o limiar da resposta positiva
No entanto, este documento pode tambm ser utilizado para as tcnicas de amplificao do cido nucleico. O limiar
2. Mtodos
Analticos
como base de validao da generalidade das tcnicas de da resposta positiva, tal como definido no mtodo 2.6.21,
amplificao. o mnimo de sequncias alvo por unidade de volume que
O presente documento define uma tcnica analtica como pode ser detectada em 95 por cento dos ensaios. Este limiar
um conjunto de operaes efectuadas aps extraco do cido da resposta positiva influenciado pela distribuio dos
nucleico seguido de deteco dos produtos de amplificao genomas vricos nas amostras individuais ensaiadas e por
analtica e se a tcnica j tiver sido validada pelo fabricante, o factores tais como a eficcia da enzima que podem levar a
operador pode deixar de efectuar a validao. aconselhvel, diferenas de 95 por cento nos limiares da resposta positiva
no entanto, o operador demonstrar o rendimento do obtidos nas anlises individuais.
conjunto (kit) relativamente ao fim a que se destina Para determinar o limiar de resposta positiva, indispensvel
(por exemplo, limite de deteco, robustez, contaminao executar a tcnica em dias diferentes com uma srie
cruzada). de diluies de um reagente de trabalho ou do vrus da
hepatite C PBR, calibrado por comparao com o Padro
Internacional do VHC 96/790 da OMS, a fim de avaliar as
2. ESPECIFICIDADE variaes entre os vrios ensaios. So testadas, no mnimo,
3 sries de diluies separadas com um nmero suficiente
A especificidade a capacidade que permitir avaliar de replicaes de cada diluio de modo a obter um nmero
inequivocamente o cido nucleico procurado, na presena de total de 24 resultados por diluio e permitir assim a anlise
componentes susceptveis de estarem presentes. estatstica dos resultados.
A especificidade das tcnicas de amplificao dos cidos Por exemplo, um laboratrio testa 3 sries de diluies
nucleicos, depende da escolha de iniciadores, das sondas com 8 replicaes para cada diluio em dias diferentes, 4
(paraanlise do produto final) e do rigor das condies sries de diluio com 6 replicaes para cada diluio em
operatrias(para ambas as fases, amplificao e deteco). dias diferentes ou 6 sries de diluies com 4 replicaes
Na concepo dos iniciadores e das sondas, um dos aspectos para cada diluio em dias diferentes. Para que o nmero
a considerar a sua especificidade para a deteco do ARN de diluies utilizadas se mantenha igual, indispensvel
do VHC; para este efeito conveniente comparar, nos bancos efectuar um ensaio preliminar (como, por exemplo, diluies
de dados, as sequncias alvo com as sequncias publicadas. logartmicas de amostra da mistura de plasma para obter
Para o VHC, os iniciadores (e as sondas) so normalmente um valor preliminar do limiar de resposta positiva (ou
seja, a maior diluio em que ocorre um sinal positivo).
escolhidos das reas de regio 5' no codificvel do genoma
A distribuio das diluies pode ento ser efectuada com
do VHC que so as mais conservadas do conjunto de todos os
base neste valor preliminar pr-calculado (utilizando, por
genotipos.
exemplo, um factor de diluio de 0,5 log) ou inferior a uma
O produto amplificado identificado de forma inequvoca mistura de plasma negativo como matriz de diluio. O teor
utilizando 1 dos vrios mtodos de amplificao como com em ARN do VHC que pode ser detectado em 95 por cento
iniciadores imbricados, anlise de enzimas de restrio, dos ensaios pode ento ser calculado utilizando uma mtodo
sequncia ou hibridao com uma sonda especfica. estatstico apropriado.
Para validao de especificidade da tcnica, conveniente Estes resultados tambm servem para demonstrar a variao
testar no mnimo 100 misturas de plasma negativos para interna do ensaio e a variao do mtodo analtico nos vrios
o ARN do VHC e todos os resultados obtidos so negativos. dias.
O Directrio Europeu para a Qualidade dos Medicamentos
(EDQM) dispe de amostras apropriadas de plasmas
noreactivos. 4. ROBUSTEZ
A aptido da tcnica para detectar todos os genotipos do VHC, A robustez de uma tcnica a medida da sua capacidade
depende tambm da escolha dos iniciadores, das sondas e em permanecer inaltervel quando sujeita a uma pequena
dos parmetros operatrios. conveniente ser demonstrada mas deliberada variao nos parmetros operatrios; d
esta aptido com uma coleco de preparaes de referncia uma indicao da fiabilidade da tcnica nas condies
caracterizadas. Contudo, como difcil obter amostras de normais de utilizao. A avaliao da robustez uma dos
alguns genotipos (por exemplo o genotipo 6), genotipos aspectos a considerar durante a fase de desenvolvimento.
dominantes (por exemplo os genotipos 1 e 3 na Europa) so Permite estabelecer a fiabilidade da tcnica face s variaes
detectados a um nvel apropriado. deliberadas nos parmetros operatrios. Nas tcnicas de
amplificao dos cidos nucleicos pequenas variaes nos
parmetros operatrios podem ter uma especial importncia.
3. LIMITE DE DETECO Contudo, a robustez da tcnica de amplificao dos cidos
pode ser demonstrada durante o desenvolvimento do mtodo
O limite de deteco de uma tcnica individual a menor quando so ensaiadas pequenas variaes na concentrao
quantidade de cido nucleico que pode ser detectado numa de reagentes (por exemplo MgCl2, iniciadores de dNTP).
amostra, mas no necessariamente quantificada com um Para demonstrar a robustez durante a validao, examine,
valor exacto. no mnimo, 20 misturas de plasma (escolhidos ao acaso)

2.6.24. Vacinas vricas avirias: pesquisa de agentes estranhos nos lotes semente
negativos para ARN do VHC e aos quais adicionada uma 2 vezes em dias diferentes num total de 24 anlises efectuadas
concentrao tpica final que corresponde a 3 vezes o em 3 dias diferentes. Todos os resultados obtidos so positivos.
limiar da resposta positiva previamente determinada; todos
os resultados obtidos so positivos.
Podem surgir problemas com a robustez no caso de mtodos 2.6.22. FACTORES DE COAGULAO
que usem na fase inicial a ultracentrifugao em vez da ACTIVADOS
2. Mtodos
Analticos
extraco do ARN vrico. Por conseguinte para testar a

robustez desses mtodos, so ensaiadas, no mnimo, 20 Se a amostra contiver heparina, determine a quantidade
misturas de plasma contendo concentraes variadas de ARN existente, como se indica no ensaio Heparina, e neutralize-a
do VHC mas isentas de anticorpos especficos do VHC; todos juntando sulfato de protamina R (10 g de sulfato de
os resultados obtidos so positivos. protamina neutralizam 1 U.I. de heparina). Com a soluo
tampo de tris (hidroximetil) aminometano de pH 7,5 R.
conveniente demonstrar a ausncia de contaminao prepare diluies a 1/10 e 1/100. Coloque uma srie de tubos
cruzada pela deteco exacta de um conjunto de, pelo de polistireno em banho de gua a 37C. Introduza em cada
menos 20 amostras alternando amostras de misturas de tubo 0,1 ml de plasma pobre em plaquetas R e 0,1 ml de uma
plasma negativos e de misturas de plasma negativos ao qual diluio apropriada de reagente de cefalina R ou de substituto
foi adicionada uma alta concentrao do VHC no mnimo de plaquetas. Deixe em repouso durante 60 s e junte a cada
102 vezes 95 por cento do limiar de resposta positiva ou no tubo 0,1 ml de uma das diluies, e para o tubo de ensaio
mnimo 104 U.I./ml. em branco 0,1 ml da soluo tampo. Junte imediatamente
a cada tubo 0,1 ml de uma soluo de cloreto de clcio R a
3,7 g/l, previamente aquecida a 37C, e determine o intervalo
5. GARANTIA DA QUALIDADE de tempo entre a adio da soluo de cloreto de clcio e a
formao do cogulo; esta determinao efectuada nos 30
Os mtodos de ensaios biolgicos tais como a tcnica de min que se seguem primeira diluio. O ensaio s vlido se
amplificao dos cidos nucleicos, podem colocar problemas o tempo de coagulao do ensaio em branco for de 200 a 350 s.
especficos que interfiram com a validao e interpretao
dos resultados. So descritos com exactido os processos do
ensaio na forma de Procedimento Operatrio Normalizado
(PON) abrangendo os seguintes aspectos:
2.6.24. VACINAS VRICAS AVIRIAS:
PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS
modo de amostragem (tipo de recipientes, etc.),
NOS LOTES SEMENTE
preparao das mini-misturas (se for caso disso),
condies de conservao antes da anlise, DISPOSIES GERAIS
descrio exacta das condies operatrias (incluindo
precaues a ter, a fim de evitar contaminao cruzada a) Nos ensaios descritos a seguir, os frangos e/ou o material
ou destruio do ARN vrico) assim como dos reagentes e proveniente dos frangos, como os ovos e culturas
preparao de referncias utilizadas, celulares, so provenientes de bandos de frangos isentos
de microrganismos patognicos especficos (SPF) (5.2.2).
frmulas detalhadas do clculo dos resultados, incluindo
b) As culturas celulares destinadas s pesquisas de agentes
para a avaliao estatstica.
estranhos satisfazem s exigncias relativas s culturas
O uso de um controlo adequado (por exemplo, uma diluio de clulas primrias especificadas em 5.2.4. Culturas
apropriada do vrus da hepatite C para amplificao dos celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso
cidos nucleicos PBR ou de plasma ao qual foi adicionada veterinrio, com excepo da anlise cariotpica e do
uma amostra do VHC calibrada com o Padro Internacional poder tumorgeno que no so necessrios efectuar.
do VHC 96/790 da OMS) pode ser considerado como um c) No caso dos ensaios com culturas celulares, so fornecidas
meio satisfatrio estvel de controlo do sistema e assegurar a informaes precisas quanto ao nmero de passagens,
fiabilidade da tcnica em cada utilizao. s reas dos tapetes celulares e s taxas mnimas de
Qualificao tcnica: Para cada elemento crtico do sobrevivncia. So tambm possveis nmeros alternativos
equipamento utilizado criada uma instalao apropriada e das passagens e das reas dos tapetes celulares desde que
se utilizem, no mnimo, 2 passagens, a rea total dos
um programa de qualificao operatria. Depois de qualquer
tapetes e o volume total da amostra utilizada no sejam
modificao dum equipamento crtico (por exemplo o
inferiores ao aqui prescrito e as especificaes das taxas de
aparelho de ciclos trmicos) indispensvel reconfirmar
sobrevivncia sejam adaptadas em conformidade.
a aceitabilidade da tcnica procedendo em paralelo ao
exame de 8 amostras duma mistura de plasma ao qual se d) Nas preparaes liofilizadas, reconstitua-as com um
adicionou uma concentrao tripla de ARN do VHC daquela lquido apropriado. A no ser em casos especificados ou
que corresponde ao limiar de resposta positiva previamente justificados, a amostra contm uma quantidade de vrus
determinada; todos os resultados obtidos so positivos. equivalente, no mnimo, a 10 doses de vacina em 0,1 ml
de inculo.
Qualificao dos operadores: desenvolvido um programa
apropriado de qualificao para o conjunto de operadores e) Se o vrus do lote semente interferir na conduo ou na
implicados no ensaio. Para este efeito, conveniente cada sensibilidade do ensaio, proceda sua neutralizao com
operador examinar pelo menos 8 amostras de uma mistura um soro monoespecfico.
de plasma qual foi adicionada uma concentrao tripla de f) O soro monoespecfico ou o soro de origem aviria
ARN do VHC do correspondente ao limiar de resposta positiva utilizado nas culturas celulares ou noutras finalidades,
previamente determinada. Este ensaio (8 amostras) repetido esto isentos de anticorpos e livres de efeitos

inibitrios contra os organismos listados a seguir em 7. alantides no derem qualquer indicao da presena de
Especificaes para a presena de anticorpos nos soros agentes estranhos.
utilizados na pesquisa de agentes estranhos.
g) No caso de ser indicado numa monografia ou se houver 2. PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS EM CULTURAS DE
qualquer outra razo justificada, se for necessria a CLULAS RENAIS DE FRANGO
neutralizao do vrus do lote semente e esta for difcil de
2. Mtodos
conseguir, pode adaptar-se os ensaios in vitro descritos
Analticos
Prepare 7 culturas de clulas renais de frango em tapetes
a seguir, consoante as necessidades, para se obterem as celulares com uma superfcie de cerca de 25 cm2. Mantenha
garantias necessrias de ausncia de contaminao por 2 culturas de clulas como testemunhas negativas e trate da
um agente estranho. mesma forma que as 5 culturas de clulas inoculadas com
h) Alm dos ensaios indicados, podem ser utilizados outros a amostra como se descreve a seguir. Quando atingirem
tipos de ensaios desde que sejam, pelo menos, to a confluncia, elimine o meio de cultura. Inocule, em
sensveis e com a necessria especificidade. As tcnicas cada um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml da amostra. Deixe
de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21) podem adsorver durante 1 h, junte meio de cultura e incube
ser adaptadas para detectar especificamente numerosos as culturas durante um total de, pelo menos, 21 dias
agentes estranhos e utilizadas aps validao da sua efectuando passagens em intervalos de 4 a 7 dias. Realiza-
sensibilidade e especificidade. -se cada passagem misturando as clulas e o meio de
cultura dos tapetes celulares aps um ciclo de congelao-
-descongelao, seguido de inoculao de 0,1 ml desta
1. PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS EM OVOS mistura em 5 outros tapetes celulares com cerca de 25 cm2
EMBRIONADOS DE GALINHA de preparao recente. Na ltima passagem, efectue tambm
1 subcultura num substrato apropriado de forma a obter, a
Utilize a amostra, diluda se necessrio, contendo uma partir de cada um dos tapetes originais, um tapete de cerca
quantidade de vrus neutralizado equivalente, pelo menos, a de 10 cm2, para efectuar o ensaio A. O ensaio s vlido se
10 doses de vacina em 0,2 ml de inculo. Podem adicionar-se sobreviverem, pelo menos, 80 por cento dos tapetes celulares
antibiticos apropriados. Inocule a amostra em 3 grupos de em qualquer das passagens.
10 ovos embrionados de galinha de acordo com os seguintes Durante todo o perodo de incubao, efectue exames
vias de administrao: microscpicos frequentes de todas as culturas celulares para
grupo 1: 0,2 ml de inculo na cavidade alantide de cada
detectar eventuais sinais de efeitos citopatognicos ou outra
ovo embrionado com 9-11 dias de idade, prova de presena de agentes contaminantes na amostra.
No final do perodo total de incubao, efectue os seguintes
grupo 2: 0,2 ml de inculo na membrana corio-alantide de ensaios.
cada ovo embrionado com 9-11 dias de idade,
A. Fixe e core (por colorao de Giemsa ou hematoxilina/
grupo 3: 0,2 ml de inculo no saco vitelino de cada /eosina) cada um dos 5 tapetes celulares confluentes com
ovoembrionado com 5-6 dias de idade. cerca de 10 cm2 obtidos a partir dos tapetes celulares
originais. Examine as clulas ao microscpio para detectar
Efectue a miragem diria dos ovos durante 7 dias nos grupos qualquer efeito citopatognico, corpos de incluso,
1 e 2 e durante 12 dias no grupo 3. Elimine, considerando formaes sinciciais ou qualquer outra prova da presena
como no especficos, os embries mortos nas primeiras de agentes contaminantes na amostra.
24 h; o ensaio s vlido quando, pelo menos, 6 embries de
cada grupo sobrevivem mais de 24 h a seguir inoculao. B. Elimine o meio de cultura e lave cada um dos 5 tapetes
Proceda a um exame macroscpico de todos os embries celulares com cerca de 25 cm2 obtidos a partir dos tapetes
mortos aps as primeiras 24 h ou que sobrevivem ao perodo originais. Recubra as clulas com uma suspenso de
de incubao, para detectar eventuais anomalias. Examine eritrcitos de frango lavados a 0,5 por cento (utilizando,
tambm a membrana corio-alantide dos ovos para detectar pelo menos, 1 ml de suspenso para 5 cm2 de clulas)
Incube as clulas a 4C durante 20 min e a seguir lave
eventuais anomalias e efectue no lquido alantide uma
com precauo com uma soluo tampo salina de
pesquisa de agentes hemaglutinantes.
fosfatos de pH 7,4. Examine as clulas ao microscpio
Proceda a uma 2 passagem nos embries. Rena para detectar uma eventual hemadsoro atribuvel
separadamente os produtos obtidos dos embries mortos presena, na amostra, de agentes hemadsorventes.
e anormais e dos embries vivos. Inocule cada misture C. Efectue, com eritrcitos de frango, um controlo em
em 10 ovos embrionados pelas vias de administrao atrs cada meio de cultura, para detectar uma eventual
descritas, utilizando o material proveniente respectivamente hemaglutinao atribuvel presena de agentes
das membranas corio-alantides para a inoculao nas hemaglutinantes na amostra.
membranas corio-alantides, dos lquidos alantides para
a inoculao na cavidade alantide e do embrio para a O ensaio s vlido se for negativa a presena de agentes
inoculao no saco vitelino. Efectue a miragem diria estranhos nas testemunhas negativas. O lote semente
durante 7 dias dos ovos inoculados pelas vias alantide satisfaz ao ensaio se no for observado qualquer sinal da
e corio-alantides, procedendo aos exames descritos presena de agentes estranhos.
anteriormente. No caso dos ovos inoculados no saco
vitelino, efectue a miragem diria dos ovos durante 12 dias,
3. PESQUISA DE VRUS DA LEUCOSE AVIRIA
procedendo aos ensaios descritos anteriormente.
O lote semente satisfaz ao ensaio se nenhum embrio Utilize frangos considerados geneticamente sensveis aos
apresentar anomalias macroscpicas nem morrer devido a subgrupos A, B e J do vrus da leucose aviria e que permitam
causas atribuveis amostra e se o exame das membranas o crescimento dos vrus exgenos da leucose aviria mas
corio-alantides e os ensaios efectuados com os lquidos no os endgenos (a estirpe C/E apropriada). A partir dos

tecidos dos embries com idades entre 9 e 11 dias, prepare, sobreviverem aps determinada passagem. Prepare a ltima
pelo menos, 13 culturas celulares primrias ou secundrias subcultura num substrato apropriado de modo a obter uma
de fibroblastos. Cada tapete celular tem uma superfcie de superfcie de cerca de 10 cm2 de fibroblastos confluentes a
cerca de 50 cm2. partir de cada uma das 11 culturas originais para executar
o seguinte ensaio: efectue a pesquisa do vrus da retculo-
Quando atingirem a confluncia, elimine o meio de cultura.
endoteliose aviria por marcao imunolgica em cada uma
Inocule, em cada uma de 5 dessas culturas, 0,1 ml da
das 11 culturas de cerca de 10 cm2. O ensaio s vlido se o
2. Mtodos
Analticos
amostra. Deixe adsorver durante 1 h, e depois junte meio

vrus da retculo-endoteliose aviria for detectado em, pelo
de cultura. Inocule em 2 culturas celulares vrus da leucose
menos, 3 das 4 culturas que serviram de testemunhas positivas
aviria do subgrupo A (no mximo 10 DICC50 em 0,1 ml),
ou no for detectado em nenhuma das testemunhas negativas,
em 2 outras culturas inocule vrus da leucose aviria do
ou se as 2 testemunhas negativas no derem resultados
subgrupo B (no mximo 10 DICC50 em 0,1 ml) e em 2 outras
inconclusivos. Se mais do que 1 cultura infectada com a
culturas inocule vrus da leucose aviria do subgrupo J (no
amostra der um resultado no conclusivo, so efectuadas
mximo 10 DICC50 em 0,1 ml). Mantenha, pelo menos, 2
novas subculturas a partir dos fibroblastos guardados que so
culturas no infectadas como testemunhas negativas.
examinadas at obteno de um resultado inequvoco.
Incube as culturas durante um total de, pelo menos, 9 dias
O lote semente satisfaz ao ensaio se no houver qualquer
efectuando passagens em intervalos de 3 a 4 dias. Conserve as
sinal da presena do vrus da retculo-endoteliose aviria.
clulas de cada nvel de passagem e recolha as clulas no final
do perodo total de incubao. Lave as clulas de cada nvel
de passagem proveniente de cada cultura inicial e ponha-as 5. PESQUISA DE VRUS DA ANEMIA DO FRANGO
em suspenso numa soluo salina de tampo de barbital,
razo de 107 clulas por mililitro, com o objectivo de as Prepare 11 suspenses de 20 ml da linha celular MDCC-MSBI
examinar atravs de um ensaio de fixao do complemento ou de uma outra linha celular com equivalente sensibilidade,
para pesquisa de vrus da leucose aviria (ensaio COFAL), em frascos de 25 ml com cerca de 5 105 clulas/ml.
ou numa soluo salina tampo de fosfato com o objectivo Inocule 0,1 ml da amostra nas suspenses contidas nos 5
de as examinar por imunoadsoro com enzima conjugada frascos. Inocule em 4 outras suspenses 10 DICC50 de vrus
(ELISA). Efectue 3 ciclos de congelao-descongelao da anemia do frango, que serviro de testemunhas positivas.
para libertar o antignio especfico de grupo e efectue, em Mantenha, pelo menos, 2 culturas no infectadas. Incube
cada extracto, um ensaio COFAL ou um ensaio ELISA para todas as culturas durante um total de, pelo menos, 24
detectar a eventual presena do antignio especfico de grupo dias efectuando 8 subculturas em intervalos de 3 a 4 dias.
da leucose aviria. Durante as subculturas a presena do vrus da anemia do
O ensaio s vlido se o antignio especfico de grupo for frango pode ser indicada por uma alterao de colorao
detectado em, pelo menos, 5 das 6 culturas que serviram de origem metablica nas culturas infectadas, o meio de
de testemunhas positivas ou se nenhuma das testemunhas cultura torna-se vermelho quando comparado com o das
negativas der um resultado positivo, ou se as 2 testemunhas clulas testemunha. Pesquise ao microscpico um eventual
negativas no derem resultados inconclusivos. Se mais do efeito citopatognico nas culturas. Aps este exame ou no
que 1 cultura infectada com a amostra der um resultado final do perodo de incubao, centrifugue o contedo de
no conclusivo, so efectuadas novas subculturas a partir cada frasco a velocidade reduzida e ponha as clulas em
dos tapetes celulares guardados que so examinadas at suspenso razo de 106 clulas por mililitro e transfira 25 l
obteno de um resultado inequvoco. Se uma das culturas das diferentes suspenses para 10 poos de uma microplaca.
infectadas com a amostra der um resultado positivo, fica Examine as clulas por marcao imunolgica.
demonstrada a presena do vrus da leucose aviria na
O ensaio s vlido se o vrus da anemia do frango for
amostra.
detectado em, pelo menos, 3 das 4 culturas que serviram de
O lote semente satisfaz ao ensaio se no houver qualquer testemunhas positivas ou no for detectado em nenhuma
sinal da presena de vrus da leucose aviria. das culturas no infectadas. Se mais do que 1 cultura
infectada com a amostra der um resultado no conclusivo,
so efectuadas novas subculturas das suspenses da amostra
4. PESQUISA DE VRUS DA RETCULO-ENDOTELIOSE guardadas, que so examinadas at obteno de um
AVIRIA resultado inequvoco.
O lote semente satisfaz ao ensaio se no houver qualquer
Prepare 11 culturas primrias ou secundrias de fibroblastos
sinal da presena do vrus da anemia do frango.
de embrio de pinto com 9-11 dias de idade ou de fibroblastos
de embrio de pato com 13-14 dias de idade. Cada tapete
celular tem uma superfcie de cerca de 25 cm2. Quando
6. PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS EM PINTOS
atingirem a confluncia, elimine o meio de cultura. Inocule,
em cada uma de 5 dessas culturas, 0,1 ml da amostra.
Inocule em, pelo menos, 10 pintos, o equivalente a 100 doses
Deixe adsorver durante 1 h, e depois junte meio de cultura.
de vacina por via intramuscular e o equivalente a 10 doses
Inocule em 4 outras culturas o vrus da retculo-endoteliose
por instilao ocular. No caso de ser necessrio e justificado,
aviria (no mximo 10 DICC50 em 0,1 ml) que serviro de
podem ser utilizados pintos com 2 semanas de idade ou mais
testemunhas positivas. Mantenha 2 culturas no infectadas
velhos se o vrus do lote semente for patognico para aquela
como testemunhas negativas.
idade. A ttulo excepcional, nas vacinas inactivadas, o vrus
Incube as clulas durante um total de, pelo menos, 10 dias, pode ser neutralizado com soros especficos se, na idade da
efectuando 2 subculturas em intervalos de 3 a 4 dias. O ensaio administrao, o vrus do lote semente for patognico para as
s vlido se, pelo menos, 3 das 4 culturas de testemunhas aves. Repita as inoculaes 2 semanas mais tarde. Mantenha
positivas ou, pelo menos, 4 das 5 culturas inoculadas os pintos em observao durante 5 semanas a contar do
com a amostra ou as 2 culturas de testemunhas negativas dia da 1 inoculao. No administre nenhum agente

antimicrobiano aos pintos durante este perodo. O ensaio em 20 perus com idade de 4 semanas. O ensaio s vlido
s vlido se o nmero de pintos sobreviventes no final do se morrerem, no mximo, 20 por cento dos perus por
perodo de observao for superior a 80 por cento. causas no especficas. O lote semente satisfaz ao ensaio
se os cortes histolgicos do bao e do timo, efectuados em
No final do perodo de observao, colha uma amostra de
10 perus 2 semanas aps a inoculao, no evidenciarem
soro de cada pinto. Pesquise, em cada amostra de soro,
leses macroscpicas ou microscpicas (diferentes das
anticorpos contra os agentes listados a seguir (com excepo
atribuveis ao vrus da vacina) e se nenhum peru morrer
2. Mtodos
do vrus do mesmo tipo que o do lote semente), por um dos
Analticos
por causas atribuveis ao lote semente.
mtodos indicados.
So considerados como prova da presena no lote semente de C. Ensaios suplementares para pesquisa de agentes
agentes estranhos a observao de sinais clnicos nos pintos estranhos do pato
(para alm dos sinais atribuveis ao vrus do lote semente)
durante o perodo de observao e a deteco de anticorpos Se o vrus do lote semente ou os substratos de
nos pintos aps a inoculao (salvo os que so dirigidos multiplicao do vrus provm do pato, efectue tambm
contra o vrus do lote semente). uma pesquisa de anticorpos contra os seguintes agentes.
Recomenda-se conservar os soros desta aves de modo a poder
Agente Mtodo de ensaio
efectuar ensaios suplementares no caso de modificao das
exigncias. Chlamydia spp EIA
Parvovrus do pato e do ganso SN, EIA
A. Ensaios padro Vrus da enterite do pato SN
Vrus da hepatite vrica tipo I do pato SN
Agente Mtodo de ensaio
Adenovrus avirios, Grupo I SN, EIA, AGP O lote semente satisfaz ao ensaio se nenhum dos agentes
Vrus da encefalomielite aviria AGP, EIA
mencionados for detectado. O ensaio s vlido se no for
detectada a presena de anticorpos contra qualquer destes
Vrus da bronquite infecciosa aviria EIA, HI
agentes.
Vrus da laringotraquete infecciosa aviria SN, EIA, IS
Vrus da leucose aviria SN, EIA,
Vrus da nefrite aviria IS
D. Ensaios suplementares para a pesquisa dos agentes
estranhos do ganso
Reovrus avirios IS, EIA
Vrus da retculo-endoteliose aviria AGP, IS, EIA Se o virus do lote semente ou os substratos do vrus
Vrus da anemia do frango IS, EIA, SN provm do ganso, efectue igualmente uma pesquisa dos
Vrus da sndrome da queda da postura HI, EIA agentes seguintes.
Vrus da bursite infecciosa aviria Serotipo 1: AGP,
EIA, SN Agente Mtodo de ensaio
Serotipo 2: SN, Parvovrus do pato e do ganso SN, EIA
Vrus A da gripe AGP, EIA, HI Vrus da enterite do pato SN
Vrus da doena de Marek AGP Poliomavrus do ganso ensaio indicado adiante em
Vrus da pseudopeste aviria HI, EIA gansinhos ou outro ensaio
Vrus da rinotraquete do peru EIA apropriado
Salmonella pullorum Agg
Inocule por via subcutnea o equivalente a, pelo menos,
Agg: aglutinao, 10 doses em gansinhos receptivos com 1 dia de idade.
AGP: precipitao em gelose, Mantenha os gansinhos em observao durante 28 dias.
EIA: doseamento imunoenzimtico (por exemplo, ELISA), O ensaio s vlido se no mais de 20 por cento dos
IS: marcao imunolgica (por exemplo, anticorpos patinhos morrerem por causas no especficas. O vrus
fluorescentes), do lote semente satisfaz ao ensaio se nenhum gansinho
HI: inibio de hemaglutinao, morrer por causas atribuveis ao lote semente.
SN: seroneutralizao.
7. ESPECIFICAES PARA A PRESENA DE ANTICORPOS
B. Ensaios suplementares para pesquisa de agentes NOS SOROS UTILIZADOS PARA A PESQUISA DE AGENTES
estranhos do peru ESTRANHOS
Se o vrus do lote semente ou os substratos de
multiplicao do vrus provm do peru, efectue tambm Demonstra-se, com ensaios com adequada sensibilidade,
uma pesquisa de anticorpos contra os seguintes agentes. que todos os lotes de soros utilizados para a pesquisa de
agentes estranhos tanto para neutralizar o vrus da vacina
Agente Mtodo de ensaio (lote semente vrica ou lote de vacina), como utilizados
Chlamydia spp EIA como aditivos dos meios de cultura celular, esto isentos de
Vrus da enterite hemorrgica infecciosa aviria AGP anticorpos contra os microrganismos mencionados a seguir e
Paramixovrus avirio 3 HI no exercem, sobre estes, efeito inibidor.
Vrus da bursite infecciosa aviria tipo 2 SN Vrus da encefalomielite aviria
Vrus da bronquite infecciosa aviria
A pesquisa do vrus da doena linfoproliferativa do peru
efectua-se inoculando a amostra por via intraperitoneal Vrus da bursite infecciosa aviria 1 e 2

2.6.25 Vacinas vricas vivas avirias: pesquisa de agentes estranhos nos lotes de produto final
Vrus da enterite hemorrgica infecciosa aviria sobrevivncia. So tambm possveis nmeros de

passagens e das reas dos tapetes celulares alternativos
Vrus da laringotraquete infecciosa aviria
desde que se utilizem, no mnimo, 2 passagens, a rea
Vrus da leucose aviria total dos tapetes e o volume total da vacina utilizada no
sejam inferiores ao aqui prescrito e as especificaes das
Vrus da nefrite aviria taxas de sobrevivncia sejam adaptadas em conformidade.
Paramixovrus avirio 1 a 9
2. Mtodos
Analticos
d) Para realizar os ensaios, utilize directamente a vacina

Reovrus avirios lquida ou se esta se apresentar na forma liofilizada,
reconstitua-a numa determinada quantidade do lquido
Vrus da retculo-endoteliose aviria indicado no rtulo ou noutro lquido apropriado como por
Vrus da anemia do frango exemplo a gua para preparaes injectveis. A no ser em
casos especificados ou justificados, a amostra de vacina
Vrus da enterite do pato contm uma quantidade de vrus equivalente, no mnimo,
Vrus da hepatite vrica tipo I do pato a 10 doses de vacina em 0,1 ml de inculo.
Vrus da sndrome da queda da postura e) Se o vrus da vacina interferir na conduo ou na

sensibilidade do ensaio, proceda sua neutralizao com
Vrus da varola aviria um soro monoespecfico.
Vrus da gripe f) No caso de ser indicado numa monografia ou se houver
Vrus da doena de Marek qualquer outra razo justificada, se for necessria a
neutralizao do vrus da vacina e esta for difcil de
Herpesvrus do peru conseguir, pode adaptar-se os ensaios in vitro descritos
a seguir, consoante as necessidades, para se obterem as
Vrus da rinotraquete do peru.
garantias necessrias de ausncia de contaminao por
O soro no imune destinado a ser adicionado aos meios de um agente estranho. Em alternativa ou alm dos ensaios
cultura pode ser considerado isento de anticorpos contra in vitro realizados no lote, pode efectuar-se a pesquisa
um destes vrus se se souber que no infecta a espcie de agentes estranhos nos soros obtidos de pintos nos
animal donde o soro originrio; no , portanto necessrio ensaios no lote de vacina como se descreve em Pesquisa
efectuar pesquisa de anticorpos. Os soros monoespecficos de agentes estranhos em pintos em 2.6.24.-6: Pesquisa
que se destinam neutralizao vrica podem ser de agentes estranhos nos lotes semente.
considerados isentos de anticorpos contra um destes vrus
g) O soro monoespecfico ou o soro de origem aviria
se se demonstrar que o antignio imunizante no pode ter
utilizado nas culturas celulares ou para outras finalidades,
sido contaminado pelos antignios provenientes do vrus e
esto isentos de anticorpos e livres de efeitos inibitrios
se souber que este no infecta a espcie animal originaria
contra os organismos listados em Especificaes para a
do soro; no , portanto, necessrio efectuar pesquisa de
presena de anticorpos nos soros utilizados na pesquisa de
anticorpos. No necessrio controlar novamente os soros
agentes estranhos (2.6.24-7).
provenientes de aves pertencentes a bandos SPF (5.2.2).
Os lotes de soro destinados neutralizao do vrus da vacina h) Alm dos ensaios indicados, podem ser utilizados outros
no so preparados a partir de uma das passagens do isolado tipos de ensaios desde que sejam, pelo menos, to
vrico de onde originrio o lote semente primrio nem a sensveis e com a necessria especificidade. As tcnicas
partir do isolado multiplicado na mesma linha celular. de amplificao dos cidos nucleicos (2.6.21) podem
ser adaptadas para detectar especificamente numerosos
agentes estranhos e utilizadas aps validao da sua
sensibilidade e especificidade.
2.6.25 VACINAS VRICAS VIVAS
AVIRIAS: PESQUISA DE AGENTES
1. PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS EM OVOS
ESTRANHOS NOS LOTES DE PRODUTO EMBRIONADOS DE GALINHA
FINAL
Prepare a amostra de vacina, diluda se necessrio, para
DISPOSIES GERAIS conter uma quantidade de vrus neutralizado equivalente,
pelo menos, a 10 doses de vacina em 0,2 ml de inculo.
a) Nos ensaios descritos a seguir, os frangos e/ou o material Podem adicionar-se antibiticos apropriados. Com este
proveniente dos frangos, como ovos e culturas celulares, inculo, infecte 3 grupos de 10 ovos embrionados de galinha
so provenientes de bandos de frangos isentos de de acordo com as seguintes vias de administrao:
microrganismos patognicos especficos (SPF) (5.2.2). grupo 1: 0,2 ml de inculo na cavidade alantide de cada
b) As culturas celulares destinadas s pesquisas de agentes ovo embrionado com 9-11 dias de idade,
estranhos satisfazem s exigncias relativas s culturas
grupo 2: 0,2 ml de inulo na membrana corio-alantide de
de clulas primrias especificadas em 5.2.4 Culturas
cada ovo embrionado com 9-11 dias de idade,
celulares utilizadas na preparao de vacinas para uso
veterinrio, com excepo da anlise cariotpica e do grupo 3: 0,2 ml de inculo no saco vitelino de cada ovo
poder tumorgeno, que no so necessrios efectuar. embrionado com 5-6 dias de idade.
c) No caso dos ensaios com culturas celulares, so fornecidas Efectue a miragem diria dos ovos durante 7 dias nos
informaes precisas quanto ao nmero de passagens, grupos 1 e 2 e durante 12 dias no grupo 3. Elimine,
s reas dos tapetes celulares e s taxas mnimas de considerando como no especficos, os embries mortos

nas primeiras 24 h; o ensaio s vlido quando, pelo cerca de 10 cm2 obtidos a partir dos tapetes celulares
menos, 6 embries de cada grupo sobrevivem mais de 24 h originais. Examine as clulas ao microscpio para detectar
a seguir inoculao. Proceda a um exame macroscpico qualquer efeito citopatognico, corpos de incluso,
de todos os embries mortos aps as primeiras 24 h ou formaes sinciciais ou qualquer outra prova da presena
que sobrevivem ao perodo de incubao, para detectar de agentes contaminantes na amostra de vacina.
eventuais anomalias. Examine tambm a membrana corio-
B. Elimine o meio de cultura e lave cada um dos 5 tapetes
-alantide dos ovos para detectar eventuais anomalias
2. Mtodos
celulares com cerca de 25 cm2 obtidos a partir dos tapetes
Analticos
e efectue no lquido alantide uma pesquisa de agentes
originais. Recubra as clulas com uma suspenso de
hemaglutinantes.
eritrocitos de frango lavados, a 0,5 por cento (utilizando,
Proceda a uma 2 passagem nos embries. Rena pelo menos, 1 ml de suspenso para 5 cm2 de clulas).
separadamente os produtos obtidos dos embries mortos Incube as clulas a 4C durante 20 min e, a seguir, lave
e anormais e dos embries vivos. Inocule cada misture com precauo com uma soluo tampo salina de
em 10 ovos embrionados pelas vias de administrao atrs fosfatos de pH 7,4. Examine as clulas ao microscpio para
descritas, utilizando o material proveniente respectivamente detectar uma eventual hemadsoro atribuvel presena,
das membranas corio-alantides para a inoculao nas na amostra de vacina, de agentes hemadsorventes.
membranas corio-alantides, dos lquidos alantides para C. Usando eritrcitos de frango, efectue um controlo em
a inoculao na cavidade alantide e do embrio para a amostras de cada meio de cultura para detectar uma
inoculao no saco vitelino. Efectue a miragem diria eventual hemaglutinao atribuvel presena de agentes
durante 7 dias dos ovos inoculados pelas vias alantide hemaglutinantes na amostra.
e corio-alantides, procedendo aos exames descritos
anteriormente. No caso dos ovos inoculados no saco O ensaio s vlido se for negativa a presena de agentes
vitelino, efectue a miragem diria dos ovos durante 12 dias, estranhos nas testemunhas negativas. O lote de vacina
procedendo aos ensaios descritos anteriormente. satisfaz ao ensaio se no for observado qualquer sinal da
presena de agentes estranhos.
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se nenhum embrio
apresentar anomalias macroscpicas nem morrer devido
a causas atribuveis vacina e se o exame das membranas 3. PESQUISA DO VRUS DA SNDROME DA QUEDA
crio-alantides e os ensaios efectuados com os lquidos DA POSTURA
alantldes no derem qualquer indicao da presena de
agentes estranhos. Prepare 11 culturas de clulas hepticas de embrio de
pinto com 14-16 dias de idade em tapetes celulares com
uma superfcie de cerca de 25 cm2. Quando atingirem a
2. PESQUISA DE AGENTES ESTRANHOS EM CULTURAS DE
confluncia, elimine o meio de cultura. Inocule, em cada
CLULAS DE FIBROBLASTOS DE EMBRIO DE PINTO
um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml da amostra de vacina
(culturas problema). Deixe adsorver durante 1 h, e depois
Prepare 7 culturas primrias ou secundrias de fibroblastos junte meio de cultura. Inocule em 4 outras culturas uma
de embrio de pinto com 9-11 dias de idade em tapetes estirpe apropriada do vrus da sndrome da queda da postura
celulares com uma superfcie de cerca de 25 cm2. Mantenha (no mximo 10 DICC50 em 0,1 ml); estas culturas servem de
2 culturas de clulas como testemunhas negativas e trate testemunhas positivas. Mantenha 2 culturas no infectadas
da mesma forma que as 5 culturas de clulas inoculadas como testemunhas negativas.
com a vacina como se descreve a seguir. Quando atingirem
a confluncia, elimine o meio de cultura. Inocule, em cada Incube todas as culturas durante um total de, pelo menos,
um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml da amostra de vacina. 21 dias, efectuando subculturas em intervalos de 4 a 5
Deixe adsorver durante 1 h, junte meio de cultura e incube as dias do modo seguinte: efectue um ciclo de congelao-
culturas durante um total de, pelo menos, 21 dias efectuando -descongelao; prepare em separado as misturas de clulas
passagens em intervalos de 4 a 5 dias. Realiza-se cada e dos lquidos das culturas problema, das testemunhas
passagem misturando as clulas e o meio de cultura dos 5 positivas e das testemunhas negativas; inocule 0,1 ml da
tapetes celulares aps um ciclo de congelao-descongelao, cada mistura respectivamente em 5, 4 e 2 culturas celulares
seguido de inoculao de 0,1 ml desta mistura em 5 culturas com superfcie de cerca de 25 cm2, recentemente preparadas
celulares de fibroblastos de embrio de pinto de preparao a partir de clulas hepticas de embrio de pinto. O ensaio
recente com cerca de 25 cm2 como anteriormente. Na ltima s vlido se, pelo menos, 4 das 5 culturas problema ou,
passagem, efectue tambm 1 subcultura num substrato pelo menos 3 das 4 culturas de testemunhas positivas e as
apropriado de forma a obter, a partir de cada um dos tapetes 2 culturas testemunhas negativas sobreviverem em cada
originais, um tapete de cerca de 10 cm2, para efectuar o passagem.
ensaio A. O ensaio s vlido se sobreviverem, em qualquer
Examine com frequncia as culturas ao microscpio durante
das passagens, pelo menos, 80 por cento dos tapetes celulares
todo o perodo de observao para pesquisar algum eventual
inoculados com a amostra de vacina ou as 2 culturas que
efeito citopatognico ou outra indicao da presena de
serviram de testemunhas negativas.
algum agente estranho na amostra de vacina. No final do
Durante todo o perodo de incubao, efectue exames perodo total de incubao proceda do modo seguinte: com
microscpicos frequentes de todas as culturas celulares para eritrocitos de frango, examine separadamente os lquidos
detectar eventuais sinais de efeitos citopatognicos ou outra das culturas preparadas a partir das culturas problema, das
prova de presena de agentes contaminantes na amostra de testemunhas positivas e das testemunhas negativas para
vacina. No final do perodo total de incubao, efectue os pesquisar hemaglutinao atribuvel presena de agentes
seguintes ensaios. hemaglutinantes.
A. Fixe e core (por colorao de Giemsa ou hematoxilina/ O ensaio s vlido se o vrus da sndrome da queda da
/eosina) cada um dos 5 tapetes celulares confluentes com postura for detectado em, pelo menos, 3 das 4 culturas que

serviram de testemunhas positivas ou no for detectado em Prepare 11 culturas primrias ou secundrias de

nenhuma das testemunhas negativas, ou se as 2 testemunhas fibroblastos de embrio de pinto com 9-11 dias de idade
negativas derem resultados conclusivos. Se mais do que 1 em tapetes celulares com uma superfcie de cerca de
cultura infectada com a amostra de vacina der um resultado 25 cm2. Quando atingirem a confluncia, elimine o meio
no conclusivo, so efectuadas novas subculturas a partir de cultura. Inocule, em cada um dos 5 tapetes celulares,
dos tapetes celulares guardados que so examinadas at 0,1 ml da amostra de vacina (culturas problema). Deixe
obteno de um resultado inequvoco. adsorver durante 1 h, e depois junte meio de cultura.
2. Mtodos
Analticos
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer Inocule em 4 outras culturas uma estirpe apropriada do
sinal da presena de vrus da sndroma da queda da postura vrus da rinotraquete do peru (no mximo 10 DICC50 em
ou de qualquer outro agente estranho. 0,1 ml); estas culturas servem de testemunhas positivas.
Mantenha 2 culturas no infectadas como testemunhas
negativas. Incube todas as culturas durante um total
4. PESQUISA DE VRUS DA DOENA DE MAREK de, pelo menos, 21 dias, efectuando subculturas em
intervalos de 4 a 5 dias do modo seguinte: efectue um ciclo
Prepare 11 culturas primrias ou secundrias de fibroblastos de congelao-descongelao; prepare em separado as
de embrio de pinto com 9-11 dias de idade em tapetes misturas de clulas e dos lquidos das culturas problema,
celulares com uma superfcie de cerca de 25 cm2. Quando das testemunhas positivas e das testemunhas negativas;
atingirem a confluncia, elimine o meio de cultura. Inocule, inocule 0,1 ml da cada mistura respectivamente em 5, 4 e
em cada um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml da amostra de 2 culturas celulares com superfcie de cerca de 25 cm2,
vacina (culturas problema). Deixe adsorver durante 1 h e recentemente preparadas a partir de fibroblastos de
depois junte meio de cultura. Inocule em 4 outras culturas embrio de pinto. O ensaio s vlido se, pelo menos, 4
uma estirpe apropriada do vrus da doena de Marek (no das 5 culturas problema ou, pelo menos 3 das 4 culturas
mximo 10 DICC50 em 0,1 ml); estas culturas servem de de testemunhas positivas e as 2 culturas testemunhas
testemunhas positivas. Mantenha 2 culturas no infectadas negativas sobreviverem em cada passagem.
como testemunhas negativas.
Prepare a ltima subcultura num substrato apropriado de
Incube as culturas durante um total de, pelo menos, 21 modo a obter uma superfcie de cerca de 10 cm2 de clulas
dias, efectuando subculturas em intervalos de 4 a 5 dias confluentes a partir de cada uma das 11 culturas originais
do modo seguinte: trate as clulas com tripsina e prepare para executar o seguinte ensaio: efectue a pesquisa do
em separado as misturas de clulas culturas problema, vrus da rinotraquete do peru por marcao imunolgica
das testemunhas positivas e das testemunhas negativas; nas 11 culturas. O ensaio s vlido se o vrus da
misture uma quantidade apropriada de cada suspenso e rinotraquete do peru for detectado em, pelo menos, 3 das
uma preparao recente de fibroblastos embrio de pinto
4 culturas que serviram de testemunhas positivas ou no
primrios ou secundrios; prepare respectivamente em 5, 4 e
for detectado em nenhuma das testemunhas negativas,
2 culturas celulares como anteriormente. O ensaio s vlido
ou se as 2 testemunhas negativas derem resultados
se, pelo menos, 4 das 5 culturas problema ou, pelo menos
conclusivos. Se mais do que 1 cultura infectada com a
3 das 4 culturas de testemunhas positivas e as 2 culturas
amostra de vacina der um resultado no conclusivo, so
testemunhas negativas sobreviverem em cada passagem.
efectuadas novas subculturas a partir dos fibroblastos
Examine com frequncia as culturas ao microscpio durante guardados que so examinadas at obteno de um
todo o perodo de observao para pesquisar algum eventual resultado inequvoco.
efeito citopatognico ou outra indicao da presena de
algum agente estranho na amostra de vacina. O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer
sinal da presena de vrus da rinotraquete do peru ou de
Prepare a ltima subcultura num substrato apropriado de qualquer outro agente estranho.
modo a obter uma superfcie de cerca de 10 cm2 de culturas
confluentes a partir de cada uma das 11 culturas originais
B. Em clulas Vero
para executar o seguinte ensaio: efectue a pesquisa do vrus
da doena de Marek por marcao imunolgica em cada uma Prepare 11 culturas de clulas Vero em tapetes celulares
das 11 culturas de cerca de 10 cm2. O ensaio s vlido se o com uma superfcie de cerca de 25 cm2. Quando
vrus da doena de Marek for detectado em, pelo menos, 3 das atingirem a confluncia, elimine o meio de cultura.
4 culturas que serviram de testemunhas positivas ou no for Inocule, em cada um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml da
detectado em nenhuma das testemunhas negativas, ou se as 2 amostra de vacina (culturas problema). Deixe adsorver
testemunhas negativas derem resultados conclusivos. durante 1 h, e depois junte meio de cultura. Inocule em
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer 4 outras culturas uma estirpe apropriada do vrus da
sinal da presena de vrus da doena de Marek ou de qualquer rinotraquete do peru (no mximo 10 DICC50 em
outro agente estranho. 0,1 ml); estas culturas servem de testemunhas positivas.
Mantenha 2 culturas no infectadas como testemunhas
negativas.
5. PESQUISA DE VRUS DA RINOTRAQUETE DO PERU
Incube todas as culturas durante um total de, pelo
menos, 21 dias, efectuando subculturas em intervalos
A. Em fibroblastos de embrio de pinto
de 4 a 5 dias do modo seguinte: efectue um ciclo de
NOTA. este ensaio pode ser combinado com o ensaio congelao-descongelao; prepare em separado as
2 utilizando as mesmas culturas celulares inoculadas misturas de clulas e dos lquidos das culturas problema,
com a preparao de referncia e os mesmos controlos das testemunhas positivas e das testemunhas negativas;
negativos em todas as etapas at ao ensaio final especfico inocule 0,1 ml da cada mistura respectivamente em 5, 4
de pesquisa do vrus da rinotraquete do peru nas clulas e 2 culturas celulares com superfcie de cerca de
da ltima subcultura. 25 cm2, recentemente preparadas a partir de fibroblastos

de embrio de pinto. O ensaio s vlido se, pelo menos, Prepare 11 culturas primrias ou secundrias de clulas
4 das 5 culturas problema ou, pelo menos 3 das 4 culturas hepticas de embrio de pato da Barbria com 21-22 dias de
de testemunhas positivas e as 2 culturas testemunhas idade em tapetes celulares com uma superfcie de cerca de
negativas sobreviverem em cada passagem. 25 cm2. Quando atingirem a confluncia, elimine o meio de
cultura. Inocule, em cada um dos 5 tapetes celulares, 0,1 ml
Prepare a ltima subcultura num substrato apropriado
da amostra de vacina (culturas problema). Deixe adsorver
de modo a obter uma superfcie de cerca de 10 cm2 de
durante 1 h, e depois junte meio de cultura. Inocule em 4
2. Mtodos
Analticos
clulas confluentes a partir de cada uma das 11 culturas outras culturas uma estirpe apropriada do vrus da enterite
originais para executar o seguinte ensaio: efectue a do pato (no mximo 10 DICC50 em 0,1 ml); estas culturas
pesquisa do vrus da rinotraquete do peru por marcao servem de testemunhas positivas. Mantenha 2 culturas no
imunolgica nas 11 culturas com 10 cm2. O ensaio s infectadas como testemunhas negativas.
valido se vrus da rinotraquete do peru for detectado
em, pelo menos, 3 das 4 culturas que serviram de Incube todas as culturas durante um total de, pelo menos,
testemunhas positivas ou no for detectado em nenhuma 21 dias, efectuando subculturas em intervalos de 4 a 5 dias
das testemunhas negativas, ou se as 2 testemunhas do modo seguinte: trate as clulas com tripsina e prepare em
negativas derem resultados conclusivos. Se mais do separado as misturas das clulas problema, das testemunhas
que 1 cultura infectada com a amostra de vacina der positivas e das testemunhas negativas; misture uma parte
um resultado no conclusivo, so efectuadas novas de cada suspenso e uma suspenso de clulas hepticas
subculturas a partir dos tapetes celulares guardados primrias e secundrias de embrio de pato da Barbria;
que so examinadas at obteno de um resultado prepare respectivamente em 5, 4 e 2 culturas celulares
inequvoco. como anteriormente. O ensaio s vlido se, pelo menos, 4
das 5 culturas problema ou, pelo menos 3 das 4 culturas de
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer testemunhas positivas e as 2 culturas testemunhas negativas
sinal da presena de vrus da rinotraquete do peru ou de sobreviverem em cada passagem.
qualquer outro agente estranho.
Prepare a ltima subcultura num substrato apropriado de
modo a obter uma superfcie de cerca de 10 cm2 de culturas
6. PESQUISA DE VRUS DA ANEMIA DO FRANGO confluentes a partir de cada uma das 11 culturas originais
para executar o seguinte ensaio: efectue a pesquisa do vrus
Prepare 11 suspenses de 20 ml da linha celular MDCC-MSBI da enterite do pato por marcao imunolgica em cada uma
ou de uma outra linha celular com equivalente sensibilidade, das 11 culturas de cerca de 10 cm2. O ensaio s vlido se
em frascos de 25 cm2 com cerca de 5 105 clulas/ml. o vrus da enterite do pato for detectado em, pelo menos, 3
Inocule 0,1 ml da amostra de vacina nas suspenses contidas das 4 culturas que serviram de testemunhas positivas ou no
nos 5 frascos. Inocule em 4 outras suspenses 10 DICC50 for detectado em nenhuma das testemunhas negativas, ou
de vrus da anemia do frango, que serviro de testemunhas se as 2 testemunhas negativas derem resultados conclusivos.
positivas. Mantenha, pelo menos, 2 culturas no infectadas. Se mais do que 1 cultura infectada com a amostra de vacina
Incube todas as culturas durante um total de, pelo menos, der um resultado no conclusivo, so efectuadas novas
24 dias, efectuando 8 subculturas em intervalos de 3 a 4 dias. subculturas a partir dos tapetes celulares guardados, que so
Durante as subculturas a presena do vrus da anemia do examinadas at obteno de um resultado inequvoco.
frango pode ser indicada por uma alterao de colorao de
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer
origem metablica nas culturas infectadas, o meio de cultura
sinal da presena de vrus da enterite do pato ou de qualquer
torna-se vermelho quando comparado com o das clulas outro agente estranho.
testemunha. Pesquise ao microscpico um eventual efeito
citopatognico nas culturas. Aps este exame ou no final do
perodo de incubao, centrigue o contedo de cada frasco a 8. PESQUISA DOS PARVOVRUS DO PATO E DO GANSO
velocidade reduzida, suspenda-as razo de 106 clulas por
mililitro e transfira 25 l das diferentes suspenses para 10 O ensaio descrito a seguir efectua-se nas vacinas preparadas
poos de uma microplaca. Examine as clulas por marcao em substratos provenientes de pato ou de ganso.
imunolgica.
Prepare uma quantidade suficiente de fibroblastos primrios
O ensaio s vlido se o vrus da anemia do frango for e secundrios de embrio de pato da Barbria com 16-18
detectado em, pelo menos, 3 das 4 culturas que serviram de dias de idade para obter, pelo menos, 11 tapetes celulares
testemunhas positivas ou no for detectado em nenhuma das com uma superfcie de cerca de 25 cm2. Inocule 0,5 ml da
culturas no infectadas. Se mais do que 1 cultura infectada amostra de vacina numa quantidade de clulas suficiente
com a amostra de vacina der um resultado no conclusivo, para preparar 5 culturas e semeie 5 recipientes com estas
so efectuadas novas subculturas das suspenses da amostra clulas (culturas problema). Inocule 0,4 ml de uma estirpe
de vacina guardadas, que so examinadas at obteno de apropriada do parvovrus do pato (no mximo 10 DICC50 em
um resultado inequvoco. 0,1 ml) numa quantidade suficiente de clulas para preparar
4 culturas e semeie 4 recipientes com estas clulas; estas
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer culturas servem de testemunhas positivas. Mantenha 2
sinal da presena de vrus da anemia do frango ou de culturas no infectadas como testemunhas negativas.
Incube todas as clulas durante um total de, pelo menos,
21 dias, efectuando subculturas em intervalos de 4 a 5
7. PESQUISA DE VRUS DA ENTERITE DO PATO dias do modo seguinte: efectue um ciclo de congelao-
-descongelao; prepare separadamente as misturas
O ensaio descrito a seguir efectua-se nas vacinas preparadas de clulas e dos lquidos das culturas problema, das
em substratos provenientes de pato ou de ganso. testemunhas positivas e das testemunhas negativas; inocule

2.6.27. Controlo microbiolgico de produtos celulares
respectivamente 0,5 ml, 0,4 ml e 0,2 ml destas misturas Solues problema. Prepare uma primeira diluio da
em quantidades suficientes duma suspenso preparada amostra com PBS contendo 2 g/l de albumina bovina R, de
recentemente de fibroblastos primrios e secundrios de modo a obter uma concentrao inicial em imunoglobulina
embrio de pato da Barbria, para preparar respectivamente G (lgG) de 25 g/l e prepare 7 outras diluies em srie a 1/2
5, 4 e 2 culturas celulares como anteriormente. O ensaio com PBS contendo 2 g/l de albumina bovina R, de modo a
s valido se, pelo menos, 4 das 5 culturas problema ou, obter uma gama de diluies de 1/2 a 1/256. Prepare 2 sries
pelo menos 3 das 4 culturas testemunhas positivas e as independentes de diluies para cada preparao. Aplique
2. Mtodos
Analticos
2 culturas testemunhas negativas sobreviverem em cada 20 l de cada diluio nas sries de cavidades da placa de
passagem. microtitulao.Prepare suspenses a 3 por cento V/V em PBS
contendo 2 g/l de albumina bovina R, de eritrcitos D-positivos
Prepare a ltima subcultura num substrato apropriado de (OR2R2) e D-negativos (Orr) tratados pela papana. Junte 20 l
modo a obter uma superfcie de cerca de 10 cm2 de culturas de eritrcitos D-positivos a cada uma das sries de diluies de
confluentes a partir de cada uma das 11 culturas originais cada amostra, preparao de referncia e testemunha negativa
para executar o seguinte ensaio: efectue a pesquisa do vrus e 20 l de eritrcitos D-negativos a outras sries de diluies
da enterite do pato por marcao imunolgica em cada uma de cada amostra, preparao de referncia e testemunha
das 11 culturas de cerca de 10 cm2. O ensaio s vlido se negativa. Homogenize colocando a placa num agitador durante
o parvovrus do pato for detectado em, pelo menos, 3 das 4 10 s. Centrifugue a placa a 80 g durante 1 min para obter um
culturas que serviram de testemurhas positivas ou no for cogulo celular. Incline a placa a cerca de 70. Leia o resultado
detectado em nenhuma das testemunhas negativas, ou se as 2 aps 4-5 min ou aps verificao de um escoamento celular
testemunhas negativas derem resultados conclusivos. nas cavidades que contm as diluies do padro negativo e
nas cavidades onde foram adicionados eritrcitos D-negativos.
O lote de vacina satisfaz ao ensaio se no houver qualquer
A presenca de um aglutinado celular slido no fundo da
sinal da presena de parvovrus do pato ou de ganso, ou de
cavidade constitui um resultado positivo e a observao de um
escoamento celular constitui um resultado negativo.
Registe o ttulo no ponto final como o inverso da mais alta
2.6.26. ENSAIO DE ANTICORPOS diluio que d resultado positivo.
ANTI-D NA IMUNOGLOBULINA HUMANA O ttulo da amostra no superior ao ttulo da preparao de

referncia.
PARA VIA INTRAVENOSA
MATERIAL 2.6.27. CONTROLO MICROBIOLGICO

DE PRODUTOS CELULARES
Soluo salina tamponada de fosfato (PBS). Dissolva 8,0 g de
cloreto de sdio R, 0,76 g de fosfato dissdico anidro R, 0,2 g Este ensaio est demonstrado que prefervel ao ensaio de
de cloreto de potssio R e 0,2 g de azida de sdio R em gua R esterilidade (2.6.1) para determinados produtos celulares
e complete 1000 ml com o mesmo solvente. desde que o ensaio tenha uma melhor sensibilidade, um
Soluo de papana. Utilize uma soluo comercial de espectro mais alargado e seja mais rpido. Aplica-se em vez
papana de qualidade serolgica cuja actividade tenha sido do ensaio de esterilidade (2.6.1) quando prescrito numa
validada. monografia. Pode ser efectuado manualmente ou utilizando
um sistema automatizado.
Eritrcitos. Utilize misturas de eritrcitos obtidas a partir
de, pelo menos, 3 dadores do grupo OR2R2 e, pelo menos, 3
dadores do grupo Orr. Lave 4 vezes as clulas com PBS ou PRECAUES GERAIS
at obter um sobrenadante lmpido. Centrifugue a 1800 g
durante 5 min para obter um cogulo celular. Trate o cogulo O ensaio efectuado em condies de assepsia, de acordo
celular com soluo de papana de acordo com as instrues com as normas em vigor para materiais potencialmente
do fabricante. Conserve em soluo de Alsever durante, no infecciosos.
mximo, 1 semana.
As precaues tomadas para evitar uma contaminao
Placas para microtitulao. Utilize placas de microtitulao microbiana no devem afectar os microrganismos que
rgidas com cavidades de fundo em V. so pesquisados no ensaio. As condies do ensaio so
Padres de referncia. So convenientes como preparao de regularmente verificadas atravs de ensaios apropriados
referncia e testemunha negativa a imunoglobulina (pesquisa efectuados na zona de trabalho e por controlos apropriados.
dos anticorpos anti-D) PBR e a imunoglobulina (testemunha
negativa para a pesquisa dos anticorpos anti-D) PBR.
TESTE DE FERTILIDADE DOS MEIOS
Solues da preparao de referncia e solues da
testemunha negativa. Reconstitua a preparao de referncia Utilize, no mnimo, 2 meios de cultura de enriquecimento
e a testemunha negativa de acordo com as instrues. apropriados (por exemplo, meio para hemocultura)
Prepare uma primeira diluio das preparaes reconstitudas destinados deteco de fungos, de leveduras e de bactrias
misturando volumes iguais com PBS contendo 2 g/l de aerbias e anaerbias.
albumina bovina R, de seguida prepare 7 outras diluies
Confirme a esterilidade de cada lote de meio, por incubao
em srie a 1/2 com PBS contendo 2 g/l de albumina bovina
de recipientes representativos a 35-37C, no mnimo, durante
R de modo a obter uma gama de diluies de 1/2 at 1/256.
7 dias.
Prepare 2 sries independentes de diluies para cada
preparao. Aplique 20 l de cada diluio em sries de Em cada lote de meio efectuado um ensaio de fertilidade,
cavidades da placa de microtitulao. pelo fornecedor e/ou o utilizador, semeando 2 recipientes

2.6.27. Controlo microbiolgico de produtos celulares
do ensaio de cada meio com 10-100 microrganismos Streptococcus pyogenes por exemplo, ATCC 19615, CIP
viveis de cada uma das estirpes referidas no quadro 1042.26, NCIMB 13285,
e em seguida incube a 35-37C, durante 7 dias para a
Yersinia enterocolitica por exemplo, ATCC 9610, CIP 80.27,
deteco automatizada, ou 14 dias para a deteco visual
NCTC 12982.
de crescimento microbiano. Os meios de cultura so
considerados satisfatrios se for observada uma clara Pode ser necessrio modificar a lista de microrganismos, em
evidncia de crescimento durante este perodo de incubao funo da origem das clulas e de qualquer microrganismo
2. Mtodos
Analticos
em todos os recipientes semeados. previamente encontrado ou associado ao tipo de clulas
considerado.
Microrganismos utilizados para os testes de fertilidade dos meios
Podem igualmente ser utilizadas outras abordagens para
Meios aerbios
validao, por exemplo, a comparao entre laboratrios.
Staphylococcus aureus por exemplo, ATCC 6538, CIP 4.83,
NCTC 10788, NCIMB 9518
Bacillus subtilis por exemplo, ATCC 6633, Cl P 52.62,

ENSAIO DA PREPARAO PROBLEMA
NCIMB 8054
Amostra. Examina-se uma amostra representativa contendo
Pseudomonas aeruginosa por exemplo, ATCC 9027, clulas e/ou meio. Aps a colheita, a amostra adicionada o
NCIMB 8626, CIP 82.118 mais cedo possvel ao meio de cultura. Se no for adicionada
Candida albicans por exemplo, ATCC 10231, IP 48.72,
rapidamente aps a colheita, conservada a 5 3C, a fim de
NCPF 3179
evitar a fagocitose dos microrganismos, pelas clulas presentes
em determinados tipos de produtos (por exemplo, neutrfilos).
Aspergillus niger por exemplo, ATCC 16404, IP 1431.83,
IMI 149007
Para os produtos hematopoiticos, a quantidade mnima de
produto a utilizar para o ensaio, em funo do volume total
Meios anaerbios do produto (V ml) indicada a seguir.
Clostridium sporogenes por exemplo, ATCC 19404, CIP 79.3,
NCTC 532 ou ATCC 11437 Volume total do produto Volume de inculo
(mililitros)
Bacteroides fragilis por exemplo, ATCC 25285, CIP 77.16,
NCTC 9343
V 10 1 por cento do volume total
1 V < 10 100 l
VALIDAO DO MTODO V<1 No aplicvel
Em funo do tipo de produto, do seu mtodo de preparao, Para os produtos hematopoiticos que requerem
do volume de inculo utilizado e do tipo de sistema de ensaio, diluio antes da congelao, o volume de inculo deve
deve ser considerada a necessidade de uma validao em ser aumentado, em funo do factor de diluio. Para
presena do tipo da preparao problema. Salvo excepo os outros produtos celulares, as quantidades mnimas
justificada e autorizada, o sistema de ensaio validado em apropriadas so definidas em termos de volume ou do
termos de especificidade (ausncia de falsos positivos), de nmero de doses.
sensibilidade (limite de deteco) e de reprodutibilidade.
Durante a validao, e nomeadamente para a determinao
do limite de deteco, o ensaio efectuado na preparao Anlise. Imediatamente aps a colheita, semeie recipientes
deliberadamente contaminada, em diferentes graus com os contendo o meio de cultura com as amostras e incube a
seguintes microrganismos, escolhidos pela sua probabilidade de 35-37C, no mnimo, durante 7 a 14 dias, em funo do
serem contaminantes e pelas suas exigncias de crescimento: sistema de deteco utilizado. Uma proporo apropriada do
inculo adicionada a um meio para cultura em aerobiose e
Aspergillus niger; por exemplo, ATCC 16404, IP 1431.83, o restante inculo a um meio para cultura em anaerobiose.
IMI 149007,
Bacillus subtilis por exemplo, ATCC6633, CIP 52.62, OBSERVAO E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
NCIMB 8054,
Candida albicans por exemplo, ATCC1O231, IP 48.72, Examine os meios, visualmente ou com o auxlio de
NCPF 3179, sistemas automatizados, no mnimo, 1 vez por dia e no fim
do perodo de observao, para detectar sinais eventuais
Clostridium sporogenes por exemplo, ATCC 19404, CIP de crescimento microbiano. Se no for observado
79.3, NCTC 532 ou ATCC 11437, crescimento microbiano durante ou no fim do perodo de
Propionibacterium acnes por exemplo, ATCC 11827, observao, o produto considerado cultura negativa
para o limite de deteco. Se for observado crescimento
Pseudomonas aeruginosa por exemplo, ATCC 9027, NCIMB num ensaio vlido, o produto considerado cultura
8626, CIP 82.118, positiva; o contaminante identificado at um nvel
Staphylococcus aureus por exemplo, ATCC 6538, CIP 4.83, taxonmico apropriado (gnero, espcie) e estabelecido
NCTC 10788, NCIMB 9518, um antibiograma.

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.6 MTODOS BIOLGICOS (NDICE)
Analticos

2.7. AFERIES
BIOLGICAS
2. Mtodos
Analticos
2.7. Aferies biolgicas 231 2.7.14. Aferio da actividade da vacina contra a
2.7.1. Mtodos imunoqumicos 231 hepatite A 258
2.7.2. Aferio microbiolgica de antibiticos 232 2.7.15. Aferio da actividade da vacina contra a
2.7.4. Aferio do factor VIII da coagulao hepatite B (ADNr) 258
humana 238 2.7.16. Aferio da actividade da vacina acelularcontra
2.7.5. Aferio da heparina 239 a tosse convulsa 259
2.7.6. Aferio da actividade da vacina adsorvida 2.7.17. Aferio da antitrombina III humana 260
contra a difteria 240 2.7.18. Aferio do factor II da coagulao humana 260
2.7.7. Aferio da actividade da vacina contra a 2.7.19. Aferio do factor X da coagulao humana 261
tosse convulsa 246 2.7.20. Aferio da actividade in vivo da vacina
2.7.8. Aferio da actividade da vacina adsorvida inactivada contra a poliomielite 261
contra o ttano 247 2.7.21. Aferio do factor de von Willebrand humano 263
2.7.9. Aferio da funo Fc da imunoglobulina 252 2.7.22. Aferio do factor XI da coagulao humana 264
2.7.10. Aferio do factor VII da coagulao 2.7.23. Contagem das clulas CD34/CD45+ dos
humana 253 produtos hematopoiticos 265
2.7.11. Aferio do factor IX da coagulao 2.7.24. Citometria de fluxo 266
humana 254 2.7.27. ndice de floculao (Lf) de toxinas e anatoxinas
2.7.12. Aferio da heparina nos factores de diftrica e tetnica (aferio de Ramon) 269
coagulao 255 2.7.28. Aferio das clulas progenitoras
2.7.13. Aferio da imunoglobulina humana hematopoiticas formadoras de colnias 270
anti-D 255 2.7.29. Contagem e viabilidade das clulas nucleadas 271

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.7 AFERIES BIOLGICAS (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.7 AFERIES BIOLGICAS (NDICE)
2.7.1. Mtodos imunoqumicos
2.7. AFERIES BIOLGICAS utilizando partculas revestidas de anticorpos ou de

antignios (por exemplo, latex).
Nos mtodos de floculao utilizam-se geralmente diluies
2.7.1. MTODOS IMUNOQUMICOS sucessivas de um dos reagentes enquanto que no mtodo
de imunodifuso (ID), a diluio obtida por difuso num
Os mtodos imunoqumicos baseiam-se numa ligao gel: obtm-se gradientes de concentrao de um ou de
selectiva, reversvel e no covalente entre antignios e dois reagentes de modo a criar no gel zonas nas quais as
2. Mtodos
Analticos
anticorpos. Estes mtodos so utilizados para detectar ou propores de reagentes favorecem a precipitao. Enquanto
dosear, quer antignios, quer anticorpos. A deteco ou que os mtodos de floculao so efectuados em tubos de
doseamento do complexo antignio-anticorpo podem ser
ensaio, os mtodos de imunodifuso podem efectuar-se
efectuados por vrias tcnicas. Os requisitos deste mtodo
usando diferentes suportes, como provetas, placas, lminas,
aplicam-se aos mtodos imunoqumicos utilizados, consoante
tinas ou cmaras.
se utilizem reagentes marcados ou no marcados.
Chama-se imunoprecipitao simples quando o antignio
Os resultados dos mtodos imunoqumicos dependem das
reage apenas com o seu anticorpo correspondente;
condies da experincia, da natureza e da qualidade dos
diz-se complexa quando se utilizam vrios reagentes
reagentes utilizados. essencial aferir os componentes de um
serologicamente aparentados e mltipla quando se utilizam
ensaio imunolgico e utilizar Preparaes Internacionais de
vrios reagentes serologicamente no aparentados.
Referncia para Imunodoseamento sempre que disponveis.
Os reagentes necessrios a muitos dos mtodos No mtodo de difuso simples estabelece-se um gradiente de
imunoqumicos esto disponveis no mercado sob a forma de concentrao somente para um dos reagentes difundidos a
kits que incluem reagentes (especialmente o antignio ou partir de uma fonte exterior para dentro do gel que contm o
o anticorpo) e os materiais destinados avaliao in vitro reagente correspondente a uma concentrao relativamente
de uma determinada substncia, assim como as instrues baixa.
necessrias para a sua correcta utilizao. Os kits so A imunodifuso radial simples (IDRS) uma tcnica de
utilizados de acordo com as instrues do fabricante; imunodifuso simples quantitativa. Quando se estabelece
importante assegurar que estes kits sejam adequados para o equilbrio entre os reagentes externo e interno, a rea da
a anlise da amostra, especialmente no que diz respeito zona circular de precipitao originada a partir do reagente
selectividade e sensibilidade. Os requisitos relativos aos kits externo directamente proporcional concentrao
para imunodoseamento so fornecidos pela O.M.S. do antignio aplicado e inversamente proporcional
(Srie de Rapports techniques 658,1981). concentrao de anticorpos no gel.
Nos mtodos de difuso dupla os gradientes de concentrao
MTODOS EM QUE UTILIZADO UM ANTIGNIO so estabelecidos para dois reagentes.
OU UM ANTICORPO MARCADOS Tanto o antignio como o anticorpo difundem a partir de
locais separados num gel inicialmente neutro sob o ponto de
As tcnicas que utilizam substncias marcadas empregam vista imunolgico.
marcadores apropriados, tais como: enzimas, fluorforos,
luminforos e radioistopos. Quando o marcador um Os mtodos comparativos de imunodifuso dupla so
radioistopo chama-se tcnica ensaio radioimunolgico. utilizados para comparar qualitativamente vrios antignios
em relao a um anticorpo apropriado ou vice-versa. A
As instrues relativas medio da radioactividade comparao baseada na presena ou ausncia de interaco
fornecidas na monografia Preparaes radiofarmacuticas entre os padres de precipitao. E possvel distinguir
aplicam-se nos mtodos imunoqumicos que envolvem
reaces de identidade, de no identidade ou de identidade
radioistopos.
parcial entre anticorpos/antignios.
Todas as tcnicas efectuadas com substncias radioactivas
so feitas em conformidade com a legislao nacional e Mtodos de imunoelectroforese
internacional para proteco contra o risco de radiaes.
A imunoelectroforese (IE) uma tcnica qualitativa de
dois mtodos associados: electroforese em gel seguida de
MTODOS EM QUE UTILIZADO UM ANTIGNIO imunodifuso.
OU UM ANTICORPO NO MARCADOS
A imunoelectroforese cruzada uma modificao da
imunoelectroforese (IE), adaptada anlise qualitativa
Mtodos de imunoprecipitao e quantitativa. Num primeiro tempo realizada uma
Os mtodos de imunoprecipitao incluem reaces de electroforese clssica. Uma faixa do gel que contm as
floculao e de precipitao. fraces a analisar, que foram separadas pela electroforese,
depois recortada e transferida para outra placa. Esta nova
Quando uma soluo de um antignio misturada com um placa ento sujeita a uma segunda electroforese numa
anticorpo correspondente em condies apropriadas, os direco perpendicular faixa anterior, utilizando um gel
reagentes formam agregados floculantes ou precipitantes. que contm um teor relativamente baixo em anticorpos
A relao entre as quantidades de reagentes correspondente correspondentes ao antignio. Para uma dada concentrao
ao mais curto tempo de floculao ou precipitao mais de anticorpos e espessura do gel, a relao entre a rea
acentuada chama-se relao ptima. Esta geralmente de cada um dos picos de precipitao e a quantidade do
obtida em presena de quantidades equivalentes de antignio antignio correspondente linear.
e anticorpo.
O ensaio electroimunolgico muitas vezes referido como
A imunoprecipitao pode ser avaliada visualmente ou imunoelectroforese fusiforme um mtodo rpido para
pela medio da disperso da luz (ensaio nefelomtrico ou dosear os antignios cuja carga difere do anticorpo e vice-
turbidimtrico). Pode obter-se um aumento da sensibilidade -versa. A electroforese do antignio a dosear realizada

2.7.2. Aferio microbiolgica de antibiticos
num gel que contenha uma concentrao relativamente 1. O ensaio efectuado, pelo menos, em triplicado.
mais baixa do anticorpo correspondente. A substncia a
2. O ensaio inclui pelo menos trs diluies diferentes do
analisar e as diluies do antignio usadas para a calibrao
padro e trs diluies diferentes da amostra com suposta
so colocadas nas diferentes cavidades do gel. Durante a
actividade semelhante da preparao padro.
electroforese formam-se zonas de precipitao fusiformes
quemigram a partir das cavidades. Quando o antignio j no 3. A distribuio das amostras feita ao acaso.
est em excesso, a linha de precipitao torna-se estacionria.
2. Mtodos
Analticos
Para uma dada concentrao de anticorpos, a relao entre a 4. Se a amostra est presente no soro ou se est misturada
distncia percorrida pela linha de precipitao e a quantidade com outros constituintes, o padro preparado do mesmo
de antignio aplicada linear. modo.
A contra-imunoelectroforese um mtodo quantitativo 5. O ensaio inclui uma medida de ligao no especfica do

rpido que permite estabelecer gradientes de concentrao reagente marcado.
do antignio e anticorpos externos num campo elctrico, 6. Para ensaios radioimunolgicos com deslocamento:
dependente das suas diferentes cargas. As diluies de um
padro e as diluies da amostra so colocadas numa fila de a) determinada a ligao mxima (deslocamento-zero);
cavidades no gel. Uma quantidade conhecida de reagente b) as diluies cobrem a gama completa de respostas
correspondente colocada numa fila oposta de cavidades. O para os valores mais prximos da ligao no especfica
ttulo da substncia a dosear pode ser considerado como a ligao mxima, de preferncia tanto para a amostra como
maior diluio em que se observa uma linha de precipitao. para o padro.
Existem variantes da imunoelectroforese cruzada e do
imunoelectrodoseamento. CLCULO ESTATSTICO
Outras tcnicas associam a separao do antignio pelo
tamanho molecular e propriedades serolgicas. Para anlise dos resultados, as curvas de resposta da amostra
e do padro podem ser analisadas pelos mtodos descritos
em Anlise estatstica dos resultados de provas e testes
Visualizao e caracterizao das linhas biolgicos.
de imunoprecipitao
O no paralelismo significativo indica que o anticorpo
Podem ser efectuadas por coloraes selectivas ou no ou antignio distingue a amostra do padro e implica a
selectivas, por fluorescncia, por marcadores enzimticos, invalidao do resultado.
marcadores isotpicos ou por outras tcnicas apropriadas.
As coloraes selectivas so habitualmente utilizadas para a Nos imunodoseamentos com deslocamento, os valores de
caracterizao de substncias no proteicas nos precipitados. ligao no especfica e do deslocamento mximo a uma
elevada concentrao da amostra ou do padro no so
Nos geles translcidos, tais como agar ou agarose, a linha de significativamente diferentes. As diferenas podero reflectir
precipitao torna-se claramente visvel no gel, desde que a efeitos devidos a matriz, quer por inibio da ligao, quer
concentrao de cada um dos reagentes seja apropriada. por degradao do marcador.
VALIDAO DO MTODO
2.7.2. AFERIO MICROBIOLGICA
Critrios de validao. DE ANTIBITICOS
Um mtodo imunoqumico quantitativo s ser vlido se:
A actividade de um antibitico avalia-se comparando
1. O anticorpo ou o antignio no distingue a inibio da proliferao de microrganismos
significativamente a substncia a analisar do padro. No sensveisprovocada, respectivamente, por determinadas
caso de um reagente marcado, o reagente correspondente concentraes da amostra e de uma substncia de referncia.
no distingue de maneira significativa a substncia
marcada da no marcada. As preparaes de referncia utilizadas nas aferies so
substncias cuja actividade foi rigorosamente determinada
2. O mtodo no influenciado pela matriz do ensaio, quer em relao ao padro internacional correspondente ou
dizer, todos os componentes da amostra a analisar ou seus
preparao de referncia internacional.
excipientes, que podem variar de uma amostra a outra.
Estes podem incluir outras protenas, sais, conservantes O esquema experimental permite a verificao da validade
em concentraes elevadas ou exercer uma actividade de do modelo matemtico em que se baseia a equao da
contaminao proteoltica. actividade. Se for escolhido um modelo de linhas paralelas,
as 2 relaes log dose-resposta (ou resposta transformada),
3. O limite de quantificao estiver abaixo do critrio de
correspondentes amostra e preparao de referncia, so
aceitabilidade indicado na monografia especfica.
paralelas e lineares no intervalo das doses escolhidas para o
4. A exactido do doseamento seja tal que a variao dos clculo do ttulo. Estas condies so verificadas por provas
resultados corresponda s exigncias estabelecidas na de validade para um dado grau de probabilidade, geralmente
monografia especfica. P = 0,05. Podem ser utilizados outros modelos matemticos,
por exemplo o do coeficiente angular, desde que a validade
5. No ocorram erros sistemticos ligados ordem em que o
seja demonstrada.
ensaio realizado.
Salvo indicao em contrrio na monografia, os limites de
Mtodos de Validao
confiana (P = 0,95) da titulao no so inferiores a 95 por
Para que estes critrios sejam verificados, a validao inclui cento nem superiores a 105 por cento da actividade medida.
os seguintes elementos: Efectue a aferio pelo mtodo A ou pelo mtodo B.

A MTODO DE DIFUSO obter uma camada uniforme de 2 mm a 5 mm de espessura.

As caixas podem conter 2 camadas de meio, das quais s a
Liquefaa o meio adaptado s condies da aferio (ver superior semeada.
mais adiante) e inocule-o, a um a temperatura adequada, por
exemplo entre 48C e 50C para as formas vegetativas, com uma Conserve as caixas em condies tais que no haja nem
quantidade determinada duma suspenso de microrganismos proliferao nem morte dos microrganismos antes da
sensveis ao antibitico a aferir, que permita obter zonas de utilizao, altura em que a superfcie do meio est seca.
2. Mtodos
Analticos
inibio nitidamente delimitadas e com dimetro conveniente,
Utilize o solvente e a soluo tampo indicados no quadro
para as concentraes de antibitico utilizadas no ensaio.
1 para obter as solues da preparao de referncia e as
Verta imediatamente o meio, assim semeado, em caixas solues do antibitico a examinar, em concentraes
de Petri (ou em grandes caixas rectangulares), de forma a presumivelmente iguais.
QUADRO 1 Aferio por difuso
Solvente a utilizar Meio e pH final

Substncia Soluo Temperatura
Antibitico para preparar Microrganismo ( 0 1 unidade
de referncia tampo (pH) de incubao
a soluo-me de pH)
Saccharomyces
cerevisiae
Anfotericina B Anfotericina B SQR Dimetilsulfoxido R pH 10,5 (0,2 M) F-pH 6,1 35-37C
ATCC 9763
IP 1432-83
Micrococcus luteus
NCTC 7743
Bacitracina-zinco Bacitracina-zinco SQR cido clordrico 0,01 M pH 7,0 (0,05 M) A-pH 7,0 35-39C
CIP 53.160
ATCC 10240
Mycobacterium
Bleomicina Bleomicina
gua R pH 6,8 (0,1) M smegmatis G-pH 7,0 35-37C
(sulfato de) (sulfato de) SQR
ATCC 607
Bordetella
bronchiseptica
NCTC 8344
CIP 53.157
Colistimetato Colistimetato
gua R pH 6,0 (0,05 M) ATCC 4617 B-pH 7,3 35-39C
de sdio de sdio SQR
Escherichia coli
NCIB 8879
CIP 54.127
ATCC 10536
Bacillus subtilis
NCTC 8236
Di-hidro- Sulfato de di- CIP 1.83
estreptomicina -hidroestreptomicina gua R pH 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis A-pH 7,9 30-37C
(sulfato de) SQR NCTC 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
Bacillus pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
Eritromicina Metanol R
Eritromicina A SQR pH 8,0 (0,05 M) Bacillus subtilis A-pH 7,9 30-37C
(estolato de) (ver as monografias)
NCTC 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
Bacillus subtilis
NCTC 10400
CIP 52.62
Framicetina Sulfato de
gua R pH 8,0 (0,05 M) ATCC 6633 E-pH 7,9 30-37C
(sulfato de) framicetina SQR
Bacillus pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
Bacillus pumilus
NCTC 8241
CIP 76.18
Gentamicina Gentamicina
gua R pH 8,0 (0,05 M) Staphylococcus A-pH 7,9 35-39C
epidermidis
NCIB 8853
CIP 68.21
ATCC 12228

QUADRO 1 Aferio por difuso (continuao)

Antibitico para preparar Microrganismo (0 1 unidade
a soluo me de pH)
Bacillus subtilis
Metanol R CIP 52.62
Josamicina Josamicina SQR pH 5,6 A-pH 6,6 35-37C
(ver a monografia) ATCC 6633
2. Mtodos
Analticos
NCTC 10400
Bacillus subtilis
Josamicina Propionato de Metanol R CIP 52.62
(propionato de) josamicina SQR (ver a monografia) pH 5,6 ATCC 6633 A-pH 6,6 35-37C
NCTC 10400
Canamicina Bacillus subtilis E-pH 7,9 30-37C

(monosulfato de) NCTC 10400
CIP 52.62
Canamicina ATCC 6633
gua R pH 8,0 (0,05 M)
(monosulfato de) SQR Staphylococcus E-pH 7,9 30-37C
aureus
Canamicina NCTC 7447
CIP 53.156
(sulfato cido de)
ATCC 6538P
Bacillus subtilis E-pH 7,9 30-37C

NCTC 10400
CIP 52.62
Neomicina Neomicina
(sulfato de) SQR gua R pH 8,0 (0,05 M) ATCC 6633
(sulfato de)
Bacillus pumilus E-pH 7,9 30-37C
NCTC 8241
CIP 76.18
Staphylococcus
Netilmicina Netilmicina aureus A-pH 7,9 32-35C
(sulfato de) SQR gua R pH 8,0 0,1
(sulfato de) ATCC 6538P
CIP 53.156
Candida tropicalis F-pH 6,0 30-37C

CIP 1433-83
pH 6,0 (0,05 M) NCYC 1393
contendo Saccharomyces F-pH 6,0 30-32C
Nistatina Nistatina SQR Dimetilformida R
5 por cento V/V de cerevisiae
dimetilformamida NCYC 87
CIP 1432-83
ATCC 9763
Micrococcus luteus
Rifamicina Rifamicina pH 7,0 (0,05 M) NCTC 8340
Metanol R
sdica sdica SQR CIP 5345 A-pH 6,6 35-39C
ATCC 9341
Bacillus subtilis
pH 8,0 (0,05 M) NCTC 10400
Espiramicina Espiramicina SQR Metanol R
CIP 52.62 A-pH 7,9 30-32C
ATCC 6633
Bacillus subtilis A-pH 7,9 30-37C

NCTC 8236
CIP 1.83
Estreptomicina Estreptomicina gua R pH 8,0 (0,05 M) Bacilhis subtilis A-pH 7,9 30-37C
(sulfato de)
(sulfato de) SQR NCTC 10400
CIP 52.62
ATCC 6633
Tilosina para uso Mistura de 40

veterinrio Metanol R a 2,5 por volumes de
Micrococcus luteus
cento V/V, em metanol
Tilosina SQR NCTC 8340
soluo tampo R com 60 volumes A-pH 8,0 32-35C
Tilosina (tartarato CIP 5345
de fosfato de pH 7,0 de soluo tampo
de) ATCC 9341
(0,1 M) R de fosfato de pH 8,0
para uso veterinrio (0,1 M) R
Bacillus subtilis
Vancomicina Vancomicina NCTC 8236
gua R pH 8,0
(cloridraro de) (cloridrato de) SQR ATCC 6633 A-pH 8,0 37-39C
CIP 52.62

Coloque as solues quer em cilindros estreis de porcelana, conforme os casos a fim de reduzir os efeitos das diferenas
de ao inoxidvel ou de qualquer outra matria apropriada, dos tempos de colorao das diversas solues nas placas e,
dispostos sobre a superfcie do meio de cultura, quer em assim, melhorar o declive da regresso.
cavidades abertas na gelose (o volume de soluo a lanar em
cada cilindro ou em cada cavidade uniforme), quer ainda Determine os dimetros com uma preciso de 0,1 mm,
em discos de papel absorvente de qualidade apropriada e pelo menos, ou as superfcies das zonas de inibio com
estreis, impregnados de solues da preparao de referncia uma preciso correspondente. Calcule o ttulo da amostra,
2. Mtodos
Analticos
ou de solues da amostra, antes de serem colocados sobre a utilizando os mtodos estatsticos apropriados.
superfcie da gelose. O nmero de repeties por dose em cada aferio suficiente
Para garantir a validade da determinao, utilize, pelo menos, para garantir a preciso requerida. O ensaio pode ser repetido,
3 doses diferentes da preparao de referncia, assim como e os resultados combinados estatisticamente, a fim de obter a
3 doses da amostra que tenham presumivelmente a mesma exactido necessria e de verificar que a actividade da amostra
actividade das doses da substncia de referncia. Recomenda- no inferior actividade mnima exigida.
-se a utilizao de sries de doses em progresso geomtrica.
Nas aferies correntes, quando a linearidade do sistema for B MTODO TURBIDIMTRICO
demonstrada por um nmero adequado de experincias no
ensaio com 3 pontos, poder ser suficiente efectuar a aferio
Semeie o meio apropriado com uma suspenso do
somente sobre 2 pontos. Todavia, em caso de recurso, a prova
microrganismo escolhido (ver mais adiante) sensvel
deve ser feita sobre 3 pontos, como antes indicado.
amostra de modo a obter uma diminuio importante da
Disponha as solues em cada caixa de Petri ou em cada cultura microbiana nas condies do ensaio. Utilize uma
placa rectangular de acordo com um plano estatisticamente quantidade determinada da suspenso, de forma a conseguir
apropriado. No caso das caixas de Petri que no comportem uma opacidade facilmente mensurvel aps uma incubao
mais de 6 solues, recomenda-se alternar a disposio das de cerca de 4h.
solues da amostra a da substncia de referncia, para evitar
qualquer interaco entre as solues mais concentradas. Utiliza-se imediatamente o meio semeado.
Incube a temperatura apropriada, durante cerca de 18 horas. Use o solvente e a soluo tamponada indicados no quadro
Antes da incubao pode ser necessrio aguardar um perodo 2 para obter as solues da preparao de referncia e as
de difuso de 1h a 4 h temperatura ambiente ou a 4C, solues da amostra, em concentraes consideradas iguais.
QUADRO 2 Aferio turbidimtrica

a soluo me de pH)
Escherichia coli
Colistimetato de Colistimetato de NCIB 8666
sdio sdio SQR gua R pH 7,0 C-pH 7,0 35-37C
CIP 2.83
ATCC 9637
Klebsiella
Di-hidro- Sulfato de di-hidro- pneumoniae
-estreptomicina estreptomicina gua R pH 8,0 NCTC 7427 C-pH 7.0 35-37C
(sulfato de) SQR CIP 53.153
ATCC 10031
Eritromicina Klebsiella D-pH 7,0 35-37C

(estolato de) pneumoniae
NCTC 7427
CIP 53.153
Eritromicina A SQR Metanol R pH 8,0 ATCC 10031
(ver monografias) Staphylococcus C-pH 7,0 35-37C
aureus
NCTC 7447
Eritromicina CIP 53.156
(etilsuccinato de) ATCC 6538 P
Staphylococcus
aureus
Framicetina Sulfato de
gua R pH 8,0 NCTC 7447 C-pH 7,0 35-37C
(sulfato de) framicetina SQR
CIP 53.156
ATCC 6538 P
Staphylococcus
Gentamicina aureus
Gentamicina
(sulfato de) gua R pH 7,0 NCTC 7447 C-pH 7,0 35-37C
(sulfato de)
SQR CIP 53.156
ATCC 6538 P

QUADRO 2 Aferio turbidimtrica (continuao)

a soluo me de pH)
Enterococcus hirae
2. Mtodos
Analticos
CIP 58.55
Gramicidina Gramicidina SQR Metanol R pH 7,0 (1) ATCC 10541 C-pH 7,0 35-37C
Staphylococcus
aureus
ATCC 6538 P
Staphylococcus
aureus
Metanol R
Josamicina Josamicina SQR pH 5,6 NCTC 7447 C-pH 8,0 35-37C
(ver a monografia)
CIP 53.156
ATCC 6538P
Staphylococcus
aureus
Josamicina Propionato de Metanol R
pH 5,6 NCTC 7447 C-pH 8,0 35-37C
(propionato de) josamicina SQR (ver a monografia)
CIP 53.156
ATCC 6538P
Canamicina Staphylococcus
(monosulfato de) aureus
Canamicina
gua R pH 8,0 NCTC 7447 C-pH 7,0 35-37C
(monosulfato de) SQR
Canamicina CIP 53.156
(sulfato cido de) ATCC 6538P
Staphylococcus
Neomicina
aureus
Neomicina (sulfato de) para
gua R pH 8,0 NCTC 7447 C-pH 7,0 35-37C
(sulfato de) aferio
CIP 53.156
microbiolgica SQR
ATCC 6538 P
Escherichia coli
NCIB 8879
Rifamicina sdica Rifamicina sdica SQR Metanol R pH 7,0 C-pH 7,0 35-37C
CIP 54.127
ATCC 10536
Staphylococcus
aureus
Espiramicina Espiramicina SQR MetanoI R pH 7,0 NCTC 7447 C-pH 7,0 35-37C
CIP 53.156
ATCC 6538 P
Klebsiella
pneumoniae
Estreptomicina Estreptomicina
gua R pH 8,0 NCTC 7427 C-pH 7,0 35-37C
CIP 53.153
ATCC 10031
Tilosina para uso Metanol R a 2,5 por Staphylococcus

veterinrio cento V/V, em aureus
Tilosina SQR soluo tampo pH 7,0 NCTC 6571 C-pH 7,0 37C
Tilosina (tartarato de) de fosfato de pH 7,0 CIP 53.154
para uso veterinrio (0,1 M) R ATCC 9144
Enterococus
Etanol a Etanol a hirae
Tirotricina Gramicidina SQR 96 por cento R 96 por cento R ATCC 10541
C-pH 7,0 35-37C
Staphylococcus
Vancomicina Cloridrato de aureus
gua R pH 8,0 C-pH 7,0 37-39C
(cloridrato de) vancomicina SQR
CIP 53.156
ATCC 6538 P

Para verificar a validade da aferio, utilize, pelo menos, Preparao do inculo. Bacillus cereus var. mycoides;
3 doses diferentes da substncia de referncia e tambm 3 Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Prepare as suspenses de
doses da amostra que presumivelmente possuam actividade esporos dos microrganismos destinados a serem utilizados,
igual das doses da substncia de referncia. Recomenda-se a procedendo como seguidamente se indica.
utilizao de sries de doses em progresso geomtrica.
Cultive o microrganismo a 35-37C durante 7 dias, superfcie
Para o clculo, pode ser necessrio utilizar, de entre um de um meio apropriado, previamente adicionado de 0,001 g/l
maior nmero, apenas 3 doses consecutivas correspondentes
2. Mtodos
de sulfato de mangansio R. Por meio de lavagem com gua R
Analticos
da soluo de referncia e da soluo em ensaio, que estril, recolha a cultura que constituda principalmente por
permitam obter a linearidade requerida. esporos. Aquea a suspenso a 70C durante 30 min e dilua-a
Utilize para o ensaio tubos idnticos. Junte a cada um deles de forma a obter uma concentrao conveniente de esporos
um volume igual de cada soluo e um mesmo volume de (geralmente 10 a 100 106 esporos por mililitro). A suspenso
meio nutritivo semeado (por exemplo 1 ml da soluo e 9 ml de esporos pode ser conservada durante longo perodo a uma
de meio). Para a aferio da tirotricina, junte 0,1 ml de temperatura que no ultrapasse 4C.
soluo a 9,9 ml de meio semeado.
Uma suspenso de esporos pode ser igualmente preparada
Prepare simultaneamente 2 tubos testemunha sem por cultura de microrganismos a 26C durante 4 a 6 dias no
antibitico, contendo ambos, meio nutritivo semeado. O 2 meio C. Adicione assepticamente uma quantidade suficiente
ser adicionado imediatamente de 0,5 ml de formaldedo R. de sulfato de mangansio R para obter uma concentrao
Estes tubos servem para calibrar o aparelho ptico utilizado de 0,001 g/l e incube durante 48 h. Verifique, por exame
na medio do crescimento. microscpico, a presena de esporulao conveniente (cerca
Disponha convenientemente todos os tubos, quer ao acaso, de 80 por cento) e em seguida proceda centrifugao.
quer em quadrado latino, quer ainda sob a forma de bloco Prepare uma nova suspenso do sedimento em gua R estril,
aleatrio, num banho de gua ou num outro conveniente, de modo a obter uma concentrao de 10 a 100 106 esporos
de modo a permitir que todos atinjam a temperatura de por mililitro. Aquea a 70C durante 30 min. Conserve a
incubao indicada. Mantenha-os a essa temperatura durante suspenso a uma temperatura que no ultrapasse 4C.
3-4 h. Exera vigilncia para assegurar uma temperatura
uniforme e uma durao de incubao idntica. Bordetella bronchiseptica. Cultive o microrganismo de prova
a 35-37C durante 16 a 18 h sobre o meio B. Retire, por
Aps a incubao, suspenda o crescimento das culturas, por lavagem com gua R estril, os elementos bacterianos que
exemplo pela adio a cada tubo de 0,5 ml de formaldedo R se cultivaram e dilua a suspenso de maneira a obter uma
ou pelo calor e mea a opacidade por meio de um aparelho opacidade adequada.
ptico apropriado, com uma preciso que v at 3 algarismos
significativos. Pode ser utilizado outro processo que Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae; Escherichia
permita medir a opacidade de cada tubo aps um perodo de coli; Micrococcus luteus; Staphylococcus epidermidis.
incubao idntico. Efectue a preparao como acima foi indicado para B.
bronchiseptica, utilizando o meio A e ajustando a opacidade
Calcule o ttulo da amostra, utilizando os mtodos
de modo a obter um valor que se tenha revelado capaz
estatsticos apropriados.
de fornecer uma relao satisfatria dose-resposta na
A linearidade da relao dose-resposta, transformada ou no, aferio por turbidimetria ou de provocar zonas de inibio
frequentemente obtida num limitado intervalo de doses; nitidamente delimitadas de dimetro conveniente na aferio
esse intervalo que se utiliza para o clculo da actividade. por difuso, conforme o caso.
Contem, todavia, pelo menos, 3 doses consecutivas que
permitem efectuar uma verificao da linearidade. Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. Cultive o
microrganismo a 35-37C durante 24 h sobre o meio F. Com
Nas aferies correntes, quando a linearidade do sistema for uma soluo estril de cloreto de sdio a 9 g/l, recolha por
demonstrada por um nmero adequado de experincias no lavagem os microrganismos cultivados e dilua a suspenso de
ensaio com 3 pontos, pode ser suficiente efectuar a aferio modo a obter uma opacidade adequada.
somente sobre 2 pontos. No entanto, em caso de recurso, a
prova feita sobre 3 pontos como antes indicado.
Solues tamponadas. Prepare as solues tampo de
O nmero de repeties por dose em cada aferio, suficiente pH compreendido entre 5,8 e 8,0 misturando 50,0 ml de
para garantir a preciso requerida. O ensaio pode ser repetido soluo de fosfato monopotssico 0,2 M com quantidades
e os resultados combinados estatisticamente, a fim de obter a de hidrxido de sdio 0,2 M indicadas no quadro seguinte e
exactido necessria e de verificar que a actividade da amostra completando 200,0 ml com gua R recentemente destilada.
no inferior actividade mnima exigida.
A seco seguinte fornecida a ttulo de informao. pH Hidrxido de sdio 0,2 M
(mililitros)
5,8 3,72
RECOMENDAES PARA A AFERIO 6,0 5,70
MICROBIOLGICA DOS ANTIBITICOS 6,2 8,60
6,4 12,60
Os textos seguintes especificam os microrganismos 6,6 17,80
recomendados e indicam as condies de trabalho. 6,8 23,65
Pode-se recorrer a outros microrganismos que apresentem a 7,0 29,63
mesma sensibilidade amostra e sejam utilizados em meios 7,2 35,00
apropriados e em condies favorveis de temperatura e de 7,4 39,50
pH. A escolha das concentraes das solues assegura a 7,6 42,80
existncia de uma relao linear entre o logaritmo da dose e a 7,8 45,20
resposta nas condies do ensaio. 8,0 46,80

2.7.4. Aferio do factor VIII da coagulao humana
Utilize estas solues tampo para todas as aferies Meio E

microbiolgicas anteriormente indicadas, com excepo das
do sulfato de bleomicina e da anfoteracina B. Peptona 5 g
Extracto de carne 3 g
Prepare a soluo tampo (pH 6,8) para a aferio do sulfato Fosfato dissdico dodeca-hidratado 26,9 g
de bleomicina do seguinte modo: dissolva 6,4 g de fosfato Gelose 10 g
monopotssico R e 18,9 g de fosfato dissdico R em gua R e gua q.b.p. 1000 ml
2. Mtodos
Analticos
complete 1000 ml com gua R.

O fosfato dissdico em soluo estril adicionado ao meio
Para a aferio da anfoteracina B, utilize a soluo tampo esterilizado.
fosfato pH 10,5 (0,2 M) preparada do seguinte modo: dissolva
35 g de fosfato dipotssico R em 900 ml de gua R, junte 20 ml
Meio F
de hidrxido de sdio 1 M e complete 1000,0 ml com gua R.
Peptona 9,4 g
Meios de cultura. Podem ser utilizados os meios cujas formas Extracto de levedura 4,7 g
seguidamente se indicam ou outros equivalentes. Extracto de carne de bovino 2,4 g
Glicose mono-hidratada 10,0 g
Meio A
Gelose 23,5 g
Peptona 6 g gua q.b.p. 1000 ml
Peptona pancretica de casena 4 g
Extracto de carne 1,5 g Meio G
Extracto de levedura 3 g
Glicose mono-hidratada 1 g Glicerina 10 g
Peptona 10 g
Gelose 15 g
Extracto de carne 10 g
gua q.b.p. 1000 ml
Cloreto de sdio 3 g
Gelose 15 g
Meio B gua q.b.p. 1000 ml
Peptona pancretica de casena 17 g pH 7,0 _ 0,1 depois da esterilizao.

Peptona papanica de soja 3 g
Cloreto de sdio 5 g
Fosfato dipotssico 2,5 g 2.7.4. AFERIO DO FACTOR VIII
Glicose mono-hidratada 2,5 g
Gelose 15 g
DA COAGULAO HUMANA
Polissorbato 80 10 g
A aferio do factor VIII da coagulao humana efectua-se
gua q.b.p. 1000 ml
pela determinao da sua actividade biolgica como um
Adicione o polissorbato 80 soluo quente dos outros cofactor da activao do factor X pelo factor IX activado (IX a)
componentes, aps t-la levado ebulio e imediatamente em presena de ies de clcio e de fosfolipidos. A actividade
antes de ajustar o volume. de uma preparao do factor VIII calculada por comparao
de quantidades respectivas desta preparao e do padro
internacional, ou de uma preparao de referncia aferida
Meio C em Unidades Internacionais que so necessrias para obter
Peptona 6 g
uma dada velocidade de formao do factor Xa num meio de
reaco contendo as diferentes substncias intervenientes na
activao do factor X.
Extracto de levedura 3 g
Cloreto de sdio 3,5 g A Unidade Internacional de actividade do factor VIII
Glicose mono-hidratada 1 g corresponde actividade de uma dada quantidade do
Fosfato dipotssico 3,68 g padro internacional que constitudo por um concentrado
Fosfato monopotssico 1,32 g liofilizado do factor VIII da coagulao humana. A
gua q.b.p. 1000 ml correspondncia entre a Unidade Internacional e o padro
internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade.
O concentrado de factor VIII da coagulao humana PBR
Meio D
aferido em Unidades Internacionais por comparao com o
Extracto de corao 1,5 g padro internacional.
Extracto de levedura 1,5 g O mtodo de aferio colorimtrica inclui 2 etapas sucessivas:
Peptona de casena 5 g a activao do factor X sob a aco do factor VIII numa
Glicose mono-hidratada 1 g mistura reactiva de factores de coagulao compostos de
Cloreto de sdio 3,5 g substncias purificadas e a lise enzimtica de um substrato
Fosfato dipotssico 3,68 g cromognico pelo factor Xa que liberta um cromforo
Fosfato monopotssico 1,32 g quantificvel por espectrofotometria. Em condies de
Nitrato de potssio 2 g aferio apropriadas, existe uma relao linear entre a
gua q.b.p. 1000 ml velocidade de formao do factor Xa e a concentrao do

2.7.5. Aferio da heparina
factor VIII. O esquema seguinte resume o princpio da quantidade de pr-diluente necessrio para obter solues a
aferio: 0,5-2,0 U.I./ml.

O pr-diluente constitudo por plasma de hemofilia A, ou de
factor VIII activado um reagente de sntese, contendo uma quantidade suficiente
Etapa 1 factor X factor Xa
factor IXa, fosfolipido, Ca+ do factor de Willebrand dando resultados sensivelmente
equivalentes aos obtidos com o plasma de hemfilo. As
2. Mtodos
solues pr-diludas devem ser estveis para alm do tempo
Analticos
necessrio para a aferio.
factor Xa
Etapa 2 substrato cromognico peptido + cromforo Prepare as diluies seguintes da preparao padro
e da preparao problema por meio de uma soluo
As 2 etapas utilizam reagentes disponveis no mercado convenientemente tamponada sem agente quelante, por
originrio de diversos fornecedores. Embora a composio exemplo, tris(hidroximetil)aminometano ou imidazol e
destes reagentes possa variar ligeiramente, as suas contendo 1 por cento de albumina humana ou bovina;
caractersticas essenciais so descritas nas especificaes que a soluo de preferncia tamponada para pH 7,3-8,0.
se seguem. Certos desvios, em relao a estas especificaes, Para cada preparao prepare 2 sries, pelo menos, de
so admissveis com a condio de que tenha sido trs diluies suplementares. A concentrao em factor
demonstrado, assim como para o padro internacional do VIII destas diluies deve ser ajustada de modo que a
factor VIII da coagulao humana, que os resultados obtidos concentrao final do factor VIII na mistura reactiva, fora da
no diferem de maneira significativa. etapa de formao do factor Xa, seja de preferncia inferior a
0,01 U.I./ml.
Prepare igualmente uma testemunha contendo o conjunto
REAGENTES dos constituintes da mistura reactiva, com excepo do factor
VIII.
A mistura reactiva dos factores de coagulao contm
especialmente protenas purificadas de origem humana Todas as diluies devem ser preparadas em tubos de plstico
ou bovina, especificadamente o factor X, o factor IXa e um e utilizadas imediatamente.
activador do factor VIII, que geralmente a trombina. Estas Etapa 1. A cada uma das diluies preaquecidas, obtidas a
protenas so parcialmente purificadas, de preferncia a, pelo partir da preparao de referncia e da preparao problema,
menos, 50 por cento e no contm impurezas susceptveis junte um volume apropriado do reagente de coagulao
de interferir na activao do factor VIII ou do factor X. A preaquecido (ou de uma mistura dos seus constituintes
trombina pode estar presente sob a forma do seu precursor, separados), misture e incube a 37C em tubos de plstico
a protrombina, com a condio de que a sua activao no ou cpulas de uma microplaca. Deixe desenvolver a reaco
seio da mistura reactiva seja suficientemente rpida para de activao do factor X durante um tempo apropriado;
permitir uma activao quase instantnea do factor VIII a paragem da reaco (etapa 2) deve acontecer quando a
aquando da aferio. A mistura reactiva contm igualmente concentrao em factor Xa tenha atingido cerca de 50 por
fosfolipidos que podem ser de origem natural ou obtidos por cento do seu nvel mximo. O tempo de reaco apropriado
sntese e devem ser constitudos por uma parte importante de geralmente da ordem de 2-5 min.
fosfatidilserina.
Etapa 2. Pare a reaco de activao por adio da mistura
Os diferentes constituintes do meio reactivo so geralmente reactiva pr-aquecida contendo o substrato cromognico. A
distribudos, no mnimo, em 2 preparaes separadas, em que velocidade de lise do substrato, que deve ser proporcional
nenhuma tem a capacidade de induzir por si s a formao concentrao do factor Xa, determinada por medio com
do factor Xa. Uma das constituies contm ies clcio. Aps um espectrofotmetro, pela variao da absorvncia num
reconstituio, estas 2 preparaes podem ser reunidas com a comprimento de onda apropriado. Pode determinar-se a
condio de que no se formem quantidades significativas de absorvncia quer em leitura contnua, o que permite calcular
factor Xa na ausncia do factor VIII. O factor VIII deve ser o a velocidade inicial de lise do substrato, quer interrompendo
nico factor que limita a formao do factor Xa na mistura de a reaco de hidrlise ao fim de um tempo apropriado
incubao final. baixando o pH, com um reagente apropriado tal como o
cido actico a (50 por cento V/V) ou uma soluo tampo
A 2. etapa consiste na quantificao do factor Xa formado citratada de pH 3 (1 M). Ajuste o tempo de hidrlise de
na etapa precedente por meio de um substrato cromognico modo que a condio de linearidade da curva de formao do
especfico do factor Xa. Este substrato geralmente um cromforo em funo do tempo seja satisfatria. Este tempo
peptdeo curto derivado de 3-5 cidos aminados ligados a um geralmente da ordem dos 3-15 min, mas so toleradas
agrupamento cromforo. A ciso deste agrupamento e do determinadas variaes se permitirem melhorar a linearidade
substrato peptdico promove um deslocamento da actividade da curva dose-resposta.
cromofrica para um comprimento de onda que permite a
sua quantificao por espectrofotometria. O substrato deve Calcule a actividade da preparao problema pelos mtodos
igualmente incluir os inibidores apropriados impedindo o estatsticos habituais (por exemplo, 5.3).
prosseguir da formao do factor Xa (por exemplo, agentes
quelantes) e suprimindo toda a actividade trombnica.
2.7.5. AFERIO DA HEPARINA
TCNICA A actividade anticoagulante da heparina avaliada in
vitro, por comparao da sua capacidade em retardar a
Imediatamente antes do emprego reconstitua o contedo coagulao do plasma de carneiro, citratado e recalcificado,
inteiro de 1 ampola da preparao de referncia e da com a de uma preparao de referncia aferida em Unidades
preparao problema. Junte s preparaes reconstitudas a Internacionais, em dadas condies.

2.7.6. Aferio da actividade da vacina adsorvida contra a difteria
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma operao, nas mesmas condies, utilizando 1 ml de soluo
dada quantidade do padro internacional; este constitudo de cloreto de sdio R a 9 g/l em vez de uma das diluies da
pela heparina sdica liofilizada, proveniente da mucosa heparina; os dois valores obtidos no ensaio em branco no
intestinal do porco. A correspondncia entre a Unidade devem diferir de modo significativo. Transforme os tempos
Internacional e o padro internacional indicada pela de coagulao em logaritmos, utilizando o valor mdio
Organizao Mundial de Sade. dos tubos tratados em duplicado. Repita o procedimento
utilizando novas diluies e efectue a incubao na ordem
2. Mtodos
Analticos
A heparina sdica PBR aferida em Unidades Internacionais T1, T2, T3, S1, S2 e S3. Calcule os resultados pelos mtodos
a partir do padro internacional, por meio da aferio abaixo estatsticos habituais.
descrita.
Efectue, no mnimo, 3 aferies independentes. Para cada
Efectue a aferio de acordo com um dos mtodos seguintes, uma, prepare respectivamente novas solues da amostra e
permitindo determinar o incio da coagulao, e escolher os do padro e utilize uma nova fraco de substrato do plasma
tubos e outros aparelhos apropriados ao mtodo utilizado: descongelado imediatamente antes do emprego.
a) exame visual directo, efectuado de preferncia, com auxlio Calcule a actividade da amostra pelos mtodos estatsticos
duma iluminao indirecta, em fundo negro e fosco, habituais, combinando os resultados das diversas aferies.
Se a varincia resultante das diferenas entre as aferies
b) registo espectrofotomtrico por troca de densidade ptica
for significativa, para P = 0,01 uma estimativa combinada da
num comprimento de onda cerca de 600 nm, actividade pode ser obtida calculando a mdia no ponderada
c) exame visual da transformao da fluidez inclinando os das estimativas da actividade.
tubos manualmente,
d) registo mecnico da transformao da fluidez, procedendo
mistura de forma a evitar, ao mximo, qualquer
2.7.6. AFERIO DA ACTIVIDADE
perturbao no seio da soluo, durante a fase inicial da DA VACINA ADSORVIDA CONTRA A
coagulao. DIFTERIA
TCNICA OPERATRIA A actividade da vacina adsorvida contra a difteria

determinada por administrao da vacina aos cobaios
seguida quer de uma prova por meio da toxina diftrica
Os volumes mencionados no texto so dados a ttulo
(mtodo A ou B), quer de uma determinao do ttulo em
indicativo e podem ser adaptados ao aparelho utilizado, com anticorpos dirigidos contra a toxina ou a anatoxina diftrica
a condio que a relao entre os diferentes volumes seja no soro de cobaios (mtodo C). Nos 2 casos, a actividade da
respeitada. vacina calculada por comparao com a actividade de uma
Dilua a heparina sdica PBR numa soluo de cloreto de preparao de referncia aferida em Unidades Internacionais.
sdio R a 9 g/l de modo a obter por mililitro, um nmero A Unidade Internacional corresponde actividade de uma
conhecido com preciso de Unidades Internacionais. Prepare dada quantidade do padro internacional; este constitudo
nas mesmas condies, uma soluo da amostra com uma por anatoxina diftrica adsorvida em hidrxido de alumnio.
actividade semelhante presumida. A partir de cada uma destas A correspondncia entre a Unidade Internacional e o padro
solues, prepare uma srie de diluies numa soluo de internacional indicada pela Organizao Mundial de Sade
cloreto de sdio R a 9 g/l em progresso geomtrica, de modo (OMS).
que o tempo de coagulao obtido com a concentrao mais
fraca no seja inferior a 1,5 vezes o tempo de recalcificao Como preparao de referncia considera-se apropriada a
vacina adsorvida contra a difteria PBR.
no ensaio em branco e que o tempo de coagulao obtido
com a concentrao mais forte seja tal que origine uma curva O mtodo escolhido para a aferio da actividade da vacina
log dose/resposta satisfatria, como a determinada no ensaio adsorvida contra a difteria depende do papel da aferio. So
preliminar. utilizados os mtodos A ou B:
Coloque 12 tubos num banho de gua com gelo, rotulando-os 1. no decurso do desenvolvimento de uma vacina para a
em duplicado T1, T2 e T3 para as diluies da amostra e S1, aferio dos lotes produzidos a fim de validar a produo,
S2 e S3 para as diluies do padro. Em cada tubo introduza 2. sempre que seja necessria uma revalidao, aps uma
1,0 ml de substrato de plasma R1 descongelado, 1,0 ml da modificao significativa do mtodo de fabrico.
diluio apropriada da amostra ou do padro. Aps cada
adio, misture evitando a formao de bolhas. Tomando os Os mtodos A ou B podem igualmente ser utilizados no
tubos na seguinte ordem S1, S2, S3, T1, T2, T3, coloque-os quadro da aferio da actividade de rotina de lotes de vacina,
em banho de gua a 37C. Deixe equilibrar a temperatura mas para o bem-estar dos animais, utilizado o mtodo C,
do meio a 37C durante cerca de 15 min, em seguida sempre que possvel.
junte em cada tubo 1 ml de um reagente APTT (tempo Com excepo dos casos anteriormente especificados nos
de tromboplastina parcial activado) apropriado contendo pontos 1 e 2, o mtodo C pode ser utilizado aps verificao
fosfolpidos e um activador de contacto, com uma diluio da conformidade do mtodo para o produto. Para este efeito,
tal, que se obtm um tempo de calcificao em branco um nmero apropriado de lotes (em geral 3) aferido
conveniente que no ultrapasse 60 s. Aps exactamente 2 segundo o mtodo C e segundo o mtodo A ou B. Se vacinas
min, junte 1 ml de uma soluo de cloreto de clcio R a diferentes (monovalentes ou polivalentes) forem preparadas
3,7 g/l previamente aquecida a 37C. Registe como tempo a partir de anatoxinas diftricas com a mesma origem e
de coagulao, o intervalo expresso em segundos, entre com nveis comparveis (expressos em Lf/ml) da mesma
esta ltima adio e o incio da coagulao, determinado anatoxina diftrica, presume-se que a conformidade para a
de acordo com o mtodo escolhido. Determine o tempo vacina polivalente com o maior nmero de componentes seja
de calcificao no ensaio em branco, no incio e no fim da igualmente vlida para as vacinas polivalentes com menos

componentes e para as vacinas monovalentes. Cada vacina se a mesma no tiver sido aferida de forma adequada, junte 5
polivalente que inclua um componente coqueluchoso com cobaios no vacinados como testemunha.
clula completa ou que inclua a vacina conjugada contra
o haemophylus tipo b e a anatoxina diftrica ou a protena ESCOLHA DA TOXINA DE PROVA
diftrica CRM 197, como protena de transporte no mesmo
recipiente, deve ser sempre avaliada separadamente. Escolha uma toxina de prova contendo 67 a 133 lr/100 em
1 Lf e 25 000 a 50 000 vezes a dose mnima de reaco por
2. Mtodos
Analticos
Para as combinaes dos componentes diftrico e tetnico,
a aferio serolgica (mtodo C) pode ser efectuada com o cobaio por Lf. Se tiver sido demonstrada a estabilidade da
toxina de prova, no necessrio controlar a actividade da
mesmo grupo de animais que foram utilizados para a aferio
soluo da toxina de prova em cada aferio.
serolgica da actividade da vacina adsorvida contra o ttano
(2.7.8), quando as condies de imunizao comuns para
os componentes diftrico e tetnico (por exemplo, doses, PREPARAO DA SOLUO DA TOXINA DE PROVA
durao) so reconhecidas como satisfatrias para a vacina
polivalente. A partir desta toxina prepare imediatamente antes do
emprego, num diluente apropriado, uma soluo da toxina
As aferies descritas a seguir utilizam diluies mltiplas de prova contendo cerca de 0,0512 Lf em 0,2 ml. Prepare a
para a amostra e para a preparao de referncia. Quando partir desta soluo uma srie de 5 diluies a 1/4 contendo
o analista adquire uma certa experincia com o mtodo respectivamente cerca de 0,0128 Lf, 0,0032 Lf, 0,0008 Lf,
para uma dada vacina, torna-se possvel aplicar um modelo 0,0002 Lf e 0,00005 Lf em 0,2 ml.
simplificado que inclui apenas uma diluio para a amostra e
para a preparao de referncia. Este ltimo modelo permite DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO DE
ao analista determinar se a amostra tem uma actividade REFERNCIA
significativamente superior ao mnimo exigido, mas no
fornece informao da linearidade, do paralelismo ou da Prepare numa soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l, diluies
curva dose-resposta. O modelo simplificado permite uma da amostra e da preparao de referncia de modo que
reduo considervel do nmero de animais necessrios e cada grupo de diluies constitua uma srie de razo 2,5
deve ser tomado em considerao por cada analista de acordo no mximo, e em que as diluies intermedirias, quando
com a Conveno Europeia para a proteco de animais injectadas por via subcutnea razo de 1,0 ml por cobaio,
vertebrados utilizados para fins experimentais ou outros fins devam dar um valor intradrmico de cerca de 3 aquando da
cientficos. prova.
No caso de utilizao de aferies com apenas uma diluio, IMUNIZAO E PROVA

a reprodutibilidade no tempo da produo e do ensaio
controlada por meio de indicadores apropriados, praticando Distribua as diluies razo de uma diluio por cada grupo
periodicamente uma aferio completa com diluies de cobaios e injecte por via subcutnea em cada cobaio 1,0 ml
mltiplas, por exemplo, de 2 em 2 anos. Relativamente da diluio atribuda ao seu grupo. Aps 28 dias, rape os 2
s aferies serolgicas, os indicadores apropriados para flancos de cada cobaio e inocule por via intradrmica em
controlar a reprodutibilidade do ensaio so: cada cobaio vacinado 0,2 ml de cada uma das 6 diluies
a mdia e o desvio padro dos ttulos relativos dos da toxina em locais diferentes escolhidos para minimizar a
interferncia entre os locais adjacentes.
soros ou dos valores obtidos das amostras de soros aps
administrao de uma determinada dose da vacina de
referncia, DETERMINAO DA ACTIVIDADE DA TOXINA DE PROVA
os ttulos ou os valores antitxicos dos soros testemunha Se necessrio, injecte aos animais no vacinados testemunha,
(amostras de soro positivo e negativo), diluies da toxina de prova contendo respectivamente 80,
a relao entre os ttulos ou os valores antitxicos do 40, 20,10 e 5 x 10-6Lf.
soro testemunha positiva e das amostras de soro que
correspondam vacina de referncia. LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
Examine todos os locais de injeco 48 h aps a injeco da

MTODO A. PROVA INTRADRMICA EM COBAIOS toxina de prova e anote aqueles que apresentem um eritema
diftrico especfico. O nmero de locais isentos de eritema
ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS representa o valor intradrmico. Inscreva num quadro os
DE EXPERINCIA valores intradrmicos para todos os animais que tenham
recebido a mesma diluio da vacina e utilize os dados aps
Utilize cobaios brancos saudveis, provenientes de uma uma transformao apropriada tal como (valor)2 ou arcseno
mesma criao e cujo tamanho seja apropriado para o ((valor/6)2) para calcular a actividade relativa de cada amostra
por uma anlise quantitativa com um modelo de linhas
nmero de inoculaes prescritas para a prova; a diferena
paralelas.
de massa corporal entre o animal mais pesado e o animal
mais leve, no deve ultrapassar 100 g. Os cobaios devem
ser do mesmo sexo, caso contrrio machos e fmeas devem CONDIES DE VALIDADE
ser distribudos igualmente entre os grupos. Distribua-os,
no mnimo, em 6 grupos iguais: o nmero de cobaios em O ensaio s vlido se:
cada grupo deve ser suficiente para obter resultados que para a amostra e para a preparao de referncia, o valor
satisfaam s condies de validade prescritas a seguir. Se no mdio obtido com a dose mais fraca for inferior a 3 e o
tiver sido demonstrada a estabilidade da toxina de prova ou valor mdio obtido com a dose mais forte for superior a 3,

se aplicvel, a diluio da toxina que contm 40 10-6 da diluio atribuda ao seu grupo. Aps 28 dias, inocule por
Lf provocar eritema, no mnimo, em 80 por cento das via subcutnea em cada animal 1,0 ml da soluo da toxina
testemunhas e a diluio que contm 20 10-6 Lf provocar de prova (100 DL50).
um eritema em menos de 80 por cento das testemunhas; se
estes critrios no forem satisfeitos, deve ser utilizada uma DETERMINAO DA ACTIVIDADE DA TOXINA DE PROVA
outra toxina,
2. Mtodos
Se necessrio, atribua a soluo da toxina de prova e as 3

Analticos
os limites de confiana (P = 0,95) no forem inferiores

a 50 por cento nem superiores a 200 por cento do valor diluies razo de uma por cada um dos 4 grupos de 5
estimado, cobaios e inocule por via subcutnea em cada cobaio de cada
grupo, 1,0 ml da soluo da toxina de prova atribuda ao seu
a anlise estatstica no revelar nenhum desvio da grupo.
linearidade nem do paralelismo.
O ensaio pode ser repetido, mas neste caso, o clculo da LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios
vlidos. 4 dias aps a injeco da toxina de prova, anote o nmero de
cobaios sobreviventes. Calcule a actividade da amostra por
comparao actividade da preparao de referncia com
MTODO B. PROVA LETAL EM COBAIOS base na proporo de animais sobreviventes em cada grupo
de cobaios vacinados, utilizando os mtodos estatsticos
ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS habituais (por exemplo, 5.3).
DE EXPERINCIA
CONDIES DE VALIDADE
Utilize cobaios saudveis provenientes de uma mesma
criao, pesando cada um entre 250-350 g. Os cobaios devem
ser do mesmo sexo, caso contrrio, machos e fmeas devem
ser distribudos igualmente entre os grupos. Distribua-os, para a amostra e para a preparao de referncia, a dose
no mnimo, em 6 grupos iguais: o nmero de cobaios em protectora 50 por cento se situar entre a dose mais fraca e a
cada grupo deve ser suficiente para obter resultados que dose mais forte das preparaes administradas aos cobaios,
satisfaam s condies de validade prescritas a seguir. Se
se aplicvel, o nmero de mortos nos 4 grupos de 5 cobaios
no tiver sido demonstrada a estabilidade da toxina de prova
que receberam a soluo da toxina de prova e as 3 diluies
ou se a mesma no tiver sido aferida de forma adequada, para
corresponder a uma dose de prova de cerca de 100 DL50,
verificar a sua actividade, junte 4 grupos de 5 cobaios no
vacinados como testemunhas. os limites de confiana (P = 0,95) no forem inferiores
a 50 por cento nem superiores a 200 por cento do valor
ESCOLHA DA TOXINA DE PROVA estimado,
a anlise estatstica no revelar nenhum desvio da
Escolha uma toxina diftrica contendo, no mnimo, 100 DL50 linearidade nem do paralelismo.
por mililitro. Se tiver sido demonstrada a estabilidade da
toxina de prova, no necessrio controlar a actividade da O ensaio pode ser repetido, mas neste caso o clculo da
soluo da toxina de prova aquando de cada aferio. actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios
vlidos.
PREPARAO DA SOLUO DA TOXINA DE PROVA
MTODO C. DETERMINAO DE ANTICORPOS
A partir desta soluo, prepare imediatamente antes do emprego, EM COBAIOS
num diluente apropriado, uma soluo da toxina de prova
contendo cerca de 100 DL50 por mililitro. Se necessrio, prepare ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS
no mesmo diluente solues diludas a 1/32, 1/100 e 1/320.
DE EXPERINCIA
DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO Utilize cobaios saudveis, provenientes da mesma criao,

DE REFERNCIA pesando cada um entre 250-350 g. Os cobaios devem ser
do mesmo sexo, caso contrrio machos e fmeas devem ser
Prepare, numa soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l, diluies distribudos igualmente entre os grupos. Distribua-os,
no mnimo, em 6 grupos iguais: o nmero de cobaios em
da amostra e da preparao de referncia de modo que
cada grupo deve ser suficiente para obter resultados que
cada grupo de diluies constitua uma srie de razo 2,5 satisfaam s condies de validade descritas a seguir.
no mximo, e em que as diluies intermedirias, quando Utilize um grupo suplementar constitudo por cobaios no
injectadas por via subcutnea razo de 1,0 ml por cobaio, vacinados e provenientes da mesma criao para fornecer
protegem cerca de 50 por cento dos animais dos efeitos letais um soro testemunha negativo. Se tiver sido demonstrada a
provocados pela inoculao por via subcutnea da quantidade reproductibilidade do ensaio, pode ser utilizado um soro de
de toxina diftrica prescrita para este ensaio. referncia testemunha negativa.
IMUNIZAO E PROVA PREPARAO DE REFERNCIA
Distribua as diluies razo de uma diluio por cada grupo Utilize uma preparao de referncia apropriada, como a
de cobaios e injecte por via subcutnea em cada cobaio 1,0 ml vacina adsorvida contra a difteria PBR ou um lote de vacina

ou um outro lote representativo cuja eficcia tenha sido O ensaio pode ser repetido, mas neste caso o clculo da
demonstrada aquando dos ensaios clnicos e que tenha sido actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios
aferido em Unidades Internacionais por comparao com vlidos.
a vacina adsorvida contra a difteria PBR ou com o padro
A seco seguinte publicada a ttulo de informao.
internacional da anatoxina diftrica.
Recomendaes
2. Mtodos
Analticos
DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO
DE REFERNCIA
para a realizao da aferio da actividade
da vacina adsorvida contra a difteria
Prepare, numa soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l, diluies
em srie da amostra e da preparao de referncia; considera-
MTODO C. DETERMINAO DE ANTICORPOS NO COBAIO
-se satisfatria uma srie de razo 2,5 a 5. Utilize, no mnimo,
3 diluies, por exemplo, no intervalo entre 0,5-16 U.I./ml
PREPARAO DAS AMOSTRAS DE SORO
para a vacina de referncia e, por exemplo, no intervalo
entre 1:2 e 1:125 para a amostra. Utilize as diluies para a Para a preparao das amostras de soro, a tcnica seguinte
imunizao de preferncia no espao de uma hora aps a sua tem sido considerada apropriada. Inverta 6 vezes os tubos
preparao. Atribua uma diluio a cada grupo de cobaios. contendo as amostras de sangue e deixe em repouso a 37C
durante 2 h, em seguida a 4C durante 2 h. Centrifugue
IMUNIZAO temperatura ambiente a 800 g durante 20 min. Transfira
o soro para tubos estreis e conserve a uma temperatura
Injecte em cada cobaio por via subcutnea, na nuca, 1,0 ml inferior a -20C. Segundo esta tcnica obtido um produto,
no mnimo, de 40 por cento de soro.
da diluio atribuda ao seu grupo.
DETERMINAO DO TTULO EM ANTICORPOS

COLHEITA SANGUNEA
Os ensaios ELISA e aferio em clulas Vero apresentados
35-42 dias aps a imunizao, colha uma amostra de sangue a seguir so dados a ttulo de exemplos de mtodos
de cada um dos cobaios vacinados e testemunha, utilizando imunoqumicos considerados apropriados para a
um mtodo apropriado. determinao do ttulo em anticorpos.
PREPARAO DAS AMOSTRAS DE SORO Determinao do ttulo em anticorpos no soro de cobaio

por imunoadsoro com enzima conjugada (ELISA). As
diluies dos soros em ensaio e dos soros de referncia so
Evite frequentes congelaes e descongelaes das amostras efectuadas em placas para ELISA revestidas com anatoxina
de soro. Para evitar uma contaminao microbiana, diftrica. Um soro de cobaio testemunha positiva e um
prefervel efectuar as manipulaes numa cmara de fluxo soro de cobaio testemunha negativa so includos em
laminar. cada placa para controlar o desempenho da aferio. So
adicionados anticorpos de coelho ou de cabra anti-IgG de
DETERMINAO DO TTULO EM ANTICORPOS cobaio conjugados peroxidase, seguidos de um substrato de
peroxidase. Mede-se a densidade ptica e calcula-se o ttulo
Determine o ttulo relativo em anticorpos ou o valor de cada relativo em anticorpos pelos mtodos estatsticos habituais
(por exemplo, 5.3).
amostra de soro por um mtodo imunoqumico apropriado
(2.7.1). Os mtodos apresentados a seguir (aferio por Reagentes e aparelhagem
imunoadsoro com enzima conjugada (ELISA) e aferio em placas para ELISA: 96 poos, colunas 1-12, linhas A-H,
clulas Vero) tm sido considerados satisfatrios.
soro de cobaio antidiftrico (vacinas para uso humano)
(soro testemunha positiva) obtido por imunizao de
CLCULO DA ACTIVIDADE cobaios com a vacina adsorvida contra a difteria PBR,
Calcule a actividade da amostra em Unidades Internacionais conjugado de peroxidase. Anticorpos de coelho ou de cabra
por comparao com a preparao de referncia, pelos conjugados peroxidase e dirigidos contra a IgG de cobaio,
mtodos estatsticos habituais (por exemplo, 5.3). anatoxina diftrica,
soluo tampo de carbonato de pH 9,6. Dissolva 1,59 g
CONDIES DE VALIDADE de carbonato de sdio anidro R e 2,93 g de bicarbonato de
sdio R em 1000 ml de gua R. Distribua em ampolas de
O ensaio s vlido se: 150 ml e esterilize por aquecimento na autoclave a 121C
durante 15 min,
os limites de confiana (P = 0,95) no forem inferiores
a 50 por cento nem superiores a 200 por cento do valor soluo salina de fosfato tamponada de pH 7,4 (PBS).
estimado, Dissolva com agitao 80,0 g de cloreto de sdio R, 2,0 g
de fosfato monopotssico R, 14,3 g de fosfato dissdico di-
a anlise estatstica mostrar que as curvas dose-resposta -hidratado R e 2,0 g de cloreto de potssio R em 1000 ml
apresentam um declive significativo e no revelar nenhum de gua R. Conserve temperatura ambiente para evitar a
desvio da linearidade nem do paralelismo (se forem cristalizao. Antes do emprego, dilua a soluo a 1/10 com
observados desvios significativos, ver captulo 5.3). gua R,

soluo de cido ctrico. Dissolva 10,51 g de cido ctrico por comparao ao soro de cobaio ou ao soro padro de
R em 1000 ml de gua R e ajuste para pH 4,0 com uma referncia da OMS. Exprime-se em Unidades Internacionais
soluo de hidrxido de sdio R a 400 g/l, por mililitro.
tampo de lavagem. PBS, contendo 0,5 g/l de polissorbato Reagentes e aparelhagem
20 R,
placas de cultura celular de fundo plano: 96 poos, colunas
diluente tampo de bloqueio. PBS contendo 0,5 g/l de 1-12, linhas A-H,
2. Mtodos
Analticos
polissorbato 20 R e 25 g/l de leite desnatado seco,

frascos para cultura celular de 75 cm,
substrato de peroxidase. Pouco tempo antes do emprego,
dissolva 10 mg de 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6- toxina diftrica,
-sulfonato) de diamnio R (ABTS) em 20 ml de soluo de soro de cobaio anti-diftrico (vacinas para uso humano)
cido ctrico. Imediatamente antes do emprego, junte 5 l (soro testemunha positiva) obtido por imunizao de
de soluo concentrada de perxido de hidrognio. cobaios com a vacina adsorvida contra a difteria PBR,
Tcnica operatria clulas Vero (clulas de rim de macaco verde). Consideram-
-se apropriadas as clulas das passagens P2 a P15.
A descrio a seguir dada a ttulo de exemplo, podendo
ser utilizadas outras disposies das placas. Os poos 1A-H Tcnica operatria 1. A toxina diftrica tem efeitos
so utilizados para o soro testemunha negativa e os poos citopatognicos nas clulas Vero que provocam uma lise
2A-H e 12A-H so utilizados para o soro testemunha positiva celular. Os anticorpos dirigidos contra a toxina diftrica
(controlo do desempenho da aferio). Os poos 3-1 1A-H so podem inibir este efeito citopatognico. Por consequncia,
utilizados para as amostras em ensaio. a actividade de uma vacina contra a difteria pode ser
determinada de forma indirecta com ajuda de um sistema
Recubra cada um dos poos das placas para ELISA com 100 l de cultura celular, cultivando diferentes diluies de soro de
da soluo da anatoxina diftrica (0,5 Lf/ml no tampo de animais imunizados com uma concentrao constante de
carbonato de pH 9,6). Deixe em repouso a 4C em atmosfera toxina. Na aferio em clulas Vero, uma colorao amarela
hmida at ao dia seguinte. Para evitar os efeitos do gradiente assinala as clulas viveis, uma colorao vermelha assinala
de temperatura, no empilhe mais de 4 placas umas sobre as clulas mortas. Se as clulas no estiverem todas mortas, a
as outras. No dia seguinte, lave cuidadosamente as placas colorao pode ser laranja.
com o tampo de lavagem. Bloqueie as placas adicionando
100 l do diluente tampo de bloqueio em cada poo. Incube Reagentes e aparelhagem
em atmosfera hmida a 37C durante 1 h. Lave as placas
cuidadosamente com o tampo de lavagem. Coloque 100 l MEM modificado. Meio de cultura MEM (Meio Essencial
do diluente tampo de bloqueio em cada um dos poos das Mnimo) com sais de Earle, sem L-glutamina e sem
placas, com excepo dos poos da fila A. Prepare diluies bicarbonato de sdio,
apropriadas dos soros testemunha negativa e testemunha meio 199 modificado. Meio 199, com soluo de Hanks e
positiva (com cerca de 0,01 U.I./ml) e dos soros em ensaio. l-glutamina, sem bicarbonato de sdio,
Atribua o soro testemunha negativa coluna 1, o soro
testemunha positiva s colunas 2 e 12 e os soros em ensaio s soro fetal bovino,
colunas 3-11 e junte 100 l de cada soro aos 2 primeiros poos soluo de bicarbonato de sdio a 7,5 por cento,
da coluna qual atribuda. Com uma micropipeta multicanal,
efectue sries de diluies a 1/2 a partir da fila B at fila H soluo de tripsina: soluo de tripsina a 2,5 por cento,
transferindo 100 l ao poo seguinte. Elimine 100 l soluo EDTA: soluo EDTA a 0,02 por cento (Versene
da ltima fila a fim de que os poos contenham todos 100 l. 1:5000),
Incube a 37C durante 2 h. Lave cuidadosamente com o
tampo de lavagem. Prepare uma diluio apropriada (tem sido D-PBS modificado. Soluo tampo de fosfato de Dulbecco
considerada satisfatria uma diluio a 1/2000) do conjugado (D-PBS), sem clcio e sem magnsio,
de peroxidase no diluente tampo de bloqueio e junte 100 l a soluo de l-glutamina 200 mM,
cada poo. Incube a 37C em atmosfera hmida durante 1 h.
Lave as placas cuidadosamente com o tampo de lavagem. soluo de penicilina/estreptomicina,
Junte 100 l de substrato de peroxidase em cada poo. Deixe meio de cultura primrio. A 50 ml de meio de cultura
em repouso temperatura ambiente, ao abrigo da luz, durante MEM, junte 440 ml de gua R, 5 ml de soluo de
30 min. Leia as placas a 405 nm, respeitando a ordem seguida l-glutamina 200 mM e 10 ml de soluo de bicarbonato de
no momento da adio do substrato. sdio a 7,5 por cento. A 25 ml deste meio junte 1,25 ml de
soro fetal bovino,
Determinao do ttulo em anticorpos no soro de cobaio
meio de cultura de manuteno. Semelhante ao meio
por aferio em clulas Vero. O mtodo utilizado baseia-se
de cultura primrio, com excepo do volume de soro
quer na inibio metablica (tcnica operatria 1), quer
fetal bovino que de 0,5 ml em lugar de 1,25 ml e que
na citotoxicidade (tcnica operatria 2) como ponto final e
adicionado a 20 ml do meio de cultura MEM enriquecido,
numa inspeco microscpica (morfologia celular) ou a olho
nu (colorao) das clulas. meio A. A 50,0 ml de meio 199, junte 440,0 ml de gua
R, 5,0 ml de soluo de l-glutamina 200 mM e 10,0 ml de
O limiar de deteco especfico para cada antitoxina situa-se
soluo de bicarbonato de sdio a 7,5 por cento,
habitualmente entre 0,015 U.I./ml (tcnica operatria 1) e
0,05 U.I./ml (tcnica operatria 2). meio B. A 150,0 ml de meio A, junte 3,0 ml de soro fetal
bovino e 0,3 ml de soluo de penicilina/estreptomicina,
O ponto final escolhido na diluio de soro mais
elevada capaz de proteger as clulas contra os efeitos da meio C. A 22,0 ml de meio A, junte 0,44 ml de soro fetal
toxina diftrica. A actividade da antitoxina calculada bovino e 0,44 ml de soluo de penicilina/estreptomicina.

As clulas Vero cultivam-se em frascos para cultura celular serve de marcador quantitativo das clulas vivas presentes.
(por exemplo, 75 cm2/250 ml) num incubador a 36 1C Uma colorao azul/negra indica a presena de clulas
com um teor em CO2 de 5 por cento e uma humidade viveis devido capacidade da desidrogenase mitocondrial
relativa de 90 por cento. As clulas Vero cultivam-se em em reduzir o corante MTT num derivado corado. As
primeiro lugar no meio de cultura primrio. Aps 2-3 dias de clulas permanecem vivas se a toxina for neutralizada pela
crescimento, o meio de cultura primrio substitudo pelo antitoxina. Os poos brancos ou incolores indicam a ausncia
meio de cultura de manuteno. Se for obtida uma camada de clulas viveis devido a uma quantidade insuficiente de
2. Mtodos
Analticos
monocelular confluente, elimina-se o sobrenadante da antitoxina para neutralizar a toxina.
cultura e a camada celular lavada suavemente com D-PBS
modificado. No frasco, junte uma mistura de 1 volume de Reagentes e aparelhagem
soluo de tripsina e 1 volume de soluo de EDTA. Agite meio de cultura MEM (Meio Essencial Mnimo),
suavemente o frasco e coloque-o no incubador de CO2
durante cerca de 3 min at que as clulas comecem a separar- soro de vitelo recm-nascido,
-se do tapete celular. D pancadas vigorosas na parede do soluo antibitica (contendo 10 000 unidades de
frasco para fazer descer as clulas. Coloque de novo as clulas penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 g de anfotericina
em suspenso em 5-6 ml de meio C fresco de modo a obter B por mililitro),
uma suspenso homognea. Prepare uma suspenso celular
no meio C contendo cerca de 1 105 clulas/ml. soluo de L-glutamina 200 mM,
Coloque 25 l de meio B em cada um dos poos, excepto nos tripsina-EDTA,
da coluna 1. Coloque 25 l de soro antidiftrico de cobaio azul de tiazolil (MTT) [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
(vacinas para uso humano) (soro testemunha positiva) -il)-2,5-difeniltetrazlio],
(diluio de trabalho no meio B de 0,40 U.I./ml) nos poos
A1, A2 e A11. Coloque 25 l de amostras de soro de cobaio soluo tampo HEPES de pH 8,11 M. Dissolva 18,75 g de
nos poos B-G das colunas 1, 2 e 11. Coloque 25 l de soro HEPES em 82,5 ml de gua R e 30,0 ml de hidrxido de
testemunha negativa nas filas H das colunas 1, 2 e 11. Com sdio 2 M,
uma micropipeta multicanal efectue sries de diluies a soluo de glucose a 10 por cento,
1/2 atravs da placa (da coluna 2 at coluna 10 para as filas
A-G e at coluna 8 para a fila H). Passe 25 l dos poos da meio de cultura completo. Misture 200 ml de meio de
coluna 10 para as filas A-G e do poo H8. cultura MEM com 10 ml de soro de vitelo recm-nascido,
3,0 ml de soluo tampo HEPES de pH 8,1 M, 2,0 ml
Reconstitua a toxina diftrica com a soluo salina para de soluo de glucose a 10 por cento, 2,0 ml de soluo
obter uma soluo a 50 U.I./ml. Prepare uma diluio a 1/50 antibitica e 2,0 ml de soluo de L-glutamina 200 mM,
desta toxina diftrica no meio B para obter uma soluo
de trabalho a 1,0 U.I./ml. Junte 25 l desta soluo de soluo salina de fosfato tamponada de pH 7,4 (PBS).
trabalho aos poos A12 e B12 (toxina testemunha). Efectue Dissolva 10,0 g de cloreto de sdio R, 0,75 g de cloreto de
uma diluio a 1/2 transferindo 25 l de um poo ao poo potssio R, 1,44 g de fosfato dissdico R e 0,125 g de fosfato
seguinte, dos poos B12 a H12. Troque a ponta da pipeta monopotssico R em gua R, em seguida complete 1000,0 ml
entre cada diluio. Elimine 25 l do poo H12. Junte 25 l com o mesmo solvente. Se necessrio, ajuste o pH (2.2.3).
do meio B aos poos B12-H12. Coloque em seguida 25 l da Aquea na autoclave a 120C, durante 15 min,
diluio de trabalho da toxina (1,0 U.I./ml) em cada um dos soluo azul de tiazolil (MTT). Dissolva 0,1 g de azul de
poos das filas A-H das colunas 1-10, com excepo dos poos tiazolil (MTT) em 20 ml de PBS. Proceda esterilizao por
H9 e H10 (s com clulas, sem soro e sem toxina). filtrao (0,2 m) e conserve numa garrafa de vidro fosco,
Cubra as placas com uma tampa ou pelcula plstica e agite soluo de ajuste de pH. Misture 40 ml de cido actico R
suavemente. Incube as placas num recipiente hmido num com 1,25 ml de cido clordrico 1 M e 8,75 ml de gua R,
incubador de CO2 a 37C, no mnimo, durante 2 horas. Junte
200 l de uma suspenso de clulas contendo 1 105 tampo de extraco de pH 4,7. Dissolva 10 g de
clulas/ml em todos os poos. Cubra as placas com pelcula de laurilsulfato de sdio R em gua R e junte 50 ml de
plstico. Incube a 37C durante 5 dias. Pesquise contaminao dimetilformamida R. Complete 100 ml com gua R. Ajuste
microbiana por um exame microscpico. o pH (2.2.3) com ajuda de um volume apropriado da
soluo de ajuste de pH.
Os poos amarelos so registados como negativos e os poos
vermelhos que assinalam as clulas mortas so registados As clulas Vero cultivam-se em frascos para cultura celular
como positivos. Uma colorao situada entre o amarelo e o (por exemplo, 75 cm2/250ml) num incubador a 36 1C
vermelho indica a presena simultnea de clulas viveis e com um teor em CO2 de 5 por cento e uma humidade
mortas e regista-se como positiva/negativa. Os resultados relativa de 90 por cento. As clulas Vero multiplicam-se no
baseiam-se na viragem da colorao podendo ser confirmados meio de cultura completo. Aps 6-7 dias de crescimento,
verificando a presena de clulas viveis e mortas ao obtm-se uma camada monocelular confluente. Elimine o
microscpio. sobrenadante da cultura e lave 3 vezes com a tripsina-EDTA
a camada celular; com uma pipeta retire com cuidado o
A actividade das amostras de soro de cobaio obtm-se meio, junte 0,5-1 ml de tripsina-EDTA, agite o frasco e verta
comparando o ltimo poo da preparao de referncia que a tripsina para fora do frasco. Repita a operao uma 2. vez.
apresente uma neutralizao completa da toxina com o 3. lavagem coloque o frasco num incubador durante 5 min
ltimo poo da amostra que apresente um efeito idntico. at que as clulas comecem a separar-se do tapete celular. D
Para o clculo da actividade necessrio no esquecer que o pancadas vigorosas na parede do frasco para fazer descer as
ponto final pode situar-se entre um poo negativo e um poo
clulas. Coloque de novo as clulas em suspenso em
positivo/negativo.
6-25 ml de meio de cultura completo fresco de forma a obter
Tcnica operatria 2. O azul de tiazolil (MTT) reduzido uma suspenso homognea. Prepare uma suspenso no meio
para derivado formazam corado pelas clulas viveis e de cultura completo contendo cerca de 4 105 clulas/ml.

2.7.7. Aferio da actividade da vacina contra a tosse convulsa
Coloque 50 l de meio de cultura completo em todos os protectora comparada com a dose de uma preparao
poos, com excepo dos da coluna 1. Coloque 100 l de referncia da vacina contra a tosse convulsa aferida em
soro antidiftrico de cobaio (vacinas para uso humano) (soro Unidades Internacionais que assegure a mesma proteco.
testemunha positiva, diluio de trabalho 0,12 U.I./ml no
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma
meio de cultura completo) no poo A1 e 50 l no poo A11.
dada quantidade de padro internacional; este constitudo
Coloque 100 l das amostras de soro de cobaio em ensaio, se
por vacina contra a tosse convulsa seca. A correspondncia
necessrio diludo, nos poos B1-G1. Junte 50 l da mesma
2. Mtodos
Analticos
entre a Unidade Internacional e o padro internacional

amostra aos poos nmero B11-G11 da fila correspondente.
indicada pela Organizao Mundial de Sade.
Coloque 100 l de soro testemunha negativa no poo H1 e
50 l no poo H11. Com uma micropipeteta multicanal, Escolha e distribuio dos animais de experincia. Utilize
efectue sries de diluies a 1/2 transferindo 50 l de um murganhos saudveis, com menos de 5 semanas de idade,
poo ao poo seguinte atravs da placa (das colunas 1-10 para de uma estirpe apropriada, proveniente de um grupo
as filas A-G e das colunas 1-8 para a fila H). homogneo. A diferena de massa entre o animal mais
pesado e o animal mais leve no ultrapassa 5 g. Distribua os
A toxina diftrica com actividade e teor Lf conhecidos murganhos em 6 grupos, pelo menos, de 16 e 4 grupos de 10.
diluda a uma diluio stock de trabalho apropriada
contendo, no mnimo, 4 doses citopticas mnimas no Os murganhos devem ser todos do mesmo sexo; caso
meio de cultura completo. Junte 50 l da toxina diluda em contrrio, reparta igualmente machos e fmeas entre os
todos os poos, com excepo dos poos H9 e H10 (clulas grupos.
testemunhas) dos poos A11-H11 (soro testemunha) e dos Escolha da estirpe de prova e preparao da suspenso de
poos A12-H12 (toxina testemunha). Junte 100 l da toxina prova. Escolha uma estirpe apropriada de B. pertussis que
diluda ao poo A12 e efectue uma diluio a 1/2 transferindo provoque a morte dos murganhos nos 14 dias seguintes
50 l de um poo ao poo seguinte no sentido descendente da infeco efectuada por via intracerebral. Se morrerem mais
placa (a partir dos poos A12-H12). Retire 50 l do poo H12. de 20 por cento dos murganhos nas primeiras 48 h aps a
Junte 50 l de meio completo aos poos H9 e H10. injeco, a estirpe de B. pertussis no convm. Efectue uma
Cubra as placas com uma tampa ou com uma pelcula subcultura e prepare uma suspenso contendo as bactrias
plstica e deixe em repouso durante 1 h temperatura recolhidas, numa soluo de pH entre 7,0 e 7,2 contendo
ambiente para permitir a neutralizao da toxina. Junte 50 l 10 g/l de hidrolisado de casena e 6 g/l de cloreto de sdio
de uma suspenso celular contendo cerca de 4 x 105 clulas/ml ou de uma outra soluo apropriada. Determine a opacidade
em todos os poos. Sele as placas e incube-as a 37C durante da suspenso. Prepare uma srie de diluies com a mesma
6 dias. Pesquise contaminao microbiana por um exame soluo e distribua-as razo de uma diluio por grupos de
microscpico. Junte 10 l da soluo (MTT) em cada poo. 10 murganhos. Injecte por via intracerebral a cada murganho
Incube as placas a 37C durante 24 h suplementares. Retire uma dose (0,02 ml ou 0,03 ml) da diluio atribuda ao seu
em seguida o meio de cultura e junte 100 l do tampo de grupo. Decorridos 14 dias, conte o nmero de sobreviventes
extraco de pH 4,7 em cada poo. Incube as placas a 37C em cada grupo e calcule, a partir destes valores, a opacidade
durante uma noite para facilitar o processo de extraco. terica da suspenso que contm 100 DL50 em cada dose de
Desde que a extraco e a solubilizao estejam concludas, prova.
examine as placas a olho nu ou efectue uma leitura a 570 nm. Para o ensaio de actividade da amostra, efectue uma nova
Os poos azuis/negros so registados como negativos (todas subcultura da mesma estirpe de B. pertussis. Recolha
as clulas esto vivas, neutralizao da toxina pela antitoxina) as bactrias e prepare uma suspenso de opacidade
e os poos brancos ou incolores que indicam a presena correspondente a cerca de 100 DL50 por dose de prova e
de clulas mortas (nenhuma neutralizao da toxina) so seguida de 3 diluies desta suspenso.
registados como positivos. Determinao da actividade da vacina. Prepare uma srie de
A actividade da antitoxina em ensaio, obtm-se comparando 3 diluies da amostra e uma srie de 3 diluies anlogas
o ltimo poo da preparao de referncia da antitoxina da preparao de referncia de maneira que, em cada srie, a
que apresente uma neutralizao da toxina com o ltimo diluio mediana corresponda que deveria proteger cerca de
poo da preparao da antitoxina que apresente um efeito 50 por cento dos animais contra o efeito letal da dose de prova
idntico. O ttulo em anticorpos neutralizantes da amostra da suspenso de B. pertussis. Convm, por exemplo, utilizar
em ensaio pode ser calculado multiplicando o factor de doses que contenham em 0,5 ml, no mximo, 1/8, 1/40 e 1/200
diluio pelo nmero total de Unidades Internacionais por da dose humana para a amostra e 0,5 U.I., 0,1 U.I. e 0,02 U.I.
mililitro da preparao de referncia no ponto final. O ensaio para a preparao de referncia. Distribua as 6 diluies razo
s vlido se todas as clulas na testemunha para a toxina de uma diluio por grupo de, pelo menos, 16 murganhos,
estiverem mortas e se a antitoxina de referncia provocar e injecte por via intraperitoneal a cada murganho a dose da
uma neutralizao, no mnimo, para as 2 primeiras diluies diluio atribuda ao seu grupo. Decorridos 14 a 17 dias, inocule,
ensaiadas. por via intracerebral a cada animal dos grupos de, pelo menos,
16 murganhos, uma dose da suspenso de prova. Distribua a
suspenso de prova e as suas 3 diluies razo de cada uma
delas por grupos de 10 murganhos. Inocule por via intracerebral
2.7.7. AFERIO DA ACTIVIDADE DA a cada murganho a dose de suspenso atribuda ao seu grupo.
VACINA CONTRA A TOSSE CONVULSA No so considerados os animais mortos no decurso das 48 h
aps administrao da dose de prova. Aps 14 dias, registe o
A actividade da vacina contra a tosse convulsa avaliada por nmero de murganhos sobreviventes em cada grupo. Calcule a
determinao da dose que protege os murganhos contra actividade da amostra em relao actividade da preparao de
os efeitos de uma dose letal de uma estirpe de Bordetella referncia com base no nmero de animais sobreviventes em
pertussis, administrada por via intracerebral. A dose cada grupo de, pelo menos, 16 murganhos.

2.7.8. Aferio da actividade da vacina adsorvida contra o ttano
O ensaio s vlido se: vacina polivalente com o maior nmero de componentes

igualmente vlida para as vacinas polivalentes comportando
para a amostra e para a preparao de referncia, a dose
menos componentes e para vacinas monovalentes. Qualquer
protectora 50 por cento se situar entre a dose mais fraca
vacina polivalente que inclua um componente da tosse
e a dose mais forte das preparaes administradas aos
murganhos, convulsa de clula inteira ou vacina conjugada contra
o haemophilus tipo b e a anatoxina tetnica no mesmo
o nmero de mortos nos 4 grupos de 10 murganhos que recipiente deve sempre ser avaliada separadamente.
2. Mtodos
Analticos
receberam a suspenso de prova e as suas diluies indicar
que a dose de prova de cerca de 100 DL50, Para as combinaes de componentes diftrico e tetnico,
pode ser efectuada a aferio serlgica (mtodo C) utilizando
a anlise estatstica no revelar desvios da linearidade ou do o mesmo grupos de animais que tenham sido utilizados para
paralelismo. a aferio serolgica da actividade da vacina adsorvida contra
O ensaio pode ser repetido, neste caso, o clculo da actividade a difteria (2.7.6) quando as condies de imunizao comuns
inclui os resultados de todos os ensaios vlidos. para os componentes diftrico e tetnico (por exemplo, doses,
durao) so reconhecidas como satisfatrias para a vacina
combinada.
2.7.8. AFERIO DA ACTIVIDADE As aferies que so descritas a seguir utilizam diluies
DA VACINA ADSORVIDA CONTRA mltiplas para a amostra e para a preparao de referncia.
O TTANO Em funo dos dados do ensaio de actividade obtidos

aquando dos ensaios com diluies mltiplas, pode ser
A actividade da vacina adsorvida contra o ttano possvel diminuir o nmero de animais necessrios
determinada por administrao da vacina aos animais obteno de resultados estatisticamente significativos,
(cobaios ou murganhos) seguida de uma prova virulenta por aplicando um modelo simplificado com apenas uma
meio da toxina tetnica (mtodo A ou B) ou por determinao diluio para a amostra e para a testemunha. Um tal
do ttulo em anticorpos dirigidos contra a anatoxina tetnica modelo permite ao analista determinar se a actividade
no soro de cobaios (mtodo C). Nos dois casos, a actividade da amostra superior, de modo significativo, ao mnimo
da vacina calcula-se por comparao com a da vacina de exigido mas no fornece informao sobre a linearidade,
referncia, aferida em Unidades Internacionais. Para os o paralelismo e sobre o declive significativo das curvas
mtodos A e B, e em pases onde o uso do mtodo paralisante dose-resposta. O modelo simplificado permite uma
no obrigatrio, pode ser utilizado o ensaio DL50. Neste reduo considervel do nmero de animais exigidos e
caso, o nmero de animais e o mtodo so idnticos aos que a sua utilizao deve ser tomada em considerao, de
so descritos para o ensaio pelo mtodo paralisante. A nica acordo com as disposies da Conveno europeia para
diferena reside no facto de o fim do ensaio ser marcado pela a proteco dos animais vertebrados utilizados para fins
morte do animal e no pela paralisia do animal. experimentais ou outros fins cientficos.
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma Em caso de utilizao de aferies com apenas uma diluio,
dada quantidade do padro internacional da anatoxina a reprodutibilidade no tempo da produo e do ensaio
tetnica adsorvida. A correspondncia entre a Unidade controlada por meio de indicadores apropriados, praticando
periodicamente uma aferio completa com diluies
Internacional e o padro internacional indicada pela
mltiplas, por exemplo, de 2 em 2 anos. Para as aferies
serolgicas, os indicadores apropriados para controlar a
A vacina adsorvida contra o ttano PBR aferida em Unidades reprodutibilidade do ensaio so:
Internacionais por comparao com o padro internacional.
a mdia e o desvio padro relativo dos ttulos relativos dos
O mtodo escolhido para a aferio da actividade da vacina
soros ou dos valores obtidos das amostras de soros aps
adsorvida contra o ttano depende do papel da aferio. So
administrao de uma dada dose da vacina de referncia,
utilizados os mtodos A ou B:
os ttulos ou os valores antitxicos dos soros testemunha
1. no decurso do desenvolvimento de uma vacina, para a
(amostras de soro positivo e negativo),
aferio de lotes produzidos a fim de validar a produo,
a relao entre os ttulos ou os valores antitxicos do soro
2. sempre que necessria uma revalidao, aps uma
testemunha positivo e da amostra do soro correspondendo
modificao significativa do mtodo de fabrico.
vacina de referncia.
Os mtodos A ou B podem igualmente ser utilizados no
quadro da aferio da actividade de rotina dos lotes de vacina,
mas pelo bem-estar dos animais utiliza-se sempre que MTODO A. PROVA DE VIRULNCIA EM COBAIOS
possvel o mtodo C.
ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS
Com excepo dos casos precedentes especificados nos pontos DE EXPERINCIA
1 e 2, o mtodo C pode ser utilizado aps verificao da
conformidade do mtodo para o produto. Para este efeito, um Utilize cobaios saudveis, provenientes de uma criao
nmero apropriado de lotes (em geral 3) aferido segundo homognea, pesando cada um entre 250-350 g. Distribua-
o mtodo C e segundo o mtodo A ou B. Se diferentes -os, no mnimo, em 6 grupos iguais; o nmero de cobaios
vacinas (monovalentes ou polivalentes) so preparadas de cada grupo deve ser suficiente para obter resultados que
a partir de anatoxinas tetnicas com a mesma origem e satisfaam s condies de validade prescritas a seguir. Se a
tendo nveis comparveis (expressos em Lf/ml) da mesma actividade da toxina de prova deve ser demonstrada, junte
anatoxina tetnica, demonstra-se que a conformidade para a 3 grupos de 5 cobaios no vacinados como testemunha. Os

cobaios devem ser do mesmo sexo, seno machos e fmeas CONDIES DE VALIDADE
devem ser igualmente distribudos entre os grupos.
ESCOLHA DA TOXINA DE PROVA para a amostra e para a preparao de referncia, a dose
protectora 50 por cento se situar entre a dose mais fraca e a
Escolha uma toxina de prova, contendo, no mnimo, 50 dose mais forte das preparaes administradas aos cobaios,
2. Mtodos
Analticos
vezes a dose paralisante 50 por cento por mililitro. Se tiver

se aplicvel, o nmero de animais paralisados nos 3 grupos
sido demonstrada a estabilidade da toxina de prova, no
de 5 cobaios que tendo recebido as diluies da soluo da
necessrio controlar a actividade da soluo da toxina de
toxina de prova, indique que a dose de prova de cerca de
prova em cada aferio. 50 doses paralisantes 50 por cento,
PREPARAO DA SOLUO DA TOXINA DE PROVA os limites de confiana (P = 0,95) da aferio no forem

inferiores a 50 por cento nem superiores a 200 por cento
do valor estimado,
A partir desta toxina, prepare imediatamente antes do
emprego, num diluente apropriado (por exemplo, uma a anlise estatstica revelar que as curvas dose-resposta
soluo salina tamponada peptonada de pH 7,4), uma soluo apresentam um declive significativo e no revelam
estvel da toxina de prova contendo cerca de 50 doses nenhum desvio da linearidade nem do paralelismo (se so
paralisantes 50 por cento por mililitro. Se necessrio, utilize observados desvios significativos, reportar ao captulo 5.3).
solues diludas a 1/16, 1/50 e 1/160 no mesmo diluente, O ensaio pode ser repetido, mas neste caso, o clculo da
para a determinao da actividade da toxina. actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios
vlidos.
DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO
DE REFERNCIA
MTODO B. PROVA DE VIRULNCIA EM MURGANHOS
ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS
da amostra e da preparao de referncia de modo que cada
grupo de diluies constitua, no mximo, uma srie de DE EXPERINCIA
razo 2,5, em que as diluies intermdias, injectadas por
via subcutnea razo de 1,0 ml por cobaio, devam proteger Utilize murganhos saudveis, provenientes de uma mesma
criao de uma estirpe reconhecida como apropriada e com
cerca de 50 por cento dos animais dos efeitos paralisantes
cerca de 5 semanas de idade. Distribua-os, no mnimo, em
provocados pela inoculao por via subcutnea da quantidade
6 grupos iguais: o nmero de murganhos em cada grupo
de toxina tetnica prescrita para este ensaio. deve ser suficiente para obter resultados que satisfaam s
condies de validade prescritas a seguir. Se no tiver sido
IMUNIZAO E PROVA demonstrada a estabilidade da toxina de prova ou se a mesma
no tiver sido aferida de forma adequada, junte, para verificar
Reparta as diluies razo de uma diluio por cada grupo a sua actividade, 3 grupos, no mnimo, de 5 murganhos no
de cobaios e injecte por via subcutnea a cada cobaio, 1,0 ml vacinados como testemunha. Os murganhos devem ser do
da diluio atribuda ao seu grupo. Aps 28 dias, inocule por mesmo sexo; seno, machos e fmeas devem ser igualmente
via subcutnea a cada animal 1,0 ml da soluo da toxina de distribudos entre os grupos.
prova contendo 50 doses paralisantes 50 por cento.
ESCOLHA DA TOXINA DE PROVA
DETERMINAO DA ACTIVIDADE DA TOXINA DE PROVA
Escolha uma toxina tetnica contendo, no mnimo, 100
Se necessrio, atribua as 3 diluies da soluo da toxina de vezes a dose paralisante 50 por cento por mililitro. Se tiver
prova razo de uma por cada um dos 3 grupos de 5 cobaios sido demonstrada a estabilidade da toxina de prova no
necessrio controlar a actividade da soluo da toxina de
e inocule por via subcutnea, a cada cobaio de cada grupo,
prova em cada aferio.
1,0 ml da soluo da toxina de prova atribuda ao seu grupo.
A actividade e a estabilidade da toxina de prova determina-se
efectuando um nmero apropriado de determinaes da dose PREPARAO DA SOLUO DA TOXINA DE PROVA
paralisante 50 por cento. No , ento, necessrio repetir esta
A partir desta toxina, prepare imediatamente antes do seu
determinao para cada aferio.
emprego, num diluente apropriado (por exemplo, uma
soluo salina de tampo peptonada de pH 7,4) uma soluo
LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS estvel da toxina de prova contendo cerca de 50 doses
paralisantes 50 por cento em 0,5 ml. Se necessrio, utilize
Examine os cobaios 2 vezes por dia. Retire aqueles que solues diludas a 1/16, 1/50 e 1/160 no mesmo diluente,
apresentem sinais especficos de paralisia tetnica e pratique para a determinao da actividade da toxina.
a eutansia nesses animais. 5 dias aps a injeco da toxina
de prova, registe o nmero de cobaios isentos de paralisia. DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO
Calcule a actividade da amostra por comparao com a DE REFERNCIA
preparao de referncia, com base na proporo de animais
submetidos prova isentos de paralisia em cada grupo de Prepare, numa soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l, diluies
animais vacinados, pelos mtodos estatsticos habituais. da amostra e da preparao de referncia de modo que

para cada uma as diluies formem uma srie de razo MTODO C. DETERMINAO DE ANTICORPOS EM
no superior a 2,5 e em que as diluies intermdias, COBAIOS
quando injectadas subcutneamente na dose de 0,5 ml por
murganho, protegem cerca de 50 por cento dos animais ESCOLHA E DISTRIBUIO DOS ANIMAIS
dos efeitos paralisantes provocados pela inoculao, por via DE EXPERINCIA
subcutnea, da quantidade de toxina tetnica prescrita para
Utilize cobaios saudveis, provenientes duma criao
2. Mtodos
Analticos
este ensaio.
homognea, pesando cada entre 250-350 g. Os cobaios
devem ser do mesmo sexo, seno machos e fmeas devem
IMUNIZAO E PROVA ser distribudos igualmente entre os grupos. Distribua-
-os, no mnimo, em 6 grupos iguais: o nmero de cobaios
Reparta as diluies razo de uma diluio por cada em cada grupo deve ser suficiente para obter resultados
grupo de murganhos e injecte por via subcutnea em cada que satisfaam s condies de validade. Utilize um grupo
murganho 0,5 ml da diluio atribuda ao seu grupo. Aps suplementar constitudo por cobaios no vacinados e
28 dias, inocule por via subcutnea a cada animal 0,5 ml da proveniente da mesma criao para fornecer um soro
soluo da toxina de prova contendo 50 doses paralisantes 50 testemunha negativo. Se tiver sido demonstrada a
por cento. reprodutibilidade do ensaio, pode ser utilizado um soro
testemunha negativo de referncia.
DETERMINAO DA ACTIVIDADE DA TOXINA DE PROVA
PREPARAO DE REFERNCIA
Se necessrio, atribua as 3 diluies da soluo da toxina
de prova, razo de uma para cada um dos 3 grupos, no Utilize uma preparao de referncia apropriada, como
mnimo, de 5 murganhos e inocule por via subcutnea, a vacina adsorvida contra o ttano PBR ou um lote de
a cada murganho, 0,5 ml da soluo da toxina de prova vacina ou um outro lote representativo em que tenha sido
atribuda ao seu grupo. demonstrada a eficcia nos ensaios clnicos e que tenha sido
aferido em Unidades Internacionais por comparao com
a vacina adsorvida contra o ttano PBR ou com o padro
LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
internacional da anatoxina adsorvida contra o ttano.
Examine os murganhos 2 vezes por dia. Retire aqueles que
apresentem sinais especficos de paralisia tetnica e pratique DILUIO DA AMOSTRA E DA PREPARAO
a eutansia nesses animais. 4 dias aps a inoculao da DE REFERNCIA
toxina de prova, registe o nmero de murganhos isentos de
paralisia. Calcule a actividade da amostra por comparao
em srie da amostra e da preparao de referncia; considera-
preparao de referncia, com base na proporo de animais
-se satisfatria uma srie de razo entre 2,5 e 5. Utilize, no
submetidos prova e isentos de paralisia em cada grupo
mnimo, 3 diluies, por exemplo, no intervalo entre
de animais vacinados, utilizando os mtodos estatsticos
0,5-16 U.I./ml para cada srie. Utilize as diluies para a
habituais.
imunizao de preferncia no espao de uma hora aps a
preparao. Atribua uma diluio a cada grupo de cobaios.
CONDIES DE VALIDADE
IMUNIZAO
para a amostra e para a preparao de referncia, a dose Injecte a cada cobaio por via subcutnea, na nuca, 1,0 ml da
protectora 50 por cento se situar entre a dose mais fraca diluio atribuda ao seu grupo.
e a dose mais forte das preparaes administradas aos
murganhos, COLHEITA DE SANGUE
se aplicvel, o nmero de animais paralisados nos 3
35-42 dias aps a imunizao, colha uma amostra de sangue
grupos, no mnimo, de 5 murganhos que tendo recebido as
de cada cobaio vacinado e testemunha, por um mtodo
diluies da soluo da toxina de prova indique que a dose apropriado.
de prova cerca de 50 doses paralisantes 50 por cento,
os limites de confiana (P = 0,95) no so inferiores a PREPARAO DAS AMOSTRAS DE SORO
50 por cento nem superiores a 200 por cento do valor
estimado, Evite frequentes congelaes e descongelaes das amostras
de soro. Para evitar contaminao microbiana, prefervel
a anlise estatstica mostrar que as curvas dose-resposta
efectuar as manipulaes numa cmara de fluxo de ar
apresentam um declive significativo e no revelam
laminar.
nenhum desvio da linearidade nem do paralelismo (se so
observados desvios significativos, reportar ao captulo 5.3).
O ensaio pode ser repetido, mas neste caso o clculo da
actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios Determine o ttulo relativo em anticorpos ou o valor de cada
vlidos. amostra de soro por um mtodo imunoqumico apropriado

(2.7.1). Os mtodos apresentados a seguir (aferio por T5: crise tetnica, espasmos tnicos contnuos dos
imunoadsoro com enzima conjugada (ELISA) e inibio da msculos,
ligao da toxina (ToBI) tm sido considerados satisfatrios. D: morte.
CLCULO DA ACTIVIDADE
MTODO B. PROVA DE VIRULNCIA EM MURGANHOS
2. Mtodos
Analticos
Calcule a actividade da amostra em Unidades Internacionais

por comparao com a preparao de referncia, pelos LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS
mtodos estatsticos habituais (por exemplo, 5.3).
Para reduzir o sofrimento animal durante o ensaio,
recomendado anotar o grau de paralisia numa escala
CONDIES DE VALIDADE semelhante quela que apresentada a seguir. A escala
fornece os sinais tpicos para uma injeco da toxina de
O ensaio s ser vlido se: prova efectuada na regio dorsal, junto de uma das patas
os limites de confiana (P = 0,95) no forem inferiores posteriores. O estdio T3 requerido como indicador do
fim do ensaio, mas, com a experincia, o estdio T3 pode ser
a 50 por cento nem superiores a 200 por cento do valor
substitudo pelo estdio T2. A toxina tetnica produz uma
estimado,
paresia seguida de uma paralisia da pata posterior qual foi
a anlise estatstica mostrar que as curvas dose-resposta injectada a toxina que facilmente detectvel num estdio
apresentam um declive significativo e no revelam precoce. Os graus de paralisia no murganho podem ser
nenhum desvio da linearidade nem do paralelismo (se so caracterizados por meio dos sinais seguintes:
observados desvios significativos, reportar ao captulo, 5.3). T1: ligeira rigidez da pata posterior qual foi injectada
a toxina, unicamente observada quando o murganho
O ensaio pode ser repetido, mas neste caso, o clculo da
levantado pela cauda,
actividade deve incluir os resultados de todos os ensaios
vlidos. T2: paresia da pata posterior qual foi injectada a toxina,
mas que permite o animal mover-se,
A seco seguinte publicada a ttulo de informao.
T3: paralisia da pata posterior qual foi injectada a toxina,
que no permite o animal mover-se,
Recomendaes T4: a pata posterior qual foi injectada a toxina est
para a realizao da aferio da actividade completamente rgida e os dedos no podem mexer-se,
da vacina adsorvida contra o ttano T5: crise tetnica, espasmos tnicos contnuos dos
msculos,
MTODO A. PROVA DE VIRULNCIA EM COBAIOS D: morte.
LEITURA E INTERPRETAO DOS RESULTADOS

MTODO C. DETERMINAO DE ANTICORPOS NO COBAIO
Para reduzir o sofrimento animal durante o ensaio, PREPARAO DAS AMOSTRAS DE SORO
recomendado registar o grau de paralisia numa escala
semelhante que apresentada a seguir. A escala fornece Para a preparao das amostras de soro, a tcnica seguinte
sinais tpicos para uma injeco da toxina de prova por via tem sido considerada apropriada. Inverta 6 vezes os tubos
subcutnea efectuada na regio ventral mediana, logo atrs contendo as amostras de sangue e deixe em repouso a 37C
do esterno, dirigindo a agulha em direco do pescoo do durante 2 h e em seguida a 4C durante 2 h. Centrifugue
cobaio. temperatura ambiente a 800 g durante 20 min. Transfira
o soro para tubos estreis e conserve a uma temperatura
O estdio T3 requerido como indicador do fim do ensaio,
inferior a -20C. Obtm-se com este mtodo, no mnimo,
mas, com a experincia, o estdio T3 pode ser substitudo 40 por cento de soro.
pelo estdio T2. A toxina tetnica produz uma paralisia, no
mnimo, de 1 pata anterior detectvel num estdio precoce.
Os graus de paralisia no cobaio podem ser caracterizados por
meio dos sinais seguintes:
Os ensaios ELISA e ToBI apresentados a seguir so dados a
T1: ligeira rigidez de uma pata anterior, difcil de observar, ttulo de exemplos de mtodos imunoqumicos considerados
apropriados para a determinao do ttulo em anticorpos.
T2: paresia de uma pata anterior, que pode contudo
permanecer em funo,
Determinao do ttulo em anticorpos no soro de cobaio
T3: paralisia de uma pata anterior. O animal movimenta-se por imunoadsoro com enzima conjugada (ELISA). As
com repugnncia, o corpo est muitas vezes ligeiramente diluies das amostras de soros a examinar e dos soros de
curvado devido escoliose, referncia so efectuadas em placas para ELISA revestidas da
anatoxina tetnica. Um soro de cobaio testemunha positiva
T4: uma pata anterior apresenta-se completamente rgida e um soro de cobaio testemunha negativa so includos em
e os dedos impossibilitados de mexer. As contraces cada placa para controlar os resultados obtidos da aferio.
musculares da pata anterior so muito pronunciadas e So adicionados anticorpos de coelho ou de cabra anti-IgG
observa-se geralmente uma escoliose, de cobaio conjugados peroxidase, seguidos de substrato de

peroxidase. Mede-se a densidade ptica e o ttulo relativo em junte 100 l de cada soro aos 2 primeiros poos da coluna
anticorpos calculado pelos mtodos estatsticos habituais qual atribuda. Com uma micropipeta de dosagem mltipla,
(por exemplo, 5.3). efectue sries de diluies em duplicado a partir da fila B
percorrendo a placa at coluna H transferindo 100 l para
Reagentes e aparelhagem o poo seguinte. Elimine 100 l da ltima fila a fim de que os
poos contenham todos 100 l. Incube a 37C durante
placas para ELISA: 96 poos, colunas 1-12, linhas A-H, 2 h. Lave cuidadosamente com o tampo de lavagem. Prepare
2. Mtodos
Analticos
soro de cobaio anti-Clostridium tetani (vacinas para uso uma diluio apropriada (tem sido considerada satisfatria
humano) PBR (soro testemunha positivo), uma diluo a 1/2000) do conjugado de peroxidase no tampo
diluente de bloqueio e junte 100 l a cada poo. Incube
conjugado de peroxidase. Anticorpos de coelho ou de cabra
a 37C em atmosfera hmida durante 1 h. Lave as placas
conjugado peroxidase e dirigido contra a IgG de cobaio,
cuidadosamente com o tampo de lavagem. Junte 100 l
anatoxina tetnica, de substrato de peroxidase a cada poo. Deixe em repouso
temperatura ambiente, ao abrigo da luz, durante 30 min.
tampo de carbonato de pH 9,6. Dissolva 1,59 g de
Leia as placas a 405 nm, respeitando a ordem seguida no
carbonato de sdio anidro R e 2,93 g de bicarbonato de
sdio R em 1000 ml de gua R. Distribua em frascos de momento da adio do substrato.
150 ml e esterilize por aquecimento em autoclave a 121C
durante 15 min, Determinao do ttulo em anticorpos no soro de cobaio
por inibio da ligao da toxina ou da anatoxina (ToBI). A
soluo salina de fosfato tamponada de pH 7,4 (PBS).
toxina tetnica adicionada srie de diluies da amostra
Dissolva com agitao 80,0 g de cloreto de sdio R, 2,0 g
e dos soros de referncia; as misturas soro/antignio so
de fosfato monopotssico R, 14,3 g de fosfato dissdico di-
mantidas em incubao durante a noite. Para determinar
-hidratado R e 2,0 g de cloreto de potssio R em 1000 ml
a quantidade de toxina ou de anatoxina livre, as misturas
de gua R. Conserve temperatura ambiente para evitar a
so transferidas para uma placa para ELISA revestida de
cristalizao. Dilua a soluo a 1/10 com gua R antes do
emprego, antitoxina tetnica. So adicionadas a IgG antitetnica de
cavalo conjugada peroxidase, seguido de um substrato de
soluo de cido ctrico. Dissolva 10,51 g de cido ctrico peroxidase. A densidade ptica medida e calcula-se o ttulo
R em 1000 ml de gua R e ajuste o pH para 4,0 com uma em anticorpos, pelos mtodos estatsticos habituais (por
soluo de hidrxido de sdio R a 400 g/l. exemplo, 5.3). A fim de controlar os resultados da aferio so
tampo de lavagem. PBS contendo 0,5 g/l de polissorbato includos em cada placa um soro testemunha positiva e um
20 R, soro testemunha negativa.
tampo diluente de bloqueio. PBS contendo 0,5 g/l de

Reagentes e aparelhagem
polissorbato 20 R e 25 g/l de leite desnatado seco,
placas de microtitulao em polistireno rgido, de fundo
substrato de peroxidase. Pouco tempo antes do emprego,
dissolva 10 mg de 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6- redondo,
-sulfonato) de diamnio R (ABTS) em 20 ml de soluo de placas para ELISA de fundo plano,
cido ctrico. Imediatamente antes do emprego, junte 5 l
de soluo concentrada de perxido de hidrognio. toxina tetnica ou anatoxina tetnica,
soro de cobaio anti-Clostridium tetani (para vacinas para
Mtodo uso humano) PBR,
A descrio a seguir dada a ttulo de exemplo e podem ser IgG antitetnica de cavalo,
utilizadas outras disposies das placas. Os poos 1 A-H so
IgG antitetnica de cavalo conjugada peroxidase,
utilizados para o soro testemunha negativa e os poos 2
A-H e 12 A-H so utilizados para o soro testemunha positiva tampo de carbonato de pH 9,6. Dissolva 1,5 g de
(controlo dos resultados da aferio). Os poos 3-11 A-H so carbonato de sdio anidro R, 2,39 g de bicarbonato de sdio
utilizados para as amostras. R e 0,2 g de azida de sdio R em 1000 ml de gua R. Ajuste
Recubra cada poo das placas para ELISA com 100 l para pH 9,6 e autoclave a 121C durante 20 min,
de soluo da anatoxina tetnica (0,5 Lf/ml no tampo tampo de acetato de sdio de pH 5,5. Dissolva 90,2 g de
carbonato). Deixe em repouso at ao dia seguinte a 4C acetato de sdio anidro em 900 ml de gua R, ajuste o pH
em atmosfera hmida. Para evitar interferncias devido ao para 5,5 com uma soluo saturada de cido ctrico mono-
gradiente de temperatura, no empilhe mais de 4 placas -hidratado R e complete 1000 ml com gua R,
umas sobre as outras. No dia seguinte, lave cuidadosamente
as placas com o tampo de lavagem. Bloqueie as placas soluo salina de fosfato tamponada de pH 7,2 (PBS).
adicionando 100 l do tampo diluente de bloqueio em cada Dissolva 135,0 g de cloreto de sdio R, 20,55 g de fosfato
poo. Incube numa atmosfera hmida a 37C durante 1 h. dissdico di-hidratado R e 4,80 g de fosfato monossdico
Lave as placas cuidadosamente com o tampo de lavagem. mono-hidratado R em gua R e complete 15 litros com o
Coloque 100 l do tampo diluente de bloqueio em cada poo mesmo solvente. Autoclave a 100C durante 60 min,
das placas, excepo dos poos da fila A. Prepare diluies tampo diluente. PBS contendo 5 g/l de albumina bovina R
apropriadas dos soros testemunha negativa e testemunha
e 0,5 g/l de polissorbato 80 R,
positiva (cerca de 0,01 U.I./ml) e das amostras. Atribua o
soro testemunha negativo coluna 1, o soro testemunha tampo de bloqueio. PBS contendo 5 g/I de albumina
positivo s colunas 2 e 12 e as amostras s colunas 3-11 e bovina R,

2.7.9. Aferio da funo Fc da imunoglobulina
soluo de tetrametilbenzidina. Soluo de 2.7.9. AFERIO DA FUNO Fc

tetrametilbenzidina R a 6 g/l em lcool R. A substncia
dissolve-se em 30-40 min temperatura ambiente, DA IMUNOGLOBULINA
substrato de peroxidase. Misture 90 ml de gua R, 10 ml de Sangue humano estabilizado. Colha sangue humano do
tampo de acetato de sdio de pH 5,5, 1,67 ml da soluo grupo O numa soluo anticoagulante ACD. Conserve o
de tetrametilbenzidina e 20 l da soluo concentrada de sangue humano estabilizado a 4C, no mximo, durante 3
2. Mtodos
Analticos
perxido de hidrognio R, semanas.

soluo de lavagem. gua corrente contendo 0,5 g/l de Soluo salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Dissolva
polissorbato 80 R. 1,022 g de fosfato dissdico anidro R, 0,336 g de fosfato
monossdico anidro R e 8,766 g de cloreto de sdio R em
Mtodo 800 ml de gua R e complete 1 000 ml com o mesmo solvente.
Bloqueie as placas de microtitulao em polistireno, de Soluo-me de magnsio e de clcio. Dissolva 1,103 g de
fundo redondo, colocando em cada poo 150 l do tampo cloreto de clcio R e 5,083 g de cloreto de magnsio R em
de bloqueio. Cubra as placas com uma tampa ou com uma gua R e complete 25 ml com o mesmo solvente.
pelcula de plstico. Incube em atmosfera hmida a 37C
Soluo-me de tampo de barbital. Dissolva 207,5 g de
durante 1 h. Lave cuidadosamente as placas com a soluo de
cloreto de sdio R e 25,48 g de barbital sdico R em 4 000 ml
lavagem. Coloque 100 l de PBS em cada poo. Coloque 100 l
de gua R e ajuste para pH 7,3 com cido clordrico 1M. Junte
de antitoxina tetnica de referncia de cobaio no primeiro
12,5 ml da soluo-me de magnsio e de clcio e complete
poo de uma fila. Coloque 100 l das amostras no diludas
5 000 ml com gua R. Filtre por membrana
no primeiro poo do nmero da fila pretendido.
(0,22 m) e conserve a 4C em recipiente de vidro.
Com uma micropipeta de dosagem mltipla, efectue sries de
Soluo tampo de albumina-barbital. Dissolva 0,150 g de
diluies em duplicado percorrendo a placa (at coluna 10)
albumina bovina R em 20 ml de soluo-me de tampo de
transferindo 100 l para o poo seguinte. Elimine 100 l da
barbital e complete 100 ml com gua R.
ltima coluna de modo que os poos contenham todos 100 l.
Prepare uma soluo da toxina ou da anatoxina tetnica a Soluo de cido tnico. Dissolva 10 mg de cido tnico R
0,1 Lf/ml utilizando o PBS como diluente. Junte 40 l desta em 100 ml de soluo salina tamponada de fosfato de pH 7.2.
soluo em todos os poos, excepo dos da coluna 12. Os Prepare imediatamente antes do uso.
poos da fila 11 so uma testemunha positiva. Junte 40 l
Complemento de cobaio. Misture os soros obtidos a partir de,
de PBS aos poos da coluna 12 (testemunha negativa).
pelo menos, 10 cobaios. Separe o soro do sangue coagulado
Agite suavemente as placas e coloque uma tampa sobre
por centrifugao a uma temperatura de cerca de 4C.
cada placa. Recubra as placas para ELISA: imediatamente
Conserve o soro, em pequenas pores, a uma temperatura
antes do emprego, efectue uma diluio apropriada de IgG
inferior a -70C. Imediatamente antes de se iniciar a hemlise
antitetnica de cavalo em tampo de carbonato de pH 9,6 e
por aco do complemento, dilua para 125-200 CH50 por
junte 100 l desta soluo em todos os poos. Coloque uma
mililitro com soluo tampo de albumina-barbital e, durante
tampa sobre cada placa. Incube as 2 sries de placas durante
o ensaio, mantenha a soluo diluda num banho de gelo.
a noite, em atmosfera hmida a 37C. Para evitar os efeitos
do gradiente da temperatura, no empilhe mais de 4 placas Antignio da rubola. Antignio de rubola apropriado para
umas sobre as outras. No dia seguinte, lave cuidadosamente as titulaes da inibio de hemuglutinao. Ttulo > 256
as placas para ELISA com a soluo de lavagem. Bloqueie unidades HA.
as placas colocando em cada poo 125 l do tampo de
Tratamento dos eritrcitos humanos com cido tnico.
bloqueio. Incube a 37C em atmosfera hmida durante 1 h.
Separe os eritrcitos por centrifugao de um volume
Lave as placas cuidadosamente com a soluo de lavagem.
apropriado de sangue humano estabilizado. Lave os
Da mistura de pr-incubao das placas de polistireno,
eritrcitos, pelo menos, 3 vezes, com soluo salina
transfira 100 l para os poos correspondentes das placas
tamponada de fosfato de pH 7,2 e suspenda-os a 2 por cento
para ELISA, comeando pela coluna 12, seguidas das colunas
V/V em soluo salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Tome
1 a 11. Coloque uma tampa sobre cada placa. Incube a 37C
0,1 ml da soluo de cido tnico e complete 7,5 ml com
em atmosfera hmida, durante 2 h. Lave cuidadosamente as
soluo salina tamponada de fosfato de pH 7,2 (concentrao
placas para ELISA com a soluo de lavagem. Efectue uma
final 1,3 mg/l); misture 1 volume da diluio recentemente
diluio apropriada (tem sido considerada satisfatria uma
preparada com l volume da suspenso de eritrcitos e incube
diluio a 1/4000) de IgG antitetnica de cavalo conjugado
a 37C durante 10 min. Recolha os eritrcitos tratados com
peroxidase no tampo diluente. Junte 100 l da diluio
cido tnico por centrifugao (400-800 g, durante 10 min),
em cada poo e coloque uma tampa sobre cada placa.
rejeite o sobrenadante e lave os eritrcitos uma vez com
Incube a 37C em atmosfera hmida, durante 1,5 h. Lave
soluo salina tamponada de fosfato de pH 7,2. Suspenda a
cuidadosamente as placas para ELISA com a soluo de
1 por cento V/V os eritrcitos tratados com cido tnico na
lavagem. Junte 100 l do substrato de peroxidase em cada
soluo salina tamponada de fosfato de pH 7,2.
poo. Desenvolve-se uma colorao azul. Incube as placas
temperatura ambiente. Pare a reaco a um dado tempo Adio do antignio aos eritrcitos. Tome um volume
(aos 10 min) juntando 100 l de cido sulfrico 2 M em cada apropriado (Vs) de eritrcitos tratados com cido tnico,
poo, na mesma ordem que para a adio do substrato. A junte 0,2 ml de antignio da rubola por 1,0 ml de
colorao azul vira para amarela. Determine a absorvncia eritrcitos e incube a 37C durante 30 min. Recolha os
em 450 nm, imediatamente aps a adio do cido sulfrico eritrcitos por centrifugao (400-800 g, durante 10 min) e
ou mantenha as placas no escuro at medio. rejeite o sobrenadante, deixando um volume de

2.7.10. Aferio do factor VII da coagulao humana
200 l. Junte um volume de soluo tampo de albumina- primeiros minutos do registo. Corrija Sexp de acordo com a
-barbital igual ao volume do sobrenadante rejeitado, frmula:
agite at suspenso dos eritrcitos, recolha estes como
acima descrito e repita a lavagem. Complete o volume Sexp
remanescente obtido de 200 l at trs-quartos de Vs , S'
As
obtendo assim o volume inicial (Vi). Misture 900 l de
soluo tampo de albumina-barbital com 100 l de Vi, que
2. Mtodos
Analticos
assim reduzido ao volume residual e determine a absorvncia Para cada preparao, calcule a mdia aritmtica dos valores
inicial em 541 nm (A). Dilua Vr por um factor igual a A de S. Calcule o ndice da funo Fc (IFc) a partir da frmula:
utilizando a soluo tampo de albumina-barbital. Obtm-
-se, assim, o volume final ajustado Vf Vr A de eritrcitos 100 (S' S'c)
I FC
humanos sensibilizados e um valor para A de 1,0 0,1 no SsS'c
caso de uma diluio a 1/10.
S = mdia aritmtica do declive corrigido para a amostra,
Ligao dos anticorpos aos eritrcitos com cido Ss = mdia aritmtica do declive corrigida para a preparao de
tnico e cobertos de antignio. Prepare, em duplicado e referncia,
sucessivamente, as seguintes solues utilizando para cada
Sc = mdia aritmtica do declive corrigida para o complemento
soluo, em separado, uma tina semi-micro (por exemplo,
testemunha.
tinas descartveis) ou um tubo de ensaio para cada soluo:
Calcule o ndice da funo Fc para a amostra. O valor no
(1) Soluo problema. Se necessrio, ajuste a amostra a pH inferior ao indicado no rtulo que acompanha a preparao
7 adicionando, por exemplo, hidrxido de sdio 1 M. referncia.
Tome volumes da amostra contendo, respectivamente,
30 mg e 40 mg de imunoglobulina e complete 900 l
com soluo tampo de albumina-barbital. 2.7.10. AFERIO DO FACTOR VII
(2) Soluo de referncia. Prepare a soluo tal como DA COAGULAO HUMANA
se descreve para a soluo problema a partir da
imunoglobulina humana PBR. A aferio do factor VII da coagulao humana efectua-se
(3) Complemento testemunha. 900 l de soluo tampo de pela determinao da sua actividade biolgica, quer dizer,
albumina-barbital. por medida da capacidade do complexo do factor VIIa / factor
tecidular em activar o factor X em presena de ies de clcio
A cada tina/tubo de ensaio junte 100 l de eritrcitos e de fosfolipidos. A actividade de uma preparao do factor VII
humanos sensibilizados e misture cuidadosamente. Incube calculada por comparao das quantidades respectivas desta
temperatura ambiente durante 15 min, junte 1 000 l de preparao e do padro internacional ou de uma preparao
soluo tampo de albumina-barbital, recolha os eritrcitos de refercia aferida em Unidades Internacionais que so
por centrifugao (1 000 g durante 10 min) da tina/tubo necessrias para obter uma velocidade de formao do factor
de ensaio e retire 1 900 l do sobrenadante. Substitua este Xa num meio de reaco contendo as diferentes substncias
volume com 1 900 l de soluo tampo de albumina-barbital intervenientes na activao do factor X.
e repita o procedimento da lavagem deixando um volume A Unidade Internacional da actividade do factor VII
final de 200 l. As amostras podem ser conservadas em corresponde actividade de uma dada quantidade do padro
tinas/tubos de ensaio fechados a 4C durante 24 h. internacional que actualmente constitudo por plasma
liofilizado. A correspondncia entre a Unidade Internacional
Hemlise por aco do complemento. Para a determinao e o padro internacional indicada pela Organizao Mundial
da hemlise adicione 600 l de soluo tampo de albumina- de Sade.
-barbital aquecida a 37C amostra, suspenda cuidadosamente O concentrado de factor VII da coagulao humana aferido
os eritrcitos pipetando-os repetidamente (no mnimo, 5 vezes) em Unidades Internacionais por comparao com um padro
e coloque a tina no porta-amostra de um espectrofotmetro internacional.
termostatado. Aps 2 min, junte 200 l de complemento de
cobaio diludo para 125-200 CH50/ml, misture cuidadosamente O mtodo de aferio cromognica inclui 2 etapas sucessivas:
pipetando a mistura 2 vezes e inicie imediatamente aps a a activao do factor X, sob a aco do factor VIIa, numa
mistura reactiva contendo o factor tecidular, fosfolipidos e o
segunda pipetagem o registo da absorvncia em 541 nm em
io clcio e a lise enzimtica de um substrato cromognico
funo do tempo, utilizando a soluo tampo de albumina-
pelo factor Xa que liberta um cromforo quantificvel por
-barbital como lquido de compensao. Pre a determinao
espectrofotometria. Em condies de aferio apropriadas
da absorvncia se a curva da absorvncia em funo do tempo
existe uma relao linear entre a velocidade de formao do
ultrapassar nitidamente o ponto de inflexo. factor Xa e a concentrao do factor VII. O esquema seguinte
Doseamento. Determine o declive (S) da curva de hemlise resume o princpio da aferio:
no ponto aproximado da inflexo segmentando a curva na
factor tecidular, ca++
regio de maior declive por intervalos de tempo apropriados a) factor VII factor VIIa
(por exemplo t = 1 min) e calculando S, expresso em A por
minuto entre os pontos de interseco adjacentes. O valor
mais elevado de S corresponde a (Sexp). Determine tambm a factor VIIa, Ca++ + factor tecidular/fosfolipido
b) factor X factor Xa
absorvncia no incio da curva (As) por extrapolao da curva,
a qual quase sempre linear e paralela ao eixo do tempo nos Etapa 2

2.7.11. Aferio do factor ix da coagulao humana
factor Xa
Substrato cromognico Peptido + cromforo Prepare igualmente uma testemunha contendo o conjunto
dos constituintes da mistura reactiva, com excepo do factor
VII.
Apresentao esquemtica da aferio do factor VII
Todas as diluies so preparadas em tubos de plstico e
da coagulao humana
utilizadas no espao de 1 hora.
2. Mtodos
Analticos
As 2 etapas utilizam reagentes disponveis no mercado Etapa 1. A cada uma das diluies, obtidas a partir da
originrios de diversos fornecedores. Embora a composio preparao de referncia e da amostra, junte um volume
destes reagentes possa variar ligeiramente, as suas apropriado do reagente de coagulao pr-aquecido (ou de
caractersticas essenciais so descritas nas especificaes que uma mistura dos seus constituintes separados), misture
se seguem. e incube a 37C em tubos de plstico ou cpulas de uma
microplaca. A concentrao dos diferentes constituintes
Reagentes durante a formao do factor Xa tal como a especificada em
Reagentes.
A mistura reactiva de factores de coagulao contm
especialmente protenas purificadas de origem humana Deixe desenvolver a reaco de activao do factor X durante
ou bovina especificamente o factor X, a tromboplastina e um tempo apropriado; a paragem da reaco acontece de
o factor tecidular fosfolipdico e um activador do factor VII. preferncia antes que a concentrao em factor Xa tenha
Estas protenas so parcialmente purificadas e no contm atingido o seu nvel mximo, a fim de que a curva dose-
impurezas susceptveis de interferir na activao do factor VII -resposta apresente uma linearidade satisfatria. O tempo de
ou do factor X. O factor X est presente em quantidade tal que reaco igualmente escolhido de modo a que a condio
a sua concentrao final, fora da etapa de activao, seja de de linearidade da curva de produo do factor Xa em funo
10-350 nmol/l, de preferncia de 14-70 nmol/l. A do tempo seja satisfatria. geralmente da ordem de 2 min
tromboplastina utilizada, que pode ser de origem natural a 5 min, mas so admisveis certas variaes se permitirem
(crebro de boi ou coelho) ou sinttica, deve convir para a melhorar a linearidade da curva dose-resposta.
determinao do tempo de Quick. diluda de 5 a 50 vezes
numa soluo tampo de maneira que a concentrao final Etapa 2. Pare a reaco de activao por adio da mistura
de Ca2+ seja de 15-25 nmol/l. A etapa final de formao do reactiva contendo o substrato cromognico. A velocidade
factor Xa conduzida numa soluo contendo albumina de lise do substrato, que proporcional concentrao
humana ou bovina a uma concentrao em que no ocorram do factor Xa determinada por medio com o auxlio de
perdas por adsoro e convenientemente tamponada para um espectrofotmetro, da variao da absorvncia num
pH compreendido entre 7,3 e 8,0. O factor VII deve ser o comprimento de onda apropriado. Pode determinar-se a
nico factor que limita a formao do factor Xa na mistura de absorvncia quer em leitura contnua, o que permite calcular
incubao final e nenhum dos constituintes reactivos da mistura a velocidade inicial de lise do substrato, quer interrompendo
tem o poder de induzir por si s a formao do factor Xa. a reaco de hidrlise ao fim de um tempo apropriado,
A segunda etapa consiste na quantificao do factor Xa baixando o pH com um reagente apropriado tal como o cido
formado na etapa anterior, por meio de um substrato actico a 500 g/l de C2H4O2 ou uma soluo tampo citratada
cromognico especfico do factor Xa. Este substrato de pH 3 (1 mol/l). Ajuste o tempo de hidrlise de modo a
geralmente um peptido curto derivado de 3 a 5 cidos que a condio de linearidade de formao do cromforo em
aminados ligados a um agrupamento cromforo. A ciso funo do tempo seja satisfatria. Este tempo geralmente da
deste agrupamento e do substrato peptdico promove ordem dos 3 min a 15 min, mas so toleradas certas variaes
um deslocamento da actividade cromofrica para um se permitirem melhorar a linearidade da curva dose-resposta.
comprimento de onda que permite a sua quantificao por Verifique a validade da aferio e calcule a actividade da
espectrofotometria. O substrato geralmente dissolvido em amostra pelos mtodos estatsticos habituais (por exemplo,
gua R e utilizado numa concentrao final de 0,2-2 nmol/l. 5.3. Anlise estatstica dos resultados das aferies e ensaios
Pode igualmente compreender inibidores apropriados biolgicos).
impedindo o prosseguir da formao do factor Xa (adio de
edetato).
2.7.11. AFERIO DO FACTOR IX
Tcnica
DA COAGULAO HUMANA
Reconstitua o contedo de uma ampola da preparao de
referncia e da amostra juntando a quantidade de gua R O princpio desta aferio baseia-se na medio da capacidade
pretendida e uma vez reconstitudas utilize-as no espao de de uma preparao do factor IX em reduzir o tempo de
uma hora. Junte s preparaes reconstitudas a quantidade coagulao prolongado de um plasma deficiente em factor IX.
de pr-diluente necessria para obter solues a 0,5-2,0 U.I. A reaco acelerada por adio de um reagente contendo
de factor VII por mililitro. fosfolpidos e um activador de contacto, como o caulino,
Prepare as diluies seguintes da preparao de referncia e a slica ou o cido elgico. A actividade avaliada por
da amostra com uma soluo tampo isotnica sem agente comparao da curva dose-resposta obtida com a preparao
quelante, contendo 1 por cento de albumina humana ou problema com a obtida com uma preparao de referncia
bovina, e de preferncia tamponada para pH 7,3 8,0. aferida em Unidades Internacionais.
Prepare para cada uma das duas preparaes, pelo menos, A Unidade Internacional da actividade do factor IX
3 diluies separadas e independentes, de preferncia em corresponde actividade de uma dada quantidade do padro
duplicado. A concentrao destas diluies em factor VII internacional, que constitudo por um concentrado
ajustada de modo a que a concentrao final seja inferior a liofilizado do factor IX da coagulao humana. A equivalncia
0,005 U.I./ml. em Unidades Internacionais do padro internacional

2.7.13. Aferio da imunoglobulina humana anti-D
indicada pela Organizao Mundial de Sade. soluo que contenha 0,1 U.l. de heparina por mililitro.
O concentrado do factor IX da coagulao humana PBR As condies descritas so aplicveis s placas de
aferido em Unidades Internacionais por comparao ao microtitulao. Se o ensaio for realizado em tubos, ajuste os
padro internacional. volumes de modo a manter as propores na mistura.
Reconstitua, separadamente, a preparao problema e a Pouco tempo antes do ensaio, coloque todas as solues a
preparao de referncia segundo as indicaes que figuram 37C em banho de gua.
2. Mtodos
Analticos
no rtulo e utilize-as imediatamente. Se a preparao
problema contm heparina, determine a quantidade (2.7.12) Distribua numa srie de poos 20 l de plasma humano
e neutralize-a, por exemplo, juntando sulfato de protamina normal e 20 l de soluo de antitrombina III R1. Junte aos
R (10 g de sulfato de protamina neutraliza poos uma srie de volumes (20 l, 60 l, 100 l e 140 l)
1 U.I de heparina). Dilua previamente a preparao da soluo problema ou da soluo de referncia e complete
problema e a preparao de referncia com plasma o volume de cada poo com 200 l utilizando o tampo de
deficiente em factor IX (por exemplo, substrato de plasma diluio (0,02-0,08 U.I. de heparina por mililitro na mistura
R2) de modo a obter solues a 0,5-2,0 U.I./ml. Prepare, reactiva final).
com uma soluo tampo apropriada (por exemplo, Mtodo do ponto de equivalncia. Transfira 40 l de cada
soluo tampo de imidazol de pH 7,3 R) contendo 10 g/l poo para uma segunda srie de poos, junte 20 l da soluo
de albumina bovina ou humana, no mnimo, 3 sries de do factor Xa bovino R e incube a 37C durante 30 s. Junte
diluies apropriadas para cada material, de preferncia 40 l de soluo do substrato cromognico do factor Xa a
em duplicado. Estas diluies devem ser utilizadas 1 mmol/l e incube a 37C, durante 3 min. Pare a reaco
imediatamente. Utilize um aparelho adaptado medio
diminuindo o pH com um reagente apropriado tal como
dos tempos de coagulao ou efectue a aferio com tubos
uma soluo a 20 por cento V/V de cido actico glacial R e
de incubao, mantidos em banho-maria a 37C. Em cada
mea a absorvncia a 405 nm (2.2.25). O tempo de reaco
tubo, introduza 0,1 ml de plasma deficiente em factor IX
geralmente da ordem de 3 min a 15 min mas so toleradas
(por exemplo, substrato de plasma R2) e 0,1 ml de uma
certas variaes se elas permitirem melhorar a linearidade da
das diluies da preparao de referncia ou da preparao
problema. Junte a cada tubo 0,1 ml de um reagente APTT curva dose/resposta.
apropriado (tempo de tromboplastina parcial activado), Mtodo cintico. Transfira 40 l de cada poo para uma
contendo fosfolpidos e um activador de contacto, incube segunda srie de poos, junte 20 l da soluo bovina R do
a 37C durante um perodo recomendado. Junte a cada factor Xa e incube a 37C durante 30 s. Junte 40 l da soluo
tubo 0,1 ml de uma soluo de cloreto da clcio R a 3,7 g/l do substrato cromognico do factor Xa a 2 mmol/l, incube
previamente aquecida a 37C. Com um cronmetro, mea a 37C e determine a velocidade de clivagem do substrato
o tempo de coagulao, ou seja, o intervalo de tempo que procedendo leitura contnua da variao de absorvncia
separa a adio do cloreto de clcio do primeiro sinal de a 405 nm (2.2.25) permitindo, assim, calcular a velocidade
formao de fibrina. Os volumes indicados mais altos podem inicial de clivagem do substrato. Esta velocidade deve ser
ser adaptados em funo do reagente APTT e do aparelho proporcional concentrao residual do factor Xa. Verifique
utilizado. Calcule a actividade pelos mtodos estatsticos a validade do ensaio e calcule a actividade da heparina da
habituais (por exemplo, captulo 5.3). amostra pelos mtodos estatsticos habituais para um modelo
relao/declive (por exemplo, 5.3. Anlise estatstica dos
resultados dos ensaios e testes biolgicos).
2.7.12. AFERIO DA HEPARINA
NOS FACTORES DE COAGULAO
2.7.13. AFERIO DA
A heparina aferida sob a forma dum complexo IMUNOGLOBULINA HUMANA ANTI-D
antitrombina III (AT) via inibio da actividade do factor Xa
da coagulao. Na mistura reactiva mantido um excesso de MTODO A
AT para garantir uma concentrao constante do complexo
heparina-AT. O factor Xa neutralizado pelo complexo A actividade da imunoglobulina humana anti-D avaliada
heparina-AT e o factor Xa residual hidrolisa um substrato por comparao da quantidade necessria para produzir a
cromognico peptdico especfico libertando um cromforo. aglutinao de eritrcitos D-positivos com a quantidade
A quantidade do cromforo inversamente proporcional de uma preparao de referncia, aferida em Unidades
actividade da heparina. Internacionais, necessria para produzir o mesmo efeito.
Substrato cromognico para o factor Xa. Substrato A Unidade Internacional corresponde actividade de uma
cromognico especfico do factor Xa tal como: o cloridrato de determinada quantidade da preparao internacional de
N-benzoil-l-isoleucil-l-glutamil-glicil-l-arginina-4- referncia. A correspondncia entre a Unidade Internacional
-nitroanilida. Reconstitua de acordo com as instrues do e a preparao de referncia indicada pela Organizao
fabricante. Mundial de Sade.
Tampo de diluio. Soluo de tris(hidroximetil)- A imunoglobulina humana anti-D PBR aferida em Unidades
aminometano R a 6,05 g/l. Se necessrio, ajuste para pH 8,4 Internacionais por comparaao ao padro internacional e
com cido clordrico R. destinada a ser utilizada na aferio da imunoglobulina
Soluo problema. Dilua a amostra com o tampo de diluio humana anti-D.
de modo a obter uma soluo que supostamente contenha Utilize uma mistura de eritrcitos D-positivos, retirados, no
0,1 U.I. de heparina por mililitro. maximo, 7 dias e conservados nas condies apropriadas,
Soluo de referncia. Dilua a preparao de referncia da obtida a partir, no mnimo, de 4 dadores do grupo OR1R1. A
heparina com o tampo de diluio de modo a obter uma um volume apropriado de eritrcitos, lavados previamente

3 vezes com uma soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l, A correspondncia entre a Unidade Internacional e a
junte um volume igual da soluo de bromelanas R, deixe preparao internacional de referncia indicada pela
em repouso a 37C durante 10 min, centrifugue, elimine o Organizao Mundial de Sade.
lquido sobrenadante e lave os eritrcitos 3 vezes com uma A imunoglobulina humana anti-D PBR aferida em Unidades
soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l. Mantenha em suspenso Internacionais por comparao ao padro internacional e
20 volumes destes eritrcitos numa mistura de 15 volumes destinada a ser utilizada na aferio da imunoglobulina
de soro inerte, de 20 volumes de uma soluo de albumina
2. Mtodos
Analticos
humana anti-D.
bovina R a 300 g/l e de 45 volumes de cloreto sdio R a 9 g/l.
Coloque a suspenso em gua com gelo em agitao
MATERIAL
contnua.
Com ajuda de um aparelho automtico de diluio calibrado, Os reagentes no especificados so de qualidade analtica.
prepare as diluies da amostra e da preparao de referncia
PBS (Soluo salina de fosfato tamponada). Dissolva 8,0 g de
numa soluo contendo 5 g/l de albumina bovina R e 9 g/l de
cloreto de sdio R, 0,76 g de fosfato dissdico anidro R, 0,2 g
cloreto de sdio R. de cloreto de potssio R, 0,2 g de fosfato monopotssico R
Utilize um aparelho apropriado anlise automtica e 0,2 g de azida de sdio R em gua R e complete a 1000 ml
contnua. Geralmente, o protocolo seguinte apropriado: com o mesmo solvente.
mantenha a temperatura a 15,0C nas tubuladuras com TBS (Soluo tampo tris(hidroximetilaminometano).
excepo das espirais de incubao. Com auxlio da bomba, Dissolva 8,0 g de cloreto de sdio R e 0,6 g de
introduza nas tubuladuras de admisso do aparelho a tris(hidroximetilaminometano R) em gua R. Ajuste o pH
suspenso de eritrcitos com dbito de 0,1 ml/min e uma para 7,2 (2.2.3) com o cido clordrico 1 M e complete at
soluo de metiIcelulose 450 R a 3 g/l a um dbito de 1000 ml com o mesmo solvente.
0,05 ml/min. Introduza as diluies da amostra e da
preparao de referncia a um dbito de 0,1 ml/min durante Soluo de papana. Introduza 1 g de papana R em 10 ml
2 min, depois o diluente a um de 0,1 ml/min durante 4 min da soluo tampo de fosfato de pH 5,4 (0,067 M) R e agite
temperatura de 37C durante 30 min, centrifugue a 10 000 g
antes de introduzir a diluio seguinte.
durante 5 min, em seguida filtre numa membrana com um
Introduza ar a um dbito de 0,6 ml/min. Incube a 37C dimetro de porosidade de 0,22 m. Para activar, misture
durante 18 min e depois disperse as espirais por introduo, 1 ml de filtrado, 1 ml de uma soluo de L-cistena R a
a um dbito de 1,6 ml/min, de uma soluo de cloreto de 48,44 g/l e 1 ml de uma soluo de edetato de sdio R a
sdio R a 9 g/l contendo um agente molhante apropriado (por 3,72 g/l, em seguida complete a 10 ml com a soluo tampo
exemplo, polissorbato 20 R a uma concentrao final de de fosfato de pH 5,4 (0,067 M). Congele a soluo em volumes
0,2 g/l) a fim de evitar romper a continuidade das bolhas. unitrios a uma temperatura inferior ou igual a -20C.
Deixe depositar os aglutinados e separe 2 vezes, a primeira Eritrcitos. Utilize uma mistura de eritrcitos D-positivos
vez a 0,4 ml/min e a segunda vez a 0,6 ml/min. Proceda lise obtidos a partir, no mnimo, de 3 dadores do grupo OR2R2.
dos eritrcitos no aglutinados com a ajuda de uma soluo a Lave as clulas 4 vezes com PBS. Centrifugue as clulas a
5 g/l de octoxinol 10 R, 0,2 g/l de ferricianeto de potssio R, 1800 g durante 5 min, misture um volume apropriado do
1 g/l de bicarbonato de sdio R e de 0,05 g/l de cianeto cogulo celular pr-aquecido com um volume apropriado da
de potssio R, a um dbito de 2,5 ml/min. Introduza uma soluo de papana pr-aquecida (considera-se apropriado 2
serpentina de retardamento de 10 min para permitir a volumes para 1 volume), em seguida incube a 37C durante
transformao da hemoglobina. Registe de modo contnuo 10 min. Lave as clulas 4 vezes com PBS. Conserve a 4C
a absorvncia (2.2.25) do hemolisado a um comprimento num estabilizante apropriado, no mximo, durante 1 semana.
de onda entre 540 nm e 550 nm. Determine o intervalo das Brad-5 biotinilado. Siga as instrues de utilizao.
concentraes em anticorpos na qual existe uma relao
linearentre a concentrao e a variao da absorvncia (A). Reagente avidina/estreptavidina conjugada fosfatase
A partir dos resultados, construa uma curva de calibrao e alcalina. De preferncia modificado de modo a combinar uma
utilize a parte linear da curva para determinar a actividade da actividade especifica elevada com uma ligao no especfica
amostra. fraca. Siga as instrues de utilizao.
Calcule a actividade da amostra pelos mtodos estatsticos Soluo do substrato. Utilize o fosfato de para-nitrofenil
habituais. seguindo as instrues de utilizao.
Tampo de fixao celular. Dissolva 18,02 g de glucose R,
MTODO B 4,09 g de cloreto de sdio R, 1,24 g de cido brico R, 10,29 g
de citrato de sdio R e 0,74 g de edetato de sdio R em gua
A actividade da imunoglobulina anti-D avaliada por R. Ajuste o pH para 7,2-7,3 (2.2.3) com o hidrxido de sdio
imunoadsoro competitiva com enzima conjugada em 1 M ou o cido cloridrico 1 M e complete a 1000 ml com gua
placas de microtitulao revestidas por eritrcitos. O mtodo R. Conserve a 4C e utilize imediatamente.
baseado numa competio na fixao, entre uma preparao Soluo de glutaraldedo. Imediatamente antes do uso,
da imunoglobulina anti-D policlonal e um anticorpo anti-D adicione a 24 ml de PBS frio, 90 l de uma soluo de
monoclonal biotinilado dirigido contra um epitope especifico glutaraldedo R a 250 g/l.
do antignio O. A actividade da amostra comparada
de uma preparao testemunha aferida em Unidades Placas de microtitulao. As placas so de polistireno com
Internacionais. poos de fundo plano e devem ser revestidas de eritrcitos,
com propriedades de superfcie optimizadas para o
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma imunodoseamento enzimtico e com uma capacidade elevada
dada quantidade da preparao internacional de referncia. de fixao das protenas. As placas utilizadas para preparar as

diluies da imunoglobulina so placas de polistireno ou de A actividade da imunoglobulina anti-D avaliada por

policloreto de vinilo com poos de fundo em U ou em V. citometria de fluxo em placas de microtitulao. O mtodo
baseado na ligao especifica da imunoglobulina anti-D e dos
MTODO eritrcitos D-positivos. A actividade da amostra comparada
de uma preparao testemunha aferida em Unidades
Prepare uma suspenso a 0,1 por cento (V,V) de eritrcitos Internacionais.
2. Mtodos
tratados pela papana na soluo tampo de fixao celular A Unidade Internacional corresponde actividade de uma
Analticos
fria. Introduza com a pipeta 50 l em cada um dos poos da dada quantidade da preparao internacional de referncia.
placa de microtitulao de fundo plano. A correspondncia entre a Unidade Internacional e a
Centrifugue a placa a 350 g durante 3 min, de preferncia a preparao de referncia indicada pela Organizao Mundial
4C. Sem retirar o sobrenadante, adicione com cuidado 100 l de Sade.
da soluo de glutaraldedo em cada poo e deixe repousar A imunoglobulina humana anti-D PBR aferida em Unidades
durante 10 min. Internacionais por comparao ao padro internacional e
Esvazie os poos invertendo a placa rapidamente e lave destinada a ser utilizada na aferio da imunoglobulina
3 vezes com 250-300 l de PBS. Pode ser efectuado humana anti-D.
manualmente ou utilizando um lavador de placas automtico
apropriado. Efectue a aferio como descrito a seguir, ou MATERIAL
conserve a placa a 4C aps ter eliminado o PBS, junte 100 l
de tampo de fixao celular por poo e sele os poos Os reagentes no especficos so de qualidade analtica.
por meio de um filme de plstico. As placas podem ser
PBS. Dissolva 8,0 g de cloreto de sdio R, 0,76 g de fosfato
conservadas a 4C, no mximo, durante 1 ms.
dissdico R, 0,2 g de cloreto de potssio R e 0,2 g de fosfato
Solues problema. Para as preparaes liofilizadas, monopotssico R em gua R e complete a 1000 ml com o
reconstitua, a preparao como indicado no rtulo. Prepare 4 mesmo solvente.
sries independentes de 5 diluies em duplicado, comeando
Soluo PBS-BSA. PBS contendo 10,0 g/l de albumina
com 30 U.I./ml em PBS contendo 10 g/l de albumina bovina
bovina R.
R. Se necessrio, ajuste a diluio inicial para obter respostas
situadas na parte linear da curva dose-resposta. Eritrcitos. Utilize eritrcitos D-positivos obtidos a partir
de um dador nico OR1R1 e retire, no mximo, 2 semanas
Solues testemunha. Reconstitua a preparao de referncia
antes. Conserve-as se necessrio a 4C num estabilizante
de acordo com as instrues. Prepare 4 sries independentes
apropriado. Lave as clulas, no mnimo, 2 vezes com a
de 5 diluies em duplicado comeando com 30 U.I./ml em
soluo PBS-BSA e prepare uma suspenso contendo 1 104
PBS contendo 10 g/l de albumina bovina R.
clulas por microlitro na soluo PBS-BSA.
Nos poos das placas de microtitulao de fundo em U ou em V,
Utilize eritrcitos D-negativos obtidos de um dador nico Orr
junte 35 l de cada diluio da amostra ou da soluo testemunha
e preparados da mesma maneira.
em cada poo de uma srie. Em cada poo, adicionar 35 l de uma
soluo de Brad-5 biotinilado a 250 ng/l. Anticorpos secundrios. Utilize um fragmento de anticorpos
anti-IgG humanos ou parte deles. Conserve e utilize de
Esvazie os poos da placa revestida por eritrcitos invertendo
acordo com as instrues do fabricante.
e depositando sobre papel absorvente, em seguida deposite
nos poos 50 pI de cada diluio da amostra ou da soluo Placas de microtitulao. Utilize placas de poos de fundo
testemunha contendo Brad-5biotinilado. Utilize 50 l de PBS plano que no foram objecto de um tratamento de superfcie
contendo 10 g/l de albumina bovina R como testemunha pelas imunoaferies enzimticas.
negativa. Sele a placa por meio de um filme plstico e incube
temperatura ambiente durante 1 h. MTODO
Esvazie o lquido dos poos da placa revestida de eritrcitos e
lave 3 vezes com 250-350 l de TBS. Solues problema. Para as preparaes liofilizadas,
reconstitua a preparao como indicado no rtulo. Prepare
Dilua o reagente avidina/estreptavidina conjugada fosfatase imediatamente, no mnimo, 3 exemplares, no mnimo, de 3
alcalina em TBS contendo 10 g/l de albumina bovina R sries de diluies razo de 1,5 ou 2 por arrastamento com
e junte 50 l em cada poo. Incube durante 30 min uma concentrao num intervalo entre 1,2-0,15 U.I./ml e
temperatura ambiente. utilizando a soluo PBS-BSA como diluente. Se necessrio,
Esvazie o lquido dos poos da placa revestida por eritrcitos ajuste a diluio de partida para obter respostas situadas na
e lave 3 vezes com 250-350 l de TBS. parte linear da curva dose-resposta.
Adicione 100 l da soluo de substrato em cada poo, incube Solues testemunha. Reconstitua a preparao de referncia
temperatura ambiente e no escuro durante 10 min. Pare a de acordo com as instrues. Prepare imediatamente, no
reaco, juntando 50 l de hidrxido de sdio 3 M em cada mnimo, 3 exemplares, no mnimo, de 3 diluies razo
poo. de 1,5 ou 2 por arrastamento com uma concentrao num
intervalo entre 1,2-0,15 U.l./ml utilizando a soluo PBS-BSA
Mea as absorvncias em 405 nm e subtraia o valor lido como diluente. Se necessrio, ajuste a diluio de partida para
pela testemunha negativa. Utilize os valores da absorvncia obter respostas situadas na parte linear da curva dose-resposta.
situados na parte linear da curva da aferio a fim de estimar
a actividade da amostra pelos mtodos estatsticos habituais. Deposite 50 l de eritrcitos D-positivos em cada poo de
uma placa de microtitulao. Junte 50 l de cada uma das
diluies da amostra ou da soluo testemunha em cada poo
MTODO C de cada uma das sries. Utilize 50 l da soluo PBS-BSA

2.7.15. Aferio da actividade da vacina contra a hepatite B (ADNr)
como testemunha negativa. Deposite 50 l de eritrcitos diluio atribuda ao seu grupo. Injecte por via subcutnea
D-negativos em 4 poos da mesma placa de microtitulao e o mesmo volume de diluente a um grupo de testemunhas
junte 50 l da diluio mais fraca da amostra. Para controlar no vacinadas. Aps 28 a 32 dias, anestesie e sangre os
as reaces parasitas, deposite 50 l de eritrcitos D-positivos animais e recolha os soros separadamente. Efectue em cada
em 4 poos da mesma placa de microtitulao e adicione soro por um mtodo imunoqumico apropriado (2.7.1),
50 l da soluo PBS-BSA. Sele por meio de um filme de um doseamento de anticorpos especficos contra o vrus de
plstico e incube a 37C durante 40 min. hepatite A.
2. Mtodos
Analticos
Centrifugue as placas a 50 g durante 3 min, elimine o

Clculos. Efectue os clculos pelos mtodos estatsticos
sobrenadante e lave as clulas com 200-250 l de soluo
habituais para as aferies baseadas numa resposta
PBS-BSA. Repita, no mnimo, uma vez a operao.
qualitativa (5.3).
A partir da distribuio dos nveis de reaco medidos em
sobrenadante e adicione 50 l de anticorpos secundrios
todos os soros do grupo de animais no vacinados, determine
diludos a uma concentrao em protena apropriada na
o nvel mximo de reaco que se possa esperar num animal
soluo PBS-BSA. Sele por meio de um filme de plstico e
no vacinado para a aferio em questo. Qualquer resposta
incube durante 20 min, ao abrigo da luz e temperatura
superior a esse limite num animal vacinado constitui por
ambiente.
definio uma seroconverso.
Efectue uma transformao apropriada (por exemplo,
sobrenadante e lave as clulas com 250-350 l da soluo
probabilidade interactiva) da percentagem de animais de cada
PBS-BSA. Repita, no mnimo, uma vez a operao.
grupo que apresente uma seroconverso e analise os dados
Centrifugue as placas a 50 g durante 3 min, elimine o da curva log dose-resposta segundo um modelo de linhas
sobrenadante e lave as clulas com 200-250 l de PBS. paralelas. Determine a actividade relativa da amostra por
Transfira a suspenso celular para um tubo adaptado ao comparao com a da preparao de referncia.
equipamento de citometria de fluxo disponvel e dilua
Condies de validade. O ensaio s vlido se:
adicionando PBS para permitir um dbito apropriado.
para a amostra e preparao de referncia, a DE50 se situar
Proceda imediatamente medio da intensidade mdia de
entre a menor e a maior dose administrada aos animais,
fluorescncia num citmetro de fluxo. Registe, no mnimo,
10 medies sem janela mas excluindo os restos. a anlise estatstica no revelar nenhum desvio
significativo da linearidade ou do paralelismo,
Utilize a intensidade mdia de fluorescncia situada na parte
linear da curva dose-resposta para estimar a actividade da os limites de confiana da actividade relativa se situarem
amostra pelos mtodos estatsticos habituais. entre 33 por cento e 300 por cento da actividade estimada.
Actividade exigida. O limite de confiana superior (P = 0,95)
da actividade relativa estimada no inferior a 1,0.
DA VACINA CONTRA A HEPATITE A
ENSAIO IN VITRO
A titulao da actividade da vacina contra a hepatite A
efectuada quer in vivo, comparando a sua capacidade Efectue uma determinao imunoqumica (2.7.1) do teor
em estimular em determinadas condies a formao em antignio, com critrios validados satisfatrios por
de anticorpos especficos nos murganhos, com a mesma comparao com o ensaio in vivo.
capacidade de uma preparao de referncia, quer in vitro, Os critrios de aceitabilidade para uma dada preparao
pela determinao do teor em antignio por um mtodo de referncia so aprovados pela Autoridade competente
imunoqumico. atendendo aos resultados dos ensaios de validao.
ENSAIO IN VIVO
2.7.15. AFERIO DA ACTIVIDADE DA
O ensaio nos murganhos abaixo descrito dado a ttulo de VACINA CONTRA A HEPATITE B (ADNr)
exemplo do mtodo que considerado satisfatrio para uma
dada vacina. Podem ser utilizados outros mtodos validados. A aferio da actividade da vacina contra a hepatite B (ADNr)
efectuada quer in vivo, comparando a sua capacidade
Escolha e distribuio dos animais de experincia. Utilize em estimular em determinadas condies a formao de
murganhos saudveis provenientes da mesma criao com anticorpos anti-HBsAg especficos no murganho ou no cobaio
cerca de 5 semanas de idade, de uma estirpe reconhecida com a mesma capacidade de uma preparao de referncia,
como apropriada. Os animais so do mesmo sexo. Distribua quer in vitro, pela determinao do teor em antignio por
os animais pelo menos em 7 grupos iguais com um nmero um mtodo imunoqumico.
igualmente apropriado s exigncias do ensaio.
Determinao do actividade da amostra. Prepare, pelo ENSAIO IN VIVO

menos, 3 diluies da amostra com uma soluo de cloreto
de sdio R a 9 g/l contendo o adjuvante base de alumnio Escolha a distribuio dos animais de experincia. Utilize
utilizado na vacina. Prepare do mesmo modo diluies murganhos saudveis provenientes da mesma criao,
equivalentes preparao de referncia. Atribua uma com cerca de 5 semanas de idade. A estirpe de murganhos
diferente diluio a cada grupo de murganhos e injecte, escolhida deve dar uma inclinao significativa na curva
por via subcutnea, no mximo, 1,0 ml a cada animal, da dose-resposta ao antignio (so apropriados os murganhos

2.7.16. Aferio da actividade da vacina acelular contra a tosse convulsa
com o haplotipo H-2q ou H-2d) So igualmente apropriados actividade da amostra in vitro.

cobaios saudveis pesando entre 300 g a 350 g (com cerca
Os critrios de aceitabilidade para uma dada preparao
de sete semanas de idade) provenientes da mesma criao.
de referncia so aprovados pela Autoridade competente
Os animais devem ser do mesmo sexo. Distribua os animais,
atendendo aos resultados dos ensaios de validao.
pelo menos, em 7 grupos iguais com um nmero igualmente
apropriado s exigncias do ensaio.
2. Mtodos
Analticos
Determinao do actividade da amostra. Prepare, pelo
menos 3 diluies da amostra com uma soluo de DA VACINA ACELULAR CONTRA A
cloreto de sdio R a 9 g/l, contendo um adjuvante base TOSSE CONVULSA
de alumnio utilizado na vacina ou com outro diluente
apropriado. Prepare, do mesmo modo, pelo menos, 3 A capacidade da amostra em estimular a formao de
diluies da preparao de referncia. Atribua uma diluio anticorpos especficos comparada com a mesma capacidade
diferente a cada grupo de animais e injecte, por via da preparao de referncia examinada em paralelo. O ttulo
intraperitoneal, no mximo 1,0 ml a cada animal da diluio em anticorpos determinado por um mtodo imunoqumico
atribuda ao seu grupo. Injecte por via intraperitoneal apropriado (2.7.1), por exemplo, imunoadsoro com enzima
o mesmo volume de diluente a um grupo de animais conjugada (ELISA). O ensaio no murganho abaixo descrito,
no vacinados. Aps um perodo, por exemplo, de 4 a 6 utiliza um modelo de 3 pontos. Aps validao, para os
semanas, anestesie e sangre os animais e recolha os soros ensaios de rotina pode ser utilizada apenas uma diluio.
separadamente. Efectue com cada soro, por um mtodo
imunoqumico apropriado (2.7.1), um doseamento de Vacina de referncia. utilizada como vacina de referncia,
anticorpos especficos contra o HBsAg. um lote de vacina ou um outro lote representativo em que
a eficcia tenha sido demonstrada aquando dos ensaios
Clculo. Efectue os clculos pelos mtodos estatsticos clnicos. Um lote representativo deve ser preparado por
habituais para as aferies baseadas numa resposta um mtodo rigorosamente idntico ao utilizado para o lote
qualitativa (5.3). submetido aos ensaios clnicos. A estabilidade da vacina de
referncia deve ser atestada por documentos.
A partir da distribuio dos nveis de reaco medidos em
todos os soros do grupo de animais no vacinados, determine Soro de referncia. O soro de murganho de Bordetella
o nvel mximo de reaco que se possa esperar num animal pertussis PBR apropriado como soro de referncia.
no vacinado para a aferio em questo. Qualquer resposta Exigncia de actividade. A capacidade da amostra em
superior a esse limite num animal vacinado constitui por estimular a formao de anticorpos no significativamente
definio uma seroconverso. inferior (P = 0,95) da vacina de referncia.
Efectue uma determinao apropriada (por exemplo O ensaio descrito a seguir dado a ttulo de exemplo de um
probabilidade interactiva) da percentagem de animais de cada mtodo que considerado satisfatrio.
grupo que apresenta uma seroconverso e analise os dados da
curva de log dose-resposta aplicando um modelo em linhas Escolha dos animais e distribuio em grupos. Utilize
paralelas. Determine a actividade relativa da amostra por murganhos saudveis (por exemplo, da estirpe CD1)
comparao com a da preparao de referncia. provenientes da mesma criao e idade de cerca de 5
semanas. Reparta os animais em 6 grupos, com um nmero
Condies de validade. O ensaio s vlido se: apropriado s exigncias do ensaio. Utilize 3 diluies da
para a amostra e preparao de referncia, a DE50 se situar amostra e 3 diluies da vacina de referncia, atribuindo uma
entre a menor e a maior dose administrada aos animais, diluio diferente a cada grupo de animais. Injecte em cada
murganho, por via intraperitoneal ou subcutnea, 0,5 ml da
a anlise estatstica no revelar nenhum desvio diluio atribuda ao seu grupo.
Colheita de amostras de soro. 4 a 5 semanas aps
os limites de confiana da actividade relativa se situarem a vacinao, anestesie os murganhos e sangre-os
entre 33 por cento e 300 por cento da actividade estimada. separadamente. Conserve o soro a -20C at ao momento da
Actividade exigida. O limite de confiana superior (P = 0,95) determinao do ttulo em anticorpos.
da actividade relativa calculada no inferior a 1,0. Determinao do ttulo em anticorpos. Determine
separadamente o ttulo em anticorpos especficos de cada
soro por um mtodo validado como, por exemplo, ELISA,
ENSAIO IN VITRO
como descrito a seguir.
Efectue uma determinao imunoqumica (2.7.1) do teor ELISA. Utilize microplacas (de cloreto de polivinilo) ou
em antignio com critrios validados satisfatrios por polistireno, como apropriado para o antignio especfico)
comparaes in vivo. So considerados satisfatrios os com o antignio purificado, a uma concentrao de 100 ng
doseamentos por imounoadsoro da enzima conjugada por poo. Aps lavagem, bloqueie as ligaes livres
(ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA) que utilizem incubando com uma soluo de albumina srica bovina e
anticorpos monoclonais especficos aos epitopes do HBsAg lave novamente. Prepare directamente nas placas diluies
que produzem um efeito protector. O ensaio feito com um do soro diludo a 2 vezes dos murganhos vacinados com a
nmero apropriado de diluies da amostra e da preparao amostra ou com a vacina de referncia. Incube a 22-25C
de referncia, se necessrio aps transformao apropriada durante 1 h, em seguida lave. Junte em cada poo uma
os dados so analisados segundo um modelo em linhas soluo apropriada de anti Ig G de murganho conjugada a
paralelas. Para a determinao in vitro do HBsAg esto uma enzima e incube a 22-25C durante 1 h. Lave novamente
disponveis Kits e podem ser adaptados determinao da e junte um substrato cromognico a partir da qual a enzima

2.7.18. Aferio do factor II da coagulao humana
conjugada liberta um cromforo que pode ser quantificado proporcional da actividade da antitrombina III humana.
por medio da absorvncia (2.2.25). As condies do ensaio
Verifique a validade do ensaio e calcule a actividade da
so escolhidas de modo a obter uma resposta linear para a
amostra pelos mtodos estatsticos habituais (por exemplo,
absorvncia em funo do teor em anticorpos na gama de
absorvncia utilizada e os valores da absorvncia situam-se 5.3. Anlise estatstica dos resultados dos ensaios e testes
entre 0,1 e 2,0. biolgicos).
2. Mtodos
Analticos
Um soro de referncia tendo uma actividade nominal

conhecida utilizado como base de clculo do ttulo em 2.7.18. AFERIO DO FACTOR II
anticorpos dos soros a testar. Um soro testemunha padro
igualmente utilizado. DA COAGULAO HUMANA
O ensaio s vlido se: A aferio do factor II da coagulao humana efectua-se
o valor obtido para o soro testemunha diferir do valor aps activao especfica em factor II a, que calculado
nominal mais de 2 vezes do desvio padro, por comparao da sua actividade em activar um substrato
cromognico peptdico especfico com a mesma actividade
o intervalo de confiana (P = 0,95) da actividade estimada do padro internacional ou de uma preparao de referncia
se situar entre 50 por cento e 200 por cento. aferida em Unidades Internacionais (U.I.)
Clculo. Calcule o ttulo em anticorpos dos soros dos A Unidade Internacional do factor II corresponde actividade
murganhos vacinados com a amostra e com a vacina de de uma dada quantidade do padro internacional, que
referncia. A partir dos valores obtidos, calcule a actividade
constitudo por um concentrado liofilizado de factor II da
da amostra em relao vacina de referncia, pelos mtodos
coagulao humana. A correspondncia entre a Unidade
estatsticos habituais (5.3).
Internacional e o padro internacional indicada pela
2.7.17. AFERIO DA ANTITROMBINA O mtodo de aferio cromognica inclui 2 etapas;

activao do factor II por aco do veneno de cobra,
III HUMANA seguida de clivagem enzimtica de um substrato
cromognio pelo factor IIa que liberta um cromofro
O teor em antitrombina III da amostra avaliado quantificvel por espectrofotometria. Em condies de
comparando a sua capacidade em inactivar a trombina aferio apropriadas, existe uma relao linear entre
em presena de um excesso de heparina com a capacidade a actividade do factor IIa e a clivagem do substracto
de uma preparao de referncia de concentrado de cromognico.
antitrombina III humana aferida em Unidades Internacionais.
Quantidades variveis da amostra so misturados a uma
quantidade fixa de trombina e a actividade trombnica REAGENTES
residual determinada com um substrato cromognico
apropriado. Activador especfico do factor II proveniente do veneno de
cobra (ecarina). Protena obtida a partir do veneno de cobra
A Unidade Internacional corresponde actividade de
das pirmides (Echis carinatus), que activa especificamente
uma quantidade determinada do Padro Internacional de
o factor II. Reconstitua a preparao seguindo as instrues
concentrado de antitrombina III humana. A equivalncia
do fabricante. Uma vez reconstituda, conserve-a a 4C e
entre a Unidade Internacional e o Padro Internacional
utilize-a no espao de 1 ms.
indicada pela Organizao Mundial de Sade.
Tcnica. Para a amostra e para a preparao de referncia Substrato cromognico para o factor IIa. Substrato
prepare com soluo tampo de tris-EDTA ASB de pH cromognico especfico do factor IIa tal como: dicloridrato
8,4 R contendo 15 U.I. de heparina por mililitro, 2 sries de H-d-fenilalanil-l-pipecolil-l-arginina-4-nitroanilida,
independentes de 3 ou 4 diluies compreendidas entre 1/75 4-toluenosulfonil-glicil-prolil-l-arginina-4-nitroanilida, H-d-
e 1/200 a partir de 1 U.I./ml. -ciclohexilglicil--aminobutiril-l-arginina-4-nitroanilida,
Aquea a 37C durante 1-2 min 200 l de cada diluio. d-ciclohexilglicil-l-arginina-4-nitroanilida-diacetato.
Junte a cada diluio 200 l de uma soluo de trombina Reconstitua seguindo as instrues do fabricante.
bovina R contendo 2 U.I./ml em soluo tampo de tris- Tampo de diluio. Soluo contendo 6,06 g/l de
EDTA ASB de pH 8,4 R. Misture e mantenha a 37C tris(hidroximetil)aminometano R, 17,53 g/l de cloreto de
durante exactamente 1 min. Junte 500 l de um substrato sdio R, 2,79 g/l de cido (etilenodinitrilo)tetractico R e 1 g/l
cromognico apropriado (por exemplo, d-fenilalanil-l- de albumina bovina R ou de albumina humana R. Ajuste, se
-pipecolil-l-arginina-4-nitroanilida; dissolva este substrato necessrio, para pH 8,4 com cido clordico R.
em gua R para obter uma soluo contendo 4 mmol/l e
em seguida dilua com soluo tampo de tris-EDTA ASB de
pH 8,4 R sem albumina at uma concentrao apropriada TCNICA
para o ensaio de aferio). Comece imediatamente a
determinao da absorvncia a 405 nm (2.2.25) e continue, Soluo problema. Dilua a amostra com um tampo de
pelo menos durante 30 s. Calcule a variao da absorvncia diluio de modo a obter uma soluo contendo 0,015 U.I. de
(A/min). (Pode utilizar-se igualmente a aferio de ponto factor II por mililitro. Prepare, pelo menos, mais 3 diluies
final parando a reaco com cido actico e medindo a desta soluo no tampo de diluio.
absorvncia a 405 nm).
Soluo de padro. Dilua a preparao de padro com um
A variao da absorvncia (A/min) inversamente tampo de diluio de modo a obter uma soluo contendo

2.7.20. Aferio da actividade in vivo da vacina inactivada contra a poliomielite
0,015 U.I. de factor II por mililitro. Prepare, pelo menos, mais especificamente o factor X. Reconstitua a preparao
3 diluies desta soluo no tampo de diluio. seguindo as instrues do fabricante. Conserve a
preparao reconstituda a 4C e utilize-a no espao de
Coloque todas as solues a 37C num banho de gua, pouco
1 ms.
tempo antes do ensaio.
Substrato cromognico para o factor Xa. Substrato
As condies descritas aplicam-se s placas de microtitulao.
cromognico especfico do factor Xa tal como: dicloridrato de
Se a aferio realizada em tubos, ajuste os volumes de modo
2. Mtodos
Analticos
N--benziloxicarbonil-d-arginil-l-glicil-l-arginina-4-
a manter as propores na mistura.
-nitroanilida, cloridrato-de-N-benzoil- l-isoleucil-l-glutamil-
Introduza 25 l das diferentes diluies da amostra -glicil-l-arginina-4-nitroanilida, metanossulfonil-d-leucil-
e da soluo padro, numa srie de poos da placa de -glicil-l-arginina-4-nitroanilida, metoxicarbonil-d-ciclo-
microtitulao mantida a 37C. Junte em cada poo 125 l do -hexilalanil-glicil-l-arginina-4-nitroanilida. Reconstitua
tampo de diluio e 25 l de ecarina e incube exactamente seguindo as instrues do fabricante.
durante 2 min. Junte em cada poo 25 l de substrato
Tampo de diluio. Soluo contendo 3,7 g/l de
cromognico para o factor IIa.
tris(hidroximetil) aminometano R, 18,0 g/l cloreto de sdio
Proceda leitura da velocidade de variao da aborvncia a R, 2,1 g/l de imidazol R, 0,02 g/l de brometo de hexadimetrina
405 nm (2.2.25) e continue durante 3 min de modo obter a R e 1 g/l de albumina bovina R ou de albumina humana R.
velocidade mdia da variao da absorvncia (A/min). Se Ajuste, se necessrio, para pH 8,4 com cido clordrico R.
no possvel uma leitura contnua, determine a absorvncia
a 405 nm em intervalos consecutivos apropriados, por
exemplo, de 40 s em 40 s. Construa o grfico linear dos TCNICA
valores de absorvncia em funo do tempo e calcule A/min
(declive da recta). A partir dos valores individuais de A/min Soluo problema. Dilua a amostra com um tampo de
para cada diluio do padro e da amostra, calcule a diluio de modo a obter uma soluo contendo 0,18 U.I. do
actividade da amostra e verifique a validade da aferio pelos factor X por mililitro. Prepare, pelo menos, mais 3 diluies
mtodos estatsticos habituais (5.3). desta soluo no tampo de diluio.
Soluo de referncia. Dilua a preparao de referncia
com um tampo de diluio de modo a obter uma soluo
REAGENTES
contendo 0,18 U.I. do factor X por mililitro. Prepare, pelo
menos, mais 3 diluies desta soluo no tampo de diluio.
Albumina humana. Albumina srica humana contendo, no
mnimo, 96 por cento de albumina. Pouco tempo antes do ensaio, coloque todas as solues num
banho de gua a 37C.
As condies descritas aplicam-se s placas de microtitulao.
2.7.19. AFERIO DO FACTOR X Se a aferio for realizada em tubos, ajuste os volumes de
DA COAGULAO HUMANA modo a manter as porpoes na mistura.
Introduza 12,5 l das diferentes diluies da amostra e da
A aferio do factor X da coagulao humana efectua-se soluo de referncia numa srie de poos de uma placa de
aps activao especfica em factor Xa, que calculada microtitulao mantida a 37C. Junte em cada poo 25 l de
por comparao da sua actividade em clivar um substrato VVR. Incube durante exactamente 90 s. Junte em cada poo
cromognico peptdico especfico com a mesma actividade 150 l do substrato cromognico do factor Xa, diludo 6 vezes
do Padro Internacional ou de uma preparao de referncia no tampo de diluio.
aferida em Unidades Internacionais.
Proceda leitura da variao de absorvncia a 405 nm
A Unidade Internacional do factor X corresponde actividade (2.2.25) e continue durante 3 min de modo a obter a
de uma dada quantidade do Padro Internacional que velocidade mdia da variao de absorvncia (A/min).
constitudo por um concentrado liofilizado do factor X da Se no for possvel uma leitura continua, determine
coagulao humana. A correspondncia entre a Unidade a absorvncia a 405 nm com intervalos consecutivos
Internacional e o Padro Internacional indicada pela apropriados, por exemplo, todos os 40 s. Construa o grfico
Organizao Mundial de Sade. linear dos valores de absorvncia em funo do tempo
O mtodo de aferio cromognica inclui 2 etapas: activao e calcule A/min (declive da recta). A partir dos valores
do factor X sob aco do veneno de cobra, seguida de individuais de A/min para cada diluio do padro e da
clivagem enzimtica de um substrato cromognico pelo amostra, calcule a actividade da amostra e verifique a validade
factor Xa que liberta um cromforo quantificvel por da aferio pelos mtodos estatsticos habituais (5.3).
espectrofotometria. Em condies de aferio apropriadas,
existe uma relao linear entre a actividade do factor Xa e a
clivagem do substrato cromognico. 2.7.20. AFERIO DA ACTIVIDADE IN
VIVO DA VACINA INACTIVADA CONTRA
REAGENTES A POLIOMIELITE
Activador especfico do factor X proveniente do veneno A capacidade da vacina em induzir a formao de anticorpos
de cobra de Russel (VVR). Protena obtida a partir do neutralizantes determinada in vivo por um dos mtodos
veneno de cobra de Russel (Vipera russelli) que activa seguintes.

2.7.20. Aferio da actividade in vivo da vacina inactivada contra a poliomielite
ENSAIO EM PINTOS OU COBAIOS anticorpos neutralizantes para cada tipo de poliovrus que
permite definir uma resposta positiva. Devido a variaes
Prepare uma srie apropriada, no mnimo, de 3 diluies entre os laboratrios, no possvel definir valores limiares
da amostra utilizando uma soluo salina tamponada aplicveis a todos os laboratrios. Os valores limiares so
apropriada. Distribua por grupos de 10 pintos com 3 determinados para cada laboratrio, com base numa srie,
semanas de idade ou cobaios pesando entre 250-350 g, de no mnimo, de 3 ensaios com a vacina de referncia. Utilize
modo a utilizar um grupo separado para cada diluio da como valor limiar o ponto mdio, numa escala log2, entre os
2. Mtodos
Analticos
vacina. Injecte por via intramuscular, a cada animal, 0,5 ml ttulos mnimos e mximos (mdia geomtrica) da srie de
da diluio atribuda ao seu grupo. Aps 5 a 6 dias sangre 3 ou mais ensaios. Para cada um dos 3 tipos de poliovrus,
os animais e guarde separadamente os soros. Pesquise a a actividade da vacina no inferior de modo significativo
presena de anticorpos neutralizantes para cada um dos vrus actividade da preparao de referncia. O ensaio s vlido
da poliomielite humana 1, 2 e 3 nos soros diludos a 1/4. se:
Misture 100 DICC50 do vrus com a diluio do soro e incube
a 37C, durante 4, 5-6 h. Em seguida mantenha a para a amostra e para a preparao de referncia, a DE50
5 3C, durante 12-18 h, se for necessrio para regularidade se situar entre a menor e a maior dose administrada aos
dos resultados. Inocule as misturas em culturas celulares animais,
a fim de detectar a presena de vrus no neutralizados a anlise estatstica no revelar nenhum desvio
e efectue a leitura do resultado at 2.7.20. Aferio
da actividade in vivo da vacina inactivada contra a
poliomielite ao 7 dia aps a inoculao. Para cada grupo de os limites de confiana (P = 0,95) se situarem entre 25 por
animais, assinale o nmero de soros contendo anticorpos cento e 400 por cento da actividade estimada.
neutralizantes e calcule a diluio da vacina que d uma
resposta em anticorpos em 50 por cento dos animais. Efectue A seco seguinte publicada a ttulo informativo.
em paralelo um ensaio testemunha com uma preparao de
referncia apropriada. A vacina satisfaz ao ensaio se, diluda a Recomendaes para a derrogao da
1/100 ou mais, induzir uma resposta em anticorpos para cada
um dos 3 tipos de vrus em 50 por cento dos animais. aferio in vivo da actividade da vacina
inactivada contra a poliomielite,
monovalente ou combinada
ENSAIO NO RATO
Um mtodo de aferio apropriado in vivo consiste numa Estas recomendaes aplicam-se s vacinas resultantes de
injeco intramuscular, no(s) membro(s) inferior(s), no estirpes selvagens de poliovrus. A validao descrita deve ser
mnimo, de 3 diluies da amostra e da preparao de efectuada para cada produto antes da derrogao da aferio
referncia, utilizando para cada diluio um grupo de 10 in vivo e renova-se em todas as modificaes importantes do
ratos provenientes de uma estirpe apropriada e isenta de processo de fabrico que possam afectar as aferies in vivo e
microrganismos patognicos especficos. geralmente in vitro.
necessrio utilizar 4 diluies a fim de obter resultados A Conveno Europeia para a proteco dos animais
vlidos para os 3 serotipos. O nmero de animais por vertebrados utilizados com fins experimentais ou outros fins
cada grupo deve ser suficiente para obter resultados que cientficos exige a renncia aos ensaios em animais se existir
satisfaam aos critrios de validade; grupos de 10 ratos so uma alternativa relativamente acessvel e prtica que seja
geralmente suficientes, mas podem ser obtidos resultados satisfatria do ponto de vista cientfico.
vlidos com grupos mais pequenos. Se forem utilizados
animais de sexos diferentes, machos e fmeas so distribudos As presentes recomendaes tm pois o objectivo de
igualmente entre os grupos. Tem sido considerado apropriado promover a derrogao da aferio in vivo da actividade
um peso entre 175-250 g. Utilize um inculo de 0,5 ml por sempre que para um dado produto seja demonstrado que a
rato. A gama de doses escolhida de modo que seja obtida aferio in vitro (determinao do antignio D) fornece
uma resposta para os 3 tipos de poliovrus. Aps 20-22 uma garantia suficiente de uma actividade satisfatria para o
dias sangre os animais. Para os 3 tipos de poliovrus, leia controlo de rotina dos lotes.
separadamente os ttulos em anticorpos neutralizantes com No que respeita aferio da actividade in vivo, considera-
100 DICC50 da estirpe Sabin como vrus de prova, com as -se o ensaio em ratos como sendo o mtodo recomendado.
clulas Vero ou Hep 2 como indicadores e sob as condies
Nas vacinas em que se utilizam pintos ou cobaios para a
de neutralizao seguintes: 3 h a 35-37C, seguidos de 18 h
aferio da actividade e que dispem de um histrico de
a 2-8C se for necessrio para regularidade dos resuftados.
produo estabelecido e documentado pode derrogar-se
Aps 7 dias de incubao a 35C, efectue a fixao e a
a aferio da actividade in vivo se a aferio em ratos
colorao e leia os resultados. Para que seja vlido o ttulo em
for igualmente aplicada aos lotes includos no estudo
anticorpos, deve ser demonstrado que o ttulo em cada vrus
de validao descrito a seguir. Para as vacinas ainda no
de prova se situa entre 10 DlCC50 e 1000 DlCC50 e o ttulo em
aprovadas, os resultados da aferio em ratos de todos os
anticorpos neutralizantes de um soro testemunha no deve
granis finais so includos em todos os dados gerados para
desviar, mais de 2 diluies e meia da mdia geomtrica do
demonstrar a regularidade da produo antes de se poder
ttulo do soro. Calcule a actividade comparando a proporo
derrogar a aferio in vivo.
de animais que apresentem uma resposta amostra e
preparao de referncia, quer pelo mtodo de probabilidade Uma vez obtida a derrogao da aferio da actividade in
interactiva, quer, aps validao, aplicando um modelo em vivo, os lotes de vacina so libertados com base nas aferies
linhas paralelas. Para o mtodo de probabilidade interactiva in vitro e a aferio in vivo no pode ser utilizada
necessrio estabelecer um valor limite de ttulo em como alternativa para a libertao de um lote que no foi

2.7.21. Aferio do factor de von Willebrand humano
satisfatrio na aferio in vitro. A repetio da aferio in constitudo por um concentrado de factor de Von Willebrand
vitro da actividade pode ser efectuada de acordo com um humano liofilizado.
mtodo autorizado.
A correspondncia entre a Unidade Internacional e o padro
internacional determinada pela Organizao Mundial de
TCNICA Sade (OMS).
2. Mtodos
Analticos
Antes de se proceder validao devem ser cumpridas as
seguintes condies: ACTIVIDADE DE TIPO COFACTOR DA RISTOCETINA
experincia apropriada da aferio em ratos, A actividade de tipo cofactor da ristocetina do factor de

completa validao da aferio do antignio D (linearidade, Von Willebrand obtida avaliando a aglutinao de uma
repetibilidade, preciso intermdia, exactido e limites de suspenso de plaquetas em presena da ristocetina A.
quantificao), O doseamento pode ser efectuado utilizando processos
automatizados no caso das determinaes quantitativas ou,
estabelecimento de critrios de aceitao relativos a no caso das determinaes semiquantitativas, por avaliao
aferio do antignio D baseado num nmero apropriado visual do limiar de aglutinao numa srie de diluies.
de lotes finais consecutivos,
prefervel um doseamento quantitativo.
estabelecimento da regularidade da produo em granis
finais recentes utilizando a aferio in vitro da actividade REAGENTES
aprovada em vigor; os granis finais devem corresponder
aos lotes finais utilizados para estabelecer os critrios de Suspenso de plaquetas. Utilize uma preparao titulada de
aceitao relativos aferio do antignio D e representam plaquetas humanas isoladas de fresco e lavadas e fixadas, por
diferentes colheitas inactivadas de cada um dos 3 tipos de
exemplo, com formaldedo ou paraformaldedo. A suspenso
poliovrus.
pode igualmente ser liofilizada. Se necessrio, pode ser
O estudo de validao deve ser efectuado em: adicionada de uma quantidade apropriada de ristocetina A.
Certos reagentes plaquetrios contm j ristocetina A.
um granel/lote final representativo do mtodo de produo,
actual. Preparao de referncia. A preparao de referncia
2 lotes cuja actividade tenha sido atenuada, por exemplo, do factor de Von Willebrand o padro internacional de
por aquecimento da vacina normal ou atravs da mistura concentrado de factor de Von Willebrand da OMS.
com um lote de vacina submetido a tratamento trmico;
os ttulos destes lotes de actividade atenuada devem ser MTODO
inferiores em cerca de metade relativamente aos de um
granel/lote final representativo. Doseamento semi-quantitativo. Prepare diluies
Os lotes so aferidos utilizando como preparao de apropriadas da amostra e da preparao de referncia
referncia um lote de produo homlogo: usando como diluente uma soluo contendo 9 g/l de
cloreto de sdio R e 10-50 g/l de albumina humana R. Junte
por aferio in vivo da actividade aprovada em vigor para a cada diluio uma quantidade apropriada da suspenso
a vacina, de plaquetas e, se necessrio, ristocetina A. Misture numa
pela aferio em ratos. se no for uma aferio in vivo, da lmina de vidro, imprimindo-lhe um movimento circular
actividade aprovada em vigor, pela aferio do antignio D. suave durante 1 min. Deixe em repouso ainda durante 1 min
e leia os resultados sobre fundo escuro, com iluminao
A derrogao da aferio in vivo da actividade aceitvel lateral. A ltima diluio na qual se observa aglutinao
se o granel/lote final representativo satisfaz s aferies in nitidamente visvel indica o ttulo da amostra em termos de
vivo e in vitro da actividade e se os lotes com actividade actividade do tipo cofactor da ristocetina. Utilize o diluente
diminuda no satisfizerem. Se um lote com actividade como testemunha negativa.
diminuda no satisfizer aferio do antignio D mas
satisfizer aferio in vivo da actividade, este ltimo Doseamento quantitativo. Imediatamente antes do emprego,
pode ser repetido. reconstitua o contedo de uma ampola da preparao de
referncia e da amostra juntando a quantidade necessria do
diluente recomendado (por exemplo, gua R). Junte s
2.7.21. AFERIO DO FACTOR DE VON preparaes reconstitudas a quantidade de pr-diluente
necessria para obter solues entre 0,5 e 2,0 U.I./ml.
WILLEBRAND HUMANO O pr-diluente constitudo por uma soluo tampo
isotnica sem agente quelante, contendo, por exemplo,
As funes biolgicas do factor de Von Willebrand humano 1 a 5 por cento de albumina humana ou bovina e
so mltiplas. O seu doseamento actualmente possvel com adicionada de tris(hidroximetil)-aminometano ou imidazol
base na sua actividade de tipo cofactor da ristocetina ou pela convenientemente tamponado.
sua capacidade de ligao ao colagnio. A determinao da
actividade do factor de Von Willebrand humano efectuada Efectue o doseamento de acordo com as instrues do
por comparao, em determinadas condies, da actividade fabricante preparando, pelo menos, 2 sries contendo tantas
da amostra com uma preparao de referncia calibrada diluies quantas as necessrias para obter, pelo menos, 3
em relao ao padro internacional, no caso presente em concentraes diferentes no intervalo de linearidade.
Unidades Internacionais.
Verifique a validade do ensaio e calcule a actividade da
A Unidade Internacional corresponde actividade de uma amostra pelos mtodos estatsticos habituais (5.3, por
determinada quantidade do padro internacional que exemplo).

2.7.22. Aferio do factor XI da coagulao humana
CAPACIDADE DE LIGAO AO COLAGNIO suspenso para cada poo da placa de microtitulao. Cubra
a placa com uma pelcula de plstico e incube a 37C durante
A capacidade de ligao determinada por imunoadsoro uma noite. Esvazie os poos invertendo e deixe esgotar a placa
com enzima conjugada em placas de microtitulao sobre papel absorvente. Junte 250 l do tampo de lavagem.
revestidas de colagnio. Aps ligao especfica do factor Esvazie novamente os poos invertendo e deixe esgotar a
de von Willebrand com o colagnio fibrilar, a visualizao placa sobre papel absorvente. Repita 3 vezes esta operao.
efectuada com um anticorpo policlonal anti-factor de Von Adicione em cada poo 250 I do reagente de bloqueio,
2. Mtodos
Analticos
Willebrand conjugado a uma enzima que, em presena de um cubra a placa com uma pelcula plstica e incube a 37C
substrato cromognico, origina um produto quantificvel por durante 1 h. Esvazie os poos invertendo e deixe esgotar a
espectrofotometria. Em condies operatrias apropriadas, placa sobre papel absorvente. Adicione 250 l do tampo
existe uma relao linear entre a actividade de ligao ao de lavagem. Esvazie novamente os poos invertendo e
colagnio do factor de Von Willebrand e a absorvncia. deixe esgotar a placa sobre papel absorvente. Repita 3
vezes esta operao.
MATERIAL Coloque nos poos quer 100 l de uma das amostras ou da
soluo de referncia, quer 100 l do tampo de diluio
Colagnio. Utilize fibrilhas de colagnio natural, equino ou (testemunhas negativas). Cubra a placa com uma pelcula
humano, do tipo I ou III. Para facilitar as manipulaes, pode plstica e incube a 37C durante 2 h. Esvazie os poos
ser utilizado colagnio em soluo. novamente invertendo e deixe esgotar a placa sobre papel
Diluente do colagnio. Dissolva 50 g de glucose R em gua R, absorvente. Repita 3 vezes esta operao.
ajuste para pH 2,7-2,9 com cido clordrico 1 M e complete Prepare uma diluio apropriada do conjugado em PBS
1000 ml com gua R. contendo 5 g/l de albumina bovina R e adicione em cada
Soluo salina tamponada de fosfato (PBS). Dissolva 8,0 g de poo 100 l desta diluio. Cubra a placa com uma pelcula
cloreto de sdio R, 1,05 g de fosfato dissdico di-hidratado R, plstica e incube a 37C durante 2 h. Esvazie os poos
0,2 g de fosfato monossdico R e 0,2 g de cloreto de potssio invertendo e deixe esgotar a placa sobre papel absorvente.
R em gua R. Ajuste para pH 7,2 com hidrxido de sdio 1 M Adicione 250 l do tampo de lavagem. Esvazie novamente os
ou com cido clordrico 1 M e complete 1000 ml com gua R. poos como indicado. Repita 3 vezes esta operao.
Tampo de lavagem. PBS contendo 1 g/l de polissorbato 20 R. Adicione em cada poo 100 l da soluo substrato e incube
temperatura ambiente, no escuro e durante 20 min. Adicione
Reagente de bloqueio. PBS contendo 1 g/l de polissorbato 20 em cada poo 100 l de cido clordrico 1 M.
R e 10 g/l de albumina bovina R.
Determine a absorvncia a 492 nm. A partir dos valores
Tampo de diluio. PBS contendo 1 g/l de polissorbato 20 R da absorvncia, determine a actividade da amostra pelos
e 50 g/l de albumina bovina R. mtodos estatsticos habituais (por exemplo, 5.3).
Conjugado. Soro de coelho anti-factor de Von Willebrand O ensaio s vlido se as absorvncias medidas para as
humano, conjugado com peroxidase de rbano. Utilize o testemunhas negativas forem superiores a 0,05.
conjugado seguindo as instrues do fabricante.
Soluo substrato. Imediatamente antes do emprego,
dissolva um comprimido de diclorohidrato de 2.7.22. AFERIO DO FACTOR XI
o-fenilenodiamina e um comprimido de perxido de ureia DA COAGULAO HUMANA
em 20 ml de gua R ou utilize um volume apropriado de
perxido de hidrognio. Mantenha ao abrigo da luz.
O princpio desta aferio baseia-se na medio da capacidade
Placas de microtitulao. Placas de polistireno com poos de uma preparao do factor XI da coagulao humana em
de fundo plano, apresentando propriedades de superfcie reduzir o tempo de coagulao prolongado de um plasma
optimizadas para os imunodoseamentos enzimticos e uma deficiente em factor XI. A reaco acelerada por adio
capacidade elevada de ligao s protenas. de um reagente contendo fosfolpidos e um activador de
contacto, como o caulino, a slica ou o cido elgico. A
TCNICA actividade avaliada por comparao da curva dose-resposta
obtida com a preparao problema com a obtida com uma
preparao de referncia constituda por plasma humano
Soluo problema. Reconstitua a amostra como indicado
normal.
no rtulo, dilua-a com o tampo de diluio de modo a
obter uma soluo que possua cerca de 1 U.I. do factor de 1 unidade do factor XI corresponde actividade de 1 ml de
Von Willebrand. Prepare 2 sries, no mnimo, de 3 outras plasma humano normal. O plasma humano normal prepara-
diluies cada uma no tampo de diluio. -se misturando unidades de plasma provenientes, no mnimo,
de 30 dadores e conserva-se a uma temperatura inferior ou
Soluo de referncia. Reconstitua a preparao de referncia
igual a -30C.
como indicado, em seguida dilua-a com o tampo de diluio
de modo a obter uma soluo com cerca de 1 U.I. do factor Reconstitua, separadamente a amostra e a prepara o de
de Von Willebrand. Prepare 2 sries, no mnimo, de 3 outras referncia segundo as indicaes que figuram no rtulo e
diluies cada uma no tampo de diluio. utilize-as imediatamente. Se a amostra contm heparina,
determine a quantidade (2.7.12) e neutralize-a, por exemplo,
Deixe a soluo do colagnio arrefecer temperatura
juntando sulfato de protamina R (10 g de sulfato de
ambiente, dilua com o diluente do colagnio de modo a
protamina neutralizam 1 U.I. de heparina). Dilua previamente
obter uma soluo do colagnio a 30-75 g/ml e misture
a amostra e a preparao de referncia com plasma deficiente
suavemente para obter uma suspenso uniforme de
em factor XI (por exemplo, substrato de plasma R3) de modo
fibrilhas de colagnio. Transfira com pipeta 100 l da
a obter solues a 0,5-2,0 unidades/ml. Prepare, no mnimo,

2.7.23. Contagem das clulas cd34/cd45+ nos produtos hematopoiticos
3 sries de diluies apropriadas para cada material, de Seleco dos parmetros

preferncia em duplicado, com uma soluo tampo
apropriada (por exemplo, soluo tampo de imidazol de A aferio por citometria de fluxo, utiliza anticorpos
pH 7,3 R) contendo 10 g/l de albumina bovina ou humana. monoclonais disponveis no mercado, que so directamente
Estas diluies devem ser utilizadas imediatamente. conjugados e marcados por um fluorocromo, os mtodos de
rotina de marcao e de lise do sangue total, uma estratgia
Utilize um aparelho apropriado medio dos tempos de de janela (gatting) que utiliza a disperso da luz e uma
2. Mtodos
Analticos
coagulao ou efectue a aferio com tubos de incubao anlise por imunofluorescncia utilizando uma combinao
mantidos em banho de gua a 37C. Em cada tubo, de anticorpos monoclonais CD45/CD34.
introduza 0,1 ml de plasma deficiente em factor Xl (por
exemplo, substrato de plasma R3) e 0,1 ml de uma das E possvel determinar a viabilidade das clulas CD34/CD45+
diluies da preparao de referncia ou da preparao por uma colorao apropriada dos cidos nucleicos, com um
problema. Junte em cada tubo 0,1 ml de um reagente corante que no atravesse a membrana celular intacta (por
APTT apropriado (tempo de tromboplastina parcial activado) exemplo, com a 7-aminoactinomicina D).
contendo fosfolpidos e um activador de contacto e incube a
37C durante um perodo recomendado. Junte a cada tubo Seleco dos anticorpos monoclonais
0,1 ml de uma soluo de cloreto de clcio R a 3,7 g/l
previamente aquecido a 37C. Com um cronmetro, Anticorpos anti-CD34. Utilize anticorpos anti-CD34 de classe
determine o tempo de coagulao, ou seja, o intervalo de III que detectem todas as formas de glicosilao da molcula
tempo que separa a adio do cloreto de clcio do primeiro (por exemplo, os clones 8G12 ou 581). Para permitir a
sinal de formao de fibrina. Os volumes indicados mais deteco de resultados pouco frequentes utilize um anticorpo
altos podem ser adaptados em funo do reagente APTT e conjugado ao fluorocromo excitvel com maior brilho,
do aparelho utilizado. Calcule a actividade pelos mtodos utilizando um citmetro de fluxo de laser rgon, como, por
estatsticos habituais (por exemplo, captulo 5.3). exemplo, a ficoeritrina (PE).
Anticorpos anti-CD45. necessrio utilizar os anticorpos do
tipo pan-anti-CD45, que possam detectar todas as isoformas e
2.7.23. CONTAGEM DAS CLULAS todas as glicoformas desta estrutura. geralmente utilizado
CD34/CD45+ NOS PRODUTOS (por exemplo, J33, HLe1, 2D1) um anticorpo anti-CD45
HEMATOPOITICOS conjugado ao fluorocromo, tal como o isotiocianato de
fluorescena (FITC).
O presente mtodo descreve a marcao imunolgica e a Controlos isotpicos ou isoclnicos. Examina-se uma
anlise por citometria de fluxo (2.7.24) para determinar testemunha negativa para detectar qualquer sinal no
o nmero de clulas CD34/CD45+ contidas nos produtos especfico na regio de fluorescncia da PE. No caso
hema-topoiticos. A determinao efectua-se por um mtodo de uma testemunha isotpica (utilize um anticorpo
simples de plataforma utilizando esferas fluorescentes monoclonal dirigido contra um antignio sem afinidade
calibradas, aps lise dos glbulos vermelhos da amostra, se
com a CD34 mas do mesmo isotipo que o anticorpo CD34),
necessrio.
o isotipo conjugado PE liga-se ao complexo CD45-FITC
Este mtodo aplica-se a todos tipos de preparaes e ao (ou PerCP). No caso de uma testemunha isoclnica, o
sangue total. Contudo, o nvel de preciso esperado particu- anticorpo monoclonal CD34 no conjugado (em excesso)
larmente adaptado s preparaes contendo percentagens e o mesmo anticorpo conjugado PE combinam-se ao
muito baixas de clulas CD34/CD45+. conjugado CD45. Podem ser utilizadas combinaes
alternativas.
Avaliao da qualidade do transplante pela medio do
nmero de clulas CD34/CD45+ Valor absoluto das CD34/CD45+
Diferentes estudos tm estabelecido que as clulas da Esferas fluorescentes calibradas. Conforme a tcnica
medula ssea que exprimem o antignio de superfcie utilizada, o padro interno constitudo por esferas
CD34 (1-3 por cento) so capazes de reconstituir uma calibradas em suspenso ou directamente introduzido nos
hematopoiese multies- tirpe a longo prazo, aps uma tubos associados, pelo fabricante.
terapia mieloblastiva. Encontram-se igualmente clulas
CD34/CD45+ na circulao perifrica de indivduos normais O valor absoluto das clulas CD34/CD45+ por microlitro
mas em percentagens extremamente baixas (0,01-0,1 por calculado utilizando a seguinte expresso:
cento). No entanto, as clulas CD34/CD45+ podem tambm
ser mobilizadas em grande nmero a partir da medula para A
B C
a circulao perifrica por citoquinas hematopoiticas,
como o factor estimulante-colnia de granulcitos e/ou por A = nmero de clulas CD34/CD45+ calculadas,
quimioterapia. O ensaio para a contagem das clulas
CD34/CD45+ deve satisfazer s seguintes exigncias: B = nmero de esferas calculadas,
sensibilidade elevada, desde que sejam escassas as clulas C = concentrao de esferas conhecida.
estaminais hematopoiticas,
Estratgia de janela
exactido, para obter resultados clnicos relevantes,
O objectivo da janela sequencial seleccionar a populao
reprodutibilidade, para obter resultados clnicos de
de interesse e simultaneamente reduzir ao mnimo as
confiana,
interferncias devidas aos fragmentos e s clulas maduras s
rapidez, para obter uma anlise em tempo real. quais os anticorpos se podem ligar de modo no especfico.

2.7.24. Citometria de fluxo
Se for utilizado um Kit comercializado, aplique a Parmetros do sistema

janela recomendada pelo fabricante. Se for utilizada uma
Discriminador/limiar: o limiar de disperso frontal da
aferio em janela, prefervel aplicar uma das estratgias
luz fixado de modo a excluir os fragmentos (difuso
actualmente recomendadas. Uma estratgia de janela que
frontal baixa) de todo o traado conservando os pequenos
utilize os parmetros da disperso da luz e a fluorescncia
linfcitos.
das CD34/CD45 facilitar uma correcta identificao e a
contagem das clulas CD34/CD45+. Regras de alta tenso do PM: estas regras devem satisfazer
2. Mtodos
Analticos
a uma anlise do marcador de superfcie celular e

Nmero de resultados analisados estabelecer em cada laboratrio de modo a poder fazer
uma distino entre as populaes celulares negativas e
Um nmero suficiente de resultados analisado para positivas com uma densidade antignica moderada. As
manter uma preciso aceitvel, por exemplo, no mnimo, tenses do PM so examinadas e ajustadas periodicamente
100 medies das CD34+ e, pelo menos, 60 000 medies de acordo com os procedimentos de laboratrio
das CD45+; o nmero total de clulas calculadas pode ser normalizados,
superior se a amostras CD34/CD45 so mantidas inalteradas
para a percentagem das CD34 for inferior ou igual a 0,1 por Compensao: deve ser aceite, face sobreposio
cento anlise da regio negativa. espectral das cores (por exemplo, FITC/PE) encontrado na
anlise do marcador de superfcie celular. Examina-se a
compensao dos fluorocromos e ajusta-se de acordo com
Colheita das amostras
os procedimentos de laboratrio normalizados,
O ACD (cido ctrico, citrato de sdio, dextrose) frmula A
Dbito: o dbito deve permitir uma anlise de rotina com
o anticoagulante utilizado nos procedimentos de aferese.
marcadores de superfcie celular,
Este anticoagulante permite efectuar numa mesma
amostra uma contagem leucocitria automatizada e uma Regies de janela: as regies de janela estabelecidas para as
avaliao por citometria de fluxo. O cido edtico (EDTA) amostras CD34/CD45 so mantidas para anlise da regio
o anticoagulante de escolha para amostras do sangue negativa.
perifrico.
Clculo do nmero absoluto das clulas CD34/CD45+
Transporte de amostras
O nmero absoluto das clulas CD34/CD45 + calculado a
As condies de transporte destinam-se a garantir a partir da expresso seguinte:
segurana fsica e trmica das amostras.
nDV
Integridade e conservao das amostras
n = nmero total de clulas CD34/CD45 + por microlitro,
Podem ser processados os produtos de aferese frescos (com
menos de 24 h), as amostras de sangue total, as amostras D = factor de diluio,
de sangue umbilical ou as amostras da medula ssea. As V = volume do produto, em microlitros.
amostras com mais tempo (mais de 24 h) e aquelas que
tiverem sido descongeladas so marcadas com um corante de Os resultados so registados, tanto em percentagem de
viabilidade. Na recepo, verifica-se a temperatura no interior clulas CD34/CD45+, como em nmero absoluto por
da embalagem. microlitro. Podem tambm ser registados em nmero
absoluto por quilograma de massa corporal do receptor,
sempre que possvel.
TCNICA
Preparao da amostra 2.7.24. CITOMETRIA DE FLUXO

Assegure que a concentrao de leuccitos apropriada antes
da marcao com anticorpos monoclonais. Se necessrio, A citometria de fluxo consiste numa anlise multiparamtrica
dilua a amostra num meio que seja compatvel com o de propriedades pticas das partculas individuais num
produto a ser testado e com o sistema de lise. Registe o sistema fluido.
factor de diluio. Recomenda-se efectuar o ensaio com uma As clulas ou as partculas em suspenso so individualmente
testemunha negativa. distribudas num fluxo linear (corrente) que flui por um
dispositivo detector. Para serem analisados, os tecidos slidos
Anlise de citometria de fluxo devem ser reduzidos a uma suspenso de clulas simples.
Auto-padronizao O espectro de parmetros mensurveis por citometria de
fluxo inclui o volume e a complexidade morfolgica das
Para a anlise das clulas marcadas com um estojo disponvel
clulas ou das estruturas de aparncia celular, os pigmentos
no mercado, os fabricantes tm desenvolvido alguns instru-
celulares, o teor em ADN, o teor em ARN, as protenas, os
mentos de qualidade para ajustar o citmetro de fluxo. Estes
marcadores de superfcie, os marcadores intracelulares, a
ajustamentos so ento transferidos automaticamente por
actividade enzimtica, o pH e a fluidez da membrana.
protocolo analtico das amostras. As esferas fluorescentes
especficas so utilizadas para regular o fotomultiplicador possvel recolher 2 parmetros morfolgicos e 1 sinal de
(PM) nos valores alvo, regulada a compensao e verificado fluorescncia ou mais por clula. A anlise multiparamtrica
o sistema, utilizando uma preparao testemunha. permite definir as populaes celulares, pelo seu fenotipo.

APARELHAGEM DETECO DO SINAL

A focagem, a ampliao e a escolha da fonte de luz so
Quando uma partcula atravessa o feixe luminoso, difunde
optimizadas para permitir a deteco e a medio automtica alguma luz em todas as direces. Se tiverem sido
das diferenas morfolgicas e dos perfis de fluorescncia. adicionados marcadores fluorescentes partcula, esta emite
A anlise citofluorimtrica de fluxo satisfaz aos critrios a sua prpria luz (fluorescncia). Esta luz fluorescente
seguintes: difunde-se tambm em todas as direces. Podem assim ser
2. Mtodos
Analticos
produzidos 2 tipos de sinais:
escolha da fonte de luz, em funo dos parmetros a ser
analisados, disperso da luz,
adaptao da posio do instrumento em funo do tipo emisso de fluorescncia.
de clula a ser analisado (por exemplo: culturas celulares, Os detectores de luz do aparelho colectam alguma desta
leuccitos, plaquetas, bactrias, espermatozides, luz dispersa e fluorescente e produzem sinais electrnicos
leveduras) e da anlise a efectuar (por exemplo: proporcionais quantidade de luz colectada.
fenotipagem, ciclo celular, apoptose, citoquinas, fluidez da
membrana, protena fluorescente). Disperso. So medidos 2 parmetros de disperso da luz:
A citometria de fluxo caracteriza-se pela quantificao a quantidade, principalmente frontal (disperso frontal
automatizada de parmetros fixos para um nmero elevado forward scatter: FS),
de clulas simples durante cada sesso de anlise. Por
a quantidade a 90 da direco do feixe de luz (disperso
exemplo, 100 000 ou mais partculas (praticamente sem
lateral side scatter: SS).
limite superior) so geralmente analisadas, uma aps a outra,
em cerca de 1 minuto. O limite de deteco pode ser de A disperso frontal est relacionada com o volume celular,
apenas 100 molculas fluorescentes por clula. enquanto que a disperso lateral depende de parmetros, tais
como a forma do ncleo, a quantidade e o tipo de grnulos
Um aparelho de citometria de fluxo composto por 5 elemen- citoplasmticos ou ainda da rugosidade da membrana e
tos principais: correlaciona-se com a complexidade morfolgica da clula, de
maneira que quanto mais forte for a intensidade da disperso
um sistema fluido e uma cmara de fluxo,
lateral, mais elevada a complexidade celular. Como uma
uma fonte de luz, funo das caractersticas morfolgicas das clulas, os sinais
de disperso so sempre gerados durante uma anlise de
um sistema detector e de converso analgica para digital fluxo; so tambm definidos como parmetros intrnsecos.
(CAD),
um sistema de amplificao, Fluorescncia. Dependendo do tipo e do nmero de fontes
de luz, quando uma clula passa atravs da rea de captao,
um computador para anlise de sinais. emite uma luz fluorescente. Os sinais de fluorescncia so
gerados pelos marcadores fluorescentes, naturalmente
SISTEMA FLUIDO E CMARA DE FLUXO presentes nas clulas (por exemplo, coenzimas, clorofila,
pigmentos de algas) e/ou por sondas fluorescentes
As clulas so expostas fonte de luz, uma aps a outra e absorvidas pelas clulas quando marcadas para a anlise
detectadas numa cmara de fluxo. O sistema fluido transporta de caractersticas especficas (por exemplo, anticorpos
uma aps a outra as clulas em suspenso do tubo da amostra fluorescentes, marcadores dos cidos nucleicos, sondas de
pH, sondas de clcio, protena fluorescente). O nmero
para o ponto de intercepo laser. Para se atingir o objectivo,
e tipos de sondas fluorescentes disponveis actualmente
o fluxo da amostra arrastado por uma corrente lquida num
so muito vastas. O filtro ptico deve ser adaptado aos
fluxo muito fino na cmara de fluxo (focalizao hidrodin- fluorocromos utilizados e mudado, se necessrio. Para
mica). A clula simples exposta fonte de luz e detectada cada sonda de fluorescncia pode ser utilizado um espectro
na cmara de fluxo. O feixe luminoso focado numa forma de comprimento de onda de excitao e um espectro de
elptica para dentro do canal da cmara de fluxo quando as comprimento de onda de emisso. Os comprimentos de onda
clulas passam por um par de lentes convergentes. O dbito de excitao e de emisso so cuidadosamente adaptados,
deve ser constante durante a anlise de rotina dos marcadores dependendo do objectivo especfico da anlise.
de superfcie celular e deve garantir uma distncia apropriada
entre as clulas para permitir a contagem celular. DIRECO DO SINAL E CONVERSO ANALGICA PARA
DIGITAL
FONTES DE LUZ
Os sinais de disperso e de fluorescncia emitidos pelas
As fontes de luz geralmente utilizadas so: clulas quando passam atravs do feixe laser so ordenados
e orientados para os detectores usando filtros pticos. Os
lmpadas (mercrio, xnon),
detectores so transductores (PM, tubos fotomultiplicadores:
laser de alta potncia refrigerado a gua (rgon, cripton, PMT) que convertem os sinais de luz difundidos das clulas
laser corado), em impulsos de tenso.
laser de baixa potncia refrigerado a gua rgon (488 nm), O mtodo de contagem de cada impulso no canal apropriado
HeNe vermelho (633 nm), HeNe verde, HeCd (UV), conhecido como converso analgica digital (CAD). Os
resultados so finalmente classificados segundo um histo-
laser com dodo (azul, verde, vermelho, violeta). grama de frequncia.

Amplificao. Os impulsos de tenso devem ser ampliados com base nas amostras e sondas utilizadas. Durante a
para uma ptima visualizao. O processo de amplificao anlise dos dados adquiridos, a aplicao informtica da
acentua as diferenas entre os sinais celulares e citometria de fluxo pode tambm produzir outros tipos
consequentemente aumenta a resoluo entre as populaes de grficos (tais como sobreposies, curvas de nveis,
celulares de diferentes caractersticas (permitindo, por tomografia, contorno 3D, diagrama de isodensidades e
exemplo, a diferenciao entre as clulas viveis e no viveis traados sobrepostos). Podem tambm ser utilizados dados
ou entre a fluorescncia no especfica e a fluorescncia estatsticos assim como as intensidades fluorescentes
2. Mtodos
Analticos
especfica a um antignio aps uma colorao por um mdias (e suas variaes com o tempo ou segundo a
anticorpo monoclonal). funo celular).
Existem 2 mtodos de amplificao: linear ou logartmico;

ANLISE DOS DADOS
a escolha entre os 2 mtodos feita para cada um dos sinais
em funo das caractersticas morfolgicas das clulas e dos
Diferentes tipos de populaes celulares podem estar
marcadores utilizados (por exemplo, anticorpos monoclonais
presentes no interior das suspenses celulares para
fluorescentes, corantes dos cidos nucleicos).
serem analisadas, algumas das quais so indesejveis
A amplificao linear, acentua as diferenas entre impulsos (tais como clulas mortas, fragmentos ou macro-
fortes e utiliza-se com os parmetros que gerem sinais de alta agregados), ou simplesmente no relevantes para a
intensidade, por exemplo: anlise (por exemplo, granulcitos num estudo de
linfcitos). Isto depende do tipo de amostra celular
a disperso da luz pelas clulas, (sangue total, medula ssea, culturas celulares, lquidos
a fluorescncia dos corantes dos cidos nucleicos para os biolgicos, suspenses celulares resultantes de tecidos
estudos dos ciclos celulares. slidos) e dos procedimentos de manipulao (como, por
exemplo, os mtodos de colorao, de lise, de fixao,
A amplificao logartmica, pelo contrrio, diz respeito aos de crioconservao, de descongelao, de preparao de
impulsos e parmetros fracos ou s condies analticas que tecidos embebidos na parafina).
possam gerar impulsos tanto fracos e como fortes como, por
exemplo: Em consequncia, nem todos os sinais produzidos durante
a anlise citomtrica de fluxo correspondem s clulas em
os antignios celulares, estudo. Adoptam-se 2 estratgias para excluir os sinais celula-
a disperso da luz pelas plaquetas, bactrias, leveduras, res indesejveis ou irrelevantes.
a fluorescncia dos corantes dos cidos nucleicos para os A 1. estratgia utilizada durante a aquisio dos dados.
estudos de apoptose. Consiste num limiar de rudo, aplicado a 1 (ou vrios)
parmetro(s) significativo(s), fixados de tal modo que
apenas sejam registados os sinais celulares de intensidade
Compensao dos sinais de fluorescncia. Cada marcador superior ao valor discriminatrio pr-definido para um dado
fluorescente tem um espectro de comprimento de onda parmetro. A disperso frontal caracteriza-se por um sinal
de absoro e um espectro de comprimento de onda de forte associado a fracas interferncias; este parmetro o
emisso mais elevado. Se forem utilizadas simultaneamente mais frequentemente utilizado como um discriminador.
2 ou mais sondas fluorescentes para marcar as clulas
(como, por exemplo, uma fenotipagem em 4 antignios), A 2. estratgia, aplicada durante a anlise dos dados,
os espectros de emisso dos fluorocromos so sobrepostos. consiste em utilizar combinaes de regies (gatting)
Em consequncia, cada detector de fluorescncia capta a luz para restringir a anlise apenas aos sinais provenientes das
fluorescente que lhe especfica e quantidades variveis de populaes que satisfaam s caractersticas morfolgicas
luz pertencentes s outras sondas fluorescentes, resultando e do perfil de expresso. Utilizam-se geralmente 2 tipos de
uma sobreavaliao do sinal e uma fraca separao das combinaes lgicas de regies. A 1 a janela morfolgica.
populaes celulares. As populaes celulares identificam-se pelos seus sinais
morfolgicos (FS e SS). traada uma combinao de
A soluo consiste em utilizar uma matriz electrnica que regies volta da populao de interesse (como, por exemplo,
permita subtrair selectivamente os sinais intervenientes de os linfcitos ou as clulas viveis) e em seguida os sinais de
cada sinal de fluorescncia captado pelo detector (compensa- fluorescncia so traados no centro das regies escolhidas.
o da fluorescncia). O 2. tipo baseia-se numa janela de fluorescncia. A
A compensao da fluorescncia requer o uso de padres de populao celular de interesse identifica-se com base na
fluorescncia de preferncia de amostras celulares positivas, expresso de intensidade de um antignio ou de um corante.
marcadas com os fluorocromos de interesse, combinadas de ento traado o contorno da regio que delimita esta
modo equivalente ao anticorpo utilizado para a anlise. populao. O traado dos sinais de fluorescncia feito em
seguida no centro das regies escolhidas.
TRAADO DO SINAL E REPRESENTAO O programa da anlise permite a criao de mltiplas
janelas, seguindo uma ordem sequencial lgica. Esta funo
Aps amplificao e compensao, os sinais so particularmente til para o estudo de populaes celulares
representados em 2 ou 3 dimenses. Os histogramas raras ou para fins de triagem.
representam a intensidade dos sinais em funo
do nmero de clulas para um dado parmetro. Os CONTROLOS
citogramas, onde cada clula representada por um
ponto, resultam da combinao de 2 intensidades de Controlo interno: o alinhamento do sistema ptico deve ser
sinais (representao biparamtrica). O tipo e o nmero validado antes da anlise utilizando fluoroesferas adaptadas
de pontos e de combinaes de sinais so escolhidos e verifica-se a estabilidade fluida ptima. Os dados obtidos

2.7.27. ndice de floculao (Lf) de toxinas e anatoxinas diftrica e tetnica (aferio de ramon)
so registados e permitem o exame dos valores resultantes O 1 tubo a flocular o que contm a quantidade de
dos controlos peridicos em comparao com o valor antitoxina mais prxima em equivalncia quantidade de
mdio de desempenho. Deve ser mantido um controlo antignio presente na amostra. A concentrao de antitoxina
positivo fortemente desejvel para provar que o anticorpo nesse tubo utiliza-se para calcular o ndice Lf da amostra. Se
a examinar funcional e para permitir uma regularizao flocularem 2 tubos ao mesmo tempo, obtm-se o resultado
apropriada do citmetro. O controlo positivo deve incluir efectuando a mdia dos tubos.
amostras em que foi estabelecido que so positivas para o
2. Mtodos
Analticos
marcador em questo. O tempo decorrido at 1 floculao (Kf) constitui um
indicador til da qualidade do antignio. Um aumento em
relao ao valor normal de Kf a uma temperatura e a uma
Controlo externo: para garantir a confiana dos dados
determinada concentrao de anatoxina e de antitoxina
obtidos ou verificar a reprodutibilidade entre laboratrios,
indicam que o antignio est deteriorado. O valor Kf pode
recomenda-se a participao num estudo de desempenho.
igualmente variar com a quantidade de antitoxina utilizada.
Exemplo
2.7.27. NDICE DE FLOCULAO
Tubo A B C D E F
(Lf) DE TOXINAS E ANATOXINAS
Antitoxina adicionada (eq-Lf) 40 45 50 55 60 65
DIFTRICA E TETNICA Antitoxina adicionada (ml) 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65
(AFERIO DE RAMON) Soluo salina adicionada 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35
Amostra diluda adicionada 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0 1,0
A concentrao de toxinas ou anatoxinas numa amostra
pode ser expressa por um ndice de floculao (Lf) utilizando Neste exemplo, se o 1 tubo a apresentar floculao o tubo
o mtodo de floculao de Ramon. Neste ensaio, adiciona- C, o ndice Lf da amostra diluda ento de 50 Lf/ml. No
-se antitoxina em concentraes crescentes a uma srie de
entanto, se o 1 tubo a apresentar floculao o tubo A ou o
tubos contendo uma quantidade constante de toxina ou
tubo F, esse facto no indica uma equivalncia a esse nvel.
de anatoxina. No ponto de equivalncia toxina/anatoxina e
antitoxina, observa-se floculao em 1 ou em vrios tubos. Ser pois necessrio repetir o ensaio alterando a diluio da
Utiliza-se o 1 tubo onde se observa a floculao para se amostra ou seleccionando diferentes doses da antitoxina de
determinar o ndice Lf da amostra. referncia.
O ndice de floculao (Lf) de uma toxina ou anatoxina Pode obter-se maior preciso levando em linha de conta a
determinado pelo nmero de unidades de antitoxina que, sequncia de floculao aps o 1 tubo. Assim, no exemplo
misturadas na amostra, produzem uma mistura floculante referido, se o 2 tubo a apresentar floculao o tubo D,
ptima (mtodo de aferio de Ramon). o ndice final relativo amostra diluda ser 52, e se for o
A experincia prtica demonstrou que a calibrao das tubo B o 2 tubo a apresentar floculao, o ndice final ser
antitoxinas em Unidades Internacionais (U.I.), por exemplo 48. O ensaio pode ser efectuado em duplicado com diluies
por comparao com padres internacionais de antitoxina, da amostra ligeiramente diferentes.
dependem do mtodo imunoqumico utilizado. Por essa
Se no existir qualquer indicao do ndice de Lf
razo, as antitoxinas utilizadas para a aferio de Ramon so
directamente calibradas por comparao com reagentes expectvel da amostra, aconselha-se obter uma estimativa
biolgicos internacionais de referncia para os ensaios de aproximada utilizando uma gama de diluies com maiores
floculao das anatoxinas diftrica ou tetnica, utilizando o concentraes de antitoxina nos tubos antes de efectuar o
ensaio descrito a seguir. A concentrao obtida a partir desta ensaio final.
padronizao pode ser indicada em equivalentes Lf/ml Exemplo
(eq-Lf/ml).
Tubo A B C D E F
Por definio, 1 Lf a quantidade de toxina ou anatoxina que
Concentrao de antitoxina
permite a mais rpida floculao em presena de 1 eq-Lf/ml
de antitoxina especfica. (eq-Lf) 20 30 45 70 100 150
Ajusta-se uma srie de volumes da preparao de referncia Os nveis de concentrao de toxina ou anatoxina e de
de antitoxina a uma concentrao de 100 eq-Lf/ml e reparte- antitoxina no ensaio podem variar mas este facto vai
-se numa srie de tubos de floculao com, por exemplo, afectar consideravelmente o tempo de floculao, pois
7 cm x 1 cm. Adiciona-se a cada tubo uma quantidade com concentraes muito baixas o ensaio ir durar muito
suficiente de uma soluo de cloreto de sdio R a 9 g/l para
tempo, enquanto que com concentraes muito elevadas,
obter um volume constante, por exemplo, 1 ml. Dilui-se a
a floculao corre o risco de sobrevir rapidamente o que
amostra para uma concentrao aproximada de cerca de
tornar difcil a distino entre o 1 e o 2 tubo a apresentar
50 Lf/ml e distribuem-se partes alquotas de 1 ml desta
floculao.
diluio, por exemplo, em cada um dos tubos contendo a
antitoxina. Misturam-se os tubos correctamente e colocam-
-se em banho de gua a uma temperatura entre 30C e 52C Aferio de baixas concentraes atravs de floculao aps
e observa-se a intervalos regulares para se detectar a primeira mistura
apario de flculos. Para esta observao pode ser necessrio
Nas concentraes muito baixas prefervel medir as toxinas
utilizar uma lupa e uma iluminao forte.
ou anatoxinas pelo mtodo de floculao aps mistura. Este
Regista-se a 1 e a 2 mistura a flocular e tambm o tempo mtodo consiste em comparar o ndice Lf de uma toxina ou
que decorreu at aparecer a 1 floculao. Podem flocular 2 de uma anatoxina conhecida, com a da mistura da amostra e
tubos simultaneamente. dessa toxina ou anatoxina.

2.7.28. Aferio de clulas progenitoras hematopoiticas formadoras de colnias
Nos casos de mistura de uma toxina ou anatoxina com ndice procedimentos de validao intra e inter laboratrios.
Lf conhecido e de uma toxina ou anatoxina com ndice de Identifica-se a origem dos materiais, incluindo os reagentes,
Lf desconhecido, o ndice Lf obtido corresponde soma dos os factores de crescimento e o material descartvel.
seus respectivos ndices se estes forem homogneos. Se se
Os principais factores de variabilidade na aferio das
misturam toxinas ou anatoxinas no homogneas, estas iro
CFC so o nmero de clulas semeadas e a identificao
produzir um perfil aberrante com 2 mximos de floculao.
das colnias. No mesmo ensaio, pode observar-se uma
2. Mtodos
variabilidade intra-laboratrio que pode ir at 15 por cento.

Analticos
Se for necessrio verificar o nmero de clulas formadoras

2.7.28. AFERIO DE CLULAS de colnia numa populao purificada de clulas, possvel
PROGENITORAS HEMATOPOITICAS utilizar a abordagem da diluio limite na qual o nmero
de poos positivos para a proliferao celular determinado
FORMADORAS DE COLNIAS atravs de um sistema automatizado.
O sistema hematopoitico representa uma extenso contnua Outra principal origem de variabilidade na aferio das
de clulas cujo fentipo e propriedades mudam durante a CFC provm da utilizao de materiais no definidos (por
sua progresso do estado de clulas estaminais ao de clulas exemplo, soro fetal de bovino ou soro albumina bovina).
diferenciadas. Estes produtos derivam de misturas de matrias-primas e
estimulam de forma no especifica a proliferao celular.
As clulas progenitoras hematopoiticas tm a propriedade No entanto, no raro haver lotes com caractersticas
de formar colnias ou pilhas celulares em culturas de meio particulares que estimulam selectivamente a proliferao de
semi-slido; so chamadas clonognicas. A quantificao linhas celulares especficas.
do nmero de clulas formadoras de colnia (CFC) num
produto celular constitui um indicador da capacidade Por ltimo, recomenda-se um baixo nvel de endotoxinas,
funcional das clulas progenitoras e um critrio presuntivo (inferior a 0,01 UI/ml ou inferior a 0,01 UI/mg) em todos
da reconstituio hematopoitica. O nmero de CFC os materiais utilizados na aferio clonognica porque
determinado est correlacionado com o nmero mnimo de nveis elevados podem provocar, numa primeira fase, um
clulas progenitoras presentes na amostra. desvio progressivo da expresso das linhas hematopoiticas
nas clulas e posteriormente uma inibio mais geral da
proliferao celular e da clonognese.
MARCADORES DA SUPERFCIE CELULAR
A capacidade das clulas formadoras de colnia de dar origem AFERIO CLONOGNICA DAS CFC
a colnias hematopoiticas in vitro e/ou de reconstituir o
sistema hematopoitico foi correlacionado com a expresso A aferio das CFC baseia-se na capacidade das clulas
dos antignios especficos da superfcie celular. A expresso progenitoras semeadas num meio semi-slido ou num gel, de
do antignio de membrana CD34 um marcador reconhecido formar uma colnia em presena de factores de crescimento
pela maior parte das clulas progenitoras e clulas estaminais especfico. Diferentes tipos de meios semi-slidos podem
hematopoiticas. ser utilizados (por exemplo, metilcelulose, colagnio, agar e
plasma-clot) dependendo da leitura de resultados pretendida.
Os meios disponveis comercialmente do em geral
ESPECIFICIDADE DA AFERIO DE COLNIAS resultados reprodutveis.
As clulas formadoras de colnia so identificadas de acordo
com a nomenclatura baseada nas linhas celulares maturas MATERIAIS
presentes nas colnias (por exemplo, CFU-mix, CFU-GEMM,
CFU-GM, CFU-M, BFU-E, CFU-E, CFU-Meg) e constituem Efectua-se a validao, pelo menos, dos seguintes materiais
uma populao de clulas progenitoras capazes de dar lugar crticos.
formao de colnias contendo uma ou mais linhas de clulas
hematopoiticas. Quando comparadas s clulas estaminais Factores de crescimento. Os factores de crescimento ao
mais imaturas, foi atribuda a esta populao de clulas mesmo tempo multipotentes (como o Kit-ligand ou o
progenitoras hematopoiticas humanas, uma capacidade de factor celular estaminal (SCF), a interleucina-3 , o factor
auto-renovao fraca ou nula. de estimulao de colnia do granulcito/macrfago
(GM-SCF)) e especficos para uma linha, (eritropoietina, o
A quantidade e o tipo de factores de crescimento fornecido
quando da cultura, modulam o tipo e o tamanho das colnias factor de estimulao de colnia do granulcito (GM-SCF))
formadas. so necessrios para se obter o maior nmero de colnias a
partir de uma suspenso celular contendo uma populao
O tempo necessrio diferenciao em clulas maturas in mista de clulas progenitoras hematopoiticas.
vitro proporciona uma maior especificidade na classe geral
das clulas progenitoras hematopoiticas e no seu potencial Outros componentes do meio. Os meios podem ser
relativo de proliferao. O tempo necessrio para as clulas suplementados com soro (nomeadamente soro fetal de
ps-natais formadoras de colnias gerarem uma colnia
bovino) e/ou albumina.
constituda por clulas maturas in vitro de 10-14 dias.
CULTURA CELULAR
SEGURANA DA QUALIDADE NA AFERIO DAS CFC
Clulas. A amostra colocada em cultura representativa do
A aplicao de uma abordagem estritamente normalizada produto celular injectado. Para esta aferio so necessrias
essencial na qualidade global da aferio das clulas suspenses celulares. No caso de aspirados da medula ssea,
formadoras de colnias. Recomenda-se por isso estas suspenses podem ser obtidas pela passagem forada da

2.7.29. Contagem e viabilidade das clulas nucleadas
medula ssea atravs de um tamis ou atravs de agulhas com suspenso celular. O processo de contagem celular pode
calibre cada vez mais pequeno. Passagens repetidas atravs ser efectuado manualmente (hemocitmetro) ou com um
de uma agulha de 21 gauges so geralmente suficientes para aparelho automatizado (por exemplo, contador de partculas,
dispersar agregados celulares com o objectivo de obter uma citometria de fluxo). Podem ser utilizados outros mtodos,
suspenso celular como os descritos a seguir.
SEMENTEIRA E CULTURA
2. Mtodos
Analticos
NMERO DE CLULAS
As clulas diludas no meio de cultura so misturadas ao
meio semi-slido. normal utilizar 1 ml da mistura semeado MTODOS MANUAIS DE CONTAGEM
numa placa de Petri estril no tratada ( 35 mm). Devido
viscosidade do meio, a soluo no pode ser semeada com Descrio do material e princpio do ensaio. necessrio o
pipetas de deslocao de ar sendo necessrio utilizar seringas material seguinte:
munidas de uma agulha de grande calibre ( 18 gauges). um hemocitmetro: cmara de contagem, apropriada
O nmero de clulas a semear depende da concentrao ao microscpio, disponvel em diferentes modelos.
em clulas progenitoras hematopoiticas na amostra. Para constitudo por uma lmina e uma lamela espessas,
evitar que uma colnia provenha de 2 clulas progenitoras montadas de modo a delimitar uma cmara com um
hematopoiticas diferentes, o nmero de clulas semeadas volume especfico definido para cada modelo. A lmina
deve permitir obter um nmero de colnias por placa espessa dos diferentes modelos de hemocitmetro inclui
( 35 mm) compreendido entre 40 e 80. O nmero de reas de contagem separadas por profundos sulcos para
colnias alvo por placa pode ser obtido tanto a partir evitar o arrastamento entre as clulas. A rea de contagem
da percentagem de CD34+ (ou concentrao em clulas gravada no vidro e contm uma grelha que especfica
CD34+/ml) determinada por citometria de fluxo (2.7.24), para cada modelo;
como a partir de diferentes diluies da suspenso celular
(geralmente ensaiam-se 2 concentraes). um microscpio ptico de baixa potncia 10 a 40 ,
Incube as placas em condies de aerobiose com uma pipetas de uma gama apropriada de volumes.
concentrao de 5 por cento de dixido de carbono, a 37C e O hemocitmetro utiliza-se para quantificar o nmero
uma atmosfera hmida (saturada) durante 10-14 dias. Com de clulas numa dada soluo, calculando a concentrao
precauo, porque o meio base de metilcelulose viscoso celular (C) utilizando a expresso seguinte:
mas no est gelificado, proceda em seguida contagem das
colnias num microscpio invertido. Uma placa inclinada
a 10n d
provoca a formao de colnias mistas e em forma de cometa,
o que susceptvel de falsear a contagem.
a = nmero de clulas contadas,
IDENTIFICAO DAS COLNIAS d = factor de diluio (nos casos apropriados),

n = factor varivel em funo do volume da cmara do
O tamanho e a estrutura das colnias dependem do tipo de hemocitmetro de acordo com o modelo especfico.
culturas maturas que as constituem. Uma concentrao de 50
clulas por colnia geralmente considerada como mnima. No caso de populaes celulares mistas, possvel distinguir
A presena de clulas hemoglubinizadas identifica as clulas as populaes entre elas, sob reserva de as clulas diferirem
progenitoras da linha eritride. Uma vez que a quantidade em tamanho ou em pigmentao (por exemplo, leuccitos e
de clulas maturas por cada linha depende em grande eritrcitos).
parte dos factores de crescimento adicionados cultura,
no se recomenda contagens diferenciadas, salvo indicao Preparao da cmara de contagem e anlise. Coloque
contrria. a lamela (ligeiramente humidificada nos bordos) sobre
a lmina. Arraste a lamela de diante para trs sobre a
EXPRESSO DOS RESULTADOS lmina, pressionando ligeiramente sobre os lados. Prepare
uma diluio apropriada da suspenso celular em tampo
Os resultados das culturas das CFC so habitualmente isotnico ou em tampo de lise dos eritrcitos.
expressos como a mdia aritmtica das colnias contadas Junte um volume apropriado da diluio na cmara de
durante o ensaio em 3 placas, pelo menos. O nmero mdio contagem. O lquido depositado no bordo da lamela
de colnias depois relacionado com 104 ou 105 clulas e escoado por capilaridade para o interior das reas de
nucleadas viveis colocadas em cultura. contagem. Coloque cuidadosamente o hemocitmetro sob
o microscpio e foque. Conte as clulas de cada uma das
reas. Calcule a concentrao celular na amostra diluda e na
2.7.29. Contagem e viabilidade primeira amostra.
das clulas nucleaDAS Para uma maior exactido da medio, importante respeitar
as seguintes precaues fundamentais:
A avaliao da qualidade das suspenses celulares requer
determinaes exactas, da concentrao celular e da utilize apenas lamelas de espessura apropriada;
percentagem de clulas viveis. Estes dados so essenciais sempre que possvel, contar mais de 100 clulas (tendo
ao processo da tomada de deciso para a preparao em conta, se necessrio, um maior nmero de reas de
de produtos celulares e para a manuteno ptima das
contagem);
condies de cultura. A contagem e a viabilidade das
clulas podem ser expressas em funo do volume da se forem detectados agregados celulares (se a suspenso

celular no for monocelular), torne a suspender as clulas influenciada pelo pH, num intervalo entre 6,6 e 7,6. A fixao
antes da aferio e repita a contagem; considera-se ptima a pH 7,5. So validadas outras condies,
como a concentrao do corante e a durao da colorao.
evite o enchimento insuficiente ou excessivo da cmara;
doutro modo o volume no exacto. Condies de conservao do corante. Geralmente utiliza-se
uma soluo de azul de tripano a 0,4 por cento ou a 0,5 por
MTODOS AUTOMATIZADOS DE CONTAGEM cento numa soluo salina tamponada de fosfato. Conserve a
2. Mtodos
Analticos
soluo ao abrigo da luz e do ar.

Contadores de partculas baseados na variao da Preparao do ensaio e anlise. Core a suspenso celular na
condutividade. Os instrumentos do contador electrnico diluio exigida (geralmente numa soluo salina tamponada
de partculas medem o tamanho e o nmero das partculas de fosfato) com uma soluo de, por exemplo, 0,1 por cento
numa soluo. a 0,2 por cento de azul tripano. Misture suavemente. Incube,
Os contadores de partculas, antes de serem utilizados so no mximo, durante 2-4 mm temperatura ambiente.
aferidos com uma soluo de partculas com tamanho e Misture suavemente e coloque um volume apropriado da
com concentrao conhecidas. Para permitir a contagem soluo numa cmara de contagem. Inicie a contagem
de partculas maiores, esto disponveis tubos munidos imediatamente.
de orifcios com diferentes calibres. Estes aparelhos no Determine a percentagem de clulas viveis a partir
permitem fazer a distino entre as clulas mortas e vivas. Os da relao entre o nmero de clulas no coradas e o
fragmentos celulares podem igualmente gerar impulsos e ser nmero total de clulas observadas ao microscpio ptico,
assim a origem de erros. Os contadores so tambm providos considerando que todas as clulas coradas so mortas. A
de um sistema de controlo do limiar, permitindo apenas viabilidade (V) exprime-se em percentagem e calcula-se
serem contadas as partculas maiores. utilizando a expresso seguinte:
O aparelho deve ser qualificado para a contagem do produto
celular (em termos de linearidade, exactido, ...). n 100
N
Contadores de partculas baseados na citometria de fluxo
(2.7.24). A citometria de fluxo deve ser aferida com partculas n = nmero de clulas no coradas (viveis)
de referncia com tamanho e com concentrao conhecidas
para dar um nmero absoluto de clulas por volume. N = nmero total de clulas (coradas e no coradas)
Contudo, para determinados instrumentos que utilizam 2 essencial que o perodo de incubao seja, no mximo, de
elctrodos inseridos na cmara de aferio, no necessria 4 mm visto que o nmero de clulas coradas pode aumentar
uma soluo de aferio. As dimenses da cmara de aferio de modo significativo aps esse tempo. Para efectuar uma nova
e a distncia entre os 2 elctrodos so fixas e permitem medir determinao, pode ser necessrio preparar um novo ensaio.
o contedo de um volume fixado. Aps a regulao inicial,
raramente necessrio aferir este tipo de instrumentos.
MTODOS AUTOMATIZADOS
VIABILIDADE Citometria de fluxo

Princpio do ensaio. O ensaio baseia-se na capacidade de
Esta seco aplica-se marcao celular utilizando corantes determinados marcadores atravessarem as membranas
da viabilidade e anlise manual ou automatizada no danificadas e ligarem-se ao ADN por intercalao entre
microscpio ptico ou por citometria de fluxo, de uma as bases, de tal modo que as clulas mortas apresentam
suspenso celular de modo a determinar a percentagem fluorescncia e podem ser detectadas por citometria de
de clulas viveis. Conforme o tipo de clulas e o mtodo fluxo (2.7.24). As clulas no viveis, positivas ao marcador,
utilizado, os resultados podem diferir. so avaliadas e discriminadas enquanto que as clulas
viveis permanecem no coradas. Esta anlise geralmente
MTODO MANUAL POR COLORAO DE EXCLUSO efectuada com a 7-aminoactinomicina D (7-AAD) ou com o
iodeto de propdio (IP), mas podem igualmente ser utilizados
Princpio do ensaio. Este ensaio baseia-se na excluso do outros marcadores apropriados.
corante pelas clulas viveis enquanto que as clulas mortas
Marcador. A 7-AAD e o IP so propostos como exemplos, de
ou danificadas absorvem o corante e so coradas. Fornece
molculas s quais a membrana impermevel e que podem
informaes sobre a integridade da membrana citoplsmica
ser utilizados como marcadores da viabilidade.
mas os resultados no reflectem necessariamente a
funcionalidade celular. As clulas vivas recentemente tratadas A 7-AAD um anlogo da actinomicina D que contm
com tripsina ou as clulas descongeladas podem apresentar uma funo amina substituida na posio 7 do cromforo.
membranas permeveis que absorvem o corante. Intercala-se entre as bases citosina e guanina do ADN. As
propriedades espectrais da 7-AAD tornam esta molcula
Corante. O azul de tripano o corante mais correntemente
particularmente apropriada para uma anlise por citometria.
utilizado para distinguir as clulas viveis das no viveis,
A absoro mxima do complexo 7-AAD/ADN situa-se na
mas podem ser utilizados outros corantes apropriados, como
regio espectral verde e por conseguinte apropriada a um
a eritrosina B ou a nigrosina. O azul de tripano um corante
citmetro equipado com um laser de rgon (comprimento
cido (Mr 961), e contm um anio com 4 grupos sulfonato
de onda de excitao de 488 nm). A emisso de fluorescncia
que podem facilmente ligar-se s protenas. A concentrao
vermelha escura do marcador da viabilidade 7-AAD (635 nm a
em protenas da amostra deve ser tambm a mais baixa
675 nm) facilita a utilizao da sonda em combinao com os
possvel.
anticorpos conjugados ao isotiocianato de fluorescena (ITCF)
Condies do ensaio. A fixao do corante fortemente ou ficoeritrina (PE) porque em relao ao IP, o complexo

7-AAD/ADN apresenta uma sobreposio minima com o ITCF Se necessrio, a lise dos eritrcitos efectua-se utilizando, por
e a PE. exemplo, o cloreto de amnio. Caso contrrio, junte apenas
um tampo.
O IP liga-se cadeia dupla do ADN intercalando-se entre
as bases com pouca ou nenhuma preferncia entre as As percentagens de clulas viveis so dadas directamente
sequncias e com uma estequiometria de 1 molcula de pelo citmetro de fluxo e deduzidas a partir da anlise das
marcador por 4-5 pares de bases de ADN. O marcador clulas positivas (clulas mortas) no citograma SST7-AAD ou
2. Mtodos
Analticos
uma vez fixado aos cidos nucleicos, a sua fluorescncia SS/PI (histogramas biparamtricos).
multiplica-se por um factor 20 a 30, o mximo de excitao
da fluorescncia desvia-se cerca de 30-40 nm para o vermelho As testemunhas positivas podem ser constitudas por clulas
e o mximo de emisso da fluorescncia (615 nm) desvia- estabilizadas (clulas mortas) misturadas segundo um valor
-se cerca de 15 nm para o azul. Embora a sua absorvncia alvo s clulas frescas viveis.
especfica seja bastante baixa, o IP apresenta um desvio de
Stokes suficientemente importante para permitir a deteco Imagens digitais das clulas coradas. O desenvolvimento
simultnea dos cidos nucleicos e dos anticorpos marcados da imagem digital tem permitido automatizar os mtodos
com a fluoresceina, desde que sejam utilizados filtros pticos de colorao de excluso. A suspenso celular e a soluo
apropriados. do corante da viabilidade, so directamente misturados
por um aparelho. O sistema, que permite a aspirao da
Condies de conservao da soluo do marcador dos
cidos nucleicos: Conserve a soluo a 5 3 C. amostra, a manipulao do reagente e a posterior lavagem dos
instrumentos, completamente automatizado. A suspenso
Preparao do ensaio e anlise. No caso de clulas celular uma vez aspirada e misturada soluo corante,
hematopoiticas, o corante pode ser adicionado aps enviada numa cmara celular para imagem. A suspenso
marcao das CD45 para obter uma melhor separao celular corada aspirada atravs de uma cmara na qual uma
entre as clulas e os fragmentos ou plaquetas devido a uma luz estroboscpica permite a uma cmara fotografar as clulas
estratgia de janela baseada na disperso lateral das clulas circulantes. As imagens so digitalizadas e conta-se o nmero
CD45 positivas (SS/CD45+). As condies de incubao da de clulas mortas ou vivas, por aplicao informtica.
suspenso celular com o marcador so validadas previamente.
A incubao efectua-se temperatura ambiente no escuro.

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.7 AFERIES BIOLGICAS (NDICE)
Analticos

2.8. MTODOS DE
FARMACOGNOSIA
2. Mtodos
Analticos
2.8. Mtodos de farmacognosia 277 2.8.11. Doseamento do 1,8-cineol nos leos essenciais 278
2.8.1. Cinzas insolveis no cido clordrico 277 2.8.12. Doseamento dos leos essenciais nos frmacos
2.8.2. Elementos estranhos 277 vegetais 279
2.8.3. Estomas e ndice de estomas 277 2.8.13. Resduos de pesticidas 280
2.8.4. ndice de intumescncia 277 2.8.14. Determinao dos taninos nos frmacos
2.8.5. gua nos leos essenciais 277 vegetais 283
2.8.6. steres estranhos nos leos essenciais 278 2.8.15. ndice de amargor 283
2.8.7. leos gordos e leos essenciais 278 2.8.16. Resduo seco dos extractos 284
resinificados nos leos essenciais 278 2.8.17. Perda por secagem dos extractos 284
2.8.8. Cheiro e sabor dos leos essenciais 278 2.8.18. Doseamento da aflatoxina B1 nos frmacos
2.8.9. Resduo de evaporao dos leos vegetais 284
essenciais 278 2.8.20. Amostragem e preparao de amostras de
2.8.10. Solubilidade dos leos essenciais no lcool 278 frmacos vegetais 286

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.8 MTODOS DE FARMACOGNOSIA (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.8 MTODOS DE FARMACOGNOSIA (NDICE)
2.8.5. gua nos leos essenciais
2.8. MTODOS DE
FARMACOGNOSIA
2.8.1. CINZAS INSOLVEIS NO CIDO
2. Mtodos
Analticos
CLORDRICO
As cinzas insolveis no cido clordrico so constitudas
pelo resduo resultante das cinzas sulfricas ou das cinzas
totais, aps extraco pelo cido clordrico, e calculadas
relativamente a 100 g de frmaco.
Adicione, no cadinho, ao resduo obtido na determinao
das cinzas sulfricas ou totais 15 ml de gua R e 10 ml
de cido clordrico R. Cubra o cadinho com um vidro de
relgio, aquea e mantenha em ebulio suave durante 10
minutos. Deixe arrefecer, filtre por um filtro sem cinzas,
arraste o resduo e lave-o com gua R quente at que o FIGURA 1
filtrado acuse reaco neutra. Seque o filtro, incinere ao
rubro sombrio, deixe arrefecer num exsicador e pese. Repita 3) O tipo diactico (clulas transversais), em que os estomas
a incinerao at que a diferena entre duas pesagens esto acompanhados por 2 clulas anexas cujas paredes
consecutivas no exceda 1 mg. comuns formam um ngulo recto com as clulas guardas
dos estomas.
4) O tipo paractico (clulas paralelas), em que os estomas
2.8.2. ELEMENTOS ESTRANHOS apresentam de cada lado uma ou vrias clulas anexas
paralelas ao eixo longitudinal do ostolo e clulas guardas
Os frmacos vegetais so, tanto quanto possvel, isentas de dos estomas.
fungos, de insectos e de outras contaminaes de origem
animal. Salvo indicao em contrrio, a percentagem de NDICE DE ESTOMAS
elementos estranhos no superior a 2 por cento m/m.
Os elementos estranhos so constitudos, no todo ou em dado pela frmula (100 S) / (E + S), em que S o
parte, pelas seguintes matrias: nmero de estomas numa determinada superfcie da
folha e E o nmero de clulas epidrmicas, incluindo
1) partes estranhas: qualquer elemento proveniente da planta os tricomas, existentes na mesma superfcie da folha.
me mas que no seja constituinte do frmaco vegetal, Para cada amostra de folhas, calcule a mdia de 10
determinaes, no mnimo.
2) matrias estranhas: qualquer elemento estranho planta
me, de origem vegetal ou mineral.
2.8.4. NDICE DE INTUMESCNCIA
DETERMINAO DOS ELEMENTOS ESTRANHOS O ndice de intumescncia o volume em mililitros ocupado
por 1 g de frmaco, nele incluindo a mucilagem que adere, o
Pese entre 100 e 500 g de amostra ou a quantidade mnima qual foi posto a intumescer num lquido aquoso durante 4 h.
indicada na monografia respectiva e espalhe em camada
delgada. Os elementos estranhos so detectados vista Numa proveta graduada, de 25 ml, com rolha esmerilada,
desarmada ou com o auxlio de uma lupa (6 ). Separe os cuja graduao em 0,5 ml ocupe, aproximadamente, uma
elementos estranhos, pese-os e calcule a percentagem. altura de 125 5 mm introduza 1,0 g de frmaco inteiro ou
no estado de diviso indicado na respectiva monografia. Salvo
indicao em contrrio, humedea o frmaco com 1,0 ml
de lcool R e junte 25 ml de gua R. Rolhe a proveta. Agite
2.8.3. ESTOMAS E NDICE energicamente de 10 em 10 minutos, durante 1 hora. Deixe
DE ESTOMAS em repouso durante 3 horas. 1 hora e 30 minutos aps o
incio do ensaio, elimine, por rotao volta do eixo vertical,
ESTOMAS o mximo de lquido retido superfcie do frmaco ou as
partculas deste que flutuam superfcie do lquido. Mea o
volume ocupado pelo frmaco, incluindo nele a mucilagem
Entre os tipos de estomas (ver figura 1), que se distinguem
que lhe adere. Efectue 3 ensaios simultaneamente.
pela forma e disposio das clulas que os rodeiam, temos:
O ndice de intumescncia obtido determinando a mdia
1) O tipo anomoctico (clulas irregulares), o qual se dos 3 ensaios.
caracteriza por os estomas estarem rodeados por um
nmero varivel de clulas que no diferem, em geral, em
nenhuma caracterstica das outras clulas da epiderme.
2.8.5. GUA NOS LEOS ESSENCIAIS
2) O tipo anisoctico (clulas desiguais), em que os estomas
esto normalmente rodeados por 3 clulas anexas, sendo Misture 10 gotas de essncia com 1 ml de sulfureto
uma delas nitidamente mais pequena que as outras. de carbono R. A soluo fica lmpida aps repouso.

2.8.11. Doseamento do 1,8-cineol nos leos essenciais
2.8.6. STERES ESTRANHOS Durante o ensaio, o nvel da gua no banho conserva-se

constante, a cerca de 50 mm abaixo da tampa.
NOS LEOS ESSENCIAIS
Aquea durante 2 minutos, em banho de gua, 1 ml de leo 2.8.10. SOLUBILIDADE DOS LEOS
essencial com 3,0 ml de soluo extempornea de hidrxido
de potssio R a 100 g/l em lcool R. No se formam cristais
ESSENCIAIS NO LCOOL
2. Mtodos
Analticos
durante os 30 minutos seguintes, mesmo aps arrefecimento.

Introduza numa proveta com rolha, de 25 ou 30 ml de
capacidade, 1,0 ml da amostra. Coloque a proveta num
termostato regulado a 20 2C. Utilizando uma bureta de,
2.8.7. LEOS GORDOS E LEOS pelo menos, 20 ml adicione fraces de 0,1 ml do lcool
ESSENCIAIS RESINIFICADOS de ttulo indicado na respectiva monografia at completa
NOS LEOS ESSENCIAIS dissoluo, continuando depois a adicion-lo em fraces
de 0,5 ml at perfazer 20 ml, agitando com frequncia e
Deixe cair uma gota de essncia num fragmento de papel energicamente. Obtida uma soluo lmpida, registe o
de filtro; a gota evapora-se completamente em 24 horas volume de lcool gasto e continue a adio deste como se
sem deixar mancha translcida ou gordurosa. indica atrs. Se a soluo turvar ou se tornar opalescente
antes que se tenha gasto um volume adicional de 20 ml,
registe o volume no momento em que isso se verifique.
2.8.8. CHEIRO E SABOR DOS LEOS Continue a adio do lcool e, se a turvao ou a opalescncia
ESSENCIAIS desaparecerem, registe o volume de lcool gasto.
Se no se obtiver uma soluo lmpida aps a adio de 20 ml
Misture 3 gotas de essncia com 5 ml de lcool a 90 por cento de lcool do ttulo indicado, repita o ensaio utilizando um
V/V R e agite com 10 g de sacarose R pulverizada. O cheiro e lcool de ttulo mais elevado.
o sabor so semelhantes aos da planta ou das partes da planta
a partir das quais o leo essencial obtido. Um leo essencial diz-se solvel em n volumes ou mais
de lcool de um determinado ttulo t se a soluo lmpida
em n volumes permanece lmpida comparada com o leo
2.8.9. RESDUO DE EVAPORAO essencial no diludo, aps adio progressiva de novas
DOS LEOS ESSENCIAIS quantidades de lcool do mesmo ttulo, at ao total de 20
volumes de lcool.
O resduo de evaporao de leo essencial expresso em Um leo essencial diz-se solvel em n volumes de lcool de
gramas por 100 g de leo essencial evaporado em banho um determinado ttulo t, tornando-se turvo aps diluio,
de gua nas condies a seguir especificadas. se a soluo lmpida em n volumes se torna turva em n1
Aparelho. O aparelho (ver figura 2) constitudo por: volumes (n1 inferior a 20) e se continua turva aps adio
progressiva de novas quantidades de lcool do mesmo ttulo,
um banho de gua com uma tampa tendo orifcios de 7 mm at totalizar 20 volumes de lcool.
de dimetro,
Um leo essencial diz-se solvel em n volumes de lcool de
uma cpsula de evaporao de vidro termo-resistente e
um determinado ttulo t, com turvao compreendida entre
inerte ao material a ensaiar,
n1 e n2 volumes se a soluo lmpida em n volumes se torna
um exsicador. turva em n1 volumes (n1 inferior a 20) e permanece turva
aps adio progressiva de novas quantidades de lcool do
Mtodo. Pese a cpsula de evaporao, aps t-la aquecido
em banho de gua durante 1 hora e deixado arrefecer em mesmo ttulo, at totalizar n2 volumes de lcool, tornando-
exsicador. Salvo indicao em contrrio, pese na cpsula -se ento novamente lmpida (n2 inferior a 20).
5,00 g de leo essencial. Evapore a banho de gua, ao abrigo Um leo essencial diz-se solvel com opalescncia se a
de correntes de ar, durante o tempo indicado na monografia. soluo alcolica apresenta a mesma colorao azulada que
Deixe arrefecer em exsicador e torne a pesar. uma soluo opalescente preparada extemporaneamente do
seguinte modo: misture 0,5 ml de soluo de nitrato de prata
R2 com 0,05 ml de cido ntrico R e junte 50 ml de soluo
de cloreto de sdio R a 12 mg/l; misture e deixe em repouso
ao abrigo da luz durante 5 min.
2.8.11. DOSEAMENTO DO 1,8-CINEOL

NOS LEOS ESSENCIAIS
Num tubo bem seco, junte 3,00 g de leo essencial
recentemente exsicado com sulfato de sdio anidro R e 2,10 g
de cresol R fundido. Coloque o tubo no aparelho para a
determinao do ponto de solidificao (2.2.18). Deixe cristalizar
por arrefecimento, agitando continuamente. Quando se inicia
a cristalizao verifica-se uma ligeira subida da temperatura.
Registe o valor mximo t1 obtido.
FIGURA 2
Dimenses em milimetros Funda de novo a mistura num banho de gua aquecido a
uma temperatura que no ultrapasse o valor de t1 em mais

2.8.12. Doseamento dos leos essenciais nos frmacos vegetais
de 5C. Coloque o tubo, de novo, no aparelho e mantenha uma dilatao (J) de 3 ml,
a temperatura 5C abaixo de t1. Quando a cristalizao
comear ou quando a temperatura da mistura descer 3C a dilatao (L) em forma de esfera, com a capacidade
abaixo de t1, agite a mistura continuamente. Registe a aproximada de 2 ml,
temperatura mxima qual a mistura cristaliza, t2. Repita a a torneira (M) de 3 vias,
determinao at que os dois valores mximos obtidos para
t2 no se afastem mais de 0,2C. Em caso de sobrefuso, a juno (B) a um nvel superior de 20 mm acima da
2. Mtodos
Analticos
provoque a cristalizao juntando mistura um pequeno graduao,
cristal do complexo constitudo por 3,00 g de cineol R
c) um dispositivo de aquecimento apropriado permitindo
e 2,10 g de cresol R fundido. Se o valor t2 for inferior a
uma regulao precisa,
27,4C, repita o doseamento aps ter adicionado 5,10 g do
complexo atrs referido. d) um suporte vertical com um anel horizontal coberto com
um material isolante.
O teor em cineol correspondente temperatura mxima
observada t2 est indicado no quadro junto. Se se tiver
adicionado mistura 5,10 g do complexo, calcule o teor de
cineol, expresso em percentagem m/m custa da expresso
2(A-50), em que A o valor indicado no quadro 1.
Nos casos em que a temperatura mxima observada t2
no venha indicada no quadro, o teor em cineol que lhe
corresponde ser calculado por interpolao.
QUADRO 1
Percentagem Percentagem Percentagem Percentagem
t2C m/m t2C m/m t2C m/m t2C m/m
em cineol em cineol em cineol em cineol
24 45,5 32 56,0 40 67,0 48 82,0
25 47,0 33 57,0 41 68,5 49 84,0
26 48,5 34 58,5 42 70,0 50 86,0
27 49,5 35 60,0 43 72,5 51 88,5
28 50,5 36 61,0 44 74,0 52 91,0
29 52,0 37 62,5 45 76,0 53 93,5
30 53,5 38 63,5 46 78,0 54 96,0
31 54,5 39 65,0 47 80,0 55 99,0
2.8.12. DOSEAMENTO DOS LEOS

ESSENCIAIS NOS FRMACOS
VEGETAIS
A determinao do teor em leos essenciais dos frmacos
vegetais efectua-se por arrastamento pelo vapor de gua,
num aparelho especial, nas condies que a seguir se
precisam. O destilado recolhido num tubo graduado, em FIGURA 3 Aparelho para o doseamento de leos essenciais nos
presena de xileno para fixar o leo essencial, enquanto que frmacos vegetais.
a fraco aquosa volta, automaticamente, ao balo gerador Dimenses em milmetro
de vapor.
Mtodo. Utilize um aparelho perfeitamente limpo. Proceda
Aparelho. O aparelho compreende: ao doseamento segundo a natureza do frmaco em ensaio.
No balo introduza o volume de lquido indicado para o
a) um balo apropriado de fundo redondo, de colo curto
arrastamento pelo vapor e alguns fragmentos de material
esmerilado, tendo um dimetro interior de cerca de
poroso. Adapte ao balo o aparelho de condensao. Deite
29 mm na extremidade mais larga, gua R pelo tubo de enchimento N at afloramento em B.
b) um aparelho de condensao (ver figura 3) que se adapta Tire a rolha K e introduza a quantidade prescrita de xileno
perfeitamente ao balo, formado pelas seguintes peas de R com uma pipeta, levando a ponta at ao extremo do tubo
vidro de baixa dilatao trmica: K. Volte a colocar a rolha K, verificando que os dois orifcios
coincidem. Aquea o lquido do balo at ao comeo da
a rolha (K) oca e a tubuladura (K) de 10 mm de ebulio e destile velocidade de 2 a 3 ml por minuto, salvo
dimetro interior na parte mais larga do tubo indicao em contrrio.
esmerilado, tendo um orifcio com cerca de 1 mm de
dimetro, na zona correspondente parte oca, Para determinar a velocidade de destilao, baixe o
nvel da agua por meio da torneira de 3 vias durante a
o tubo graduado (JL) dividido em 0,01 ml e com 2 destilao, de maneira que o menisco chegue ao trao
marcas (H e J) acima da graduao, (a) (ver figura 4).
2.8.13. Resduos de pesticidas
Feche em seguida a torneira e determine o tempo necessrio 2 nem nas directivas comunitrias so calculados usando a
para o enchimento do tubo at ao trao (b) superior. Abra a seguinte expresso:
torneira e continue a destilao. Modifique o aquecimento DJA M
para regular a velocidade de destilao. Destile durante MDD 100
30 min. Pare o aquecimento e leia o volume de xileno no
tubo graduado. No balo, introduza a quantidade de droga DJA = dose diria admissvel pela FAO / OMS, em miligramas por
prescrita e proceda ao arrastamento pelo vapor, como acima
2. Mtodos
quilograma de massa corporal,

Analticos
se descreve, durante o tempo e velocidade indicados. Aps M = massa corporal, em quilogramas (60 kg),
10 min leia o volume de lquido recolhido no tubo graduado.
Subtraia do volume total o volume de xileno determinado MDD = consumo dirio do frmaco, em quilogramas.
precedentemente. A diferena representa a quantidade de Se o frmaco se destina preparao de extractos, tinturas ou
leo essencial na quantidade de frmaco utilizada no ensaio. outras formas farmacuticas cujo modo de preparao possa
Calcule o resultado em mililitros por 1000 g de droga. influir no teor em pesticidas do produto final, os limites so
Quando o leo essencial destinado a outras operaes calculados usando a seguinte expresso:
analticas, a mistura xileno-leo essencial isenta de gua
DJA M E
pode ser recuperada como a seguir se indica. Tire a rolha
K e introduza 0,1 ml de uma soluo de fluoresceinato de MDD 100
sdio R a 1 g/l e 0,5 ml de gua R. Baixe o nvel da mistura E = coeficiente de extraco do mtodo de preparao, determinado
xileno-leo essencial na dilatao L por meio da torneira experimentalmente.
de 3 vias. Deixe em repouso durante 5 min e em seguida
deixe a mistura escoar lentamente, exactamente at ao nvel Em casos excepcionais podem igualmente ser autorizados
da torneira M. Abra a torneira no sentido dos ponteiros limites mais elevados, nomeadamente quando uma planta
do relgio de maneira que a gua possa escoar-se do tubo exige uma cultura particular, ou apresenta um metabolismo
de comunicao BM. Lave este ltimo com acetona R e ou uma estrutura que possa levar a um teor de pesticida
depois com um pouco de tolueno R, introduzidos pelo tubo superior ao normal.
de enchimento N. Rode em seguida a torneira no mesmo
QUADRO 2
sentido, a fim de recuperar a mistura xileno-leo essencial
em frasco apropriado. Tolerncia
Substncia
em mg/kg
Alacloro 0,02
Aldrina e Dialdrina (mistura de) 0,05
Azinfos-metilo 1,0
Bromopropilato 3,0
Cipermetrina (e ismeros) 1,0
Clordano (mistura dos ismeros cis, trans e oxiclordano) 0,05
Clorofenvinfos 0,5
Cloropirifos 0,2
Cloropirifos-metilo 0,1
DDT (mistura de p,p-DDT, o,p-DDT, p,p-DDE e p,p-TDE) 1,0
FIGURA 4 Deltametrina 0,5
Diazino 0,5
Diclorvos 1,0
2.8.13. RESDUOS DE PESTICIDAS Ditiocarbamatos (em CS2) 2,0
Endossulfano (mistura dos ismeros e de sultato de
endossulfano) 3,0
Definio. Considera-se como pesticida qualquer substncia
Endrina 0,05
ou associao de substncias destinadas a prevenir, destruir
Etio 2,0
ou combater as pragas e as espcies indesejveis de plantas Fenitrotio 0,5
ou de animais que causem danos ou sejam nocivas durante a Fenvalerato 1,5
produo, a transformao, a armazenagem, o transporte ou Fonofos 0,05
a distribuio de frmacos de origem vegetal. Englobam-se Fosalona 0,1
ainda as substncias a ser utilizadas quer como reguladoras Heptacloro (mistura de heptacloro e de heptacloro-epxido) 0,05
do crescimento de plantas, quer como desfolhantes ou Hexaclorobenzeno 0,1
agentes secantes, assim como substncias aplicadas nas Hexaclorociclo-hexano Ismeros (diferentes de ) 0,3
culturas, antes ou depois da colheita, para proteger os Lindano ( Hexaclorociclo-hexano) 0,6
produtos contra a deteriorao durante a armazenagem e o Malatio 1,0
transporte. Metidatio 0,2
Paratio 0,5
Paratio-metilo 0,2
Limites. Salvo indicao em contrrio na monografia, a
Permetrina 1,0
amostra satisfaz pelo menos os limites indicados no quadro
Piperonilo-butxido 3,0
2. Os limites aplicados aos pesticidas que no figurem neste
Piretrinas (mistura de) 3,0
quadro mas de que se suspeite a presena, so estabelecidos
Pirimifos-metilo 4,0
na base dos limites fixados pelas directivas 76/895 e 90/642 Quintozeno (mistura de quintozeno, pentacloroanilina
da Unio Europeia, seus anexos e sucessivas actualizaes. Os e sulfureto de metilpentaclorofenil 1,0
limites aplicados aos pesticidas que no figurem no quadro

As autoridades competentes podem dispensar o ensaio, total a concentrao das solues das amostras e das solues
ou parcialmente, quando conhecida a histria completa padro e a regulao da aparelhagem so tais que os picos
do tratamento do lote (natureza e quantidade dos pesticidas se situem na parte linear da resposta do detector.
usados, data de cada tratamento durante a cultura e depois da
colheita) e pode ser controlado de uma maneira exacta. QUADRO 3
Concentrao do analito Repetibilidade Reprodutibilidade
2. Mtodos
Analticos
Recolha da amostra a analisar. (mg/kg) (diferena mg/kg) (diferena mg/kg)
Mtodo. Para embalagens cujo contedo seja inferior a 1 kg,
0,010 0,005 0,01
tome uma amostra do produto total bem homogeneizado, em
quantidade suficiente para o ensaio. Para embalagens cujos 0,100 0,025 0,05
1,000 0,125 0,25
contedos estejam compreendidos entre 1 kg e 5 kg, tome
uma amostra da parte superior, outra da intermdia e outra
da inferior da embalagem, sendo as 3 amostras de volumes
sensivelmente idnticos e em quantidade suficiente para a MTODOS DE ANLISE
realizao dos ensaios; misture cuidadosamente as amostras
e, da mistura, tome uma quantidade suficiente para realizar DOS RESDUOS DE PESTICIDAS
os ensaios. Para embalagens cujo contedo seja superior a
5 kg, tome amostras de, pelo menos, 250 g, sendo uma da INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS,
parte superior, outra da intermdia e outra da inferior da
ORGANOCLORADOS E PIRETRINIDES
embalagem; misture cuidadosamente as 3 amostras e, da
mistura, tome uma quantidade suficiente para realizar os
Os mtodos analticos a seguir descritos podem ser
ensaios.
utilizados para a pesquisa de pesticidas. Segundo
Nmero de amostras. Se o nmero (n) de embalagens for a substncia em ensaio, pode ser necessrio fazer
inferior ou igual a 3, tome uma amostra de cada embalagem modificaes, s vezes importantes, no mtodo descrito.
da maneira descrita em Mtodo, para os diferentes ensaios. Pode, em todo o caso, ser necessrio utilizar mais uma
Se o nmero de embalagens for superior_ a 3, efectue a coluna de polaridade diferente ou um outro mtodo de
amostragem de acordo com a frmula n + 1, arredondando deteco (espectrometria de massa) ou, ainda uma outra
para o nmero inteiro imediatamente superior. Para se tcnica (mtodos imunoqumicos) para confirmar os
evitarem alteraes qumicas ou fsicas da amostra, esta resultados obtidos.
analisada de imediato e, se no for possvel, a amostra A tcnica descrita a seguir s se aplica aos frmacos vegetais
conservada em recipientes estanques para alimentos, ao cujo teor em gua seja inferior a 15 por cento. Os frmacos
abrigo da luz e a uma temperatura inferior a 0C. vegetais com teor em gua mais elevado podem ser secos
desde que o mtodo de secagem a usar tenha demonstrado
Reagentes. Os reagentes e os solventes so isentos de que no afecta significativamente o teor em pesticidas.
qualquer contaminao, especialmente pesticidas, susceptvel
de interferir com os resultados das anlises. Muitas vezes 1. Extraco. Macere durante 20 min 10 g da amostra
necessrio utilizar solventes de qualidade especial ou, no os grosseiramente pulverizada em 100 ml de acetona R. Junte
havendo, solventes recentemente redestilados em aparelho de 1 ml de soluo a 1,8 g por mililitro de carbofenotio R
vidro. So sempre necessrios ensaios em branco. em tolueno R. Homogenize com um misturador de alta
velocidade durante 3 min. Filtre e lave o filtro e o seu
contedo 2 vezes com 25 ml de acetona R de cada vez. Rena
Aparelhagem. Lavam-se os equipamentos, nomeadamente os
o filtrado e o solvente utilizado para a lavagem e evapore
de vidro, de maneira a retirar qualquer resduo de pesticida,
quase secura num evaporador rotativo a temperatura
mergulhando-os durante pelo menos 16 h numa soluo de
inferior a 40C. Junte alguns mililitros de tolueno R e
detergente isento de fosfatos, lavando-os abundantemente
evapore de novo at completa eliminao da acetona. Dissolva
com gua destilada e, depois, lavando-os com acetona e com
o resduo em 8 ml de tolueno R. Filtre por um filtro de
hexano ou heptano.
membrana (45 m), lave o balo e o filtro com tolueno R e
complete 10,0 ml com o mesmo solvente (soluo A).
Anlise qualitativa e quantitativa de resduos de pesticidas.
Os processos analticos usados so validados de acordo com 2. Purificao
as normas em vigor e, em particular, satisfazem os seguintes
2.1. Insecticidas organofosforados, organoclorados e
critrios:
piretrinides. Proceda por cromatografia de excluso (2.2.30).
o mtodo escolhido, especialmente as fases de purificao,
conveniente para a substncia em anlise e nenhum
efeito resultante dos co-extractos susceptvel de uma coluna de ao inoxidvel de 0,30 m de comprimento
interferir com os resultados. Os limites de deteco e de e 7,8 mm de dimetro interno cheia com copolmero
quantificao so conhecidos para cada pesticida na matriz estirenodivinilbenzeno R (5 m),
considerada,
como fase mvel, com um dbito de 1 ml/min, tolueno R.
os resultados oscilam entre 70 e 110 por cento para cada
Capacidades da coluna. Injecte 100 l de uma soluo a
pesticida,
0,5 g/l de vermelho de metilo R e a 0,5 g/l de azul de oracet
a reprodutibilidade do mtodo no inferior aos 2R R em tolueno R. A coluna s satisfaz se a colorao do
valores indicados no quadro 3, eluato passar de vermelho para azul depois de um volume de

eluio de cerca de 10,3 ml. Se necessrio, calibre a coluna um detector azoto-fsforo ou um detector de espectrometria
cromatografando uma soluo que contenha em tolueno de emisso atmica.
R, numa concentrao apropriada, o pesticida em ensaio de
Mantenha a temperatura da cmara de injeco a 250C
massa molecular mais alta (por exemplo, a deltametrina),
e a do detector a 275C, programando a temperatura da
e de massa molecular mais baixa (por exemplo, diclorvos).
coluna do seguinte modo: mantenha a temperatura a
Determine a fraco de elato que contm os dois pesticidas.
80C durante 1 min, eleve-a at 150C razo de 30C por
2. Mtodos
Analticos
Purificao da soluo problema. Injecte um volume minuto e mantenha-a a esta temperatura durante 3 min.
apropriado da soluo A (100 a 550l) e proceda De seguida, eleve a temperatura ate 280C razo de 4C
cromatografia. Recolha a fraco determinada como se por min e mantenha-a a esta temperatura durante 1 min.
indica acima (soluo B). Os insecticidas organofosforados Injecte o volume escolhido de cada soluo. Quando os
eluem normalmente entre 8,8 e 10,9 ml e os insecticidas cromatogramas so registados nas condies prescritas,
organoclorados e os piretrinides entre 8,5 e 10,3 ml. os tempos de reteno relativos so aproximadamente os
indicados na tabela 1. Calcule o teor de cada pesticida a
2.2. Insecticidas organoclorados e piretrinides partir da rea dos picos e da concentrao das solues.
Numa coluna para cromatografia de 0,10 m de TABELA 1

comprimento e 5 mm de dimetro interno introduza um
tampo de algodo hidrfilo desengordurado e 0,5 g de Substncia Tempos de reteno relativos
um gel de slica preparado do seguinte modo: aquea na
estufa a 150C, durante, pelo menos, 4 h, gel de slica para Diclorvos 0,20
cromatografia R. Deixe arrefecer e verta, gota a gota, sobre Fonofos 0,50
o gel de slica uma quantidade de gua R que represente Diazino 0,52
1,5 por cento da massa do gel de slica em preparao; Paratio-metilo 0,59
agite energicamente at eliminar os grumos e continue Clorpirifos-metilo 0,60
a agitao durante 2 h usando um agitador mecnico. Pirimifos-metilo 0,66
Acondicione a coluna com 1,5 ml de hexano R. Colunas Malatio 0,67
pr-cheias prontas a utilizar contendo cerca de 0,50 g de Paratio 0,69
gel de slica podem ser utilizadas se tiverem sido validadas Clorpirifos 0,70
previamente. Metidatio 0,78
Concentre a soluo B em corrente de hlio para Etio 0,96
cromatografia R ou de azoto isento de oxignio R Carbofenotio 1,00
at quase secura e tome o resduo com um volume Azinfos-metilo 1,17
apropriado de tolueno R (200 l a 1 ml, segundo o Fosalona 1,18
volume injectado para a preparao da soluo B).
Transfira quantitativamente para a coluna e proceda
cromatografia utilizando 1,8 ml de tolueno R como fase 3.2. Insecticidas organoclorados e piretrinides.
mvel. Recolha o eluato (soluo C). Proceda por cromatografia em fase gasosa (2.2.28),
utilizando carbofenotio como padro interno. Pode
3. Anlise quantitativa ser necessrio utilizar um segundo padro interno de
modo a identificar eventuais interferncias com o pico de
3.1. Insectitidas organofosforados. carbofenotio.
Proceda por cromatografia em fase gasosa (2.2.28), Soluo problema. Evapore cuidadosamente a soluo C em
utilizando carbofenotio R como padro interno. Pode corrente de hlio para cromatografia R ou de azoto isento de
ser necessrio utilizar um segundo padro interno de oxignio R quase at secura e tome o resduo com 500 l de
modo a identificar eventuais interferncias com o pico do tolueno R.
carbofenotio.
Soluo padro. Prepare pelo menos 3 solues contendo,
Soluo problema. Concentre a soluo B em corrente de em tolueno R, o ou os pesticidas em anlise e carbofenotio
hlio para cromatografia R at quase secura e retome em concentraes apropriadas construo de uma curva
com 100 l de tolueno R. padro.
Soluo padro. Prepare pelo menos 3 solues contendo,
A cromatografia pode ser realizada, utilizando:
em tolueno R, o ou os pesticidas em anlise e carbofenotio
em concentraes apropriadas construo de uma curva uma coluna de slica fundida de 30 m de comprimento e
padro. 0,32 mm de dimetro interno de parede interna recoberta
com uma camada de cerca de 0,25 m de poli(dimetil)
A cromatografia pode ser realizada, utilizando:
(difenil)siloxano R,
uma coluna de slica fundida de 30 m de comprimento
como gs vector, hidrognio para cromatografia R. Podem
e 0,32 mm de dimetro interno de parede interna
igualmente ser utilizados outros gases vectores como hlio
recoberta com uma camada de cerca de 0,25 m de
para cromatografia R ou azoto para cromatografia R, desde
poli(dimetil)siloxano R,
que se faa a validao apropriada do mtodo,
como gs vector, hidrognio para cromatografia R. Podem
um detector de captura de electres,
igualmente ser utilizados outro gases vectores como hlio
para cromatografia R ou azoto para cromatografia R, desde um injector que permita a injeco directa a frio na
que se faa a validao apropriada do mtodo, coluna.

2.8.15. ndice de amargor
Mantenha a temperatura da cmara de injeco a 250C de reagente fosfomolibdotngstico R e 10,0 ml de gua R,

e a do detector a 275C, programando a temperatura da misture e complete 25,0 ml com soluo de carbonato de
coluna do seguinte modo: mantenha a temperatura a sdio R a 290 g/l. Determine a absorvncia (2.2.25) em
80C durante 1 min, eleve-a at 150C razo de 30C 760 nm (A1) aps 30 min, utilizando a gua R como lquido
por min e mantenha-a a esta temperatura durante 3 min. de compensao.
De seguida, eleve a temperatura at 280C razo de 4C
por min e mantenha-a a esta temperatura durante 1 min. Polifenis no adsorvveis pela pele em p. A 10,0 ml do
2. Mtodos
filtrado junte 0,10 g de pele em p SQR e agite energicamente
Analticos
Injecte o volume escolhido de cada soluo. Quando os
cromatogramas so registados nas condies prescritas, durante 60 min. Filtre. Tome 5,0 ml do filtrado e complete
os tempos de reteno relativos so aproximadamente os 25,0 ml com gua R. Tome 2,0 ml da soluo, junte 1,0 ml
indicados na tabela 2. Calcule o teor de cada pesticida a de reagente fosfomolibdotngstico R e 10,0 ml de gua R,
partir da rea dos picos e da concentrao das solues. misture e complete 25,0 ml com soluo de carbonato de
sdio R a 290 g/l. Determine a absorvncia (2.2.25) em
760 nm (A2) aps 30 min, utilizando a gua R como lquido
TABELA 2 de compensao.
Substncia Tempos de reteno relativos Padro. Dissolva imediatamente antes do emprego 50,0 mg
de pirogalhol R em gua R e complete 100,0 ml com o
-Hexaclorociclo-hexano 0,44 mesmo solvente. Tome 5,0 da soluo e complete 100,0 ml
Hexaclorobenzeno 0,45 com gua R. Tome 2,0 ml da soluo, junte 1,0 de reagente
-Hexaclorociclo-hexano 0,49 fosfomolibdotngstico R e 10,0 ml de gua R, misture e
Lindano 0,49 complete 25,0 ml com soluo de carbonato de sdio R a
-Hexaclorociclo-hexano 0,54 290 g/l. Determine a absorvncia (2.2.25) em 760 nm
-Hexaclorociclo-hexano 0,56 (A3) aps 30 min, utlizando a gua R como lquido de
Heptacloro 0,61 compensao.
Aldrina 0,68
Calcule o teor por cento em taninos, expressos em
cis-Heptacloro-epxido 0,76
pirogalhol, usando a expresso:
o,p-DDE 0,81
-Endossulfano 0,82 62,5 (A1 A2) m2
Dieldrina 0,87 A3 m1
p,p-DDE 0,87
o,p-DDD 0,89 m1 = massa da tomada de ensaio, em gramas,
Endrina 0,91
m2 = massa de pirogalhol, em gramas.
-Endossulfano 0,92
o,p-DDT 0,95
Carbofenotio 1,00
p,p-DDT 1,02
2.8.15. NDICE DE AMARGOR
cis-Permetrina 1,29
O ndice de amargor de um composto, de um lquido ou
trans-Permetrina 1,31
de um extracto o inverso da diluio limite que pode ser
Cipermetrina (*) 1,40
qualificado de amargo. determinado por comparao com
Fenvalerato (*) 1,47 e 1,49
o cloridrato de quinina, cujo ndice de amargor fixado em
Deltametrina 1,54
200 000.
Determinao do factor de correco.
(*) A substncia apresenta vrios picos.
recomendado efectuar o ensaio por um painel composto
pelo menos de 6 pessoas. necessrio lavar a boca com
2.8.14. DETERMINAO DOS TANINOS gua R antes do ensaio.
NOS FRMACOS VEGETAIS Para considerar as diferenas individuais de percepo do
amargor no painel, necessrio determinar um factor de
Efectue todas as operaes de extraco e diluio ao correco para cada pessoa.
abrigo da luz.
Soluo-me. Dissolva 0,100 g de cloridrato de quinina
Introduza as quantidades prescritas de frmaco pulverizado R em gua R e complete 100,0 ml com o mesmo
(180) ou de extracto num balo de 250 ml e junte 150 ml de solvente. Tome 1,0 ml desta soluo e complete 100,0 ml
gua R. Aquea em banho de gua durante 30 min. Arrefea com gua R.
em gua corrente e passe quantitativamente para um balo
marcado de 250 ml. Lave o balo e passe as guas de lavagem Solues padro. Prepare uma srie de diluies
para o balo marcado e complete 250 ml com gua R. Deixe introduzindo num primeiro tubo 3,6 ml da soluo-me e
decantar e filtre o lquido sobrenadante por papel de filtro de aumente progressivamente o volume de 0,2 ml nos tubos
125 mm de dimetro. Rejeite os primeiros 50 ml do filtrado. seguintes at atingir 5,8 ml no ltimo tubo. Dilua o contedo
s quantidades prescritas de extracto lquido ou de tintura de cada tubo at 10,0 ml com gua R.
junte gua R at completar 250 ml. Filtre a mistura por Determine do seguinte modo a diluio que corresponde
papel de filtro de 125 mm de dimetro. Rejeite os primeiros menor concentrao com sabor amargo: introduza na
50 ml do filtrado.
boca 10,0 ml da primeira diluio da srie e, durante
Polifenis totais. Tome 5,0 ml do filtrado e complete 30 s, faa passar a soluo de um lado para o outro da
25,0 ml com gua R. Tome 2,0 ml desta soluo, junte 1,0 ml boca, por baixo da lngua. Se a soluo no considerada

2.8.18. Doseamento da aflatoxina B1 nos frmacos vegetais
amarga, rejeite-a, aguarde 1 min e lave em seguida a Deixe arrefecer em exsicador em presena de pentxido de
boca com gua R. Aps 10 min, utilize a soluo de difsforo R ou de gel de slica anidro R e pese. Exprima o
concentrao imediatamente superior. resultado em percentagem m/m ou em gramas por litro.
Calcule o factor de correco k para cada membro do
painel por meio da expresso seguinte: 2.8.17. PERDA POR SECAGEM
DOS EXTRACTOS
2. Mtodos
Analticos
n
K=
5,00 Para uma cpsula de fundo plano com cerca de 50 mm de
dimetro e cerca de 30 mm de altura pese 0,50 g de extracto
n = nmero de mililitros de soluo-me contidos na soluo seco finamente pulverizado. Seque na estufa a 100-105C
correspondente menor concentrao considerada amarga. durante 3 h. Deixe arrefecer no exsicador sobre pentxido
de difsforo R ou de gel de slica anidra R e depois pese. O
So excludas do painel as pessoas que no detectem o sabor resultado expresso em percentagem m/m.
amargo com a soluo padro preparada a partir de 5,8 ml da
soluo-me.
Preparao da amostra 2.8.18. DOSEAMENTO DA AFLATOXINA
A 1,0 g da amostra pulverizada (710) se necessrio, junte
B1 NOS FRMACOS VEGETAIS
100 ml de gua R ebulio. Aquea em banho de gua
durante 30 min com agitao constante. Deixe arrefecer ADVERTNCIA: as aflatoxinas so altamente txicas e
e complete 100 ml com gua R. Agite energicamente e cancergenas. Trabalhe, sempre que possvel, em hotes de
filtre. Rejeite os 2 primeiros mililitros de filtrado. O filtrado extraco e tome precaues especficas (por exemplo,
restante designado por C-1 e corresponde-lhe um factor de utilizao de cmara isoladora) para manipular as toxinas
diluio (FD) de 100. quando no estado seco, uma vez que as suas propriedades
electrostticas lhes favorecem a disperso na rea de
Se a amostra um lquido, tome 1 ml e complete 100 ml
trabalho. O Centro Internacional de Pesquisa sobre o Cancro
com um solvente apropriado. Esta soluo designada C-1.
j desenvolveu procedimentos de descontaminao dos
Determinao do ndice de amargor resduos de laboratrio.
Solues problema: As aflatoxinas so micotoxinas naturais produzidas,
10,0 ml de C-1 diludos at 100 ml com gua R: C-2 (FD = 1 000) principalmente, por Aspergilus flavus e Aspergilis parasiticus,
10,0 ml de C-2 diludos at 100 ml com gua R: C-3 (FD = 10 000) espcies comuns e largamente representadas na natureza,
20,0 ml de C-3 diludos at 100 ml com gua R: C-3A (FD = 50 000) que contaminam, na maioria das vezes, as sementes de certas
10,0 ml de C-3 diludos at 100 ml com gua R: C-4 (FD = 100 000) plantas que foram submetidas a condies de stress devidas,
por exemplo, secura. Estes fungos podem estar presentes
Comeando pela diluio C-4 cada membro do painel
no solo, nos vegetais em decomposio, na forragem ou nas
determina a primeira das diluies que apresenta um sabor
amargo. Esta soluo designada D. Designe como Y o FD da sementes em processo de deteriorao microbiana; infestam
soluo D. todos os tipos de substratos orgnicos desde que estejam
reunidas as condies favorveis ao seu crescimento, nomea-
A partir da soluo D, prepare a srie de diluies seguinte: damente humidade e temperatura elevadas. Na natureza
existem, pelo menos, 13 tipos de aflatoxinas. Na sua maioria
D (ml) 1,2 1,5 2,0 3,0 6,0 8,0
so reconhecidas como altamente txicas e cancergenas e a
gua R (ml) 8,8 8,5 8,0 7,0 4,0 2,0 aflatoxina B1 considerada como a mais txica. Os frmacos
vegetais susceptveis de estar contaminados por aflatoxinas
so examinados por um mtodo validado.
Determine o nmero X de mililitros de soluo D que, aps
diluio at 10,0 ml com gua R, apresenta ainda um sabor Salvo indicao em contrrio na monografia, o teor em
amargo. aflatoxina B1 nos frmacos vegetais , no mximo, de 2 g/kg.
Calcule o ndice de amargor para cada membro do painel por A Autoridade competente pode, igualmente, exigir que o
intermdio da expresso seguinte: teor total em aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 satisfaam o limite
de 4 g/kg. O mtodo abaixo descrito citado, a ttulo de
YK exemplo, como um mtodo que mostrou ser adequado para a
X 0,1 anlise da raiz de harpagfito, do gengibre e dos senes. Para
os outros frmacos vegetais necessrio demonstrar a sua
Calcule o ndice de amargor da amostra com a mdia dos
aplicabilidade ou utilizar um outro mtodo validado.
valores de cada membro do painel.
2.8.16. RESDUO SECO MODO OPERATRIO
DOS EXTRACTOS Cromatografia lquida (2.2.29).
Para uma cpsula de fundo plano de cerca de 50 mm de As aflatoxinas degradam-se sob o efeito da luz. Efectue o
dimetro e cerca de 30 mm de altura pese rapidamente doseamento ao abrigo da luz do dia, colocando, nas janelas,
2,00 g ou mea 2,0 ml do extracto. Evapore secura em um filtro anti-UV e utilizando luz filtrada, ou utilizando
banho de gua e seque na estufa a 100-105C durante 3 h. cortinas ou estores e luz artificial (a luz fluorescente

2.8.18. Doseamento da aflatoxina B1 nos frmacos vegetais
aceitvel). Proteja da luz do dia as solues contendo as com uma mistura de 2 volumes de acetonitrilo R e 98
aflatoxinas. volumes de tolueno R. Envolva cuidadosamente o matrs
com uma folha de alumnio e conserve a soluo a uma
Antes do emprego, lave o material de vidro com uma
temperatura inferior a 4C. Antes do emprego espere que
soluo de cido sulfrico R a 10 por cento V/V e depois,
a soluo atinja a temperatura ambiente e retire a folha
cuidadosamente, com gua destilada R at completa de alumnio. Em caso de armazenamento prolongado
eliminao do cido. da soluo (por exemplo, durante 1 ms), pese o matrs
2. Mtodos
Analticos
Soluo problema. Utilize uma coluna de imunoafinidade e anote qualquer variao de massa antes e depois da
contendo anticorpos especficos para a aflatoxina B1, de utilizao da soluo.
capacidade superior ou igual a 100 ng de aflatoxina B1 e Soluo de referncia de aflatoxina B1. Em bales
com uma recuperao igual ou superior a 80 por cento para graduados de 250 ml, introduza, separadamente, os volumes
uma soluo contendo 5 ng de aflatoxina B1, numa mistura de soluo-me secundria indicados na tabela. Aplique
de 87,5 volumes de gua R e 12,5 volumes de metanol R. uma corrente de azoto, temperatura ambiente, durante
Deixe a coluna atingir a temperatura ambiente. A 5,00 g da o tempo estritamente necessrio para a evaporao do
amostra pulverizada (500), junte 100 ml de uma mistura de solvente. A cada balo adicione 75 ml de metanol R e,
30 volumes de gua R e 70 volumes de metanol R e proceda depois, aps a dissoluo da aflatoxina B1, complete 250 ml
extraco, utilizando ultra-sons, durante 30 min. Filtre com gua R.
por filtro de pregas. Com auxlio de uma pipeta, transfira
10,0 ml do sobrenadante lmpido para um matrs de 150 ml Solues de referncia de aflatoxina B1
e adicione 70 ml de gua R. Faa passar 40 ml desta soluo
Soluo Volume de soluo-me Concentrao final da
na coluna de imunoafinidade, com um dbito de 3 ml/min
de referncia secundria (l) soluo de referncia (ng/ml)
(sem ultrapassar 5 ml/min). Lave a coluna por 2 vezes com
10 ml de gua R de cada vez, com um dbito no superior 1 125 0,05
a 5 ml/min. Lave a coluna com duas vezes 10 ml de gua R 2 250 0,1
com um dbito que no ultrapasse 5 ml/min. Seque a coluna 3 500 0,2
aplicando uma presso reduzida moderada durante 5-10 s ou 4 750 0,3
insuflando-lhe ar durante 10 s, com auxlio de uma seringa. 5 1000 0,4
Aplique 0,5 ml de metanol R na coluna e deixe o solvente
passar apenas pela fora da gravidade. Recolha o eluato num Curva de calibrao. Construa a curva de calibrao utili-
balo marcado de 5 ml. Decorrido 1 min aplique novamente zando as solues de referncia 1 a 5 da aflatoxina B1, que
0,5 ml de metanol R e recolha o eluato no mesmo balo. cobrem um intervalo de teor em aflatoxina B1 no frmaco
Decorrido 1 min repita a operao uma terceira vez. vegetal de 1-8 g/kg. Verifique a linearidade do traado. Se
o teor em aflatoxina B1 da amostra em anlise se situar fora
Procure recolher o mximo de eluato por aplicao de
do intervalo de calibrao, dilua a soluo problema at
presso reduzida ou fazendo passar ar sob presso.
uma concentrao de aflatoxina compatvel com a curva de
Complete 5 ml com gua R e agite cuidadosamente. Se a calibrao estabelecida.
soluo estiver lmpida, pode ser analisada directamente. No Coluna:
caso contrrio, filtre-a por filtro descartvel antes da injeco;
utilize um filtro que no provoque perda de aflatoxinas por dimenses: l = 0,25 m; =4,6 mm,
reteno (por exemplo um filtro de politetrafluoroetileno fase estacionria: gel de slica octadecilsililada para
com poros de 0,45 m). cromatografia R (5 m).
Soluo-me primria de aflatoxina B1. Dissolva aflatoxina Fase mvel:
B1 R numa mistura de 2 volumes de acetonitrilo R e 98 volu-
mes de tolueno R de modo a obter uma soluo a 10 g/ml. fase mvel A (derivatizao ps-coluna por reaco
Para determinar a concentrao exacta de aflatoxina B1 nesta fotoqumica ou por brometo de piridnio): acetonitrilo R,
soluo, determine a absorvncia (2.2.25) entre 330 nm e metanol R, gua R (2:3:6 V/V/V),
370 nm, em clulas de quartzo. fase mvel B (derivatizao ps-coluna por brometo
obtido por via electroqumica): junte 0,12 g de brometo de
Calcule a concentrao, em massa, da aflatoxina B1, em
potssio R e 350 l de cido ntrico diludo R1 por litro de
microgramas por mililitro, utilizando a expresso:
fase mvel A.
A M 100 Dbito: 1 ml/min.
l Deteco: detector fluorimtrico, com filtro de excitao em
360 nm e filtro de emisso em 420 nm, ou equivalente. Para
A = absorvncia no mximo do espectro de absoro, os detectores regulveis, os comprimentos de onda recomen-
M = massa molar da aflatoxina B1 (B2 g/mol),
dados so de 365 nm (comprimento de onda de excitao) e
435 nm (comprimento de onda de emisso).
e = coeficiente de absoro molar da aflatoxina B1 na mistura
Injeco: 500 l.
tolueno-acetonitrilo (1930 m2/mol),
Derivatizao ps-coluna pelo bromidrato de perbrometo de
l = percurso ptico da clula (1 cm).
piridnio (PBPB):
Soluo-me secundria de aflatoxina B1. Prepare uma
bomba isenta de pulsaes,
soluo-me secundria com uma concentrao em
aflatoxina B1 de 100 ng/ml diluindo a soluo-me primria misturador em T de volume morto nulo,

2.8.20. Amostragem e preparao de amostras de frmacos vegetais
reactor: tubo em politetrafluoroetileno, l = 0,45 m; 2.8.20. AMOSTRAGEM E PREPARAO

= 0,5 mm,
DE AMOSTRAS DE FRMACOS
fase mvel A,
VEGETAIS
reagente de derivatizao ps-coluna: dissolva 50 mg de
bromidrato de perbrometo de piridnio R em 1000 ml de Para limitar o efeito da amostragem sobre os resultados da
gua R; conserve ao abrigo da luz e utilize dentro de um
2. Mtodos
anlise qualitativa e quantitativa, necessrio assegurar

Analticos
prazo de 4 dias, que a composio da amostra seja representativa do lote

em exame. Os processos a seguir descritos constituem as
dbito do reagente de derivatizao: 0,4 ml/min.
exigncias mnimas aplicveis aos frmacos vegetais.
Derivatizao ps-coluna em reactor fotoqumico (PHRED): NOTA: outros processos podem ser utilizados se eles poderem
unidade de irradiao: lmpada de UV de 254 nm de mercrio demonstrar que permitem obter amostras representativas do
de baixa presso de 8 W mnimo, lote.
placa suporte polida, AMOSTRA DO GRANEL

bobine de reaco: tubo em politetrafluoroetileno
formando uma malha estreita em torno da lmpada UV, Quando a observao externa das embalagens de um lote
l = 25 m; = 0,25 mm, volume morto nominal 1,25 ml, indica que este pode ser considerado como homogneo,
efectue a amostragem sobre o nmero de embalagens,
tempo de exposio: 2 min, seleccionadas ao acaso, de acordo com o que seguidamente
fase mvel A. se indica. Quando o lote no pode ser considerado como
homogneo, divida-o em sublotes to homogneos quanto
Derivatizao ps-coluna por brometo gerado por via
possvel, efectuando depois a amostragem sobre cada sublote
electroqumica (KOBRA):
como se se tratasse de um lote homogneo, utilizando, no
clula KOBRA: clula electroqumica gerando brometo mnimo, o nmero de embalagens seleccionadas ao acaso,
activo capaz de assegurar a derivatizao das aflatoxinas como seguidamente se indica.
para permitir uma melhor deteco fluorimtrica; esta
clula est disponvel no comrcio em vrios fornecedores, Nmero de embalagens no lote Nmero de embalagens em amostragem
(N) (n)
gerador de corrente contnua, em srie com a clula KOBRA,
fornecendo uma corrente constante de cerca de 100 A, 1-3 todas
_
>3 nN + 1
tubo de reaco em politetrafluoroetileno, l = 0,12 m, =
0,25 mm, * n arredondado para o nmero inteiro imediatamente superior
fase mvel B.
Retire uma amostra de cada uma das embalagens em
Ordem de eluio: aflatoxina G2, aflatoxina G1, aflatoxina B2, amostragem. A colheita da amostra efectuada na parte
aflatoxina B1. superior, na intermdia e na inferior das embalagens. No caso
Clculo: de fardos ou sacos grandes, as amostras devem ser retiradas a
uma profundidade de, pelo menos, 10 cm. O peso do produto
Calcule a equao y = a + b da recta de calibrao, sendo x a a retirar de cada embalagem depende do peso total da
concentrao em aflatoxina B1 (ng/ml) e y o sinal S obtido. A amostra do granel e ser de acordo com os valores seguintes.
concentrao C em aflatoxina B1 na soluo igual a S-b
a
Peso do frmaco vegetal contido no lote Peso mnimo das recolhas, em
Calcule o teor em aflatoxina B da amostra, em nanogramas (kg) percentagem do peso
por grama, utilizando a expresso: do lote de frmaco vegetal
V1 V2 C < 50 1.00*
50-100 0,50
m Vi > 100-250 0.25
> 250-500 0,20
m = massa da tomada de ensaio, em gramas, > 500-1000 0,18
> 1000-2500 0,15
V1 = volume de solvente utilizado na extraco, em mililitros, > 2500-5000 0,10
> 5000-10 000 0,08
Vi = parte alquota submetida purificao por > 10 000-25 000 0,05
imunoafinidade, em mililitros,
NOTA: se o peso do lote superior a 25 000 kg ser dividido em
V2 = volume final de soluo obtida aps passagem na coluna sublotes, sendo o processo aplicado a cada sublote.
de imunoafinidade e diluio, em mililitros,
* Com um mnimo de 125 g para o peso total da amostra do granel.
C = valor determinado da concentrao em aflatoxina B1 na Se este peso mnimo representa mais de 10,0 por cento do peso do
soluo problema, em nanogramas por mililitro. frmaco vegetal contido no lote, pode ser utilizado, como amostra, o
lote inteiro.
A presena de aflatoxina B1 pode ser confirmada por registo
do cromatograma sem derivatizao ps-coluna; observa-se, Prepare a amostra do granel reunindo e misturando
contudo, uma importante diminuio (mais de 10 vezes) da uniformemente as amostras provenientes de cada uma das
resposta devida aflatoxina B1. embalagens seleccionadas ao acaso.

2.8.20. Amostragem e preparao de amostras de frmacos vegetais
AMOSTRA EM ANLISE dividindo-se diagonalmente a rea em quatro partes

iguais. As pores contidas nos 2 quartos opostos so
Salvo indicao em contrrio na monografia, prepare a
retiradas e cuidadosamente misturadas. O processo
amostra em anlise como a seguir se indica.
repetido, as vezes necessrias, at obter a amostra em
anlise com o peso mnimo pretendido.
Proceda reduo da quantidade da amostra do granel pelo
mtodo do quarteamento (ver Nota abaixo) ou por qualquer Proceda pulverizao da amostra e passe uma s vez por
2. Mtodos
Analticos
outro mtodo que d uma amostra homognea, de modo que tamis com malha de 1 mm ou com a malha especificada na
cada fraco separada seja representativa do conjunto, at monografia. recomendado o uso de moinho.
obteno de uma fraco final de peso mnimo conforme as
Passe a amostra em p por tamis padronizado de 1 mm ou
indicaes seguintes.
por tamis especificado na monografia. O resduo retido no
tamis no mais de 10 por cento do peso total da amostra em
Tipo de frmaco vegetal Peso mnimo da amostra em anlise
p e no tem mais de 2 por cento de partculas de tamanho
Razes, rizomas cascas, 500 g ou o peso da amostra superior a 1,5 mm ou 1,5 vezes o tamanho das partculas
plantas inteiras total se a amostra do granel especificado na monografia. Se estas condies esto
inferior a 500 g satisfeitas. misture cuidadosamente a amostra e o resduo
para obter a amostra em anlise.
Folhas, flores, sementes, frutos 250 g ou o peso da amostra
total se a amostra do granel Quando estas condies no esto satisfeitas, a amostra em
inferior a 250 g anlise constituda por 2 partes tratadas separadamente.
A quantidade da amostra necessria para cada anlise
Frmacos vegetais partidos ou obtida por pesagem de quantidades proporcionais do p e do
fragmentados (peso mdio 125g
dos fragmentos inferior a 0.5 g)
resduo.
NOTA: para o exame das caractersticas microscpicas,
NOTA: o quarteamento consiste na distribuio uniforme uma poro da amostra em p novamente pulverizada e
da amostra do granel sobre uma rea quadrada, passada por tamis com malha de 0,355 mm.

2. Mtodos MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.8 MTODOS DE FARMACOGNOSIA (NDICE)
Analticos

2.9. MTODOS
DE FARMACOTECNIA
2. Mtodos
Analticos
2.9. Mtodos de farmacotecnia 291 2.9.18. Preparaes para inalao: avaliao
2.9.1. Desagregao dos comprimidos e das aerodinmica das partculas finas 317
cpsulas 291 2.9.19. Contaminao por partculas: partculas
2.9.2. Desagregao dos supositrios e dos no visveis 330
vulos 293 2.9.20. Contaminao por partculas: partculas
2.9.3. Ensaio de dissoluo das formas slidas 294 visveis 332
2.9.4. Ensaio de dissoluo dos adesivos 2.9.22. Tempo de amolecimento dos supositrios
transdrmicos 304 lipfilos 333
2.9.5. Uniformidade de massa das preparaes 2.9.23. Densidade picnomtrica dos slidos 334
apresentadas em formas farmacuticas 2.9.25. Ensaio de dissoluo das gomas para mascar
unitrias 306 medicamentosas 335
2.9.6. Uniformidade de teor das preparaes 2.9.26. Superfcie especfica por adsoro gasosa 337
apresentadas em formas farmacuticas 2.9.27. Uniformidade de massa da dose dispensada
unitrias 307 pelos recipientes multidose 340
2.9.7. Friabilidade dos comprimidos no 2.9.29. Dissoluo intrnseca 341
revestidos 308 2.9.31. Determinao do tamanho das partculas por
2.9.8. Dureza dos comprimidos 309 difraco dos raios laser 342
2.9.9. Determinao da consistncia por 2.9.33. Caracterizao dos slidos cristalinos
penetrometria 309 e parcialmente cristalinos por difraco dos
2.9.10. Teor em etanol e tabelas alcoomtricas 311 raios-X em ps 346
2.9.11. Pesquisa de metanol e de 2-propanol 312 2.9.36. Escoamento dos ps 353
2.9.12. Classificao granulomtrica dos ps por 2.9.37. Microscopia ptica 356
tamisao 312 2.9.38. Estimativa da distribuio granulomtrica por
2.9.14. Superfcie especfica por permeabilidade tamisao analtica 358
ao ar 312 2.9.40. Uniformidade de dosagem das formas
2.9.15. Volume aparente 315 farmacuticas unitrias 361
2.9.16. Escoamento 315 2.9.41. Friabilidade de granulados e esferides 364
2.9.17. Ensaio do volume extravel das 2.9.42. Ensaio de dissoluo de formas slidas lipfilas 365
preparaes parentricas 316 2.9.43. Dissoluo aparente 366

2. Mtodos MENU9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.9 MTODOS DE FARMACOTECNIA (NDICE)
Analticos

MENU 9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.9 MTODOS DE FARMACOTECNIA (NDICE)
2.9.1. Desagregao dos comprimidos e das cpsulas
2.9. MTODOS comporta, igualmente fixada no centro, uma haste metlica

que atravessa as 2 placas. Com o auxlio de um dispositivo
DE FARMACOTECNIA adequado possvel suspender este conjunto de um motor
por um ponto situado no eixo do porta-tubos. A concepo
ndice do aparelho pode apresentar algumas variaes de pormenor,
2.9.1. DESAGREGAO DOS desde que as especificaes das dimenses dos tubos e da rede
sejam respeitadas. As dimenses cumprem as especificaes
2. Mtodos
Analticos
COMPRIMIDOS E DAS CPSULAS apresentadas na figura 1.
Este ensaio destina-se a determinar a capacidade que os Discos. A utilizao dos discos s admitida quando
comprimidos e as cpsulas apresentam de se desagregarem explicitamente especificada e autorizada. Cada um dos tubos
no tempo prescrito, em meio lquido e nas condies est munido de um disco cilndrico com 9,5 0,15 mm de
experimentais a seguir descritas. espessura e 20,7 0, 15 mm de dimetro, de matria plstica
transparente e com densidade relativa entre 1,18 e 1,20. Cada
Neste ensaio, a desagregao no implica a dissoluo disco perfurado, de cima a baixo, por 5 orifcios tubulares
completa da unidade submetida a anlise, nem mesmo da paralelos de 2 0,1 mm de dimetro, um deles centrado com
respectiva substncia activa. Por definio, a desagregao o eixo do cilindro e os outros, situados a 6 0,2 mm do eixo,
completa quando o resduo que eventualmente subsista sobre sobre rectas imaginrias perpendiculares ao eixo e paralelas
a rede, ou que adira face inferior do disco (se se utilizarem entre si. A face lateral de cada disco provida de 4 entalhes
discos), for apenas constitudo por uma massa mole que no trapezoidais idnticos, sensivelmente perpendiculares s 2
inclua qualquer ncleo palpvel. No considere fragmentos bases do cilindro; estes entalhes tm a forma de um trapzio
insolveis do revestimento de comprimidos ou de cpsulas.
simtrico cujos 2 lados paralelos coincidem com as bases do
Utilize o aparelho A para comprimidos e cpsulas cujo cilindro e so paralelos a uma recta imaginria que liga os
tamanho no exceda 18 mm. No caso dos comprimidos e das centros dos 2 orifcios adjacentes situados a 6 mm do eixo.
cpsulas de maiores dimenses, utilize o aparelho B. O lado do trapzio que visvel na face inferior do cilindro
tem 1,6 0,1 mm de comprimento e a aresta inferior est
recolhida 1,6 0,1 mm em relao circunferncia do
ENSAIO A COMPRIMIDOS E CPSULAS cilindro. O lado do trapzio que visvel na face superior
DE DIMENSES NORMAIS do cilindro tem 9,4 0,2 mm de comprimento e o centro
est recolhido 2,6 0,1 mm em relao circunferncia do
Aparelho. O aparelho constitudo por um cesto porta- cilindro. Todas as superfcies dos discos so lisas.
-tubos, um vaso cilndrico de 1 litro de capacidade com
149 11 mm de altura e 106 9 mm de dimetro interno Se o uso dos discos for prescrito, coloque um disco em cada
e que se destina a conter o lquido de imerso, um sistema tubo e ponha o aparelho em funcionamento como se indica
termostatado que mantm o lquido a uma temperatura em Mtodo. Os discos esto conformes s especificaes de
compreendida entre 35C e 39C, e um dispositivo que dimenso indicadas na figura 1.
imprime ao porta-tubos, no lquido de imerso, um O uso de discos modificados de modo a permitirem deteco
movimento vertical, alterno e regular, de frequncia automtica autorizada nos casos em que o uso de discos
constante compreendida entre 29 e 32 ciclos por minuto e
especificado e autorizado. Estes discos devem satisfazer s
55 2 mm de amplitude.
exigncias de densidade e de dimenses indicadas neste texto.
O volume de lquido a introduzir no recipiente ajustado
Mtodo. Coloque uma unidade da preparao em anlise
de modo que a rede metlica se situe, na posio mais
em cada um dos 6 tubos do cesto e um disco, caso o uso de
elevada, pelo menos 15 mm abaixo da superfcie livre do
discos seja prescrito. Ponha o aparelho em funcionamento
lquido e, na posio mais baixa, pelo menos a 25 mm
utilizando, como lquido de imerso, o meio especificado
do fundo do recipiente. A parte superior do cesto nunca
mantido a 37 2C. Ao fim do tempo indicado, suba o
fica completamente submersa. Os tempos de subida e de
porta-tubos para fora do lquido e examine o estado das
descida so iguais e a mudana de sentido corresponde a
unidades submetidas ao ensaio. Todas as unidades esto
uma transio progressiva e no a uma inverso brusca. O
completamente desagregadas. Se 1 ou 2 no desagregarem,
movimento vertical do porta-tubos processa-se segundo o
repita o ensaio com mais 12 unidades. As exigncias do
seu eixo, sem deslocao horizontal aprecivel nem desvio
significativo em relao vertical. ensaio so satisfeitas se pelo menos 16 das 18 unidades
submetidas ao ensaio se desagregarem.
Conjunto mvel. O cesto contm 6 tubos transparentes
abertos nas duas extremidades. Cada tubo mede
77,5 2,5 mm de comprimento e 21,85 1,15 mm de ENSAIO B COMPRIMIDOS E CPSULAS
dimetro interno; a parede tem uma espessura de DE GRANDES DIMENSES
1,9 0,9 mm. Os tubos so mantidos em posio vertical por
2 placas, de 90 2 mm de dimetro e 6,75 1,75 mm de Aparelho. A parte principal do aparelho (ver figura 2)
espessura, ambas perfuradas por 6 orifcios com 24 2 mm constituda por um conjunto rgido que suporta 3 tubos
de dimetro, igualmente espaados entre si e equidistantes cilndricos transparentes. Cada tubo mede 77,5 2 5 mm de
do centro da placa. Sob a placa inferior est fixada uma rede comprimento e 33,0 0,5 mm de dimetro interno; a parede
metlica de fios de ao inoxidvel de 0,615 0,045 mm de tem uma espessura de 2,5 0,5 mm. Cada um dos tubos est
dimetro, com entranamento simples e malhas quadradas munido de um disco cilndrico (com 31,4 0,13 mm
com 2,0 0,2 mm de abertura. As diferentes peas do de dimetro e 15,3 0,15 mm de espessura), de matria
conjunto so montadas e mantidas no lugar por 3 hastes plstica, transparente e com densidade relativa de 1,18 a
metlicas verticais situadas na periferia; a placa superior 1,20. Cada disco perfurado, de cima a baixo, por 7 orifcios

MENU9.0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE) 2.9 MTODOS DE FARMACOTECNIA (NDICE)
2.9.1. Desagregao dos comprimidos e das cpsulas

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 1 Aparelho de desagragao A

de 3,15 0,1 mm de dimetro, um deles central e os outros O aparelho colocado de preferncia num vaso cilndrico
6 equidistantes entre si e dispostos num crculo de 4,2 mm de 1 litro de capacidade ou noutro recipiente apropriado.
de raio a partir do centro do disco. Os tubos so mantidos O volume de lquido a introduzir no recipiente tal que a
em posio vertical por 2 placas, separadas e sobrepostas, rede se situe, na posio mais elevada, pelo menos 15 mm
de matria plstica rgida, de 97 mm de dimetro e 9 mm abaixo da superficie do lquido; na posio mais baixa, pelo
de espessura, ambas perfuradas por 3 orifcios. Os orifcios menos a 25 mm do fundo, com as extremidades superiores
so equidistantes do centro da placa e igualmente espaados dos tubos acima da superficie do lquido. Um dispositivo
entre si. Sob a placa inferior est fixada uma rede metlica de adequado mantm a temperatura do conjunto entre 35C
fios de ao inoxidvel de 0,63 0,03 mm de dimetro e com e 39C.
abertura de malha de 2,0 0,2 mm. As placas so mantidas no
Os elementos mecnicos descritos podem sofrer
seu lugar, a uma distncia de 77,5 mm, por hastes metlicas
modificaes de pormenor, mas as cotas dos tubos e da
verticais situadas na periferia; a placa superior inclui tambm,
rede metlica devem estar conformes s prescries acima
fixada no centro, uma haste metlica que permite efectuar a
descritas.
ligao deste conjunto a um dispositivo mecnico destinado
a assegurar um movimento vertical, alterno e regular, cuja Mtodo. Examine 6 comprimidos ou cpsulas, quer
amplitude de 55 2 mm; o nmero de deslocamentos utilizando os 2 aparelhos em paralelo, quer repetindo
completos (subida-descida) de 29 a 32 por minuto. o ensaio. Em cada um dos 3 tubos introduza um

2.9.2. Desagregao dos supositrios e dos vulos
2. Mtodos
Analticos
FIGURA 2 Aparelho de desagragao B
comprimido ou uma cpsula e o disco, se este for a) a dissoluo seja completa,

prescrito; coloque o conjunto no vaso cilndrico contendo
o meio lquido indicado. Ponha em funcionamento o b) os componentes dos supositrios ou vulos estejam
aparelho durante o tempo prescrito. Quando este tempo separados: os compostos lipdicos fundidos e reunidos
terminar, retire o conjunto e examine o estado dos superfcie da gua, os ps insolveis depositados no
comprimidos e das cpsulas. A amostra satisfaz ao ensaio se fundo e os compostos solveis na forma dissolvida.
os 6 comprimidos ou cpsulas esto desagregados. Consoante o tipo de preparao, os componentes podem
estar repartidos por um ou vrios destes estados,
c) se produza um amolecimento, acompanhado
2.9.2. DESAGREGAO eventualmente de uma modificao do formato primitivo
DOS SUPOSITRIOS E DOS VULOS do supositrio ou do vulo, sem completa separao dos
constituintes. O amolecimento tal que o supositrio ou
Este ensaio destina-se a determinar a maior ou menor o vulo no contm qualquer ncleo que resista presso
capacidade destas formas farmacuticas amolecerem ou de uma vareta de vidro).
se desagregarem em meio lquido, no espao de tempo
prescrito. Utilizando o aparelho da figura junta, nas d) o invlucro de gelatina das cpsulas rectais e vaginais
condies experimentais descritas, a desagregao apresente uma ruptura e comece a libertar o seu
considerada como atingida quando: contedo,

2.9.3. Ensaio de dissoluo das formas slidas
e) no reste qualquer resduo sobre a placa perfurada ou, Tcnica. Utilize 3 supositrios ou vulos. Coloque cada um
se subsiste algum resduo, este seja constitudo por uma deles sobre a placa inferior de um suporte. Introduza e fixe
massa mole (que pode ser efervescente) que no inclua cada suporte na tina de cada aparelho. Rode os aparelhos
qualquer ncleo resistente presso de uma vareta de de 180 de 10 em 10 minutos. Decorrido o prazo indicado
na monografia, examine o estado das amostras: o ensaio
vidro (comprimidos vaginais).
considerado satisfatrio se todas as amostras estiverem
Aparelho. O aparelho (ver figura 3) constitudo por um vaso desagregadas.
2. Mtodos
Analticos
cilndrico de parede de vidro ou matria plstica, transparente,

de espessura apropriada, no interior do qual se fixa, por meio UTILIZAO DO APARELHO NO CASO
de 3 ganchos, um suporte metlico. Este ltimo comporta 2 DOS COMPRIMIDOS VAGINAIS
placas de ao inoxidvel, de forma circular, ambas perfuradas
por 39 orifcios de 4 mm de dimetro e distando uma da Utilize o aparelho atrs descrito mas dispondo-o de modo
outra cerca de 30 mm; o seu dimetro sensivelmente igual a que repouse sobre os seus ganchos (ver figura 2).
ao dimetro interior do vaso. O ensaio efectuado com 3
destes aparelhos, destinando-se cada um deles a conter uma
nica amostra. Cada um deles colocado numa tina de, pelo
menos, 4 litros de capacidade, cheia de gua cuja temperatura
mantida a 36-37C, salvo indicao contrria. Os 3 aparelhos
podem igualmente ser colocados numa nica tina de, pelo
menos, 12 litros de capacidade. A tina munida de um
agitador de baixa velocidade e de um dispositivo que permite
manter o aparelho verticalmente, pelo menos 90 mm abaixo
da superfcie da gua, e rod-lo de 180 volta de um eixo
horizontal, sem o fazer sair do lquido.
FIGURA 2
A Placa de vidro
B Comprimido vaginal
C Superfcie da gua
D gua
E Copo
Coloque-o num copo de dimetro apropriado, contendo

gua cuja temperatura se mantenha a 36-37C e cujo nvel
se situe ligeiramente abaixo da placa perfurada superior.
Com o auxlio de uma pipeta, ajuste seguidamente esse
nvel com gua a 36-37C de modo a cobrir os orifcios da
placa com uma fina camada de gua. Utilize 3 comprimidos
vaginais; deposite cada um deles sobre a placa superior de
um aparelho e cubra este ltimo com uma placa de vidro
por forma a manter as condies de humidade apropriadas.
Decorrido o prazo indicado na monografia, examine o estado
das amostras. O ensaio satisfatrio se todas as amostras
estiverem desagregadas.
2.9.3. ENSAIO DE DISSOLUO

DAS FORMAS SLIDAS
O objectivo deste ensaio verificar se as formas farmacuticas
slidas orais satisfazem s exigncias de dissoluo. Neste
texto, uma unidade da preparao em anlise definida como
um comprimido/uma cpsula ou o nmero prescrito de
comprimidos/cpsulas.
APARELHAGEM
FIGURA 3 Aparelho para a desagregao dos supositrios
e dos vulos
Aparelho 1 (aparelho com cesto de rede). O aparelho
Dimenses em milmetros constitudo pelos seguintes elementos: um recipiente, de

vidro ou de outro material transparente inerte (1), que pode

ser tapado; um motor; um agitador constitudo por uma haste
que actua como eixo motor e um cesto cilndrico. O recipiente
parcialmente imerso num banho de gua termostatado
de dimenses apropriadas, ou aquecido por um dispositivo
apropriado, como uma resistncia de aquecimento. O banho
de gua ou o dispositivo de aquecimento permitem manter a
2. Mtodos
Analticos
temperatura a 37 0,5C no interior do recipiente e garantir o
movimento fluido e constante do meio de dissoluo. Nenhum
dos elementos do aparelho, ou do local onde colocado,
provoca movimento de agitao ou de vibrao perceptvel,
alm do que resulta da rotao regular do agitador. prefervel Orifcio
utilizar um aparelho que permita observar a amostra e o
elemento de agitao durante todo o ensaio. O recipiente
cilndrico, de fundo hemisfrico e com a capacidade de 1 litro; a Suporte de fixao
altura de 160-210 mm e o dimetro interno de 98-106 mm. com 3 grampos
A parte superior do recipiente forma um rebordo ao qual se equidistantes
pode adaptar uma tampa que evita a evaporao (2). A haste de 120
montada de modo que o eixo no se afaste mais de 2 mm do
eixo vertical do recipiente e que a sua rotao seja uniforme
e sem oscilaes significativas susceptveis de afectarem os
resultados. O aparelho est equipado com um dispositivo que
permite regular a velocidade de rotao da haste e control- Dimetro externo
la com uma exactido de 4 por cento em relao ao valor do tamis
prescrito.
A haste e o cesto que constituem o agitador so de
ao inoxidvel tipo 316, ou equivalente, e cumprem as
especificaes da figura 1.
Pode utilizar-se um cesto construdo em metal folheado a
ouro com cerca de 2,5 m (0,0001 polegadas) de espessura.
No incio do ensaio introduza a amostra no cesto, que
est seco. A distncia entre o fundo do cesto e o fundo do
recipiente de 25 2 mm durante todo o ensaio.
Aparelho 2 (aparelho com p agitadora). O aparelho

apresenta configurao idntica do aparelho 1, excepo
do agitador que, neste caso, constitudo por uma haste
vertical que na extremidade inferior tem fixada uma p. A
haste montada de tal modo que o eixo no se afaste mais
de 2 mm do eixo vertical do recipiente e que a sua rotao
seja uniforme e sem oscilaes apreciveis susceptveis de
afectarem os resultados. A p insere-se no centro da haste
de tal modo que os, seus eixos coincidam e que a base fique
exactamente ao nvel da extremidade da haste. A p cumpre
as especificaes da figura 2.
(1) Tamis com soldadura em contnuo: dimetro do fio de 0,25-0,31 mm;
A distncia entre o fundo do cesto e o fundo do recipiente
de 25 2 mm durante todo o ensaio. A p e a haste so abertura de mallha de 0,36-0,44 mm. A realizao da soldadura pode
de metal, ou doutro material rgido e inerte apropriado, provocar uma ligeira modificao do tamis.
e formam uma s pea. No entanto, pode utilizar-se um
sistema apropriado constitudo por 2 partes destacveis, (1) Desvio mximo admissvel em A de 1,0 mm, quando o elemento
desde que as 2 peas permaneam unidas durante todo roda em torno do eixo central e o cesto se encontra na posio
o ensaio. A p e a haste podem ser cobertas por um apropriada.
revestimento apropriado que permite torn-las inertes.
Deixa-se cair a amostra at ao fundo do recipiente antes de
pr a p em funcionamento. As amostras que flutuam podem FIGURA 1 Aparelho 1, com cesto de rede
ser lastradas com um material inerte como, por exemplo, Dimenses em milmetros
um fio metlico enrolado em hlice. A imerso da amostra
pode tambm ser realizada com o dispositivo representado na
figura 3. Podem tambm ser utilizados outros dispositivos, Aparelho 3 (aparelho de pistes). O aparelho constitudo
desde que sejam previamente validados.
pelos seguintes elementos: um conjunto de tubos cilndricos
de vidro, de fundo plano; um conjunto de pistes tubulares
(1) O material utilizado no deve adsorver, reagir ou interferir com
a amostra. de vidro; ligaes inertes (ao inoxidvel tipo 316, ou outro
(2) A tampa apresenta aberturas que permitem a introduo de um material apropriado) e tamises, de material no reactivo e no
termmetro e a fcil colheita das amostras. absorvente, que se adaptam s 2 extremidades dos pistes;


2. Mtodos
Analticos
As dimenses A e B no variam mais de 0,5 mm quando a p roda em torno do eixo central.

Salvo indicao em contrrio, as tolerncias so de 1,0 mm
FIGURA 2 Aparelho 2, com p agitadora

um motor e um sistema mecnico que permite imprimir aos utilizar um aparelho que permita observar a amostra e os
pistes um movimento vertical alternativo no interior dos pistes. Cada recipiente est equipado com uma tampa que
tubos e, se necessrio, transferi-los por translao horizontal evita a evaporao e permanece tapado durante todo o ensaio.
para outro conjunto de recipientes. Os recipientes so Salvo indicao em contrrio, os elementos do aparelho
parcialmente imersos num banho de gua termostatado de cumprem as especificaes de dimenses da figura 4.
dimenses apropriadas que permite manter a temperatura
a 37 0,5C. Nenhum dos elementos do aparelho, ou do Aparelho 4 (aparelho de fluxo contnuo). O aparelho
local onde colocado, provoca movimento de agitao ou constitudo pelos seguintes elementos: um reservatrio
de vibrao perceptvel, alm do que resulta do movimento e uma bomba que garantem a circulao do lquido de
vertical regular dos pistes. O aparelho est equipado com dissoluo; uma clula de fluxo contnuo; um banho de gua
um dispositivo que permite seleccionar a frequncia do termostatado que permite manter a temperatura do meio
movimento alternativo e control-la com uma exactido de de dissoluo a 37 0,5C. Utilize uma clula do tamanho
5 por cento em relao ao valor prescrito. prefervel prescrito.

2. Mtodos
Analticos
A: fecho resistente aos cidos.
B: suporte resistente aos cidos
FIGURA 3 Dispositivo de imerso
A bomba propulsiona o meio de dissoluo no sentido pode tambm ser efectuado mantendo o termmetro na
ascendente atravs da clula de fluxo contnuo e apresenta posio apropriada, desde que se demonstre que os resultados
uma amplitude de velocidades de 240 960 ml/h, com obtidos em ambos os casos so equivalentes.
dbitos normalizados de 4 ml/min, 8 ml/min e 16 ml/min.
Garante um dbito constante ( 5 por cento do dbito Coloque 1 unidade da preparao em anlise no aparelho,
nominal) e o regime de escoamento sinusoidal, com uma tomando as precaues necessrias para evitar a formao de
frequncia de 120 10 impulsos/min. Podem tambm ser bolhas gasosas superfcie da amostra, e ponha o aparelho
utilizados dbitos no pulsteis. imediatamente em funcionamento velocidade prescrita.
No intervalo de tempo especificado ou em cada um dos
A clula de fluxo contnuo (figuras 5 e 6) de material inerte e tempos indicados, retire uma amostra duma zona situada a
transparente. montada verticalmente e munida de um filtro, meia distncia entre a superfcie do lquido de dissoluo e
na parte superior, para que as partculas no dissolvidas fiquem o cimo da p ou do cesto e a, pelo menos, 1 cm da parede do
retidas na clula; os dimetros normalizados da clula so 12 mm recipiente. Compense o volume retirado, quer por juno de
e 22,6 mm; a parte inferior da clula cnica e encontra-se igual volume de lquido de dissoluo fresco e a 37C, quer
geralmente cheia de pequenas esferas de vidro com um dimetro entrando em conta com a variao de volume nos clculos,
de cerca de 1 mm; no fundo do cone coloca-se uma esfera maior, desde que se demonstre que no necessrio substituir o
com cerca de 5 mm, para proteger a entrada do tubo; para
meio de dissoluo. Mantenha o recipiente tapado durante
determinadas formas farmacuticas pode utilizar-se um suporte
todo o ensaio e verifique a temperatura do meio de dissoluo
especial (figuras 5 e 6). A clula imersa num banho de gua
termostatado que permite manter a temperatura a em intervalos de tempo apropriados. Proceda anlise da
37 0,5C. A montagem da clula efectuada com um amostra por um mtodo de doseamento apropriado (3). Repita
dispositivo de fecho e 2 juntas. A bomba est separada da o ensaio noutras unidades da preparao em anlise.
unidade de dissoluo, para que esta esteja isolada das vibraes Se utilizar um sistema automatizado de amostragem ou um
provocadas pela bomba, e no deve ser instalada a um nvel aparelho modificado para outros fins, necessrio verificar
superior ao dos reservatrios. O comprimento dos tubos que o aparelho modificado origina resultados equivalentes
de ligao o mais curto possvel. Convm utilizar tubos aos obtidos com o aparelho descrito neste captulo.
de material inerte, como o politetrafluoroetileno, com um
dimetro inferior a 1,6 mm e sistemas de ligao quimicamente Meio de dissoluo. Utiliza-se um meio de dissoluo
inertes. apropriado. O volume especificado medido a 20-25C.
Se o lquido de dissoluo for tamponado, ajuste o pH
Conformidade do aparelho. A conformidade do aparelho com a aproximao de 0,05 unidades. A presena de gases
para a realizao de ensaios de dissoluo inclui a verificao
dissolvidos pode originar a formao de bolhas susceptveis
da conformidade com as dimenses e tolerncias descritas
de falsear os resultados do ensaio; neste caso, elimine os
acima. Alm disso, durante a utilizao devem ser
gases dissolvidos antes de realizar o ensaio (4).
controlados periodicamente outros parmetros crticos, como
o volume, a temperatura do meio de dissoluo, a velocidade Tempo. Quando existe uma s especificao de tempo,
de rotao (Aparelhos 1 e 2), a frequncia do movimento pode considerar-se o ensaio concludo quando se atinge a
alternativo (Aparelho 3) e o dbito do meio de dissoluo taxa mnima de dissoluo exigida. As colheitas devem ser
(Aparelho 4). Verifique periodicamente que o desempenho do efectuadas nos tempos indicados, com uma tolerncia de 2
aparelho de dissoluo aceitvel. por cento.
MTODO (3) As amostras so filtradas logo aps a colheita, excepto quando

se demonstra que no necessrio filtr-las. Utilize um filtro inerte
APARELHOS 1 E 2 que no adsorva a substncia activa e que no contenha substncias
extraveis que possam interferir na anlise.
Formas de libertao convencional (4) Pode usar o seguinte mtodo de desgaseificao: aquea o meio
a cerca de 41C, agitando suavemente, e filtre de imediato a presso
Mtodo. Introduza no recipiente do aparelho prescrito reduzida por filtro de porosidade inferior ou igual a 0,45 m,
o volume de lquido de dissoluo indicado ( 1 por agitando energicamente. Mantenha a agitao a presso reduzida
cento). Monte o aparelho. Ajuste a temperatura do meio de durante cerca de 5 min. Para eliminar os gases dissolvidos, pode
dissoluo para 37 0,5C e retire o termmetro. O ensaio utilizar outras tcnicas de desgaseificao validadas.

Formas de libertao prolongada

Mtodo. Proceda como se descreve para as formas de
libertao convencional.
Meio de dissoluo. Proceda como se descreve para as formas
de libertao convencional.
2. Mtodos
Tempo. Os tempos de realizao das colheitas (geralmente

Analticos
em nmero de 3) so expressos em horas.
Formas de libertao retardada

Mtodo. Utilize o mtodo A ou o mtodo B.
Mtodo A
Perodo em meio cido. Introduza 750 ml de cido
clordrico 0,1 M no recipiente e monte o aparelho. Deixe
equilibrar o meio a 37 0,5C. Coloque 1 unidade da
preparao em anlise no aparelho, tape o recipiente
e ponha o aparelho em funcionamento velocidade
prescrita. Aps 2 h de agitao em cido clordrico 0,1 M,
retire uma amostra do meio e prossiga imediatamente
como se indica em Perodo em meio tamponado. Proceda
anlise da amostra por um mtodo de doseamento
apropriado.
Perodo em meio tamponado. A juno do tampo e o
ajuste do pH devem ser efectuados em menos de 5 min.
Com o aparelho em funcionamento velocidade prescrita,
junte ao meio contido no recipiente 250 ml de soluo de
fosfato trissdico dodeca-hidratado R a 0,20 M previamente
equilibrado a 37 0,5C. Ajuste, se necessrio, para pH
6,8 0,05 com cido clordrico 2 M ou com hidrxido de
sdio 2 M. Mantenha a agitao durante 45 min ou durante
o tempo prescrito, retire em seguida uma amostra do
meio e proceda anlise por um mtodo de doseamento
apropriado.
Mtodo B
Perodo em meio cido. Introduza 1000 ml de cido
clordrico 0,1 M no recipiente e monte o aparelho. Deixe
equilibrar o meio a 37 0,5C. Coloque 1 unidade da
preparao em anlise no aparelho, tape o recipiente
e ponha o aparelho em funcionamento velocidade
prescrita. Aps 2 h de agitao em cido clordrico 0,1 M,
retire uma amostra do meio e prossiga imediatamente
como se indica em Perodo em meio tamponado. Proceda
anlise da amostra por um mtodo de doseamento
apropriado.
Perodo em meio tamponado. Para esta fase do
procedimento utilize tampo previamente equilibrado
a 37 0,5C. Esvazie o cido contido no recipiente
e introduza 1000 ml de soluo tampo de pH 6,8
preparada do seguinte modo: misture 3 volumes de
cido clordrico 0,1 M e 1 volume de soluo de fosfato
trissdico dodeca-hidratado R 0,20 M e, se necessrio,
ajuste para pH 6,8 0,05 com cido cloridrico 2 M R
ou com hidrxido de sdio 2 M R. Em alternativa, pode
retirar do aparelho o recipiente que contm o cido,
substitu-lo por outro recipiente contendo o tampo e
transferir em seguida para este ltimo a preparao em
anlise. Mantenha a agitao durante 45 min ou durante
o tempo prescrito, retire em seguida uma amostra do
meio e proceda anlise por um mtodo de doseamento
apropriado.
Tempo. Salvo indicao em contrrio, as colheitas devem ser
FIGURA 4 Aparelho 3, de pistes
efectuadas nos tempos indicados, com uma tolerncia de 2
por cento. Dimenses em milmetros, salvo indicao em contrrio

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 5 Aparelho 4, clula de grandes dimenses para comprimidos e cpsulas (em cima) e suporte especial correspondente (em baixo)
Dimenses em milmetros, salvo indicao em contrrio
APARELHO 3 termmetro. Coloque em cada um dos pistes uma unidade da

preparao em anlise, tendo a precauo de evitar a formao
Formas de libertao convencional de bolhas de ar superfcie das amostras. Ponha de imediato
Mtodo. Introduza o volume indicado (1 por cento) de meio o aparelho em funcionamento nas condies prescritas. No
de dissoluo em cada um dos recipientes, monte o aparelho, decurso de cada ciclo de movimento ascendente/descendente,
equilibre o meio de dissoluo a 37 0,5C e retire o o pisto percorre uma distncia total de 9,9-10,1 cm.


2. Mtodos
Analticos
FIGURA 6 Aparelho 4, clula de pequenas dimenses para comprimidos e cpsulas (em cima) e suporte especial correspondente (em baixo)
No intervalo de tempo prescrito ou em cada um dos tempos necessrio substituir o meio, entre em conta com a variao
indicados, suba os pistes e retire uma amostra do meio de de volume nos clculos. Mantenha os tubos tapados durante
dissoluo numa zona situada a meia distncia da superfcie todo o ensaio e verifique a temperatura do meio a intervalos
do meio e do fundo de cada tubo. Proceda anlise como se de tempo apropriados.
prescreve. Se necessrio, repita o ensaio com outras unidade Meio de dissoluo. Proceda como se descreve para as formas
da preparao em anlise. de libertao convencional com os Aparelhos 1 e 2.
Substitua as amostras retiradas por volumes iguais de meio Tempo. Proceda como se descreve para as formas de
de dissoluo fresco a 37C ou, se se demonstrar que no libertao convencional com os Aparelhos 1 e 2.

Formas de libertao prolongada se obtiver resultados satisfatrios nos nveis S1 ou S2. A

grandeza Q a quantidade de substncia activa dissolvida
expressa em percentagem do teor indicado no rtulo; as
libertao convencional com o Aparelho 3.
percentagens (5 por cento, 15 por cento e 25 por cento) que
Meio de dissoluo. Proceda como se descreve para as formas figuram no quadro referem-se tambm ao teor indicado no
de libertao prolongada com os Aparelhos 1 e 2. rtulo, pelo que so expressas nos mesmos termos que Q.
2. Mtodos
Analticos
Tempo. Proceda como se descreve para as formas de QUADRO 1
libertao prolongada com os Aparelhos 1 e 2.
Nvel Nmero de Critrios de
Formas de libertao retardada unidades aceitao
ensaiadas
S1 6 Nenhuma unidade inferior a Q 5 por cento.
libertao retardada com os Aparelhos 1 e 2, Mtodo B. Use
S2 6 A mdia das 12 unidades (S1S2) igual ou
uma srie de recipientes para o perodo em meio cido e superior a Q e nenhuma unidade inferior a
outra srie para o periodo em meio tamponado e utilize o Q 15 por cento.
volume de meio prescrito (geralmente 300 ml).
S3 12 A mdia das 24 unidades (S1 S2S3) igual
Tempo. Proceda como se descreve para as formas de ou superior a Q, no mximo 2 unidades podem
ser inferiores a Q 15 por cento e nenhuma
libertao retardada com os Aparelhos 1 e 2. unidade inferior a Q 25 por cento.
APARELHO 4
Formas de libertao prolongada
Formas de libertao convencional Salvo indicao em contrrio, as exigncias do ensaio so
Mtodo. Coloque as esferas de vidro na clula prescrita. satisfeitas quando as quantidades de substncia activa dissolvida
Coloque uma unidade da preparao em anlise sobre a cumprem os critrios de aceitao apresentados no quadro
camada de esferas ou, nos casos especificados, sobre um 2. Prossiga o ensaio at ao terceiro nvel, excepto se obtiver
suporte especial. Com o dispositivo de fecho, monte a cabea resultados satisfatrios nos nveis L1 ou L2. Os limites respeitantes
de filtrao e as diferentes partes do aparelho. Com a bomba, s quantidades de substncia activa dissolvida exprimem-se em
introduza o meio de dissoluo aquecido a 37 0,5C na percentagem do teor indicado no rtulo e delimitam os intervalos
clula pela parte inferior, de modo a obter o dbito prescrito nos quais se enquadra cada valor de Qi, isto , a quantidade
medido com uma exactido de 5 por cento. Recolha o eludo de substncia dissolvida em cada um dos tempos de anlise
por fraces nos tempos prescritos. Proceda anlise como prescritos. Quando se prescrevem vrios tempos de anlise, os
indicado. Repita o ensaio com outras unidades da preparao. critrios de aceitao aplicam-se individualmente a cada um deles.
Meio de dissoluo. Proceda como se descreve para as formas
de libertao convencional com os Aparelhos 1 e 2. QUADRO 2
Tempo. Proceda como se descreve para as formas de Nvel Nmero de Critrios de

libertao convencional com os Aparelhos 1 e 2. unidades aceitao
ensaiadas
Formas de libertao prolongada L1 6 Nenhum valor individual se situa fora dos

diferentes intervalos prescritos, nem inferior
Mtodo. Proceda como se descreve para as formas de quantidade especificada no tempo final do
libertao convencional com o Aparelho 4. ensaio.
L2 6 A mdia das 12 unidades (L1 + L2) est
Meio de dissoluo. Proceda como se descreve para as formas includa no intervalo especificado e no
de libertao convencional com o Aparelho 4. inferior quantidade prescrita para o tempo
final do ensaio; nenhum valor apresenta, em
Tempo. Proceda como se descreve para as formas de relao aos diferentes intervalos prescritos,
libertao convencional com o Aparelho 4. um desvio superior a 10 por cento do teor
indicado no rtulo; nenhum valor inferior
quantidade prescrita no tempo final do ensaio
Formas de libertao retardada em mais de 10 por cento do teor indicado no
rtulo.
Mtodo. Proceda como se descreve para as formas de L3 12 A mdia das 24 unidades (L1 + L2 + L3) est
libertao retardada com os Aparelhos 1 e 2, utilizando os includa no intervalo especificado e no
meios prescritos. inferior quantidade prescrita para o tempo
final do ensaio; no mximo, 2 dos 24 valores
Tempo. Proceda como se descreve para as formas de podem apresentar, em relao aos diferentes
libertao retardada com os Aparelhos 1 e 2. intervalos prescritos, um desvio superior a
10 por cento do teor indicado no rtulo; no
mximo, 2 dos 24 valores podem ser
inferiores quantidade prescrita no tempo
INTERPRETAO final do ensaio em mais de 10 por cento do
teor indicado no rtulo; nenhum valor
apresenta, em relao aos diferentes
Formas de libertao convencional intervalos especificados, um desvio superior
a 20 por cento do teor indicado no rtulo;
Salvo indicao em contrrio, as exigncias do ensaio so nenhum valor inferior quantidade
satisfeitas quando as quantidades de substncia activa prescrita no tempo final do ensaio em
dissolvida cumprem os critrios de aceitao apresentados mais de 20 por cento do teor indicado no
no quadro 1. Prossiga o ensaio at ao terceiro nvel, excepto rtulo.

Formas de libertao retardada a composio, o volume e a temperatura do meio de

dissoluo,
Perodo em meio cido. Salvo indicao em contrrio, as
exigncias desta fase do ensaio so satisfeitas quando as a velocidade de rotao ou o dbito do meio de dissoluo,
quantidades de substncia activa dissolvida, expressas em
o modo de colheita das amostras do meio de dissoluo
percentagem do teor indicado no rtulo, cumprem os critrios
(tempo, mtodo e volume) ou as condies de verificao
de aceitao apresentados no quadro 3. Prossiga o ensaio at ao
em contnuo,
2. Mtodos
Analticos
terceiro nvel, excepto se obtiver resultados satisfatrios para as

duas fases (em meio cido e em meio tamponado) nalgum dos o mtodo de anlise,
nveis anteriores.
os critrios de aceitao.
QUADRO 3 A escolha do aparelho determinada pelas caractersticas
fisico-qumicas da forma farmacutica. Pode ser prefervel
unidades aceitao
utilizar o aparelho de fluxo contnuo quando se recorre a um
ensaiadas grande volume de meio de dissoluo para obter as condies
de imerso adequadas, ou quando se altera o pH.
A1 6 Nenhum valor individual ultrapassa a taxa de
dissoluo de 10 por cento.
A2 6 A mdia das 12 unidades (A1 A2) no CONDIES OPERATRIAS
ultrapassa a taxa de dissoluo de 10 por
cento e nenhum valor individual ultrapassa a
taxa de dissoluo de 25 por cento. O funcionamento dos aparelhos com p, com cesto e com
A3 12 A mdia das 24 unidades (A1 A2 A3) no
movimento alternativo fundamenta-se geralmente na
ultrapassa a taxa de dissoluo de 10 por utilizao de condies de imerso escolhidas de modo que
cento e nenhum valor individual ultrapassa a o produto dissolvido no origine modificaes significativas
taxa de dissoluo de 25 por cento. da velocidade de dissoluo do produto remanescente. Estas
condies so normalmente obtidas quando o volume do
Perodo em meio tamponado. Salvo indicao em contrrio, as meio de dissoluo representa, pelo menos, 3 a 10 vezes o
exigncias do ensaio so satisfeitas quando as quantidades de volume de saturao.
substncia activa dissolvida cumprem os critrios de aceitao Em regra, utiliza-se um meio de dissoluo aquoso.
apresentados no quadro 4. Prossiga o ensaio at ao terceiro A composio do meio escolhida em funo das
nvel, excepto se obtiver resultados satisfatrios para as duas caractersticas fsico-qumicas da(s) substncia(s) activa(s)
fases nalgum dos nveis anteriores. No quadro 4 o valor de Q e do(s) excipiente(s) e condicionada pelas condies a que
75 por cento, salvo indicao em contrrio. A grandeza Q a a forma farmacutica exposta aps a administrao, o que
quantidade total de substncia activa dissolvida no decurso das se aplica nomeadamente ao pH e fora inica do meio de
duas fases (em meio cido e em meio tamponado) expressa em dissoluo.
percentagem do teor indicado no rtulo; as percentagens (5
por cento, 15 por cento e 25 por cento) que figuram no quadro O pH do meio de dissoluo est habitualmente
referem-se tambm ao teor indicado no rtulo, pelo que so compreendido entre 1 e 8. Em certos casos justificados,
expressas nos mesmos termos que Q. pode ser necessrio recorrer a um pH mais elevado. Para os
valores de pH cido mais baixos utiliza-se normalmente cido
QUADRO 4 clordrico 0,1 M. Os meios de dissoluo recomendados esto
descritos a seguir.
unidades aceitao S recomendvel utilizar gua como meio de dissoluo
ensaiadas quando se verificou que as variaes de pH no afectam as
caractersticas de dissoluo.
B1 6 Nenhuma unidade inferior a Q 5 por cento.
Em certos casos, os meios de dissoluo podem conter
B2 6 A mdia das 12 unidades (B1 B2) igual ou
superior a Q e nenhuma unidade inferior a enzimas, agentes tensioactivos ou outras substncias
Q 15 por cento. orgnicas ou inorgnicas. Para a anlise de preparaes
B3 12 A mdia das 24 unidades (B1 B2 B3) igual contendo substncias activas pouco solveis em gua,
ou superior a Q, no mximo, 2 unidades pode ser necessrio modificar o meio de dissoluo.
podem ser inferiores a Q 15 por cento e recomendvel usar ento um agente tensioactivo em
nenhuma unidade inferior a Q 25 por cento.
baixa concentrao; no aconselhvel utilizar solventes
orgnicos.
A seco seguinte publicada a ttulo informativo.
A presena de gases dissolvidos no meio de dissoluo pode
afectar os resultados do ensaio, em especial no caso do
Recomendaes respeitantes aparelho de fluxo contnuo, em que necessrio desgaseificar
ao ensaio de dissoluo o meio para evitar a formao de bolhas na clula. Pode
usar-se o seguinte mtodo de desgaseificao: aquea o
meio a cerca de 41C, agitando suavemente, e filtre de
Na verificao da velocidade de dissoluo da(s) substncia(s)
imediato a presso reduzida por filtro de porosidade inferior
activa(s) de uma forma farmacutica slida especificam-se os
ou igual a 0,45 m, agitando energicamente. Mantenha a
seguintes parmetros:
agitao a presso reduzida durante cerca de 5 min. Para
o aparelho a utilizar e, no caso do aparelho de fluxo contnuo, eliminar os gases dissolvidos, pode utilizar outras tcnicas de
o tipo de clula a utilizar, desgaseificao.

Para os aparelhos com p e com cesto, o volume de meio de Solues tampo de fosfato
dissoluo utilizado normalmente de 500 a 1000 ml e a
velocidade de rotao aplicada de 50 r/min a 100 r/min; no Para preparar as solues tampo de fosfato indicadas no
deve exceder 150 r/min. Quadro 7 mea 250,0 ml de soluo de fosfato monopotssico
0,2 M R num balo marcado de 1000 ml, junte o volume
Para o aparelho de fluxo contnuo, o dbito normalmente indicado de hidrxido de sdio 0,1 M e complete 1000,0 ml
ajustado para um valor compreendido entre 4 ml/min e com gua R.
50 ml/min.
2. Mtodos
Analticos
QUADRO 7 Solues tampo de fosfato
MEIOS DE DISSOLUO RECOMENDADOS pH 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8
NaOH (ml) 18,0 28,0 40,5 58,0 82,0 112,0
Podem ser utilizados os meios de dissoluo descritos a
seguir. pH 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0
NaOH (ml) 145,5 173,5 195,5 212,0 222,5 230,5
QUADRO 5 Exemplos de meios de dissoluo
pH Meio de dissoluo
Outras solues tampo de fosfato
Soluo tampo de fosfato de pH 4,5. Dissolva 13,61 g de
pH 1,0 HCl
fosfato monopotssico R em 750 ml de gua R; ajuste o
pH 1,2 NaCl, HCl
pH (2.2.3), se necessrio, com hidrxido de sdio 0,1 M ou
pH 1,5 NaCl, HCl
cido clordrico 0,1 M. Complete 1000,0 ml com gua R.
pH 4,5 Tampo de fosfato ou de acetato
pH 5,5 a 5,8 Tampo de fosfato ou de acetato Soluo tampo de fosfato de pH 5,5 R,
pH 6,8 Tampo de fosfato
Soluo tampo de fosfato de pH 6,8 R1,
pH 7,2 a 7,5 Tampo de fosfato
Soluo tampo de fosfato de pH 7,2 R,
A composio e o modo de preparao destes meios descrita Soluo tampo de fosfato de pH 7,5 (0,33 M) R.
a seguir.
Suco entrico artificial de pH 6,8
Meios de cido clordrico
Misture 250,0 ml de uma soluo contendo 6,8 g de fosfato
cido clordrico 0,2 M, monopotssico R, 77,0 ml de hidrxido de sdio 0,2 M e
Cloreto de sdio 0,2 M. Dissolva 11,69 g de cloreto de sdio 500 ml de gua R. Junte 10,0 g de p de pncreas R, misture
R em gua R e complete 1000,0 ml com o mesmo solvente. e ajuste o pH (2.2.3), se necessrio. Complete 1000,0 ml com
gua R.
Para preparar os meios com os valores de pH referidos no
quadro 6, mea 250,0 ml de cloreto de sdio 0,2 M para um Suco gstrico artificial
balo marcado de 1000 ml, junte o volume indicado de cido
clordrico 0,2 M e complete 1000,0 ml com gua R. Dissolva 2,0 g de cloreto de sdio R e 3,2 g de p de pepsina
R em gua R. Junte 80 ml de cido clordrico 1 M e complete
QUADRO 6 Meios com cido clordrico 1000,0 ml com gua R. Se necessrio, no utilize o p de
pepsina.
pH 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7
HCl (ml) 425,0 336,0 266,0 207,0 162,0 130,0 Aumento do pH
pH 1,8 1,9 2,0 2,1 2,2 No caso dos ensaios efectuados a pH crescente, pode utilizar
HCl (ml) 102,0 81,0 65,0 51,0 39,0 uma das sequncias seguintes:
Tempo (h) 0-1 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7

Os meios com cido clordrico tambm podem ser preparados pH 1,0
com cloreto de potssio em vez de cloreto de sdio. pH 1,2 6,8
pH 1,2 2,5 4,5 7,0 7,5
Solues tampo de acetato
pH 1,5 4,5 7,2
cido actico 2 M. Tome 120,0 g de cido actico glacial R e
complete 1000,0 ml com gua R, Para obter estas variaes de pH possvel adoptar vrios
mtodos:
Soluo tampo de acetato de pH 4,5. Dissolva 2,99 g
de acetato de sdio R em gua R. Junte 14,0 ml de cido substituio de uma soluo tampo por outra
actico 2M e complete 1000,0 ml com gua R. (substituio total),
Soluo tampo de acetato de pH 5,5. Dissolva 5,98 g realizao de colheitas sucessivas de metade do volume do
de acetato de sdio R em gua R. Junte 3,0 ml de cido meio (substituio a 1/2), substituindo-o por uma soluo
actico 2 M e complete 1000,0 ml com gua R. tampo de pH mais elevado: o pH inicial 1,2 e a segunda
soluo utilizada a soluo tampo de fosfato de pH 7,5,
Soluo tampo de acetato de pH 5,8. Dissolva 6,23 g
de acetato de sdio R em gua R. Junte 2,1 ml de cido juno de uma dose de uma mistura em p contendo
actico 2 M e complete 1000,0 ml com gua R. tris(hidroximetil)aminometano R e acetato de sdio

2.9.4. Ensaio de dissoluo dos adesivos transdrmicos
anidro R a uma soluo inicial de pH 1,5, de modo a obter Quando se apresenta uma justificao para um tempo de
um pH de 4,5, e juno de uma segunda dose de modo a libertao superior ao acima indicado, podem ser prescritos
obter um pH de 7,2: limites com 2 tempos.
soluo clordrica de pH 1,5. Dissolva 2 g de cloreto de
sdio R em gua R, junte 31,6 ml de cido clordrico R e Formas de libertao prolongada
complete 1000,0 ml com gua R, Para as formas de libertao prolongada, a especificao de
2. Mtodos
Analticos
dissoluo estabelecida pelo fabricante refere normalmente 3

soluo tampo de pH 4,5. Misture 2,28 g de
pontos ou mais. Com o primeiro ponto procura-se controlar
tris(hidroximetil)aminometano R e 1,77 g de acetato de
uma libertao demasiado rpida da substncia activa (dose
sdio anidro R e dissolva esta mistura na soluo clordrica dumping); o tempo escolhido corresponde, em regra, a uma
de pH 1,5 descrita antes, taxa de dissoluo de 20 por cento a 30 por cento. O segundo
soluo tampo de pH 7,2. Misture 2,28 g de ponto define o perfil de dissoluo e corresponde a uma taxa
tris(hidroximetil)aminometano R e 1,77 g acetato de sdio de libertao de cerca de 50 por cento. O ltimo ponto serve
anidro R e dissolva esta mistura na soluo tampo de pH para verificar que a libertao da substncia praticamente
4,5 descrita antes. total, pelo que ser, de acordo com o critrio de aceitao
mais vulgar, superior a 80 por cento.
Para proceder em gradiente contnuo de pH, possvel
utilizar a clula de fluxo contnuo. Formas de libertao retardada
Consoante o modo como foram formuladas, as formas
QUALIFICAO E VALIDAO de libertao retardada podem libertar a(s) substncia(s)
activa(s) fraccionadamente ou na totalidade, quando so
Devido natureza do mtodo de ensaio, a qualidade da ensaiadas em meios de dissoluo diferentes (por exemplo,
concepo dos equipamentos utilizados para os ensaios em condies de pH crescente). As especificaes de
de dissoluo in vitro um aspecto importante da sua dissoluo so ento estabelecidas caso a caso.
qualificao. Evita-se qualquer perturbao de origem As formas gastrorresistentes requerem pelo menos
mecnica, como a vibrao ou a agitao indesejada. especificaes de dois pontos no caso de um ensaio
sequencial, e 2 especificaes diferentes no caso de um
A qualificao do equipamento deve atender s dimenses e
ensaio em paralelo. No ensaio sequencial, o primeiro ponto
s tolerncias do aparelho. Os parmetros crticos, como a
corresponde a uma exposio de 1 h ou 2 h em meio cido e
temperatura e o volume do meio de dissoluo, a velocidade o segundo ponto a um tempo de permanncia pr-definido
de rotao ou o dbito do lquido, as tomadas de ensaio numa soluo tampo apropriada (de preferncia de pH 6,8).
e os mtodos de colheita, devem ser objecto de controlos Salvo indicao em contrrio, o valor de Q 75 por cento.
peridicos durante os perodos de utilizao.
O desempenho do equipamento pode ser controlado atravs
da realizao de um ensaio com um produto padro sensvel 2.9.4. ENSAIO DE DISSOLUO
variao das condies hidrodinmicas. Estes controlos DOS ADESIVOS TRANSDRMICOS
podem ser efectuados periodicamente ou em contnuo, sendo
comparados com os resultados obtidos noutros laboratrios. O ensaio tem como objectivo determinar a velocidade de
No decorrer dos ensaios necessrio ter poder de observao dissoluo das substncias activas existentes nos adesivos
e esprito crtico, o que particularmente importante para transdrmicos.
justificar eventuais resultados aberrantes.
1. Mtodo do aparelho com disco
A validao dos sistemas automatizados, quer incida
apenas na amostragem e na anlise, quer inclua tambm a
preparao dos meios de dissoluo e a realizao do ensaio, APARELHO
deve abranger a exactido, a fidelidade e a eliminao de
riscos de contaminao no decurso das operaes de diluio, Utilize a p e o recipiente do aparelho com p agitadora
descrito no ensaio de dissoluo das formas slidas (2.9.3),
de transferncia, de limpeza e de preparao das amostras ou
e um disco constitudo por um crivo de ao inoxidvel com
dos solventes.
uma abertura de malha de 125 m (figura 1) que se destina
a manter o adesivo transdrmico imerso e que concebido
de modo a reduzir ao mnimo o volume morto do fundo do
ESPECIFICAES DE DISSOLUO DAS FORMAS ORAIS
recipiente. O disco mantm o adesivo transdrmico plano
com a superfcie de libertao para cima e paralela ao bordo
Uma especificao de dissoluo a quantidade Q de inferior da p. Durante o ensaio, a distncia entre o bordo
substncia activa, expressa em percentagem do teor indicado inferior da p e a superfcie do disco de 25 2 mm (figura
no rtulo, que se dissolve num intervalo de tempo prescrito. 2). Mantenha a temperatura a 32 0,5C. O recipiente pode
ser coberto para reduzir a evaporao.
Formas de libertao convencional
Salvo indicao em contrrio, o valor de Q 75 por cento. Na MTODO
maior parte dos casos, em condies operatrias aceitveis
e justificadas, a quantidade de substncia activa libertada , Introduza no recipiente o volume de lquido de dissoluo
pelo menos, 75 por cento em 45 minutos. usual especificar indicado e regule a temperatura para o valor especificado.
um limite nico que procura garantir que a maior parte da Aplique o adesivo transdrmico sobre o disco de modo
substncia activa se dissolve no intervalo de tempo definido. que a superfcie de libertao se apresente o mais plana

2.9.4. Ensaio de dissoluo dos adesivos transdrmicos
possvel. O sistema pode ser fixado no disco com um adesivo transdrmicos do tipo reservatrio. Coloque o adesivo
apropriado ou com uma fita adesiva de dupla face. Qualquer transdrmico colado sobre o disco no fundo do recipiente,
que seja o mtodo de fixao utilizado, verifique previamente com a superfcie de libertao virada para cima. Ponha
que no interfere no doseamento ou que no adsorve a(s) imediatamente o aparelho em funcionamento, a 100
substncia(s) activa(s). Pressione o adesivo transdrmico plano rotaes por minuto, por exemplo. Em intervalos de tempo
contra a superfcie adesiva do disco, mantendo a superfcie determinados, recolha uma tomada de ensaio numa zona
de libertao voltada para cima. Aps a colocao do adesivo que se situa a meia-distncia entre a superfcie do lquido de
2. Mtodos
Analticos
transdrmico, a superfcie no ultrapassa a do disco. No caso dissoluo e a parte superior da p e a, pelo menos, 1 cm da
de a preparao ser homognea e se encontrar uniformemente parede do recipiente.
distribuda no suporte externo, pode avaliar-se a velocidade
de dissoluo num pedao do adesivo transdrmico com as Proceda ao doseamento em cada uma das amostras,
dimenses apropriadas e medido com preciso. Pode proceder compensando, se for necessrio, o volume de lquido retirado.
do mesmo modo para obter condies de imerso adequadas Repita o ensaio para cada sistema.
mas no pode recorrer a este processo para adesivos
2. Mtodo da clula
Rede de ao inoxidvel
de malha de 125 m APARELHO
Utilize a p e o recipiente do aparelho descrito no ensaio de

dissoluo das formas slidas (2.9.3), com o complemento da
clula (clula).
A clula constituda por um material quimicamente inerte
e composta por um suporte, uma cobertura e, se for
necessrio, por uma membrana colocada sobre o sistema
em estudo para o isolar do meio, se este for susceptvel de
modificar ou alterar as suas propriedades fsico-qumicas
(figura 3).
Suporte. O suporte inclui, na sua parte central, uma
cavidade destinada a receber o adesivo transdrmico. Esta
cavidade tem uma profundidade de 2,6 mm e um dimetro
adaptado s dimenses do sistema em ensaio. Pode utilizar
os seguintes dimetros: 27 mm, 38 mm, 45 mm e 52 mm,
que correspondem, respectivamente, aos volumes de 1,48 ml,
2,94 ml, 4,13 ml e 5,52 ml.
Cobertura. A cobertura inclui uma abertura central cujo
dimetro funo das dimenses do sistema em estudo,
o que permite centrar o sistema com exactido e limitar a
FIGURA 1 Disco superfcie de difuso. Pode utilizar os seguintes dimetros:
Dimenses em milmetros 20 mm, 32 mm, 40 mm e 50 mm, que correspondem,
respectivamente, s superfcies de 3,14 cm2, 8,03 cm2,
12,56 cm2 e 19,63 cm2. A cobertura mantida na posio
adequada por porcas apertadas em parafusos fixados na base
do suporte. A estanquicidade assegurada por uma junta de
borracha adaptada base do suporte.
Clula de extraco. A clula mantm o sistema em ensaio na
posio horizontal, com a superfcie de libertao para cima e
paralela ao bordo inferior da p. Durante o ensaio, a distncia
Recipiente
entre o bordo inferior da p e a superfcie do disco de
25 2 mm (figura 4).
Mantenha a temperatura a 32 0,5C. O recipiente pode ser
P coberto para reduzir a evaporao.
MTODO
Introduza no recipiente o volume de lquido de dissoluo

indicado e regule a temperatura para o valor especificado.
Centre exactamente o sistema na clula, com a superfcie
de libertao para cima. Feche a clula aplicando
eventualmente nos bordos planos uma substncia hidrfoba
(vaselina, por exemplo) para garantir a estanquicidade, e
Disco
verifique se o sistema se mantm na posio apropriada.
FIGURA 2 P e disco Introduza a clula no recipiente, em posio horizontal e
Dimenses em milmetros com a cobertura para cima.

2.9.5. Uniformidade de massa das preparaes apresentadas em formas farmacuticas unitrias
Proceda ao doseamento em cada uma das amostras,

compensando, se for necessrio, o volume de lquido retirado.
Repita o ensaio para cada sistema.
porcas 3. Mtodo do cilindro rotativo

2. Mtodos
Analticos
APARELHO
Utilize o aparelho com p agitadora descrito no ensaio de

tampa dissoluo das formas slidas (2.9.3), substituindo a p e a
haste por um agitador cilndrico de ao inoxidvel (cilindro)
(ver figura 5). No incio de cada determinao, coloque cada
sistema sobre o cilindro. Durante o ensaio, a distncia entre
membrana o fundo do recipiente e o cilindro de 25 2 mm. Mantenha
a temperatura a 32 0,5C. O recipiente est coberto para
reduzir a evaporao.
parafuso MTODO
junta de
borracha Introduza no recipiente o volume de lquido de dissoluo
reservatrio indicado e regule a temperatura para o valor especificado. Retire
a pelcula protectora do sistema e aplique a face adesiva sobre
uma membrana porosa inerte apropriada cujas dimenses
ultrapassem as do sistema em, pelo menos, 1 cm. Coloque o
conjunto sobre uma superfcie limpa, com a qual contacta a
membrana. Pode utilizar 2 processos de fixao no cilindro:
aplique um adesivo apropriado sobre os bordos da
membrana e, se for necessrio, na parte posterior do
sistema,
aplique uma fita adesiva de face dupla na parede exterior
do cilindro.
Aplique com precauo a face externa do sistema (face no
adesiva) ao cilindro, pressionando ligeiramente de modo
que a superfcie de libertao contacte com o lquido de
FIGURA 3 Clula de extraco
dissoluo e que o eixo longitudinal do sistema rodeie o
Dimenses em milmetros cilindro.
Qualquer que seja o processo de fixao utilizado,
verifique previamente que no interfere no doseamento ou
que no adsorve a(s) substncia(s) activa(s).
Instale o cilindro no aparelho e ponha-o imediatamente em
funcionamento, a 100 rotaes por minuto, por exemplo.
Em intervalos de tempo determinados, recolha uma tomada
de ensaio numa zona que se situa a meia-distncia entre a
P superfcie do lquido e o bordo superior do cilindro e a, pelo
menos, 1 cm da parede.
Proceda ao doseamento em cada uma das amostras,
Recipiente compensando, se for necessrio, o volume de lquido retirado.
Repita o ensaio para cada sistema.
INTERPRETAO
A amostra satisfaz ao ensaio se a quantidade de

substncia activa que passa para a soluo, expressa em
Clula quantidade por superfcie e por unidade de tempo, estiver
de extraco compreendida entre os limites indicados para os diferentes
tempos de colheita previamente definidos.
FIGURA 4 Aparelho com p e clula de extraco

2.9.5. UNIFORMIDADE DE MASSA DAS
Ponha imediatamente o aparelho cm funcionamento, a 100
PREPARAES APRESENTADAS EM
rotaes por minuto, por exemplo. Em intervalos de tempo FORMAS FARMACUTICAS UNITRIAS
determinados, recolha uma tomada de ensaio numa zona que se
situa a meia-distncia entre a superfcie do lquido de dissoluo Pese individualmente 20 unidades, ou para as preparaes
e a parte superior da p e a, pelo menos, 1 cm da parede. ubitrias apresentadas em recipientes individuais o contedo

2.9.6. Uniformidade de teor das preparaes apresentadas em formas farmacuticas unitrias
Quatro orifcios equidistantes
2. Mtodos
Analticos
de dimetro 1,111 Ajustamento fechado
dispostos num crculo
de 2,540 de dimetro com
um ngulo de 63,4 0,5
em relao superfcie
Raio mximo 0,300
TOLERNCIAS 0,0127 Adaptador

para os
sistemas
ACABAMENTO DA SUPERFCIE: de grande
Desengordurar antes de montar dimetro
o agitador no eixo
MATERIAL: Ao inoxidvel
FIGURA 5 Agitador cilndrico

Dimenses em centmetros
de 20 unidades, retiradas ao acaso do mesmo lote e determine CPSULAS

a massa mdia. No mais do que 2 das 20 unidades podero
diferir da massa mdia encontrada em percentagem superior Pese uma cpsula cheia. Sem perder quaisquer fragmentos
da tabela abaixo indicada e em nenhum caso poder a diferena do invlucro, abra a cpsula e extraia o seu contedo to
exceder o dobro dessa percentagem. completamente quanto possvel.
No caso das cpsulas e dos ps para preparaes No caso de cpsulas de invlucro mole, lave este com
um solvente apropriado e deixe-o exposto ao ar livre at
injectveis proceda do seguindo modo:
desaparecimento do cheiro do solvente. Pese o invlucro e
Forma farmacutica Massa mdia Desvios limite
calcule a massa do contedo por diferena. Repita a operao
em percentagem
em mais 19 cpsulas.
da massa mdia
Comprimidos no at 80 mg 10
PS PARA PREPARAES INJECTVEIS
revestidos e comprimidos mais de 80 mg e
peliculados menos de 250 mg 7,5
Depois de retirar, se for caso disso, o rtulo do recipiente e
de proceder lavagem e secagem da sua superfcie externa,
250 mg ou mais 5
abra-o e pese-o imediatamente com o seu contedo. Extraia
Cpsulas, granulados menos de 300 mg 10 este ltimo to completamente quanto possvel, sacudindo
no revestidos e ps 300 mg ou mais 7,5
cuidadosamente o frasco e lavando-o, se necessrio, com gua
R e depois com etanol a 96 por cento R. Seque-o a 100-105C
(em formas unitrias)
durante 1 hora ou, se o material no suporta esta temperatura,
Ps para uso parentrico mais de 40 mg 10 seque-o a temperatura inferior at massa constante. Deixe
(em formas unitrias) (1) arrefecer em exsicador e pese. Calcule a massa do contedo por
diferena. Repita a operao com mais 19 recipientes.
Supositrios e vulos sem distino de massa 5
Ps para colrios e menos de 300 mg 10

ps para solues para 300 mg ou mais 7,5 2.9.6. UNIFORMIDADE DE TEOR DAS
lavagem oftlmica PREPARAES APRESENTADAS EM
(em formas unitrias)
FORMAS FARMACUTICAS UNITRIAS
(1) Sempre que a massa mdia for igual ou inferior a 40 mg a
preparao no submetida ao ensaio de uniformidade de massa, mas O ensaio de uniformidade de teor das preparaes
sim ao ensaio de uniformidade de teor das preparaes unitrias (2.9.6). apresentadas em formas farmacuticas unitrias baseia-se

2.9.7. Friabilidade dos comprimidos no revestidos
na determinao do teor individual em substncia activa das 2.9.7. FRIABILIDADE DOS

unidades que constituem a amostra, permitindo verificar se
se encontram ou no dentro dos limites estabelecidos em COMPRIMIDOS NO REVESTIDOS
relao ao teor mdio da amostra.
Este captulo destina-se a fornecer indicaes sobre a
O ensaio no obrigatrio para as preparaes polivitamnicas determinao da friabilidade dos comprimidos no revestidos.
ou que contenham oligoelementos e ainda para outros casos O mtodo de proceder ao ensaio descrito geralmente
2. Mtodos
Analticos
justificados e autorizados. aplicvel maior parte dos comprimidos. A determinao

Mtodo. Tome ao acaso 10 unidades da amostra e doseie da friabilidade complementa outras determinaes da
resistncia mecnica, por exemplo a resistncia ruptura
individualmente a substncia activa em cada uma,
(dureza).
recorrendo a um mtodo analtico apropriado.
Utilize os critrios de avaliao do ensaio A, do ensaio B ou
do ensaio C conforme o especificado na monografia da forma APARELHO
farmacutica considerada.
Utilize um tambor rotativo constitudo por um polmero
sinttico transparente com 283 a 291 mm de dimetro
ENSAIO A interno e 36 a 40 mm de altura com superfcies internas
polidas e que no origine electricidade esttica (ver a figura).
No caso dos comprimidos, ps para uso parentrico, Uma das faces do tambor amovvel. Durante uma rotao,
preparaes para aplicao oftlmica e suspenses os comprimidos so projectados do centro do tambor para a
injectveis, a preparao satisfaz ao ensaio se o teor parede exterior segundo uma trajectria curvilnea de raio
individual de cada unidade estiver compreendido entre 85 a interior compreendido entre 75,5 mm e 85,5 mm. O dimetro
115 por cento do teor mdio. No satisfaz ao ensaio se o teor externo do anel central de 24,5-25,5 mm. O tambor est
individual de mais de uma unidade se afastar destes limites montado no eixo horizontal de um motor cuja velocidade
ou se o teor individual de uma unidade se afastar dos limites de rotao de 25 1 rotaes por minuto. Deste modo,
de 75 a 125 por cento do teor mdio. em cada rotao os comprimidos rolam ou deslizam e caem
sobre a parede ou uns sobre os outros.
Se o teor individual de uma s unidade ultrapassar os limites
de 85 e 115 por cento, mas estiver ainda entre 75 a 125 por
cento do teor mdio, tome ao acaso mais 20 unidades e
doseie individualmente a sua substncia activa. A preparao
Altura
satisfaz ao ensaio se o teor individual de no mais de uma das de
30 unidades ensaiadas se afastar dos limites de 85 a 115 por queda
cento do valor mdio e se nenhuma ultrapassar os limites de
75 a 125 por cento do mesmo teor. 80,5 5,0 mm
(raio interior)
ENSAIO B
No caso das cpsulas, ps no destinados a uso parentrico,

granulados, supositrios e vulos, a preparao satisfaz ao
ensaio se o teor individual de uma s unidade se afastar dos
limites de 85 a 115 por cento do teor mdio mas se no se
afastar de 75 a 125 por cento do mesmo valor. A preparao Dimenses em milmetros
no satisfaz ao ensaio se o teor individual de mais de 3
unidades se afastar dos limites de 85 a 115 por cento do teor No caso de comprimidos de massa unitria inferior ou
mdio ou se o teor de uma ou mais unidades se afastarem dos igual a 650 mg, utilize um nmero de comprimidos inteiros
limites de 75 a 125 por cento do mesmo valor. correspondendo tanto quanto possvel a uma massa de 6,5 g;
no caso de comprimidos de massa unitria superior a 650 mg,
Se o teor individual de 2 ou 3 unidades ou mais se afastar utilize 10 comprimidos inteiros. Coloque os comprimidos
dos limites de 85 a 115 por cento do teor mdio e se nenhum num tamis n 1000 e elimine o p com ar comprimido ou
teor individual se afastar dos limites de 75 a 125 por cento com uma escova macia. Pese exactamente os comprimidos
do mesmo teor, tome ao acaso outras 20 unidades e doseie e coloque-os no tambor. Submeta-os a 100 rotaes e retire
individualmente a substncia activa em cada uma delas. A os comprimidos do tambor. Elimine o p como se descreveu
preparao satisfaz ao ensaio se os teores individuais de no anteriormente. Se nenhum dos comprimidos estiver partido
mais de 3 unidades em 30 se afastarem dos limites de 85 ou rachado, determine a massa total em miligramas.
a 115 por cento do teor mdio e se nenhum dentre eles se
afastar dos limites de 75 a 125 por cento do mesmo valor. Em regra, no necessrio repetir o ensaio. No entanto,
se os resultados forem ambguos, se a amostra apresentar
comprimidos visivelmente fissurados ou partidos ou; se a
ENSAIO C perda de massa for superior a 1 por cento; repita o ensaio
mais 2 vezes e calcule a mdia dos 3 resultados. A perda
No caso dos adesivos transdrmicos a preparao satisfaz ao mxima de massa que considerada aceitvel, para a maior
ensaio se o teor mdio das 10 unidades da preparao estiver parte dos produtos, de 1 por cento da massa total dos
compreendido entre 90 e 110 por cento do teor indicado comprimidos submetidos ao ensaio.
no rtulo e se o teor individual de cada unidade estiver No caso de comprimidos com dimetro igual ou superior a
compreendido ente 75 e 125 por cento do mesmo valor.
13 mm podem surgir problemas de reprodutibilidade relacio-

2.9.8. Dureza dos comprimidos
nados com a irregularidade dos movimentos. Ajuste a posio APARELHAGEM

do tambor de modo a evitar a aglomerao dos comprimidos
na posio de repouso e que os impea de cair livremente. A aparelhagem composta por um penetrmetro,
Em regra, pode conseguir-se este objectivo inclinando o compreendendo um suporte e um mvel. A figura 1
tambor de modo que o eixo forme um ngulo de 10 com a representa um exemplo do aparelho apropriado.
base.
2. Mtodos
Analticos
Os comprimidos efervescentes e os comprimidos destinados
a serem partidos podem ser objecto de especificaes
particulares quanto friabilidade.
Para os comprimidos higroscpicos, o ensaio deve ser
realizado em atmosfera de humidade controlada.
tambm autorizado o emprego do aparelho de dupla
pala ou de aparelhos que possuam vrios tambores para a
avaliao simultnea de vrias amostras.
2.9.8. DUREZA DOS COMPRIMIDOS

Este ensaio destina-se a medir, em condies determinadas, a
dureza dos comprimidos, avaliada pela fora necessria para
provocar a sua ruptura por esmagamento.
APARELHO
O aparelho constitudo por duas maxilas colocadas face

a face, deslocando-se uma delas em direco outra. A
superfcie plana das maxilas perpendicular ao sentido do
deslocamento. A superfcie de esmagamento das maxilas
plana e maior que a zona de contacto com o comprimido. O
aparelho calibrado com um sistema cuja preciso de cerca
de 1 newton.
MTODO FIGURA 1 Penetrmetro
Coloque o comprimido entre as maxilas atendendo, se A. Escala, graduada em dcimos de milmetro, indicando a
for esse o caso, forma, ranhura e gravao; em cada profundidade de penetrao
determinao, oriente os comprimidos sempre do mesmo B. Eixo vertical servindo de suporte e guia do mvel
modo relativamente direco de aplicao da fora. Efectue C. Dispositivo de travagem e de libertao do mvel de
a medio em 10 comprimidos, eliminando todos os resduos levantamento automtico e de durao programada
antes de cada determinao.
D. Dispositivo permitindo assegurar a verticalidade do mvel e a
Este processo no se aplica quando se utiliza um aparelho horizontalidade da base
totalmente automtico. E. Mvel (ver figuras 16 e 17)
F. Recipiente
EXPRESSO DOS RESULTADOS G. Base horizontal
H. Regulao da horizontalidade da placa.
Exprima os resultados indicando o valor mdio e os valores
mximo e mnimo das foras avaliadas, exprimindo sempre em O mvel, constitudo por um material apropriado, tem a
newton. superfcie lisa e caracterizado pela sua forma, dimenses e
massa.
Indique o tipo de aparelho e, se necessrio, a orientao dos
As figuras 2 e 3 representam exemplos de mveis apropriados.
comprimidos.
MTODO
2.9.9. DETERMINAO DA
CONSISTNCIA POR PENETROMETRIA Prepare as amostras segundo um dos mtodos seguintes:
A. Encha completamente 3 recipientes, com precauo,
Este ensaio destina-se a medir, em condies determinadas e evitando a formao de bolhas de ar. Se necessrio, nivele
validadas, a penetrao de um mvel no produto a examinar, para obter uma superfcie plana. Conserve a 25 0,5C
contido num recipiente de dimenses e forma definidas. durante 24 h, salvo indicao em contrrio.

2.9.9. Determinao da consistncia por penetrometria

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 2 Mvel cnico (m = 102,5 g), com recipiente (d = 102 mm ou 75 mm, h 62 mm) e haste (l = 162 mm; m = 47,5 g) apropriados
FIGURA 3 Micro-mvel cnico (m = 7,0 g), com recipiente e haste apropriados (l = 116 mm; m = 16,8 g)
B. Conserve 3 amostras a 25 0,5C durante 24 h. Submeta superfcie perpendicular ao eixo vertical do mvel. Leve
as amostras a uma tenso de corte apropriada durante a temperatura do mvel a 25 0,5C. Ajuste a altura do
5 min. Encha completamente 3 recipientes, com mvel de modo que a sua ponta toque ao de leve a superfcie
precauo, evitando a formao de bolhas de ar. Se da amostra. Liberte o mvel durante 5 s, fixe-o de novo e
necessrio nivele, para obter uma superfcie plana. mea a profundidade de penetrao. Repita o ensaio com os 2
recipientes restantes.
C. Funda 3 amostras e depois encha completamente 3
recipientes, com precauo, evitando a formao de
bolhas de ar. Conserve a 25 0,5C durante 24 h, salvo EXPRESSO DOS RESULTADOS
indicao em contrrio. A profundidade de penetrao expressa em dcimos de
Determinao da profundidade de penetrao. Coloque a milmetro pela mdia aritmtica dos 3 resultados de medida.
amostra sobre a base do penetrmetro. Verifique se a sua Se alguns dos resultados se afastarem da mdia mais de 3 por

2.9.10. Teor em etanol e tabelas alcoomtricas
cento, repita o ensaio e exprima os resultados indicando a Aparelho. O aparelho (ver figura 1) constitudo por um
mdia das 6 determinaes e o desvio padro relativo. balo (A), de fundo redondo, ligado por uma alonga (B) a um
refrigerante (C) mantido em posio vertical. Este munido
na parte inferior de um tubo (D) que conduz o destilado para
2.9.10. TEOR EM ETANOL a parte bojuda de um balo marcado de 100 ml ou de 250 ml.
Este balo mergulha numa mistura de gua com gelo (E)
E TABELAS ALCOOMTRICAS durante a destilao. Um disco perfurado, com uma abertura
2. Mtodos
Analticos
circular de 6 cm de dimetro, colocado por baixo do balo
As preparaes farmacuticas lquidas que contm etanol (A), permite evitar que nas paredes deste haja uma eventual
e somente s quais se aplica o presente mtodo, contm pirogenao das matrias dissolvidas.
tambm substncias dissolvidas que se torna necessrio
separar por destilao do lcool a dosear. Quando esta
destilao arrasta substncias volteis, alm do lcool e
da gua, as precaues eventuais a tomar so indicadas na QUADRO 1 Relao entre a massa volmica, a densidade
respectiva monografia. e o teor em etanol
20 Densidade do destilado Teor em etanol
O teor em etanol de um lquido expresso pelo nmero de (kg.m3) determinada no ar por cento V/V
volumes de etanol, determinados a 20 0,1C, contidos em d20 a 20C
20
100 volumes do lquido. Este nmero representa o ttulo
alcoomtrico volmico expresso em percentagem (por cento 968,0 0,969 7 25,09
V/V). Este teor pode igualmente ser expresso em gramas de 968,5 0,970 2 24,64
969,0 0,970 7 24,19
etanol por 100 g de lquido. Este nmero representa o ttulo 969,5 0,971 2 23,74
alcoomtrico mssico (por cento m/m). 970,0 0,971 7 23,29
970,5 0,972 2 22,83
A relao entre a massa volmica a 20 0,1C, a densidade 971,0 0,972 7 22,37
(referida ao vazio) e o ttulo alcoomtrico de uma mistura 971,5 0,973 3 21,91
de gua e etanol dada nas tabelas alcoomtricas da 972,0 0,973 8 21,45
972,5 0,974 3 20,98
Organizao Internacional de Metrologia Legal, 1972, 973,0 0,974 8 20,52
Recomendao Internacional n 22. 973,5 0,975 3 20,05
974,0 0,975 8 19,59
974,5 0,976 3 19,12
975,0 0,976 8 18,66
975,5 0,977 3 18,19
976,0 0,977 8 17,73
976,5 0,978 3 17,25
977,0 0,978 8 16,80
977,5 0,979 3 16,34
978,0 0,979 8 15,88
978,5 0,980 3 15,43
979,0 0,980 8 14,97
979,5 0,981 3 14,52
980,0 0,981 8 14,07
980,5 0,982 3 13,63
981,0 0,982 8 13,18
981,5 0,983 3 12,74
982,0 0,983 8 12,31
982,5 0,984 3 11,87
983,0 0,984 8 11,44
983,5 0,985 3 11,02
984,0 0,985 8 10,60
984,5 0,986 3 10,18
985,0 0,986 8 9,76
985,5 0,987 3 9,35
986,0 0,987 8 8,94
986,5 0,988 3 8,53
987,0 0,988 8 8,13
987,5 0,989 3 7,73
988,0 0,989 8 7,34
988,5 0,990 3 6,95
989,0 0,990 8 6,56
989,5 0,991 3 6,17
990,0 0,991 8 5,79
990,5 0,992 3 5,42
991,0 0,992 8 5,04
991,5 0,993 3 4,67
992,0 0,993 8 4,30
992,5 0,994 3 3,94
993,0 0,994 8 3,58
993,5 0,995 3 3,22
994,0 0,995 8 2,86
994,5 0,996 3 2,51
995,0 0,996 8 2,16
995,5 0,997 3 1,82
996,0 0,997 8 1,47
996,5 0,998 3 1,13
997,0 0,998 8 0,80
997,5 0,999 3 0,46
FIGURA 1 Aparelho para determinar o teor em etanol
998,0 0,999 8 0,13

2.9.14 Superfcie especfica por permeabilidade ao ar
Mtodo pelo picnmetro. No balo de destilao introduza Conformidade do sistema:

25,0 ml da amostra, medidos a 20 0,1C; dilua com 100 a
propanol: nenhum pico corresponde ao propanol no
150 ml de gua destilada R e junte uma pequena quantidade
cromatograma obtido com a soluo problema (b),
de pedra-pomes. Adapte a alonga e o refrigerante, destile e
recolha, pelo menos, 90 ml de destilado no balo marcado de relao pico/vale: no mnimo 15, com Hp = altura acima
100 ml. Ajuste a temperatura do destilado para 20 0,1C da linha de base do pico devido ao 2-propanol e Hv = altura
e complete 100,0 ml com gua destilada R a 20 0,1C. acima da linha de base do ponto mais baixo do traado
2. Mtodos
Analticos
Determine a 20 0,1C a densidade relativa com um entre esse pico e o pico devido ao etanol do cromatograma
picnmetro. obtido com a soluo padro (a),
Os valores indicados na coluna 3 da tabela anexa so relao sinal/rudo: no mnimo 10, para os picos devidos
multiplicados por 4 para obter a percentagem V/V de etanol ao metanol e ao 2-propanol, do cromatograma obtido com
na amostra. Aps calcular o teor em etanol com ajuda da a soluo padro (b).
tabela, arredonde o resultado para uma casa decimal.
2.9.12. CLASSIFICAO
2.9.11. PESQUISA DE METANOL GRANULOMTRICA DOS PS
E DE 2-PROPANOL POR TAMISAO
Proceda por cromatografia em fase gasosa (2.2.28). A tenuidade de um p pode exprimir-se em relao aos
tamises que cumprem as especificaes dos tamises no
Soluo do padro interno. Prepare uma soluo contendo analticos (2.1.4).
2,5 por cento V/V de propanol R em etanol R1.
Quando a tenuidade dos ps determinada por tamisao,
Soluo problema (a). A um determinado volume do definida em funo do ou dos nmeros do ou dos tamises
destilado junte 2,0 ml da soluo do padro interno. Ajuste o utilizado(s) recorrendo classificao seguinte ou, se esta
teor em etanol (2.9.10) para 10,0 por cento V/V completando classificao no puder ser aplicada, exprimindo a tenuidade
50 ml com gua R ou juntando etanol R1. em percentagem (m/m) de p que passa atravs do(s)
Soluo problema (b). Ajuste o teor em etanol (2.9.10) de tamis(es) utilizado(s).
um determinado volume do destilado a 10 ,0 por cento V/V e a seguinte a terminologia utilizada para definir os ps:
complete 50 ml com gua R ou juntando etanol R1.
Soluo padro (a). Prepare 50 ml de uma soluo contendo P grosso. P em que, no mnimo, 95 por cento da massa
2,0 ml de soluo do padro interno, 3,0 ml de etanol R1, do p passa atravs de um tamis nmero 1400 e em que no
0,05 por cento V/V de 2-propanol R e metanol anidro R em mais de 40 por cento em massa passa atravs de um tamis
quantidade suficiente para obter no total 0,05 por cento V/V nmero 355.
de metanol, tendo em conta o teor em metanol do etanol R1.
P medianamente fino. P em que, no mnimo, 95 por cento
Soluo padro (b). Prepare uma soluo de etanol R1 a 10,0
da massa do p passa atravs de um tamis nmero 355 e em
por cento V/V contendo 0,0025 por cento V/V de metanol R e
que no mais de 40 por cento da massa passa atravs de um
0,0025 por cento V/V de 2-propanol R. tamis nmero 180.
Coluna:
material: slica fundida, P fino. P em que, no mnimo, 95 por cento da massa do p
passa atravs de um tamis nmero 180 e em que no mais
dimenses: l = 30 m; = 0,53 mm, de 40 por cento da massa passa atravs de um tamis nmero
125.
fase estacionria: poli[(cianopropil)(fenil)][dimetil]
siloxano R (espessura da pelcula 3 m).
P muito fino. P em que, no mnimo, 95 por cento da massa
Gs vector: hlio para cromatografia R. do p passa atravs de um tamis nmero 125 e em que no
Dbito: 2 ml/min. mais de 40 por cento da massa passa atravs de um tamis
nmero 90.
Razo de diviso: 1:10.
Quando o p caracterizado por um nmero de tamis, o
Temperatura: tamis com esse nmero deixa passar, no mnimo, 97 por
cento do p, salvo indicao em contrrio.
Intervalo Temperatura
(min) (C) Monte o conjunto dos tamises e proceda de modo apropriado
at que a tamisao esteja praticamente concluda. Pese cada
Coluna 0-5 35 fraco.
5-15 35 85
Cmara de injeco 250

2.9.14. SUPERFCIE ESPECFICA
Detector 250 POR PERMEABILIDADE AO AR
Este ensaio destina-se a determinar a superfcie especifica,
Deteco: ionizao de chama.
expressa em m2/g, de ps secos cuja tenuidade seja inferior
Injeco: 1,0 l. mais pequena abertura de malha dos tamises. O efeito

2.9.14. Superfcie especfica por permeabilidade ao ar
produzido pela deslocao das molculas (deslizamento), que

pode ser importante na anlise de ps com granulometria
inferior a alguns micrmetros, no considerado na equao
que permite calcular a superfcie especfica.
APARELHO
2. Mtodos
Analticos
O aparelho constitudo pelos seguintes elementos:
a) Uma clula de permeabilidade (ver figura 1) constituda
por um tubo cilndrico (A), de vidro ou de um metal
inaltervel, com um dimetro interno de 12,6 0,1 mm.
Este tubo inclui, na extremidade inferior, um elemento de
unio (um adaptador, por exemplo) que assegura a ligao
estanque com um manmetro (ver figura 2) e, a
50 15 mm da extremidade superior, um ressalto
com 0,5 a 1 mm de largura. Este ressalto faz parte
integrante do tubo, ou est fixado de modo a garantir
a estanquicidade, e suporta um disco perfurado (B) de
metal inaltervel, com uma espessura de 0,9 0,1 mm,
perfurado por 30 a 40 orifcios com um dimetro de 1 mm
e uniformemente distribudos.
O pisto (C), constitudo por um metal inaltervel,
move-se no interior do tubo, no devendo a folga lateral
ultrapassar 0,1 mm. A base do pisto forma um plano
com arestas vivas perpendicular ao eixo principal. Num
dos lados, uma ranhura com 3 mm de comprimento e
0,3 mm de profundidade permite a passagem do ar. A
extremidade superior apresenta um estrangulamento FIGURA 2 Manmetro
numa posio tal que, depois de se colocar o pisto no
lugar e o estrangulamento ao nvel do bordo superior do
tubo, a distncia entre a base do pisto e a superfcie do
disco perfurado (B) seja de 15 1 mm. Um manmetro em U (E) (ver figura 2) com um dimetro
externo nominal de 9 mm e um dimetro interno de 7 mm,
O disco de papel de filtro (D), de bordos lisos, tem um constitudo por um tubo de vidro de paredes padronizadas.
dimetro igual ao dimetro interno do tubo. Um dos braos apresenta, na extremidade superior, um
elemento de unio (F) que assegura a ligao estanque com
a clula de permeabilidade; apresenta tambm, abaixo da
tubuladura lateral, uma marca circular gravada (G) a
125-145 mm do bordo superior da tubuladura lateral, e
mais trs marcas situadas, respectivamente, 15, 70 e
110 mm abaixo da primeira. A tubuladura lateral, situada a
250-305 mm da base do manmetro, serve para retirar o ar
do brao ligado clula de permeabilidade e apresenta uma
torneira, no mximo, a 50 mm do brao do manmetro.
O manmetro encontra-se bem fixado de modo a garantir
a verticalidade dos braos e est cheio, at marca
inferior, com ftalato de dibutilo R adicionado de um
corante lipfilo.
MTODO
Se forem prescritas as operaes seguintes, seque o p que

constitui a amostra e passe atravs de um tamis apropriado
(125, por exemplo) para eliminar os aglomerados de
partculas.
Calcule a massa (M) de p a utilizar usando a frmula:
M = V (1 ) (Eq. 1)
V = volume aparente da camada de p comprimido,
= massa volmica da amostra, em gramas por mililitro,

FIGURA 1 Clulas de permeabilidade
Dimenses em milmetros = porosidade da camada de p comprimido.

2.9.14. Superfcie especfica por permeabilidade ao ar
Aplique a equao 1 admitindo, numa primeira fase, que a superfcie superior. Lance o mercrio para um vaso de
porosidade igual a 0,5. precipitao previamente tarado e determine novamente
a respectiva massa (MB). Calcule o volume aparente (V) da
Coloque um disco de papel de filtro sobre o disco
camada de p comprimido usando a frmula:
perfurado (B). Pese, at ao mg, uma tomada de ensaio de
massa M. Transfira cuidadosamente o p para a clula de
permeabilidade, previamente limpa e tarada, bata levemente
2. Mtodos
Analticos
no tubo de modo a alisar a superfcie da camada de p e

cubra com um segundo disco de papel de filtro. Comprima
lentamente o p com o pisto sem exercer movimento de
rotao. Mantenha a presso at que o pisto se encontre
no mximo do seu percurso. Se no o conseguir, reduza MA MB = diferena entre as massas de mercrio determinadas, em
a quantidade de p utilizada; se, pelo contrrio, a presso gramas,
exercida for muito pequena, aumente a quantidade de
p utilizada. Neste caso, calcule novamente o valor da Hg = massa volmica do mercrio temperatura do ensaio,
porosidade. Aps, pelo menos, 10 segundos, retire o pisto. em gramas por mililitro.
Ligue a clula de permeabilidade ao manmetro de modo Repita mais 2 vezes esta operao mudando, de cada vez, o p
a garantir a estanquicidade. Com a ajuda de uma pra de utilizado. O desvio entre os valores obtidos para o volume V
borracha retire o ar contido no manmetro at que o nvel do no ultrapassa 0,01 ml. Utilize a mdia dos trs valores para
lquido corado atinja a marca superior. o clculo.
Feche a torneira e verifique a estanquicidade do aparelho b) Constante do aparelho (K). Proceda como se indica a
fechando hermeticamente a abertura superior da clula de seguir, utilizando o p padro, de superfcie especfica e
permeabilidade com uma rolha de borracha, por exemplo. massa volmica conhecidas.
Retire a rolha e, com a ajuda de um cronmetro, determine Calcule a massa do p padro a utilizar usando a equao
o tempo gasto para o lquido chegar da segunda terceira 1, tomando como massa volmica o valor declarado
marca. e, como volume da camada de p comprimido, o valor
Em funo do tempo de escoamento assim determinado, calculado usando a equao 3.
calcule a superfcie especfica S, em metros quadrados por Homogenize e areje o p agitando-o durante 2 min num
grama, usando a frmula:
matrs de 100 ml. Prepare uma camada de p comprimido
e determine o tempo de escoamento do ar como se
indicou acima. Calcule a constante do aparelho (K)
usando a equao:
t = tempo de escoamento, expresso em segundos,

= viscosidade dinmica do ar, era milipascal segundo (ver quadro 2),
K = constante do aparelho, determinada usando a equao 4,
Ssp = valor declarado da superfcie especfica do p padro,
= porosidade da camada de p comprimido.
= porosidade da camada de p comprimido,
CALIBRAO DO APARELHO t = tempo de escoamento, expresso em segundos,
= viscosidade dinmica do ar, em milipascal.segundo (ver

a) Volume aparente da camada de p comprimido. Proceda quadro 1).
como se indica a seguir, usando o denominado mtodo do
deslocamento do mercrio. Os valores da massa volmica do mercrio e da viscosidade
do ar em funo da temperatura esto indicados no quadro 1.
Coloque dois discos de papel de filtro na clula, alisando
bem os bordos sobre o disco metlico perfurado com o QUADRO 1
auxlio de uma vareta com um dimetro ligeiramente
inferior ao do tubo. Encha completamente a clula com Temperatura Massa volmica do Viscosidade do ar ()

mercrio, no deixando bolhas de ar aderentes parede, (C) mercrio (g/ml) (mPa.s)
e alise a superfcie superior da coluna de mercrio de 16 13,56 0,01800 0,1342
modo a obter uma superfcie plana. Se se puder formar 17 13,56 0,01805 0,1344
uma amlgama com o material constituinte da clula, 18 13,55 0,01810 0,1345
lubrifique previamente as paredes do tubo e o disco 19 13,55 0,01815 0,1347
metlico com uma fina camada de parafina lquida. Lance 20 13,55 0,01819 0,1349
o mercrio para um vaso de precipitao previamente 21 13,54 0,01824 0,1351
tarado e determine a respectiva massa (MA) e temperatura. 22 13,54 0,01829 1,1353
23 13,54 0,01834 0,1354
Com o p padro, prepare uma camada de p comprimido 24 13,54 0,01839 0,1356
e encha de novo a clula de mercrio, alisando a

2.9.16. Escoamento
2.9.15. VOLUME APARENTE EXPRESSO DOS RESULTADOS
O ensaio do volume aparente destina-se a determinar, em a) Volumes aparentes:

condies definidas, os volumes aparentes antes e depois volume aparente antes de compactao ou volume
de compactao, a capacidade de compactao, bem como bruto: V0 ml,
as massas volmicas aparentes dos slidos divididos (por volume aparente aps compactao ou volume
2. Mtodos
Analticos
exemplo, ps e granulados). reduzido: V1250 ml ou V2500 ml.
b) Capacidade de compactao: diferena V10 ml V500 ml.
c) Massas volmicas aparentes:
As massas volmicas aparentes so obtidas usando as
frmulas:
massa volmica aparente antes de compactao ou massa
volmica do produto em bruto:
m/ V0 (gramas por mililitro),

massa volmica aparente aps compactao ou massa
volmica do produto reduzido:
m/ V1250 ou m/ V2500 (gramas por mililitro).
2.9.16. ESCOAMENTO
O ensaio de escoamento destina-se a determinar, em
condies definidas, a capacidade dos slidos divididos (ps,
granulados...) de escoarem verticalmente.
APARELHAGEM
Segundo as caractersticas de escoamento da amostra, utilize

funis com ou sem haste, com ngulos e dimetros de orifcio
diferentes (ver figuras 1 e 2). O funil mantido verticalmente
por um dispositivo apropriado. O conjunto protegido das
FIGURA 1
vibraes.
MTODO
APARELHAGEM
No funil seco, cujo orifcio de escoamento foi previamente
A aparelhagem (ver figura 1) constituda por: obturado por um meio apropriado, introduza sem compactar
uma tomada de ensaio pesada com uma preciso de 0,5 por
um aparelho de compactao que possa provocar por min
cento. A quantidade da amostra depende do seu volume aparente
250 15 pancadas de 3 0,2 mm de altura. O suporte da e do aparelho utilizado. Abra o orifcio do funil e determine o
proveta, com o seu dispositivo de fixao, tem uma massa de tempo de escoamento da totalidade da amostra. Efectue trs
450 5 g, determinaes.
uma proveta de 250 ml graduada de 2 em 2 ml, cuja massa
de 220 40g. EXPRESSO DOS RESULTADOS
A capacidade de escoamento expressa em segundos e

MTODO dcimos de segundo, em relao a 100 g da amostra.
Na proveta seca introduza, sem compactar, 100,0 g (m g) Os resultados dependem das condies de conservao da
da amostra. Caso tal seja impossvel, escolha uma tomada amostra. O resultado pode ser expresso:
de ensaio cujo volume aparente esteja compreendido entre a) pela mdia das determinaes, se nenhum dos resultados
50 ml e 250 ml e indique a sua massa na expresso dos individuais se afastar mais de 10 por cento do valor mdio,
resultados. Fixe a proveta no suporte. Leia o volume aparente b) pelos dois valores extremos, se os resultados individuais se
no compactado, com aproximao de 1 ml. Submeta afastarem mais de 10 por cento do valor mdio,
a 10, 500 e 1250 pancadas e leia os volumes aparentes
correspondentes V10, V500 e V1250, com aproximao de 1 ml. c) graficamente (massa em funo do tempo de escoamento),
Se a diferena entre V500 e V1250 for superior a 2 ml, efectue d) por um tempo infinito se a totalidade da amostra no
outras 1250 pancadas. escoa.

2.9.17 Ensaio do volume extravel das preparaes parentricas
2.9.17 ENSAIO DO VOLUME EXTRAVEL

DAS PREPARAES PARENTRICAS
As suspenses e as emulses so agitadas antes da retirada
do contedo para a determinao da massa volmica. As
preparaes oleosas ou viscosas podem ser aquecidas, se
2. Mtodos
Analticos
necessrio, segundo as indicaes indicadas no rtulo e

vigorosamente agitadas imediatamente antes da retirada do
contedo; este arrefecido a 20 - 25C antes da determinao
do volume.
RECIPIENTES UNIDOSE
Use 1 recipiente se o volume nominal igual ou superior

a 10 ml, 3 recipientes se o volume nominal superior a 3
ml e inferior a 10 ml, ou 5 recipientes se o volume nominal
inferior ou igual a 3 ml. Retire, separadamente e na
totalidade, o contedo de cada recipiente seleccionado com
uma seringa hipodrmica seca cuja capacidade no exceda 3
vezes o volume a medir, munida de uma agulha n 21 e com,
pelo menos, 2,5 cm de comprimento. Elimine as bolhas de
ar eventualmente existentes na seringa e na agulha e, sem
esvaziar a agulha, passe o contedo da seringa para uma
proveta seca (cuja graduao indique o volume contido
FIGURA 1 Modelo de um funil para escoamento e do seu suporte. mais do que o volume vertido) cuja capacidade seja tal que
O suporte de ao inoxidvel, resistente aos cidos (V4A, CrNi) o volume a determinar ocupe, pelo menos, 40 por cento do
volume nominal da proveta. Pode tambm calcular o volume
do contedo, em mililitros, dividindo a massa, em gramas,
pela massa volmica.
Dimetro (d) do orifcio
Ponteira de escoamento (milmetros) Para a medio, pode misturar-se o contedo de 2 ou 3
recipientes de volume nominal igual ou inferior a 2 ml, desde
1 10 0,01
2 15 0,01
que se use um conjunto seringa/agulha seco e diferente para
3 25 0,01 cada recipiente. O volume do contedo dos recipientes de
contedo igual ou superior a 10 ml pode ser determinado
abrindo o recipiente e despejando-o directamente na proveta
graduada ou num recipiente tarado.
No caso dos recipientes ensaiados individualmente, o volume
no inferior ao volume nominal. No caso dos recipientes
de volume nominal inferior ou igual a 2 ml, o volume no
inferior soma dos volumes nominais dos recipientes
ensaiados.
RECIPIENTES PARA MULTIDOSE
Para o ensaio das preparaes injectveis apresentadas em

recipientes para doses mltiplas cujo rtulo indica que
contm um nmero especfico de doses de um determinado
volume, escolha um recipiente e proceda segundo as
instrues indicadas para os recipientes unidose, utilizando
separadamente um nmero de conjuntos seringa/agulha
idntico ao nmero de doses especificadas. O volume
libertado por cada seringa no inferior dose indicada.
CARTUCHOS E SERINGAS PR-CHEIAS
Use 1 s recipiente se o volume nominal igual ou superior

a 10 ml, 3 recipientes se o volume nominal superior a 3 ml
e inferior a 10 ml, ou 5 recipientes se o volume nominal
inferior ou igual a 3 ml.
FIGURA 2
Se necessrio, ajuste aos recipientes os acessrios necessrios
Dimenses em milmetros para a sua utilizao (agulha, mbolo, corpo de seringa) e

2.9.18. Preparaes para inalao: avaliao aerodinmica das partculas finas
passe a totalidade do contedo de cada recipiente, sem esva- Introduza a preparao lquida para inalao no reservatrio
ziar a agulha, para um recipiente seco e tarado, empurrando do nebulizador. Monte a ponteira do nebulizador e ligue-a ao
lenta e regularmente o mbolo. Calcule o volume, em milili- aparelho por meio de um adaptador.
tros, dividindo a massa, em gramas, pela massa volmica.
Ponha a bomba em movimento e depois, ao fim de 10 s, o
O volume calculado para cada um dos recipientes no
inferior ao volume nominal. nebulizador.
2. Mtodos
Analticos
Passados 60 s, salvo indicao contrria, pare o nebulizador,
PREPARAES PARA PERFUSO espere cerca de 5 s e pare a bomba. Desmonte o aparelho.
Lave o interior da cmara do depsito superior recolhendo os
Escolha um recipiente. Transfira o seu contedo para uma produtos de lavagem num balo marcado.
proveta graduada seca cuja capacidade seja tal que o volume
a determinar corresponda, pelo menos, a 40 por cento do
QUADRO 1 Especificaes dos elementos do aparelho
volume nominal da proveta. Determine o volume recolhido.
representado na figura 1
O volume determinado no inferior ao volume nominal.
Cdigo Elemento Descrio Dimenses(*)
A Adaptador Adaptador de borracha moldada
2.9.18. PREPARAES PARA INALAO: da ponteira para juno com a ponteira do
AVALIAO AERODINMICA DAS inalador
PARTCULAS FINAS B Colo Balo de fundo redondo

modificado 50 ml
Entrada: junta cnica esmerilada
Este ensaio utilizado para determinar a fraco fmea 29/32
representada pelas partculas finas nos aerossoles produzidos Sada: junta cnica esmerilada
a partir de preparaes para inalao. macia 24/29
Salvo excepo justificada e autorizada, o ensaio pode ser C Adaptador Adaptador de vidro modificado
Entrada: junto cnica esmerilada
realizado com um dos aparelhos e conforme as tcnicas fmea 24/29
seguintes. Sada: junta cnica esmerilada
24/29
macho
As caractersticas de dimenses dos estgios so objecto de Parte inferior: tubo de vidro
verificaes peridicas do mesmo modo que so confirmadas calibrado
14
as outras dimenses que desempenham uma funo crucial Dimetro interno
no funcionamento do impactor. Tubo de vidro de parede fina
Dimetro interno 17
Reequipamento (para os aparelhos D e E). Para assegurar D Cmara Balo de fundo redondo
uma captura eficaz das partculas, recubra cada placa com do depsito modificado 100 ml
glicerina, leo de silicone ou outro lquido de alta viscosidade superior Entrada: junta cnica esmerilada
similar, geralmente veiculado por meio de um solvente fmea 24/29
voltil. Este tratamento das placas integrado na validao Sada: junta cnica esmerilada
24/29
do mtodo e pode ser omitido em certos casos justificados e macho
autorizados. E Tubo de ligao Tubo de vidro de parede mdia
14/23
Junta cnica esmerilada macho
Massa total. A massa total da substncia activa recolhida Curva e parte direita superior
13
no inferior a 75 por cento nem superior a 125 por cento Dimetro externo
Parte direita inferior
do valor mdio obtido no ensaio de uniformidade de dose Dimetro externo 8
libertada. Esta exigncia no diz respeito ao inalador mas
permite assegurar a validade dos resultados. F Adaptador com Cobertura enroscada de plstico
tubuladura Junta de silicone 28/13
lateral e Anilha PTFE 28/11
cobertura Roscado de vidro 28/11
APARELHO A (IMPACTOR EM CASCATA DE VIDRO) enroscada Passo da rosca 28
Ramo lateral (sada para a bomba
O aparelho est representado na figura 1 (ver tambm o de vcuo)
Dimetro interno mnimo 5
quadro 1).
G Injector Porta-filtro modificado em
Tcnica aplicvel aos nebulizadores polipropileno ligado parte
inferior do tubo de ligao por
Introduza, respectivamente, 7 e 30 ml de um solvente um tubo de PTFE Conf. fig. 1
Disco circular de acetal com 4
apropriado nas cmaras do depsito inferior e superior.
injectores dispostos em crculo
Adapte os diferentes elementos do aparelho e verifique se de 5,3 mm de dimetro e uma
cavilha de afastamento central 10
o conjunto est na vertical e bem fixo e que a cavilha do Dimetro da cavilha 2
injector da cmara do depsito inferior toca ao de leve o Altura da salincia da cavilha 2
fundo da cmara. Ligue uma bomba apropriada munida de
H Cmara do Balo cnico 250 ml
um filtro de porosidade adequada sada do aparelho e regule depsito inferior Junta cnica esmerilada fmea 24/29
o dbito de ar que atravessa o aparelho, medido entrada do
colo, a 60 5 litros por minuto. (*) Dimenses em milmetros, salvo indicao contrria.

5 s e depois agite e accione de novo com perda. Repita de

novo esta operao 3 vezes.
Agite durante cerca de 5 s, ponha a bomba em movimento e
coloque a ponteira do difusor no adaptador. Accione imediata-
mente uma vez. Separe o conjunto do inalador do adaptador,
agite durante cerca de 5 s, coloque de novo a ponteira do
2. Mtodos
Analticos
difusor no adaptador e accione de novo. Repita o procedimento

de descarga. O nmero de descargas assim recolhidas no deve
ser demasiado elevado (em geral, menos de 10).
Com um solvente apropriado lave o tubo de admisso
cmara do depsito inferior (superfcie interior e exterior
da parte penetrante na cmara) recolhendo os produtos de
lavagem na cmara do depsito inferior. Determine o teor em
princpio activo da soluo recolhida. Calcule a quantidade
de princpio activo retido na cmara do depsito inferior em
cada accionamento da vlvula e exprima os resultados em
percentagem da dose indicada no rtulo.
Tcnica aplicvel aos inaladores de p

Introduza, respectivamente, 7 ml e 30 ml de solvente
apropriado nas cmaras dos depsitos superior e inferior.
Ligue os diferentes elementos do aparelho e verifique que o
conjunto est no sentido vertical e bem fixo e que a cavilha
do injector da cmara do depsito inferior aflora exactamente
o fundo da cmara. Antes de instalar o inalador ligue uma
bomba apropriada sada do aparelho e regule o dbito de ar
que atravessa o aparelho, medido entrada do colo, para
60 5 litros/min.
Prepare o inalador a ser utilizado e ligue a sua ponteira ao
FIGURA 1 Aparelho A: impactor em cascata de vidro aparelho por meio de um adaptador apropriado. Ponha a
para a avaliao aerodinmica das partculas finas bomba em movimento durante 5 s e depois pare-a e separe o
inalador do aparelho. Repita o procedimento. O nmero de
(salvo indicao em contrrio, tolerncia de 1 mm)
descargas assim recolhidas no deve ser demasiado elevado
(em regra, no mais de 10). Desmonte o aparelho.
Lave o interior da cmara do depsito inferior recolhendo Com um solvente apropriado lave o tubo de admisso
os produtos de lavagem num segundo balo marcado. Lave cmara do depsito inferior (superfcie interior e exterior
o filtro situado entrada da bomba e os elementos que da parte que penetra na cmara) recolhendo os produtos de
serviram para o ligar cmara do depsito inferior e junte lavagem na cmara do depsito inferior. Determine o teor
os produtos de lavagem aos obtidos na lavagem da cmara em princpio activo desta soluo. Calcule a quantidade de
do depsito inferior. Determine a quantidade de princpio princpio activo recolhido na cmara do depsito inferior em
activo contido em cada um dos dois bales. Exprima o cada descarga e exprima os resultados em percentagem da
resultado obtido para cada uma das 2 partes do aparelho em dose indicada no rtulo.
percentagem da quantidade total de princpio activo.
Tcnica aplicvel aos inaladores pressurizados Dose de partculas finas e distribuio

Instale um adaptador extremidade do colo do aparelho de granulomtrica das partculas
tal modo que a ponteira do difusor, uma vez inserida a uma
profundidade de cerca de 10 mm no adaptador, seja alinhada
sobre o eixo horizontal do colo e que a extremidade aberta do APARELHO C IMPACTOR EM CASCATA
difusor que recebe o reservatrio pressurizado esteja dirigida
EM VRIOS ESTGIOS
para cima no mesmo plano vertical que o resto do aparelho.
Introduza, respectivamente, 7 e 30 ml de um solvente O impactor em cascata em vrios estgios (ver figuras 4, 5 e
apropriado nas cmaras dos depsitos superior e inferior. 6) composto por quatro estgios de depsito, numerados
de 1 (pr-separao) a 4, e por um estgio de filtrao
Ligue os diferentes elementos do aparelho e verifique que
integrado (estgio 5). Cada estgio de depsito compreende
o conjunto est na vertical e bem fixo e que a cavilha do
um tecto metlico (B) atravessado por um injector metlico
injector da cmara do depsito inferior aflora exactamente
(A) associado a uma placa de depsito (D), uma parede
o fundo da cmara. Ligue uma bomba apropriada sada do
vertical formada por uma cuba cilndrica de vidro (E)
aparelho e regule o dbito do ar que atravessa o aparelho,
comportando um orifcio de acesso (F); um pavimento
entrada do colo, para 60 5 litros por minuto.
metlico (G) atravessado por um injector (H) que assegura a
Ponha em movimento a vlvula doseadora agitando durante ligao com o estgio inferior. O injector do estgio
5 s e accionando uma vez com perda. Espere, no mnimo, 4 (U) comporta um dispositivo multi-jactos. Cada placa do

depsito (D) instalada num quadro metlico (J) fixado por QUADRO 2 Especificaes dos elementos do aparelho representado
dois fios metlicos (K) a uma manga de ligao (L) fixada nas figuras 4, 5 e 6
ao injector. A placa do depsito centrada e perpendicular
Cdigo(1) Elemento Descrio Dimenses(2)
ao eixo do injector. A sua superfcie superior ligeiramente
mais elevada que o bordo do quadro metlico. Uma ranhura A.H Injector Tubo metlico de parede Ver figura 5
perifrica escavada no pavimento permite a colocao da interna polida,
aparafusado no tecto
cuba de vidro. Uma junta (M) assegura a estanquicidade
2. Mtodos
com junta de
Analticos
entre a parede de vidro e o pavimento e o conjunto vedao (C)
mantido por 6 cavilhas de ferro (N). Os orifcios de acesso B.G Tecto Placa metlica circular
120
so fechados hermeticamente por rolhas. A face inferior Dimetro
do pavimento do estgio 4 comporta uma salincia Espessura Ver figura 5
C Junta de Por exemplo, em teflon Adaptada ao
circular sobre a qual instalada uma junta de borracha
estanquicidade injector
(P) que assegura uma juno estanque com um porta-
filtro ao longo dos bordos do filtro. O porta-filtro (R) tem D Placa de Disco de vidro fundido,
a forma de uma cuba com uma ranhura circular na qual depsito porosidade 0
Dimetro Ver figura 5
encastrado um suporte de filtro perfurado (S). O porta-filtro
dimensionado para filtros com dimetro de 76 mm. O E Cuba Seco de tubo cilndrico
de vidro polido
conjunto constitudo pelos estgios de depsito fixado ao Altura, juntas includas 46
porta-filtro por dois ressaltos (T). Um tubo de admisso (ver Dimetro externo 100
figura 7) liga-se ao injector do estgio 1. A estanquicidade Espessura da parede 3,5
Dimetro do orifcio de
da junta com o injector assegurada por uma junta de acesso (F) 18
borracha montada no injector, a da juno com a ponteira Rolha do orifcio de acesso 180 24/25
do nebulizador por um adaptador apropriado que permite J Quadro Quadro circular com
alinhar num mesmo plano a face anterior da ponteira com a metlico seco em L com colo
do tubo de admisso. Dimetro interno Adaptado
placa
de depsito
Altura 4
Espessura da seco
horizontal 0,5
Espessura da seco vertical 2
K Fio metlico Fio metlico (2 por quadro)

ligando o quadro manga
Dimetro 1
L Manga Manga em metal aparafusada

sobre o injector
Dimetro interno Adaptado
ao injector
Altura 6
Espessura 5
M Junta de Em silicone, por exemplo Adaptada

estanquicidade cuba
N Parafusos Parafusos metlicos com

porcas (6 pares)
Comprimento 205
Dimetro 4
P Junta Junta de borracha

Dimetro espessura 66,34 2,62
Q Junta Junta de borracha

Dimetro espessura 29,1 1,6
R Porta-filtro Caixa metlica com suporte

e orifcio de sada Ver figura 6
S Suporte Folha metlica perfurada

de filtro Dimetro 65
Dimetro das perfuraes 3
Distncia entre os pontos
centrais dos parafusos 4
T Ressaltos
U Injector Injector (H) terminando Ver

mltiplo num dispositivo pormenores
multijactos na figura 5
(1) Ver figura 4.

(2) Salvo indicao em contrrio, dimenses em milmetros com
FIGURA 4 Aparelho C: impactor em cascata em vrios estgios tolerncias segundo ISO 2768-m.

QUADRO 3 Dimenses(1) dos injectores e das placas de depsito 20 ml de um solvente capaz de dissolver o princpio activo
e reponha as rolhas. Incline o aparelho para humedecer as
Tipo Cdigo(2) Estgio Estgio Estgio Estgio Filtro rolhas e, assim, neutralizar as cargas electrostticas. Coloque
1 2 3 4 (estgio 5) no estgio 5 um filtro que permita reter quantitativamente
Distncia 1 9,5(-,0+,5) 5,5(-,0+,5) 4,0(-,0+,5) 60(-,0+,5) n.a.
o princpio activo e monte o aparelho. Instale um adaptador
Distncia 2 26 31 33 30,5 0
apropriado na extremidade do tubo de admisso de tal modo
que a ponteira do difusor, uma vez inserida no adaptador,
2. Mtodos
Analticos
Distncia 3 8 5 5 5 5
fique alinhada com o eixo horizontal do tubo de admisso e
Distncia 4 3 3 3 3 n.a.
Distncia 5 0 3 3 3 3
que o corpo do inalador fique orientado como se indica para
o emprego normal. Ligue uma bomba de vazio apropriada
Distncia 6(3) 20 25 25 25 25
sada do aparelho e regule o dbito (medido entrada do tubo
Distncia 7 n.a. n.a. n.a. 8,5 n.a. de admisso) para 30 l/min ( 5 por cento). Pare a bomba.
Dimetro c 25 14 8,0(1) 21 14
Dimetro d 50 30 20 30 n.a. Salvo indicao em contrrio nas instrues de utilizao,
Dimetro e 27,9 16,5 10,5 23,9 n.a. agite o inalador durante 5 s e accione uma vez com perda.
Dimetro f 31,75(-0,0+0,5) 22 14 31 22 Ponha em movimento a bomba, coloque a ponteira do
Dimetro g 25,4 21 13 30 21 difusor no adaptador e descarregue o inalador no aparelho
Dimetro h n.a. n.a. n.a. 2,70(0,5) n.a. carregando na vlvula o tempo necessrio para obter uma
Dimetro j n.a. n.a. n.a 6,3 n.a. descarga completa. Aguarde 5 s antes de separar o conjunto
Dimetro k n.a. n.a. n.a. 12,6 n.a. do inalador do adaptador. Repita as operaes descritas.
Raio (4) r 16 22 27 28,5 0 O nmero de descargas recolhidas no muito elevado (em
Raio (4) s 46 46 46 46 n.a. regra, no mais de 10), mas so as suficientes para permitir
Raio (4) t n.a. 50 50 50 50 uma determinao exacta e fiel da dose de partculas finas.
ngulo w 10 53 53 53 53 Aps a ltima descarga, espere 5 s e pare a bomba.
ngulo u n.a. n.a. n.a. 45 n.a.
ngulo v n.a. n.a. n.a. 60 n.a. Desmonte o estgio de filtrao do aparelho. Retire o filtro
com precauo e proceda extraco do princpio activo
(1) Salvo indicao em contrrio, dimenses em milmetros, com com um volume apropriado de solvente. Desmonte o tubo
tolerncias segundo ISO 2768-m. de admisso e o adaptador da ponteira e proceda do mesmo
(2) Ver a figura 5. modo. Se necessrio, lave o interior do injector do estgio
(3) Compreendendo a junta de estanquicidade. 1 com solvente, recolhendo os produtos de lavagem na cuba
(4) Centro do compartimento de estgio considerado. do estgio. Recupere da cuba de cada um dos 4 estgios
n.a. No aplicvel. superiores os resduos de princpio activo depositados nas
paredes e placa de depsito correspondente a cada estgio,
inclinando e fazendo rodar o aparelho com precauo de
Tcnica aplicvel aos inaladores pressurizados
modo a evitar a transferncia de qualquer quantidade de
Introduza em cada um dos estgios 1 a 4 do aparelho liquido entre os estgios.
FIGURA 5 Aparelho C: configurao do injector da placa de depsito.

Detalhe da extremidade do injector mltiplo U do estgio 4
As letras minsculas e os nmeros reportam-se ao quadro 3 e as letras maisculas figura 4

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 6 Aparelho C: estgio de filtrao (estgio 5)
Os nmeros indicam as dimenses em mlimetros ( = dimetro) e as letras maisculas remetem para o quadro 2
NOTA
(1) Utilize como material alumnio ou ao inoxidvel,
(2) Faa os acabamentos com uma barra cilndrica de 38 mm,
(3) Desbastar e polir o interior da barra em todo o seu comprimento para obter um tubo de d.i. de 19 mm,
(4) Seccionar o tubo a 45 exactamente, como indicado,
(5) A superfcie interior dos cilindros e cones lisa (acabamento da superfcie cerca de 0,40 m),
(6) Trate as superfcies de juno das duas seces do tubo para assegurar a estanquicidade aos lquidos,
(7) Utilize um suporte adequado para alinhar os dimetros internos de 19 mm e para perfurar e roscar orifcios M4 0,7. O alinhamento dos dimetros das duas
seces do tubo ao nvel da juno quase perfeito.
FIGURA 7 Tubo de admisso


Por um mtodo de anlise apropriado, determine a QUADRO 4 Especificaes dos elementos da montagem
quantidade de princpio activo contida em cada um dos 6 representada na figura 8
volumes de solvente.
Cdigo Elemento Descrio
Calcule a dose de partculas finas (ver Clculo).
A Ligador d.i. 8 mm, por exemplo, manga metlica
curta com ligao de pequeno dimetro para
2. Mtodos
P3.
Analticos
Coloque no estgio 5 um filtro apropriado de fraca resistncia

que permita reter quantitativamente o princpio activo e B Tubo de vcuo Comprimento do tubo apropriado de
monte o aparelho. Ligue-o a um circuito hidrulico como o d.i. 8 mm e de volume inferior a 25 5 ml.
representado na figura 8 e as indicaes do quadro 4. Salvo C Electrovlvula Electrovlvula 2/2 (2 vias, 2 orifcios) com
indicao em contrrio, efectue o ensaio com o dbito Qout orifcio de resistncia ao escoamento
determinado no ensaio Uniformidade da dose libertada. mnimo de d.i. 8 mm e tempo de abertura
aspirando 4 litros de ar atravs do aparelho, aps a ponteira de 100 ms (por exemplo, tipo 256-A08,
do inalador Burkert GmbH, D-74653 Ingelfingen) ou
equivalente).
Ligue ao tubo de admisso um debitmetro volumtrico
calibrado para a corrente gasosa de sada ou calcule o dbito D Bomba de vcuo Bomba capaz de estabelecer o dbito
gasoso sada do debitmetro (Qout) de acordo com a lei dos requerido atravs do aparelho montado com
gases perfeitos. No caso de um debitmetro calibrado para a o inalador colocado no adaptador da
ponteira (por exemplo, tipo 1023,1423 ou
corrente gasosa de entrada (Qin), utilize a expresso: 2565, Gast Manufacturing
Inc., Benton Harbor, Ml 49022 ou
equivalente).
A bomba ligada electrovlvula por meio
de um tubo para vazio curto e/ou largo (d.i.
10 mm) e de ligaes que permitam
reduzir a capacidade de bombagem
requerida.
P0 = presso atmosfrica,
E Temporizador Temporizador capaz de comandar a
P = perda de carga no debitmetro. electrovlvula 2/2 durante o tempo
necessrio (por exemplo, G814, RS
Ajuste o dbito por meio do regulador de modo a estabelecer Components International.Corby. NN17 9RS,
no aparelho um regime estacionrio de dbito Q ( 5 por UK
cento) e pare a circulao do ar. ou equivalente).
Verifique que o regime crtico instaurado no regulador P2, P3 Medidas Medidas em regime estacionrio com
de dbito operando do seguinte modo, com o inalador manomtricas transdutor de presso absoluta.
correctamente ligado e com o dbito de ensaio estabelecido:
determine a presso absoluta entrada e sada do regulador F Regulador de Torneira regulvel com Cv mximo 1 (por
dbito exemplo, tipo 8FV12LNSS, Parker Hannifin
(pontos de medida P2 e P3 da figura 8). Uma relao P3/P2
plc., Barnstaple, EX31 1NP, UK ou
inferior ou igual a 0,5 indica que o dbito crtico. Se o equivalente).
dbito crtico no for atingido, substitua a bomba por uma
mais potente e determine de novo o dbito do ensaio.
Prepare o inalador de p seco para o emprego como se indica
Introduza em cada um dos 4 estgios superiores do aparelho nas instrues de utilizao. Ponha a bomba em movimento
20 ml de um solvente capaz de dissolver o princpio activo e feche a electrovlvula. Coloque a ponteira do inalador
e coloque as rolhas. Incline o aparelho para humedecer no adaptador. Provoque uma descarga de p no aparelho,
as rolhas e, assim, neutralizar as cargas electrostticas. abrindo a electrovlvula durante o tempo T necessrio
Instale um adaptador apropriado na extremidade do tubo de ( 5 por cento). Repita a operao. O nmero de descargas
admisso. recolhidas no muito elevado (em regra, no mais de 10),
mas so as suficientes para permitir uma determinao
exacta e fiel da dose de partculas finas. Aps a ltima
descarga, espere 5 s e pare a bomba.
Desmonte o estgio de filtrao do aparelho. Retire o filtro
com precauo e proceda extraco do princpio activo
com um volume apropriado de solvente. Desmonte o tubo
de admisso e o adaptador da ponteira e proceda do mesmo
modo. Se necessrio, lave o interior do injector do estgio 1
com solvente, recolhendo os produtos de lavagem na cuba
do estgio. Recupere da cuba de cada um dos 4 estgios
superiores os resduos de princpio activo depositados nas
paredes e placa de depsito correspondente a cada estgio,
inclinando e fazendo rodar o aparelho com precauo
de modo a evitar a transferncia de qualquer quantidade
de lquido entre os estgios. Por um mtodo de anlise
apropriado, determine a quantidade de princpio activo
contida em cada um dos 6 volumes de solvente.
FIGURA 8 Montagem experimental utilizada Calcule a dose de partculas finas como se indica mais
para os inaladores de p adiante.

APARELHO D AMOSTRADOR GRANULOMTRICO permite recolher a maior parte da fraco no respirvel

ANDERSEN do p. ligado ao tubo de admisso como se representa na
figura 10. Para permitir fortes dbitos gasosos atravs do
O amostrador granulomtrico Andersen 1 ACFM amostrador, a tubuladura de sada que assegura a ligao
constitudo por 8 estgios e um estgio terminal de filtrao. desta bomba de vazio larga, com um dimetro superior ou
Pode ser de alumnio, ao inoxidvel, ou outro material igual a 8 mm.
apopriado. Os estgios so ligados uns aos outros com molas
2. Mtodos
Analticos
e a estanquicidade das junes assegurada por juntas
QUADRO 5 Dimenses crticas do aparelho D
tricas. As dimenses crticas aplicadas pelo fabricante ao
aparelho D so indicadas no quadro 5. Durante a utilizao Descrio Nmero Dimenses (mm)
podem produzir-se fenmenos de ocluso e colmatagem
dos poros. As tolerncias dimensionais durante a utilizao Estgio 0 dimetro de tubo 96 2,55 0,025
devem ser justificadas. Na configurao utilizada para os Estgio 1 dimetro de tubo 96 1,89 0,025
inaladores pressurizados (figura 9) o cone de entrada do
Estgio 2 dimetro de tubo 400 0,914 0,0127
amostrador ligado a um tubo de admisso (ver figura 7).
Estgio 3 dimetro de tubo 400 0,711 0,0127
Um adaptador apropriado assegura uma juno estanque
entre a ponteira do inalador e o tubo de admisso e permite Estgio 4 dimetro de tubo 400 0,533 0,0127
alinhar num mesmo plano a face anterior da ponteira e a Estgio 5 dimetro de tubo 400 0,343 0,0127
face do tubo. Na configurao utilizada para os inaladores Estgio 6 dimetro de tubo 400 0,254 0,0127
de p, um pr-separador colocado acima do estgio superior Estgio 7 dimetro de tubo 201 0,254 0,0127
FIGURA 9 Aparelho D: amostrador granulomtrico Andersen adaptado para os inaladores pressurizados


2. Mtodos
Analticos
FIGURA 10 Juno do tubo ao pr-separador no amostrador granumtrico Andersen

Tcnica aplicvel aos inaladores pressurizados Por um mtodo de anlise apropriado, determine a
quantidade de princpio activo contida em cada um dos 9
Coloque no aparelho um filtro apropriado, Monte o
volumes de solvente. Calcule a dose de partculas finas como
amostrador e verifique a estanquicidade do sistema. Instale
se indica mais adiante.
um adaptador apropriado na extremidade do tubo de tal
modo que a ponteira do difusor, uma vez inserida no
adaptador, fique alinhada com o eixo horizontal do tubo de Tcnica aplicvel aos inaladores de p
admisso e que o corpo do inalador fique orientado como se Os dimetros de fenda dos diferentes estgios deste aparelho
indica para a utilizao normal. Ligue uma bomba apropriada no esto ainda bem estabelecidos para dbitos diferentes de
sada do aparelho e regule o dbito de ar que atravessa o 28,3 litros/min. Incumbe aos utilizadores justificar e validar
aparelho (medido entrada do tubo de admisso) para o emprego do amostrador em condies escolhidas que no
28,3 l/min ( 5 por cento). Pare a bomba. operem a 28,3 litros/min.
Salvo indicao em contrrio, nas instrues de utilizao, Coloque no aparelho um filtro apropriado, monte o
agite o inalador durante 5 s e accione uma vez com perda. aparelho com um pr-separador e verifique a estanquicidade
Ponha a bomba em movimento, coloque a ponteira do difusor
do sistema. Em certos casos justificados e autorizados
no adaptador e descarregue o inalador virado para baixo no
pode omitir-se o pr-separador. Os estgios 6 e 7 podem
aparelho, carregando na vlvula o tempo necessrio para obter
igualmente ser omitidos para dbitos elevados, com reserva
uma descarga completa. Espere 5 s antes de separar o conjunto
de justificao. O pr-separador pode receber o mesmo
do inalador do adaptador. Repita o procedimento de descarga.
O nmero de descargas recolhidas no muito elevado (em tratamento que as placas, favorecendo a captura das
regra, no mais de 10), mas so as suficientes para permitir partculas, ou pode conter 10 ml de um solvente apropriado.
uma determinao exacta e fiel da dose de partculas finas. Ligue o aparelho a um circuito hidrulico de acordo com o
Aps a ltima descarga, espere 5 s e pare a bomba. esquema da figura 8 e as indicaes do quadro 4.
Desmonte o aparelho. Retire o filtro com precauo e proceda Salvo indicao em contrrio, efectue o ensaio com o dbito
extraco do princpio activo com um volume apropriado Qout utilizado no ensaio de uniformidade da dose libertada,
de solvente. Desmonte o tubo de admisso e o adaptador da aspirando 4 litros de ar atravs do aparelho aps a ponteira
ponteira e proceda do mesmo modo. Recupere os resduos de do inalador. Ligue ao tubo de admisso um debitmetro
princpio activo depositados nas paredes e placa de depsito volumtrico. Utilize um debitmetro calibrado para a
correspondente a cada estgio com volumes apropriados de corrente gasosa de sada ou calcule o dbito gasoso de sada
solvente. do debitmetro (Qout) a partir da lei dos gases perfeitos. No

caso de um debitmetro calibrado para a corrente gasosa de As dimenses crticas esto inscritas no quadro 6.
entrada (Qin) utilize a expresso:
QUADRO 6 Dimenses crticas do aparelho E
Qin P0
Qout Descrio Dimenses (mm)
P0 P
Pr-separador (dimenso a ver fig. 15) 12,8 0,05
2. Mtodos
Analticos
P0 = presso atmosfrica, Dimetro de tubo estgio 1* 14,3 0,05
P = perda de carga no debitmetro. Dimetro de tubo estgio 2* 4,88 0,04
Dimetro de tubo estgio 3* 2,185 0,02
Ajuste o dbito por meio do regulador de dbito de modo a
Dimetro de tubo estgio 4* 1,207 0,01
instaurar na aparelhagem um regime estacionrio com o
dbito Qout requerido ( 5 por cento). Verifique que o regime Dimetro de tubo estgio 5* 0,608 0,01
crtico instaurado no regulador de dbito pelo mtodo Dimetro de tubo estgio 6* 0,323 0,01
descrito para o aparelho C. Pare a bomba. Dimetro de tubo estgio 7* 0,206 0,01
Prepare o inalador de p para o emprego como se indica nas CMO* aprox. 0,070
instrues de utilizao. Ponha a bomba em movimento Profundidade do cadinho (dimenso b ver
e feche a electrovlvula. Coloque a ponteira do inalador figura 14) 14,625 0,10
no adaptador. Provoque uma descarga de p no aparelho,
Rugosidade da superfcie do cadinho(Ra) 0,5 2 m
abrindo a electrovlvula durante o tempo T necessrio
( 5 por cento). Repita a operao. O nmero de descargas Dimenso c no estgio 1** 0 1,18
recolhidas no muito elevado (em regra, no mais de 10), Dimenso c no estgio 2** 5,236 0,736
mas so as suficientes para permitir uma determinao Dimenso c no estgio 3** 8,445 0,410
exacta e fiel da dose de partculas finas.
Dimenso c no estgio 4** 11,379 0,237
Desmonte o aparelho. Retire o filtro com precauo e proceda
Dimenso c no estgio 5** 13,176 0,341
extraco do princpio activo com um volume apropriado de
solvente. Desmonte o pr-separador, o tubo de admisso e o Dimenso c no estgio 6** 13,999 0,071
adaptador da ponteira e proceda do mesmo modo. Recupere Dimenso c no estgio 7** 14,000 0,071
os resduos de princpio activo depositados nas paredes e Dimenso c ao nvel do CMO** 14,429 a 14,571
placa de depsito correspondente a cada estgio por meio de
volumes apropriados de solvente. * Ver fig. 13
** ver fig. 14
Por um mtodo de anlise apropriado, determine a
quantidade de princpio activo contida em cada um dos
volumes de solvente. Em funcionamento de rotina, o corpo intermedirio e o
cadinho so solidrios e formam um conjunto nico. Os
Calcule a dose de partculas finas como se indica mais
cadinhos de impactao so acessveis quando se abre o
adiante.
aparelho no fim do ensaio. Esto alojados numa plataforma-
-suporte o que permite retir-los todos ao mesmo tempo
APARELHO E elevando a plataforma.
Um tubo de admisso, cujas dimenses internas (adaptadas
O aparelho E um impactor em cascata em 7 estgios e ao trajecto de circulao do ar) so definidas na figura 7,
1 colector terminal de micro-orifcios (CMO). Na regio vem ligar-se entrada do impactor. Se necessrio, pode
entre 30 litros/min e 100 litros/min os dimetros de fenda ser adicionado um pr-separador, nomeadamente para os
correspondentes a uma eficcia de reteno de 50 por cento inaladores de p; este pr-separador intercala-se entre o
(valores D50) escalonam-se entre 0,24 m e 11,7 m, com tubo de admisso e o impactor. Para assegurar uma ligao
intervalos constantes numa escala logartmica. Nesta regio estanque entre o inalador e o tubo de admisso convm
de dbito, o aparelho comporta sempre, pelo menos, 5 utilizar um adaptador de ponteira apropriado.
estgios cujos D50 se situam ente 0,5 m e 6,5 m. As curvas
de eficcia de reteno de cada estgio apresentam um perfil O aparelho E comporta um colector terminal com micro-
agudo o que reduz tanto quanto possvel o cruzamento entre -orifcios (CMO) que permite, para a maior parte das
os estgios. formulaes, evitar a utilizao de um filtro terminal (aps
validao do processo). O CMO uma placa de impactao
O aparelho construdo em alumnio, ao inoxidvel ou cujo tubo comporta nominalmente 4032 orifcios de
outro material apropriado. dimetro aproximado de 70 m cada um. A maior parte das
O aparelho funciona com cadinhos de impactao amovveis, partculas no captadas no estgio 7 do impactor so-no
todos situados num mesmo plano (ver figuras 11 a 14). na superfcie do cadinho situado sob a DMO. No caso de
impactores funcionando com um dbito de 60 litros/min, o
Compreende 3 partes principais: uma base que comporta
CMO permite captar 80 por cento das partculas de 0,14 m.
locais destinados aos cadinhos, um corpo intermedirio
Para as formulaes que contenham uma fraco significativa
que assegura o fecho hermtico dos cadinhos e contm os
de partculas no retidas pelo CMO, est disponvel um porta-
respiros e uma cobertura no interior da qual se efectua a
filtro opcional; ele pode quer substituir o CMO, quer ser
passagem entre os estgios (figuras 11 e 12). Os respiros
montado como segurana (pode servir um filtro de fibra de
com orifcios mltiplos so utilizados em todos os estgios
vidro).
salvo no primeiro (figura 13). A circulao de ar atravs do
aparelho efectua-se segundo um trajecto em dentes de serra.


2. Mtodos
Analticos
FIGURA 11 Aparelho E (representado com o pr-separador no seu lugar)
FIGURA 12 Elementos componentes do aparelho E
Tcnica aplicvel aos inaladores pressurizados

Instale cadinhos nos locais prprios da plataforma. o inalador no aparelho carregando na vlvula o tempo
Adapte a plataforma na base e feche a tampa (com o corpo necessrio para obter uma descarga completa. Aguarde 5 s
intermedirio no lugar) e aperte o conjunto de modo a antes de separar o conjunto do inalador do adaptador. Repita
garantir que o sistema seja estanque. Ligue ao orifcio de o processo de descarga. O nmero de descargas recolhidas
entrada do impactor um tubo de admisso de dimenses no muito elevado (em regra, no mais de 10) mas so as
internas como definidas na figura 7. Na outra extremidade suficientes para permitir uma determinao exacta e fiel da
do tubo de admisso instale um adaptador apropriado de dose de partculas finas. Aps a ltima descarga, espere 5 s e
2. Mtodos
Analticos
tal modo que a ponteira do difusor, uma vez inserida no pare a bomba.
adaptador, fique alinhada com o eixo horizontal do tubo de Desmonte o aparelho e proceda como se indica a seguir para
admisso. A face anterior da ponteira e a do tubo de admisso recolher a substncia activa: desmonte o tubo de admisso
devem ficar alinhadas num mesmo plano. Quando ligado e o adaptador da ponteira e recolha o princpio activo
ao adaptador da ponteira, o inalador deve ser orientado como depositado com um volume apropriado de solvente. Abra o
se indica para o emprego normal. Ligue uma bomba de aparelho desatarrachando o punho e levante a cobertura.
vazio apropriada sada do aparelho e regule o dbito de ar Retire a placa com os cadinhos e recolha o princpio activo
(medido entrada do tubo de admisso) para 30 litros/min com um volume apropriado de solvente.
( 5 por cento). Pare a bomba.
Por um mtodo de anlise apropriado, determine a
Salvo indicao em contrrio nas instrues de utilizao, quantidade de princpio activo contida em cada um dos
agite o inalador durante 5 s e accione uma vez com perda. volumes de solvente.
Ponha em movimento a bomba. Prepare o inalador para
Calcule a dose de partculas finas (ver Clculo).
o emprego como se indica nas instrues de utilizao.
Coloque a ponteira do difusor no adaptador e descarregue
FIGURA 13 Aparelho E: configurao dos tubos
FIGURA 14 Aparelho E: circulao entre os estgios


Ligue o aparelho e o pr-separador (fig. 15). Em certos abrindo a electrovlvula durante o tempo T necessrio
casos justificados, em funo das caractersticas do ( 5 por cento). Repita a operao. O nmero de descargas
produto, pode omitir-se o pr-separador. recolhidas no muito elevado (em regra, no mais de 10),
Instale cadinhos nos locais prrios da plataforma. mas so as suficientes para permitir uma determinao
Adapte a plataforma na base, feche a tampa (com o corpo exacta e fiel da dose de partculas finas.
intermedirio no seu lugar) e movimente o punho de modo a Desmonte o aparelho e proceda como se indica a seguir para
2. Mtodos
Analticos
apertar o conjunto para garantir que o sistema seja estanque. recolher o princpio activo. Separe o tubo de admisso e o
Para instalar um pr-separador, proceda do seguinte modo. adaptador da ponteira do pr-separador (se for caso disso) e
Coloque o inseror na base do pr-separador. Monte a base recolha o princpio activo depositado por meio de um volume
do pr-separador na entrada do impactor e encha o cadinho apropriado de solvente. Separe (se for caso disso) o pr-sepa-
central do inseror com 15 ml do solvente utilizado para a rador do impactor, evitando introduzir no impactor lquido
extraco do produto activo. Coloque o corpo do pr- contido no cadinho e recolha o princpio activo contido no
-separador sobre o conjunto e feche as duas molas. pr-separador.
Ligue ao orifcio de entrada do impactor, ou do pr-separador, Abra o impactor desatarrachando o punho e levante a
um tubo de admisso de dimenses internas como as cobertura. Retire a plataforma com os cadinhos e recolha o
definidas na figura 7. Na outra extremidade do tubo instale princpio activo depositado em cada cadinho com um volume
um adaptador apropriado de tal modo que a ponteira do apropriado de solvente.
inalador, uma vez inserida no adaptador, fique alinhada
no sentido do eixo horizontal do tubo de admisso. A face Determine, por um mtodo de anlise apropriado, a
anterior da ponteira do inalador e a do tubo de admisso quantidade de princpio activo contida em cada um dos
devem ser alinhadas como se indica para o emprego normal. volumes do solvente.
Ligue o aparelho a um circuito hidrulico conforme o Calcule a dose de partculas finas (ver Clculo).
esquema da figura 8 e o quadro 4. Salvo indicao em
contrrio, efectue o ensaio ao dbito Qout utilizado no ensaio
de uniformidade da dose libertada, aspirando 4 litros de Clculos
ar atravs do aparelho, aps a ponteira do inalador. Ligue A partir dos resultados da anlise das solues, calcule a
ao tubo de admisso um debitmetro volumtrico. Utilize massa de princpio activo depositada quando de cada descarga
um debitmetro calibrado para a corrente gasosa de sada, nos diferentes estgios bem como no tubo de admisso, no
ou calcule o dbito gasoso de sada do debitmetro (Qout) a adaptador da ponteira e, se for o caso, no pr-separador.
partir da lei dos gases perfeitos. No caso de um debitmetro
calibrado para a corrente gasosa de entrada (Qin) utilize a Comeando pela fraco colectada terminal (filtro ou CMO),
expresso: calcule para cada um dos estgios a massa acumulada em
funo do dimetro de corte de cada estgio, apresentando
Qin P0 os resultados na forma de quadro (ver quadros 7, para o
Qout
P0 P aparelho C, 8 para o aparelho D e 9 para o aparelho E).
Calcule por interpolao a massa de princpio activo de
granulometria inferior a 5 m. Esta massa representa a dose
P0 = presso atmosfrica, de partculas finas (DPF).
P = perda de carga no debitmetro. Se necessrio, e nos casos apropriados (por exemplo, no caso
de distribuio log-normal), construa em papel
Ajuste o dbito por meio do regulador de dbito de modo
semi-logartmico o grfico da fraco acumulada de princpio
a instaurar na aparelhagem um regime estacionrio com o
activo em funo do dimetro de corte (ver quadros 7/9)
dbito Qout requerido ( 5 por cento). Verifique que o regime
e utilize este grfico para determinar o valor do dimetro
crtico instaurado no regulador de dbito pelo mtodo
aerodinmico mediano mssico (DAMM) ou o desvio padro
descrito para o aparelho C. Pare a bomba.
geomtrico (ETG), segundo o caso. Podem igualmente ser
Prepare o inalador de p para o emprego como se indica nas utilizados mtodos informticos apropriados.
instrues de utilizao. Ponha a a bomba em movimento
QUADRO 7 Mtodo de clculo para o aparelho C
e feche a electrovlvula. Coloque a ponteira do inalador
no adaptador. Provoque uma descarga de p no aparelho, Utilize q = 60/Q) em que Q o dbito em litros/min (Qout para os
inaladores de p)
Dimetro limite Massa de princpio activo Massa acumulada de princpio activo Percentagem acumulada
(m) depositada por descarga depositada por descarga de princpio activo (por cento)
d4 = 1,7 q massa recolhida no estgio 5, m5(*) c4 = m5 f4 = (c4/c) 100

d3 = 3,1 q massa recolhida no estgio 4, m4 c3 = c4+ m4 f3 = (c3/c) 100
d2 = 6,8 q massa recolhida no estgio 3, m3 c2 = c3+ m3 f2 = (c2/c) 100
massa recolhida no estgio 2, m2 c = c2 + m2 100
(*) O estgio 5 o estgio de filtrao.

QUADRO 8 Mtodo de clculo para o aparelho D, utilizado com um dbito de 28,3 litros/min
Dimetro limite Massa de princpio activo Massa acumulada de princpio activo Percentagem acumulada
d7 = 0,4 massa recolhida no estgio 8, m8 c7 = m8 f7 = (c7/c) 100

d6 = 0,7 massa recolhida no estgio 7, m7 c6 = c7 + m7 f6 = (c6/c) 100
2. Mtodos
Analticos
QUADRO 9 Mtodo de clculo para o aparelho E. Utilize q = (60/Q)x em que Q o dbito utilizado,
em litros/min, e x est inscrito no quadro
Dimetro limite x Massa de princpio activo Massa acumulada de princpio activo Percentagem acumulada
d7 = 0,34 q 0,67 massa recolhida no CMO ou no filtro terminal, m8 c7 = m8 F7 = (c7/c) 100

d6 = 0,55 q 0,60 massa recolhida no estgio 7, m7 c6 = c7 + m7 F6 = (c6/c) 100
FIGURA 15 Aparelho E: configurao do pr-separador

2.9.19. Contaminao por partculas: partculas no visveis
2.9.19. CONTAMINAO Lave muito cuidadosamente a vidraria utilizada e o material

de filtrao, com excepo das membranas filtrantes, com
POR PARTCULAS: PARTCULAS uma soluo quente de detergente e depois lave abundante-
NO VISVEIS mente com gua para eliminar qualquer vestgio da soluo
do detergente. Imediatamente antes da utilizao lave o
A contaminao por partculas das preparaes para uso material de alto a baixo pela parte exterior e de seguida pelo
parentrico e das preparaes para perfuso constituda interior com gua isenta de partculas R.
2. Mtodos
Analticos
por partculas estranhas, no dissolvidas e mveis, alm das Evite introduzir bolhas de ar na amostra especialmente
bolhas de gs que se encontram involuntariamente nestas quando da transferncia das fraces para o recipiente no
preparaes. qual a determinao se vai realizar.
Para a determinao da contaminao por partculas Para verificar se o ambiente apropriado para o ensaio, se a
especificam-se a seguir 2 mtodos: mtodo 1 (ensaio de vidraria est lavada de modo conveniente e se a gua utilizada
contagem de partculas por intercepo da luz) e mtodo est isenta de partculas, efectue o ensaio seguinte: determine
2 (ensaio de contagem de partculas por microscopia a contaminao por partculas de 5 amostras de gua isenta
ptica). Para a determinao de partculas no visveis nas de partculas R de 5 ml cada, utilizando o mtodo operatrio
preparaes injectveis e nas preparaes para perfuso a seguir descrito. Se o nmero de partculas de 10 m ou
utilize de preferncia o mtodo 1. Em determinadas mais for superior a 25 para os 25 ml reunidos, as precaues
preparaes, entretanto, pode ser necessrio realizar ensaios tomadas para o ensaio no foram suficientes e as manipula-
de contagem de partculas por intercepo da luz em es preparatrias so repetidas at que o ambiente, a
primeiro lugar e s depois por microscopia ptica para poder vidraria e a gua sejam apropriados para o ensaio.
concluir quanto conformidade dos resultados obtidos.
A pesquisa das partculas no visveis efectuada aplicando MTODO
um destes mtodos, ou mesmo os dois, no possvel para
todas as preparaes injectveis. Quando o mtodo 1 no Misture o contedo da amostra com 20 rotaes lentas e
aplicvel, por exemplo no caso das preparaes pouco sucessivas do recipiente. Se necessrio, retire com cuidado
lmpidas ou muito viscosas, o ensaio realiza-se com recurso a cpsula de fecho. Lave as superfcies exteriores da abertura
ao mtodo 2 (caso das emulses, das solues coloidais e das do frasco com um jacto de gua isenta de partculas R e retire
preparaes de lipossomas). Do mesmo modo, um ensaio o obturador evitando qualquer contaminao do contedo.
de contagem de partculas por microscopia ptica pode Elimine as bolhas de gs de modo apropriado, por exemplo
igualmente ser exigido no caso de produtos que formem deixando a soluo em repouso durante 2 min ou aplicando
bolhas de ar ou de gs quando passam atravs do detector. tratamento com ultrassons.
Se a viscosidade da preparao tal que o exame por um
ou outro dos mtodos impossvel, pode efectuar-se uma No caso das preparaes parentricas de grande volume,
diluio quantitativa com um diluente apropriado de modo efectue o ensaio em unidades separadas. Quanto s
a reduzir a viscosidade para o grau julgado necessrio para preparaes parentricas de pequeno volume, cujo volume
permitir o ensaio. seja inferior a 25 ml, rena o contedo de 10 unidades ou
mais num recipiente limpo de modo a obter um volume
Os resultados obtidos quando se examina uma unidade mnimo de 25 ml; em casos justificados e autorizados, a
ou um grupo de unidades no pode ser extrapolado com soluo problema pode ser preparada misturando o contedo
fiabilidade em relao a outras unidades que no foram de um nmero apropriado de frascos e completando 25 ml
ensaiadas. Por consequncia, convm estabelecer planos com gua isenta de partculas R ou um solvente apropriado
de amostragem estatisticamente vlidos se se quiser tirar isento de contaminao por partculas, quando a gua
concluses vlidas, a partir dos dados recolhidos, para isenta de partculas R no for apropriada. As preparaes
determinar o grau de contaminao por partculas de um parentricas de pequeno volume cujo volume for superior ou
grande grupo de unidades. igual a 25 ml podem ser examinadas individualmente.
No caso dos ps para uso parentrico, reconstitua a
preparao com gua isenta de partculas R ou um solvente
MTODO 1. Ensaio de contagem de partculas por intercepo
apropriado isento de contaminao por partculas, quando a
da luz
gua isenta de partculas R no for apropriada.
Utilize um aparelho apropriado baseado no princpio da O nmero de amostras suficiente para permitir uma
intercepo de um raio luminoso permitindo a determinao determinao estatisticamente vlida. No caso de preparaes
automtica do tamanho das partculas e o nmero destas por parentricas de grande volume ou de pequeno volume igual
tamanhos. ou superior a 25 ml, podem ser suficientes para o ensaio
menos de 10 embalagens de acordo com um plano de
O aparelho calibrado com substncias de referncia amostragem apropriado.
certificadas apropriadas consistindo em disperses de
partculas esfricas de tamanho conhecido e compreendido Tome 4 tomadas de ensaio de volume igual ou superior a
entre 10 m e 25 m. Estas partculas de referncia so 5 ml. Determine o nmero de partculas de tamanho superior
dispersas em gua isenta de partculas R, evitando a ou igual a 10 m e a 25 m. Calcule o nmero mdio de
aglomerao das partculas. partculas da amostra sem ter em conta o resultado obtido
com a primeira fraco.
PRECAUES GERAIS
AVALIAO
Efectue o ensaio em condies que limitem a contaminao
por partculas, de preferncia numa cmara de fluxo de ar Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo
laminar. nominal superior a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 1.A.

2.9.19. Contaminao por partculas: partculas no visveis
Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo

nominal inferior a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 1.B.
Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo
nominal igual a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 1.B.
Se o nmero mdio de partculas ultrapassar os limites,
2. Mtodos
efectue o ensaio de contagem das partculas por microscopia
Analticos
ptica.
Ensaio 1.A Solues para perfuso e solues injectveis
acondicionadas em recipientes de contedo nominal
superior a 100 ml.
A preparao satisfaz ao ensaio se o nmero mdio de part-
culas presentes nas unidades examinadas no for superior
a 25 por mililitro para as partculas de tamanho superior
ou igual a 10 m e a 3 por mililitro para as partculas de
tamanho superior ou igual a 25 m.
Ensaio 1.B Solues para perfuso ou solues injectveis
acondicionadas em recipientes de contedo nominal inferior FIGURA 1 Retculo circular
a 100 ml.
A preparao satisfaz ao ensaio se o nmero mdio de PRECAUES GERAIS
partculas presentes nas unidades examinadas no for
superior a 6000 por recipiente para as partculas de tamanho Efectue o ensaio em condies que limitem a contaminao
superior ou igual a 10 m e a 600 por recipiente para as por partculas, de preferncia numa cmara de fluxo de ar
partculas de tamanho superior ou igual a 25 m. laminar.
Lave muito cuidadosamente a vidraria utilizada e o sistema
de filtrao, com excepo da membrana filtrante, com uma
MTODO 2. Ensaio de contagem de partculas por microscopia soluo quente de detergente e depois lave abundantemente
ptica com gua para eliminar qualquer vestgio da soluo do
detergente. Imediatamente antes da utilizao lave os dois
Utilize um microscpio binocular apropriado, um dispositivo lados da membrana filtrante e o material de alto a baixo
de filtrao para reter a contaminao por partculas e uma pelo exterior e de seguida pelo interior com gua isenta de
membrana filtrante. partculas R.
O microscpio est equipado com um micrmetro ocular Para verificar se o ambiente apropriado para o ensaio, se
calibrado, com um micrmetro de objectiva, uma platina de a vidraria e a membrana filtrante esto lavadas de modo
movimentos cruzados capaz de manter e de atravessar toda a conveniente e se a gua utilizada est isenta de partculas,
superfcie de filtrao da membrana filtrante, 2 iluminadores efectue o ensaio seguinte: determine a contaminao
apropriados que permitem uma iluminao episcpica e uma por partculas sobre um volume de 50 ml de gua isenta
de partculas R, utilizando o mtodo operatrio a seguir
iluminao oblqua e ajustado para uma ampliao de
descrito. Se, a superfcie de filtrao comporta um nmero
100 10. de partculas de 10 m, ou mais, superior a 20 ou um
O micrmetro ocular um retculo circular (ver figura 1) nmero de partculas de 25 m, ou mais, superior a 5, as
e compreende um grande crculo dividido em quartos por precaues tomadas para o ensaio no foram suficientes e as
linhas cruzadas, crculos de referncia negros e transparentes manipulaes preparatrias so repetidas at que o ambiente,
a vidraria, a membrana filtrante e a gua sejam apropriados
de dimetro de 10 m e de 25 m com um aumento de 100 e
para o ensaio.
uma escala linear graduada de 10 em 10 m. calibrado com
um micrmetro de objectiva certificado por uma organizao
internacional ou nacional de normalizao. aceitvel um MTODO
erro relativo de 2 por cento para a escala linear do retculo. O
grande crculo chamado campo de viso do retculo (CVR). Misture o contedo da amostra com 20 rotaes lentas e
sucessivas do recipiente. Se necessrio, retire com cuidado a
So necessrios dois iluminadores, um iluminador episcpico cpsula de fecho. Lave as superfcies exteriores da abertura do
para fundo claro, interno do microscpio, e um iluminador frasco com um jacto de gua isenta de partculas R e retire o
auxiliar externo regulvel, ajustvel para permitir uma obturador evitando qualquer contaminao do contedo.
iluminao oblqua reflectida segundo um ngulo de 10-20.
No caso das preparaes parentricas de grande volume,
O dispositivo de filtrao destinado a reter a contaminao efectue o ensaio em unidades separadas. Quanto s prepara-
por partculas compreende um suporte de filtro de vidro es parentricas de pequeno volume, cujo volume seja
ou outro material conveniente, uma fonte de vcuo e uma inferior a 25 ml, rena o contedo de 10 unidades ou mais
membrana filtrante adequada. num recipiente limpo; em casos justificados e autorizados,
a soluo problema pode ser preparada misturando
A membrana filtrante, de dimenses apropriadas, de cor o contedo de um nmero apropriado de frascos e
negra ou cinzenta escura; coberta ou no com uma grelha e completando 25 ml com gua isenta de partculas R ou um
o tamanho dos poros inferior ou igual a 1,0 m. solvente apropriado isento de contaminao por partculas,

2.9.20. Contaminao por partculas: partculas visveis
quando a gua isenta de partculas R no for apropriada. Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo
As preparaes parentricas de pequeno volume cujo nominal igual a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 2.B.
volume for superior ou igual a 25 ml podem ser examinadas
individualmente. Ensaio 2.A. Solues para perfuso e solues injectveis
acondicionadas em recipientes de contedo nominal
No caso dos ps para uso parentrico, reconstitua a superior a 100 ml.
preparao com gua isenta de partculas R ou um solvente
A preparao satisfaz ao ensaio se o nmero mdio de part-
2. Mtodos
Analticos
apropriado isento de contaminao por partculas, quando a

gua isenta de partculas R no for apropriada. culas presentes nas unidades examinadas no for superior
a 12 por mililitro para as partculas de tamanho superior
O nmero de amostras suficiente para permitir uma ou igual a 10 m e a 2 por mililitro para as partculas de
determinao estatisticamente vlida. No caso de preparaes tamanho superior ou igual a 25 m.
parentricas de grande volume ou de pequeno volume igual
ou superior a 25 ml, podem ser suficientes para o ensaio Ensaio 2.B. Solues para perfuso ou solues injectveis
menos de 10 embalagens de acordo com um plano de acondicionadas em recipientes de contedo nominal inferior
amostragem apropriado. a 100 ml.
Humedea o interior do suporte do filtro munido da A preparao satisfaz ao ensaio se o nmero mdio de
membrana filtrante com alguns mililitros de gua isenta partculas presentes nas unidades examinadas no for
de partculas R. Passe para o filtro a totalidade da amostra superior a 3000 por recipiente para as partculas de tamanho
(mistura das tomadas de ensaio ou a unidade em ensaio) e superior ou igual a 10 m e a 300 por recipiente para as
aplique o vazio. Se necessrio, junte a pouco e pouco fraces partculas de tamanho superior ou igual a 25 m.
da soluo at que o volume total seja filtrado. Aps a ltima
adio, comece a lavagem das paredes internas do suporte
do filtro utilizando um jacto de gua isenta de partculas R.
Mantenha o vazio at que a superfcie da membrana filtrante 2.9.20. CONTAMINAO POR
fique isenta de lquido. PARTCULAS: PARTCULAS VISVEIS
Coloque o filtro numa caixa de Petri e seque ao ar deixando
a caixa ligeiramente aberta. Quando o filtro estiver seco, A contaminao por partculas das preparaes injectveis
coloque a caixa de Petri na platina do microscpio, efectue e das preparaes injectveis para perfuso constituda
o varrimento da membrana filtrante inteira sobre a luz por partculas estranhas, no dissolvidas e mveis, alm das
reflectida do iluminador e conte o nmero de partculas de bolhas de gs, e que se encontram involuntariamente nestas
tamanho superior ou igual a 10 m e o nmero de partculas solues.
de tamanho superior ou igual a 25 m. igualmente possvel A finalidade do ensaio fornecer um mtodo simples de
efectuar uma contagem parcial e determinar por clculo o avaliao visual da qualidade das solues no que respeita
nmero total de partculas retidas no filtro. Calcule o nmero
s partculas visveis. Podem utilizar-se outros mtodos
mdio de partculas presentes na amostra.
validados.
Para determinar o tamanho das partculas com auxlio do
retculo circular, proceda a uma transformao mental da
imagem de cada partcula num crculo e depois compare-a APARELHO
com os crculos de referncia do retculo de 10 m e de
25 m. Assim, as partculas mantm a sua posio inicial no
Rampa de iluminao ajustvel
interior do campo de viso do retculo e no se sobrepem
aos crculos de referncia para fins de comparao. O
dimetro interior dos crculos de referncia transparentes do
retculo utilizado para determinar o tamanho das partculas
brancas ou transparentes enquanto que o tamanho das
partculas escuras determinado com o dimetro exterior
dos crculos de referncia do retculo negros ou opacos. Painel
Painel
branco
Quando realizar um ensaio de contagem de partculas ao preto
anti-reflexo
microscpio no procure medir ou enumerar matrias bao
amorfas, semi-lquidas ou morfologicamente indistintas
que se assemelham a uma mancha ou zona descorada da Painel branco
membrana filtrante. Estes materiais podem apresentar um anti-reflexo
fraco ou nulo brilho e assumir um aspecto gelatinoso ou a
aparncia de uma pelcula. A interpretao da enumerao
pode ser facilitada realizando um ensaio de contagem das
partculas por reteno da luz sobre uma amostra da soluo. FIGURA 1 Aparelho para partculas visveis
O aparelho (ver figura 1 composto por um posto de

AVALIAO
observao, compreendendo:
Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo um painel preto bao, de dimenses apropriadas, colocado
nominal superior a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 2.A. em posio vertical,
Nas preparaes acondicionadas em recipientes de contedo um painel branco anti-reflexo de dimenses apropriadas,
nominal inferior a 100 ml, aplique os critrios do ensaio 2.B. colocado em posio vertical ao lado do painel preto,

2.9.22. Tempo de amolecimento dos supositrios lipfilos
uma rampa de iluminao ajustvel, comportando uma

fonte de luz branca protegida e um difusor apropriados
(uma rampa contendo 2 tubos fluorescentes de 13 W, com
um comprimento de 525 mm cada um, apropriada).
A intensidade da iluminao no ponto de observao
mantida entre 2 000 e 3 750 lux sendo aconselhvel uma
2. Mtodos
intensidade mais elevada para recipientes de vidro corado
Analticos
ou de plstico.
MTODO
Retire eventualmente os rtulos, lave e seque o exterior do

recipiente. Agite suavemente e inverta cada recipiente com
precauo, evitando a formao de bolhas de ar e observe-o
durante cerca de 5 s contra o painel branco. Repita este
procedimento contra o painel preto.
Anote a presena de qualquer partcula.
2.9.22. TEMPO DE AMOLECIMENTO

DOS SUPOSITRIOS LIPFILOS
Este ensaio destina-se a determinar, em condies definidas,
o tempo que decorre at que um supositrio, colocado em
gua, se apresente suficientemente mole para no apresentar
resistncia a uma carga definida.
APARELHO A
O aparelho (ver figura 1) constitudo por um tubo de vidro

de fundo plano, com 15,5 mm de dimetro interno e cerca de FIGURA 1 Aparelho A para determinao do tempo de
140 mm de comprimento. O tubo fechado por uma tampa amolecimento dos supositrios lipfilos
de material plstico, com um orifcio de 5,2 mm de dimetro. Dimenses em milmetros
O aparelho apresenta uma vareta de 5,0 mm de dimetro, que
se torna mais larga na extremidade inferior at atingir um
APARELHO B
dimetro de 12 mm. Na face inferior est fixada uma agulha
metlica com 2 mm de comprimento e 1 mm de dimetro. O aparelho (ver figura 2) constitudo por um banho de gua
A vareta constituda por 2 partes sendo a inferior em (B) no qual est colocado um tubo interior (A) fechado por
material plstico e a superior em material plstico ou uma rolha na extremidade inferior. O aparelho inclui um
metlico e com um disco de carga. As partes inferior e termmetro e um dos dois acessrios seguintes:
superior so quer solidrias (verso manual) quer separadas uma vareta de vidro oca (C1) constituda por um tubo
(verso automatizada). A massa da vareta de 30 0,4 g. A fechado nas duas extremidades e com um rebordo na base;
parte superior da vareta provida de um anel de marcao a vareta lastrada com granalha de chumbo e a sua massa
deslocvel. Quando a vareta repousa no fundo do tubo vazio o de 30 0,4 g,
anel de marcao rasa a tampa de material plstico.
um sistema perfurador (C2) constitudo por uma vareta de
7,5 0,1 g num tubo que alarga para baixo para receber o
MTODO supositrio; a vareta e o tubo so de ao inoxidvel.
Encha o tubo de vidro com 10 ml de gua a 36,5 0,5C.

MTODO
Mergulhe o tubo de vidro pelo menos 7 cm num banho de
gua termostatado e sem tocar no fundo. No tubo de vidro,
Introduza no tubo interior (A) com 5 ml de gua a
coloque um supositrio, previamente levado temperatura 36,5 0,5C, de seguida coloque o supositrio com a ponta
ambiente, com a extremidade mais larga voltada para baixo. voltada para baixo e por fim o acessrio prescrito (C1 ou
Introduza rapidamente a vareta no tubo de vidro at que C2). Determine o tempo que medeia entre este instante e o
toque no supositrio e ajuste a tampa (incio da medio). momento em que o rebordo da vareta de vidro (C1) ou da
Mea o tempo que decorre at que a vareta desa at ao fundo vareta de ao inoxidvel (C2) atinge o estrangulamento do
do tubo e o anel de marcao tenha atingido a parte superior tubo interior: a fuso ou a dissoluo , ento, considerada
da tampa de material plstico como terminada.

2.9.23. Densidade picnomtrica dos slidos

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 2 Aparelho B para determinao do tempo de amolecimento dos supositrios lipfilos

2.9.23. DENSIDADE PICNOMTRICA A temperatura do picnmetro de gs est compreendida entre

15 e 30C e no varia mais de 2C no decorrer do ensaio.
DOS SLIDOS
A calibrao do aparelho (determinao dos volumes Vc e Vr)
O ensaio da densidade picnomtrica dos slidos consiste em feita com esferas de ao polido calibradas, com um volume total
determinar o volume ocupado por uma massa conhecida (cerca de 6 cm3) conhecido at 0,001 cm3. O mtodo abaixo
de p, medindo o volume de gs deslocado em condies
conhecidas. Calcula-se, assim. a densidade picnomtrica. descrito executado em duas fases, usando-se na primeira a
clula de ensaio vazia e na segunda a clula de ensaio com as
esferas. Os volumes Vc e Vr so calculados usando a equao
APARELHAGEM
indicada para o clculo do volume da amostra, atribuindo a
O aparelho (ver figura 1) constitudo por: este volume o valor zero na primeira fase da determinao.
uma clula de anlise fechada, de volume vazio Vc, ligada

por uma torneira a uma clula de referncia de volume Vr, MTODO
um sistema que permite levar a presso interna da clula
de ensaio, com o auxlio do gs de medida, a um valor Pese a clula de ensaio do picnmetro e anote a massa.
definido P indicado por um manmetro, Encha a clula de ensaio com uma massa determinada da
uma fonte de um gs de medida que, salvo indicao em amostra. Monte a clula no picnmetro de modo a garantir
contrrio, de preferncia o hlio(1). a estanquicidade. Elimine os contaminantes volteis
existentes no p procedendo a uma desgaseificao em fluxo
(1) Os resultados obtidos com hlio e com outro gs no sero constante de gs. Por vezes, pode ser necessrio proceder
necessariamente equivalentes: a penetrao do gs depende da
dimenso dos poros e da seco transversal das molculas do gs.
a uma desgaseificao inicial sob vazio. Anote a presso
Por exemplo, a densidade picnomtrica de um produto poroso ser de referncia Pr do sistema, que o valor indicado pelo
mais elevada se a avaliao for efectuada com azoto em vez de hlio. manmetro quando a torneira de comunicao entre a

2.9.25. Ensaio de dissoluo das gomas para mascar medicamentosas
APARELHO
O aparelho (figura 1) constitudo por:

uma cmara de mastigao,
um pisto vertical,
2. Mtodos
2 pistes horizontais munidos de juntas tricas e de juntas
Analticos
de estanquicidade.
A cmara de mastigao composta por 4 elementos:
uma cmara central,
dois elementos de orientao com casquilhos,
uma chamin (figura 2).
A chamin e os elementos de orientao so montados
na cmara central. As juntas tricas so montadas numa
chanfradura do pisto prevista para este efeito e dobradas
para as juntas que asseguram a estanquicidade da cmara. Os
FIGURA 1 Representao de um picnmetro de gs
pistes horizontais so introduzidos na cmara de mastigao
Vr = volume da clula de referncia, atravs dos elementos de orientao.
Vc = volume da clula de ensaio, A goma submetida a uma mastigao artificial por aco
dos pistes horizontais; um pisto vertical impede que a
Vs = volume da amostra,
goma se desloque entre os ciclos de mastigao.
M = manmetro.
A velocidade do aparelho regulada de modo a assegurar
a realizao de ciclos constantes. Um ciclo de mastigao
clula de referncia e a clula do ensaio est aberta. Feche a define-se do seguinte modo: os pistes horizontais partem
torneira para isolar as duas clulas. Com o gs, leve a presso da sua posio extrema de abertura, deslocam-se at sua
interna da clula de ensaio presso inicial Pi e anote este posio extrema de fecho e depois regressam posio
valor. Abra a torneira para restabelecer a comunicao entre inicial. No decurso deste ciclo, o pisto vertical sobe da
as duas clulas. Anote a presso final Pf. Repita a medio sua posio mais baixa at sua posio mais alta e depois
com a mesma amostra de p at obter, para o volume Vs, dois regressa posio inicial. O curso de cada pisto horizontal
resultados sucessivos cuja diferena seja inferior a 0,5 por de 25,0 mm. A distncia mxima entre estes dois pistes
cento. O volume da amostra exprime- se em cm3. Desmonte a de 50 mm. A distncia mnima entre os dois pistes
clula de ensaio e determine a massa final m do p, expressa horizontais de 0,1 mm a 1,0 mm. O curso do pisto
em gramas. vertical de 22,0 mm.
O movimento dos pistes horizontais regulado de modo
EXPRESSO DOS RESULTADOS que os dois se encontrem simultaneamente na sua posio
extrema de fecho. O movimento do pisto vertical regulado
de modo a no interferir com o movimento dos pistes
O volume Vs da amostra calculado usando a seguinte
horizontais.
expresso:
Se necessrio, o aparelho pode ser construdo de tal modo
Vr que, no fim do ciclo de mastigao, os pistes horizontais
Vs = Vc
Pi pr girem em torno do seu eixo em sentidos opostos um do outro
1 permitindo que a goma seja submetida a um esforo mximo
Pf Pr
de mastigao.
A densidade calculada usando a equao: Todas as partes do aparelho susceptveis de entrar em
contacto com a amostra ou o meio de dissoluo so
m quimicamente inertes e no adsorvem os componentes
=
Vs da amostra nem reagem com eles ou interferem no seu
comportamento.
2.9.25. ENSAIO DE DISSOLUO MTODO
DAS GOMAS PARA MASCAR Para cada determinao so necessrias as seguintes

MEDICAMENTOSAS informaes:
composio, volume e temperatura do meio de dissoluo,
PRINCPIO
nmero de ciclos de mastigao por minuto,
O ensaio destina-se a determinar a velocidade de dissoluo condies de amostragem (tempo e mtodo),
dos princpios activos contidos em gomas para mascar
medicamentosas. Consiste em submeter a uma mastigao se o ensaio para ser efectuado sobre o resduo da goma ou
sobre o meio de libertao,
artificial um pedao de goma colocado numa pequena cmara
concebida para simular uma operao de mastigao. mtodo de anlise.

2.9.25. Ensaio de dissoluo das gomas para mascar medicamentosas

2. Mtodos
Analticos
A. Pisto horizontal C. Cmara de mastigao E. Pisto vertical

B. Elemento de orientao D. Chamin
FIGURA 1 Cmara de mastigao e pistes

(Dimenses em milmetros)
Introduza na cmara de mastigao o volume prescrito do o resduo da goma e tome uma amostra do meio.
meio de dissoluo, geralmente 20 ml de tampo de fosfato Determine o teor em princpio(s) activo(s) por um
de pH 6,0 R2. Mantenha a temperatura do meio a 37 0,5C mtodo de anlise apropriado. O meio pode ser reposto
por meio de um dispositivo elctrico com controlo externo aps cada tomada de ensaio mas necessrio aplicar aos
e mantenha a velocidade dos pistes no nmero prescrito de resultados uma correco numrica para ter em conta
ciclos por minuto (geralmente, 60). Pese exactamente um a variao de volume ou de diluio. Alternativamente,
pedao da amostra (ou uma amostra inteira), coloque na determine o teor de pricpo(s) activo(s) no resduo da
cmara de mastigao e ponha o aparelho a funcionar. goma.
A quantidade de princpio(s) activo(s) dissolvido(s) num
AMOSTRAGEM E AVALIAO
tempo prescrito expressa em percentagem do teor declarado
Pare o aparelho ao fim do tempo presrito, elimine no rtulo.

2.9.26. Superfcie especfica por adsoro gasosa
2.9.26. SUPERFCIE ESPECFICA POR

ADSORO GASOSA
INTRODUO
Este ensaio consiste em determinar a superfcie especfica de
um p por adsoro fsica de um gs superfcie do slido, e
2. Mtodos
Analticos
pelo clculo da quantidade de gs adsorvido (gs de medida)
que esta adsorve sob a forma de camada monomolecular. A
adsoro fsica resulta de interaces relativamente fracas
(foras de van der Waals) entre as molculas do gs (gs de
medida) e a superfcie do p. A determinao geralmente
efectuada temperatura do azoto lquido. A quantidade de
gs adsorvido pode ser medida por gravimetria, por
volumetria ou em fluxo contnuo.
FUNO DE BRUNAUER, EMMETT E TELLER (BET)

E DETERMINAO DA SUPERFCIE ESPECFICA
DETERMINAO COM VRIOS PONTOS
Os dados recolhidos so tratados aplicando a equao das

isotrmicas de adsoro de Brunauer, Emmett e Teller (BET):
FIGURA 2 Chamin
(dimenses em milmetros)
P = presso parcial de vapor do gs de medida em equilbrio com a

superfcie a 77,4 K (Eb. do azoto lquido) em pascal,
P = presso de saturao do gs de medida, em pascal,
Va = volume de gs adsorvido nas condies normais de presso e
temperatura [273,15 K e presso atmosfrica (1,013 105Pa)],
em mililitros,
Vm= volume de gs adsorvido que, nas condies normais de presso
e temperatura, origina uma monocamada aparente superfcie
da amostra, em mililitros,
C = constante sem dimenso relacionada com a entalpia de adsoro
do gs superfcie da amostra do p.
Efectue uma medio de Va para, pelo menos, 3 valores de
P/Po. Construa o grfico dos valores da varivel BET
em funo de P/Po utilizando a equao (1). O grfico obtido

apresenta normalmente um traado linear no intervalo de
presses relativas compreendido entre cerca de 0,05 e 0,3.
Os resultados so considerados aceitveis se o coeficiente de
correlao, r, da regresso linear no for inferior a 0,9975
(ou seja, se r2 for igual ou superior a 0,995). Por anlise de
regresso linear, determine a inclinao da recta, que igual
a (C-1) / VmC, e a intercepo na origem, que igual a 1/VmC.
Pode calcular-se o valor de Vm usando a relao l/(inclinao
intercepo na origem) e o de C usando a relao
(inclinao/intercepo na origem) 1. A partir do valor de
Vm assim obtido, calcule a superfcie especfica, S, em m2.g-1,
utilizando a equao:
FIGURA 3 Elementos de orientao (seco G-G)

(dimenses em milmetros) N = nmero de Avogadro (6,022 1023 mol-1),

a = superfcie da seco efectiva de uma molcula do gs de MTODOS EXPERIMENTAIS

medida, em metros quadrados (0,162 nm2 para o azoto e
0,195 nm2 para o crpton), Esta seco descreve os mtodos utilizados para a preparao
m = massa da tomada de ensaio, em gramas, das amostras e para a execuo dos mtodos de adsoro
gasosa em fluxo dinmico (Mtodo I) e volumtrico (Mtodo
22400 = volume, em mililitros, ocupado por 1 mole do gs de II).
medida nas condies normais de presso e temperatura
2. Mtodos
Analticos
(admitindo ligeiros desvios em relao situao ideal).

PREPARAO DAS AMOSTRAS
So necessrios, no mnimo, 3 pontos de medida. Podem ser
efectuadas determinaes suplementares, nomeadamente Desgaseificao
nos casos em que se observa no linearidade quando o Antes de determinar a superfcie especfica de uma amostra,
valor P/P0 est prximo de 0,3. Como a curva muitas necessrio eliminar todos os gases e vapores que possam ter
vezes no linear para valores de P/P0 inferiores a 0,05, sido adsorvidos fisicamente sua superfcie aps a produo
desaconselhado proceder a determinaes nesta zona de e durante o tratamento, a manuteno e a conservao.
valores. O teste de linearidade, o modo de tratamento dos indispensvel realizar esta desgaseificao para no obter
dados e o mtodo de clculo da superfcie especfica da valores de superfcie especfica inferiores aos reais, ou
amostra so descritos mais atrs. variveis, apenas porque uma zona intermdia da superfcie
se encontra coberta por molculas de gases ou vapores
DETERMINAO COM UM NICO PONTO previamente adsorvidos. No caso dos produtos farmacuticos,
as condies de desgaseificao constituem um factor crtico
Quer a medio seja efectuada em fluxo dinmico (Mtodo I) para a obteno de resultados que apresentem a preciso
ou por volumetria (Mtodo II), para determinar a superfcie e a exactido requeridas, devido elevada sensibilidade da
especfica por adsoro gasosa em regra necessrio superfcie destes produtos.
efectuar, pelo menos, 3 medies de Va, correspondendo
cada uma a um valor diferente de P/Po. Contudo, e em Condies de desgaseificao. Demonstra-se que as condies
certas condies indicadas abaixo, aceitvel determinar a de desgaseificao aplicadas permitem obter traados BET
superfcie especfica de um p a partir de um s valor de Va reprodutveis, uma massa constante da amostra e que no
medido num nico ponto P/Po, por exemplo 0,300 (valor originam qualquer modificao fsica ou qumica do p.
correspondente a 0,300 mole de azoto ou 0,001038 mole
As condies de desgaseificao, definidas pela presso, pela
de crpton). Neste caso, utiliza-se a equao seguinte para
temperatura e pelo tempo, so escolhidas de modo a garantir,
calcular Vm:
tanto quanto possvel, a manuteno do estado inicial da
superfcie. A desgaseificao de numerosas substncias
muitas vezes realizada aplicando vazio parcial ou purgando a
amostra numa corrente de um gs inerte seco ou aplicando
um mtodo de ciclos de desadsoro/adsoro. Em todos
A equao (2) permite calcular a superfcie especfica a partir os casos se recorre, por vezes, temperatura elevada para
do valor de Vm assim obtido. acelerar a eliminao dos contaminantes. A desgaseificao
por aquecimento da amostra do p pode, no entanto, afectar a
O mtodo com um nico ponto pode ser utilizado natureza da superfcie, sendo por isso evitada, salvo indicao
directamente para uma srie de amostras de p de um em contrrio.
produto cuja constante C seja muito superior unidade.
Pode verificar-se que esta condio satisfeita comparando Se se proceder por aquecimento, utiliza-se uma temperatura
os valores da superfcie especfica obtidos, para uma srie e um tempo de desgaseificao to baixos quanto possvel a
de amostras do p, pelo mtodo com um nico ponto e pelo fim de poder medir, de modo reprodutvel, os elevados valores
mtodo com vrios pontos. A obteno de valores prximos da superfcie especfica num intervalo de tempo aceitvel.
pelos dois mtodos indica que 1/C tende para zero. Para desgaseificar amostras sensveis recomenda-se a
O mtodo com um nico ponto pode tambm ser utilizado utilizao de outros mtodos como, por exemplo, o dos ciclos
indirectamente para uma srie de amostras de p muito de desadoro-adsoro.
semelhantes de um produto cuja constante C no seja
infinita, mas que possa ser considerada invarivel. Nestas Gs de medida
condies possvel reduzir, ou at eliminar, o erro
inerente utilizao do mtodo com um nico ponto se se O procedimento normal a adsoro do azoto de qualidade
usar o mtodo com vrios pontos para calcular o valor de C analtica temperatura de liquefaco do azoto.
de uma das amostras da srie a partir da representao da
funo BET, pois possvel determinar C pela frmula Para os ps com baixa superfcie especfica (<0,2 m2.g1). a
(1 inclinao/intercepo na origem). Calcula-se ento o proporo de gs adsorvido baixa. Nestes casos, prefervel
valor a partir do nico valor de Va medido (para uma nica utilizar o crpton temperatura de liquefaco do azoto,
presso relativa P/Po) usando a seguinte equao: pois a baixa presso de vapor exercida por este gs reduz
consideravelmente o erro.
Quando tal possvel, a utilizao de amostras maiores
(correpondendo a uma superfcie total de 1 m2 ou mais,
quando o azoto utilizado) pode compensar os erros das
determinaes em que se medem superfcies reduzidas.
A superfcie especfica calculada a partir de Vm aplicando a
equao (2) Todos os gases utilizados esto isentos de humidade.

Tomada de ensaio Modo operatrio

Pese exactamente uma quantidade da amostra cuja superfcie Faa passar uma mistura de gases (em geral, azoto e hlio)
total seja, pelo menos, 1 m2, quando o gs de medida o de composio conhecida numa clula de condutividade
azoto, e 0,5 m2, se se tratar do crpton. trmica, em seguida na amostra e novamente na clula de
condutividade trmica, que envia o sinal a um potencimetro
Quantidades mais pequenas de amostra podem ser utilizadas
aps validao apropriada. registador.
2. Mtodos
Analticos
Mergule a clula que contm a amostra em azoto lquido.
Verifica-se a adsoro do azoto gasoso contido na fase mvel,
MEDIO o que origina um desequilbrio na clula de condutividade
trmica, que envia ento um sinal ao registador.
A quantidade de gs adsorvido, a uma determinada presso,
tende a aumentar quando a temperatura diminui, pelo que Retire a amostra do refrigerador. Aparece um pico de
a medio da adsoro geralmente efectuada a baixas dessoro, de superfcie igual e de sentido oposto aos do pico
temperaturas. A temperatura padro 77,4 K, que o ponto de adsoro. Se este pico de dessoro for melhor definido
de ebulio do azoto lquido. do que o pico de adsoro, a partir dele que se efectua a
determinao.
Mtodo 1: medio em fluxo dinmico Para efectuar a calibrao, injecte no sistema uma quantidade
Princpio de gs de medida suficiente para originar um pico com
amplitude igual do pico de dessoro e determine a
Para as determinaes em fluxo dinmico (ver figura 1), o proporo do volume de gs por unidade de superfcie do
gs de medida recomendado o azoto ou o crpton seco, pico.
utilizando-se hlio como gs diluente por no ser adsorvido
nas condies prescritas. Para as determinaes com um nico ponto utilize uma
mistura de azoto e hlio. Para as determinaes com vrios
necessrio utilizar, pelo menos, 3 misturas de hlio e de
pontos utilize vrias misturas deste tipo, ou proceda por
gs de medida diferentes, de modo a abranger o intervalo de
pr-mistura dos dois gases.
valores P/Po, compreendidos entre 0,05 e 0,30.
O fundamento do clculo essencialmente idntico ao da
O detector-integrador emite um sinal proporcional ao volume
medio volumtrica.
de gs que o atravessa, nas condies definidas de presso e
temperatura. Existem diferentes tipos de instrumentos que
podem ser utilizados para este efeito como, por exemplo, Processo II: medio volumtrica
os detectores de condutividade trmica com integrador Princpio
electrnico. necessrio efectuar, pelo menos, 3 medies
correspondentes a valores de P/Po, includos no intervalo Nas medies volumtricas (ver figura 2) o gs de medida
recomendado (0,05-0,30). recomendado o azoto que introduzido no espao vazio
FIGURA 1 Representao esquemtica do aparelho de medio em fluxo dinmico

2.9.27. Uniformidade de massa da dose dispensada pelos recipientes multidose

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 2 Representao esquemtica do aparelho de medio volumtrica
situado acima da amostra previamente desgaseificada de Mergulhe a clula da amostra at um ponto definido, num
modo a originar uma presso no equilbrio definida, P. Assim, vaso de Dewar contendo o azoto lquido a 77,4 K. Introduza
no necessrio utilizar um gs diluente, como o hlio, mas no sistema um volume de gs de medida suficiente para
pode utilizar-se este gs com outras finalidades como, por obter a presso relativa mais baixa desejada e determine
exemplo, para medir o volume vazio. o volume adsorvido Va. No caso das determinaes com
vrios pontos, repita a determinao de Va para valores
Como se utiliza o gs de medida puro, e no em misturas, de P/P0 crescentes. Quando o gs de medida utilizado o
evitam-se as interferncias resultantes da difuso trmica. azoto, valores de P/P0 de 0,10, 0,20 e 0,30 so muitas vezes
apropriados.
Modo operatrio
Introduza uma pequena quantidade de azoto seco no tubo PADRES
da amostra, de modo a evitar a contaminao das superfcies
limpas, retire em seguida o tubo da amostra, feche-o e pese-o. Verifique periodicamente o bom funcionamento do aparelho
Calcule a massa da tomada de ensaio. Fixe o tubo da amostra utilizando padres apropriados com superfcie especfica
ao aparelho de medio volumtrica. Com precauo, aplique conhecida, como a -alumina, e que apresentem superfcie
vazio no tubo at obter uma presso definida (por exemplo, comparvel da amostra
entre 2 Pa e 10 Pa).
Certas aparelhagens podem igualmente produzir o vazio
segundo uma variao de presso definida, em funo do 2.9.27. UNIFORMIDADE DE MASSA
tempo (por exemplo, menos de 13 Pa/30 s) e manter a presso DA DOSE DISPENSADA PELOS
durante um tempo definido antes de passar etapa seguinte. RECIPIENTES MULTIDOSE
Se o princpio de funcionamento do aparelho requer a
determinao do volume vazio no tubo da amostra, por O ensaio seguinte destinado s formas farmacuticas
exemplo por introduo de um gs no adsorvido como o orais, tais como os granulados, os ps orais e as
hlio, efectue, ento, esta determinao e depois expulse preparaes lquidas orais, que so acondicionadas em
o gs. A determinao do volume vazio pode ser evitada recipientes multidose munidos de um dispositivo doseador
efectuando determinaes diferenciais, isto , utilizando integrado.
um tubo de amostra e um tubo testemunha unidos por Pese separadamente 20 doses, tomadas ao acaso em
meio de um transdutor diferencial. Proceda de seguida um ou em vrios frascos com a ajuda do dispositivo
determinao da adsoro do azoto gasoso como descrito. doseador integrado, e determine a massa individual e

2.9.29. Dissoluo intrnseca
a massa mdia. Duas massas individuais, no mximo, seno quando apresentar um valor de dissoluo de 50 por
podem desviar-se da massa mdia mais de 10 por cento e cento a 75 por cento.
nenhuma pode desviar-se mais de 20 por cento.
A parte superior da matriz tem um ombro estriado que
permite fix-la a um suporte. A este suporte liga-se um
agitador e o conjunto da matriz com o compacto imerso no
2.9.29. DISSOLUO INTRNSECA meio de dissoluo e submetido a agitao.
2. Mtodos
Analticos
O ensaio destinado a determinar a velocidade intrnseca de
dissoluo de substncias slidas puras aps compactao. MTODO
realizado em condies experimentais especficas,
permitindo obter uma determinao prtica da velocidade Pese a amostra em papel apropriado. Fixe a placa metlica
intrnseca de dissoluo. polida na parte inferior da matriz por intermdio de 3
parafusos. Transfira a amostra para a cavidade da matriz.
A velocidade intrnseca de dissoluo um valor terico Introduza o puno na cavidade e fixe a placa de metal no
referido a substncias slidas puras de porosidade nula; topo. Compacte o p com uma prensa hidrulica aplicando
mas na prtica a velocidade intrnseca de dissoluo uma presso apropriada durante um perodo de tempo
determinada em substncias de porosidade mnima. suficiente para garantir uma porosidade mnima; necessrio
evitar tanto quanto possvel a desagregao do compacto,
uma vez que poder causar um aumento da rea exposta e da
PRINCPIO velocidade de dissoluo. Desmonte a placa metlica polida
e aparafuse a matriz com o puno ao suporte. Limpe a
A velocidade intrnseca de dissoluo definida como superfcie da matriz com uma corrente de ar comprimido ou
a velocidade de dissoluo de substncias puras aps de azoto para eliminar os resduos de p livre.
compactao, nas condies de rea constante. A sua
avaliao til para a caracterizao de substncias activas e Fixe o conjunto matriz-suporte no aparelho de dissoluo
de excipientes. com a ajuda do dispositivo de aperto. Posicione o eixo com
uma agulha de rosca de tal modo que a posio do conjunto
A velocidade da dissoluo de uma substncia pura pode aps descida tenha a rea exposta do compacto colocada a
ser afectada por todas as propriedades do estado slido tais 3,8 cm do fundo do recipiente.
como o sistema cristalino, a cristalinidade, o amorfismo,
o polimorfismo, o pseudo-polimorfismo, o tamanho das Proceda ao alinhamento de modo a reduzir a agitao ao
partculas e a superfcie especfica. Pode igualmente ser mnimo e evite as bolhas que contribuem para reduzir a
influenciada por factores extrnsecos (condies de ensaio) superfcie da amostra em contacto com o meio de dissoluo.
tais como as condies hidrodinmicas ou a temperatura, a Tanto quanto possvel, as condies de imerso devem
viscosidade, o pH, o poder tampo e a fora inica do meio de ser mantidas durante o ensaio. Entretanto, para obter
dissoluo. concentraes detectveis em soluo, pode ser necessrio
utilizar um volume de meio de dissoluo relativamente
A avaliao da velocidade intrnseca de dissoluo de uma
baixo, por motivo da pequena rea exposta ao meio de
substncia slida implica a preparao por compactao.
dissoluo.
necessrio assegurar que o p a analisar apresente proprie-
dades de compactao apropriadas. Aquea o meio de dissoluo temperatura escolhida para o
A velocidade intrnseca de dissoluo determinada em ensaio. Faa baixar o conjunto matriz-suporte at posio
condies de imerso por exposio de uma rea constante da de ensaio antes de o submeter a rotao. Procure evitar a
substncia compactada a um meio de dissoluo apropriado; formao das bolhas de ar superfcie do compacto, pois
a velocidade de agitao, a temperatura, a fora inica do causariam a reduo da rea de contacto com o meio de
meio e o pH so mantidos constantes. dissoluo. Ligue imediatamente o aparelho com a velocidade
de agitao escolhida para o ensaio.
A velocidade intrnseca de dissoluo expressa em termos
de massa de substncia dissolvida por unidade de tempo e por Recolha as amostras em intervalos de tempo fixados
unidade de superfcie exposta, geralmente em miligramas por e proceda ao doseamento por um mtodo analtico de
minuto e por centmetro quadrado (mg. min-1.cm-2). sensibilidade e exactido apropriadas.
APARELHAGEM AVALIAO DOS RESULTADOS
O aparelho tipo constitudo por um puno e uma matriz conveniente corrigir os resultados obtidos (quantidade
em ao temperado. A base da matriz comporta 3 parafusos acumulada dissolvida em cada tempo de colheita) tendo em
que permitem a fixao de uma placa plana em ao polido, conta as perdas das amostras. Para calcular a velocidade
que fornece ao compacto uma superfcie de apoio to intrnseca de dissoluo, construa um grfico da quantidade
lisa como um espelho. A matriz possui uma cavidade acumulada de substncia dissolvida por unidade de superfcie
com um dimetro de 0,1 cm a 1,0 cm na qual colocada de p compactado, em funo do tempo. A quantidade
uma determinada quantidade da amostra. O puno dissolvida acumulada por unidade de superfcie obtida
introduzido na cavidade e compacta o p geralmente dividindo a quantidade dissolvida acumulada em cada tempo
por aco de uma prensa hidrulica de laboratrio. Uma de colheita pela rea exposta. Aplique a regresso linear aos
abertura na cabea do puno permite a insero de um resultados experimentais tendo em considerao um intervalo
parafuso para facilitar a remoo no final do ensaio. de tempo que antecede a eventual desagregao do compacto.
Forma-se na cavidade um compacto com uma s face de A velocidade intrnseca de dissoluo da amostra, expressa em
rea definida na base da matriz (Figura 1). A base da matriz miligramas por minuto e por centmetro quadrado, dada pela
tem uma abertura dimensionada para o compacto no cair inclinao da recta de regresso. As condies exactas de

2.9.31. Determinao do tamanho das partculas por difraco dos raios laser
2. Mtodos
Analticos
A. Placa C. Junta de neopreno E. Conjunto suporte-eixo
B. Matriz D. Puno F. Face inferior da matriz
FIGURA 1 Aparelho tipo para a determinao da dissoluo intrnseca

preparao do compacto e a realizao do ensaio (meio de INTRODUO

dissoluo, volume do meio utilizado, velocidade de agitao,
temperatura, etc.) devem ser especificadas com o valor obtido A tcnica de difraco dos raios laser usada para determinar
para a velocidade intrnseca de dissoluo. a distribuio do tamanho de partculas tem por base a
Em certos casos justificados, admissvel a utilizao de anlise do perfil de difraco obtido quando as partculas
um aparelho de configurao diferente, por exemplo onde o so expostas a um feixe de luz monocromtica. Os primeiros
suporte da matriz mantm o compacto em posio vertical instrumentos de difractometria laser usavam exclusivamente
fixa, ficando a agitao assegurada por uma placa colocada a a difuso luminosa em pequenos ngulos. A tcnica foi
uma distncia definida da superfcie do compacto. alargada de modo que, actualmente, a difuso luminosa se
estende a ngulos maiores com aplicao da teoria de Mie
juntamente com a aproximao de Fraunhofer e da difraco
anmala.
2.9.31. DETERMINAO DO TAMANHO
DAS PARTCULAS POR DIFRACO A difractometria laser no permite distinguir a difuso devida
s partculas elementares da difuso resultante da acumula-
DOS RAIOS LASER o de partculas primrias (aglomerados ou agregados).
Como a maior parte das amostras contm aglomerados ou
O mtodo descrito baseado nas normas ISO 13320-1(1999) agregados e o objectivo da avaliao a distribuio das
e 9276-1(1998). dimenses das partculas primrias, geralmente procede-se

disperso dos aglomerados para obter as partculas primrias que permite determinar o perfil de difraco. tambm
antes da determinao. necessrio um sistema de tratamento de dados para a
converso, por inverso, dos dados de difuso em distribuio
Para as partculas no esfricas, obtida uma distribuio
granulomtrica em volume, e para as operaes associadas da
equivalente grandeza da esfera porque a tcnica assume
anlise de dados e apresentao dos resultados.
partculas esfricas no modelo ptico. O resultado da
distribuio pode diferir do obtido por mtodos baseados Existem 2 possibilidades para a passagem das partculas
2. Mtodos
em outros princpios fsicos (por exemplo, sedimentao,
Analticos
no feixe laser. Na geometria convencional, as partculas
tamisao, etc.). encontram o feixe paralelo antes da lente colectora. Na
geometria chamada ptica de Fourier invertida, a exposio
Este captulo constitui um guia para a anlise da
efectuada depois da lente colectora, num feixe convergente.
distribuio granulomtrica das partculas de diferentes
A vantagem da geometria convencional proporcionar
sistemas dispersos, (por exemplo, ps, pulverizaes,
amostra um comprimento razovel de percurso ptico
aerossoles, suspenses, emulses e espumas) atravs dos
at lente. O segundo dispositivo somente para um
valores dos ngulos da disperso luminosa. No tem como
comprimento ptico pequeno, mas permite a determinao
objectivo definir as exigncias especficas com aplicao a
da luz difusa em grandes ngulos, o que til para dimenses
determinados produtos.
submicroscpicas.
A interaco do feixe incidente e das partculas dispersas
PRINCPIO produz um perfil de difuso onde as intensidades luminosas
variam segundo determinados ngulos. A distribuio
Uma amostra representativa, dispersa em concentrao angular total da intensidade, para a qual contribuem a luz
adequada num lquido ou num gs apropriado, atravessada directa e a luz difusa focada sobre um multidetector por
por um feixe de luz monocromtica, geralmente laser. uma lente ou uma srie de lentes. As lentes produzem um
A luz difundida pelas partculas em diferentes ngulos perfil de difuso que , dentro de certos limites, independente
determinada por meio de um multidetector e os da localizao das partculas no feixe luminoso. A distribuio
dados numricos representando o perfil de difuso so angular contnua de intensidade convertida por uma srie
registados para a anlise. Esses dados de difuso so ento de elementos detectores numa distribuio espacial de baixa
transformados por intermdio de um modelo ptico e de intensidade.
um algoritmo matemtico apropriados, obtendo-se uma
partilha do volume total num pequeno nmero de classes Uma das hipteses do clculo que o perfil de difuso
de dimenses, isto , uma distribuio granulomtrica em determinado para o conjunto das partculas o somatrio das
volume. imagens individuais das partculas dispersas presentes nas
posies relativas aleatrias. Note-se que somente uma parte
angular limitada da luz difusa colectada pela(s) lente(s) e
APARELHACEM pelo detector.
A fig. 1 representa um exemplo de um dispositivo instrumen-

DESENVOLVIMENTO DO MTODO
tal para difractometria laser. Podem ser usados outros
equipamentos.
A determinao do tamanho das partculas por difraco
O aparelho compreende uma fonte luminosa laser, laser era reservada para as partculas de dimenso
constituintes pticos de tratamento do feixe, uma janela (ou compreendida entre cerca de 0,1 mm e 3 mm. Hoje, dado o
clula) de medida, uma lente de Fourier e um multidetector progresso na concepo de lentes e de equipamentos, certos
1. Detector de obturao 5. Luz difundida no captada pela lente (4) 9. Distncia de trabalho da lente (4)
2. Feixe difundido 6. Partculas 10. Multidetector
3. Feixe directo 7. Origem laser 11.Distncia local da lente (4)
4. Lente de Fourier 8. ptica de tratamento do feixe
FIGURA 1 Exemplo do dispositivo instrumental para difractometria laser

aparelhos so capazes de trabalhar por rotina com grande serem compatveis com os materiais constituintes do
diversidade. Cumpre ao utilizador demonstrar a aplicao do aparelho (juntas, anilhas, tubos, etc.),
mtodo, indirectamente, pelo relatrio da validao.
possuir uma viscosidade apropriada facilitando a
recirculao, a agitao e a filtrao.
Amostragem. A tcnica de amostragem escolhida deve
permitir obter uma amostra representativa de volume Os agentes tensioactivos e/ou dispersantes so usados muitas
adaptado s determinaes granulomtricas. vezes para molhar as partculas e estabilizar a disperso.
2. Mtodos
Analticos
Para os cidos e bases fracas, so usados tampes no meio

de disperso de pH baixo ou elevado, respectivamente, para
Avaliao do mtodo de disperso. O mtodo de disperso
ajudar identificao do agente dispersante apropriado.
usado deve ser adaptado ao objectivo da determinao:
segundo o caso, prefervel fraccionar, tanto quanto possvel, Uma verificao preliminar da qualidade da disperso
os agregados em partculas primrias ou, ao contrrio, realizada por exame visual ou microscpico. Tambm
conservar a sua integridade. Assim, as partculas a considerar possvel efectuar tomadas de ensaio fraccionadas de uma
podem ser partculas primrias ou acumuladas. disperso-me bem homogeneizada, preparando a amostra
por adio de lquido e misturando com ajuda de barra
No desenvolvimento do mtodo recomendado ter
a certeza de que no h cominuio de partculas e, de vidro, esptula ou vrtex, por exemplo. necessrio
inversamente, de que a disperso das partculas ou agregados assegurar a transferncia representativa da amostra para
satisfatria. Pode verificar-se alterando a energia de evitar a deposio das partculas maiores.
disperso e observando a alterao resultante da distribuio
granulomtrica. Esta no deve variar significativamente se Optimizao da disperso gasosa. Para as disperses de
a amostra est dispersa convenientemente e se as partculas ps secos e de pulverizaes, usado um gs comprimido
no so frgeis nem solveis. As partculas podem tambm isento de leo, de gua e de partculas. A eliminao destes
ser observadas ao microscpio. conveniente confirmar contaminantes efectuada por meio de um exsicador munido
a aplicabilidade do mtodo (por exemplo, por comparao de filtro. Em tal circunstncia, a unidade de vazio deve ser
ao microscpio) aps qualquer alterao do processo de colocada longe da zona de trabalho para no perturbar a
produo (cristalizao, triturao, etc.). determinao.
Nos casos de pulverizaes, aerossoles e espumas, a
determinao efectuada directamente, na condio da Determinao das concentraes de trabalho. A concentrao
concentrao ser a adequada, visto que a amostragem e a da disperso deve ser superior a um valor mnimo, de modo
diluio alteram geralmente a distribuio granulomtrica. que a relao sinal/rudo no detector seja aceitvel e no
Nos outros casos, (emulses, pastas, ps, etc.), as amostras deva ultrapassar um valor mximo, para evitar mltiplas
representativas podem ser dispersas em lquidos apropriados. difuses. A zona ptima de concentrao condicionada pela
Por vezes, recorre-se a agentes dispersantes (molhantes, largura do feixe laser, pelo comprimento do percurso ptico
estabilizantes) e/ou a foras mecnicas (agitao, ultra-sons) na janela, pelas propriedades pticas das partculas e pela
para desaglomerar ou desagregar os acumulados e estabilizar sensibilidade dos elementos do detector.
a disperso. habitual, para certas disperses lquidas, usar conveniente efectuar determinaes a diferentes
um sistema de recirculao constitudo por uma clula ptica concentraes para determinar a zona de concentrao
de medida, um banho de disperso geralmente equipado com ptima para qualquer tipo de amostra de dado material.
agitador e um gerador de ultra-sons, uma bomba e tubos. (Nota: para dadas concentraes, os diversos aparelhos
til o uso de clulas com agitao, sem recirculao quando existentes usam escalas e diferentes grandezas tais como a
as tomadas de ensaio so reduzidas ou quando se recorre a obscuridade, a concentrao ptica, a proporo em massa
lquidos especiais para disperso. em relao massa total, etc.).
Os ps secos podem ser convertidos em aerossoles por meio
de dispersores de ps secos apropriados, que promovem Seleco do modelo ptico. A maior parte dos aparelhos
uma desaglomerao ou desagregao por foras mecnicas. recorrem quer teoria de Fraunhofer, quer teoria de
Estes dispersores usam geralmente a energia de um gs Mie, e a outras teorias de aproximao por vezes aplicadas
comprimido ou a presso diferencial relativamente ao vazio para o clculo da matriz de difuso. A escolha do modelo
para dispersar as partculas e convert-las num aerossole terico depender da aplicao e das hipteses postas
que varrido atravs da janela de medida, geralmente partida quanto s caractersticas do material a analisar
pela entrada de um tubo de vazio onde so colectadas as (dimenso, absorvncia, ndice de refraco, rugosidade,
partculas. orientao cristalina, mistura, etc.). Se os valores do ndice
de refraco (parte real e imaginria do comprimento de
Optimizao da disperso lquida. Os lquidos e os agentes onda usado) no so conhecidos, recorre-se aproximao de
tensioactivos ou dispersantes usados para a disperso dos ps Fraunhofer ou teoria de Mie como uma estimativa realista
devem: do ndice de refraco. A primeira aproximao apresenta
a vantagem de ser simples, no so necessrios os valores
ser transparentes no comprimento de onda laser usado e
do ndice de refraco e muito til para a anlise de ps
praticamente isentos de bolhas de ar ou de partculas,
de granulometria superior a cerca de 1-2 m; a segunda
possuir um ndice de refraco diferente do material em aproximao proporciona menor desvio na distribuio
anlise, granulomtrica das partculas mais pequenas. Para a
obteno da traabilidade dos resultados, indispensvel
no promover a dissoluo do material em anlise (por
considerar os valores dos ndices de refraco usados, porque
exemplo, por solubilizao, facilitar a solubilizao ou a
pequenas diferenas nos valores estimados para a parte real
recristalizao),
e imaginria do ndice de refraco podem originar desvios
favorecer a disperso e a estabilidade, significativos nos resultados da distribuio granulomtrica.

Por vezes so atribudos valores baixos (cerca de 0,01i-0,1i) Converso do perfil de difuso em distribuio
parte imaginria do ndice de refraco, para permitir granulomtrica. Esta etapa de desconverso a recproca
a correco da absorvncia em funo da rugosidade da do clculo de um perfil de difuso a partir de uma dada
superfcie das partculas. distribuio granulomtrica. A hiptese de esfericidade das
partculas tem aqui um papel particularmente importante,
Repetibilidade. A repetibilidade possvel com o mtodo pois a maioria dos algoritmos usam a soluo matemtica
considerado depende principalmente das caractersticas do que corresponde difuso das partculas esfricas. Por outro
2. Mtodos
Analticos
material (modo ou no, robusto ou frgil, com distribuio lado, os valores das determinaes contm sempre um certo
de tamanho mais ou menos alargada, etc.), enquanto que a nmero de erros aleatrios e sistemticos que podem falsear
repetibilidade exigida funo do objectivo da determinao. os resultados da distribuio granulomtrica. Tm sido
impossvel especificar aqui os limites de aplicao desenvolvidos vrios processos matemticos para o uso dos
obrigatria, pois a repetibilidade (preparao individual das aparelhos existentes. Comportam sistemas de ponderao
amostras) pode variar ligeiramente de uma substncia para dos desvios entre os perfis de difuso determinados e os
outra. Contudo, uma boa prtica para a repetibilidade calculados (mnimos quadrados, por exemplo), algumas
aceitar como critrios srel 10 por cento [n = 6] para um constries (no negatividade de quantidades de partculas, por
valor central da distribuio (por exemplo x50), todavia os exemplo) e/ou mtodos de linearidade da curva da distribuio
valores dos extremos da distribuio (por exemplo x10 e x90) granulomtrica. Os algoritmos usados so especficos de cada
so submetidos a critrios de aceitao mais restritos tais tipo e modelo de aparelho e so registados. O uso dos mesmos
como srel 15 por cento [n = 6]. Abaixo de 10 m, os valores algoritmos com aparelhos diferentes origina diferenas no
so multiplicados por 2. clculo granulomtrico estatstico.
DETERMINAO Repeties. recomendado definir caso a caso, para cada

mtodo especfico aplicado a uma substncia, o nmero
Precaues. importante seguir as instrues do manual de de repeties (com preparao individual) a efectuar por
utilizao do aparelho: amostra.
nunca olhar para o feixe laser directo ou reflectido,

APRESENTAO DOS RESULTADOS
ligar com fio de terra todos os constituintes do aparelho,
dado o risco de inflamao dos solventes ou exploso de
Os dados da anlise granulomtrica so geralmente expressos
impurezas,
na forma de distribuio acumulada e/ou de distribuio de
verificar as normas do aparelho (aquecimento, amplitude densidade por volume. O smbolo x representa a dimenso
de determinao e requisitos das lentes, distncia das partculas, definida como o dimetro da esfera de volume
apropriada ao trabalho, posio do detector, ausncia de equivalente. Q3 (x) representa a fraco em volume das
iluminao intensa directa, etc.), partculas de dimenso inferior a x. Graficamente, a abcissa
nos casos de disperses em lquidos, evitar a formao representa a varivel x e a ordenada a varivel dependente
de bolhas de ar, a evaporao de lquido, a existncia de Q3. Os valores usuais caractersticos so geralmente
descontinuidades de densidade ou qualquer fonte de no calculados por interpolao a partir da curva de distribuio
homogeneidade da disperso. Nos casos de disperses granulomtrica. Entre os valores frequentemente usados
secas, evitar qualquer perturbao das condies de fluxo figuram as dimenses correspondentes s fraces
da massa constante sada do dispersor ou efeitos de acumuladas de 10 por cento, 50 por cento e 90 por cento,
turbulncia. Tais efeitos podem originar a obteno de respectivamente designadas x10, x50 e x90. O valor x50
distribuies granulomtricas erradas. chamado tamanho mdio. O smbolo d tambm muito
usado para designar a dimenso das partculas e pode
Determinao da difuso da(s) amostra(s) dispersa(s). Aps substituir o smbolo x.
alinhamento dos componentes pticos do aparelho, convm Por outro lado, conveniente reunir e registar todas
efectuar um ensaio em branco do meio de disperso isento as informaes teis no que respeita amostra, sua
de partculas. O sinal de fundo obtido deve ser inferior a um preparao, as condies de disperso e o tipo de clula
limite apropriado. usado. Como os resultados dependem do aparelho usado,
Regra geral, o tempo de determinao usado permite um do programa da anlise de dados associado e do modelo
grande nmero de varrimentos do detector com curtos ptico, so aspectos que devem tambm ser descritos na
intervalos de tempo. calculado um sinal mdio para cada documentao.
elemento do detector, por vezes associado ao desvio padro.
A amplitude do sinal fornecido por cada elemento depende
CONTROLO DO FUNCIONAMENTO DA APARELHO
da superfcie de deteco, da intensidade luminosa e da
eficcia quntica. As coordenadas (dimenso e posio)
dos elementos do detector com a distncia focal da lente, Use o aparelho seguindo as instrues do fabricante e efectue
determinam a gama dos ngulos de difuso correspondente os controlos prescritos com uma periodicidade apropriada,
a cada elemento. A maioria dos aparelhos mede tambm a segundo o uso do aparelho e as substncias a analisar.
intensidade do feixe laser central (no difundido). A razo
entre as intensidades obtidas, respectivamente, em presena Calibrao. Os sistemas de difraco laser usam as
da amostra dispersa e na sua ausncia (ensaio em branco) propriedades ideais das partculas e tm como fundamento
indica a proporo de luz difundida e ainda a concentrao de os primeiros princpios da difuso da luz laser. Em sentido
partculas. restrito, a calibrao no necessria. Contudo, necessrio

2.9.33. Caracterizao dos slidos cristalinos e parcialmente cristalinos por difraco dos raios-X em ps
confirmar se o aparelho funciona correctamente. Tal pode ser e procedimento de desconverso. essencial que a totalidade
conseguido por intermdio de qualquer padro ou material do processo de operaes seja completamente descrito.
de referncia certificado aceite na prtica industrial.
Regra geral, salvo indicao em contrrio na monografia
O procedimento efectuado desde as operaes de recolha,
individual, a resposta de um aparelho de difractometria laser
disperso e transporte das amostras para o interior da zona
de medida, determinao e procedimento de desconverso. considerada conforme s exigncias, se o valor mdio x50
2. Mtodos
no se desvia mais de 10 por cento do intervalo de valores

Analticos
essencial que o procedimento operatrio seja descrito com

detalhe. certificado para o material de referncia usado (mdia e
desvio padro associado). Se os valores nos extremos da
recomendado empregar padres ou materiais de referncia distribuio (por exemplo x10 e x90) so tambm avaliados, o
certificados, constitudos por partculas esfricas de desvio mximo admitido em relao ao intervalo de valores
distribuio granulomtrica conhecida cobrindo uma dada certificado de 5 por cento. Abaixo de 10 m, os valores
ordem de grandeza. Devem ser padronizadas em termos de devem multiplicar-se por 2.
distribuio granulomtrica em percentagem de massa por
uma tcnica absoluta, se possvel, e usadas segundo um modo
operatrio detalhado e aprovado. Se a teoria de Mie usada
2.9.33. CARACTERIZAO DOS
para anlise de dados, essencial indicar precisamente as
partes real e imaginria do ndice de refraco complexo do SLIDOS CRISTALINOS E
material. A representao da distribuio granulomtrica em PARCIALMENTE CRISTALINOS POR
volume ser equivalente da distribuio em massa, com a
condio da massa volmica das partculas ser a mesma para DIFRACO DOS RAIOS-X EM PS
todas as fraces granulomtricas.
Cada fase cristalina presente numa dada substncia produz
A resposta da aparelhagem de difractometria laser uma imagem de difraco dos raios-X caracterstica.
considerada como sendo conforme s exigncias se o valor Tais imagens chamadas difractogramas (ou diagramas ou
mdio x50 obtido a partir de, pelo menos, 3 determinaes espectros de difraco), so obtidos a partir de ps cristalinos
independentes no se afasta mais do que 3 por cento do apresentando uma orientao aleatria, compostos de
intervalo de valores certificados para o padro ou material
cristalitos ou fragmentos cristalinos de determinada
de referncia usado (mdia e desvio padro respectivo). Para
dimenso. O difractograma de um p fornece essencialmente
os valores mdios de x10 e x90, o desvio mximo admitido em
3 tipos de informaes: a posio angular das riscas de
relao ao intervalo de valores certificado de 5 por cento.
Abaixo de 10 m, os valores devem multiplicar-se por 2. difraco, que funo da geometria e dimenso da malha
cristalina; a intensidade das riscas de difraco, que depende
prefervel o uso de materiais constitudos por partculas principalmente da natureza e do arranjo dos tomos e da
esfricas, mas igualmente admitido o uso de partculas no orientao das partculas na amostra; e a forma do traado
esfricas. tambm desejvel que essas partculas sejam de difraco, que funo da resoluo instrumental, da
caracterizadas por valores tipos ou certificados obtidos por dimenso dos cristalitos, das foras de tenso e da espessura
difractometria laser segundo um modo operatrio detalhado da amostra.
e aprovado. O uso dos valores de referncia obtidos por
mtodos diferentes do da difraco laser podem introduzir O estudo da posio angular e da intensidade das riscas de
desvios significativos, pois os princpios inerentes a estes difraco tem aplicao na anlise qualitativa das fases (por
mtodos podem conduzir obteno de dimetros diferentes, exemplo, a identificao das fases cristalinas) e na anlise
em esferas equivalentes, para as mesmas partculas no quantitativa das fases de um material cristalino. Pode
esfricas. igualmente ser efectuada uma estimativa das fraces amorfa
Com os outros materiais de referncia certificados, e e cristalina(1).
mencionados acima, tambm possvel usar amostras de Alm disso, a anlise do alargamento do traado pode
composio e de distribuio granulomtrica representativas permitir determinar a dimenso dos cristalitos (domnios de
de uma classe especfica de produtos, na condio de disperso coerente) e de microtenses.
ser provado que a sua distribuio granulomtrica se
mantm estvel. Neste caso, os resultados obtidos devem A difraco dos raios-X em ps tem vantagem sobre outros
ser conformes aos dados pr-determinados, com a mesma mtodos de anlise por ser geralmente no destrutiva
fidelidade e o mesmo desvio do material de referncia (a preparao de amostras limita-se geralmente a uma
certificado. triturao destinada a assegurar uma orientao aleatria no
interior da amostra). Por outro lado, as anlises de difraco
Verificao do sistema. No decorrer da calibrao dos raios-X em ps podem ser realizadas nas condies in
conveniente verificar as funes do aparelho em intervalos situ sobre as amostras expostas s condies no ambientais,
de tempo regulares ou com a frequncia necessria. Esta por exemplo a temperaturas e teores de humidade baixos ou
verificao pode ser efectuada com a ajuda de todo o material elevados.
apropriado tal como foi definido anteriormente. A verificao
do sistema tem por base o conceito de que o equipamento, a (1) Existem outras numerosas aplicaes da difraco dos raios-X
electrnica, a aplicao informtica e as operaes de anlise em ps que dizem respeito a substncias farmacuticas com
constituem um sistema integrado que pode ser avaliado estrutura cristalina: esclarecimento e pormenorizao de estruturas
como uma entidade. A execuo integral do procedimento cristalinas, determinao da pureza cristalogrfica das fases
de determinao inclui a recolha da amostra, disperso da cristalinas, caracterizao da textura cristalogrfica, etc. Estas
amostra, o transporte para a zona de medida e a determinao aplicaes no so descritas neste captulo.

PRINCPIO A ttulo de exemplo, os registos obtidos de uma mesma

substncia em 5 fases slidas diferentes (3) so apresentados
A difraco dos raios-X resulta da interaco destes raios na figura 2.
com a nuvem electrnica dos tomos. Consoante o arranjo Para alm dos picos de difraco, na anlise por difraco
atmico, os raios-X difractados produzem interferncias. dos raios-X h um campo mais ou menos uniforme sobre
Estas interferncias so construtivas se a diferena de o qual se sobrepem os picos. Para a configurao desse
percurso entre 2 ondas X difractadas um mltiplo inteiro campo contribuem factores como a preparao e o suporte
2. Mtodos
Analticos
do comprimento de onda, condio descrita pela relao (ou da amostra, a difraco difusa devida ao ar e ao equipamento,
lei) de Bragg (figura 1): e outros parmetros instrumentais tais como o rudo do
detector, a radiao do feixe a partir do tubo dos raios-X, etc.
2dhkl sen hkl = n
possvel aumentar a relao sinal/rudo reduzindo a fonte e
operando com tempos de exposio mais longos.
O comprimento de onda do raio-X da mesma ordem de
grandeza da distncia dhkl separando os planos reticulares
APARELHAGEM
sucessivos, ou distncia inter-reticular; hkl o ngulo de
incidncia do feixe X sobre a famlia de planos reticulares
Componentes da aparelhagem. As anlises por difraco dos
e senhkl inversamente proporcional distncia inter-
raios-X so geralmente efectuadas por meio de difractmetros
-reticular. de ps ou de aparelhos com cmara fotogrfica.
A orientao e o espao dos planos em relao aos eixos das Um difractmetro de ps compreende geralmente 5 partes
malhas elementares so definidas pelos ndices de Miller principais: um gerador dos raios-X, elementos pticos
(hkl). Estes ndices so os inversos, reduzidos ao inteiro que actuam no feixe incidente (monocromatizao,
imediatamente inferior, das intercepes do plano com os filtrao, colimao, e/ou focagem, etc.), um gonimetro,
eixos da malha elementar. As dimenses da malha elementar elementos pticos que actuam sobre o feixe difractado
so dadas pelas distncias sobre os eixos a, b e c e pelos (monocromatizao, filtrao, colimao e focagem ou
ngulos , e formados por estes eixos. paralelismo, etc.) e um detector. Os sistemas de recolha e
de tratamento de dados so igualmente necessrios e nos
A distncia inter-reticular de uma dada famlia de planos aparelhos modernos j esto includos.
paralelos hkl indicada por dhkl. Cada famlia de planos
identificados apresenta ordens de difraco superiores, onde O tipo de anlise a efectuar (identificao de fases, anlise
os valores de d associados s famlias de planos nh, nk, nl quantitativa, determinao dos parmetros da malha, etc.)
condiciona a configurao instrumental e o nvel de eficcia
diminuem de um factor l/n (sendo n um inteiro: 2, 3, 4, etc.).
requerido. O instrumento mais simples que permite registar
A cada famlia de planos presente num cristal est associado, os difractogramas de ps a cmara fotogrfica. Entre os
segundo a relao de Bragg, um ngulo de difraco diferentes tipos de cmaras existentes, 3 so frequentemente
especfico hkl (para um comprimento de onda especfico). usadas: as cmaras de focagem do tipo Debye-Scherrer,
Gandolfi e Guinier. A substituio da pelcula fotogrfica pelos
Uma amostra de p suposta policristalina, de modo detectores fotnicos como meio de deteco determinou
que existe para qualquer ngulo hkl dos cristalitos cuja o desenvolvimento de difractmetros onde o arranjo da
orientao permita a difraco segundo a lei de Bragg (2). geometria dos elementos pticos no verdadeiramente a
Para um dado comprimento de onda x, as posies dos picos focagem mas uma focagem aproximada como na geometria de
de difraco (tambm chamados riscas, reflexes ou Bragg-Brentano. A montagem na focagem de Bragg-Brentano,
reflexes de Bragg) so caractersticas da arquitectura da actualmente a mais usada, descrita abreviadamente a seguir.
rede cristalina (distncias inter-reticulares), a sua intensidade Um dado instrumento pode ser usado quer em geometria /20
terica depende do contedo da malha elementar (natureza horizontal ou vertical quer em geometria /0 vertical. Nas 2
e posio dos tomos) e o perfil do traado da perfeio e da geometrias, o feixe X incidente forma um ngulo com o plano
extenso da rede cristalina. O pico de difraco apresenta, da amostra e o feixe X difractado forma um ngulo 2 com a
pois, uma intensidade definida que a resultante do arranjo direco do feixe X incidente (e um ngulo com o plano da
atmico, do tipo de tomos, dos movimentos trmicos e amostra). A montagem clssica est representada na figura 3. O
das imperfeies estruturais bem como das caractersticas feixe incidente divergente emitido pelo tubo gerador
instrumentais.
(3) Os difractogramas foram registados com um difractmetro
Os parmetros principais que caracterizam os raios de Siemens D500 (em geometria de Bragg-Brentano) sob feixe
difraco so a posio 2 , a altura, a rea e a forma dos CuK1 monocromtico puro ( = 0,1540598 nm) seleccionado por
picos (descrita, por exemplo, pela largura ou assimetria do intermdio de um monocromador em germnio encurvado com
pico, ou por uma funo analtica ou uma representao focagem assimtrica (distncia focal curta 124 mm, distncia focal
emprica). longa 216 mm). A deteco do sinal realizada por um detector
com cintilao. Para reduzir o efeito de transparncia da amostra,
(2) O p ideal para um estudo de difraco composto por um depositada uma fina camada de p sobre uma placa de silcio
grande nmero de pequenos cristalitos esfricos (domnio cristalino monocristalino orientado. O alinhamento do difractmetro
com coerente difraco) com orientao aleatria. Se o seu nmero verificado por meio de refleces 00I de mica fluoroflogopite (NIST
for suficiente, haver sempre no p cristalitos com uma orientao SRM 675). O erro do zero estimado em menos de 0,01(2). A funo
de modo a obter um difractograma reprodutvel. Para que a leitura de resoluo instrumental da montagem apresenta um mnimo de
da intensidade dos raios-X difractados seja precisa, recomendado 0,065(2 ) a cerca de 40(2) e um valor 2 vezes superior a 130(2).
que os cristalitos sejam de pequena dimenso (igual ou inferior a Para cada fase, o ditractograma registado com o mesmo limiar de
10 m), dependendo das caractersticas da amostra (absoro dos 0,02(2 ), mas com tempos de contagem fixos diferentes (forma A:30
raios-X, forma, etc.) e da geometria de difraco. s; forma B:48 s; forma C: 48 s; forma D: 40 s; fase amorfa: 10 s).

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 1 Difraco dos raios-X por um cristal de acordo com a lei de Bragg
(chamado feixe primrio) passa atravs de placas de em grande parte convertida em calor, o que limita a potncia
colimao paralelas e de uma fenda de divergncia e ilumina dos tubos e necessita de um sistema eficaz de arrefecimento
a superfcie plana da amostra. Todos os raios difractados do nodo.
segundo o ngulo igual pelos cristalitos convenientemente
O uso de nodos rotativos e o emprego de pticas de raios-X
orientados convergem numa linha ao nvel de uma fenda
permitem um aumento de luminosidade de 20 a 30 vezes.
receptora. Um segundo grupo de placas de colimao
Outra possibilidade consiste em produzir fotes X num
paralelas e uma fenda antidifuso podem ser colocadas antes
centro de radiao em larga escala (sincrotro).
ou depois da fenda receptora. Os eixos de focagem e da fenda
receptora situam-se a igual distncia do eixo do gonimetro. O espectro de emisso de um tubo gerador de raios-X
Os quanta de raios-X so determinados por um detector operando sob uma diferena de potencial suficiente
de raios que geralmente um cintilador, um contador composto por uma fonte contnua de radiao policromtica
proporcional ao gs selado ou um detector tipo PSD (position qual se junta uma radiao caracterstica dependente do
sensitive detector) ou em estado slido. A fenda receptora tipo de nodo. Somente esta radiao caracterstica usada
e o detector so solidrios e deslocam-se tangencialmente ao nas anlises por difraco dos raios-X. Os geradores mais
crculo de focagem. Para os varrimentos /2, o gonimetro correntes em difractometria X so os tubos de vcuo com
roda a amostra volta do mesmo eixo do detector, mas a nodo em cobre, molibdnio, ferro, cobalto ou crmio; os
metade da velocidade, segundo a geometria /2. A superfcie raios-X do cobre, do molibdnio ou do cobalto so os mais
da amostra permanece ainda tangente ao crculo de focagem. usados para as substncias orgnicas (principalmente os
O colimador de placas paralelas limita a divergncia axial nodos de cobalto permitem uma melhor separao dos
do feixe e ainda controla parcialmente a forma do perfil do raios- X). A escolha da radiao depender das propriedades
traado de difraco. de absoro da amostra e de uma eventual emisso de
Um difractmetro de Bragg-Brentano pode tambm ser usado fluorescncia pelos tomos da amostra. Os comprimentos
em transmisso. A vantagem desta tcnica reduzir os efeitos de onda usados em difractometria de ps correspondem
devidos orientao preferencial. Um capilar de espessura geralmente radiao K emitida pelo nodo. ainda
de cerca de 0,5-2 mm pode tambm ser usado para pequenas desejvel produzir o feixe X monocromtico eliminando
amostras. todos os outros componentes do espectro de emisso. Esta
operao parcialmente assegurada por filtros K, que so
filtros metlicos com o mximo de absoro compreendido
Radiao dos raios-X. No laboratrio, os raios-X so
entre os comprimentos de onda Ke K emitidos pelo tubo.
produzidos por bombardeamento de um nodo metlico com
electres emitidos por efeito termo-inico e acelerados num Tal filtro geralmente inserido entre o tubo gerador de
campo elctrico potente (produzido por um gerador de alta raios-X e a amostra. Um outro mtodo, utilizado de vez em
voltagem). A maior parte da energia cintica dos electres quando, para obter um feixe X monocromtico consiste

2. Mtodos
Analticos
FIGURA 2 Registo de raios-X em ps de 5 fases slidas diferentes de uma substncia. As intensidades foram normalizadas.
A. tubo dos raios-X C. amostra E. fenda receptora G. fenda receptora do detector J. crculo de difraco
B. fenda divergente D. fenda anti-difuso F. monocromador H. detector K. crculo de focagem
FIGURA 3 Geometria de Bragg-Brentano montagem em focagem aproximada

no uso de um cristal monocromador de grande dimenso (habitualmente chamado monocromador). O cristal, colocado

antes ou depois da amostra, difracta os diferentes picos de dimenso inferior a 0,5 um) pode conduzir a um aumento das
caractersticos do feixe dos raios-X (correspondentes a riscas do traado e alteraes significativas na prpria amostra
Ke K) segundo diferentes ngulos, de modo a permitir a como por exemplo:
seleco e a entrada no detector de somente um de entre
eles. tambm possvel separar os raios K1 e K2 usando contaminao da amostra pelas partculas cedidas pelos
um monocromador especfico. Entretanto, o ganho obtido materiais de pulverizao (almofariz, pilo, bolas, etc.),
produzindo um feixe monocromtico com o auxlio de um
2. Mtodos
Analticos
reduo do grau de cristalizao,

filtro ou de um monocromador contrabalanado por uma
perda de intensidade. Um outro mtodo para separar os transio ao estado slido dando outra forma polimorfa,
comprimentos de onda K e K consiste em usar espelhos decomposio qumica,
curvos para os raios-X, capazes de fazer simultaneamente a
monocromatizao e a focagem ou a posio em paralelo do introduo de tenses internas,
feixe dos raios-X. induo de reaces no estado slido.
aconselhado ainda comparar o difractograma de amostra
PROTECO CONTRA AS RADIAES no pulverizada com o da amostra com partculas mais
pequenas (por exemplo, uma amostra pulverizada). Se
A exposio de qualquer parte do corpo humano a uma o difractograma obtido adequado ao objectivo, no
radiao X costitui um risco para a sade. , portanto, necessrio proceder pulverizao.
essencial, quando se utiliza um equipameno que produza
Deve ter-se em linha de conta que se uma amostra contm
raios-X, tomar precaues adquadas para assegurar a
vrias fases, ao proceder-se a uma tamisao para isolar
proteco do operador e de qualquer outra pessoa que partculas de determinada dimenso alterada a composio
se encontre na proximidade. As prticas recomendadas inicial.
para assegurar esta proteco, bem como os nveis
mximos admissveis de exposio aos raios-X, so regidas
pela legislao nacional de cada pas. Na ausncia de MONTAGEM
regulamentaes ou recomendaes oficiais num pas,
convm adoptar as recomendaes mais recentes da Efeito do deslocamento da amostra. Um desequilbrio D
Comisso Internacional de Proteco Radiolgica. da superfcie da amostra em relao ao eixo de rotao do
difractmetro origina erros sistemticos difceis de evitar
totalmente e que se traduzem por desvios absolutos nos
PREPARAO E MONTAGEM DA AMOSTRA valores de D.cos (5) nas posies 2 (tipicamente da ordem
de 0,01 nos ngulos pequenos (cos 1) para um desvio
A preparao de matrias pulverizadas e a montagem das D = 15 m) e um alargamento assimtrico do perfil para os
amostras num suporte apropriado constituem etapas criticas de valores 2 mais baixos. O emprego de um padro interno
muitos mtodos de anlise, em particular na difraco dos raios-X permite detectar e corrigir simultaneamente este efeito e
em ps onde podem afectar muito significativamente a qualidade o efeito de transparncia da amostra. Esta origem de erro
dos dados adquiridos (4). As principais fontes de erro associadas de longe a mais importante tendo em conta o correcto
preparao e montagem da amostra so a seguir abordadas, no alinhamento do difractmetro.
contexto instrumental da focagem prxima de Bragg-Brentano.
Efeitos da espessura e da transparncia da amostra. Em
PREPARAO difraco dos raios-X para ps no modo reflexo, muitas
vezes prefervel trabalhar com amostras de espessura
A morfologia das partculas cristalinas tende em geral a dar infinita. Esta expresso significa que, para uma amostra
uma amostra que, no seu suporte, apresenta um certo grau de de atenuao mssica e de dada massa volmica e com dado
orientao preferencial. Esta particularmente evidente nos casos intervalo de ngulos de difraco, a intensidade difractada
de cristais na forma de agulhas ou de plaquetas onde pela reduo da parte posterior da amostra desprezvel. Em anlise
da dimenso se obtm agulhas ou plaquetas mais pequenas. A quantitativa, para que a intensidade difractada represente
orientao preferencial no seio da amostra afecta a intensidade pelo menos 99,9 por cento do valor mximo esperado quando
das diferentes reflexes, se bem que algumas so menos intensas se aumenta a espessura t da amostra, a espessura dever ser
e outras mais intensas, relativamente ao esperado, numa amostra igual ou superior a:
sem orientao preferencial. Podem ser usadas vrias tcnicas
para aumentar o carcter aleatrio de orientao dos cristalitos T = 3,45 sen / p
(e ainda limitar a orientao preferencial), mas o modo mais = coeficiente de atenuao de massa (por vezes chamado
simples e o mais satisfatrio , por vezes, uma reduo maior coeficiente de absoro de massa) da amostra,
da dimenso das partculas. O nmero ptimo de cristalitos
depende da geometria do difractmetro, da resoluo exigida e da p = massa volmica da amostra.
atenuao do feixe dos raios-X para a amostra. Em certos casos, as
partculas de grande dimenso (at 50 m) podem dar resultados
a soma dos coeficientes de atenuao de massa dos
satisfatrios na identificao de fases. Em anlise quantitativa,
elementos constituintes da amostra. Trata-se de uma
(4) Do mesmo modo, as alteraes podem intervir na amostra

(5) Note-se que um desvio do zero do gonimetro origina um desvio
durante a recolha de dados se o equilbrio no seio da amostra no
constante em todas as posies 2 observadas ou seja, uma translao
assegurado (temperatura. humidade).
em todo o difractograma de Z em 2 .
recomendado usar a amostra com domnios coerentes (cristalitos)
de dimenso inferior a 10 m. Uma reduo demasiada (cristalitos grandeza independente do estado fisico da matria. Nos casos

das amostras com fraca atenuao (tais como substncias ANLISE QUALITATIVA DAS FASES (IDENTIFICAO DAS
orgnicas com coeficiente de absoro linear muito FASES)
pequeno), a intensidade difractada parece proveniente de
uma posio situada abaixo da superfcie, o que se traduz A identificao por difraco dos raios-X em ps das fases
num deslocamento do traado e uma alterao da sua presentes numa amostra desconhecida, tem geralmente
largura. Este efeito chamado transparncia importante como base a comparao, visual ou computorizada, de
nas amostras espessas com fraca atenuao e pode conduzir a
2. Mtodos
uma parte do difractograma obtido com o difractograma
Analticos
erros angulares da ordem dos dcimos do grau. Nesses casos,
de referncia (experimental ou calculado). Teoricamente,
numa amostra com espessura o mais fina possvel, faz-se
desejvel que estes difractogramas de referncia
uma determinao exacta da posio das riscas no traado
sejam obtidos a partir de amostras monofsicas bem
dando intensidades difractadas aceitveis. desejvel usar
caracterizadas. Este mtodo permite, na maioria dos casos,
um suporte no difractor (com rudo de fundo nulo) tal como
uma placa de silcio monocristalino cortado paralelamente identificar uma substncia cristalina a partir de ngulos de
aos planos reticulares 510 (6). Uma das vantagens em usar a difraco 2 ou distncias inter-reticulares e intensidades
transmisso a menor importncia dos problemas associados relativas. A comparao por computador do difractograma
espessura e transparncia da amostra. da amostra com os dados de referncia pode ser efectuada
quer num intervalo 2 mais ou menos alargado do
O uso de um padro interno apropriado permite detectar difractograma total, quer num conjunto da dados reduzidos
e corrigir simultaneamente este efeito e o efeito do derivados do difractograma. Por exemplo, a lista das
deslocamento da amostra.
distncias inter-reticulares e de intensidades normalizadas
Inorm, chamada lista (d, Inorm) retirada do difractograma,
ALINHAMENTO DO DIFRACTMETRO constitui a identificao cristalogrfica da substncia e
pode ser comparada com as listas (d, Inorm) das amostras
Os gonimetros e os elementos pticos que actuam sobre monofsicas registadas na base de dados. Para a maior parte
os feixes dos raios-X antes e aps difraco contm muitas dos cristais orgnicos, quando usado um raio Cu K,
partes mecnicas necessitando de um ajustamento. O grau de recomendado registar o difractograma num intervalo 2
alinhamento ou de disposio afecta directamente a qualidade partindo de um valor o mais prximo de 0 at 40. O grau
dos resultados da anlise difractomtrica. Torna-se essencial de concordncia, para os ngulos de difraco 2 entre a
proceder a um ajustamento cuidadoso dos diferentes amostra e a substncia de referncia de menos 0,1 para
elementos do difractmetro (sistemas pticos e mecnicos, a mesma forma cristalina, embora possam existir variaes
etc.) a fim de limitar os erros sistemticos, optimizando considerveis entre a amostra e a substncia de referncia
as intensidades recebidas pelo detector. A procura da quanto s intensidades relativas, devido aos efeitos de
intensidade mxima e a da resoluo mxima, durante o orientao preferencial. Para outros tipos de amostras (sais
alinhamento de um difractmetro so sempre antagonistas. inorgnicos, por exemplo), pode ser necessrio alargar para
necessrio encontrar um compromisso ptimo entre os
alm dos 40 a regio 2 registada. Geralmente, suficiente
dois. Existem muitas configuraes possveis e cada aparelho
registar as 10 principais reflexes identificadas na base de
requer procedimentos de alinhamento especficos.
dados de difraco monofase dos raios-X em ps. por vezes
difcil, ou at impossvel, identificar as fases presentes nos
CALIBRAO, CONTROLO E VERIFICAO PERIDICA seguintes casos:
DOS DIFRACTMETROS
substncias no cristalinas ou amorfas,
Para determinar a ordem de grandeza dos erros potenciais
devidos ao difractmetro, estabelecida uma curva de fraco pequena de compostos a identificar relativamente
calibrao com um padro apropriado (interno ou externo), aos componentes totais (menos de 10 por cento m/m),
aps alinhamento do difractmetro, para cada um dos efeitos de orientao preferencial pronunciados,
seguintes aspectos:
ausncia na base de dados da fase a identificar,
calibrao angular,
formao de solues slidas,
calibrao da intensidade,
presena de desordens estruturais que alteram a malha
calibrao da forma do traado.
elementar,
A calibrao realizada geralmente com o auxlio de padres
de referncia certificados (cuja escolha depende do tipo de existncia de um certo nmero de fases da amostra,
anlise). O bom funcionamento global do difractmetro presena de deformaes na rede cristalina,
deve ser controlado em seguida e verificado periodicamente,
por intermdio de padres de trabalho e/ ou de referncia semelhana estrutural de fases diferentes.
(segundo o tipo de anlise respectivo).
ANLISE QUANTITATIVA DE FASES
(6) No caso de uma amostra fina com fraca atenuao, possvel
uma determinao exacta das posies do traado trabalhando com
um difractmetro focalizado com uma geometria de transmisso
Se a amostra uma mistura de 2 ou mais fases conhecidas e
ou de reflexo. Para a exactido da determinao das posies somente uma amorfa, possvel determinar a percentagem
do traado duma amostra com fraca atenuao, preferivel usar (em volume ou em massa) de cada fase cristalina e da fase
difractmetros com ptica de feixe paralelo. Estes permitem reduzir amorfa. A anlise quantitativa das fases pode ter como
o efeito da espessura da amostra. base as intensidades integradas, as alturas dos picos de

algumas riscas de difraco (7) ou no difractograma total. As No mtodo de adies, uma dada quantidade de fase a pura
intensidades integradas, alturas dos picos ou difractogramas adicionada mistura que contm uma concentrao
so comparados com os valores correspondentes das desconhecida de a. So assim efectuadas adies mltiplas
substncias de referncia. Estas podem ser substncias para estabelecer uma curva da intensidade em funo da
monofsicas ou misturas de fases conhecidas. As dificuldades concentrao; o ponto de intercepo (negativo) desta curva
encontradas em anlise quantitativa so relacionadas com com o eixo dos x representa a concentrao da fase a na
a preparao da amostra (a preciso e a fidelidade dos amostra original.
2. Mtodos
Analticos
resultados exigem a homogeneidade de todas as fases e uma

distribuio granulomtrica apropriada em cada fase) e aos ESTIMATIVA DE FRACES AMORFAS E CRISTALINAS
efeitos da matriz.
Numa mistura de fases cristalinas e amorfas, existem vrios
EFEITOS DA MATRIZ meios para estimar as fraces cristalinas e amorfas. A
escolha do mtodo depende da natureza da amostra:
A correco dos efeitos da matriz consiste em eliminar ou se a amostra composta por fraces cristalinas e uma
estimar o fenmeno da absoro, excepto no caso de misturas fraco amorfa de composies qumicas diferentes, a
de amostras polimorfas nas quais todas as fases tm o mesmo quantidade de cada uma das fases cristalinas presentes
coeficiente de absoro. Nos casos dos sistemas orgnicos, pode ser estimada por intermdio de substncias de
estes efeitos so relativamente limitados, de modo que a sua referncia apropriadas, como atrs descrito; a fraco
correco pode no ser efectuada. amorfa determinada por subtraco,
se a amostra composta por uma fraco cristalina e
AMOSTRAS POLIMORFAS uma fraco amorfa, em mistura monofsica ou bifsica,
da mesma composio elementar, a quantidade de fase
No caso de uma amostra composta por 2 fases polimorfas a e cristalina (ou grau de cristalinidade) pode ser estimada a
b, a fraco Fa da fase a apresentada pela relao seguinte: partir de 3 reas determinadas no difractograma:
A = rea total dos picos resultante da difraco
1 correspondente fraco cristalina da amostra,
Fa =
1 K(Ib/Ia)
B = rea total sobre a rea A,
C = rea correspondente ao fundo (devido difraco
Obtm-se a fraco atravs da relao das intensidades das 2 difusa atravs do ar, a uma emisso de fluorescncia,
fases, sendo conhecido o valor da constante K. K a relao ao equipamento, etc).
das intensidades absolutas das 2 fases polimorfas puras Ioa/Iob.
O seu valor pode ser calculado pelas determinaes sobre a Uma vez obtidas estas reas, o grau de cristalinidade
substncia de referncia. estimado dado pela expresso:
% cristalinidade = 100A / (A + B C)
MTODOS QUE USAM UM PADRO Este mtodo no fornece valores absolutos do grau de
cristalinidade, e geralmente usado s para comparao.
Os mtodos mais usados para anlise quantitativa so: Existem mtodos mais sofisticados tais como o mtodo de
mtodo do padro externo, Ruland.
mtodo do padro interno,

mtodo das adies. OBTENO DE INFORMAES ESTRUTURAIS
A PARTIR DO DIFRACTOGRAMA
O mtodo do padro externo o mais generalizado, consiste
em comparar o difractograma X da mistura ou a intensidade A difraco dos raios-X em ps foi durante vrias dcadas
do traado correspondente com o difractograma de uma um importante meio de identificao e de caracterizao de
mistura de referncia, ou com as intensidades tericas de substncias cristalinas. Os recentes aperfeioamentos dos
um modelo estrutural perfeitamente conhecido. Para limitar mtodos de difractometria permitem hoje retirar informaes
os erros devidos aos efeitos da matriz, usa-se uma substncia estruturais teis a partir dos dados obtidos, como descrito
de referncia que apresente uma forma de cristalitos e um anteriormente.
coeficiente de absoro de raios-X comparveis aos componentes
da amostra e cujo espectro de difraco no interfira, em nenhum Determinao dos parmetros da malha. Num difractograma
ponto, com o da substncia a analisar. Uma quantidade conhecida pode ser associado cada trao a uma distncia inter-reticular
desta substncia de referncia adicionada amostra e a cada e aos ndices de Miller (hkl) do ou das famlias de planos
preparao padro. Nestas condies, existe uma relao linear correspondentes, se conhecida a malha elementar da rede
entre a intensidade do traado e a concentrao. Este mtodo cristalina (sistema cristalino, rede de Bravais, parmetros de
chamado do padro interno, exige uma determinao exacta das malha aproximados). As distncias inter-reticulares determina-
intensidades difractadas. das a partir do difractograma so ligadas aos parmetros da
malha pelas relaes geomtricas tendo em conta os ndices de
(7) Se a estrutura cristalina de todos os componentes conhecida, Miller dos planos considerados. Se a amostra composta por
a sua quantificao com a exactido suficiente possvel pelo fases cristalinas cujos parmetros de malha so relativamente
mtodo de Rietveld. Se a estrutura cristalina das componentes no conhecidos, podem conhecer-se mais exactamente pelo
conhecida, podem ser usadas o mtodo de Pavley ou o mtodo dos mtodo dos mnimos quadrados usando o difractograma do p
mnimos quadrados parciais (PLS). ou a lista de distncias inter-reticulares indexadas.

2.9.36. Escoamento de ps
Se a amostra composta por uma fase cristalina o trabalho de caracterizao da capacidade de escoamento.
desconhecida, a determinao dos parmetros da malha O objectivo deste texto uma reviso dos mtodos de
necessita de uma indexao ab initio do difractograma. Os caracterizao mais frequentes na literatura farmacutica.
ndices de Miller so atribudos a cada uma das riscas do Dada a manifesta impossibilidade de eleger um simples e
difractograma obtido. Pode proceder-se por comparao com nico mtodo que permita a caracterizao adequada das
um difractograma de referncia ou por indexao automtica propriedades de escoamento dos ps farmacuticos, prope-
por meio de programas especficos. A soluo matemtica se a normalizao de diversos mtodos o que pode ser valioso
2. Mtodos
Analticos
encontrada por um programa de indexao automtico para o desenvolvimento farmacutico.
a malha elementar verdadeira ou uma pseudo-malha
dependendo da exausto e do grau de incerteza dos dados So citados frequentemente 4 mtodos para os ensaios de
experimentais recolhidos e consoante a grandeza e a simetria escoamento dos ps:
da malha elementar. ngulo de repouso,
ndice de compressibilidade ou razo de Hausner,
Conhecimento da estrutura. Regra geral, a determinao
das estruturas cristalinas efectuada a partir de dados de velocidade de escoamento atravs de um orifcio,
difraco dos raios-X obtidos sobre microcristais. Contudo,
clula de deslocamento.
este modo convencional no pode ser usado quando
impossvel preparar uma substncia na forma cristalogrfica Existem numerosas variantes destes mtodos e, devido
pura. Os desenvolvimentos recentes com base nas tcnicas a tal multiplicidade de mtodos e variantes, torna-se
de alta resoluo da difraco dos raios-X em ps constituem desejvel a normalizao de metodologia logo que possvel.
progressos significativos para a determinao das estruturas nesta perspectiva que so discutidos a seguir os mtodos
cristalinas. Esta determinao por vezes realizada a partir mais usados, que so identificados os principais aspectos
de dados de difraco que apresentam uma resoluo experimentais e que so apresentadas recomendaes em
suficiente, por tentativas, pelo mtodo de Patterson e/ou matria de normalizao. Regra geral, um mtodo para
pelos mtodos directos. Todavia, a anlise estrutural de determinar a capacidade de escoamento dos ps deve ser
cristais orgnicos torna-se um trabalho difcil quando os prtico, til, reprodutvel, sensvel e fornecer resultados
parmetros da malha so relativamente extensos, pouca pertinentes. Nenhum mtodo de determinao simples
simetria e as propriedades de difraco geralmente muito permite caracterizar convenientemente ou completamente
limitadas. Para dada forma cristalina de uma substncia, o as mltiplas propriedades relacionadas com o escoamento
conhecimento da estrutura permite calcular o difractograma que interessam indstria farmacutica. Pode ser utilizada
dos raios-X correspondente e estabelecer tambm um uma estratgia apropriada e talvez utilizar-se um conjunto
difractograma de referncia sem orientao preferencial o de mtodos normalizados para caracterizar os diferentes
qual pode ser usado para comparao. aspectos das propriedades de escoamento dos ps segundo as
necessidades de aplicao farmacutica.
Distino das estruturas cristalinas. A distino das
estruturas cristalinas consiste em reduzir ao mnimo
a diferena entre as intensidades do difractograma NGULO DE REPOUSO
experimental de uma substncia cristalina e as intensidades
obtidas atravs do clculo a partir de um modelo estrutural O ngulo de repouso utilizado em diferentes domnios
suficientemente prximo da estrutura real. Esta operao cientficos para caracterizar as propriedades de escoamento
que se efectua pelo mtodo dos mnimos quadrados (ou dos slidos. Exprime as frices interpartculas, ou a resistn-
outro mtodo), permite distinguir os parmetros estruturais cia ao movimento ligado interaco das partculas. As
do modelo (dimenses da malha elementar, coordenadas determinaes do ngulo de repouso so muito dependentes
dos tomos, posio) e os parmetros de deslocamento do mtodo usado, das dificuldades experimentais associadas
atmico at obteno de uma concordncia satisfatria separao da substncia e compactao ou ao volume
entre as intensidades obtidas pelo clculo e as determinadas. aparente do p quando se forma o cone. Todavia, apesar
Esta necessita de dados de difraco exactos (intensidade e destas dificuldades, este mtodo continua a ser utilizado
posio) com informao suficiente de modo a permitir uma na indstria farmacutica e a literatura contm numerosos
estimativa dos parmetros estruturais respectivos. Na maioria exemplos que atestam o valor na previso de problemas de
dos casos, na distino das estruturas so usados mtodos fabrico.
do tipo Rietveld mas pode tambm ser usado o mtodo da
intensidade integrada. O ngulo de repouso constante, o ngulo tridimensional,
relativamente a uma base horizontal, de um monte de p de
forma cnica que se pode obter por vrios mtodos a seguir
descritos.
2.9.36. ESCOAMENTO DE PS
A utilizao muito difundida de ps na indstria Mtodos de determinao
farmacutica tem conduzido ao desenvolvimento de uma So descritos na literatura diversos mtodos de determinao
grande diversidade de mtodos para caracterizar a sua do ngulo de repouso. Os mais correntemente utilizados
capacidade de escoamento. No surpresa o aparecimento para a determinao do ngulo de repouso esttico, podem
na literatura farmacutica de mltiplas referncias a diversas ser classificados em relao a duas variveis experimentais
determinaes da capacidade de escoamento dos ps, essenciais:
associadas a tentativas de correlao com as propriedades
que afectam o fabrico. Esta diversidade de mtodos o a altura em relao base do funil atravs do qual escoa
resultado inevitvel da complexidade do comportamento o p pode ser fixa e definida, ou pode variar medida da
dos ps, onde h mltiplas variveis tornando complicado formao do cone,

a base sobre a qual se forma o cone pode ter um dimetro Mtodo recomendado
fixo, ou variar o dimetro do cone do p medida da sua
Determine o ngulo de repouso sobre uma base fixa com um
formao.
bordo que permita a reteno de uma camada de p. A base
deve ser isenta de vibraes. Faa variar a altura do funil
Variantes do mtodo do ngulo de repouso com cuidado para formar um cone de p simtrico e com
Estes mtodos comportam variantes mencionadas de a precauo de evitar qualquer vibrao na deslocao do
2. Mtodos
Analticos
diferentes modos na literatura farmacutica: funil. Para limitar o impacto da queda de p sobre o topo do
cone, o funil deve ser mantido a uma distncia de cerca de
ngulo de repouso em escoamento: determinado 2-4 cm do topo do cone em formao. Se for impossvel obter
deixando escoar de um recipiente um excesso de material ou reproduzir um cone de p simtrico, este mtodo no
colocado em cima de uma base de dimetro fixo; a apropriado. Determine a altura do cone de p e calcule o
formao de um cone de p sobre esta base permite ngulo de repouso usando a expresso:
determinar o ngulo de repouso em escoamento,
ngulo de repouso dinmico: um recipiente cilndrico altura
tg ()
(com uma tampa transparente numa extremidade) 0,5 base
cheio de p e posto a rodar a uma velocidade definida; o
ngulo de repouso dinmico o ngulo que forma o p
escoado com a horizontal. O ngulo interno de frico NDICE DE COMPRESSIBILIDADE E RAZO DE HAUSNER
cintica definido por um plano separador das partculas
que deslizam sobre a camada superior do monte de p das Durante os ltimos anos, a determinao do ndice de
partculas que acompanham a rotao do recipiente (com a compressibilidade ou da razo de Hausner mostrou-se
rugosidade de superfcie). um mtodo comum, simples e rpido para a previso
das propriedades de escoamento dos ps. O ndice de
compressibilidade foi proposto como uma determinao
Escala geral da capacidade de escoamento com base indirecta de um conjunto de propriedades: densidade
no ngulo de repouso aparente, forma e tamanho, superfcie especfica, humidade,
Apesar da existncia de uma certa variabilidade na descrio coeso, todas exercendo uma influncia no valor do ndice
qualitativa do escoamento dos ps segundo o ngulo de de compressibilidade. Este e a razo de Hausner so obtidos
repouso, a literatura farmacutica encontra-se bastante de por determinaes sucessivas dos volumes do p antes e aps
acordo com a classificao de Carr, apresentada na tabela 1. compactao
Menciona exemplos de formulaes que, com um ngulo de
repouso da ordem de 40-50, apresentam um comportamento Mtodos de determinaao
de fabrico satisfatrio. Quando um ngulo de repouso de Embora existam variaes, a base do mtodo para determinar
50, o escoamento raramente aceitvel para as necessidades o ndice de compressibilidade e a razo de Hausner consiste
de fabrico. em determinar o volume aparente antes da compactao V0
e depois o volume final Vf obtido aps a compactao do p
Aspectos experimentais at um volume constante. O ndice de compressibilidade e
a razo de Hausner so definidos, respectivamente, pelas
O ngulo de repouso no uma propriedade intrnseca do p; expresses seguintes:
dependente do mtodo utilizado para formar o cone. A este
respeito, existem na literatura vrios aspectos importantes:
V0 Vf
o topo do cone do p pode apresentar distores devido ao ndice de compressibilidade = 100
Vf
impacto da descida do p; possvel reduzir as distores
do impacto procedendo construo do cone com cuidado, V0
Razo de Hausner =
a natureza da base sobre a qual se forma o cone afecta o Vf
ngulo de repouso. recomendado formar o cone de p
sobre uma base comum, que pode ser constituda, por O clculo do ndice de compressibilidade e da razo
exemplo, por uma camada de p; assim, pode ser utilizada de Hausner pode ser tambm efectuado a partir dos
uma base de dimetro fixo com um bordo externo saliente valores das determinaes da massa volmica aparente
que permite reter uma camada de p sobre a qual se antes da compactao (bruto) e a massa volmica aps
formara o cone. compactao(reduzido):
TABELA 1 Escala geral da capacidade de escoamento reduzido bruto

com base no ngulo de repouso ndice de compressibilidade = 100
bruto
ngulo de repouso
Capacidade de escoamento reduzido
(graus) Razo de Hausner = bruto
Excelente 25-30
Boa 31-35
Aceitvel (no necessita ajuda) 36-40
Numa variante destes mtodos, a determinao da alterao
Fraca (risco de blocagem) 41-45
do volume devida compactao substituda pelo volume
M (ajuda necessria por agitao ou vibrao) 46-55
aparente aps compactao. A escala da capacidade de
Muito m 56-65
escoamento geralmente aceite para o ndice de
Pssima > 66 compressibilidade e razo de Hausner apresentada na
tabela 2.

TABELA 2 Escala da capacidade de escoamento o tipo de recipiente utilizado como contentor: os mais
correntes so cilindros e funis, ou tremonhas dos
ndice de compres- Capacidade de Razo de aparelhos de produo,
sibilidade (por cento) escoamento Hausner
o dimetro e a forma do orifcio so factores crticos na
1-10 Excelente 1,00-1,11 determinao da velocidade de escoamento,
11-15 Boa 1,12-1,18
o mtodo de determinao usado: a velocidade de
2. Mtodos
Analticos
16-20 Aceitvel 1,19-1,25
escoamento do p pode ser determinada em contnuo
21-25 Fraca 1,26-1,34
ou por intermdio de uma balana electrnica com um
26-31 M 1,35-1,45
sistema de registo (registador com fita, computador);
32-37 Muito m 1,46-1,59
podendo assim determinar-se pequenas quantidades (por
> 38 Pssima > 1,60
exemplo o tempo necessrio, em dcimos de segundo, para
100 g de p passarem atravs do orifcio, ou a quantidade
Aspectos experimentais de p, em dcimos de grama, que passa atravs do orifcio
em 10 s.
O ndice de compressibilidade e a razo de Hausner no
so propriedades intrnsecas do p, o valor depende da
Variantes do mtodo
metodologia utilizada. Na literatura constam vrios
parmetros importantes susceptveis de afectar a Pode determinar-se a velocidade em massa ou em volume. A
determinao do volume aparente antes da compactao V0, determinao da velocidade em massa mais simples, mas
do volume final aps compactao Vf, da massa volmica introduz nos resultados um desvio a favor dos materiais
aparente antes da compactao bruto e da massa volmica com densidade elevada. Se o enchimento das matrizes for
aps compactao reduzido: volumtrico, prefervel a determinao da velocidade
em volume. Por vezes usado um vibrador para facilitar o
o dimetro da proveta onde feita a compactao, escoamento para fora do recipiente mas esta prtica parece
o nmero de batimentos aplicados amostra para obter a complicar a interpretao dos resultados. Foi proposto
massa volmica aps compactao, o emprego de um orifcio mvel para simular melhor as
condies de fabrico com a ajuda de uma prensa rotativa. O
a massa da amostra, dimetro mnimo do orifcio de escoamento pode tambm ser
a rotao da amostra durante a compactao. determinado.
Mtodo recomendado Escala geral de escoamento com base na velocidade de

escoamento atravs de um orifcio
Disponha de uma proveta graduada de 250 ml e de uma
amostra de p de 100 g. Podem ser utilizados volumes e No existe escala geral com base na velocidade de escoamento
atravs de um orifcio, visto esta ser muito dependente do
massas inferiores, sendo necessrio descrever nos resultados mtodo de determinao usado. A comparao dos resultados
as variaes introduzidas no mtodo. recomendado utilizar publicados difcil.
a mdia de 3 determinaes.
Aspectos experimentais
ESCOAMENTO ATRAVS DE UM ORIFCIO A velocidade de escoamento atravs de um orifcio no uma
propriedade intrnseca do p. muito dependente do mtodo
A velocidade de escoamento de um material depende de de determinao usado. A literatura refere vrios parmetros
numerosos factores, alguns ligados s partculas e outros importantes susceptveis de afectar as determinaes:
ao processo utilizado. A determinao da velocidade de o dimetro e a forma do orifcio,
escoamento atravs de um orifcio foi proposta como sendo a
melhor avaliao da capacidade do escoamento dos ps. Pode a natureza do material que constitui o recipiente (metal,
ser muito til observar o escoamento contnuo embora haja vidro, plstico),
sempre escoamento pulstil mesmo nos casos dos materiais o dimetro e a altura do leito do p.
fluidos. As variaes da velocidade de escoamento podem ser
observadas ao esvaziar os recipientes. As equaes empricas
Mtodo recomendado
exprimem a relao entre a velocidade de escoamento e o
dimetro do orficio, o tamanho e a densidade das partculas. A determinao da velocidade de escoamento atravs de um
Contudo, s se usa determinar a velocidade de escoamento orifcio s pode ser usada para produtos com certa capacidade
atravs de um orifcio para os materiais fluidos. A velocidade de escoamento. No tem utilidade para materiais coesivos.
de escoamento atravs de um orifcio geralmente Partindo do princpio de que a altura do leito de p muito
determinada em termos de escoamento de massa por unidade superior ao dimetro do orifcio, a velocidade virtualmente
de tempo a partir de um certo tipo de recipiente (cilindro, independente daquela altura. recomendado usar um
funil, tremonha). A determinao pode ser efectuada pelos cilindro como recipiente porque a forma cilndrica tem pouca
pequenos incrementos ou em contnuo. influncia sobre o escoamento. Com esta configurao, a
velocidade determinada principalmente pelo movimento
Mtodos de determinaao bsicos do tipo p-sobre-p mais do que do p sobre a parede. A
velocidade de escoamento aumenta por vezes quando a
So descritos na literatura diversos mtodos de determinao altura da coluna de p representa menos de duas vezes o seu
da velocidade de escoamento atravs de um orifcio. Os mais dimetro. O orifcio deve ser circular e o recipiente isento
usados so classificados em relao a 3 variveis experimentais de vibraes. Os princpios gerais a respeitar quanto s
principais: dimenses do cilindro so as seguintes:

2.9.37. Microscopia ptica
dimetro de abertura superior a 6 vezes o dimetro das como nos outros mtodos de caracterizao do escoamento
partculas, dos ps, encontram-se descritas na literatura diversas
variaes. De um modo geral, uma vantagem significativa
dimetro do cilindro superior a 2 vezes o dimetro da
abertura. da clula de escoamento permitir um melhor controlo
experimental. Por outro lado, trata-se de um mtodo longo e
O emprego de uma tremonha como recipiente pode ser que necessita do uso de quantidades significativas de p e de
igualmente conveniente se for representativo do escoamento um operador qualificado.
2. Mtodos
Analticos
nas condies de produo. Est desaconselhado usar um

funil com haste porque a velocidade de escoamento ser
Recomendaes
condicionada pelo dimetro e pelo comprimento da haste e
tambm pelas frices haste-p. Pode ser usado um tronco A clula de escoamento, com mltiplas configuraes e
de cone mas a velocidade influenciada pelo coeficiente de procedimentos de ensaio, fornece muitos dados e permite
frico do p na parede; torna-se muito importante a escolha uma caracterizao muito eficaz do escoamento dos ps.
do material que constitui o recipiente. tambm til para optimizar a concepo de tremonhas
Para orifcio do cilindro, use uma base plana, com opo e silos. Devido diversidade de aparelhos e procedimentos
possvel para fazer variar o dimetro do orifcio de modo a experimentais existentes, no so apresentadas neste texto
proporcionar a mxima flexibilidade assegurando o melhor recomendaes especficas de metodologia. Recomenda-
escoamento p sobre p. A determinao da velocidade se, entretanto, que os resultados da caracterizao do
de escoamento pode ser descontnua ou contnua. A escoamento incluam uma descrio completa dos aparelhos e
determinao em contnuo por intermdio de uma balana mtodos usados.
electrnica permite uma melhor deteco das variaes
momentneas do dbito.
2.9.37. MICROSCOPIA PTICA
CLULA DE ESCOAMENTO A microscopia ptica geralmente aplicvel caracterizao
das partculas de tamanho superior ou igual a 1 m. O limite
Para tentar chegar a uma base mais geral, os estudos de inferior imposto pelo poder de resoluo do microscpio.
escoamento de ps e a concepo de tremonhas tm sido
O limite superior menos bem definido e depende da
desenvolvidos diversos dispositivos e mtodos de ensaio de
maior dificuldade associada caracterizao das partculas
deslocamento, permitindo uma avaliao mais completa
de grande tamanho. Diversas tcnicas alternativas esto
e precisa das propriedades de escoamento de ps. O
mtodo chamado da clula de deslocamento muito usado disponveis para a caracterizao das partculas excludas do
para o estudo sobre produtos farmacuticos. Permite a domnio da aplicao da microscopia ptica. A microscopia
determinao de mltiplos parmetros, principalmente dos ptica particularmente til para a caracterizao das
critrios de plasticidade representando a relao tenso de partculas esfricas. Pode igualmente servir de base de
corte-velocidade de escoamento, ngulo de frico interno, calibrao de mtodos mais rpidos desenvolvidos para as
limite elstico em meio no confinado, a resistncia traco anlises de rotina.
e uma srie de parmetros derivados tais como o coeficiente
de escoamento e outros indicadores da capacidade de Aparelhagem. O microscpio utilizado deve estar estvel
escoamento. Devido facilidade e maior preciso no controlo e protegido de vibraes. A sua amplificao (produto
dos parmetros experimentais, permite a determinao da amplificao da objectiva pela amplificao da ocular
das propriedades de escoamento em funo da carga de e outros componentes pticos amplificadores) deve ser
compactao, do tempo e de outras condies do meio. Tem suficiente para permitir uma caracterizao adequada das
sido aplicada com sucesso para determinar os parmetros partculas mais pequenas a classificar na amostra. Convm
crticos de concepo de tremonhas e silos. encontrar a abertura numrica mxima da objectiva para
cada intervalo de amplificao. Podem utilizar-se filtros
Mtodos fundamentais de determinao polarizantes em conjugao com analisadores e lminas
O primeiro tipo de clulas de escoamento a clula apropriadas. O emprego de filtros de cor de transmisso
cilndrica; tem uma diviso horizontal que forma um plano espectral relativamente estreita necessrio com as
de escoamento entre a partcula inferior, estacionria, e a objectivas acromticas e prefervel com as objectivas
partcula superior, mvel, da clula; aps o acondicionamento apocromticas; indispensvel para uma boa restituio
do p na clula (por um processo definido), determinadas cores em fotomicrografia. Devem ser utilizados sob a
-se a fora necessria para o escoar pondo em movimento platina do microscpio e com a lmpada condensadores
a parte superior. As clulas de escoamento do segundo corrigidos, pelo menos, para as aberraes de esfericidade.
tipo, chamadas anulares, apresentam certas vantagens A abertura numrica do condensador colocado sob a
sobre as cilndricas, permitem principalmente o uso de platina deve coincidir com a abertura da objectiva nas
uma quantidade menor da amostra; por outro lado, a sua condies do emprego; ela condicionada pela abertura
concepo no permite assegurar uma uniformidade de efectiva do diafragma do condensador e a presena de leo
escoamento equivalente, pois as velocidades de escoamento de imerso.
do material so mais elevadas na parte exterior do anel do
que na regio central. Um terceiro tipo de clula (tipo plano) Afinao. essencial o alinhamento exacto de todos os
composto por uma fina camada de p colocada entre duas elementos do sistema ptico, bem como uma focagem
superficies rugosas, sendo mvel a inferior. correcta. A focagem dos elementos efectuada de acordo com
Cada um destes mtodos tem vantagens e inconvenientes e as instrues do fabricante do microscpio. Recomenda-se
a sua anlise detalhada ultrapassa o mbito deste texto. Tal um alinhamento axial crtico.

2.9.37. Microscopia ptica
Iluminao. Uma das condies para uma boa iluminao apropriada e examine ao microscpio uma rea correspondente,
obter uma intensidade luminosa uniforme e ajustvel no mnimo, a 10 g da amostra. Conte todas as partculas
ao conjunto do campo de viso; prefervel operar sob cuja dimenso mxima superior ao tamanho especificado. O
iluminao Khler. Com as partculas coradas, a cor dos tamanho limite e o nmero admitido de partculas de tamanho
filtros escolhida de modo a optimizar o contraste e os superior a este limite so definidos para cada substncia.
detalhes da imagem.
2. Mtodos
Analticos
Caracterizao visual. A amplificao e a abertura numrica
devem ser suficientemente elevadas para permitir obter to
en
uma resoluo adequada das imagens das partculas a pr
im
caracterizar. Determina-se a amplificao efectiva calibrando m
Co
o micrmetro da ocular com um micrmetro-objecto Dimetro de Feret
calibrado. possvel minimizar os erros adoptando uma
amplificao suficiente para que a imagem da partcula
ocupe, pelo menos, 10 divises da ocular. Cada objectiva deve
ser calibrada separadamente. Para calibrar a escala da ocular, Dimetro de Martin
convm alinh-la com a do micrmetro-objecto. Pode, assim,
determinar-se exactamente a distncia entre as divises da
escala da ocular. Por vezes, necessrio operar-se com vrias Dimetro da rea projectada
amplificaes para caracterizar produtos que apresentem
Seco horizontal mxima
uma ampla distribuio granulomtrica.
La
rgu
Caracterizao fotogrfica. Se o tamanho das partculas for ra
determinado por mtodo fotogrfico, necessrio obter uma
focagem exacta do objecto no plano da emulso fotogrfica.
Determina-se a amplificao efectiva fotografando um FIGURA 1 Medidas correntes do tamanho das partculas
micrmetro-objecto calibrado com uma pelcula fotogrfica
que possua velocidade, poder de resoluo e contraste Caracterizao do tamanho das partculas. A determinao
suficientes. A exposio e o tratamento utilizados para do tamanho das partculas de complexidade varivel
fotografar a amostra e para determinar a amplificao segundo a sua forma e o nmero de partculas
devem ser idnticos. O tamanho aparente de uma imagem caracterizadas deve ser suficiente para assegurar um
fotogrfica funo da exposio, do desenvolvimento e da nvel de incerteza aceitvel dos parmetros determinados.
impresso bem como do poder de resoluo do microscpio. Informaes complementares sobre a determinao do
tamanho das partculas, o tamanho da amostra e a anlise
Montagem da preparao. O meio de montagem a utilizar dos dados figuram, por exemplo, na norma ISO 9276.
depende das propriedades fsicas da amostra. Para permitir Para as partculas esfricas, o tamanho definido pelo
uma observao que satisfaa os contornos, o contraste dimetro. Para as partculas irregulares pode ser definido de
entre a amostra e o meio deve ser suficiente sem ser muito diversos modos. Regra geral, a caracterizao do tamanho
elevado. As partculas devem ser repartidas num s plano das partculas de forma irregular deve compreender
e convenientemente dispersas, de modo que seja possvel informaes sobre o tipo de dimetro determinado, bem
distinguir as partculas elementares a caracterizar. Devem, como sobre a forma da partcula. Diversas determinaes
alis, ser representativas da distribuio granulomtrica do correntemente utilizadas esto representadas na figura 1;
material e no ter sofrido alterao durante a montagem. so definidas do seguinte modo:
importante vigiar para que esta condio seja satisfeita. Na o dimetro de Feret a distncia entre as paralelas
escolha do meio de montagem igualmente de tomar em imaginrias tangentes a uma partcula orientada de modo
considerao a solubilidade das partculas. aleatrio e perpendiculares escala da ocular,
o dimetro de Martin o dimetro no ponto que divide
Caracterizao da cristalinidade. Pode caracterizar-se a
uma partcula orientada de modo aleatrio em 2 reas
cristalinidade de um produto para verificar se ela satisfaz
projectadas iguais,
exigncia de cristalinidade especificada na monografia de
uma substncia farmacutica. Salvo indicao em contrrio o dimetro da rea projectada o dimetro de um crculo
da monografia, monte algumas partculas da amostra num da mesma rea projectada que a partcula,
leo mineral numa lmina de vidro limpa e examine a
o comprimento a maior dimenso de bordo a bordo de
mistura num microscpio polarizante; fazendo girar a platina
uma partcula orientada paralelamente escala da ocular,
do microscpio, observa-se uma birrefringncia (cores de
interferncia) bem como posies de extino. a largura da partcula a maior dimenso determinada
perpendicularmente ao comprimento.
Ensaio granulomtrico limite por microscopia. Pese uma
quantidade apropriada do p da amostra (10-100 mg, por Caracterizao da forma das partculas. Para as partculas
exemplo) e suspenda-a em 10 ml de um meio apropriado no de forma irregular, a caracterizao do tamanho deve
qual o p no se dissolva, juntando, se necessrio, um agente igualmente incluir informaes sobre a forma da partcula.
molhante. possvel manter as partculas em suspenso A homogeneidade do p deve ser verificada com uma
homognea utilizando um meio de densidade semelhante ou amplificao apropriada. Na figura 2 apresentam-se
adaptada e assegurando uma agitao apropriada. Introduza descries de formas correntemente utilizadas e que so
uma poro da suspenso homognea numa clula de contagem definidas da seguinte forma:

2.9.38. Estimativa da distribuio granulomtrica por tamisao analtica
Acicular
Isomtrica Lamelar
2. Mtodos
Analticos
Em lmina
Colunar
Tabular
FIGURA 2 Descritores morfolgicos correntes
acicular: partcula longa e fina, em forma de agulha, de porosa: apresentando aberturas ou canalculos,
largura e grossura prximas,
rugosa: acidentada, desigual, no lisa,
colunar: partcula longa e fina mas mais larga e espessa
que uma partcula acicular, pontuada: apresentando pequenas chanfraduras.
lamelar: partcula fina, achatada, de comprimento e

largura prximos,
2.9.38. ESTIMATIVA DA DISTRIBUIO
em lmina: partcula achatada de comprimento e largura
prximas mas mais espessa que uma lamelar,
GRANULOMTRICA POR TAMISAO
tabular: partcula principalmente desenvolvida nas 2
ANALTICA
direces,
A tamisao um dos mtodos mais antigos de classificao
isomtrica: partcula de comprimento, largura e espessura de ps e granulados em funo da sua distribuio
prximas: as partculas cbicas e esfricas fazem parte granulomtrica. Quando se usa um tamis de uma rede de
deste grupo. tecido, a triagem das partculas efectuada essencialmente
segundo a dimenso mdia (largura ou espessura). A
Observaes gerais. A partcula geralmente definida como tamisao mecnica est principalmente adaptada para os
a mais pequena unidade existente. Pode tratar-se de uma casos onde a maioria das partculas so de tamanho superior
gotcula lquida ou semi-slida, de um monocristal ou de a cerca de 75 m. Para partculas menores, o baixo peso das
uma estrutura policristalina, de uma partcula amorfa ou de partculas insuficiente para vencer a foras superficiais de
um aglomerado. As partculas podem estar associadas em coeso e de adeso que levam as partculas a aglutinar e a
graus diversos descritos nos termos seguintes: aderir ao tamis, de tal modo que as partculas que deveriam
atravessar normalmente o tamis ficam retidas. Nestes casos,
lamelar: folhas empilhadas,
so mais apropriados outros meios de agitao tais como
agregado: massa de partculas agregadas, a tamisao por corrente forada de ar ou por ultra-sons.
Entretanto, a tamisao pode por vezes, sob reserva de
aglomerado: partculas fundidas ou cimentadas,
validao, ser usada para ps ou grnulos com granulometria
conglomerado: mistura de, pelo menos, 2 tipos de mdia inferior a 75 m. Na rea farmacutica, a tamisao
partculas, o mtodo mais utilizado para a classificao relativamente
grosseira das qualidades de ps e granulados de composio
esferulite: aglomerao de estrutura radial,
homognea. Tem a vantagem de fazer a classificao dos
drusa: partculas cobertas com outras partculas mais ps e granulados unicamente com base na distribuio
pequenas. granulomtrica e de permitir, na maioria dos casos, a anlise
Os termos seguintes descrevem o aspecto e estado das no estado seco.
partculas: Nas limitaes do mtodo conta-se a necessidade do uso de
bordos: angulares, arredondados, lisos, agudos, uma amostra para ensaio relativamente grande (no mnimo,
fracturados, cerca de 25 g, segundo a densidade do p ou do granulado
e dimetro do tamis), e a dificuldade da tamisao dos ps
aspecto: cor (com filtros de equilibrao apropriados), e granulados grosseiros ou os mais coesivos, que tendem a
transparente, translcida, opaca, colmatar as malhas do tamis. O mtodo tem principalmente
defeitos: ocluses, incluses. uma estimativa bidimensional, porque a passagem atravs
das malhas muitas vezes mais condicionada pela largura e
A rea das partculas pode ser descrita como:
espessura mximas do que pelo comprimento.
fendida: parcialmente fendida, quebrada ou fissurada,
O mtodo descrito destina-se a estimar a distribuio
lisa: isenta de irregularidades, rugosidades ou projeces, granulomtrica total de um produto de composio

homognea. No destinado determinao da proporo de TABELA 1 (continuao)

partculas no retidas ou retidas por 1 ou 2 tamises.
Abertura nominal ISO Tamis Tamis USP Tamis Tamis
Salvo especificao em contrrio na monografia, proceda Dimenses Dimenses US recomendado Europeu Japons
estimativa da distribuio granulomtrica segundo o principais suplementares N. (mesh) N. N.
processo de tamisao a seco. Se houver dificuldade para R 20/3 R20 R40/3
atingir o ponto final (se o produto no passa facilmente 3,35 mm 6 5,5
atravs do tamis), ou se for necessrio usar os tamises mais
2. Mtodos
Analticos
3,15 mm
finos (menores do que 75 m), torna-se necessrio recorrer a 2,80 mm 2,80 mm 2,80 mm 7 2800 2800 6,5
um outro mtodo de granulometria. 2,50 mm
2,36 mm 8 7,5
A tamisao deve decorrer de modo a que a amostra no 2,24 mm
adquira absoro nem perda de humidade. A humidade 2,00 mm 2,00 mm 2,00 mm 10 2000 2000 8,6
relativa do ambiente deve ser controlada de modo a prevenir 1,80 mm
toda a absoro ou perda de humidade da amostra. Salvo 1,70 mm 12 10
indicao em contrrio, a tamisao analtica geralmente 1,60 mm
efectuada humidade ambiente. Qualquer condio especial 1,40 mm 1,40 mm 1,40 mm 14 1400 1400 12
aplicada a um determinado produto deve ser especificada na 1,25 mm
monografia correspondente. 1,18 mm 16 14
1,12 mm
Princpio da tamisao analtica. Os tamises analticos so 1,00 mm 1,00 mm 1,00 mm 18 1000 1000 16
constitudos por uma rede de tecido com aberturas (malhas) 900 m
de forma ligeiramente quadrada. Esta rede vedada por 850 m 20 18
um cilindro aberto.O princpio do mtodo o seguinte: 800 m
os tamises so empilhados uns sobre os outros por ordem 710 m 710 m 710 m 25 710 710 22
decrescente de malha e a amostra do p colocada no tamis 630 m
superior; aps agitao da coluna de tamises durante um 600 m 30 26
perodo indicado, pesa-se a quantidade da amostra retida 560 m
500 m 500 m 500 m 35 500 500 30
em cada tamis. O ensaio indica a percentagem em massa de
450 m
partculas compreendidas em cada intervalo granulomtrico.
425 m 40 36
Este mtodo de estimativa da distribuio granulomtrica de 400 m
um p de composio homognea est geralmente adaptado 335 m 335 m 335 m 45 355 355 42
aos produtos com, pelo menos, 80 por cento de partculas de 315 m
tamanho superior a 75 m. O parmetro dimensional que 300 m 50 50
intervm na determinao da distribuio granulomtrica 280 m
250 m 250 m 250 m 60 250 250 60
o comprimento do lado da abertura quadrada mais pequena
224 m
que deixa passar a partcula. 212 m 70 70
200 m
180 m 180 m 180 m 80 180 180 83
TAMISES ANALTICOS 160 m
150 m 100 100
Os tamises analticos apropriados aos ensaios de farmacopeia 140 m
so conformes srie de tamises normalizados como os 125 m 125 m 125 m 120 125 125 119
especificados na edio mais recente da norma ISO 1: Tamis 112 m
de controlo Exigncias tcnicas e verificaes Parte 1: 106 m 140 140
tamis de controlo em tecidos metlicos (ver tabela 1). Salvo 100 m
especificao contrria na monografia, use os tamises ISO 90 m 90 m 90 m 170 90 90 166
assinalados na coluna Dimenses principais da tabela 1 que 80 m
so recomendados na regio considerada. 75 m 200 200
71 m
TABELA 1 63 m 63 m 63 m 230 63 63 235
Abertura nominal ISO Tamis Tamis USP Tamis Tamis 56 m
Dimenses Dimenses US recomendado Europeu Japons 53 m 270 282
principais suplementares N. (mesh) N. N. 50 m
R 20/3 R20 R40/3 45 m 45 m 45 m 325 45 45 330
11,20 mm 11,20 mm 11,20 mm 11 200 40 m
10,00 mm 38 m 38 391
9,50 mm
9,00 mm
8,00 mm 8,00 mm 8,00 mm
7,10 mm Os tamises so escolhidos de modo a servir o conjunto da
6,70 mm extenso granulomtrica da amostra. recomendado
_ usar
6,30 mm uma srie de tamises com uma progresso de 2 para a rea
5,60 mm 5,60 mm 5,60 mm 5600 3,5
5,00 mm da abertura de malha. So dispostos por ordem de malha
4,75 mm 4 crescente sendo o mais baixo o de malha mais fina e o do
4,50 mm topo o de malha mais larga. A dimenso da malha expressa
4,00 mm 4,00 mm 4,00 mm 5 4000 4000 4,7 em milmetros ou micrmetros (Nota: os valores em mesh
3,35 mm
so indicados na tabela com o propsito de converso).

Os tamises so de ao inoxidvel ou, na falta deste, de lato que usam uma agitao mecnica ou electromagntica que
ou de outro material apropriado. podem induzir um movimento oscilatrio vertical ou um
movimento circular horizontal, ou a aplicao de choques
A calibrao e a recalibrao dos tamises analticos so
mecnicos que podem ser combinados com um movimento
efectuadas conforme as especificaes da edio mais recente
circular horizontal. Tambm possvel a conduo das
da norma ISO 3310-1. Antes da utilizao, conveniente
partculas atravs de uma corrente forada de ar. E necessrio
proceder a um exame visual cuidadoso a fim de detectar
indicar nos resultados o mtodo de agitao usado bem como
2. Mtodos
eventuais deformaes ou ruturas, principalmente nas juntas

Analticos
os parmetros aplicados (se so variveis), dado que a anlise

da rede do tecido.
granulomtrica e a determinao do ponto final indicam
Os tamises podem ser calibrados por processos pticos resultados diferentes segundo as condies de agitao e
procurando estimar o tamanho mdio e a variao das tais diferenas podem ser suficientes para se obterem falsos
aberturas. Podem tambm ser usadas esferas padro de vidro, resultados em certas circunstncias.
para avaliar a malha efectiva dos tamises entre 212 m e
850 m. Salvo indicao em contrrio na monografia, a Determinao do ponto final. O ponto final da anlise por
anlise por tamisao efectuada temperatura ambiente tamisao atingido quando a massa retida em cada tamis
controlada e nas condies de humidade relativa ambiente. no varia mais do que 5 por cento ou cerca de 0,1 g (10
Limpeza dos tamises. Para limpar os tamises, recomendado por cento para os tamises de 76 mm) em relao ao valor
usar exclusivamente um jacto de ar a baixa presso ou em previamente determinado para esse tamis. Se, para um dado
corrente de vapor. Se ainda assim algumas aberturas ficarem tamis, o resduo representa menos de 5 por cento da massa
obstrudas, podem escovar-se com cuidado. total da amostra, o ponto final para esse tamis corresponder
a uma variao de massa inferior ou igual a 20 por cento da
Amostra para ensaio. Se a massa da amostra para ensaio no massa previamente determinada.
est indicada na monografia da substncia, use uma amostra Se, para um dado tamis, o resduo representa mais de 50 por
compreendida entre 25 g e 100 g consoante a massa volmica cento da massa total da amostra, excepto se for indicado na
da substncia, para tamises de 200 mm de dimetro. A monografia, convm repetir o ensaio com adio coluna
amostra ser da ordem de 1/7 da correspondente ao tamis de de tamises, de um tamis de malha intermdia compreendida
200 mm, para os tamises de 76 mm de dimetro. Determine entre o tamis em causa e o tamis imediatamente superior da
a massa ptima da amostra, procedendo tamisao com srie inicial, ou seja, o tamis da srie 150 que no foi includo
agitador mecnico de vrias amostras pesadas (por exemplo de incio na coluna.
25 g, 50 g e 100 g), durante o mesmo perodo de tempo
(Nota: se os resultados obtidos so semelhantes para as
amostras de 25 g e de 50 g, mas para a de 100 g passa uma MTODOS DE TAMISAO
menor percentagem atravs do tamis de malha inferior,
ento esta amostra de 100 g demasiada). Quando s for Agitao mecnica (tamisao a seco). Pese cada tamis com
possvel usar amostras de 10 g a 25 g, podem usar-se tamises a aproximao de 0,1 g. Coloque uma certa massa da amostra
de dimetro inferior mas da mesma malha; no entanto, no tamis do topo (o mais grosseiro) e coloque a tampa.
preciso voltar a determinar o ponto final do ensaio. Pode Agite a coluna de tamises durante 5 min, depois separe com
ser necessrio o emprego de amostras de massa inferior cuidado cada tamis, sem perder p. Pese de novo e determine
(por exemplo, at 5 g). Para os produtos com partculas de a massa do resduo de cada tamis. Determine tambm a
baixa densidade aparente, ou principalmente constitudos massa de resduo encontrado na base. Volte a formar a coluna
por grandes partculas de forma isodiamtrica, pode ser de tamises e agite durante 5 min, depois separe e pese cada
necessrio usar amostras inferiores a 5 g para um dimetro tamis como anteriormente. Repita esta operao tantas vezes
de tamis de 200 mm, a fim de evitar a colmatagem excessiva quantas as necessrias at ao ponto final (ver Determinao
do tamis. O problema da colmatagem das aberturas do tamis do ponto final em Tamises Analticos). Depois de terminado o
geralmente um dos aspectos a considerar na validao de ensaio, junte as massas obtidas. A perda total da amostra no
um mtodo particular de anlise por tamisao. superior a 5 por cento da massa da amostra inicial.
Se o produto a analisar sensvel s variaes de humidade Repita o ensaio com uma nova amostra, mas use a tcnica
e tende a absorver ou a perder quantidades considerveis uma s vez durante um perodo igual ao somatrio dos
de gua, o ensaio deve ser conduzido em ambiente tempos das fases de agitao anteriores. Verifique que este
convenientemente controlado. Do mesmo modo, se o perodo de tamisao satisfaz os critrios especificados
produto tem tendncia a produzir electricidade esttica, na determinao do ponto final. Quando este ponto final
necessrio acompanhar com ateno o decorrer do ensaio por validado para uma determinada substncia, as anlises
forma a assegurar que a anlise no afectada. Este ltimo posteriores podem ser efectuadas num nico perodo com
efeito pode ser combatido pela adio de um agente um tempo de agitao fixo, sob reserva de que a distribuio
anti-esttico (tal como o dixido de silcio coloidal e/ou o granulomtrica se situa dentro dos limites da variao
xido de alumnio) a 0,5 por cento m/m. Se for impossvel normal.
eliminar estes efeitos indesejveis, convm recorrer a outro
mtodo de anlise granulomtrica. Se as partculas retidas em um ou mais tamises so
agregados de partculas, pouco provvel que a tamisao
Mtodos de agitao. Existem no mercado diferentes mecnica a seco permita obter uma boa reprodutibilidade;
sistemas de agitao de tamises e de p podendo ser usados necessrio recorrer a outro mtodo de anlise de distribuio
para a tamisao analtica. Contudo, os diversos mtodos de granulomtrica.
agitao podem conduzir a diferentes resultados nas anlises
por tamisao e determinaes do ponto final, porquanto o Mtodos por corrente forada de ar (tamisadores por jacto
tipo e a amplitude das foras exercidas sobre as partculas de ar e por ultra-sons). Existem no comrcio diferentes
individualmente, no so as mesmas. Existem mtodos tipos de tamises que utilizam a corrente forada de ar. Um

2.9.40. Uniformidade de dosagem das formas farmacuticas unitrias
destes sistemas que funciona com um tamis de cada vez, da quantidade de substncia activa. Por consequncia, salvo
chamado tamisao por jacto de ar. Usa o mesmo mtodo que indicao em contrrio da Farmacopeia, se a preparao
foi descrito na tamisao a seco mas o sistema de agitao unidose contiver vrias substncias activas, as exigncias do
mecnica substitudo por um jacto de ar normalizado. A presente captulo aplicam-se individualmente a cada uma
determinao da distribuio granulomtrica necessita de delas.
vrias determinaes sequenciais em diferentes tamises, A uniformidade das preparaes unidose pode ser verificada
comeando pelo tamis mais fino. Por vezes, na tamisao por
2. Mtodos
por 2 mtodos: a uniformidade de teor e a variao da massa
Analticos
jacto de ar usam-se tamises mais finos do que os utilizados (ver o quadro 1).
na tamisao a seco clssica. Este mtodo apropriado para
os casos onde somente se determina a fraco do tamanho O ensaio de uniformidade de teor das preparaes unidose
superior ou inferior a um dado valor. assenta no doseamento individual da(s) substncia(s)
activa (s) num certo nmero de unidades para determinar
Um mtodo semelhante usa um empilhamento de tamises se estes teores individuais esto compreendidos dentro
onde a amostra arrastada por uma coluna de ar submetida dos limites estabelecidos. Este mtodo pode aplicar-se em
a oscilaes verticais que levantam a amostra e depois a todos os casos.
projectam contra as malhas do tamis a uma determinada
frequncia. Neste mtodo pode ser necessrio usar amostras O ensaio de variao da massa aplicvel s formas farmacu-
somente de 5 g. ticas seguintes:
Estes dois mtodos podem ser teis para a anlise de ps ou (1) solues contidas em recipientes unidose ou cpsulas de
de granulados quando o mtodo da tamisao mecnica se gelatina mole,
mostra incapaz de fornecer bons resultados. (2) preparaes slidas (compreendendo ps, granulados e
So todavia muito condicionados pela disperso do p no preparaes slidas estreis) acondicionadas em recipientes
fluxo de ar. Esta condio pode ser difcil de executar quando unidose e no tendo adicionadas substncias activas ou
se usa a gama inferior de tamises (menor que 75 m), ou as inactivas,
partculas tendem a ser mais coesivas e principalmente se (3) preparaes slidas (compreendendo preparaes
a substncia tem tendncia a ganhar electricidade esttica. estreis), acondicionadas em recipientes unidose e tendo ou
Por estas diferentes razes, a determinao do ponto final no substncias activas ou inactivas adicionadas, preparadas
particularmente crtica e muito importante verificar que a a partir de solues verdadeiras que foram posteriormente
fraco mais grosseira constituda por partculas separadas liofilizadas no recipiente final e cujo rtulo especifica que
e no por agregados. foram assim preparadas,
(4) as cpsulas de gelatina dura, os comprimidos no
INTERPRETAO revestidos e os comprimidos revestidos por pelcula que
contm, pelo menos, 25 mg de uma substncia activa
O conjunto de dados deve compreender a massa da amostra, representando, pelo menos, 25 por cento, em massa, da
o tempo total da tamisao, uma descrio precisa do mtodo preparao unidose ou, no caso das cpsulas de gelatina
dura, do contedo da cpsula; todavia, a uniformidade das
usado e os valores correspondentes a todos os parmetros
outras substncias activas presentes em menor proporo
variveis e a massa recolhida em todos os tamises e na
reportada s exigncias da uniformidade de teor.
base. Pode ser conveniente converter estes dados brutos na
distribuio (em massa) acumulada e, se for opo exprimir O uso do ensaio de uniformidade de teor exigido para todas
a distribuio em termos de massa acumulada por tamanhos as formas farmacuticas que no satisfaam s condies de
(somatrio da massa das partculas de tamanho inferior a um aplicao do ensaio de variao de massa especificado mais
dado valor), necessrio integrar o tamis que deixa passar adiante. Entretanto, para os produtos que se situem abaixo do
todas as partculas. A anlise no vlida se o resduo obtido limite de 25 mg/25 por cento, a verificao da uniformidade
num dos tamises for composto por agregados constitudos no pode ser efectuada pelo ensaio de variao de massa de
decurso da tamisao. preferncia ao ensaio de uniformidade de teor com a seguinte
condio: o desvio padro relativo (DPR) da concentrao
da substncia activa na preparao unitria final no
2.9.40. UNIFORMIDADE DE DOSAGEM superior a 2 por cento, de acordo com os dados obtidos
quando da validao do procedimento e do desenvolvimento
DAS FORMAS FARMACUTICAS e sob reserva de aprovao desta substituio pela
UNITRIAS Autoridade competente. O DPR da concentrao o DPR
da concentrao por unidade de dose (m/m ou m/V) que
Para que seja assegurada a uniformidade das preparaes igual ao resultado do doseamento efectuado em cada unidade
unidose, cada unidade de um lote deve apresentar um teor referido massa individual da unidade. A expresso para o
em substncia activa compreendido num intervalo estreito clculo do DPR est includa no quadro 2.
em relao ao valor indicado no rtulo. As preparaes
unidose so definidas como formas farmacuticas contendo,
UNIFORMIDADE DE TEOR
por unidade, uma dose nica ou uma fraco de dose de uma
substncia activa. As especificaes de uniformidade das
Tome, no mnimo, 30 unidades e proceda como indicado
preparaes unidose no se aplicam s suspenses, emulses
adiante para a forma farmacutica considerada. Se for
ou geles, acondicionados em recipientes unidose, que so
utilizado um processo diferente para o doseamento da
destinados a serem administrados por via cutnea.
amostra e para o ensaio de uniformidade de teor, pode ser
A uniformidade de uma preparao unidose definida necessrio estabelecer um factor de correco a aplicar aos
como o grau de uniformidade, no conjunto das unidades, resultados deste ltimo.

QUADRO 1 Aplicao s diferentes formas farmacuticas dos ensaios de uniformidade de teor (UT) e de variao de massa (VM)
Forma farmacutica Tipo Sub-tipo Quantidade e proporo da substncia activa
25 mg e 25 < 25 mg ou < 25
por cento por cento
Comprimidos no revestidos VM UT
2. Mtodos
Analticos
revestidos por pelcula VM UT

outros UT UT
Cpsulas gelatina dura VM UT
gelatina mole suspenses, emulses, geles UT UT
solues VM VM
Preparaes slidas em recipientes

unidose mono-composto VM VM
multi-composto solues liofilizadas no recipiente final VM VM
outras UT UT
Solues em recipientes unidose VM VM
Outras UT UT
Formas slidas. Doseie individualmente 10 unidades por um subtraindo a massa do invlucro da massa bruta da cpsula.
mtodo de anlise apropriado. Calcule o valor de aceitao Calcule o teor em substncia activa do contedo de cada
(ver quadro 2). cpsula a partir da massa individual do contedo das cpsulas e
do resultado do doseamento. Calcule o valor de aceitao.
Formas lquidas. Doseie individualmente 10 unidades por
um mtodo de anlise apropriado. Efectue o doseamento Cpsulas de gelatina mole. Pese individualmente com
numa quantidade de amostra, bem misturada, que exactido 10 cpsulas, tendo o cuidado de preservar a
extrada de um recipiente individual nas condies normais identidade de cada cpsula. Em seguida abra as cpsulas com
de utilizao. Exprima os resultados em termos de dose um instrumento apropriado, limpo e seco, tipo tesoura ou
libertada. Calcule o valor de aceitao (ver quadro 2). lmina de barbear e esvazie o seu contedo, lavando com
um solvente apropriado. Deixe evaporar-se temperatura
Clculo do valor de aceitao. ambiente, durante 30 min, o solvente retido nos invlucros,
tomando as precaues necessrias para evitar qualquer
Calcule o valor de aceitao (VA) usando a frmula: perda ou absoro de humidade. Pese individualmente os
invlucros e calcule a massa do contedo. Calcule o teor em
M X ks substncia activa do contedo de cada cpsula a partir da
massa individual do contedo das cpsulas e do resultado do
cujos termos se acham definidos no quadro 2. doseamento. Calcule o valor de aceitao.
Outras formas slidas alm dos comprimidos e das

VARIAO DE MASSA
cpsulas. Proceda como indicado para as cpsulas de gelatina
dura tratando cada unidade como prescrito. Calcule o valor
Efectue um doseamento da(s) substncia(s) activa(s)
de aceitao.
numa amostra representativa do lote por um mtodo de
anlise apropriado. O valor obtido constitui o resultado
A, expresso em percentagem do valor indicado no rtulo Formas lquidas. Pese individualmente com exactido a
(ver Clculo do valor de aceitao). A concentrao (massa quantidade de lquido extrada de 10 recipientes nas condies
de substncia activa em relao massa da unidade) normais de utilizao. Se necessrio, calcule o volume
supostamente uniforme. Tome, no mnimo, 30 unidades da equivalente aps ter determinado a massa volmica. Calcule
amostra e proceda como indicado neste texto para a forma o teor em substncia activa do contedo de cada recipiente a
farmacutica considerada. partir da massa individual do contedo dos recipientes e do
resultado do doseamento. Calcule o valor de aceitao.
Comprimidos no revestidos ou revestidos por pelcula. Pese
individualmente com exactido 10 comprimidos. Calcule o Clculo do valor de aceitao. Calcule o valor de aceitao
teor em substncia activa de cada comprimido, expresso em (VA) como indicado no ensaio de uniformidade de teor, mas
percentagem do valor indicado no rtulo, a partir da massa substituindo os teores individuais das unidades pelos teores
individual dos comprimidos e do resultado do doseamento. individuais estimados, definidos do seguinte modo:
Calcule o valor de aceitao. x1, x2, ..., xn = teor individual estimado das unidades examinadas,
sendo
Cpsulas de gelatina dura. Pese individualmente com
A
exactido 10 cpsulas, tendo o cuidado de preservar a xi wi
identidade de cada cpsula. Esvazie cada cpsula por um meio W
apropriado. Pese individualmente com exactido os invlucros
vazios e calcule a massa do contedo de cada cpsula w1, w2, ..., wn= massa individual das unidades examinadas,

A = teor em substncia activa, em percentagem do valor CRITRlOS

indicado no rtulo, obtido por um mtodo de anlise
Salvo indicao em contrrio, aplique os critrios seguintes:
apropriado,
Formas slidas e formas lquidas. As exigncias de
W = mdia das massas individuais (w1, w2, ..., wn). uniformidade ficam satisfeitas se o valor de aceitao das 10
2. Mtodos
Analticos

2.9.41. Friabilidade dos granulados e dos esferides
primeiras unidades examinadas inferior ou igual a L1. Se MTODO A

for superior a L1, efectue o ensaio nas 20 unidades seguintes
e calcule o valor de aceitao. As exigncias de uniformidade Aparelhagem (aparelho de leito flutuante). O aparelho
ficam satisfeitas se o valor de aceitao final das 30 unidades (ver a figura 1) composto por um tubo de vidro (A) de
igual ou inferior a L1 e se nenhum teor individual por forma cilndrica, cnica na sua parte inferior. fechado na
unidade inferior a (1-L2 0,01)M ou superior a extremidade superior por um tamis de 500 pm de abertura de
(1 + L2 0,01)M no clculo do valor de aceitao no ensaio malha ou um outro tamis apropriado que serve de tampa (B).
2. Mtodos
Analticos
de uniformidade de teor ou de variao de massa. Salvo A extremidade cnica ligada a um tubo de vidro em
indicao em contrrio, L1 igual a 15,0 e L2 igual a 25,0. U (C) que possvel destacar para retirar os granulados ou os
esferides. O tubo em U ligado a uma juno em T (D) que
tem uma das entradas ligada por um tubo de silicone a um
2.9.41. FRIABILIDADE DOS manmetro que permite regular o dbito de ar comprimido
GRANULADOS E DOS ESFERIDES (utilize ar comprimido conforme com as exigncias de teor
em gua da monografia Ar medicinal); a outra entrada
Este captulo descreve 2 mtodos de determinao da ligada por um tubo de silicone a um debitmetro de
friabiidade dos granulados e dos esferides utilizveis derivao (E) (0,10-1,00 m3.h-1).
no decurso dos estudos de desenvolvimento. Reconhece-
se, entretanto, que podem ser utilizados outros mtodos Mtodo. Em geral, o mtodo seguinte conveniente. Elimine
equivalentes. as partculas finas por tamisao (tamis com 710 m de
Este ensaio destinado a determinar, em condies definidas, abertura de malha ou outro tamis apropriado). Introduza
a friabilidade dos granulados e dos esferides. A friabilidade cerca de 8,0 g (m1) da amostra no tubo A. Feche com a tampa
definida como uma reduo da massa dos granulados ou B. Ajuste o dbito do ar comprimido para 0,45 m3.h-1. Ao
dos esferides ou a formao de fragmentos de granulados fim de 15 mm, retire a amostra desligando o tubo em U e
e de esferides que sucedem quando os granulados ou os pese-a de novo (m2). Examine 3 tomadas de ensaio e calcule
esferides so submetidos a fenmenos mecnicos durante a a mdia dos valores obtidos. recomendvel pulverizar um
manipulao (choque, vibrao, fluidificao, etc.). A abraso, agente anti-esttico na parede interna da aparelho cada 3
a ruptura ou a deformao so exemplos de modificaes determinaes de modo a impedir a formao de electricidade
apresentadas pelos granulados ou os esferides. esttica.
Figura 1 - Aparelho de leito flutuante

2.9.42. Ensaio de dissoluo das formas slidas lipfilas
2. Mtodos
Analticos
Recipiente
de vidro
Tempo Frequncia
Recipiente de vidro de 105 ml, com
49,0 mm de dimetro interno e
85,0 mm de altura, munido de uma
cpsula de quarto de volta
FIGURA 2 - Aparelho oscilante
Perda por secagem. Salvo indicao em contrrio, seque (m2). Examine 3 tomadas de ensaio e calcule a mdia dos
na estufa a 105 C. Podem igualmente ser utilizadas outras valores obtidos.
condies de secagem descritas no mtodo geral 2.2.32.
Clculos Perda por secagem. Salvo indicao em contrrio, seque
m1(100 T1)m2 (100T2) na estufa a 105C. Podem igualmente ser utilizadas outras
F= 100 condies de secagem descritas no mtodo 2.2.32.
m1
Clculos
F = friabilidade,
m1(100 T1)m2 (100T2)
F= 100
T1 = perda por secagem antes do ensaio, em percentagem (mdia de m1
2 determinaes),
T2 = perda por secagem aps o ensaio, em percentagem (mdia de 2 F = friabilidade,
determinaes),
T1 = perda por secagem antes do ensaio, em percentagem (mdia de
m1 = massa da amostra antes do ensaio, em gramas,
2 determinaes),
m2 = massa da amostra aps o ensaio, em gramas.
T2 = perda por secagem aps o ensaio, em percentagem (mdia de 2
determinaes),
MTODO B
m1 = massa da amostra antes do ensaio, em gramas,
Aparelhagem (aparelho oscilante). O aparelho (ver a figura
2) composto por um recipiente de vidro de 105 ml, no qual m2 = massa da amostra aps o ensaio, em gramas.
colocada a amostra. O recipiente submetido a oscilaes
horizontais cuja frequncia e durao podem variar em
contnuo. A frequncia pode ser ajustada numa escala de 2.9.42. ENSAIO DE DISSOLUO DAS
0-400 oscilaes/min. A durao pode ser regulada num valor FORMAS SLIDAS LIPFILAS
entre 0 e 9999 s.
APARELHAGEM
Mtodo. Em geral, o mtodo seguinte conveniente. Elimine
as partculas finas por tamisao (tamis com 355 m O aparelho (ver Fig. 1) constitudo por:
de abertura de malha ou outro tamis apropriado). Para o
recipiente de vidro pese cerca de 10,00 g (m1) da amostra. um reservatrio para o meio de dissoluo,
Instale o recipiente no aparelho. Agite durante 4 min com a uma bomba que faz passar o meio de dissoluo atravs da
frequncia mxima para as amostras duras ou durante 2 min a clula de fluxo contnuo,
uma frequncia mais baixa (por exemplo, 140 oscilaes/min)
para as amostras moles. Tamise (355 m ou o mesmo tamis uma clula de fluxo contnuo (Fig. 2) mais especialmente
que foi usado precedentemente) e pese de novo a amostra destinada s formas slidas lipfilas como os supositrios e as

2.9.43. Dissoluo aparente
cpsulas moles. composta por 3 unidades transparentes Filtre as colheitas e proceda anlise de acordo com as
que se adaptam umas s outras. A unidade inferior (1) indicaes dadas. O filtro, de uma porosidade apropriada,
constituda por 2 cmaras adjacentes que comunicam inerte, no retm de modo significativo a substncia activa
entre si. contida na soluo e no contm nenhuma substncia
extravel pelo meio de dissoluo que infuencie os mtodos
O meio de dissoluo atravessa a cmara A em fluxo
analticos prescritos.
ascendente e depois a cmara B em fluxo descendente. O
2. Mtodos
fluxo sai da cmara B por um orifcio de pequeno dimetro e A quantidade de substncia activa dissolvida num tempo
Analticos
sobe para o conjunto de filtrao. A unidade intermdia (2) prescrito expressa em percentagem do teor indicado no
forma uma cavidade destinada a reter os excipientes lipfilos rtulo.
que sobrenadam superfcie do meio de dissoluo. Uma
grelha metlica faz de filtro grosseiro. A unidade superior (3)
comporta um suporte que pode receber filtros de papel, de
fibra de vidro ou de celulose.
Um banho de gua termostatado que permite manter a
temperatura do meio de dissoluo a 37 0,5 C.
Meio de dissoluo. Se o meio de dissoluo tamponado,

ajuste o pH para 0,05 unidades do valor prescrito. Se
no meio se dissolvem gases, estes podem formar bolhas
susceptveis de falsear os resultados; elimine-os antes do
ensaio.
FIGURA 1 Aparelho de fluxo contnuo

FIGURA 2 Clula de fluxo contnuo
MTODO (dimenses em milmetros)
Coloque 1 unidade da amostra na cmara A. Feche a 2.9.43. DISSOLUO APARENTE

clula por meio do conjunto de filtrao, previamente
montado. Antes do incio do ensaio, deve retirar-se o ar Este mtodo geralmente usado para determinar a
da cmara A por intermdio de um pequeno orifcio que velocidade de dissoluo aparente de substncias slidas
comunica com o conjunto de filtrao. Aquea o meio de puras. Pode ser tambm usado para a determinao
dissoluo a uma temperatura apropriada tendo em conta da velocidade de dissoluo de substncias activas em
o ponto de fuso da amostra. Por meio de uma bomba preparaes apresentadas na forma de ps ou de granulados.
adequada introduza o meio de dissoluo aquecido
pela parte inferior da clula de modo a obter um fluxo
contnuo apropriado, em circuito aberto ou fechado, APARELHAGEM
cujo dbito controlado com uma exactido de 5 por
cento. Quando o meio de dissoluo atinge o ponto de Todas as partes do aparelho que podem entrar em
ligao entre as duas cmaras adjacentes, o ar contido contacto com a amostra ou com o lquido de dissoluo
na cmara B empurrado pelo tubo capilar e substitudo so quimicamente inertes, no absorvem a substncia a
pelo meio de dissoluo. A amostra reparte-se no meio de analisar, no reagem na sua presena nem influenciam o
dissoluo em funo das suas propriedades fsico- seu comportamento. Nenhum elemento do aparelho nem do
-qumicas. meio em que colocado exerce movimento de agitao ou de
vibrao, a no ser o sistema de fluxo contnuo.
Em casos excepcionais e justificados, para os supositrios de
grande volume, o ensaio pode ser efectuado num fragmento prefervel usar um aparelho que permita a observao da
representativo. amostra.
O aparelho (ver figura 1) constitudo por:
AMOSTRAGEM E AVALIAO um reservatrio para o lquido de dissoluo,
A colheita faz-se sempre sada da clula quer o circuito seja uma bomba que faz circular o lquido de dissoluo atravs
aberto ou fechado. da clula de fluxo contnuo,

2. Mtodos
Analticos
A. reservatrio para o lquido de dissoluo B. bomba C. clula de fluxo contnuo termostatada e filtro D. recipientes para as solues a analisar
FIGURA 1 Aparelho de fluxo contnuo
uma clula de fluxo contnuo, de preferncia em material sobre a unidade inferior. Introduza a amostra no dispositivo
transparente, montada verticalmente e munida de um de filtrao e pese-o dentro da clula. Coloque o tamis do
dispositivo de filtrao para a reteno das partculas no dispositivo com o cone voltado para cima sobre a amostra
dissolvidas, e posicione a argola no meio da unidade intermdia.
Coloque de novo o tamis (abertura de malha 0,2 mm) e um
um banho de gua termostatado que permite manter o
filtro apropriado na parte superior da unidade intermdia.
lquido de dissoluo temperatura escolhida (geralmente
Coloque a unidade superior. Aquea o lquido de dissoluo
a 37 0,5C).
temperatura escolhida. Por meio de uma bomba adequada,
A clula de fluxo contnuo (ver figura 2) constituda por 3 introduza o lquido de dissoluo aquecido atravs da
unidades que se adaptam umas s outras. A unidade inferior parte inferior da clula a fim de obter um fluxo contnuo
constituda por um sistema de grelhas e de filtros sobre os apropriado, em circuito aberto ou fechado, cujo dbito
quais se coloca a amostra. A unidade intermdia que assenta controlado com uma preciso de 5 por cento.
na unidade inferior compreende um dispositivo que permite
a tamisao da amostra quando passa o lquido de dissoluo.
Este dispositivo constitudo por 2 partes: um tamis de
forma cnica que colocado sobre a amostra e uma argola
colocada no meio da unidade intermdia destinada a segurar
o tamis a partir da chegada do lquido de dissoluo. Um
segundo conjunto de filtrao (grelha e filtro) colocado na
parte superior da unidade intermdia antes de ser colocada a
unidade superior atravs da qual o lquido de dissoluo sai
da clula.
LQUIDO DE DISSOLUO
Se o lquido de dissoluo for tamponado, ajuste o seu pH

com a aproximao de 0,05 unidades. Se houver gases
dissolvidos no lquido, podendo formar bolhas susceptveis de
falsear significativamente os resultados, elimine-os antes do
ensaio.
MTODO
Coloque uma esfera de 5 0,5 mm de dimetro no fundo

do cone da unidade inferior e, de seguida, esferas de vidro
de tamanho apropriado, de preferncia de 1 0,1 mm de A. unidade inferior C. argola E. unidade mediana
dimetro. Coloque um tamis (abertura de malha 0,2 mm), B. tamis D. dispositivo F. unidade superior
um filtro apropriado e um segundo tamis na unidade
FIGURA 2 Clula de fluxo contnuo
inferior. Pese o conjunto. Coloque a unidade intermdia

AMOSTRAGEM AVALIAO DOS RESULTADOS
A tomada de ensaio do lquido de dissoluo faz-se sempre Quando a anlise realizada com vista libertao de um
sada da clula, quer o circuito seja aberto, quer seja fechado. lote, efectuado um nmero de ensaios apropriado. Os
Filtre imediatamente as tomadas de ensaio. O filtro, de resultados so expressos como se indica:
porosidade apropriada, inerte, no retm significativamente a quantidade de substncia dissolvida por unidade de tempo
2. Mtodos
Analticos
as substncias contidas na soluo e no contm nenhuma (se a dissoluo se faz de de modo linear),
substncia extravel para o lquido de dissoluo que possa
influenciar os mtodos analticos prescritos. Proceda a durao necessria para a dissoluo da amostra e para as
anlise do filtrado segundo as indicaes dadas. etapas intermdias apropriadas.

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MENU 9.

0 CAPTULOS GERAIS MTODOS ANALTICOS (NDICE)

14 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 15

16 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 17

2.1.3. Lmpadas de radiao ultravioleta para anlise

18 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.1.3. Lmpadas de radiao ultravioleta para anlise

2.1. APARELHOS 2.1.2. QUADRO DE COMPARAO DOS

O termo gotas designa gotas ditas normais debitadas por

< 2,5 filtrao bacteriolgica

2.1.3. LMPADAS DE RADIAO

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 19

2.1.6. Tubos detectores de gs

2.1.4. TAMISES Dimetro do fio d: os dimetros dos fios dados no quadro

2.1.6. TUBOS DETECTORES DE GS

QUADRO 2 Valores em micrmetros

Tolerncia das aberturas Dimetro do fio

11 200 770 350 560 2500 2900 2100

20 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.1.6. Tubos detectores de gs

Tubo detector de monxido de carbono. Tubo de vidro

Tubo detector de sulfureto de hidrognio. Tubo de vidro

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 21

22 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.2. MTODOS FSICOS

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 23

24 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.2.1. Limpidez e grau de opalescncia dos lquidos

2.2. MTODOS FSICOS respectivamente, de 3 UNT, 6 UNT, 18 UNT e 30 UNT. Existem

QUADRO 1 A Para a avaliao da limpidez e da opalescncia a tcnica

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 25

2.2.1. Limpidez e grau de opalescncia dos lquidos

NEFELOMETRIA ratio a influncia da luz parasita torna-se negligencivel.

obtidos. As suspenses I-IV da Ph. Eur. podem ser utilizadas

transmitido, em parte absorvido e em parte difundido para a calibrao dos instrumentos.

26 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.2.2. Grau de colorao dos lquidos

partir de 100 UTN; o instrumento calibrado e regulado REAGENTES

MTODO I Soluo azul. Dissolva 63 g de sulfato de cobre R em cerca de

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 27

2.2.3. Determinao potenciomtrica do pH

QUADRO 2 QUADRO 6 Solues de referncia Avd

Soluo Soluo Soluo cido clordrico a Soluo Soluo cido clordrico

Ac (amarela Avd2 15,0 85,0

acastanhada) 2,4 1,0 0,4 6,2 Avd3 8,5 91,5

Solues de referncia utilizadas nos mtodos I e II QUADRO 7 Solues de referncia V

em que E a tenso, expressa em volts, da clula contendo

28 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.2.3. Determinao potenciomtrica do pH

QUADRO 9 Variao do pH das solues tampo em funo da temperatura

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 29

Conserve as solues em recipientes estanques e quimicamente

inertes apropriados, por exemplo, frascos de vidro de tipo I

Determine a densidade ou a massa volmica com o nmero de

Determine as constantes A e B enchendo o tubo do aparelho

30 FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0

2.2.7. Poder rotatrio

Nestes aparelhos, a parte essencial um prisma de ndice de

FARMACOPEIA PORTUGUESA 9.0 31

2.2.9. Viscosidade mtodo do tubo capilar

um cronmetro com uma aproximao de 1/5 de segundo.