2011 /2012

Les techniques utilises pour

obtenir une enzyme ou une
protine partir dune
bactrie
Les mthodes spectrophotomtriques

3me anne LMD microbiologie

Dpartement de microbiologie/
Universit Ferhat Abbas-SETIF

Boussoualim N. 2011 /2012

 Les techniques utilises pour obtenir une enzyme ou une protine partir dune bactrie

L a spectrophotomtrie est une mthode analytique quantitative qui consiste mesurer l'absorbance ou la

densit optique d'une substance chimique donne en solution, et donc sa concentration. Plus cette substance
est concentre plus elle absorbe la lumire.

11.1. Principe du spectrophotomtre

La spectrophotomtrie est trs utilise dans les laboratoires pour identifier ou doser des substances. Les
mesures sont ralises dans:

LUV (160nm<<400nm)
Le visible (400<<800nm)
LInfrarouge (>800nm)

11.2. Spectre dabsorption (balayage de spectre)

Si on place une solution contenant une substance dissoute dans un solvant, dans un spectrophotomtre, et on
mesure labsorbance a diffrente longueurs donde, on va obtenir un graphique des pics des longueurs
donde dfinies. Le maximum dabsorbance correspond (max)

1
 Les techniques utilises pour obtenir une enzyme ou une protine partir dune bactrie

11.3. Labsorbance dans lUV ou Vis

Labsorption dun rayonnement ultraviolet ou visible correspond une interaction des photons avec les
lectrons des couches externes des atomes ou des molcules. La position du maximum dabsorption
correspond la longueur donde de la radiation qui provoque la transition lectronique. Les molcules qui
possdent des doubles liaisons, des triples liaisons, des cycles aromatiques ou des cycles htrocycles
absorbent dans lUV.

11.4. La loi dabsorbance

Un faisceau lumineux monochromatique (une longueur donde fixe) de longueur l et intensit I 0 traverse
une cuve base carre contenant une solution dune substance de concentration C, une distance L
(L=longueur de la cuve).

Si :I0= I, milieu transparent

Si :I0> I, milieu partiellement absorbant
Si :I= 0, milieu opaque (absorption totale)

On dfinit :

La transmittance (T): qui est le pourcentage de transmission T%=I/I0.100

2
 Les techniques utilises pour obtenir une enzyme ou une protine partir dune bactrie

Absorbance (A) ou densit optique (DO) qui reprsente la valeur du logarithme dcimale de linverse
de T:
A=log (1/T) = el. L .C

La loi de Beer Lambert : A = . L .C

A = labsorbance a une longueur l
= coefficient dabsorption molaire (M-1cm-1)
L= trajet optique (cm)
C= concentration de la solution (M)

Remarque : labsorbance na pas dunit

Daprs Beer Lambert, l'absorbance A est fonction de la concentration C de la solution, du coefficient

d'absorption molaire et de la longueur de solution traverser L

Condition de validit de la loi de Beer Lambert : cette loi nest pas valable que dans certaines conditions:

1. le monochromatisme (une seule longueur donde max )

2. Les faibles concentrations (dilues)
3. Temprature stable(e dpends de la Temprature)
4. pH stable
5. Clart du milieu

11.5. Le spectrophotomtre UV-VIS :

Un spectrophotomtre UV-visible est un appareil qui permet de mesurer l'absorbance d'une solution
homogne une longueur d'onde donne ou sur une rgion spectrale donne.

3
 Les techniques utilises pour obtenir une enzyme ou une protine partir dune bactrie

Le spectrophotomtre comprend :

Une source lumineuse

Solide chauff : ce sont des lampes utilisant un filament tungstne, elles fournissent des radiations lumineuses
dans le domaine du visible.
Dcharge dans les gaz rares : Lampes hydrogne ou deutrium, elles fournissent des radiations lumineuses
dans le domaine de lUV

Le monochromateur : un monochromateur form d'un rseau diffractant la lumire de la source. Il permet

de slectionner la longueur d'onde de la lumire qui traversera la solution doser.

La fente dentre : une fente de largeur fixe ou variable pour rgler la bande passante.

La cuve : une cuve transparente dans laquelle on place la solution tudier. Suivant la qualit et la quantit
d'chantillon, il existe diffrentes cuves, gnralement en plastique ou en verre (spectre visible) ou en quartz
(UV).

La cellule photolectrique : une cellule photolectrique, permet la transformation de lnergie lumineuse en

nergie lectrique, le courant produit est trs faible et sera amplifi ultrieurement

Lamplificateur : un dtecteur lectronique amplifie le courant fourni par la cellule photolectrique.

Lenregistreur : Permet de mesurer le courant fourni par lamplificateur, il est gnralement reli un
microordinateur qui permet dafficher les rsultats en pic (balayage de spectre) ou des valeurs fixes des
absorbances.

11.6. Principes des dosages

Mthode de dosage directe

Si la substance doser possde un pic dabsorption caractristique, on mesure labsorbance max et on

calcule directement la concentration par la loi de Beer Lambert(e doit tre connue). Exp: dosage des
protines a une longueur de 280nm
Mthode de dosage indirecte

4
 Les techniques utilises pour obtenir une enzyme ou une protine partir dune bactrie

Ces mthodes sont utilises dans le cas o la substance doser ne possde pas un pic dabsorbance
caractristique (max):

Utilisation dun ractif color

Utilisation dune gamme dtalonnage

Remarque : La lecture au niveau du spectrophotomtre est effectue contre une solution quon appelle
blanc, qui contient tous les constituants du milieu sauf la substance doser(chantillon), pour que
labsorbance soit pour la substance doser.

11.7. Application

Dosage des protines

Dosage des enzymes (Activit enzymatique)