1.

introduccin

El termino cromatografia se acuo en un primer momento por Mikhail Tsweet

para hacer referencia a la separacin de los pigmentos contenidos en extractos
vegetales, conforme estos se filtraban a travs de una columna rellena con un
slido poroso.
En cada uno de los segmentos de color haba definido un pigmento diferente.

Actualmente, el termino de cromatografia se utiliza para todos los procesos en

los que los componentes de una mezcla, disueltos en una fase movil, se van desplazando con diferente velocidad a traves de una
fase estacionaria.

La eficacia de esta tecnica y de la separacionde los componentes de la muestra depende de la correcta eleccin de las fases mvil
y estacionaria. Cada molcula de la mezcla reaccionara de distinta forma con ambas fases en funcin de sus propiedades fsico-
qumicas
Se da una separacin segn la diferente distribucin entre las fases mvil y estacionaria

Segn la IUPAC
Cromatografa es la tcnica o el mtodo de separacin en el cual los componentes de una muestra que se desean separar se
distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es mvil.
La muestra; mezcla que consiste en un conjunto de componentes que se pretenden separar
Los componentes; cada uno de los constituyentes qumicamente puros que forman la muestra (analito)
La fase estacionaria; es la fase que est retenida en un soporte y que logra contener los componentes de la muestra para
separarlos. Puede ser un slido, un gel o un lquido. (En el caso de que sea un lquido estar distribuido sobre un slido,
inmovilizado sobre un slido, o unido qumicamente a un slido)
La fase mvil; es el fluido que se infiltra o atraviesa la fase estacionaria y que disuelve yt ransporta los componentes de la
muestra. ( lquido; eliyente. Gas; gas portador. Fluido supercrtico)
Dos tipos de cromatografa;
- Cromatografa analtica; tiene como principal objetivo determinar la identidad y concentracin de los componentes de una
mezcla
- Cromatografa preparativa; se emplea para purificar grandes cantidades de una especie molecular

2. Clasificacin de la cromatografa;

Dividimos la cromatografa en funcin de varias caractersticas;

1. Estado fsico de la fase mvil
Lquida; cromatografa de lquidos
Gaseosa; cromatografa de gases
Fluidos supercrticos; cromatografa de fluidos supercrticos

2. Mecanismo de separacin de los componentes de la muestra

Solubilidad
Tamao
Carga elctrica
 Hidrofobicidadinteracciones por afinidad biolgica
Interacciones inespecficas.

3. Metodologa para llevar a cabo la cromatografa; depende de la fase estacionaria y del soporte que la contenga
Sobre una superficie plana (silica gel o sobre planos)
En columna

3. Tipos de cromatografa

3.1 cromatografa en papel

Fase mvil; lquida. Es una

cromatografa de lquidos. Es un
disolvente orgnico o una mezclad e
disolventes.
Fase estacionaria; sobre una superficie
plana. Es el agua retenida entre las fibras
de celulosa de una hoja de papel.
El mecanismo de separacin de los
componentes de la muestra se basa en la
solubilidad y el reparto
Esta cromatografa puede darse en
sentido ascendente o descendente. En el
primer caso la fase mvil ascender por
capilaridad, y en el segundo, adems de
la capilaridad, interviene el efecto de la
gravedad.
El soporte suele ser un papel de filtro.
La muestra problema o la mezcla a
separar se deposita en forma de gota,
sobre el papel, antes de sumergir el
extremo de ste en fase mvil. La
mancha se extender despus por
difusin a travs de las fibras de papel.
La aplicacin de nuestra muestra se hace
rozando el papel con una punta de un tubo capilar que contiene la disolucin problema. El disolvente se evaporar quedando
nicamente la muestra.
 En el mismo papel podemos aplicar diferentes muestras problemas, para asegurar una adecuada separacin entre los
respectivos puntos de aplicacin. De esta forma
se pueden establecer comparaciones entre
diferentes muestras.
Desarrollo; El flujo ascendente o descendente
de la fase mvil ser el que alcance los solutos
presentes en dichas zonas, desplazandolos en
mayor o menos medida dependiendo del
particular coeficiente de reparto de cada soluto.
La fase movil sigue ascendiendo hasta que el
frente de avance de la fase mvil est prximo
al extremo superior del papel, momento en el
cual acaba el proceso y se deja secar el papel.
El desarrollo cromatogrfico se lleva a cabo en
el interior de cmaras cerradas, generalmente
de vidrio, en las que se ha generado
previamente una atmsfera saturada de la fase
mvil.
Es muy importante destacar el factor de retraso
(Rf), que se encuentra entre cero y uno, y es caracterstico de cada soluto para una composicin dada de la fase mvil y un
determinado tipo de papel

3.2. Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina es una optimizacin de la

cromatografa en papel. La idea principal es la misma; hacer
avanzar, por capilaridad, una fase mvil, sobre una fase
estacionaria plana, de forma que los solutos de la muestra
aplicada se separen por su Rf.
La fase mvil est en estado lquido y por tanto hablamos de
cromatografa de lquidos
El mecanismo de separacin de los componentes de la
muestra es la hidrofobicidad
La fase estacionaria se encuentra en una superficie plana
El soporte de la fase estacionaria es un slido pulverizado
que se encuentra extendido en una fina capa sobre una
plancha de vidrio, plstico o metal. El slido incluye
habitualmente un agente cementante para lograr la cohesin del conjunto.
Cuando trabajamos con slidos pulverizados, nos aseguramos que la superficie especfica sea muy elevada, y por tanto la
 interfase de contacto entre las fases mvil y estacionaria. Habitualmente trabajamos con slidos pulverizados en los que el
dimetro promedio de las partculas est entre 10 y 45 micrometros para lograr superficies especficas de hasta 400 m2/g.
Se pueden utilizar diversos slidos como soporte;'celulosa,
poliamida, almina o gel de slice.
La estructura quimica d la superficie de las partculas se
caracteriza porque tiene grupos sianoles (SiOH) que
confieren a la slica un carcter fuertemente polar. Esto
posibilita la utilizacin de la slica para la cromatografa de
adsorcin de solutos polares. Para esto hay que eliminar el
agua que est retenida en la slica.
La forma de eliminar el agua es mediante la activacin de
las placas de slica-gel antes de la aplicacin de la muestra.
Esto consiste en someterlas a temperaturas superiores a
100 grados centigrados durante ms de una hora.

El desarrollo cromatogrfico es similar al de la cromatografa en

papel. La nica diferencia es que esta cromatografa se realiza
siempre en sentido ascendente.
Cuando tenemos muestras complejas, en las que con una nica
fase mvil no es posible diferenciar todos los solutos,
utilizaremos una cromatografa bidimensional. Tras emplear una
fase mvil en una direccin, se utiliza otra distina para hacer un
segundo deaarrollo en direccin perpendicular a la del primero.
Cuando utilizamos esta cromatografa con fines preparativos, los
solutos se hande extraer de la capa fina despus del desarrollo cromatogrfico. Para ello se raspa la capa fina donde se
encuentra el soluto que queremos obtener. El polvo obtenido se suspende en el disolvente adecuado para obtener el soluto
embebido en el, y que se disuelva. Despus, mediante una filtracin o centrifugacin, se dispondr d una disolucin del soluto.
Cuando hacemos la cromatografa con fines preparativos, utilizaremos mas volumen a cromatografiar (=200 microlitros) y
trabajamos con capas ms gruesas (2mm). Adems, aplicamos la muestra en bandas.
En este caso, el soluto ha de ser visible para poder extraerlo. Un mtodo sencillo de deteccin es utilizar una fase estacionaria
que contenga un agente fluorescente. Al finalizar la separacin cromatogrfica, se coloca la placa bajo una fuente de luz UV,
observndose como toda ella emite radiacin visible excepto las oosiciones donde se encuentran los solutos. Esas zonas
aparecen oscuras por haberse producido un proceso de desactivacin de fluorescencia, o uno de absorcin de la luz UV por los
solutos. Existen otros mtodos de deteccin inespecficos. Estos mtodos puedens er utilizados en la cromatografa en papel,
excepto el mtodo del cido sulfrico.

3.3 Cromatografa en columna; fundamentos

La fase mvil es lquida y por tanto, hablamos de una cromatografa de lquidos

Las propiedades a partir de las cuales se da la separacinde ls componentes de la muestra son muchas; solubilidad, reparto,
tamao, carga elctrica, hidrofobicidad, interacciones por afinidad biolgica, interacciones especficas
La metodologa que hace referencia a la fase estacionaria y al soporte, en este caso se trata encuna fase estacionaria en
columna! La fase estacionaria constituye el relleno del recipiente cilndrico ( de la columna). El soporte es un recipiente
cilndrico de vidrio, plstico o metal abierto por ambos extremos que se denomina columna.
La columna debe tener una estructura porosa que permita que la fase mvil fluya. El flujo esta propiciado por la accin de la
gravedad o por sistemas de bombeo de alta presin
La esencia de la cromatografa se debe en el contacto entre la fase mvil y estacionaria. Para esto es necesari evitar la
formacin de grietas y acanaladuras en el lecho.
Es necesario que se de una aplicacin zonal de la muestra. En la cromatografa en columna esto se consigue depositando la
disolucin problema sobre la parte superior del lecho cromatogrfico. Una vez aplicada la muestra, se abre la columna por el
extremo opuesto y se deja que la disolucin problema vaya fluyendo hacia el interior del lecho. Antes de que la parte superior
se seque, se aporta una nueva fase mvil, y de estabforma se hace d modo continuado hasta el findel proceso. El paso de la fase
 mvil hasta la salida de los solutos se llama elucin, y el trmino eluido hace referencia a la fase mvil que se recige desde la
aplicacin hasta la salida de todos los solutos. A la fase movil, por tanto, se le llama tambin eluyente.

En su viaje a traves de la fase estacionaria, los solutos no se irn separando cromatogrficamente (nicamente), sino que se
difundirn, por lo qie la zona en la que viaja cada uno se ira ensanchando y sus lmites se irn difuminando.
La distribucin de cada soluto en el eluido de la columna ser de tipo gaussiano. El perfil de elucin, perfil cromatogrfico o
cromatograma es la sucesin de curvas gaussianas que informa sibre la salida de los diferentes solutos.
Para cada soluto, la posicin en el eje de abscisas del correspondiente pico gaussiano, informa sobre el tiempo transcurrido

desde que se aplic la muestra hasta que se produjo la elucin de la columna. Este tiempo se llama tiempo de retencin tR.
 Tiempo de retencin; (tR) tiempo al que se obtiene el mximo de pico de un compuesto de inters. Es el tiempo al que
eluye dicho compuesto
Volumen de retencin o volumen de elucin (VR o Ve); es el volumen de fase mvil que se ha introducido en la
columna en el momento en que se obtiene el mximo de pico de un compuesto de inters
Caudal de la fase mvil (F); volumen/ tiempo , mL/ min

Tiempo de exclusin: (tM o t0) es el tiempo de elucin correspondiente a un compuesto que no interacciona ni queda
retenido por la fase estacionaria.

Volumen de exclusin o volumen vaco; (VM o V0) volumen de elucin para un compuesto no retenido por la fase
estacionaria. Tambin se define como el volumen del lecho ocupado por lanfase mvil ( no ocupado por las partculas
de la fase estacionaria)

Tiempo de retencin ajustado; (t'R) es el tiempo neto que permanece un soluto dado inmvil en la fase estacionaria

Factor de capacidad (k) ; es caracterstico de cada soluto y relaciona el tiempo de retencin ajustado con el tiempo de
exclusin

Factor de separacin o selectividad (alfa) es la relacin entre los factores de capacidad de dos solutos que se pretendn
separar mediante cromatografa.

Retencin relativa; ( ri) es la relacin entre el factor de capacidad o el tiempo de retencin ajustado y los
correspondientes a un compuesto de referencia.

Teora clsica o esttica; considera un sistema esttico en equilibrio, en el cual el soluto recorre la coumna mediante una serie
de equilibrios, cada uno de los cuales se alcanza, en toda su extensin, en un segmento o porcin de la columna, llamado Plato
terico. (Se supone que la columna cromatogrfica esta dividida en una serie o platos tericos, donde se producen un equilibrio
de distribucin del soluto entre la fase mvil y estacionaria). La eficacia de la columna depende de (N) el nmero de platos
tericos. ( Cuanto mayor sea el numero de platos tericos la eficacia de la columna ser inversamente proporcional a la altura
equivalente del plato terico)
El numero de platos tericos para la elucin de un soluto est relacionado con el tiempo de retencin y la desviacin estndar del
pico de elucin de ese soluto

Resolucin cromatogrfica; es un parmetro que permite cuantificar la bondad de la separacin entre dos solutos. La resolucin
(R) para dos componentes de una muestra se define como;
La cromatografa en columna tiene como ibjetivos la optimizacin de la separacin.

Objetivos;

Separar los solutos que se pretende determinar

Poder medir con precisin las reas de cada pico (las areas se relacionan con la concentracin de cada especie)
Minimizarel tiempo de anlisis.

De esta forma logramos aumentar la separacin de las bandas ( aumanta la longitud de la columna, modificar la fase
mvil, la estacionaria, la temperatura...)

Con esto se origina un problema, ya que los picos se ensanchan. Para disminuir el ensanchamiento de los picos se
disminuye el dimetro de la columna, se vara el dimetro de la partcula...
 3.3. Cromatografa de exclusin molecular.

La fase mvil es lquida, es una cromatografa de lquidos

El mecanismo de separacin de los componentes de la muestra es el tamao
La metodologa para llevar a cabo la cromatografa por la fase estacionaria es en columna, y el
soporte esta basado en polmeros fuertemente hidroflicos, que al ser puestos en contacto con
agua. Estos polmeros suelen ser polisacridos.
En un lecho cromatogrfico empaquetado con un soporte hay que considerar no unicamente el
lquido de los intersticios entre las partculas, tambin en el interior de las mismas.
Tambin se denomina cromatografa de filtracin en gel, cromatografa de permeacin en gel,
cromatografa de tamizado molecular y cromatografa de exclusin por tamao.
La mayora de los soportes de esta cromatografa estn basados en polmeros fuertemente
hidroflicos, que una vez estn en contacto con el agua, adquieren un aspecto de gel. Esto es lo
que se denomina la resina. Estos polmeros suelen ser polisacridos o poliacrilamida o mezclas
de ellos.
Las micropartculas en que estn divididos estos soportes son esferas formadas por enrejados
de fibras del polmeri correspondiente, los huecos o poros de estos enrejados tendrn un
tamao determinado por la concentracin de fibras y su grado de entrecruzamiento, en suma,
las micropartculas esfricas son como esponjas.
De esta forma, no hay que considerar que la fase estacionaria es completamente esttica. El
eluyente puede acceder al interior de las micropartculas , ya que, a fin de cuentas, la
composicin de la fase estacionaria y el eluyente es la misma.

Volumen de exclusin o volumen vaco (VM o V0) es tambin el volumen del lecho ocupado por la fase mvil. No es el ocupado
por las partculas de la fase estacionaria.
Volumen interno; (Vi) es el volumen interno de las partculas de gel (fase estacionaria).
Volumen total de lquido (Vt); es el volumen total de lquido contenido en el lecho cromatogrfico
Volumen ocupado por las fibras del polmero (Vg)
Volumen total (Vt): es el volumen del lecho cromatogrfico

Volumen de acceso para un soluto dado; (Vacc); es el volumen interior de las partculas de gel al que puede acceder un analito

Coeficiente de reparto; (Kav); es la proporcin de volumen que resulta accesible a un soluto.

Cuando el soluto es demasiado grande o demasiado pequeo hay unos calores fijos;
- para un soluto de gran tamao que no queda retenido en la columna;

-Para un soluto extremadamente pequeo;

Estimacin de las masas moleculares; en primer lugar se calibra la columna, haciendo una mezcla de solutos de masas
moleculares conocidas y que se encuentran dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna a calibrar. Esta mezcla
conocida proporcionar los volumenes de exclusin de cada uno de los solutos. A partir de estos tres valores ser posible calcular
los respectivos Kav (conocemos V0 y Vt).
La representacin semilogartmica de las masas moleculares de los solutos frente a sus respectivos Kav proporcionar una recta
de calibrado. El resto es sencillo; se interpola la muestra problema, se halla su volumen de exclusin, se determina su Vexclusin
y a partir de el Kav, y se interpola el valor de Kav en la recta de calibrado, con lo que se determina la masa molecular.
Otras aplicaciones de la cromatografa de exclusin molecular;
Separacin de biomolculas que deben mantener su conformacin nativa; gracias a las condiciones suaves de operacin con
que se trabaja.
Criterio de pureza; en una muestra por la aparicin de picos simtricos.
Desalado de muestras; para cambiar un disolvente un determinado analito y separarlo de las sales que lo acompaen.

3.4 Cromatografa de intercambio inico

La fase mvil se encuentra en estado lquido, y es por tanto una cromatografa de lquidos. Es un lquido que anula la
interaccin electrosttica. Hay dos posibilidades; puede establecerse un gradiente de pH
(que cambiar las cargas de las molculas de la muestra) o gradientes inicos
(competencia por los grupos electroflicos)
El mecanismo de separacin de los componentes es mediante la carga elctrica
La metodologa para llevar a cabo la cromatografa es en columna.
En esta cromatografa, la fase estacionaria es slida, y se compone de grupos con cargas
inicas que se unen al soporte, tiene grupos cargados que interaccionan
electrostticamente con iones de signo contrario de la fase mvil. La principal diferencia
entre los distintos intercambiadores de iones ser la naturaleza de sus grupos cargados.
Otra caracterstica muy importante es la naturaleza de la matriz o soporte al cual estn
anclados los grupos. Las matrices pueden ser polmeros sintticos o naturales.
Si los polmeros son sintticos son para la separacin de aminocidos, pptidos, mono u
oligonucletidos. Sirve para eliminar impurezas como cationes metlicos en tampones y
disolventes, impurezas de iones de reactivos. Los biopolmeros se desnaturalizan a causa
de su hidrofobicidad (amberlite, dowex)
Cuando la fase estacionaria se compone de polmeros naturales como las biomolculas,
estos son fuertemente hidroflicos, tienen menos capacidad de intercambio inico que las
resinas y un menos nmero de residuos cargados ( dextranos, agarosa, celulosa)
Los compuestos polares y cargados se pueden separar utilizando fases estacionarias que
posean zonas inicas. A mayor carga del soluto, mayor retencin.
Las fases estacionarias actan como un intercambiador de iones; los intercambiadores de cationes separan especies catinicas y
los intercambiadores aninicos separan especies aninicas.

Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de elucin cuando se usan en cromatografa de intercambio inico.

Cromatoenfoque;
Es una tcnica de separacin que se incluye en la cromatografa de intercambio inico y que consiste en la separacin de solutos
en funcin de su punto isoelctrico (pI) empleando un intercambiador inico. La diferencia del punto isoelctrico entre dos
sustancias est cuantitativamente relacionada con su separacin con esta tcnica

1. Generalmente se utiliza un intercambiador de aniones equilibrado a un pH superior a los pI de los solutos.

2. Se utiliza un tampn de equilibrado, la muestra y el tampn de elucin a baja fuerza inica para evitar infecciones en la
elucin.
3. Tras la retencin de los solutos se hace una elucin a un pH inferior a los pI de los solutos y se va generando un gradiente de
pH.

4. El avance del tampn de elucin hace que la muestra depositada sobre la columna sufre una disminucin progresiva del pH
5. Cuando el pH se aproxima al pI de un determinado soluto,msu carga negativa disminuye
6. Cuando el pH es menos o igual que el pI las molculas dejan de tener carga negativa y eluyen.

Los solutos van siendo arrastrados cuando se alcanza un valor de pH cercano a su punto isoelctrico. Hay que tener en cuenta la
carga de los tampones.
-Ventaja; se estrechan las bandas y los solutos se concentran a causa del gradiente de pH. Aumenta la resolucin y la cantidad de
muestra no es un factor crtico en cromatoenfoque
-Desventaja; presencia de contaminantes se carcter antiptico en la muestra

Deteccin en cromatografa de intercambio inico.

En cromatografa de intercambio inico se puede emplear un tipo de detector particular.

Est basado en la propiedad de los electrolitos de conducir corriente elctrica
Mide la conductancia (inverso de la resistencia) de la fase mvil entre dos microelectrodos al salir de la columna.
Es necesario baja conductancia de la fase mvil, control preciso de la temperatura y una clula de medida de volumen muy
reducido

3.5 Cromatografa hidrofbica.

Se trata de una cromatografa de lquidos, ya que su fase mvil es un lquido.
El mecanismo de separacin de los componentes de la muestra que utiliza es la hidrofobicidad.
La metodologa para llevar a cabo la cromatografa es en columna.
La cromatografa hidrofbic es una cromatografa de adsorcin;
presenta interacciones entre los grupos hidrofbicos expuestos de
las protenas y los grupos hidrofbicos de la matriz
cromatogrfica.
La interaccin hidrofbica es una asociacin entre las regiones
apolares cuando el entorno es acuoso.
Esta cromatografa, al igual que la de intercambio inico sigue los
mismos planteamientos experimentales;
- Retencin de los solutos en la columna
- Posterior elucin mediante cambios en la composicin de los
eluyentes.
En el caso de las protenas, su hidrofobicidad global vendr
determinada por el nmero de aminocidos apolares que tengan.
Se trata de una cromatografa no desnaturalizante
Se utilizan fases estacionarias de moderado caracter hidrofbico, como polmero hidroflicos, a los que se han unido
covalentemente grupos hidrocarbonados como metilo, butilo o fenilo.
Las muestras que se aplican proceden de un paso previo de precipitacin con sulfato amnico para asegurar que la muestra se
encuentre en condiciones idneas para su retencin. De no ser as, se aade NaCl hasta alacanzar una fuerza inica
suficientemente alta y compatible con la solubilidad de los componentes.
El pH se pone utilizando un tampn que presente un pH prximo a la neutralidad.
Las elevadas concentraciones salinas de los eluyentes tienen inconvenientes como; dificultad de deteccin mdiante medidas de
absorbancia en el UV, desviaciones en las lineas basales de los cromatogramas por las variaciones en el ndice de refraccin al
pasar de alta a baja fuerza inica, elevada viscosidad de los eluyentes que ensancha los picos, la necesidad de utilizar sales de
muy elevada pureza....
Normalmente esta columna se utiliza una vez tenemos la muestra de biomolculas en un buffer con una concentracin de sales
determinadas. Lo aadimos en la resina, esta resina es muy hidrofbica (C18; cadena de 18 tomos de carbono). Se unirn los
componentes segn lo hidrofbicas que sean.
Una vez se han unido a las sales (que han sido solvatadas previamente) eluimos las protenas. Despus, cuando ya se ha unido
la protena o las sales, habr que hacer la elucin y quitar las sales.
El tiempo que se quede la protena en la retina depender de la hidrofobicidad de esta. Las que mas se sueltan son las mas
hidroflicas
3.6 Cromatografa de afinidad
Se trata de una cromatografa de lquidos
Para separar los componentes de la muestra utilizamos las interacciones por afinidad biolgica
Se realiza utilizando como fase estacionaria una columna.
Esta cromatografa de afinidad se basa en anclar covalentemente a un soporte cromatogrfico uno
de los componentes de un sistema biolgico. El segundo componente viaja en la fase mvil, y
ambos estn funcionalmente activos, y por tanto se produce su
unin especfica, quedando retenido en la columna. De esta forma
podemos purificar biomolculas a partir de mezclas muy
complejas, ya que el resto de solutos pasan de largo y podrn ser
lavados de la columna. Por ltimo se realiza una elucin para
recuperar los solutos retenidos.
La cromatografa posee una serie de caractersticas como son:
-La funcionalidad biolgica; la mayora de las funciones biolgicas
resultan de la interaccin muy especfica entre dos biomolculas.
- Especificidad; elevada capacidad de reconocimiento y unin incluso en matrices muy
complejas entre determinados
sistemas biolgicos ( anticuerpo-
antgeno, hormona-receptor...)
-Cromatografa de afinidad; se
da la separacin en base a uniones
especficas entre molculas.
Los soportes deben ser hidroflicos, sin carga, con resistencia
mecnica, inertes y estables. Los ms comunes son la agarosa
(Shepharose 4B) y las matrices acrlicas. Se selecciona para
cada caso en funcin de la afinidad requerida.

Preparacin de la fase estacionaria.

1. Activacin de la matriz o el soporte.

Habitualmente se adquieren soportes cromatogrficos ya activados, y, si se precisa, provistos de brazo espaciador.

2. Anclaje covalente del ligando

El anclaje consiste bsicamente en incubar, bajo agitacin suave, la suspensin formada por la matriz
activada y una disolucin del ligando. A esta suspendin se le aade la cabodiimida si se precisa de un
agente condensante. Hay que controlar variables como la temperatura, fuerza inica, el pH y el tiempo
de incubacin.

3. Bloqueo de los grupos reactivos remanentes.

Terminada la incubacin entre el ligando y la matriz, se procede a eliminar el exceso de ligando y
reactivos por decantacin o filtracin del sobrenadante, seguido de un lavado con tampn. Ser
inevitable que una proporcin indeterminada de frupos activos de la matriz hayan permanecido sin
reaccionar. Estos deben ser eliminados para evitar interacciones inespecficas con los solutos de la
muestra. Por ello se suelen bloquear con aminas o cidos en concentraciones suficientes. Esto se hace
para unir en los sitios remanentes otros grupos NH2 o COOH distintos a los del ligando. Tras el
bloqueo, un lavado eficiente, seguido de equilibrado en el tampn adecuado, dejar a la fase
estacionaria lista para ser empaquetada en la columna.

Aplicacin de la muestra y elucin.

El tampn de equilibrado se habr escogido de tal forma que se favorezcan las interacciones
biolgicas de inters, y de la misma forma se reduzcan al mnimo otras interacciones inespecficas.
El flujo de la columna, puede ser una variable crtica en aquellos casos en que las constantes de
velocidad de las reacciones de asociacin y disociacin sean bajas.
En ocasiones, la unin del soluto de inters es tan fuerte que su elucin solo es posible bajo condiciones incompatibles con la
funcionalidad biolgica, excluyendo el empleo de este tipo de cromatografa cuando necesitemos la funcionalidad de la
molcua. En situaciones menos extremas utilizaremos eluciones especficas o inespecficas.
Una elucin especfica es la que se consigue cuando la fase mvil tiene algn agente que compite por unirse al ligando anclado.
Este tipo de elucin especfica ser el preferido siempre que resulte factible.
En las eluciones inespecficas se suele acudir a alterar la fuerza inica del eluyente, o el pH, o incluso la temperatura. Para ello se
desnaturaliza el sistema biolgico. Por tanto, solo se podr utilizar cuando esta desnaturalizacin sea reversible, o cuando la
conformacin nativa no sea un requisito para los estudios posteriores.
3.7 Cromatografa sobre hidroxiapatito.
La fase mvil que se utiliza es lquida
Se basa en las interacciones inespecficas para separar los componentes de la muestra
La fase estacionaria se pone en una columna.
El hidroxiapatito es una forma cristalina de fofato clcico, que puede emplearse como fase estacionaria. Dos de sus principales
campos de aplicacin son la purificacin de anticuerpos monoclonales y la separacin de diferentes formas de DNA.
Esta capacidad puede atribuirse a las propiedades de intercambio inico de los grupos fosfato y los cationes de calcio, forman
compuestos de coordinacin dando lugar a la conformacin de las biomolculas

3.8. HPLC
La HPLC es una abreviatura del nombre en ingls; High Performance Liquid Cromatography)
Lo ms caracterstico de esta cromatografa es su eficiciencia.
Esta eficiencia es debida a las fases estacionarias utilizadas, que son mucho mas finalmente divididas que en cromatografa
convencional. Esto, en la prctica, se puede ver representado en picos de elucin muy estrechos. Dicho de otra forma, el valor
de h hace que, con columnas ms cortas, se consigan mejores resultados que en cromatografa convencional.
En HPLC las fases estacionariias han de estar formadas por partculas de mucha mayor rigidez mecnica.
La slica, por tanto, constituye uno de los soportes cromatogficos mas ventajosos. Encontramos fases estacionarias basadas en
slica-gel
Para conseguir empaquetar la fase estacionaria de un modo homogneo, es necesario trabajar a muy altas presiones.
Adems, hay que utilizar columnas de acero inoxidable. Las conducciones habr que hacerlas con este material.
Adems, para sacar el mximo partido a esta cromatografa, hay que utilizar sistemas o equipos de cromatografa integrados.
Esto equivale a decir que todos sus componentes deben estar especficamente diseados y acoplados en busca de la eficacia
ptima. La HPLC se considera el ltimo escaln en el desarrollo de la cromatografa.
La HPLC presenta como ventajas que aumentamos la resolucin de la cromatografa, obteniendo picos de elucin muy
estrechos y una menor dispersin, adems de permitir que se utilicen columnas ms cortas.
A su vez, aunque la HPLC presenta muchas ventajas, tambin presenta ciertos problemas. Cuanto ms pequeas son las
partculas del lecho mayor resistencia opondrn al paso de la fase mvil, problemas de resistencia mecnica de partculas
porosas si aumentamos el caudal.
 Se trata de una cromatografa de lquidos, ya que la fase
mvil est en estado lquido
El mecanismo de separacin de componentes de la muestra
es muy variado, ya que pueden separarse en funcin de
solubilidad o reparto, tamao, carga elctrica, quiralidad,
hidrofobicidad, interacciones por afinidad biolgica o
interacciones inespecficas.
La fase estacionaria utilizada es en columna
La HPLC, para conseguir la alta resolucin, requiere de una
alta eficiencia en su sistema de bombeo, sistema de
aplicacin de la muestra, un sistema para termostatizar
columnas y en las conducciones.
Los equipos de HPLC se componen de varios mdulos con
funciones definidas.
Son mdulos integrados entre s.
Se encuentran conectados por tubuladoras cortas, de pequeo
tamao y materiales resistentes a la presin y corrosin;
acero inoxidable, PEEK...
Se encuentran distintos tipos de HPLC;
- Exclusin por tamao
- Intercambio inico
- Adsorcin Silice sin modificar o almina
- Particin o reparto
1. Fase normal
2. Fase inversa
La fase estacionaria ms utilizada es el gel de slice. Esto es debido a ciertas caractersticas como su elevada polaridas,
presenta una porosidad controlada (dimetro de partcula de 2- 4 micras). Tiene una superficie especfica (2- 250 m2/g), tiene
resistencia mecnica y su pk=10 debido a la presencia del grupo -Si-OH
Tambin se utilizan geles de slice modificados; fijando molculas orgnicas en su superficie para disminuir su polaridad,
ejemplos de esto son el dimetiloctisilano, dimetiloctadecilsilano, hexametildisilazano...
Se utilizan en algunas ocasiones otras fases estacionarias como polmeros de estireno/divinilibenceno o hidroximetilestireno,
que presentan mucha resistencia a cidos y bases. Tambin se utiliza aluminio y xido de zirconio, que presenta resistencia a
cidos y bases tambin, y por ltimo grafito poroso, que
es totalmente hidrfobo (100% Carbono)
En cuanto a las fases mviles, se dan separaciones
isocrticas y separaciones en gradiente. Podemos tener
dos situaciones segn la polaridad de la fase estacionaria.
- Fase estacionaria polar con una fase mvil poco polar.
Se hace una cromatografa en fase normal
- Fase estacionaria muy poco polar con una fase mvil
polar. Se da una cromatografa en fase inversa o hidrofbica.
Podemos utilizar como eluyentes; metanol, acetonitrilo,
propanol y tetrahidrofurano.
Las fases estacionarias ms utilizadas son C18 (cidos
grasos, mononucletidos, pptidos...) C8 (molculas de
tamao intermedio) C3 y C4 (biomolculas grandes)