Resumos BioMol PDF

Licenciatura em Bioqumica 2 ano
T4 Replicao
Problema Topolgico
Este problema surgiu da necessidade de
desenrolar a dupla hlice para que pudesse ser
replicada. Contudo, desenrolar a dupla hlice era
criada uma grande tenso sendo que esta chegava a
um limite onde no permitia desenrolar mais a
hlice.
Esta tenso poderia ser aliviada se a outra extremidade rodasse mas para
isso seria necessrio cerca de 25 milhes de volta o que se tornaria complicado
num espao to limitado como o ncleo.
Alm disso, o DNA circular no conseguia rodar para aliviar a tenso uma
vez que nem continha pontas livres.
Estrutura plectonmica e paranmica
Delbruck sugeriu que o DNA poderia estar numa estrutura

paranmica, onde o DNA separado movendo-se e ficando as
cadeias lado a lado, em vez da estrutura plectonmica, onde o DNA
est em dupla hlice no permitindo que as das cadeias se separem
sem qualquer tipo de tenso.
Sugeriu-se ainda que a dupla hlice poderia ser convertida
numa estrutura paranmica por superenrrolamento no sentido
oposto volta da prpria hlice.
Ele props ainda um mecanismo dispersivo para a replicao do DNA,
onde a cadeia desenrola uma volta, esse volta copiada e depois volta a enrolar
e assim sucessivamente.
Biologia Molecular 1
Mecanismos tericos para a replicao do DNA
a) Proposto por Watson e Crick, onde uma cadeira parental replicada com
DNA novo, formando uma cadeia hibrida.
b) Segundo este mecanismo a dupla hlice nova foi totalmente copiada de uma
velha.
c) Proposto por Delbruck onde a cadeia desenrola, copiada e volta a enrolar
sendo que a nova cadeia tem fragmentos do DNA parental e outros da nova
cadeia.
Experincia de Meselson e Stahl

Na tentativa de perceber qual o mecanismo utilizado na replicao
realizaram experincias com istopos radioativos, 15N.
Assim, depois de se dar a primeira replicao havia uma banda de
hbridos logo o mecanismo conservativo ficaria de parte.
Aps a segunda replicao havia duas bandas, uma s de DNA novo (15N)
e outra hibrida (14N e 15N).
Este resultado descartava o modelo dispersivo, uma vez que segundo ele
deveria haver apenas uma banda com igual quantidade de 14N e 15N, e deste
modo provou-se que a replicao do DNA semiconservativa.
Topoisomerases
Enzimas que cortam as cadeias para serem transcritas, resolvendo o problema
topolgico impedindo assim a tenso de toro que se pensava existir. Sendo assim
a replicao pode ocorrer sem desenrolar a cadeia.
Topoisomerase tipo IA (ssDNA): Corta numa volta e a cadeia transcrita sendo
que depois ligada novamente pela DNA ligase. Exemplos: E. coli Topoisomerases I
and III, Topoisomerase III de humanos e leveduras, girase reversa das
arqueobacterias
Topoisomerase tipo IB (ssDNA): Semelhante ao IA e acontece na Topoisomerase
I dos eucariotas
Topoisomerase tipo II (dsDNA): Girases. Quebram duas cadeias da dupla hlice
criando um porto atravs do qual passada um segundo segmento
As Topoisomerases so essenciais na transcrio e na recombinao, aumentam

o superenrrolamento nos procariotas por parte da Topoisomerase II e girase reversa.
Os inibidores da Topoisomerase (camptothecin) so bastante txicos e utilizados
no tratamento de cancro.
Variaes da replicao semiconservtiva
Tanto em eucariotas como em procariotas a replicao acontece a partir

de cima forquilha de replicao que se abre na cadeia por parte da ao de
Topoisomerases.
Contudo, o genoma mitocondrial no se replica da mesma forma mas sim
a partir de um processo designado por deslocamento da replicao onde se d a
replicao integral de uma cadeia e essa cadeia deslocada sendo que a partir
desta se faz uma nova.- Figura A
Outro tipo de variao acontece em plasmdeos, bacterifagos, virides
e alguns vrus eucariotas que designado por rolling circle Figura B.
usada quando se pretende uma sntese rpida de mltiplas cpias de
genomas circulares. Forma-se um nick numa dessas cadeias (fora) criando uma
extremidade 3 nessa. A extremidade 5 ao qual se ligaria deslocada para fora

medida que vo sendo adicionados nucletidos 3. Por complementariedade
gera-se ssDNA e linear que pode facilmente se tornar dsDNA circular.
A B
Replicao
Envolve 3 fases:
- Iniciao: envolve identificao da posio na molcula de DNA
onde se inicia a replicao
- Elongao: eventos que acontecem na forquilha de replicao
em que se copia a cadeia me
- Terminao: vagamente conhecida uma vez que ocorre quando
a molcula me j foi replicada
Tambm poderia ser considerada outra fase a de sntese dos telmeros.
Iniciao
A replicao comea sempre no
mesmo local sendo ele designado por
origem da replicao. Uma vez iniciada
forma-se as forquilhas de replicao e a
replicao feita de um modo
bidirecional. No DNA linear existem
simultaneamente duas forquilhas de
replicao, sendo que uma para quando
se depara com a outra, e no DNA circular
h apenas uma. No entanto, essas
forquilhas percorrem pequenas
distncias podendo haver 20 000 origens
em todo o cromossoma humano (1 por
150kb).
Origem da replicao da E.coli: oriC (245bp)

Este segmento oriC tem dois motivos de repetio, um de 9 nucletidos que se
repete 5 vezes (5- TTNTNCANA-3) e outro de 13 nucletidos que se repete 3 vezes (5-
GATCTNTTNTTTT-3).
O local de repetio de 9 nucletidos o local onde se liga uma protena
chamada DNA A. Estas protenas (cerca de 30) ligam-se oriC (quando o DNA est
enrolado negativamente) e abre as repeties A-T localizadas no final da sequncia (13
nucletidos). Acontece nas A-T porque so mais fceis de quebrar j que tm apenas 2
ligaes. A DNA A no tem atividade enzimtica, simplesmente atua por stress torcional.
Este melting da hlice inicia uma srie de eventos que vo culminar no inicio
da elongao. O primeiro passo a ligao de um complexo de duas protenas DNA B
DNA C que do origem a um complexo prepriming. A DNA C ajuda ligao da DNA B
e remove-se depois da formao do complexo. De seguida d-se o fim da iniciao e o
inicio da elongao ao impedir que se juntem enzimas de elongao atravs da ligao
da DNA B enquanto que a helicase(B+C) separa os pares de bases.
Origem da replicao na S. cerevisiae: ARS (200bp)

A tcnica usada para sequenciar oriC envolvia a transferncia de segmentos de
DNA para plasmdeos sem estarem em replicao e a mesma usada neste caso. As
origens encontradas so as ARS(Autonomously Replicating Sequences) que so
constitudas por 4 domnios:
- A e B1 que so sequncias de reconhecimento da origem que o binding site
para o ORC (origin recognition complex)
- B2: regio que abre melted region
-B3
Em A e B1 ligam-se os ORC, complexo de

reconhecimento de origem (6 protenas que so
equiparveis ao DNA A na E. coli). Pensa-se que
estejam envolvidas na regulao da replicao do
genoma, esto permanentemente ligados a esta
zona.
O B2 uma sequncia de repetio de 13
nucletidos, semelhante da E coli, e neste local
que se abre a forquilha de replicao pela tenso de
toro induzida pela ligao de uma protena ABF1 no subdomnio B3.
Depois de abrir a forquilha liga-se helicase e a outras enzimas
Elongao
Existem duas complicaes
- As DNA polimerases apenas so capazes de sintetizar no
sentido 5 -> 3 (leading strand) o que significa que tem de
haver um processo diferente para a lagging strand (modo
descontnuo), so replicadas por pequenos fragmentos os
fragmentos de okazaki.
- DNA polimerase no se pode ligar a uma parte qualquer
da molcula para replicar, tem de haver uma parte que
proporcione uma extremidade 3, tem de existir primers.
DNA polimerases
Sintetizam polinucletidos no sentido 5-3. Algumas atuam com o auxlio de
nucleases que degradam polinucletidos hidrolisando a ponte ditiol entre 2
nucletidos. Estas nucleases atrasam o processo mas ajudam a corrigir erros,
havendo um equilbrio entre as duas funes, a da DNA pol e a da nuclease.
Endonucleases destri polinucletidos dentro da cadeia e as exonucleases
destri nas extremidades.
Exonuclease no sentido 3-5 existe em muitos organismos procariotas e
eucariotas o que permite que a enzima remova nucletidos a partir da
extremidade 3 que acabou de ser sintetizada podendo assim corrigir eventuais
erros durante a sntese.
Exonuclease no sentido 5-3 menos comum e devem remover de um
polinucletido que j est ligado cadeia molde, uma vez que esta atividade
usada durante um processo que une fragmentos de DNA descontnuos na lagging

strand.
Em bactrias
- DNA pol I um polipptido nico que tem como funo a reparao do
DNA e replicao
- DNA pol III tem mltiplas subunidades
Em eucariotas
,, so subunidades principais da DNA polimerase III, sendo que a
primeira relacionada com a atividade da prpria polimerase tratando dos
primers, a segunda uma exonuclease 3-5 e a terceira pensa-se ter um
papel estrutural.
A DNA pol tem duas subunidades e trabalha em conjunto com a

protena PCNA que o equivalente funcional da subunidade da pol III e
segura a enzima ao template de DNA.
Primming
A helicase separa as cadeias entre o primer e a DNA pol e a outra.

A primase produz primers e no precisa de uma ponta 3 livre.
Em bactrias os primers so sintetizados pela primase (pol de RNA)
Em eucariotas a primase est ligada -DNA pol e coopera com esta na sntese
dos primeiros nucletidos. Ou seja, a primase sintetiza um iniciador de 8/12 nucletidos
e de seguida a -DNA pol complementa com mais 20 nucletidos. Depois atua ento a
DNA pol que faz a restante polimerizao.
Fragmentos de Okazaki
Aps a dio de primer, o DNA pol alfa
adiciona novo DNA isto porque as 2
enzimas esto muito ligadas e depois
entra em ao a DNA pol . Nas
bactrias mais simples porque a
primase no est ligada a nenhuma
enzima.
Ocorre sempre iniciao dentro da
elongao
Apos a formao do complexo
preprimming vem a primase para
formar o primossoma(helicase +
primase).
Primming
A atividade de reviso requer que a polimerizao ocorra apenas quando o
nucletido do terminal 3 est bem emparelhado.
Se tal no acontece, a atividade da 3-5 exonuclease prevalece sobre a 5-3
polimerase.
A polimerizao de um nucletido do terminal 3 bem emparelhado assegura a
fidelidade da cpia. Sntese de ssDNA considerada como um nucletido terminal 5
no emparelhado ento a polimerizao no ocorre.
RNA pol no requer polimerizao o que pode explicar o porque de os primers serem
de RNA e no de DNA.
Helicases
Quebra os pares de bases em ambas as direes para que se d a replicao
necessitando para tal da hidrlise de ATP.
A principal helicase da E.coli a DnaB que percorre a lagging strand quebrando as
ponte de H e gerando a forquilha de replicao enquanto a Topoisomerase vai ativando
a toro.
PriA e Rep tambm so helicases mas percorrem a

leading strand.
As helicases reparam as cadeias no entanto estas podiam
voltar a emparelhar para que isso no acontea existem
protenas que se ligam s cadeias separadas as SSB nos
procariotas e as RPA nos eucariotas. Tambm evitam que
estas cadeias sejam degradadas por nucleases. (a libertao
de RPA feita pela RMP)
Apos 1000 /2000 nucletidos estarem replicados na
leading strand a primase sintetiza mais um primer de RNA
para a lagging strand.
-Clamp: subunidade que agarra as cadeias
Clamp-loader: subunidade e da DNA pol III que regula
a ligao da polimerase cadeia lagging strand. Liga e desliga
a cadeia ao B- clamp quando j est tudo replicado e precisa
de mais um primer
Ligao entre os fragmentos de Okazaki

Depois de a replicao ter terminado os
fragmentos de Okazaki tm de ser ligados
pois entre cada um ainda existe um primer
de RNA
Esse primer no pode ser removido pela
DNA pol III porque esta no tem atividade
exonuclease 5-3
A remoo dos primers de RNA feita
pela DNA pol I pois tem exonuclease 5-3.
Esta retira o primer, completa a sntese de
DNA ligase estabelece a ponte ditiol entre
os nucletidos. A DNA pol I s trabalha na
lagging strand.
Elongao nos eucariotas
Em eucariotas o progresso da
forquilha de replicao realizado
pela helicase e os polinucletidos
separados so impedidos de se
voltarem a ligar pelo RPA.
A sntese do primer diferente nos
eucariotas. Nestes seres a DNA pol
coopera com a primase fazendo
primer de RNA sendo que a DNA pol
alfa prolonga + 20 nucletidos. No
entanto no pode continuar a
replicao porque esta polimerase no
tem PCNA e deste modo a restante
replicao feia pela DNA pol .
Fatores de replicao dos eucariotas

Em eucariotas as enzimas que
sintetizam a leading e a lagging
strand no formam um dmero como
nas bactrias.
A funo do complexo das
bactrias (que permite que a clamp
prenda a enzima cadeia)
desempenhada nos eucariotas por
uma protena designada por RFC
(fator C da replicao).
Nas bactrias necessrio que se
removam os primers de cada
fragmento de okazaki recorrendo a uma exonuclease 5-3 que realizado pela DNA
pol I.
Nos eucariotas a mais importante a Fen1 pois associa-se DNA pol na ponta
3 de um fragmento okazaki de forma a degradar o primer da extremidade 5. Tem
duas hipteses para tal:
A) A helicase do fragmento de okazaki anterior corta a ligao entre pares de

bases e continua a replicao. Ento o primer e o pedao de DNA sintetizado pela
DNA pol alfa fica deslocada- Flap. A FEN1 reconhece essa estrutura em flap e corta
por a. A DNA ligase faz ento a ligao ditiol entre os 2 nucletidos.
B) RNases H destoem o primer mas no conseguem destruir o ltimo nucletido.
Como j no trifosfatado a FEN1 vai l e quebra a ligao. Depois a DNA ligase liga
os dois nucletidos.
Ambos os processos permitem que tanto o primer e o pedao de DNA sintetizado
pela DNA pol seja removido. Isto porque como o DNA pol no tem atividade de
exonuclease podendo introduzir erros. Esse pedao ento introduzido pela DNA
pol que j tem atividade de exonucleases e corrigir erros.
Nos eucariotas no existe replissoma mas sim fatores de replicao, estruturas
dentro do ncleo onde h milhares de complexos de replicao individuais. Os
cromossomas orientam zonas que querem replicar para os fatores de replicao.
Terminao da replicao
A forquilha de replicao para quando encontra uma segunda forquilha em

movimento oposto ao seu ou quando atinge a extremidade da molcula.
o Terminao em E coli
Em DNA circular o genoma replicado bidireccionalmente a partir da origem de

replicao. No entanto uma forquilha pode andar mais rpido que a outra e terminar
noutro local mas isto no acontece devido existncia de forquilha de terminao.
Estas sequncias atuam como locais de ligao para protenas Tus.
Se uma forquilha estiver a andar na cadeia numa determinada direo e bater
numa protena Tus, esta deixa-a passar, no entanto, se a forquilha tentar passar pela
direo oposta a protena j no deixa passar. A helicase (DnaB) responsvel pela
progresso da forquilha e quando alcana a Tus impedida de progredir devido a parede
de cadeias que ela no consegue penetrar.
Quando abordada pelo outro lado, a TUS permite que a Dna B a degrade
provavelmente devido ao facto que o desdobramento da helice dupla tem na protena.
A intensidade da ligao Tus- sequncia terminal tal que ambas as forquilhas
ficam presas numa regio relativamente curta no lado oposto da origem de replicao.
Assim a terminao ocorre sempre perto da mesmo posio
Este evento seguido pela desintegrao do replissoma de uma forma
controlada ou espontnea
O resultado so duas molculas filhas interligadas separadas pela Topoisomerase
II
Terminao da replicao em eucariotas

No existe Tus nem foram identificada equivalentes s terminaes bacterianas.
Possivelmente as forquilhas encontram-se numa posio aleatria e a terminao
envolve apenas a ligao das novas cadeia polinucleotdicas.
Os complexos de replicao no se separam porque estas factories so
caractersticas permanentes do ncleo.
Assim, como no se sabe muito estuda-se como as molculas filhas no ficam
enroladas permanentemente
O genoma eucaritico no esta empacotado no ncleo ao acaso mas sim
ordenado em vola das replication factoris que esto presentes num nmero limitado.
Cada fbrica replica uma parte do DNA e mantm as molculas filhas num
arranjo ordenado de modo a no se embrulhar.
Inicialmente, as 2 moleculas filhas so mantidas juntas por protenas(coenzimas)
que so ligadas imediatamente aps a passagem da forquilha atravs da DNA pol K
(apesar de no requerer atividade de polimerase). Este alinhamento mantido pelos
cromatdeos irmos at anafase onde so divididos e podem separar-se
As condensinas so responsveis pela condensao dos cromossomas na
anafase e na metfase.
Problema da replicao nas extremidades

As pontas da molculas de DNA lineares
e com duplas cadeias vo ficando mais
curtas a cada replicao havendo duas
maneiras de isso acontecer:
A) O extremo 3 lagging strand
pode no ser copiado porque o
ultimo fragmento de okazaki
no pode ser primed sendo que
a posio natural para se
colocar o primer est alem do
final do template.
B) Mesmo que este fragmento de
RNA seja colocado na
extremidade 3 da cadeia
resultante, h na mesma
reduo do comprimento. Isto
acontece porque este primer
no pode ser convertido em
DNA pelo processo
normalmente pois requerem
extenso da ponta 3 de um
fragmento okazaki adjacente.
Telomerase
Os telmeros so uma sequencia de minissatlite composta por mltiplas cpias de

um motivo de repeties
As clulas podem ento contronar este problema atravs da telomerase enzima
que sintetiza DNA telomrico de modo a prolongar as cadeias
A telomerase uma ribonuclease uma vez que constituda por RNA e protenas
sendo que essa sequencia de RNA que vai expandir os telmeros agindo assim como
transcriptase reversa.
Na sua sequencia de RNA a telomesare tem complemento do microssatlite
existente nos telmeros dos humanos assim sendo a teloresase liga-se a e faz a
extenso
Depois de completar com o DNA que
faltava a telomerase desloca-se e ainda aumenta
mais a cadeia , um aumento rico em Gs.
Para compensar esse aumento por parte
da telomerase na leading strand a DNA primase
alfa sintetiza a cadeia em faltra. Isto requer um
novo primer e por isso o leading fica mais curta
mas no entanto o comportamento total da
molcula de DNA foi mantida. Esta cadeia rica
em C Crich strand .
A telomerase est presente em clulas
embrionrias e reprodutoras e estaminais e no
est presente nas clulas somticas.
Telomerase e Senescncia celular

O mais importante proteger as extremidades do
DNA do efeito das enzimas de reparao de DNA. Essa
proteo feita por protenas CAP (TRF2 em
humanos).
Estas protenas reconhecem as regies de
repetio dos telmeros como os seus locais de
ligao.
Se no houver estas protenas as enzimas de
reparao fazem ligaes inadequadas nos telmeros
e isso poder causar interrupes no ciclo celular
Todas as clulas so capazes de se multiplicar no entanto cegam a um ponto em

que no se multiplicam mais mas mantm-se vivas ficando assim num estado de
senescncia.
Pode ser retardada induzindo a sntese de telomerase que o que acontece no
cancro. Tem a telomerase ativa e multiplicam-se vrias vezes no entrando em
senescncia sendo que em muitos casos a telomerase fica hiperativa e os telmeros
ficam ainda maiores.
Regulao da replicao
Coordenam o ciclo celular sempre que este muda de etapa, essencialmente
detetam mutaes
- A reputao regulada nas fases G1,S, G2, M
- Os genes no so replicados todos ao mesmo tempo.

- Genes ativamente transcritos e centrmero so replicados no inicio da fase S
- As restantes regies do genoma so replicadas mais tarde
- As origens de replicao so especficas do tecido e refletem o padro de expresso
gentica que ocorre numa molcula
o Checkpoint na Fase S
Este checkpoint implica a utilizao de CdK-cinases dependentes de ciclinas
Existem assim protenas presentes na replicao que reconhecem danos no DNA
e quando detetam erros avisam as protenas de regulao, as CdK
As protenas de deteo so a DNA pol , PCNA,RFC.
Assim sendo quando so detetados erros, so estimuladas as protenas de
regulao as ATR, ATM, CKK1, CDC25C, CDK1. Estas aqui analisam o caso e veem se o
DNA segue uma via de reparao ou se entra em apoptose, ou por outro lado se no
tiver nada continua para a fase M
Por outro lado o DNA tambm pode sofrer ao das ATM, CHK2, p53, p21,
CDK2,RB que medeiam o caso e analisam se o DNA entra em reparao em apoptose ou
se entra na fase S
P53: protena supressora de tumores. Quando h erros nesta protena a clula
no tem capacidade de reparar a replicao e origina tumores.
o Inibidores da replicao usados na terapia do cancro
- Cisplatina: liga-se a guaninas eperde os seus cloros. Isto faz parar a forquilha de
replicao
- Topotecan: inibem a topoisomerase I e a replicao para
- Guanazole: inibe a ribonucleotido redutase no havendo nucleotidos para ser
possvel fazer a replicao.
T5 Transcrio
Transcrio o primeiro passo da regulao de expresso
A transcrio inicia-se pela interao entre a RNA pol e o promotor que se localiza
imediatamente antes do inicio da transcrio e que onde as protenas se ligam.
Ao avaliar as regies antes dos genes (upstream) pode-se verificar que h regies
muito semelhantes, h uma grande homologia na sequncias regies consenso. Estas
regies so os promotores de transcrio e variam de espcie para espcie embora a
homologia entre eles seja bastante elevada.
Quanto mais estas sequencias forem semelhantes maior a interaao da RNA pol
e do promotor e consequentemente maior a taxa de transcrio o promotor regula
a transcrio (fora do promotor)
H 3 regies consenso:
o +1: um nucletido, normalmente uma purina, G ou A que por vezes
encaixada nas sequncias CAT
o -10 : Pribnow box- TATAAT (TATA box) a regio de inicio da transcrio e
esta presente em todos os promotores
o -35: TTGACA regio de reconhecimento da RNA pol
O espaamento entre estas regies importante, pode haver a insero ou
deleo de nucletidos o que afeta o espaamento. Por exemplo, o espaamento
entre -10 e -35 de 16-18bp em 90% dos promotores.
Mutaes no promotor
- Mutaes up: aumentam a taxa de transcrio por aumento da homologia da
sequncia ou diminuio do espaamento entre as regies -10/-35.
- Mutaes down: Diminuem a taxa de transcrio por diminuio de homologia da
sequncia ou aumento do espaamento entre as regies -10/-35
Nas down h uma diminuio da afinidade da RNA pol ao promotor embora no

impea a transcrio de ocorrer quando acontecem na regio -35 pois esta uma
regio de reconhecimento. Quando ocorre na regio -10 a taxa de transcrio
diminuda uma vez que esta regio responsvel pelo incio da transcrio sendo
que as mutaes ai afetam a formao do complexo mas diminuem a taxa de
transcrio.
A afinidade do RNA pol sequencia do promotor pode definir a frequncia com
que ocorre transcrio. Sendo assim podemos ter:
Promotores fortes: homologia elevada e curto
espaamento entre regies consenso
Promotores fracos: baixa homologia e elevado

espaamento entre regies consenso
NOTA: as sequncias dos promotores nunca so iguais s regies consenso.
O sequenciamento dos promotores em

laboratrio conseguido juntando RNA pol e
DNA.
Este ensaio baseia-se na proteo de DNA
por protenas que se ligam ao RNA polimerase.
O RNA liga-se ao DNA e as DNAses
presentes vo cortar o DNA que no est
protegido.
Recupera-se fragmentos de 44pb e so os
promotores que queremos sequenciar
Apenas protegeu a sequncia -10 de incio
de transcrio e a de reconhecimento no.
RNA polimerase
o Complexo enzimtico responsvel pela transcrio
o A iniciao e a terminao da sntese de RNA requerem protenas
adicionais
o Procariotas: 1 tipo de RNA pol para sintetiza todos os RNAs
o Eucariotas: RNA pol l: sintetiza rRNA ; RNA pol ll: sintetiza pr-mRNA; RNA
pol lll: sintetiza RNAs mais pequenos (tRNA,rRNA 5s e miRNA)
Estrutura da RNA pol

constituda por 2 grandes unidades:
Complexo 2 e o fator .
O complexo 2 tem 4 subunidades:
- 2 : codificadas pela rpoA, esto envolvidas
na montagem do complexo e ligao de ativadores.
Mutaes no rpoA diminuem a afinidade dos promotores.
- e : a primeira de 155kDa e codificada pela rpoB e a segunda de 160kDa e
codificada pela rpoC. Esto envolvidas na atividade cataltica. Mutaes na rpoC e na
rpoB afetam todas as etapas da transcrio
- : codificada por rpoZ e responsvel pela estabilizao do complexo proteo
fsica s subunidades .
Fator tem 39.90 kDa, codificada pela rpoD e est
envolvido no reconhecimento do promotor, direciona o
complexo para o promotor.
O complexo 2 tem afinidade para qualquer
sequncia de DNA, este complexo iniciaria a transcrio
em qualquer lugar. Contudo o fator diminui a afinidade
no especifica da DNA pol e direciona todo o complexo
para o promotor
O fator reconhece as sequncias -35 e -10, liga-se a -
35 e o restante ao -10.
O complexo ligado ao complexo 2 forma a
holoenzima e a transcrio s ocorre com a holoenzima,
ou seja, quando todas as subunidades esto presentes.
Depois de se iniciar a transcrio o fator desliga-se do
complexo
H vrios tipos de fatores utilizados em diferentes
condies: fatores 70 so os essenciais para a
manuteno da clula, os 32 direcionam a DNA pol para genes responsveis no

combate ao stress trmico.
Alguns vrus sintetizam RNA pol na forma de uma protena monomrica, perdendo
versatilidade pois reconhece apenas alguns promotores.
Etapas da transcrio
o Iniciao
Inicialmente a holoenzima liga-se ao promotor e a cadeia dupla aberta. Apenas
uma das cadeias copiada.
Se o fator no se desligar temos uma iniciao absortiva: se continuar ligado a
RNA pol vai iniciar a transcrio mas vai haver uma fora que a vai puxar para trs, a
tenso energtica da ligao ao promotor. Ao fim de nucletidos o complexo desliga-
se e no ocorre transcrio
Numa situao normal o fator desliga-se do complexo e gera-se uma tenso
nas cadeias que aliviada por Topoisomerases e girases
Os ribonucletidos so adicionados na forma trifosfatada havendo um ataque
nucleoflico do OH do C3 ao fosfato, promove a sada do pirofosfato e
consequentemente a ligao ditiol.
o Elongao
Forma-se uma bolha de transcrio, pois vai

desenrolando a cadeia, transcreve e elas voltam a
enrolar
Antes da bolha atua a Topoisomerase aliviando
os enrolamentos. Depois da bolha a girase introduz os
enrolamentos
A RNA pol uma translocase descontinua
porque enquanto que a parte de trs da enzima vai
incorporando nucletidos a parte da frente avana
vrios o que tem lgica devido ao superenrrolamento
positivo que h a jusante.
o Terminao
1)Terminao intrnseca
H uma sequncia que faz com que a RNA pol deixe de trabalhar. O mRNA adquire
uma conformao tridimensional, forma uma estrutura em loop e a RNA pol desagrega-
se. uma sequncia consenso rica em G-C seguida de 7 ou 8 nucleotdeos U. Quando
chega ao uracilo, ela enrola-se e as sequncias ricas em G-C emparelham-se.
2)Terminao dependente de p
p uma protena em forma de barril com 6 subunidades que se liga ao mRNA e tem
atividade de helicase. Esta protena percorre o mRNA e quando chega RNA pol
reconhece o RNA ligado ao DNA e desagrega-se o complexo.
Estes dois mecanismos podem ocorrer simultaneamente o RNA pol mais rpida
que a protena p. Contudo, quando se forma a estrutura em loop a RNA pol para e d
tempo para a protena p chegar l.
NOTA: a protena p liga-se a uma zona rica em C
T6 Regulao em procariotas
Regulao da transcrio
Feita por fatores proteicos que interagem com a sequencia e pela RNA polimerase.
A transcrio regulada de um gene implica a existncia de cis acting elements. O
elemento cis uma sequncia reguladora que est antes do operados ao qual se pode
ligar uma molcula trans que est codificada noutro local do genoma. O trans liga-se ao
cis e promove a regulao da transcrio.
Essa regulao pode ativar a expresso do gene (regulao positiva por parte dos
ativadores) ou ento pode inativar a expresso (regulao negativa por parte dos
repressores).
Eucariotas tem RNA monocistrnico pois s tem a informao de uma protena e os
procariotas tm RNA policistrnico uma vez que tm informao de vrias protenas.
Regulao do opero lac

O opero lac codifica para enzimas que
degradam a lactose. Deste modo quando no h
lactose este opero no precisa de estar expresso.
Esta expresso do opero lac induzida por
lactose e uma regulao negativa.
A montante do promotor h um gene regulado
que codifica para o repressor lac.
A transcrio do opero lac reprimida na ausncia de lactose (com ou sem glicose).
O que reprime lac liga-se ao operador e exclui a RNA pol.
Quando no h lactose para degradar o repressor lac liga-se ao operador e quando
a RNA pol surge para efetuar a transcrio esta bate no repressor e a transcrio
impedida.
No entanto quando h lactose no meio o opero precisa se ser expresso. O repressor
lac tem bastante afinidade para a lactose por isso quando h lactose na clula o
repressor liga-se a esta e automaticamente desliga-se do operador permitindo assim
que a RNA pol faa a transcrio e consequentemente haja expresso dos genes.
Regulao do opero trp

O opero trp produz triptofano e
quando no h triptofano no meio os
genes deste so expressos mas por
outro lado quando h triptofano no
meio a clula no precisa de o produzir
e estes genes ficam inativos.
O repressor codificado por um
gene que est antes do promotor mas o
repressor s funciona quando est
ligado ao triptofano
Quando no h trp no meio o
repressor produz-se mas no consegue
ligar-se ao operador o que faz com que
seja produzido trp e vice-versa.
A expresso induzida pela falta de
trp logo uma regulao negativa.
Regulao do opero lac por cAMP
E.coli + glucose = no induo do opero lac

E.coli + lacose = induo do opero lac
E.coli + lactose + glusose = No induo do opero lac
Nas clulas quando os nveis de

glicose so baixos produz-se cAMP e em
situaes em que s existe lactose
produz-se cAMP que se liga a uma
protena ativadora catablica, CAP. O
complexo cAMP + CAP liga-se ao
promotor, estimla a RNA pol e a
transcrio acelerada pois aumenta a
afinidade do RNA pol ao promotor.
represso catablica mediada por cAMP
Quando h glicose e lactose
primeiro utiliza a glicose como fonte de
energia e como h lactose no meio esta
liga-se ao repressor e faz-se a transcrio
genes. Contudo como h glicose, no h
cAMP e por isso a transcrio muito
reduzida.
A regulao do opero lac pelo
cAMP-CAP uma regulao positiva.
A represso catablica implica o cAMP

como mecanismo de ativao e est presente em
muitos operes: lactose, arabinose, maltose
Este mecanismo s ocorre quando no h
glicose, ou seja, o prprio mecanismo leva
utilizao preferencial da glicose.
A transcrio de vrios operes pode ser
regulada por uma protena, regulo.
A RNA pol no precisa do complexo cAMP CAP para fazer a transcrio,
ela reconhece uma grande variedade de promotores por associao com
diferentes fatores . Os nveis de fator alteram-se durante condies de stress
(ex. calor) e esporolao.
T7- Transcrio em Eucariotas
Fatores semelhante transcrio em procariotas:

- A polimerizao canalizada pela RNA pol
- Os promotores regulam a expresso
- H cis acting elemnets e trans acting elements
H 3 tipod de RNA pol:
Estrutura da RNA pol

constituda por duas grandes subunidade semelhantes e dos procariotas. Depois
constituisa por 12/15 subunidades mais pequenas que no so comuns a todas
A subunidade L tem 7 repeties de aminocidos consenso na zona C terminal: Tyr-Ser-
Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. uma regio letal pois sem ela a RNA pol no se liga o que faz com
que a transcrio e as clulas no consigam produzir protenas e acabem por morrer.
Estrutura e funo dos elementos do promotor

O promotor do gene um conjunto de elementos cis que so necessrios
para iniciar a transcrio.
Os elementos que fazem parte do core so:
TATA box: regio consenso e local ao qual se liga a RNA pol ll (-31 a -26)
Inr: nem todos tm e a sequncia no esta bem definida (-2 a +4)
TATA box liga-se o fator de transcrio TBP, uma subunidade do

complexo TFHD.
Inr ligam-se a subunidade TAF1 e TAF2 da TFllD. Estes elementos
trabalham de forma independente, mas juntos aumentam a taxa de transcrio.
Todos os genes tm o core promotor.
Tanto a TBP como TFllB dizem protena em que lado se d a transcrio
Mutaes na TATA box alteram o nvel de transcrio
Ao core promotor liga-se o RNA pol, mas h outras regies consenso s
quais se ligam fatores de transcrio e que por sua vez regulam a transcrio:
Assim temos os elementos de control proximal e distal.
Elementos de controlo proximais

Esto localizados a 70-200pb a montante do incio da transcrio.
Estes elementos so:
-GC box:onde se liga o fator transcrio Sp1
-CAAT box: onde se liga os fatores CTF e NF1.
Nem todos tm estes elementos, so todos
diferentes e por isso implicam fatores de
transcrio diferentes. Estes elementos proximais
podem aumentar a frequncia de iniciao da
transcrio quando esto prximos do local de
transcrio.
Podem tambm servir para recrutar
elementos de controlo distais para o promotor do
ncleo.
Os elementos de controlo proximal so
ainda constitudos por mltiplos elementos cis no
essenciais.
Elementos de controle distais

Encontram-se a 100kb ou mais a partir do promotor e so:
Enhancers: tem cerca de 500pb e 10 locais de ligao para vrios fatores de
transcrio distintos. Aumentam a taxa de transcrio
Silencers: semelhantes aos enhancer mas reprimem a atividade dos genes
Estes elementos so influenciados pelas condies ambientais
NOTAS: Genes com funes semelhantes tm sequencias distais e proximais
semelhantes e so constitudos por mltiplos elementos cis (core promotor, elementos
distais e proximais). Os elementos trans so os fatores de transcrio
Fatores de transcrio
o Gerais:
- So sempre necessrios para fazer a transcrio.
- Participam na montagem do complexo e no
reconhecimento do promotor.
- TFllD: tem a subunidade TBP que reconhece a TATA
box
- TFllH: 9 subunidades, funes de helicase, a TPase
e a Kinase, fosforila CTD e o desenvolvimento da cadeia
dupla, fuso, feito por esta.
o Reguladores:
- Ligam-se aos elementos distais e proximais
- Aumentam a eficincia de montagem do complexo por interaes com
protenas
- Regula a eficincia da iniciao da transcrio
Como o enhancer estimula o promotor os ativadores (elementos trans) ligam-se
ao enhancer, a molcula dobra de modo a que a TFllD se ligue TATA box e a partir da
ligam-se todos os outros fatores e monta-se o complexo
NOTAS: elementos proximais e distais no substituem o promotor; so colocados
em qualquer direo; podem estar a montante ou a jusante do promotor
o Dominio CTD:
CTD uma cauda da RNA pol ll na posio C terminal. constituda por 52
repeties e durante a transcrio sofre fosforilaes dinmicas nos resduos de serina
nas posies 2 e 5:
- Iniciao: CTD no fosforilada
- Elongao: CTD fosforilada
Quando fosforilada a CTD pode ligar-se a fatores de processamento de mRNA
durante a terminao.
Fosforilao: TFllH e outras quinases
Desfosforilao: Fcp1 fosfatase
o TFllD:
Fator de transcrio que recruta o resto da maquinaria.
Uma das subunidades do TFllD a TBP que se liga TATA box pois se no se
ligarem no ocorre transcrio uma vez que quando se ligam o DNA dobra-se.
T8 Processamento
mRNA heterogneo: alta heterogeneidade entre transcries a partir do mesmo
gene
a transcrio e a traduo ocorrem simultaneamento em procariotas mas nos
eucariotas no porque a transcrio ocorre no ncleo e a traduo no citoplasma.
H muitas zonas do DNA que no so transcritas para o RNA mRNA hibrido
para alm de haver mais intres do que exes.
A maioria dos eucariotas tm intres e as bactrias e bacterifagos tambm
podem apresentar embora seja rara.
A estrutura de um gene constante em todos os tecidos de um organismo.
A disposio de exes a mesma ao longo do genoma
A posio de intres conservada em genes homlogos de diferentes espcies.
Adio do cap 5
O cap 5 um capacete que se
adiciona na extremidade 5 e confere
molcula uma maior estabilidade pois
protege-a da ao de fosfatases e nucleases.
adicionado ao mRNA.
Sai um fosfato da extremidade 5 por
hidrlise. Fica uma extremidade difosfato ao
qual se liga o fosfato de um GTP. O
nitrognio na posio 7 da guanina sofre
metilao formando o capo.
As riboses dos dois primeiros nucletidos sofrem metilao no OH formando o
cap1 e o cap2.
Implica a guaniltransferase
Cauda poliadenilao- 3
O mRNA pode ainda ter uma cauda de
poliadenilatos na extremidade 3 que estabiliza a estrutura.
Os nucletidos de adenina no so codificados pelo
DNA mas sim adicionados ao mRNA.
O mRNA clivado por uma endonuclease que
reconhece a sequencia AAUAAA e depois a polimerase
poly-A adiciona os nucletidos.
Splicing
a retirada de intres para produzir mRNA maduro.
A maior parte dos intres comeam com GU e terminam
com AG.
Tm uma sequncia consenso no incio AGGUAGU
e no fim (10 pirimidinas C ou U) seguida por uma base
qualquer um C e um AG.
Para alm destas regies consenso os intres ainda
tm um branch-point (ponto de ramificao) com uma
adenina.
Depois de reconhecido o
intro faz-se a exciso e forma-se
uma estrutura em forma de lao do
intro havendo a quebra da ligao
ditiol.
A estrutura em lao
conseguida pela formao de
spliceossomo, o intro em forma de
lao rodeado por ribonucleo
protenas SnRNPs que reconhecem
os pontos de ramificao e os de
corte e catalisam essa clivagem.
O processo mediado por SMN (survival of motor neurons).
Splicing alternativo
Os intres e exes so tecido especficos sendo que num tecido pode ser um intro e
noutro uma exo.
Caracteriza funes especificas de uma mesma protena.
T9 Traduo
O mRNA saindo do ncleo cai ser traduzido para dormao de uma protena
sendo que pode seguir duas vias:
1)Pode ser traduzido por ribossomas do reticulo endoplasmtico rugoso e a a
protena exportada para fora da clula na forma de vesculas, passando ainda pelo
complexo de Golgi
2)Pode ser traduzido por ribossomas livres e a a protena permanecer dentro
da clula executando alguma funo.
Na traduo a informao mantm-se.
Hiptese de Wooble
Existem 64 codes possveis, no entanto no h tRNA's suficientes para esses
codes todos: Bacteria tem 30/40 e os animais e plantas tm 50 tRNA.
Ou seja, wooble props que nos anticodes do tRNA 8 dessas bases fossem fixas
e seguiam o modelo de Watson e Crick.
A ultima base segue o modelo de Wooble qual codifica para mais do que um
nucletido, ou seja, um anticodo codifica para vrios codes.
A posio de Wooble a 1 do tRNA e a 3 do mRNA.
Estrutura do tRNA
Protenas
os aminocidos tem um lado N-terminal e um C-terminal sendo que o primeiro
vai ligar-se ao C-terminal da protena formando-se assim uma ligao peptdica.
A ligao peptdica ocorre sempre entre um grupo amina e um aminocido e um
grupo carboxila do outro. O radical carboxilo perde um OH e a radical amina perde um
H sendo que h produo de uma molcula de gua e os dois aminocidos estabelecem
uma ligao covalente entre o N de um e o C de outro (reao de condensao)
Cdigo gentico
Redundante: existem vrios codes para o mesmo aminocido
No ambguo: nenhum codo codifica duas protenas
Universal: igual para todos os organismos, exceto alguns procariotas
Ribossoma
Procariotas: 50s (rRNA 23s + 5s + 31 protenas); 30s(rRNA 16s + 21 protenas); 70s
Eucariotas: 60s (28s + 5,8 s + 5s + 50 protenas), 40s (18s + 33 protenas); 80s
Locais catalticos
E- exit, P- peptide site, A aminoacil site
Iniciao
As protenas das duas so diferentes embora entre procariotas e eucariotas sejam

iguais.
O mRNA liga-se subunidade pequena do ribossoma e chega ao tRNA com o
anticodo de iniciao. Depois de o tRNA se ligar, chega a subunidade grande do
ribossoma e est assim formado o complexo de iniciao
Assim o tRNA com a metionina liga-se ao local A e depois vm o 2 tRNA liga-se

ao local P e os dois aminocidos formam a ligao peptdica sendo que o primeiro passa
para o local E e sai, medida que se vai fazendo a traduo.
Todos od tRNAs subsequentes entram no local A.
Fatores de traduo
Iniciao
- IF3- assegura a fidelidade ao codo AUG
- IF1- facilita a ligao a AUG e o tRNA seguinte
- IF2- ligao das subunidades do ribossoma.
Fatores de iniciao ligam-se pequena subunidade do ribossoma
Elongao
O tRNA iniciador vai para a posio P, o aminoacil-tRNA levado at posio

A pelo fator de transcrio EF1A ou EF-Tu e forma-se uma ligao peptdica. A peptidil
transferase hidrolisa a ligao covalente entre metionina e tRNA e o ribossoma desloca-
se para uma posio E e sai.
Terminao
Inicia-se com o codo stop e com a protena RF que l o sinal de terminao da

cadeia.
As RF reconhecem os codes de terminao e induzem a peptidil transferase a
clivar a ligao peptdica entre o tRNA e o aminocido.
-RF1: reconhece UAA e UAG
- RF2: reconhece UAA e UGA
-RF3: promove a sada do polipptido induzindo a peptidil transferase
-erf1: reconhece codes stop
- erf3: promove a sada do polipptido.
A traduo s pode ocorrer segundo uma grelha de leitura, se o ribossoma tentar
traduzir noutra grelha vai encontrar um codo de stop e a traduo pra. Isto
alterando a grelha de eitura h codes stop que param o processo.

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