Molecular Biology and Genetic Engineering (2017)

DETECCIN DE ALIMENTOS MODIFICADOS GENTICAMENTE

lvarez Manuel1 Fuentes Karen1 Hernndez Mara J.1 Hernndez Yhara1 Villadiego Heifren1
E-mail: manuelalvares1208@hotmail.com
1
Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa, Lnea de
profundizacin en Biotecnologa, Ingeniera Gentica, Sincelejo Colombia.

Resumen
Teniendo en cuenta el manejo de aislamiento y purificacin de ADN es un mtodo muy empleado en la
biologa molecular e ingeniera gentica, como medio de obtencin de fragmentos de ADN de inters en
nuestro caso importancia para el investigador al momento de analizar un alimento genticamente
modificado; en esta prctica se aisl ADN de una galleta Galleta Club social trigo y un mecato marca ( )
utilizando mtodos de electroforesis y PCR para los cuales se observara resultados en forma de bandas
de ADN en un transiluminador para la comparacin con las muestras controles una silvestre y una
modificada genticamente.

Palabras clave: Plantas transgnicas, ADN, electroforesis, PCR, alimentos modificados.

INTRODUCCIN transferencia de genes entre organismos vivos de

El anlisis de OGM consiste en la deteccin y
cuando se desee, la cuantificacin de las
secuencias genticamente modificadas que estn
presentes en las muestras analizadas (plantas,
producto semiprocesado o alimentos
procesados). [1]. En la actualidad, mediante el
uso de la ingeniera gentica y la biotecnologa,
se ha logrado la insercin de material gentico
forneo en organismos de diferentes especies.
Estos avances, entre otras aplicaciones, han
permitido la obtencin de plantas que muestran
una mayor resistencia a las plagas, a sustancias
qumicas especficas y/o a los cambios
climticos. Adems, ha hecho posible
incrementar la produccin de determinados
compuestos existentes en las especies
hospederas, sean stas de origen animal o
vegetal; lograr la expresin de diversas
sustancias qumicas que inicialmente no
formaban parte de su metabolismo, e incluso se
ha llevado a cabo el silenciamiento de genes
especficos. Con el desarrollo de la
Biotecnologa, y mediante el uso de la ingeniera
gentica, se ha logrado la manipulacin y
diferentes especies. Todo este proceso es llevado
a cabo mediante la aplicacin de numerosas
tcnicas que han contribuido de forma importante
al desarrollo de la humanidad. Sin embargo, en el
caso particular de los productos obtenidos por
medios biotecnolgicos, se requiere incrementar
el rigor cientfico para garantizar la inocuidad y
seguridad de estos compuestos que son utilizados
como alimentos, principios activos de
medicamentos, o bioproductos capaces de
interactuar con el medio ambiente. [2].
Las principales tecnologas que permiten evaluar
la presencia de organismos genticamente
modificados (OGM) se basan fundamentalmente
en la evaluacin del ADN recombinante, o en la
deteccin de la nueva protena expresada, y que
es el producto de las modificaciones hechas en el
genoma hospedero. Estos controles han ido en
ascenso con el desarrollo de las investigaciones.
Sin embargo, en muchos casos el crecimiento
exponencial no ha ido aparejado al crecimiento
del desarrollo biotecnolgico. [3]. Los mtodos
de deteccin (cualitativos o cuantitativos) de los
organismos genticamente modificados (OGM)
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se basan, fundamentalmente, en la determinacin OBJETIVOS

de las modificaciones introducidas en el cido
desoxirribonucleico (ADN), as como en la Asilar el ADN de producto alimenticio y
deteccin de las nuevas protenas secretadas en el tejido vegetal.
organismo genticamente modificado y que son Determinar la presencia del promotor 35s y
los productos de la transgnesis. Existe un tercer Tubulina a travs de la reaccin en cadena de
mtodo que permite determinar la presencia de la polimerasa PCRF.
los OGM a partir del anlisis de las variaciones Determinar mdiate procesos selectivos de
fenotpicas de las especies en estudio, pero solo caracterizacin gentica, si los productos
es aplicable si la transgnesis es evidente en el implementados en la prctica presentan
organismo transgnico, despus de modificaciones genticas.
comparaciones con el fenotipo de la contraparte
no modificado genticamente. [4].
MATERIALES Y REACTIVOS
La reaccin en cadena de la polimerasa (aplicada
metodolgicamente en este trabajo como PCR en Frasco para
alusin a las siglas en ingls Polymerase Chain almacenaje
Reaction) es el principal mtodo de deteccin de de residuos
los OGM a partir de las modificaciones hechas en de 1-
propanol
el ADN nativo. Esta tcnica de Biologa
molecular fue descrita en 1986 por Kary Mullis y
se refiere a la amplificacin enzimtica de un
fragmento de cido nucleico (ya sea ADN o
ARN) que acta como fragmento original o
molde. [5].
3 ml de
Los usos de la PCR son mltiples, pues una vez tris/EDTA
amplificada la muestra del ADN molde, es (TE) con
posible la identificacin de la presencia de RNasa A.
microorganismos (virus/ bacterias) causante de
una enfermedad especificada; la realizacin de la
secuenciacin del ADN y el anlisis funcional de
genes; la identificacin de los cadveres de
personas desconocidas; la realizacin del Tubos de
diagnstico de trastornos hereditarios, la microcentrfu
identificacin de huellas genticas (muy usadas ga
en tcnicas forenses y test de paternidad); y la
deteccin y diagnstico de enfermedades
infecciosas, entre otras muchas. [6].
En el presente trabajo se dan a conocer algunas
de las principales tcnicas y mtodos analticos
utilizadas en la deteccin de la presencia de un
producto genticamente modificado, junto con
las bondades, aplicaciones y limitaciones de las
mismas.
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Micropipetas primer/
loading dye
mix.

Tubos de
microcentrifu
ga.

Hojas de
Soya de tipo
silvestre. Galleta Club
social trigo

Hojas de
Soya roundup
ready.

Cheetos
(yupi)

20 ml del
tampn de
Edwards.

10 ml de
isoporpanol METODOLOGA
al 100%. 1). EXTRACCIN DE ADN AISLAR ADN
DE SOJA Y PRODUCTOS ALIMENTICIOS
500 2). AMPLIFICAR ADN POR PCR
microlitros WT= silvestre
35s primer /
TRR= transgnica
loading dye
mix. TFP= producto alimenticio

500
microlitros
tubulina
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6. Aadir 100l de tampn de Edwards a

cada tubo que contiene el material
alimenticio o planta.
7. Triturar con un mini pistilo plstico
limpio contra la superficie interior del
tubo de 1.5 ml, macerar con fuerza el
contenido completo, hasta
aproximadamente un minuto.

3). Electroforesis
- TBE 1X 600ml
-Agarosa 0,8%; 70ml
-Sybr Safe 5
-Orange G. 3 + 7 de ADN
Extraccin de ADN de los productos
alimenticios:
1. Realizar el pesaje de los tubos eppendorf 8. Aadir 900 l de tampn de Edwars a
vacos. cada tubo que contiene la muestra
Para la Galleta: triturada.
9. Agite los tubos durante 5 segundos en el
Tubo vaco: 1.070g vortex.
10. Hervir las muestras durante 5 minutos en
Tubo + Galleta: 1.118g TFP un bao de agua o bloque de
calentamiento.
Muestras de control:
Negativo: silvestre 0.012g WT
Positivo: transgnico 0.002g TRR

2. Tomar una porcin del producto a utilizar

y someterlo a triturado, cubrindolo con
un pedazo de papel limpio, hasta producir
un polvo del producto.
3. Introducir el polvo obtenido del triturado
(producto), hasta la marca 0.1 ml del
tubo, el cual posee una capacidad de 1.5
ml.
4. Pesar los tubos eppendorf con su
respectiva cantidad de triturado.
11. Colocar los tubos en configuracin
5. Etiquetar el tubo con el tipo de alimento
equilibrada en la centrifuga, y centrifugar
y el nmero del grupo.
a 12000 rpm durante dos minutos para
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sedimentar los desechos celulares y restos 19. Incubar la solucin de TE/RNasa a

alimenticios. temperatura ambiente durante cinco
12. Transferir 350 l de cada uno de los minutos.
sobrenadantes a un tubo nuevo. Mantener 20. Llevar a microcentrifugar a 14000 rpm
las etiquetas respectivas para cada planta, los tubos durante un minuto, para
alimento y nmero de grupo. precipitar cualquier material que no se
haya disuelto.
21. El ADN puede ser usado inmediatamente
o almacenado a -20 C hasta que se est
listo para iniciar con la siguiente parte
experimental.
Tabla de volmenes y concentraciones
agregadas.

13. Aadir 400 l de isopropanol a cada tubo Volumen del gel 70ml
de sobrenadante.
14. Mezclar invirtiendo los tubos varias % agarosa 0.8%
veces, y dejar a temperatura ambiente por
un tiempo de tres minutos. T: 150C
15. Llevar los tubos a centrifugar a 14000
Rpm: 130
rpm durante un tiempo de cinco minutos.
16. Verter cuidadosamente y desechar el Buffer de corrido Tris borato EDTA
sobrenadante de cada tubo. Retirar por
completo el lquido restante con ayuda de
Voltaje 80
la micropipeta calibrada en 100 l.
Tiempo: 60min

Volumen de la ADN: 7l
muestra
Orange: 3l

Volumen del 7l ms 3l del

marcador buffer orange

Para preparar el buffer tris- borato EDTA (TBE

1X) se realiz lo siguiente:
17. Dejar secar al aire los pellets dejando los
tubos con las tapas abiertas durante diez
minutos. El isopropanol restante se
evaporara.
18. Aadir 100 l de TE/ tampn de RNasa a
cada tubo. Disolver los pellets de cido
nucleico.
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Calculo del gel

Gel: 0.8%

% = %

.%
% = = .
%

AMPLIFICAR ADN POR PCR

Use una micropipeta con una punta nueva para

agregar 2,5 L de ADN de soja de tipo salvaje o
Nivelacin de la cmara de
Roundup Ready (de la Parte II) al tubo de
electroforesis para el gel.
reaccin apropiado marcado como "T WT" o "T
RR".

Programe el termociclador para 32 ciclos del

siguiente perfil. El programa puede estar
vinculado a un programa de espera de 4 C
despus de que se completen los 35 ciclos.

Tapado del gel para

solidificacin.

Agitacin con
calentamiento magntico

Calculo de TBE para preparar el gel

C1= 20x
C2 = 1x

V2= 100ml (TBE)

=

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ANALIZAR LOS PRODUCTOS PCR POR
GEL ELECTROFORESIS
Use una micropipeta con una punta nueva para
agregar 20 L de cada muestra / mezcla de tinte
de carga en diferentes pocillos de un gel de
agarosa al 2%, de acuerdo con el siguiente
esquema. (Si us aceite mineral durante la PCR,
perfore la punta de su pipeta a travs de la capa
de aceite mineral para extraer los productos de
PCR, y deje el aceite mineral en el tubo original).
ANALIZAR LOS PRODUCTOS PCR POR
GEL ELECTROFORESIS
Cargue 20 L del marcador de peso molecular
(pBR322 / BstNI) en un pocillo.
Ejecute los geles a 130 V durante
aproximadamente 30 minutos. Se habr
producido una separacin adecuada cuando el
frente de colorante rojo de cresol se haya movido
al menos a 50 mm de los pocillos.
ANALIZAR LOS PRODUCTOS PCR POR
GEL ELECTROFORESIS
Para la tincin de CarolinaBLU , se sigui las
instrucciones proporcionadas por el instructor.
Visualizar el gel con transiluminacin y
fotografelo con una cmara digital o instantnea.
RESULTADOS Y ANLISIS
Un aspecto que origina polmica es el empleo de
ADN de una especie distinta a la del organismo
transgnico; por ejemplo, que en maz se
incorpore un gen propio de una bacteria del suelo,
y que este maz est destinado al consumo
humano.
No obstante, la incorporacin de ADN de
organismos bacterianos e incluso de virus sucede
de forma constante en cualquier proceso de
alimentacin. De hecho, los procesos de
preparacin de alimento suelen fragmentar las
molculas de ADN de tal forma que el producto
ingerido carece ya de secuencias codificantes (es
decir, con genes completos capaces de codificar
informacin. Ms an, debido a que el ADN
ingerido es desde un punto de vista qumico igual
ya provenga de una especie u otra, la especie del
que proviene no tiene ninguna influencia.
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Marcador
35 S PBR322/BstNI Tubulina 35 S Tubulina 35 S Tubulina 35 S Tubulina 35 S

Soya Galleta
Roundup Soya Club
Ready Soya tipo Roundup social Yupi
(RR) salvaje (WT) Ready trigo cheetos

Tabla 1. Mapa de siembra par la electroforesis. Resultado para la amplificacin de ADN = no

muestra bandas en el gel; bandas vistas en el gel de agarosa.

El promotor 35S se est utilizando en casi todos
los cultivos transgnicos actualmente cultivados
o probados, especialmente maz GM. Es el
promotor de eleccin para la ingeniera gentica
de plantas, ya que es un promotor fuerte y
constitutivo. La falta de reconocimiento o de
tener en cuenta su capacidad de ser
universalmente activo en casi cualquier
organismo es irresponsable y descuidado y
muestra una grave falta de rigor cientfico y
compromiso con la seguridad. (Lewin A, Jacob
D, Freytag B, Appel B.1998).

Imagen 1. Electroforesis en gel de agarosa del ADN de ingredientes alimenticios, extrado para la
prueba de transgnicos; posos: 1. Soya Roundup Ready (RR) (35 S) 2. Marcador PBR322 3. Soya tipo salvaje
(WT) (Tubulina) 4. Soya tipo salvaje (WT) (35 S) 5. Soya Roundup Ready (Tubulina) 6. Soya Roundup Ready
(35 S) 7. Galleta Club social trigo (Tubulina) 8. Galleta Club social trigo (35 S) 9. Yupi cheetos (Tubulina) 10.
Yupi cheetos (35 S). Los resultados arrojan que los productos alimenticios utilizados para el corrido de
ADN no son transgnicos.
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Al momento de observar el gel de agarosa
imagen #1, las bandas en los posos con marcaje
de tubulina dieron positiva debido a que esta es
una protena globular que por polimerizacin da
lugar a los microtbulos en las clulas eucariotas,
que a su vez forman los cilios, flagelos y
centriolos, aparte de otros sistemas
citoesquelticos intracelulares.
La agarosa es un polisacrido (originalmente
obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composicin ms homognea), cuyas disoluciones
(tpicamente de 0,5 a 2%) poseen la propiedad de
permanecer lquidas por encima de aprox. 50C y
formar un gel, semislido, al enfriarse. Este gel
est constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras polimericas, embebida en
gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso
de las molculas de cido nucleico a su travs, en
mayor medida cuanto ms grandes sean stas.
Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde
adecuado, se dejan en l unos huecos o pocillos
para poder introducir luego en ellos la muestra, y
que as sta se vea obligada a introducirse en el
seno del gel cuando apliquemos el campo elctrico
(Sambrook,2001).
Los fragmentos de DNA se cargan sobre el gel
horizontal de agarosa, el cul fue sumergido dentro
de una cmara contenedora de una solucin
amortiguadora. Para poder separar fsicamente los
fragmentos de DNA fue necesario aplicar una
corriente elctrica entre dos electrodos ubicados en
ambos extremos de la cmara. Estos fragmentos de
DNA poseen una carga negativa por Los grupos
fosfato de su esqueleto de azcares-fosfato, por
ende al someterlos a un contacto en un campo
elctrico estos migran hacia el polo positivo.
La matriz de agarosa acta como un tamiz
molecular separando las molculas ms pequeas
de DNA (que migran ms rpidamente) de las ms
grandes (que migran ms lentamente). Por lo cual
se puede inferir, que la velocidad a la cual las
molculas de DNA migran a travs de una matriz
de agarosa es inversamente proporcional a su masa
molecular. Despus de un rato que ha corrido el
gel, los fragmentos ms cortos de ADN estarn
ms cerca del extremo positivo del gel y los ms
largos se mantendrn cerca de los pozos. Los
fragmentos de ADN muy pequeos podran
correr hasta salirse del gel si lo dejramos
corriendo por demasiado tiempo.
Los tamaos exactos de los fragmentos de ADN
separados pueden determinarse trazan-do el
registro del peso molecular de las distintas
bandas de un estndar de ADN contra la distancia
recorrida por cada banda.
CONCLUSIN
Con el incremento de las nuevas tecnologas y su
habilidad para realizar diferentes ensayos que
pueden estar basados tanto en la presencia de
ADN recombinante como de la protena
expresada, han aumentado las probabilidades de
deteccin de los OGM. Asimismo, ha ocurrido
una diversificacin de tales mtodos y ensayos de
deteccin.
El uso de las tecnologas siempre ha sido
considerado una importante contribucin al
desarrollo de la humanidad. Sin embargo, en el
caso particular de los productos obtenidos por
medios biotecnolgicos, se hace necesario
incrementar el rigor cientfico que garantice la
inocuidad de los alimentos ADN modificados, de
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los frmacos obtenidos por recombinacin
gentica, y los productos textiles provenientes de
plantas genticamente modificadas.
En la actualidad, mediante el uso de
diversas tcnicas de la biologa molecular que
son capaces de detectar la mnima variacin en el
genoma de las especies transgnicas, ha sido
posible desarrollar un sistema de normas y
procedimientos que garantizan, no solo la
seguridad de los seres humanos, sino tambin la
seguridad del equilibrio natural, pues no se debe
olvidar que la ruptura del eslabn ms dbil de la
biodiversidad (animal o vegetal) podra causar
efectos irreversibles que atentaran contra la
existencia de la vida en el planeta.
Se puede concluir que la metodologa
desarrollada para la deteccin, incluyendo la
PCR para verificar la integridad del ADN y la de
deteccin del transgen, fue efectiva. Esta
secuencia de pasos es aplicable para detectar
transgenes que contengan el promotor 35S
CaMV en toda fuente de protena de soya que sea
utilizada como ingrediente, as como en
productos alimenticios terminados.
CUESTIONARIO
1. describe el propsito de cada uno de los
siguientes pasos o reactivos utilizados en el
aislamiento del ADN (parte II):
A. triturar con mortero: Los morteros permiten
mezclar los diversos ingredientes para obtener
una sustancia homognea. El mortero y el piln
es uno de los iconos ms comunes que se asocian
con la actividad farmacutica. Se puedan romper
las membranas de y queden los ncleos sueltos.
B. Tampn de Edward: EDTA. Inhibidor de
metaloenzimas tales como nucleasas que
degradan el ADN. Secuestra los iones magnesio
Mg2 + y as bloquea la actividad de muchas
nucleasas que dependen de este ion.
C. Ebullicin: El calentamiento con bao de
mara es utilizado para acelerar las reacciones
enzimticas, en nuestro caso posiblemente para
mejorar el efecto que tiene el tampn de
Edwards, adems para homogenizar las muestras
en los tubos ependorf.
D. tris- EDTA (TE) tampn con RNasa A: El
tampn TE es una solucin tampn comnmente
utilizada en biologa molecular, especialmente en
procedimientos que implican ADN, ADNc o
ARN. "TE" se deriva de sus componentes: Tris,
un tampn de pH comn, y EDTA, una molcula
que quela cationes como Mg 2+. El propsito del
tampn TE es solubilizar el ADN o el ARN, al
mismo tiempo que lo protege de la degradacin.
2. Cul es el propsito de llevar a cabo cada
una de las siguientes reacciones de PCR:
A. Tubulina: protena de marcaje no modificado
para visualizacin de las bandas en el gel de
agarosa.
B. soya tipo silvestre: control negativo no
modificado.
C. soya Roundup Ready: control positivo
modificado para la visualizacin en la
electroforesis.
3. Cul muestra(s) en los geles de las figuras
o fotos de la pgina siguiente o anexo,
muestran los siguientes patrones de bandas?
Explicar el significado de cada patrn de
bandas. (Foods 1 y 2 mostrados, son dos
ejemplos de los resultados esperados.
Recuerde que sus propias muestras pueden
producir cualquiera de las combinaciones de
la tubulina y 35s en la tabla a continuacin.)
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187 pb 162 pb Muestras

(tubulina) (35s) mostradas,
patrn y

187 pb

162 pb
explicacin

Presente Presente Foods 2

Presente Ausente Foods 1

Ausente Ausente NO

Ausente Ausente NO

Promotor 35s, este promotor es debido a que este

es un constitutivo muy fuerte que causa altos
niveles de expresin gnica en plantas
dicotiledneas, adems es una secuencia que en
este caso est marcada como organismo
transgnico.

Tubulina, es una protena globular de 55 Kdalton

responsable de uno de los principales
componentes del citoesqueleto. Esta no es
modificada genticamente y permite la
visualizacin en el gel debido a la adicin del
Orange G.

4. observar la fotografa del gel teido que

contiene su muestra y las de otros estudiantes.
Oriente la fotografa con los pozos en la parte
superior o sea hacia arriba. Interpretar cada
carril del gel.
Localizar el carril que contiene el Marcador
PBR322/BstNI en el lado izquierdo del gel.
Comenzando en el pozo, localizar las bandas
correspondientes a cada fragmento de restriccin:
1.857 pb, 1058 pb 929 pb, 383 pb y 121 pb (puede
ser leve o difusa). Alternativamente, localizar el
carril que contienen la escalera de 100 pb, con la
banda de migracin mas rpida igual a 100 pb y
cada banda sucesiva mayor a 100 pb (100, 200, 300,
400, etc).
Imagen 2. Gel de agarosa con localizaciones de
Marcador PBR322/BstNI en el lado izquierdo
del gel. Comenzando en el pozo bandas
correspondientes a cada fragmento de
restriccin: 1.857 pb, 1058 pb 929 pb, 383 pb.
Debido a que en la prctica no es posible
visualizar muy bien el corrido de cada banda en
el gel de agarosa, la identificacin de la
migracin ms rpida igual a 100 pb no es
correctamente identificada, y sucesivamente las
mayores a esta.
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REFERENCIAS
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Cold Spring Harbor Laboratory Press.
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