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REAES DE PRECIPITAO:

Interaes secundrias
Avaliam alteraes que o anticorpo induz no
estado fsico do antignio.

Reao de precipitao
Reao indicada pela formao de um precipitado visvel quando
antignio e anticorpo, ambos solveis, se ligam.
O precipitado constitudo por agregados de antignio em rede com
anticorpos (complexos Ag:Ac ou imunocomplexos).
A mistura de anticorpos tem
que reconhecer diferentes
epitopos do antignio.

O antignio tem que ter pelo


menos dois epitopos diferentes.

PRECIPITADO

Reao de precipitao

Anticorpos policlonais Obtidos a


partir de soros de animais inoculados com
um determinado antignio. O referido soro
contm uma mistura de anticorpos, cada um
dos quais interage com um eptopo
especfico.

Os anticorpos monoclonais tm
especificidade para um nico eptopo, de
modo que, nesse caso, o antignio ser
monovalente, sendo difcil a precipitao.

1
Os anticorpos monoclonais tm
especificidade para um nico epitopo, 15
de modo que, nesse caso, o antignio
ser monovalente, sendo difcil a
precipitao.

15

Reaco de precipitao
afectada por:
Reao
Reaco de precipitao
de precipitao
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo
afectadatempara
por: afetada pela:o que depende da sua classe estrutural)
o antignio,
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo tem
Valncia do anticorpo (nmero de locais de ligao que cada anticorpo
para o antignio,
tem para o antignio, IgM
o que depende da sua classe estrutural)
IgD
o que depende da sua classe estrutural)

IgM IgD Valncia Ac = 4


Valncia Ac = 10
IgD, IgE, IgG IgA IgM
Valncia AC=2 Valncia Ac = 4
Valncia AC=4 Valncia AC=10
Valncia Ac = 10
Valncia do antignio (nmero mximo de anticorpos que se podem
Valncia
ligar a uma do antignio
molcula de(nmero mximo
antignio num dedeterminado
anticorpos que se podem o
momento, ligar
quea
Valncia do umaantignio (nmero
molcula mximo num
de antignio de anticorpos que se
determinado podem o que depende de
momento,
depende
ligar a uma molculadede
efeitos estereoqumicos)
antignio num determinado momento, o que
efeitos
depende de efeitos estereoqumicos)
estereoqumicos)

2 eptopos 6 eptopos
2 epitopos
2 epitopos Valncia do Ag= 2 6 epitopos
Valncia do Ag= 4
6 epitopos
Valncia
Valncia Ag =2 Ag = 2 Valncia Ag = 4 Valncia Ag = 4
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
Ambas as valncias tm de ser 2 para que ocorra precipitao.
16
16

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Precipitao em gel
Mtodo que permite observar reaes de precipitao atravs da difuso do
antignio e/ou do anticorpo um em direo ao outro em meio semi-slido (agar
ou agarose)

IMUNODIFUSO

Simples Dupla
Um dos componentes (o Ag ou o Ac) permanece fixo ao suporte Tanto o Ag como o Ac so mveis, difundem-se
(agar) enquanto o outro se difunde at haver precipitao do um em direo ao outro at ocorrer precipitao
complexo.

Imunodifuso linear Unidimensional


Imunodifuso radial Bidimensional

1. IMUNODIFUSO LINEAR SIMPLES (ID)


(Oudin, 1946)

1.Soro (Ac) fixo no gel


2.Gelificao no tubo
3.Adio do Ag (presente
na amostra a analisar) Gelificao Incubao
no no cimo da coluna.
4.Difuso unidirecional do
Ag AG AG
Gel
5.Precipitao na zona de + ppt
AC
equivalncia

Envolve a incorporao de um anticorpo ou de um antignio num meio semi-slido de


agar ou de agarose
A distncia entre o limite externo do halo de precipitao e o ponto de aplicao
directamente proporcional concentrao da substncia, presente na amostra a
analisar (AG ou AC), que se difunde atravs do agar

2
2. IMUNODIFUSO LINEAR DUPLA
(Oakley e Fulthorpe, 1953)

1.Gel contendo Ac (agar 1%)


2.Gelificao no tubo
3.Adio de agar sem nada e solificao (agar
0,5%)
4.Adio de gel com Ag (agar 1%)
5.Difuso dos diferentes componentes em
direes opostas
6.Precipitao na zona de equivalncia

Nota: podero ser visveis outras bandas.


Banda mais fina e mais prxima do fundo do tubo Ag em excesso
Banda mais fina e mais prxima do cimo do tubo Ac em excesso
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Imunodifuso radial simples


Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012
(Mancini e Fahey, 1965)
3. IMUNODIFUSO RADIAL SIMPLES
Imunodifuso
Mtodo que (IDR)
radial
permite quantificar
simples
antignio ou anticorpo.

(Mancini e Fahey,
(Mancini 1965) 1965)
e Fahey,
Colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de
agar que contm fixo o anticorpo respectivo (ou antignio); o antignio difunde-se de forma radial e precipita
aps reaco com o anticorpo formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. O
Mtodo
quadrado doque permite
dimetro quantificar
do anel de precipitao antignio
proporcionalou anticorpo.
concentrao do antignio.

Mtodo que permite quantificar Ag ou Ac. Colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de
agar que contm fixo o anticorpo respectivo (ou antignio); o antignio difunde-se de forma radial e precipita
aps reaco com o anticorpo formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. O
Imunodifuso
Colocam-se concentraes definidas de Ag(ou radial simples quadrado do dimetro do anel de precipitao proporcional concentrao do antignio.

Ac) nos poos abertos (Mancini


num gel de agar e Fahey,
que 1965)
contm o anticorpo respectivo
Mtodo incorporado
que permite quantificar (ou antignio ou anticorpo.
Ag); Colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de

agar que contm fixo o anticorpo respectivo (ou antignio); o antignio difunde-se de forma radial e precipita
o Ag difunde-se de forma aps
radial e na zona de
reaco com o anticorpo formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. O
quadrado do dimetro do anel de precipitao proporcional concentrao do antignio.
eqivalncia Ag-Ac, o imunocomplexo precipita
num anel de concntrico cuja rea pode ser 21

determinada.
Colocando em simultneo amostras com 21

concentraes conhecidas pode-se fazer uma


avaliao quantitativa da [Ag] na amostra.
Utilizao: quantificao de IgA, IgG e IgM.

21

Imunodifuso radial simples


Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas.

Imunodifuso radial simples


Utilizao: dosagem de IgG, IgA e IgM e protenas sricas.
Anel de
precipitao
IgG anti-IgG

Imunologia Oral TP
Imunodifuso radial simples
Aula 5 e 6 MaroAnel
2012de
precipitao
Poos onde so
colocados
Agarose
IgG anti-IgG padres e
Utilizao: dosagem de IgG, IgAcontendo
e IgM e protenas sricas. amostras a
anticorpos serem doseadas.
anti-IgG humana Poos onde so

Agarose
contendo
IDR colocados
padres e
amostras a
anticorpos serem doseadas.
Anel de anti-IgG humana
Imunodifuso radial simples precipitao
Medio dos halos de precipitao
Medio dos anis de precipitao
IgG anti-IgG
22

Poos onde so
colocados
Agarose padres e
contendo amostras a 22
anticorpos serem doseadas.
anti-IgG humana

11
22

11
Determinao da concentrao da 23

protena com auxlio da curva de


calibrao feita com os padres (de
concentrao conhecida).

O quadrado do dimetro do anel de 11


precipitao proporcional concentrao
do Ag.
Imunodifuso radial simples

Determinao da concentrao
da protena com auxlio da
curva de calibrao feita com
os padres (de concentrao
conhecida).

24
3
IDR

IDR
Padres Amostras

Aneis de
Precipitao A B C a b c

Curva Padro

4. IMUNODIFUSO RADIAL DUPLA


(Ouchterlony, 1947)

1. Coloca-se agar numa placa de petri ou


lmina.
2. Aps solidificado, o agar perfurado
formando poos onde so depositadas
pequenas quantidades de Ag e Ac.
3. Quer o Ag, quer o Ac, se difundem em O meio gelosado serve apenas de suporte ao AG e
forma radial a partir do seu poo e, ao AC, que esto livres para se moverem na direco
quando o Ag e o Ac se encontram em um do outro e precipitarem no ponto ptimo da
equivalncia, formam-se bandas
(arcos) de precipitao. Estas podem relao entre a concentrao do AG e do AC.
ser visualizadas aps lavagem do gel
para remoo das protenas solveis,
por colorao das bandas com corante O gradiente de concentrao estabelecido
apropriado. mutuamente pelo AG e pelo AC.
Permite determinar se dois antignios
so semelhantes (se partilham os
mesmos epitopos).

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1 2

Imunodifuso radial dupla


(Ouchterlony, 1947)
1. Coloca-se agar numa placa de petri ou
lmina.

2. Aps solidificado, o agar perfurado


3 formando poos onde so depositadas
pequenas quantidades de Ag e Ac.

3. Quer o Ag, quer o Ac, se difundem em


forma radial a partir do seu poo e, quando
o Ag e o Ac se encontram em equivalncia,
formam-se bandas (arcos) de precipitao.
Estas podem ser visualizada aps lavagem
do gel para remoo das protenas solveis,
por colorao das bandas com corante
apropriado.

Permite determinar se dois antignios


so semelhantes (se partilham os
mesmos epitopos).

25

Imunodifuso radial dupla


Formao do precipitado aps difuso das molculas de Ag e Ac
at ao seu ponto de equivalncia.

Ag Ag

Ac

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13
5
Reao de identidade
Antignios com eptopo 1

1 1

1 1

Precipitado
Anti-1-1

Antisoro anti-1

O Ac precipita o eptopo que existe em ambas amostras de Ag.


Formam-se 2 linhas de precipitina que se fundem completa/ na interseco e
so contnuas.
Isto no significa que os AG sejam exactamente iguais. So considerados
idnticos, na medida em que o AC no consegue detetar essa diferena.

Reao de no identidade
Anti2-2 Anti1-1

Ag 1 2 Ag
com com
Eptopo 1 Eptopo 2
1 2

pp Anti1-1
pp Anti2-2

Anti2 Anti1

Nenhum dos eptopos partilhado pelas duas amostras de Ag


as linhas de precipitina intersetam-se.
O AC distingue os Ag diferentes que formam linhas independentes
de precipitina.

Reao de identidade parcial


Linha prologanda (spur) anti1-1

Ag com 1 2 2 Ag com
eptopos eptopo 2
1e2 2
2 1

1 1/2
Precipitado
Anti2-2

Precipitado
Anti1-1,2 e
Anti2-1,2
Anti2 Anti1

Trata-se de Ags diferentes, mas que partilham eptopos (eptopo 2).


A linha de precipitina, que corresponde ao eptopo 1 e AC homlogo, exibe um
prolongamento (spur) dirigido ao poo com menos eptopos reativos.
H uma identidade parcial entre as duas preparaes de Ags.

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Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012
Imunologia Oral TP Aula 5 e 6 Maro 2012

Imunodifuso radial dupla


Imunodifuso
Aplicao: avaliao da radial dupla
concentrao relativa do antignio.
Aplicao: avaliao da concentrao relativa do antignio.

[b] <
[b] > [b] <
[b] >

Quando um antignio tem uma concentrao relativamente superior, a zona de


equivalncia
Quando forma-se
um antignio umuma
tem pouco mais afastada
concentrao do poo em
relativamente que foi adepositado.
superior, zona de
equivalncia forma-se um pouco mais afastada do poo em que foi depositado.
Quando um antignio tem uma concentrao relativamente inferior, a zona de
equivalncia
Quando forma-se
um antignio umuma
tem pouco mais prxima
concentrao do poo. inferior, a zona de
relativamente
equivalncia forma-se um pouco mais prxima do poo.

33
33

Imunodifusoradial
Imunodifuso radialdupla
dupla
Aplicao: Evoluo dos passos de purificao de uma protena
Aplicao: Evoluo dos passos de purificao de uma protena

Controlo com albumina


Controlo com albumina
pura (com anticorpos contra as
pura (com anticorpos contra as
protenas do material a
(para verificar a sua protenas do material a
(para verificar a sua purificar)
identidade com a banda purificar)
identidade com a banda
presenteno
presente notimo
timopasso
passode
de
purificao.)
purificao.)

Poo1-
Poo 1-material
materialaapurificar
purificar
Poo2-
Poo 2-apresenta
apresentauma
umabanda
bandaa amenos
menosquequeo o
11(2(2 mais
mais puro
puro que
que 1).1).
Poos33ee44 apresenta
Poos apresentasomente
somentea abanda
bandacontnua
contnua correpondente
correpondente albumina
albumina
(Protena pura).
(Protena pura).

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Imunodifuso radial dupla


Aplicao: Avaliao semi-quantitativa (Titulao de anti-soros)

Diluies crescentes dos anti-soros (anticorpos)

s/ dil. 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

Anti-soro 1
Antignio
(concentrao
Anti-soro 2 constante)

Ttulo do anti-soro = inverso da ltima diluio que deu um resultado positivo.

1 1
Ttulo do anti-soro 1 = =8 Ttulo do anti-soro 2 = =4
1 1
8 4

35

7
Para pensar ...
Antignio
(concentrao
Anti-soro 2 constante)

Ttulo do anti-soro = inverso da ltima diluio que deu um resultado positivo.

1 1
Ttulo do anti-soro 1 = =8 Ttulo do anti-soro 2 = =4
1 1
8 4

35

Para pensar ...


Exerccio: Fazer corresponder os antignios A, B, C e D aos
respectivos conjuntos de epitopos:
(1,2); (1,4); (3,2); (3,4)

Anti-1,4 Anti-3,4

A = (1,2); B = (3,4); C = (3,2); D = (1,4)

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18
IDR- simples vs dupla

Difuso simples
O meio de suporte (gel) contm um reativo
em concentrao uniforme
Apenas os desconhecidos se movem atravs
do gel

Difuso dupla
O gel inerte (no contm reativos)
Quer o Ag, quer o Ac difundem-se atravs do
gel.

2. ELETROIMUNOENSAIOS
Contra-imunoeletroforese (CIE)

Imunoeletroforese cruzada (CRIE)

Imunoeletroforese simples unidirecional de Laurell


(rocket)

Imunoeletroforese (IEF)

8
a. CONTRA-IMUNOELETROFORESE
ou
IMUNOELETROFORESE DUPLA, UNIDIRE-
CIONAL (CIE)

b. IMUNOELETROFORESE CRUZADA (CRIE) ou


IMUNOELETROFORESE BIDIMENSIONAL

+ +

- -

c. IMUNOELETROFORESE SIMPLES
UNIDIRECIONAL DE LAURELL (rocket)

Esta tcnica tambm conhecida como


eletroforese em ponta de lana.

pH do gel escolhido de forma que os


AC no tenham mobilidade e o AG se
apresente carregado negativamente.
A g difunde-se em direo ao polo
positivo, ocorrendo pp nas margens
laterais do seu limite, formando-se um
cone a um foguete.

Esta tcnica pode ser aplicada maioria


dos AGs uma vez que os ACs possuem
um ponto isoelctrico relativamente
elevado (i.e., possuem carga neutra em
pH mais alcalino do que a maioria do
AGs).

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d. IMUNOELETROFORESE (IEF)
1. Electroforese separao dos AGs 3. Imunodifuso com o anti-soro e pp
Protenas individualizadas
Amostra
Linhas de pp
finais obtidas

Soro padro

2. Colocao do anti-soro

Anti-soro

Permite detetar anomalias nos componentes do soro por comparao de


uma amostra teste com um padro.

d. IMUNOELETROFORESE (IEF)

A caracterizao das anomalias qualitativas e quantitativas das


molculas proteicas, em geral, e das imunoglobulinas, em particular,
reveladas pela(o):
aspecto
posio
forma Arcos de precipitina
espessura
simetria
Deve ser efetuada em conjunto com os resultados obtidos por
eletroforese e pelo doseamento das protenas totais e
especficas.

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IMUNOFIXAO
AMOSTRAS POSSVEIS: soro, urina, LCR (lquido cefalorraquidiano)

REAES DE PRECIPITAO

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