Laboratorio N 1

Reconocimiento de
protenas y cuantificacin de
protenas por Bradford

INTRODUCCIN
Las protenas, son los pilares fundamentales de la vida. El cuerpo necesita protena
para repararse y mantenerse a s mismo. Cada clula en el cuerpo humano contiene
protenas, las cuales son una parte muy importante de la piel, los msculos, rganos
y glndulas.

Los cambios ambientales o los tratamientos qumicos pueden causar una

desorganizacin en la conformacin nativa de una protena, con la prdida
concomitante de la actividad biolgica. Esta desorganizacin se llama
desnaturalizacin. Como la informacin nativa slo es estable de manera marginal,
la energa necesaria para causar la desnaturalizacin es una frecuencia pequea,
quiz equivalente a la desorganizacin en tres o cuatro puentes de hidrgeno.
(Virginia Melo,2007).

La estructura fundamental de las protenas son los aminocidos, los cuales cuando
se juntan entre s, o bien, con otras sustancias, dan origen a las protenas simples
o conjugadas.

Dentro del amplio grupo de las protenas, podemos encontrar la ovoalbmina, que
se encuentra en la Casena que se encuentra en la leche, las cuales sern las que
estudiaremos su comportamiento ante la reaccin con diversos compuestos.

La determinacin de protenas, es un proceso mediante el cual se puede cuantificar

la cantidad de protenas presentes en diversas muestras. Por lo general, las
protenas ms importantes para los seres humanos son las que nos aportan la leche
la fuente principal e importante como lo es la carne.

OBJETIVO GENERAL
 Reconocimiento de alteraciones de protena en leche.
Cuantificacin de protenas mediante metodologa de Bradford.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Desnaturalizacin de protenas en leche con HCl, NaCl al 4% p/v, NaOH al

20% p/v y en altas temperaturas.
Nitracin de anillos de fenol mediante la reaccin Xantoproteicas.
Reconocer enlaces peptdicos por medio de la reaccin de Biuret.
Reacciones de aminocidos azufrados para verificar la presencia de azufre
en leche.
Cuantificar protenas mediante un espectrofotmetro.

MATERIALES
 Gradilla Tubos de ensayo
Pinza de madera Bao Mara
Pipetas graduadas Pro-pipeta
Leche Gotario
Vaso precipitado Espectrofotmetro
Micro-pipetas Tubos de vidrio
Agua destilada Vortex

Reactivos
cido clorhdrico HCl (puro)
cido ntrico HNO3
cido actico(CH3CO2H)
Acetato de plomo Pb(CH3COO)2
Sulfato de cobre Cu2SO4 al 1%
Reactivo de Bradford
Muestras patrones de protenas
Cloruro de sodio NaCl al 4%
Hidrxido de sodio NaOH al 20%

PROCEDIMIENTO

Desnaturalizacin o coagulacin de protenas:

A cuatro tubos de ensayo se le adicionaron 2mlde leche y se enumeran.
Al tubo numero 1 se le agreg 2ml de HCl puro.
Al tubo numero 2 se le agreg 2ml de una disolucin concentrada de NaCl al
4% p/v.
Al tubo numero 3 se le agreg 2ml de NaOH al 20%p/v.
El tubo numero 4 se le aplico calor mediante bao mara.
Reacciones Xantoproteicas:
A un tubo de ensayo se le agregaron 2ml de leche y 1ml de HNO 3
concentrado, se calent a bao mara durante un tiempo y luego se enfri en
agua helada y posteriormente se le aadieron unas gotas de disolucin al
40% p/v.
Reaccin de Biuret:
 A un tubo de ensayo se agregaron 2ml de leche y 2ml de Hidrxido de sodio
al 20% p/v, luego se aadieron unas gotas de solucin de Sulfato Cprico
diluido al 1% p/v.
Aminocidos azufrados:
A un tubo de ensayo s ele agregaron 2ml de leche, 2 ml solucin de Hidrxido
de sodio al 20% p/v y gotas de solucin de Acetato de Plomo al 5% p/v,
posteriormente se calent a bao mara.
Cuantificacin de protenas por Bradford:
En un tubo de vidrio se colocaron 0,5ml de leche y 2,5ml reactivo de Bradford.
En otros 9 tubos de vidrio se colocaron 0,5ml de patrn de protenas y 2,5ml
de reactivo de Bradford.

DATOS EXPERIMENTALES
Desnaturalizacin o coagulacin de protenas
Tubo N1 2mL de leche y 2mL de HCl puro
Tubo N2 2mL de leche y 2mL de NaCl al 4% p/v
Tubo N3 2mL de leche y 2mL de NaOH al 20% p/v
Tubo N4 2mL de leche ms calor

Reacciones Xantoproteicas:
Tubo N5 2mL de leche ms 1mL de HNO3 , calor, golpe de fro y gotas de
sosa al 40%

Reaccin de Biuret:
Tubo N6 2mL de leche mas 2mL de hidrxido de sodio al 20% p/v mas
gotas de solucin de sulfato cprico al 1% p/v

Reaccin de Aminocidos Azufrados:

Tubo N7 2mL de leche ms hidrxido de sodio al 20% p/v mas gotas de
acetato de plomo al 5% ms calor

DATOS BIBLIOGRFICOS
Casena: Es una fosfoprotena presente en la leche y en algunos de sus derivados
en la leche se encuentra en la fase soluble asociada al calcio en un complejo que
se ha denominado casingeno.

Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia

especfica. Son creadas por los ribosomas que traducen los codones de los genes
y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica.
Si la protena es alterada por algn factor externo, no es capaz de cumplir su funcin
celular.

Desnaturalizacin de protenas: Es un cambio estructural de las protenas, donde

pierden su estructura nativa y de esta forma, su ptimo funcionamiento adems de
cambiar sus propiedades fsicas y qumicas.

En la desnaturalizacin de la estructura cuaternaria, las subunidades de protenas

se separan o su posicin espacial cambia.

La desnaturalizacin terciaria implica los siguientes cambios:

Enlaces covalentes entre cadenas laterales de los aminocidos.

Enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de
aminocidos.
Enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas
laterales no polares de aminocidos.
En la desnaturalizacin de la estructura secundaria las protenas pierden todos los
patrones de repeticin regulares como las hlices alfa y adoptan formas aleatorias.

La estructura primaria, la secuencia de aminocidos ligados por enlaces peptdicos,

no es interrumpida por la desnaturalizacin, ya que esta es la estructura bsica de
toda protena.
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos
cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de
composicin desconocida.

Mtodo de Bradford

El mtodo de Bradford, cuantifica la unin de un colorante a una protena

desconocida y la compara con diferentes cantidades de otra protena estndar,
usualmente albumina de bovino. El complejo colorante-protena presenta un
mximo de absorcin de 595 nm. El colorante, en disolucin acida, se presenta en
dos formas una azul y la otra naranja. Este mtodo est diseado para cuantificar
entre 1 10 ug de protena. Es un mtodo simple, barato, confiable, rpido y pocas
sustancias interfieren en su determinacin.
RESULTADOS

Desnaturalizacin de protenas en leche:

Tubo n1 Se produce una reaccin exotrmica,
precipitacin y adems de la
desnaturalizacin de la casena.
Tubo n2 No ocurre ninguna reaccin.
Tubo n3 Ocurre un cambio de color y la
desnaturalizacin de la casena.
Tubo n4 No ocurre ninguna reaccin.

Reaccin Xantoproteicas ( Tubo n5):

leche + HNO3 concentrado + calor Cambio de color de blanco a amarillo.
leche + HNO3 concentrado + calor + Cambio de color de amarillo a
golpe de frio + CuSO4 1% p/v anaranjado.

Reaccin de Biuret:
Tubo n6 Ocurre la desnaturalizacin de la
casena y la formacin de un denso
color violeta, el cual representa la
presencia del cobre en la muestra.

Reaccin de aminocidos azufrados:

Tubo n7 Al agregar solo el NaOH la muestra se
vuelve lechosa y ocurre la
desnaturalizacin de la casena y al
aplicar acetato de plomo + Calor, la
muestra se vuelve oscuro lo cual indica
la presencia de sulfuro de plomo.
Cuantificacin de protenas por Bradford:
Absorbancia Concentracin (mg/L)
0,0 0
0,174 25
0,510 50
0,675 75
1,108 125
1,485 150
1.674 200
1,871 250
2,018 300
2,091 1:100

Curva de Calibracin
2.5
y = 0.0071x + 0.1348
R = 0.9549 2.018
2 1.871
1.674
1.485
ABSORBANCIA

1.5
1.108

1
0.675
0.51
0.5
0.174
0
0
0 50 100 150 200 250 300 350
CONCENTRACION (mg/L)

Y = 0,0071X + 0,1348
2,091 = 0,0071X + 0,1348
X = 275,52mg/L de protena
R2 = 0,9549
DISCUSIN DE RESULTADOS

En los tubos donde se produjo la desnaturalizacin de la protena debido a un

aumento del pH, ocurri un proceso irreversible, volvindose insoluble debido a que
la protena perdi sus propiedades fsicas y qumicas.

En las reacciones Xantoproteicas las protenas en presencia de HNO 3 se

desnaturalizan originando un anillo bencnico, que se forma con la entrada de un
NO3 y la salida de un OH. La nitracin se puede identificar mediante el cambio de
color a amarillo debido a la presencia de aminocidos aromticos.

Por otro lado en la reaccin de Biuret el grupo amino paso a ser un grupo carboxlico,
ya que est formado por una disolucin de sulfato de cobre en un medio alcalino,
este reconoce el enlace peptdico de las protenas mediante la formacin de un
complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos, lo que produce
una coloracin violeta.

Mientras que en las reacciones donde debemos identificar la presencia de

aminocidos azufrados el azufre que poseen algunos aminocidos se mezcla con
el plomo dado lugar al sulfato de plomo.
CONCLUSIN

Mediante los experimentos realizados en el laboratorio podemos decir que la leche

sufri grandes cambios en sus estructuras terciarias y cuaternarias, ya que en la
mayora de los tubos se produjo la desnaturalizacin de la casena, la que se separ
mediante la acidificacin formando precipitados blancos, provocando la prdida de
las propiedades fsicas y qumicas. El cambio de color detecta la presencia de
protenas.
Hay numerosos agentes desnaturalizantes, como el calor, pH, sales inorgnicas a
concentraciones elevadas, disolventes orgnicos, etc. La desnaturalizacin conlleva
cambios drsticos en las propiedades fsicas de las protenas: solubilidad, grado de
hidratacin, ndice de refraccin, etc. Son ejemplos de desnaturalizacin de
protenas: a) la albmina de la clara de huevo, transparente y semilquida, se
convierte por calentamiento en una masa blanca y slida (huevo fresco y cocido);
b) La casena de la leche soluble origina, por acidificacin, un precipitado
gelatinoso (yogur) (Jos M. Macarulla Flix M. Goi, 1994)
Por el mtodo de Bradford, podemos decir que a mayor concentracin mayor ser
la absorbancia y que las muestras deben ser diluidas para que el espectrofotmetro
nos entregue el valor de absorbancia. El valor R2 fue cercano a 1, por lo tanto, las
mediciones fueron correctas.
Este tipo de grfica es la ms apropiada para la calibracin espectrofotomtrica.
Existen muchas razones por las que este tipo de grficas se tornan curvas. Cuando
la pendiente tiende hacia el eje de la ordenada, se dice que la desviacin es positiva,
y cuando la pendiente se aproxima a la abscisa, la desviacin es negativa. (Wilbert
Villegas- Pablo Acereto, 2006)
BIBLIOGRAFA

Virginia Melo Ruiz, 2007, Bioqumica de los procesos metablicos, Revert,

Mxico, 99-100 pg.
Jos M. Macarulla Flix M. Goi, 1994, Bioqumica humana, Revert,
Espaa, 114-118 pg.
Wilbert Villegas- Pablo Acereto, 2006, Anlisis ultravioleta- visible,
Universidad Autnoma de Yucatn, Mxico, 4-11 pg.
ANEXOS
1. Cmo se manifiesta la desnaturalizacin de la clara de huevo?
Se produce cambio de color de la clara. Pasa de transparente a opaco o
blanco.

2. Cul de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalizacin?

Al agregarle NaCl a la leche se produjo un cambio brusco de color de blanco
a amarillo provocado por la desorganizacin de las protenas.

3. Cmo podramos saber que una sustancia desconocida es una protena?

Mediante la reaccin Biuret o Xantoproteica.

4. Qu coloracin da la reaccin del Biuret?

Da un color violeta.

5. Una protena coagulada podra dar la reaccin de Biuret?

S, porque el reactivo reacciona con cualquier lquido o slido.

6. Si se realiza la reaccin de Biuret sobre un aminocido como la Glicina es

positiva o negativa? Por qu?
La glicina no reaccin con el reactivo de Biuret porque esta se forma libre y
no presenta enlaces peptdicos con los que reacciona el reactivo, por lo tanto,
es negativa.

7. Mencione 3 aminocidos portadores de azufre, fosforo y grupos aromticos.

Aminocidos portadores de azufre: Metionina, Cisteina, Leucina.
Aminocidos portadores de grupos aromticos: Finilalanina, Tirosina,
Triptofano.