MICROPROPAGAO

O CULTIVO IN VITRO DE CALOS DE CENOURA

O consumo da raiz da cenoura (Daucus carota, famlia Apiaceae) data do tempo

dos Romanos. Documentos do perodo medieval mostram que as cenouras eram
brancas ou prpura. No sculo XVI, uma mutao deu origem a uma variedade de
cor laranja, selecionada por horticultores holandeses como homenagem casa de
Orange. Hoje essa variedade a mais frequentemente encontrada.

Em 1958, cultivando explantes de cenoura em gua de coco, dentro de um

dispositivo rotatrio, F. C. Steward mostrou a totipotncia das clulas vegetais.
Esse trabalho inovador abriu as portas para o cultivo de tecidos vegetais e para a
regenerao de plantas modificadas por engenharia gentica.

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Muitas das plantas cultivadas no podem ser propagadas diretamente por

multiplicao vegetativa. Contudo, explantes de raiz colocados em um meio com
os nutrientes adequados podem dar origem a um calo, que uma massa de clulas
no diferenciadas. No calo aparecem, eventualmente, embriides que podem ser
transferidos a um meio de diferente composio, onde se desenvolvero
regenerando a planta inteira.

Um corte longitudinal de cenoura (Figura 1) mostra uma fina epiderme com pelos
radiculares, o crtex de tecidos fundamentais e o endoderme. O cilindro vascular
est rodeado pelo periciclo, que forma as razes laterais. Dentro encontram-se os
vasos do xilema e do floema), o cmbio que os origina e tecido parenquimatoso.

Figura 1. Corte longitudinal de raiz de cenoura

Exoderme
Crtex
Endoderme

Cilindro
vascular

Pelos radiculares

BIBLIOGRAFIA

DODDS J.H., ROBERTS L.W. Experiments in plant tissue culture, third edition.
Cambridge, Cambridge University Press, 1995

MALAJOVICH M.A. e MANN V.S. Micropropagao. Guia 80: O laboratrio de ensino; Guia
85: A desinfeco dos instrumentos; Guia90: A desinfeco dos explantes e Guia 96: Os
meios de cultivo. http://www.bteduc.bio.br

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ATIVIDADE PRTICA

OBJETIVO: Cultivar explantes de tecidos de cenoura, in vitro.

MATERIAIS

Cenoura, faca, azulejo, frasco desinfetante com gua sanitria 50%, 3 frascos com
gua estril, pinas, papel toalha, bquer com lcool 950, duas placas de Petri com
papel toalha estril, 4 frascos com meio nutriente estril *, palitos estreis, lcool
700, bico de Bunsen (opcional).

* O meio nutriente (Murashige&Skoog ou Taji) uma soluo de sais minerais s

quais se adiciona sacarose (1 a 5%), gar (0,7%) e gua de coco, como indicado nos
Guias 111: Micropropagao: meios clssicos e 112: Micropropagao: meios
alternativos.

PROCEDIMENTO
A limpeza do lugar de trabalho fundamental, assim como a higiene das mos.
O lugar de trabalho ser desinfetado com lcool 700. Os participantes lavaro
muito bem as mos e os antebraos com gua e sabo, antes de passar lcool
700. Cuidado! O lcool inflamvel. Esterilizar o material contaminado antes
de descarta-lo.

1. Esterilizao da superfcie da cenoura

o Em um azulejo bem limpo, cortar com uma faca um pedao de cenoura de

3 a 6 cm, descartando ambas as extremidades da raiz.

Descartar Conservar Descartar

o Raspar para retirar a epiderme e marcar com algum corte a extremidade

inferior da raiz.

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o Desinfetar durante 20 a 30 minutos em gua sanitria (hipoclorito de sdio)

diluda metade (50%) e com uma gota de detergente.

o Lavar 3 vezes em gua estril durante 1, 3 e 5 minutos, tendo a precauo

de limpar previamente o frasco e a tampa com lcool.

o Agitar suavemente durante todo o procedimento.

2. Obteno dos explantes

o Sempre em condies asspticas, transferir o pedao de cenoura a uma
placa de Petri com papel toalha estril para eliminar as partes queimadas,
com uma faca ou bisturi estril.
o Transferir novamente o pedao de cenoura a uma segunda placa de Petri
com papel de filtro estril e cortar uma rodela fina de 1 a 2 mm de
espessura.
o Separar o cilindro vascular e corta-lo em 4 partes, como indicado abaixo:

Explantes

3. Estabelecimento da cultura

Em condies asspticas, semear os quatro explantes mantendo a polaridade, nos

frascos com meio nutriente.

4. Incubao
A 25 0
C, na escurido.

5. Subcultura ou repique

Sempre em condies asspticas, descartar mensalmente o tecido necrosado e

transferir os explantes a meio novo. Depois de um tempo, transferir os explantes
a um meio nutriente contendo sais minerais e sem gua de coco, e incubar na luz.

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NOSSO COMENTRIO

Trata-se de um experimento clssico, que d bons resultados. A maior dificuldade

est na obteno do explante, porque uma vez que se utiliza um meio contendo
sacarose e gua de coco, o trabalho ter que ser muito rigoroso para manter as
condies asspticas e evitar as contaminaes.

Por outro lado, como pode resultar difcil diferenciar o crescimento incipiente do
calo de uma contaminao bacteriana, acrescentamos na figura 2 vrias imagens
de calos em diversas etapas de desenvolvimento. A menos de observar claramente
uma contaminao fngica ou bacteriana, prefervel aguardar um pouco antes
de eliminar o material.
A cenoura no a nica raiz que pode originar calos. Os testes com batata doce
(Ipomoea batatas) foram positivos (Figura 3)

COMO MONTAR UM PROJETO

Testar com outras razes de dicotiledneas, como por exemplo, batata doce
(Ipomoea batatas), ou batata inglesa (Solanum tuberosum).
Comparar o crescimento e diferenciao dos tecidos em meios de diferente
composio.

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Figura 2. Calos de cenoura

A: Incio da formao do calo; B: proliferao de um tecido esbranquiado opaco; C:

fragmento original do explante rodeado de tecido no diferenciado; D: transferido a um
meio sem gua de coco e incubado na luz, o explante est coberto pelo calo no qual se
observa um fragmento vermelho (produo de pigmento?) e um fragmento esverdeado
(atividade fotossinttica?).
A B

C D

Figura 3. Calo de batata doce (Ipomoea batatas)

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