La clorofila es el pigmento que les da el color verde a las plantas; aunque tambin est presente en

plantas y algas de distintos colores que hacen fotosntesis. La clorofila se excita con la luz o con la
energa que pasa desde otros pigmentos excitados por la luz, a los que se llama pigmentos accesorios.
Existen varios tipos de clorofila. Es factible que el ms importante sea la clorofila a. Esta molcula
presenta una cabeza hidroflica que es un anillo de porfirina, que tiene un tomo central de Mg
(Magnesio), y una cola o cadena lateral formada por un fitol (terpeno lineal), que es hidrofbica, lo
que determina la orientacin de la molcula de clorofila en las membranas internas del cloroplasto.

Las molculas de clorofila se disponen agrupadas con protenas intrnsecas formando varios
complejos de gran importancia en la fotosntesis (fotosistemas I y II). Adems de estos complejos,
hay otros complejos moleculares que no poseen- clorofila, a saber:
1) Complejo cit f b6 (contiene cit f y b6 y plastocianina, protena que posee Cu2+). Este complejo
interviene en la cadena de electrones.
2) Complejo CF0 o HF0, (contiene protenas hidrofbicas). Acta en la traslocacin de protones y se
une a CF1 para formar el complejo ATPasa.
Las partculas CF1, son factores de acoplamiento, que intervienen en la fotofosforilacin de ADP a
ATP. Estn localizadas en la superficie externa de la membrana tilacoidal. Se hallan unidas a la
membrana por medio del segmento CF0, que representa un canal protnico formado por protenas
hidrofbicas.
Existen varios tipos de clorofila. Es factible que el ms importante sea la clorofila a. Esta molcula
presenta una cabeza hidroflica que es un anillo de porfirina, que tiene un tomo central de Mg
(Magnesio), y una cola o cadena lateral formada por un fitol (terpeno lineal), que es hidrofbica, lo
que determina la orientacin de la molcula de clorofila en las membranas internas del cloroplasto.
Consiste en la transferencia de energa lumnica en qumica bajo la forma de ATP, y en la obtencin
de una fuente reductora de alta energa: la coenzima NADPH.
Como subproducto de esta etapa se obtiene 02 . La etapa lumnica se lleva a cabo en las granas.
La etapa lumnica, se desencadena cuando el fotosistema I (PS I) absorbe un fotn, este PS I emite
un electrn que es aceptado por una protena, la Ferredoxina. Este fotosistema queda por lo tanto con
carga positiva. La ferredoxina ahora reducida, transporta electrones al NADP+ el cual, juntamente
con H+ provenientes de la fotooxidacin del H2O, es reducido a NADPH.
Por otro lado, el PS II tambin es excitado por la luz y sus electrones son llevados a un nivel de alta
energa donde son aceptados sucesivamente por una cadena transportadora especfica. Finalmente los
electrones son aceptados por el PS I que haba quedado positivo, restituyendo as su estado inicial.
El flujo de electrones desde el PS II al I es un transporte exergnico, esta energa se emplea para
bombear H+ a travs de la membrana tilacoidal hacia el interior de sta. Los H+ regresan luego desde
el interior hacia el estroma a travs de canales especiales de la membrana formados por los complejos
CF0 Y CF1.
Mientras tanto el PS II que haba quedado con carga positiva, para recuperar su estado inicial,
promueve la oxidacin (fotlisis) del H2O y capta sus electrones, quedando as restituida su carga
elctrica. Pero adems se producen H+ que como ya se mencionara anteriormente, contribuyen ala
reduccin de la coenzima NADPH. El O2 que resulta de la oxidacin de la molcula de H2O, se libera
al medio.
Reaccin de Hill
Una prueba de que el oxgeno liberado en la fotosntesis proviene del agua y no del dixido de carbono
se debe a los experimentos realizados por Robn Hill (1937), quien obtuvo oxgeno al exponer
cloroplastos aislados a la luz en presencia de un aceptor de electrones, el ferricianuro, pero en ausencia
de CO2 y NADP. Esto demostr que el oxgeno tambin se libera sin que haya reduccin del CO2,
cuando se dispone de un aceptor de electrones. La ausencia de CO2 en la mezcla confirm que el
oxgeno liberado proviene de las molculas de agua. Adems, los experimentos demostraron que el
fenmeno fundamental en la fotosntesis es la transferencia inducida por la luz, de electrones de un
compuesto a otro.
En 1937, R. Hill descubri que cuando una suspensin de cloroplastos aislados, o fragmentos de
cloroplastos, se iluminan en presencia de un aceptor de electrones adecuados, ste es reducido al
mismo tiempo que se libera O2 , derivndose los electrones de la cadena transportadora. Esta es la
denominada reaccin de Hill, y como aceptores de electrones (los denominados oxidantes de Hill )
pueden utilizarse diversas sustancias, como son complejos de iones frricos, benzoquinona y algunos
colorantes, como los derivados del indofenol. La estequiometra de la reaccin de Hill cuando se
utiliza ferricianuro como aceptor de electrones es:
Luz 4 Fe+3 + 2 H2O -------------------> 4 Fe+2 + 4 H+ + O2
Cloroplastos y en general:
2 [A] + 2 H2O --------------------> 2 [AH] + 2 H+ + O2
En 1950, Ochoa y Vishniac encontraron que el NADP+ poda actuar como reactivo de Hill (aceptor
de electrones [A]), segn la reaccin:
Luz 2 NADP+ + 2 H2O --------------> 2 NADPH + 2 H+ + O2
Conocido el papel del NADPH en muchos procesos biosintticos, pareca probable que el NADPH
fuese el reductor que, formado en la fase luminosa de la fotosntesis, se utilizase en la fase oscura
para la reduccin del CO2 a carbohidratos, con la regeneracin del NADP+ que de nuevo sera
reducido en el proceso luminoso. El par NADP+ / NADPH actuara, pues como una coenzima entre
los dos procesos, luminoso y oscuro.
La experiencia original de Hill ha sido perfeccionada posteriormente por otros investigadores y hoy
se sabe que anteriores fracasos se debieron a una serie de factores que no fueron considerados. Entre
otros, junto con los cloroplastos en la extraccin se liberan algunos inhibidores como saponinas y
resinas. Si durante la extraccin y posterior manipuleo, no se somete el jugo extrado a baja
temperatura, la actividad de los cloroplastos decae rpidamente. La suspensin de cloroplastos en una
solucin osmticamente alta, prolonga la conservacin y favorece la reaccin cuando se transfiere a
un medio ms diluido.
En 1954, Arnon y sus colaboradores encontraron que los cloroplastos iluminados podan formar ATP
a partir de ADP y fosfato. Surga as la posibilidad de que el ATP tambin se utilizase en el proceso
biosinttico oscuro y se regenerase en el luminoso. Efectivamente, NADPH y ATP actan como los
productos formados en la fase luminosa, que convierten CO2 en carbohidratos en un proceso que no
requiere iluminacin.

Figura 3: Localizacin de las reacciones luminosa y oscura de la fotosntesis.

La formacin de ATP y poder reductor (ferredoxina reducida que luego reduce el NADP+) se produce
en los tilacoides de los cloroplastos, mientras que la formacin de azcares a partir de CO2, NADPH
y ATP se produce en el estroma y, alguna etapa, en el citoplasma de las clulas fotosintticas (Fig.
3). Esta reaccin permite el estudio del mecanismo de accin de diversas sustancias y agentes de la
fisiologa de las plantas. As, es un hecho bien conocido que la toxicidad de ciertos herbicidas que
inhiben este proceso son derivados de la urea (CMU o monuron, DCMU o diuron) o triazinas
(simazina). La reaccin de Hill se ve tambin inhibida por detergentes, algunos tampones a
concentraciones elevadas (Trs), calor, etc., as como por la ausencia de ciertos iones en el medio (Cl_
y Mn++). El objetivo del trabajo prctico es demostrar experimentalmente el proceso de
xidoreduccin (Reaccin de Hill) de la fotosntesis, utilizando como aceptor de electrones [A], un
indicador de xido-reduccin (2,6 diclorofenol indofenol) que permitir visualizar la aceptacin de
protones por el cambio de color. En estado oxidado: azul, reducido: incoloro.
ORMACIN DE ATP EN LOS GRADIENTES PROTNICOS QUIMISMOSIS
Conforme a la teora quimiosmtica, los organoides que usan energa (cloroplastos), acumulan
protones dentro de compartimentos membranosos especiales. Los protones difunden luego a travs
de las membranas (como ya se mencionara en la etapa lumnica). La energa potencial de la membrana
creada por las diferencias en la concen-tracin de protones es captada por el complejo proteico CF0-
CF1. Este complejo usa una parte de la energa para sintetizar ATP.
Segn pasan los electrones a travs de la cadena de aceptores los protones son bombeados hacia el
interior del tilacoide donde se acumulan. Los protones equivalen a iones de H+, por lo tanto el pH
interior del tilacoide desciende, con lo que se establece una diferencia de pH a travs de la membrana.
 La reaccin de Hill se demuestra con el DCPIP (2,6 diclorofenolindofenol). En estado oxidado, este
colorante es azul, mientras que reducido no tiene color. Las molculas del colorante interceptan los electrones
en la cadena fotosinttica; especficamente acepta dos electrones en lugar de que vayan a P680, por lo que la
prdida del color demuestra que el flujo de electrones est ocurriendo durante las reacciones dependientes de
la luz. Dicha prdida es proporcional al flujo de electrones y puede ser cuantificada en un espectofotmetro o
en un Spectronic.

La reaccin sera:

H2 O + DCIP DCIP (reducido) + O2 en presencia de luz y de PSII (Funkhouser y Balin, 1994).

Los cloroplastos, son orgnulos subcelulares (plastidios) verdes, con un dimetro que puede variar desde 5 a
10 m. Estn presentes en las clulas mesoflicas de las hojas o en cualquier otro tejido vegetal con capacidad
fotosinttica. Las angiospermas pueden contener de 15 a 20 cloroplastos por clula fotosinttica. Hasta el 50%
de la protena foliar puede estar contenida en los cloroplastos. Su forma y tamao vara en dependencia de la
especie vegetal. Los cloroplastos se originaron como organismos endosimbiticos en la clula eucariota
primitiva y poseen una autonoma gentica parcial, al contener cido desoxiribonucleco (ADN), cido
ribonucleco (ARN) y toda la maquinara enzimtica de replicacin, transcripcin y traduccin (Barcel et al.,
2007). Una suspensin de cloroplastos aislados puede desprender O2 en presencia de luz, si se suministra un
compuesto oxidado capaz de aceptar electrones procedentes de la fotolisis del agua. De esta forma, el proceso
de desprendimiento de O2 en la fotosntesis puede ser separado del de la fijacin de CO2 (Kozuleva e Ivanov,
2010). En la hoja intacta, los principales aceptores naturales de electrones son la ferredoxina y el NADP, pero
se inactivan durante el proceso de aislamiento de los cloroplastos. En varios de los experimentos in vitro,
estos aceptores naturales pueden sustituirse por 2,6 diclorofenolindofenol (DCPIP) (Sauer y Park, 1965,
Goltsev et al., 2008). Este compuesto es azul intenso en su forma oxidada (quinona) pero se decolora
lentamente cuando adquiere su forma reducida (fenol). La reaccin que tiene lugar es la siguiente: Luz
Cloroplastos + DCPIP+ (azul intenso)+ H 2O Cloroplastos + DCPIP-H (azul plido) + O 2 La evaluacin
de la actividad fotosinttica en condiciones in vitro, ha sido una tarea difcil debido a las alteraciones
estructurales y funcionales que sufren los cloroplastos y a la presencia de fracciones celulares contaminantes
durante el proceso de aislamiento.

Los cloroplastos catalizan el transporte de electrones dependiente de luz desde el agua hasta
un aceptor, el NADP+. Los componentes de la cadena de transporte de electrones fotosintticos se
encuentran incluidos asimtricamente en la membrana tilacoide. Cada fotosistema en presencia de
luz reduce a su aceptor primario y oxida a su dador primario.
El PSII toma electrones del agua, la que es oxidada a O2 en el proceso denominado fotlisis del
agua y los cede a la plastoquinona. El PSI toma electrones de la plastocianina y los cede a la
ferredoxina. La ferredoxina es a su vez oxidada por la ferredoxina NADP+ oxidorreductasa para
reducir al NADP+. Los dos fotosistemas (PSII y PSI) estn conectados en serie por el complejo de
citocromo b6-f.
La ferredoxina-NADP reductasa ( la enzima Terminal del transporte de electrones
fotosinttico) puede reducir distintos aceptores artificiales de electrones como el metilviolgeno y el
ferricianuro de potasio, adems del NADP+. A su vez, el PSII tambin puede utilizar aceptores
externos artificiales de electrones, como el 2,6-dicloro fenol indofenol (DCPIP). Este ltimo
compuesto presenta la ventaja de ser de color azul (a pH neutro) cuando est oxidado, mientras que
es incoloro en la forma reducida, lo que permite seguir espectrofotomtricamente el curso de la
reaccin de reduccin.
La atrazina compite con QB por el sitio en PSII.
 La reduccin de la absorbancia de la cubeta iluminada se deber a la reduccin del DCPIP y esto
a su vez estar directamente relacionado con la tasa fotosinttica de la suspensin de
cloroplastos. El transporte de electrones y los equivalentes reductivos en los fotosistemas de los
cloroplastos, provocan que el DCPIP oxidado (azul intenso) al aceptar electrones procedentes de
la fotlisis del agua, se convierta en DCPIP reducido (azul claro). A menudo el DCPIP, se utiliza en
las mediciones de la cadena de transporte de electrones en los cloroplastos debido a su mayor
afinidad por los electrones que la ferredoxina. Mediante la medicin de la absorbancia a 595 nm
se puede calcular la tasa de transporte electrnico en trminos de umol DCPIP reducido/mg
clorofila/ h y utilizarse como un ndice de vitalidad cloroplstica.

Referencias:

https://www.researchgate.net/profile/Yelenys_Alvarado-
Capo/publication/236150100_Protocolo_para_el_aislamiento_de_cloroplastos_intactos_de_hojas
_de_plantas_de_Musa_spp_obtenidas_por_cultivo_in_vitro_y_evaluacion_de_la_actividad_fotosi
ntetica/links/552e7c5d0cf22d43716eb7fa/Protocolo-para-el-aislamiento-de-cloroplastos-intactos-
de-hojas-de-plantas-de-Musa-spp-obtenidas-por-cultivo-in-vitro-y-evaluacion-de-la-actividad-
fotosintetica.pdf

Barcelo, CJ, Sabater GB, Nicols RG, Snchez TR (2007) Cloroplastos. En: Barcel Coll J (Ed)
Fisiologa vegetal, pp. 155-156. Pirmide. Madrid

Busogoro, JP, Etame JJ, Harelimana G, Lognay G, Messiaen J, Lepoivre P, Van Cutsem P (2004)
Experimental evidence for the action of M. fijiensis toxins on banana photosynthetic apparatus.
En: Mohan SJ y Swennen R (Eds) Banana improvement: cellular, molecular biology, and induced
mutations, pp.161-170. Enfield. Science Publishers

Goltsev, V, Tsimilli-Michael M, Chernov P, Zaharieva I, Kouzmanova M, Strasser JR (2008)

Electromagnetic frequency spectra of samples placed in a coil that senses the electromagnetic
background field: Application for leaves, chloroplasts and molecules useful in photosynthesis. En:
Allen JF, Gantt E, Golbeck JH, Osmond B (Eds) Photosynthesis. Energy from the Sun, 14th
International Congress on Photosynthesis, pp. 591- 595. Springer. Dordrecht

Kosky, RG, Del Sol L, Reyes VM, Freire-Seij M, Posada-Prez L, Herrera I, Escalant JV (2001)
Embriognesis somtica en bananos y pltanos partiendo de flores masculinas inmaduras.
Biotecnologa vegetal 1(1): 29-35

Orellana P (1994) Tecnologa para la micropropagacin in vitro de clones de Musa ssp. Tesis para
aspirar por el grado cientfico de Doctor en Ciencias Agrcolas. UCLV. IBP. Santa Clara. 120p