NUMERACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA

POSITIVA

I. FUNDAMENTO TEORICO:

Staphylococcus aureus es un microorganismo de distribucin en

el medio ambiente muy amplia, se encuentra de forma natural en
el hombre, los animales de granja, el polvo y diversos alimentos y
otros productos en los que la contaminacin se debe
principalmente a los manipuladores.

El principal problema a nivel de la microbiologa de los alimentos

es que S. aureus puede producir una enterotoxina termoestable, y
otras toxinas.

Estas toxinas actan sobre receptores intestinales cuyo estmulos

alcanzan el centro del vmito del cerebro, por lo que deberan
considerarse como neurotoxinas.

El mayor inconveniente de estas toxinas es su elevada resistencia

a los tratamientos trmicos habituales, soportando tratamientos
de pasteurizacin a 72 C / 13 segundos, e incluso 100 C / 30
minutos. Se inactivan a temperaturas de esterilizacin de 115 C,
resisten la irradiacin y las enzimas proteolticas.

Para la produccin de toxinas en un alimento tienen que

concurrir los siguientes requisitos:

contaminacin del alimento por Staphylococcus aureus: en

origen, por los manipuladores o por falta de higiene en
locales o utensilios
 la multiplicacin de una cepa enterotoxignica del
microorganismo en el alimento alcanzando al menos 106
clulas por gramo.

Staphylococcus auerus se multiplica en alimentos proteicos,

soporta concentraciones normales de azcar e incluso elevadas
de sal y el tratamiento con nitritos.

MTODOS NORMALIZADOS

a) ISO 6888
Directiva general para el recuento de Staphylococcus aureus.
Mtodo mediante enumeracin de colonias.

Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de

cultivo slido, preparando dos series de placas, con una cantidad
determinada de la muestra problema si es lquida o una cantidad
determinada de la suspensin madre para otros productos. En las
mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la
muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 35 C
durante 24 48 horas. Clculo del nmero de Staphylococcus aureus
por mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias
caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los niveles de
dilucin que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante
la prueba de la coagulasa.

b) NF V 08-057-1
Mtodo de rutina para la enumeracin de estafilococos cuagulasa
positivos mediante recuento de colonias a 37C. Tcnica de
confirmacin de las colonias.
Este mtodo se basa en la siembra en superficie en un medio de
cultivo slido selectivo, repartido en placas de Petri, con una
cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una
cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos.
 Incubacin de las placas a 37 C durante 24 48 horas. Clculo del
nmero de estefilococoscogulasa positivos por mililitro o por gramo
de muestra a partir del nmero de colonias caractersticas y/o no
caractersticas obtenidas en las placas escogidas a los rdenes de
dilucin que dan un resultado significativo, y confirmadas mediante
la prueba de la coagulasa.

MEDIOS DE CULTIVO

c) Caldo Cerebro Corazn

Es un medio slido muy apropiado para el cultivo de bacterias y
hongos, incluyendo los de difcil desarrollo.

Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado
desarrollo microbiano. La infusin de cerebro de ternera, la infusin
de corazn vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrgeno,
y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el
cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el fosfato disdico
otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante.

El agar cerebro corazn mantiene los mismos principios que el caldo

para el cultivo de estreptococos y otras bacterias exigentes. Con el
agregado de 10% de sangre de caballo desfibrinada, fue utilizado
para el crecimiento de Histoplasma capsulatum y de hongos
patgenos. Por tratarse de un medio que contiene glucosa, no es un
agar sangre apropiado para la observacin de reacciones de
hemlisis.

Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 40 g/ml de estreptomicina,

se utiliza este medio para el aislamiento de hongos patgenos.
 Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Infusin de cerebro de ternera 200.0 Disolver 52 g de polvo en
Infusin corazn vacuno 250.0 un litro de agua destilada.
Peptona 10.0 Calentar a ebullicin
Cloruro de sodio 5.0 hasta su disolucin total.
Glucosa 2.0 Esterilizar en autoclave
Fosfato disdico 2.5 durante 15 minutos a
Agar 15.0 121C.

pH final: 7.4 0.2

Siembra
De acuerdo a los fines de empleo.

Incubacin
El tiempo, la temperatura y la atmsfera de incubacin, sern las ptimas y
dependern del microorganismo que se est investigando.

Resultados
Microorganismos Crecimiento
Aspergillus niger Bueno
Neisseria meningitidis Bueno
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Bueno
Streptococcus pneumoniae ATCC Bueno
49619

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.
d) Baird Parker Medio Base.
Medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para
el aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en
alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento
En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto
de carne constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto
de levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato
estimulan el crecimiento de los estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de
potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora
acompaante. La yema de huevo permite demostrar la actividad
lecitinsica.
Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y
originan colonias de color grisceo-negro, y dan reaccin sobre la
yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca
que a menudo tiene una zona clara ms externa.
Se pueden encontrar cepas no lipolticas, que presentan igual
caractersticas de colonias pero sin la zona opaca y clara.
Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas
bioqumicas.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Peptona de casena 10.0 Suspender 60 g del medio
Extracto de carne 5.0 deshidratado en 940ml de agua
Extracto de 1.0 destilada. Dejar en reposo 5 a 10
levadura minutos. Calentar agitando
Cloruro de litio 5.0 frecuentemente y hervir durante 1
Agar 17.0 minuto. Distribuir y esterilizar en
Glicina 12.0 autoclave a 121C (15 libras) durante
Piruvato de sodio 10.0 15 minutos. Enfriar a 45-50C y
agregar 50 ml de la emulsin de yema
de huevo y 10ml de la solucin de
telurito (Cdigo B03-601-61).
Homogeneizar y distribuir en cajas de
Petri.
pH final: 6.8 0.2
Siembra
Dejar secar la superficie de la placa preparada y extender 0.1 ml de la
dilucin de la muestra a analizar.
Incubacin
24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados
Microorganismos Crecimiento Apariencia
E. coli ATCC Inhibido ---
25922
P. mirabilis Bueno Colonias marrones sin zona clara u
ATCC 43071 opaca alrededor
S. aureus ATCC Bueno a Colonias negras con borde incoloro,
25923 excelente convexas, rodeadas de una zona
opaca, con una zona clara externa.
S. epidermidis Escaso o Colonias negras, de tamao irregular.
ATCC 14990 bueno Zona opaca alrededor de la colonia
(no hay zona clara).

Caractersticas del medio:

Medio preparado: mbar claro opalescente (sin el agregado de yema de
huevo).

Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Medio preparado: a 2-8 C.

II. MATERIALES Y EQUIPOS:

2.1. Biolgico:
a) Muestras bacterianas diversas:
Los requisitos para la preparacin y dilucin de las muestras de
alimentos.

2.2. Materiales y Equipos:

2.2.1. Materiales
a) Placas Petri de vidrio (100 X 15mm.)o de plstico de 90 x15 mm.
 b) Pipetas de 1 ml. graduadas al 0.1
c) Extensores de vidrio
d) Tubos de 75x10 mm. contenido 0.3 ml de plasma de conejo

2.2.2. Equipos
a) Bao de agua regulado a 44-46C.
b) Incubadora regulada a 35-37C.

2.3. Reactivos:
a) Agar BAIRD-PARKER.
b) Caldo cerebro corazn.

III. PROCEDIMIENTO:

a) Preparar diluciones 10-1,10-2,10-3,10-4.

b) Pipetear, 10-5.Las diluciones preparadas y sembradas pueden

variar de acuerdo al nmero de colonias sospechosas.

c) Agregar de 10-15 ml. de medio de cultivo, temperado a 44-46C.

d) Mezclar inmediatamente ,la alcuota con el agar por

Movimiento de placa de arriba hacia abajo 5 veces en una

direccin.

Rotacin de la placa en el sentido de las agujas del reloj, 5

veces.

Movimiento de la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo

recto del usado en el primer tiempo y,
 Rotar de la placa ,5 veces en el sentido inverso al de las agujas
de reloj.

e) Despus de solidificado el agar, invertir las placas Petri e incubarlas

a 20-24 C por 3-5 das.

f) Usando el contador de colonias, contar todas las colonias de las

placas que contengan de 20-100 colonias, efectuar el examen
microscpico cuando se requiera identificar las colonias.

g) Reportar el numero de hongos y levaduras por gramo o ml. de

alimento.
 IV. RESULTADOS:

Despus de 48 horas de haber incubado las placas tenemos el siguiente

resultad:
Colonias Brillantes: Con borde blanco angosto rodeado de zonas
claras que contrastan con el medio opaco:
En la placa 10-1 : 7 colonias
En la placa 10-2 : 2 colonias
En la placa 10-3 : 0 colonias
En la placa 10-4 : 0 colonias
En la placa 10-5 : 0 colonias
En la placa 10-6 : 0 colonias

Colonias Negras:
En la placa 10-1 : 601 colonias aprox.
En la placa 10-2 : 358 colonias
En la placa 10-3 : 28 colonias
En la placa 10-4 : 3 colonias
En la placa 10-5 : 0 colonias
En la placa 10-6 : 1 colonias

V.-BIBLIOGRAFIA:
http://www.analizacalidad.com/staphy.htm
W. C. FRAIZER, microbiologa de alimentos, editorial ACRIBIA

(1981) Zaragoza Espaa.

TOMAS AGURTO SAENZ, microbiologa, editorial MCGRAW

HILL, Mxico.