RESUMEN En el siguiente informe se muestran la diferenciacin por el proceso de tincin de gram de

bacterias tanto gran positivas como gram negativas y variables. Por medio de una observacin de bacterias
de diferente ambiente y utilizando el proceso de tincin de gram se hace un reconocimiento de bacterias
en el microscopio, dndonos como resultado la diferenciacin de los tipos de bacterias dependiendo de la
coloracin que tengan despus de un proceso como el de tincin de Gram.

ABSTRACT The following report differentiation process gram stain gram positive and negative bacteria
and variables both displayed great. Through an observation of bacteria of different environment and using
the process gram stain recognition of bacteria in the microscope is, giving as a result the differentiation of
types of bacteria depending on the color having after a process as Gram stain.

Palabras clave: tincin, Gram positiva, Gram negativo, morfologa.

Keywords staining, Gram positive, Gram negative, morphology.

INTRODUCCIN

Esta prctica tuvo como objetivo conocer las
bacterias negativas y positivas por medio de
la tincin de Gram, la cual permito entender
el mtodo de extendido y coloracin de
distintas muestras en este caso de saliva de
gato, perro y humano.
El tamao de la mayora de las clulas
bacterianas resulta muy difcil de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es
la falta de diferencia entre la clula y el medio
que la rodea y el medio ms simple de
aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de clulas o
para mostrar la presencia de dicha bacteria
que tienen unos determinados componentes
tales como flagelos, esporas, cpsulas,
paredes celulares, centros de actividad
respiratoria.
Las clulas generalmente son tratadas para
solidificar el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para bacterias, la
fijacin por el calor es lo ms comn, aunque
tambin puede fijarse con sustancias
qumicas como formaldehido, cidos
alcoholes. Despus de la fijacin,
suministrar el colorante a la muestra no se
afectara la estructura. La fijacin de clulas o
bacterias se hace comnmente en una
lmina, tratando despus
ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La
fijacin produce el encogimiento de las
clulas; la tincin, por el contrario, hace que
las clulas aparezcan ms grandes, de
manera que las medidas de las clulas que
han sido fijadas o teidas no pueden
realizarse con mucha precisin [1].
1. Tincin: Es el proceso por el cual las
molculas de un colorante se
adsorben a una superficie. El uso de
colorantes permite cambiar el color
de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la
observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi
incoloras, no presentan contraste
con el medio en el cual se
encuentran suspendidas y no
pueden observarse claramente sin
algn tratamiento previo [2].
y
A continuacin, se vern diferentes
al
mtodos de tincin
 Tincin Simple: nicamente
permite determinar la morfologa de
las bacterias.
Figura 1. Bacterias de coco y bacilos.
Recuperado de
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/qui
mica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf
Tincin diferencial: Este tipo de
tincin es la que se usa para
diferenciar de manera ms clara los
microorganismos. Estas tinciones
utilizan diferentes colorantes, que se
componen de ms de una sustancia
tintrea. En algunas tcnicas de
coloracin, las tinciones
diferenciales ms importantes que se
emplean en bacteriologa son las de
Gram y la tincin cido-resistente.
Ambas tinciones se utilizan para
obtener informacin acerca de la
composicin de las capas de la
pared celular de las clulas
bacterianas.
Colorantes: Los ms utilizados son:
azul de metileno, cristal violeta,
safranina, son catinicos los cuales
combinan fuertemente con
componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos
nucleicos. Los diferentes colorantes
reaccionan o se concentran en
diferentes partes de las clulas o
tejidos, y estas propiedades son
utilizadas como una ventaja para
revelar partes o reas especficas.
En qumica, el colorante est
constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El
cromforo es todo grupo aislado,
covalente e insaturado, que tiene
una filtracin caracterstica en la
regin ultravioleta o visible, es la
capacidad que tiene la molcula para
que sus electrones absorban energa
o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la
longitud de emitida como resultado
del cambio en el nivel energtico.
Cabe mencionar que esta longitud de
onda corresponde al rango de
espectro visible.
Los auxcromos son grupos
funcionales que constituyen una
molcula y poseen carga parcial
positiva cumplen la funcin de
intensificar la formacin de color
mediante grupos de tomos no
saturados el cual desplaza a los
cromforos hacia longitudes de
ondas largas para aumentar la
intensidad [3].
Figura 2. Colorantes.
Recuperado de
http://microbiologiavanessalopez.blogspot.com.co/2015
_10_01_archive.html
Tincin Gram: En 1884, un
bacterilogo dans, Christian Gram,
desarroll una tcnica de tincin que
 permite separar a las bacterias en
dos grandes grupos, Gram-positivas
y Gram-negativas, reteniendo el
colorante primario (cristal violeta)
luego del proceso de decoloracin.
Los organismos que retienen el
cristal violeta luego de la adicin del
agente decolorante, el alcohol,
aparecen como azul oscuro o violeta,
y se designan como Gram-positivos;
aquellos que pierden el cristal violeta
y se tien con el colorante
secundario, la safranina, aparecen
como rojos y se designan como
Gram-negativos. Un examen
minucioso de un extendido
bacteriano teido diferencialmente,
provee una informacin muy
importante sobre la caracterizacin
morfolgica e identificacin de la
muestra. Por ejemplo, una reaccin
positiva o negativa a la Tincin de
Gram es sumamente importante
para la clasificacin [4].
Figura 3. Proceso de tincin Gram.
Recuperado de
http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_
odontologia/unidades/labv/LabMicro/Diag_di
recto.html
El cristal violeta tie las bacterias, se quita
el exceso de este reactivo, en este estado
las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas estn teidas de azul. La lmina
se cubre entonces con una solucin de
lugol la cual consiste en una disolucin de
yodo molecular. El ingrediente activo es
aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma
un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta. De nuevo tanto las clulas Gram-
positivas como las Gram-negativas se
encuentran en la misma situacin. Se
procede a la decoloracin, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en
las que es soluble el complejo I2-cristal
violeta. Algunos organismos (Gram-
positivos) no se decoloran, mientras que
otros (Gram-negativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin, esta resistencia se debe
probablemente al hecho de que en el caso
de bacterias Gram-negativas, la mezcla de
alcohol/acetona es un solvente lipdico y
disuelve la membrana exterior de la pared
de la clula (y tambin puede daar la
membrana citoplasma a la que se une
peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de
complejo cristal violeta-yodo y la clula se
decolora.
Las clulas Gram-positivas, a causa de sus
paredes celulares ms espesas (tienen
ms peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente, provocando que
el de complejo cristal violeta-yodo quede
atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas
Gram-positivas son todava azules, pero las
Gram-negativas son incoloras. Para poner
de manifiesto las clulas Gram-negativas
se utilizan una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color
rojo, como la safranina o la fucsina bsica.
Despus de la coloracin de contraste las
clulas Gram-negativas son rojas, mientras
 que las Gram-positivas permanecen azules
[6].
Las bacterias Gram-positiva y Gram-
negativas tien de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura
de sus paredes celulares. La pared de la
clula bacteriana sirve para definir su
tamao y su forma al organismo as como
para prevenir la destruccin osmtica. La
pared dela clulas Gram positivas es
gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano
(cadenas lineales de un polisacrido
formado por residuos alternativos de N-
acetilglucosamina y N-acetilmurmico
unidos mediante un enlace) y un poco de
cido teicoico, mientras que las bacterias
Gram negativas se componen de una capa
delgada de peptidoglicano y est rodeada
por una capaexterior de lipopolisacridos
(forma parte
de la pared de la pared celular de las bacte
rias Gram-negativas. Tienen carcter
anfiptico, presentan carga negativa, y
repelen molculas hidrofbicas. Son
txicos para el hombre, y tambin se llaman
endotoxinas) por lo cual estos dos tipos
de bacterias se tien de diferente color y e
s posible identificarlas como Gram-positiva
o Gram-negativo. [5]
Figura 4. Bacterias Gram-negativas y Gram-
positivas.
Recuperado de
https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
MATERIALES Y METODOLOGA
Materiales y reactivos: Microscopio,
lminas, gotero, papel de arroz, sharpie,
cristal violeta, lugol, alcohol-acetona,
safranina, mechero bunsen y aceite de
inmersin.
Metodologa
1. Muestra microscopio
a. Tomar el microscopio, este debe ser
transportado con ambas manos,
sosteniendo el brazo del microscopio
y la base. Acomodar el microscopio
en el mesn, conectar y verificar que
la luz se encienda.
b. Tomar la lmina y dividirla
imaginariamente en tres espacios,
marcar en la parte inferior de la
lmina con la informacin del
espcimen, fecha y el grupo.
c. Tomar la lmina con la muestra y
dirigirse al vertedero, tomar el gotero
y suministrar el cristal violeta a la
lmina, dejar durante 1 minuto, lavar
con un poco de agua, dejar secar y
se procede a suministrar unas dotas
de lugol el cual se deja durante 1
minuto, remover con un poco de
agua y dejar secar, tome el alcohol-
acetona y agregue unas pocas
gotas, dejar por 15 segundos, retirar
con un poco de agua y dejar secar la
lmina por ltimo se toma unas gotas
de safranina y dejar un tiempo de 1
minuto, lavar con un poco de agua y
dejar secar.
d. Colocar la lmina en la platina,
enfocar al lente 4x, partir moviendo
en zigzag la lmina hasta encontrar
una regin donde se manifiesten
algunos puntos de colores (azul o
rojo), enfocar al lente 10x sin perder
la regin con mayor concentracin
de puntos, enfocar al lente 40x
observar hasta encontrar bacteria
para poder agregar el aceite de
 inmersin y poder enfocar el lente de simtricas y 2). Unas de mayor tamao cuya
100x, acercar la platina al lente coloracin es ms rosada, estas
suavemente para no daar el lente y corresponden a bacterias Gram positivas.
observar mejor la bacteria. Tambin en esta muestra se observa una
capa gruesa y homognea la cual
RESULTADOS Y DISCUSION corresponde a la pared celular
Tabla1. Resultados obtenidos en cada En la saliva de gato hubo presencia de
muestra clulas epiteliales, las cuales presentaban
forma hexagonal, dichas clulas dependen
Gram
Muestra Imagen de muestra observaciones de la parte extrada ya que varan segn el
+ -
En la saliva de
rgano en el que se encuentren, en esta
gato se observ muestra se logr identificar y reconocer el
con mayor ncleo de la clula el cual corresponde al
facilidad
Saliva bacterias punto central oscuro que est en la
si si
de gato (rosada) y membrana citoplasmtica que es de color
clulas
epiteliales de morado en este caso.
coloracin
morada Para el perro se distinguieron tambin Gram
En la saliva de
perro se negativas y positivas, sin embargo a contrario
Salivad observ con de lo obtenido con la saliva del gato en esta
mayor facilidad
de si si muestra se observ de manera ms clara las
y eficiencia
perro Gram negativos bacterias Gram positivas (coloracin
y pocos morada), ya que morfolgicamente estn
positivos
En la saliva de mejor definidas y el tamao y forma no varan
humano tanto considerablemente, adems la coloracin e
Saliva Gram negativas
de si si como positivas mantiene regular a lo largo de la muestra,
humano fueron muy este correcto resultado pudo haberse dado
poco
perceptibles
por dos razones fundamentales: 1) el frotis
realizado fue adecuado y meticuloso, 2) el
extendido sistemtico (zigzag), fue correcto
En la tabla 1 se observan los resultados ya que no presentaba exceso de muestra.
cualitativos que se obtuvieron en el anlisis Las bacterias Gram negativas de la saliva del
sistemtico de las tres muestras de saliva perro no se vieron correctamente debido a
(gato, perro, humano) las cuales fueron que en esa parte del extendido haba exceso
obtenidas gracias a la realizacin de un frotis. de muestra lo que interfiere con la
visualizacin de bacterias, cocos o bacilos.
La razn por la cual las bacterias Gram del
gato, perro y de cierta forma la saliva humana Finalmente en la saliva humana los Gram
se debe a la composicin de las clulas negativos y positivos fueron difciles de
cuyas paredes estn compuestas en gran encontrar ya que por lo general la boca est
cantidad por peptidoglicano, el cual retiene el siendo limpiada constantemente2, es decir
colorante final, es decir que en este caso la que la generacin de bacterias no fue visible
segunda imagen de la tabla correspondiente o notoria en ese instante.
a la identificacin de una Gram negativa, a
este resultado se lleg de forma sistemtica
la cual permiti analizar la muestra
Tabla 2. Aumento y observaciones
morfolgicamente y en ella se encuentran
dos tamaos : 1) pequeas tiras uniformes y Muestra Aumento Observaciones
 Se ven pequeos encontraba en Berln en 1884, descubri el
puntos rosados y mtodo para teir las bacterias que lleva su
4x
morados pero nada nombre y que se usa ampliamente para
definido clasificar las bacterias.
Los puntos
comienzan a tener Gram sigui el mtodo de Paul Ehrlich,
Saliva de mayor tamao y se utilizando una solucin de anilina y violeta de
10x
gato distingue una forma genciana. Despus un tratamiento con lugol
geomtrica (iodo en yoduro potsico acuoso) y etanol
hexagonal observ que algunas bacterias retenan el
El microscopio no colorante (por ejemplo, los neumococos)
permite enfocar de mientras que otras no lo hacan. Esto
100x
forma adecuada se permiti dividir las bacterias en Gram-
ve una sombra positivas y en Gram negativas, clasificacin
Se ven sombras que es de gran utilidad hoy da para elegir un
4x moradas pero no tratamiento antibitico.
son Gram positivas
Los puntos En 1891 Gram fu nombrado profesor de
comienzan a tener farmacologa de la Universidad de
Saliva de 10x mayor tamao y se Copenhague, donde mostr un gran inters
perro acenta la en los aspectos clnicos de la farmacologa.
coloracin Fue un mdico practicante durante toda su
El microscopio no vida. Fue Presidente de la Comisin de la
permite enfocar de Pharmacopoeia entre 1901 y 1921 y director
100x
forma adecuada se del departamento de medicina interna del
ve una sombra Hospital Frederick de Copenhague, hasta su
No se percibe casi retiro 1923.
4x
nada
Saliva El microscopio no 2. Es posible hallar bacterias Gram
humana permite enfocar de positivas y Gram negativas que sean de la
100x
forma adecuada se misma especie?
ve una sombra
La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est su resistencia a la decoloracin,
En la tabla 2 se exponen las observaciones e
esta resistencia se debe probablemente al
cada uno de los aumentos empleados; ente hecho de que en el caso de bacterias Gram-
las cuales se denota que el uso de un negativas, la mezcla de alcohol/acetona es
material bueno es fundamental dado que es un solvente lipdico y disuelve la membrana
l el que permite la distincin, observacin y exterior de la pared de la clula (y tambin
anlisis de las muestras, adems a pesar de puede daar la membrana citoplasma a la
que se une peptidoglicano). As las bacterias
emplear el aceite de inmersin en el aumento
Gram positivas y Gram negativas pertenecen
de 100X no se logr ver una imagen clara. las dos a una gran especie llamada
Eubacterias la cual tiene diferentes tipos y
ANEXOS esta se pueden dar siendo tanto bacterias
Gram positivas como Gram negativas, as
1 Quin fue Hans Christian Gram? como los cocos. [8].

GRAM, Hans Christian Joachim (1853 - 3. Cul es la funcin de cada uno de los
1938) reactantes usados en la coloracin Gram?

Bacterilogo dans graduado en medicina en
Copenhague en 1878, viaj por varios pases
de Europa entre 1878 y 1885 estudiando
farmacologa y bacteriologa. Mientras se
El cristal violeta tie las bacterias, se quita el
exceso de este reactivo, en este estado las
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
estn teidas de azul. La lmina se cubre
entonces con una solucin de lugol la cual
consiste en una disolucin de yodo
molecular. El ingrediente activo es aqu el I2;
el KI simplemente hace soluble el I2 en agua.
El I2 entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las clulas Gram-positivas como
las Gram-negativas se encuentran en la
misma situacin. Se procede a la
decoloracin, usando una mezcla de alcohol-
acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo I2-cristal violeta. Algunos
organismos (Gram-positivos) no se
decoloran, mientras que otros (Gram-
negativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de clulas est por tanto
en su resistencia a la decoloracin, esta
resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias Gram-
negativas, la mezcla de alcohol/acetona es
un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin
puede daar la membrana citoplasma a la
que se une peptidoglicano). La delgada capa
de peptidoglicano es incapaz de retener el de
complejo cristal violeta-yodo y la clula se
decolora. [6].
4. De ejemplos de bacterias Gram positivas,
Gram negativas y Gram variables. [8].
Cocos gram positivos:
staphylococcus aureus,
staphylococcus coagulosa negativa,
streptococcus pneumoniae,
streptococcus grupo A, B, C.
Cocos gram negativos: neisserias
meningiditis, gonorrhoeae,
moraxella.
Bacilos gram positivos
Bacilos gram negativos
Gram variables: actinomicetos,
arthobacter, corynebacterium,
mycobacterium, y propionibacterium
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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[4]. Tincin Gram. (noviembre 2001).
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[5]. Gram-negativas y Gram-positivas.
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[6]. Proceso de tincin Gram. Universidad
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[7]. Hans Christian Gram. Hombres
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[8]. Gram positivos y negativos. Hector
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positivos-y-negativos