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ESTUDO DIRIGIDO - 1.

VA VIROLOGIA III
1. Defina vrus

R: Vrus so estruturas subcelulares, com um ciclo de replicao exclusivamente


intracelular, sem nenhum metabolismo ativo fora da clula hospedeira. Basicamente,
composto de uma molcula de cido nucleico circundado por uma capa de protena,
podendo conter acares e lipdios; cuja funo desse aparato levar informao
gentica a salvo para dentro da clula infectada.

2. Comente sobre os parmetros utilizados para a classificao dos vrus em


famlias.

R: A taxonomia formal dos vrus estabelecida baseada, principalmente, em


propriedades estruturais, como morfologia, propriedades fsico-qumicas, protenas,
lipdios e carboidratos, replicao viral e organizao gnica, propriedades antignicas e
propriedades biolgicas.

3. Cite as fases do processo de replicao viral e explique de que maneiras ocorrem


a penetrao e liberao dos vrus da clula hospedeira?

R: As fases do processo de replicao viral consistem em: Adsoro, internalizao


(penetrao), replicao, montagem/maturao e liberao.

A penetrao um processo dependente de energia e envolve a etapa de transferncia


do genoma para dentro da clula. Durante a adsoro, mudanas conformacionais nas
protenas virais e receptores celulares permitem a entrada do genoma viral ou do
nucleocapsdeo na clula. Isso pode acontecer por alguns mecanismos distintos: 1) Para
alguns vrus envelopados, a adsoro expe aminocidos hidrofbicos das
glicoprotenas virais que facilitam a fuso entre o envelope viral e a membrana
plasmtica celular (fuso direta) liberando o genoma viral para o citoplasma da clula.
2) Alguns vrus so endocitados pela clula aps a adsoro. Nesse caso, isso se d de
maneiras diferentes dentre os vrus. Para os vrus envelopados, geralmente a
acidificao da vescula endoctica facilita a fuso do envelope viral com a membrana
da vescula endoctica (fuso dependente de pH cido). Para os vrus no-envelopados,
existem mecanismos de lise da vescula endoctica para a liberao do genoma viral,
podendo ou no depender de pH. 3) Ocorre a formao de um poro na membrana
plasmtica celular, e translocao do genoma viral atravs do poro formado, com o
restante da partcula viral permanecendo no meio extracelular; 4) translocao do vrus
inteiro para o interior da clula atravs da membrana plasmtica (penetrao direta).

A liberao dos vrus se d de modo diferente para dois tipos de vrus envelopados e
no-envelopados. Nos no-envelopados, existe a dependncia da lise celular para a
liberao das partculas virais;
Os vrus envelopados, por sua vez, como adquirem seu envelope lipdico nas
membranas celulares (citoplasmticas, nucleares ou de vesculas intracelulares) passam
por um processo denominado brotamento. No caso de brotamento ocorrendo em
membranas intracitoplasmticas, a liberao das partculas pode ser feita por exocitose
de vacolos ou vesculas que contm partculas j envelopadas. Este processo de
brotamento geralmente feito sem causar dano a membrana celular, embora em alguns
casos o grande nmero de partculas virais brotando em uma clula j prejudicada pela
infeco viral possa levar, por fim, a lise celular.

4. De que maneiras os vrus com genoma RNA e DNA produzem RNAm?

R: No caso dos vrus de RNA, existem trs possiblidades: RNA de fita dupla, RNA de
fita simples polaridade positiva (RNAfs+) e RNA de fita simples polaridade negativa
(RNAfs-).
Nos vrus de RNA de fita dupla, para que a replicao tenha incio, necessria a
sntese de RNAm, entretanto vrus com esta configurao j trazem em seu vrion a
RNA polimerase-RNA dependente, para a sntese de RNAm.
Vrus de RNAfs+ possui a forma mais simples de replicao, uma vez que j est pronto
para ser traduzido, ou seja, um RNAm.
Vrus de RNAfs- no podem ser traduzidos diretamente. Por isso, para estes, assim
como o RNA dupla fita, existe a necessidade do genoma estar associado a uma
transcriptase viral, que ir primeiramente sintetizar uma fita complementar posita, que
ser o RNAm, que ento ser traduzido.
Para os vrus de DNA, existem duas possibilidades: DNA de fita dupla (DNAfd) e DNA
de fita simples (DNAfs).
Nos vrus de DNAfd, o DNA genmico transportado para o ncleo e imediatamente
transcrito em RNAm por enzimas celulares do hospedeiro. Nos vrus de DNAfs, estes
fazem uma fita complementar ao DNA genmico antes do incio da traduo e
replicao, para que posteriormente ocorra a traduo deste DNA em RNAm.

5. Explique o mecanismo de ao dos interferons alfa ()/beta () e gama ().

R: Interferons (IFN) so citocinas produzidas por diferentes tipos celulares. Os IFN do


tipo I (que so os alfa e beta) so elementos chave na resposta imunolgica antiviral.A
produo de IFN tipo I induzida aps a infeco viral, e isso pode se dar por meio de
engajamento de receptores que reconhecem Padres Moleculares Associados a
Patgenos (PAMPs). Esse Interferon tipo I secretado ir interagir com receptores
presentes nas clulas vizinhas e induzem diferentes vias de sinalizao intracelular que
podem culminar na induo do chamado estado antiviral. O IFN-beta se liga a seus
receptores de forma parcrina e autcrina, o que resulta num feedback positivo de
produo dessa citocina. A ligao inicia uma cascata de sinalizao intracelular,
levando a ativao de STATs, que iro desencadear a transcrio de de vrios genes
influenciados por IFN. Estes genes transcritos levam ao estado antiviral na clula
hospedeira, por influenciarem a sntese proteica, na inibio do crescimento celular e na
apoptose. Dentre estes genes, pode-se destacar uma endorribonuclease que degrada
RNA viral e uma cinase que fosforila um fator de iniciao da sntese proteica, inibindo
a sntese de protenas celulares e virais. Alm disso, elementos estimulados por IFN
potencializam a maturao de clulas dendrticas, a citotoxicidade mediada por clulas
NK e a diferenciao das clulas T citotxicas, contribuindo assim para a integrao
entre a imunidade inata e adaptativa. Alm dos IFN do tipo I, o IFN-gama tambm
participa do controle da replicao de patgenos virais, especialmente por ativao
celular de NK e linfcitos T citotxicos.
6. Explique a importncia das clulas Natural killer (NK) na imunidade inata e
adaptativa.

R: Estas clulas apresentam atividade citotxica e, quando ativadas (reconhecendo


clulas infectadas), liberam grnulos citolticos contendo enzimas, como granzimas e
perforinas, que induzem a apoptose na clula alvo. Alm da atividade citotxica, as
clulas NK so capazes ainda de secretar diversas citocinas, como IFN-gama e
quimiocinas, como MIP-1alfa, MIP-1-beta e RANTES, participando assim tambm da
regulao da resposta imunolgica.

7. Qual a funo dos linfcitos T helper (Th) e T citotxicos (Tc) na resposta


especfica contra uma infeco viral?

R: Quando o linfcito T helper apresentado ao antgeno, ele estimulado a proliferar


(expanso clonal) e a produzir citocinas. Dependendo do tipo de antgeno apresentado,
as clulas T helper podem se diferenciar em dois tipos diferentes de linfcitos: T helper
I ou II (diferenciao mediada pelo tipo de citocina produzida), a partir desses
linfcitos, o linfcito T citotxico (CD8+) estimulado a causar lise de clulas
infectadas, sendo considerada a clula tardia, por necessitar do estmulo de citocinas
para agir. As clulas infectadas so reconhecidas pelo fato de possurem em sua
superfcie ptns virais, com isso, a cel. CD8+ reconhece e libera porinas e granzinas para
causar lise da mesma. Enquanto isso, os linfcitos T helper produzem citocinas que
estimulam os linfcitos B a produzir anticorpos.

8. Explique de que maneiras os anticorpos podem contribuir para a eliminao dos


vrus do organismo.

R: Eles agem sobre vrus livres ou sobre clulas infectadas. Quando os anticorpos se
ligam ao vrus, impedindo que este se ligue clulas, chama-se de neutralizao do
vrus. O complexo antgeno-anticorpo ativa via clssica do complemento, causando lise
do envelope do vrus (se for envelopado), caso no ocorra lise, esse complexo
fagocitado por macrfagos. Quando os anticorpos se ligam clula infectada, h o
ADCC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos), feita pela clula NK, que
tambm lisa a clula infectada.
Imunoglobulinas trs classes produzidas durante uma infeco viral: IgA, IgG e IgM.
A IgA muito importante para proteo de mucosas (respiratria; TGI);
A primeira imunoglobulina detectada no soro aps infeco viral a IgM, e s
detectado at 2-3 meses aps infeco, sendo importante como marcador de infeco
recente.
A IgG permanece no organismo a vida toda, e so os que do imunidade reinfeco.
(A partir do segundo trimestre de gestao, o IgG da me atravessa a placenta- em
humanos- e passa para o beb. Nos animais, IgG passado por colostro, pois a barreira
placentria no permite a passagem).
9. Cite as portas de entrada dos vrus no hospedeiro.

R: Em geral, os vrus adentram os organismos atravs das clulas na superfcie do


corpo. Os stios de entrada comumente utilizados por vrus incluem as mucosas do trato
respiratrio, gastrointestinal e urogenital, a conjuntiva e a pele.

10. Defina: infeco aguda, infeco subclnica, infeco latente, infeco


persistente.

R: - Aguda ou clinicamente aparente: ocorre a entrada do vrus, replicao, transmisso


do vrus, aparecimento de sintomas, ativao da resposta imune, eliminao do vrus.
- Subclnica ou inaparente: ocorre a entrada do vrus, replicao, transmisso do vrus,
no h manifestao de sintomas, ativa a resposta imune, eliminao do vrus. So
problemticas para controle.
Exemplo: rubola em gestantes desencadeia m formao fetal.
- Persistente: ocorre a entrada do vrus, replicao, transmisso do vrus, surgimento de
sintomas, ativao da resposta imune, porm esta no elimina o vrus, pois tem
capacidade de evaso do sistema imune, por mecanismos.
Exemplo: retrovrus
- Latente: ocorre a entrada do vrus, NO h replicao, NO h transmisso do vrus,
gera resposta imune, NO manifesta sintomas e a resposta imune no impede a
latncia. Disseminao neuronal.
Exemplo: herpesvrus - sua latncia nas terminaes nervosas.
- (Recorrncia: a reativao do vrus latente, ele volta para a porta de entrada e
manifesta sintomas).

11. Em que circunstncias o diagnstico laboratorial de uma virose importante?

R: O diagnstico virolgico pode ser fundamental em algumas situaes clnicas, por


exemplo, o laboratrio tem papel crucial na identificao rpida e precisa de patgenos
que causam doenas em pacientes com o sistema imunolgico comprometido
(exemplos: FIV/FELV+, HIV (primatas)), com doenas sexualmente transmissveis,
com infeces respiratrias graves, infeces gastrintestinais, hepatites virais agudas ou
crnicas e infeces congnitas. Alm disso, o diagnstico virolgico tem importncia
tambm em sade pblica, para, por exemplo, o reconhecimento de uma nova cepa viral
com potencial pandmico.

12. Quais os cuidados na coleta e transporte de amostras clnicas para o


laboratrio? O que deve constar na ficha de identificao da amostra?

R: Colher o material na fase aguda da doena e no stio onde est ocorrendo a replicao
viral aumenta o xito no diagnstico laboratorial; As amostras clnicas devem ser
colocadas em meio de cultura com salina balanceada e tamponada em pH 7,2, contendo
antifngicos e antibiticos, e transportadas rapidamente para o laboratrio. Quando no
possvel o transporte imediato, a amostra em meio de transporte deve ser mantida
refrigerada ou em gelo. Se houver uma demora maior que 24h, as amostras devem ser
congeladas temperatura de -70C ou mais baixa, e transportadas em gelo seco.
Amostras suspeitas de Vrus Sincicial Respiratrio (RSV) e os herpesvrus podem ser
seriamente comprometidos com o congelamento, nestes casos, as amostras suspeitas de
conter estes vrus devem permanecer na geladeira (4C) e no devem ser congeladas a -
20C.
Acompanhando o material colhido deve seguir uma ficha contendo as seguintes
informaes: nome, idade, endereo e sexo do paciente; descrio do material coletado;
poca da colheita e suspeita clnica; histrico das vacinas virais j tomadas pelo
paciente; a situao epidemiolgica da doena na zona residencial do paciente; e se
realizou viagem a local com algum vrus endmico.

13. Como se pode detectar o vrus diretamente da amostra clnica atravs dos
mtodos rpidos de diagnstico:

(a) detectar a partcula viral


R: Atravs dos mtodos de Reao de Hemaglutinao (HA); Microscopia eletrnica;
(b) detectar o vrus como antgeno - descreva o fundamento da reao e faa um
esquema do teste
Mtodo de ELISA: A reao imunoenzimtica base para muitos testes usados para a
identificao de antgenos ou deteco de anticorpos. O sistema envolve a deteco do
imunocomplexo fixo em um suporte, usando para isso um anticorpo conjugado a uma
enzima. O resultado deste teste determinado pela observao ou medida
espectrofotomtrica da colorao produzida pela reao da enzima sobre o substrato.
Assim, o teste possui as seguintes etapas: (1) formao do imunocomplexo (Ag-Ac); (2)
adio do conjugado (Ac + enzima); e (3) revelao (adio do substrato-reao
colorida). Um dos componentes do imunocomplexo (Ag ou Ac para essa resposta,
vamos considerar apenas o Ac) fixado a um suporte slido (placa). No ensaio para
deteco do antgeno, o material teste o material clnico (ex: lavado de garganta,
secrees, fezes ou suspenso de clulas). Aps a reao do material teste com a fase
slida e a lavagem do sistema para a remoo do material que no reagiu, o conjugado
adicionado. Aps incubao e lavagem, o substrato adicionado, onde a enzima atua
sobre o substrato, produzindo mudana de cor.
(c) detectar o genoma viral - descreva o fundamento da tcnica, os reagentes e
etapas da reao.

R: Reao em Cadeia da Polimerase PCR: A PCR uma tcnica de amplificao


usada para sintetizar, in vitro, sequncias especficas de DNA. Inicialmente, um cido
nucleico alvo (DNA ou RNA) isolado de tecidos, fluidos ou de cultura de clulas
infectadas. Se o cido nucleico for um RNA, este deve ser convertido primeiramente em
cDNA por transcrio reversa (RT-PCR), antes de comear o processo de amplificao.
A partir da, o DNA amplificado enzimaticamente atravs da PCR. A PCR uma
reao cclica que requer um molde de DNA, um tampo, os quatro
desoxirribonucleotideos trifosfados dNTPs, sequencias iniciadoras (primers) e a DNA
Polimerase. Quando os iniciadores se ligam ao DNA-alvo (hibridizao), a DNA
polimerase, usando os dNTPs, como substrato, inicia a replicao da sequncia-alvo
(extenso). O tampo fornece as condies adequadas para a atividade da DNA
polimerase. Esse processo cclico repetido diversas vezes para amplificar o DNA
original em progresso exponencial. A reao realizada num termociclador, o qual
aumenta ou diminui a temperatura de acordo com as necessidades do processo para
permitir a PCR. O produto amplificado (amplicon), pode ser detectado por outras
tcnicas, como hibridizao com sondas especficas ou visualizado aps eletroforese e
colorao do gel.

14. Explique a importncia da utilizao de cultura de clulas e ovos embrionados


de galinha em virologia.

R: Sua importncia se d, principalmente, porque so verdadeiros meios de cultivo de


vrus, uma vez que so capazes de fornecer, em totalidade, todas as vias que os vrus
necessitam para sua reproduo/replicao. Por no terem metabolismo prprio, a
cultura de clulas e os ovos embrionados (por terem metabolismo ativo) servem de
substrato (energtico, metablico, ambiental) para a propagao viral.

15. Como se pode detectar a replicao viral em cultura de clulas?

R: No que diz respeito observao da propagao viral em culturas de clulas, vrias


abordagens podem ser realizadas a fim de detectar a presena da propagao viral. O
efeito citoptico (CPE), por exemplo, se refere a alteraes na morfologia em clulas
individuais ou grupos de clulas induzidas pela infeco viral, as quais so observadas
em microscpio ptico. Dependendo do vrus e do tipo de cultura de clulas. O CPE
observado pode ser caracterizado por arredondamento celular, clulas refrteis, picnose,
vacuolizao, granulao, formao de clulas gigantes, degenerao granular em que o
citoplasma se torna refringente, formao de sinccios que resultam da fuso de clulas,
agregao, perda de aderncia ou lise.

16. Como se faz a identificao dos vrus isolados em cultura de clulas?

R: Para a identificao do vrus isolado em culturas de clulas, colhem-se o


sobrenadante da cultura para a execuo de testes, que podem ser por exemplo testes
sorolgicos clssicos como teste de neutralizao, teste de fixao do complemento ou
teste de inibio da hemaglutinao, utilizando-se soros padres contra os vrus
pesquisados.
17. De que maneiras se podem realizar o diagnstico de infeco recente por
sorologia?

R: Atravs da deteco de IgM especfica, que um anticorpo marcador de infeco


recente.

18. Discuta as vantagens e desvantagens da utilizao de vacinas replicativas e no


replicativas.

R: - No replicativas: o vrus no replica no hospedeiro. Mais segura. No contm o


agente vivel (vrus inteiro, porm inativado ou uma parte do vrus, como uma protena
viral). Estimula de forma mais eficiente a resposta humoral. No caso de vrus inteiro
inativado, faz-se a propagao do mesmo, para gerar uma grande massa viral e, depois
disso, estes vrus so inativados para a produo da vacina.
- Replicativas: o vrus replica no hospedeiro. Estimula de forma eficaz a imunidade
celular (Th e Tc) e humoral (linfcitos B e anticorpos). O vrus apenas perde a
virulncia, porm continua infectando as clulas. Existe o risco (raro) de reverso
virulncia. Por esse motivo no so recomendadas a gestantes e indivduos
imunodeprimidos. Podem ser feitas com vrus heterlogo, como o vrus da varola,
naturalmente atenuado. Mesmo mtodo utilizado para prevenir a doena de Marek em
galinhas, a vacina produzida com herpesvrus de peru. Pode-se usar vrus atenuado em
laboratrio para a produo da vacina. Nesse mtodo, feito passagens desse vrus em
hospedeiros ou cultura de clulas que promove uma mutao que causa a perda da
capacidade de causar doena. H tambm os vrus atenuados por seleo de mutantes
sensveis temperatura adaptados para se replicar apenas em uma determinada
temperatura. possvel ainda fazer a manipulao gentica, retirando genes que
codificam fatores de virulncia. Nesse caso, o indivduo no ir produzir anticorpos para
a protena codificada pelo gene deletado. Dessa forma, pode-se detectar se o animal tem
anticorpos devido ao contato com o vrus selvagem ou por ter sido vacinado (ex:
herpesvrus deleo da glicoprotena E).