Tcnico en farmacutico industrial cets 32 alumno Francisco Lozano Gmez

Produccin de anticuerpos contra albmina humana en

conejo
Objetivos
Ensayar las tcnicas de inmunizacin con conejos, practicando algunos de los esquemas de
inmunizacin ya establecidos.
Efectuar la purificacin de gamma globulina por precipitacin con sulfato de amonio a una
saturacin final del 33%.
Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reaccin de precipitacin que ocurre cuando
un antgeno soluble interacciona con su anticuerpo homlogo.

Introduccin
El sistema inmunolgico tiene como funcin principal proteger al organismo de
agentes extraos, est integrado por diferentes rganos, tejidos, clulas y
molculas que funcionan coordinadamente. Sus componentes ms importantes
son: la piel y las mucosas, los rganos linfoides como las amgdalas, las
adenoides, el bazo, el timo, los ganglios linfticos; numerosas clulas leucocitarias
(linfocitos) y sus productos de secrecin como citocinas, quimiocinas e
inmunoglobulinas entre otros. Este sistema tiene tres propiedades esenciales:
primera, tiene la habilidad de reconocer sustancias extraas denominadas
antgenos principalmente provenientes de patgenos, tales como bacterias, virus,
hongos.

Los anticuerpos, tambin llamados inmunoglobulinas, son glucoprotenas

producidas por clulas especficas del sistema inmunitario en respuesta a una
proteina extraa o antgeno. Inmunoglobulinas, trmino introducido por vez
primera por J. F. Heremans en 1959 para referirse a aquellas globulinas que se
asocian al sistema linforreticular y que a menudo son referidas como anticuerpos
que son producidas por las clulas plasmticas. El descubrimiento de los
anticuerpos fue el resultado global de un cmulo de conocimientos derivados de
observaciones cientficas recabadas a lo largo de varios siglos, desde las vacunas
rudimentarias de la antigua civilizacin China (variolizacin), hasta la primera
estructura resuelta por Edelman y Porter (Sanabria y Landa; 2007).

En general los anticuerpos, independientemente de su especificidad tienen una

estructura comn, consistente de cuatro cadenas polipeptdicas: dos cadenas
pesadas idnticas de 55-70 kDa denominadas con la letra H (del ingls heavy),
unidas covalentemente a un oligosacrido, y un par idntico de cadenas livianas
no glicosiladas de 24 kDa denominadas con la letra L (del ingls light). Un puente
disulfuro y otras uniones no covalentes unen las cadenas pesadas con las livianas.
Las cadenas pesadas tambin estn unidas entre s por al menos un puente
disulfuro, tal unin est localizada en una regin conocida como bisagra, regin
formada por aproximadamente 12 residuos de aminocidos que proporciona una
gran flexibilidad a la molcula, stos residuos estn expuestos a la ruptura qumica
y enzimtica.
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Clases o Isotipos

Existen diferentes clases de anticuerpos, las cuales son determinadas por el tipo
de cadena pesada. Hay cinco tipos de cadenas pesadas, denotados por las letras
griegas y para cada una de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgD,
IgE e IgM, respectivamente. En estas clases pueden existir cadenas livianas ya
sea de tipo kappa ) o tipo lambda (). Los genes que codifican para las distintas
variantes isotpicas estn presentes en todos los individuos sanos, es decir, stos
poseen los genes para las cadenas pesadas denominadas 1, 2, 3, 4, , 1,
2 localizados en el brazo largo del cromosoma 14 y para las cadenas livianas
y, en los cromosomas 2 y 22, respectivamente.

Factores que intervienen en la reaccin antgeno-anticuerpo

La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta

inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formacin de un precipitado o
aglutinacin de partculas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las
macromolculas est dado por varias fuerzas dbiles que disminuyen con la
distancia, como los puentes de hidrgeno, las fuerzas de Van Der Waals, las
interacciones electrostticas y las hidrofbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una
reaccin de complementariedad, por lo que se efecta a travs de mltiples
enlaces no covalentes entre una parte del antgeno y los aminocidos del sitio de
unin del anticuerpo. La reaccin se caracteriza por su especficidad, rpidez,
espontaneidad y reversibilidad: (Bautista;2005)

Especficidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura
similar. La unin dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos
qumicos con diferencias mnimas.
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Rapidez: la velocidad con que ocurre la primera etapa de la reaccin Ag-Ac es del orden de
milsimas de segundo, y est limitada nicamente por la difusin. La segunda etapa, que es ms
larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interaccin,
tales como precipitacin, aglutinacin, neutralizacin, etctera.
Espontaneidad: la reaccin Ag-Ac no requiere energa adicional para efectuarse y es factible
explicarla en trminos de la ley de accin de masas.
Reversibilidad: dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en
consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporcin de Ag-Ac, el pH y la
fuerza inica.

Metodologa
Medicin de albmina en suero
A)
-La concentracin inicial de albumina srica bovina era 22%, equivalente a 220 mg/mL
-De ah se tomaron 272 microlitros, que equivalen a 60 mg de albumina
-Se aforaron a 10 mL

B)
-Se tomaron 5 mL de stos 10 mL (=30 mg de albumina) y se aforaron a 10mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=15 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=7.5 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=3.75 mg de albuina) y se aforaron a 10 mL

C)
-De esos 5 ml restantes se tom una alcuota de 1 mL (=6 mg de albumina)
-se le adicion a esa alcuota de 1ml, 5 mL de biuret. Volumen final= 6mL.
-Se ley en el espectro, la concentracin de albmina era de 6mg/6mL=1 mg/mL

D)
-Se repiti ste ltimo procedimiento C) para los matraces 2,3,4 y 5.

Obtencin del antgeno

1. Se extrajo sangre de tres individuos sanos en un tubo sin anticoagulante por venopuncin.
2. Se dej coagular durante una hora a temperatura ambiente.
3. Se centrifug a 3,000 rpm durante 15 minutos para obtener el suero.
4. Se extrajo la fraccin del suero y se calent a 60C durante 15 minutos para obtener coagular el
suero.
5. Se inocul en el conejo.

Inoculaciones del conejo

Se hizo va subcutnea:
1. Se rasur el lomo del conejo.
2. Se introdujo la aguja de 22x32 mm punta verde en la dermis del conejo con el bisel hacia arriba.
Una vez dentro de la piel, se gir 180 y se deposit el inculo. En el sitio de la inoculacin se
observ la formacin de una ppula que das despus evolucion en costra.
El programa de inoculacin fue el siguiente:

Tabla 1. Programa de inoculacin de suero humano en el conejo por va subcutnea.

Da Fecha Cantidad inoculada Nmero de
(ml) puntos
0 31-oct-13 0.5 2
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4 4-nov-13 1.0 4
7 7-nov-13 1.5 6
11 11-nov-13 2.0 8
14 14-nov-13 2.0 8
19 19-nov-13 VIA INTRAVENOSA**
21 21-nov-13 SANGRADO**
*Se administr por va intravenosa 3 das antes del sangrado para asegurarse que presentara alta
concentracin de anticuerpos. Se administraron 0.8 ml correspondientes a 54 mg de albmina
srica humana.
**El sangrado se obtuvo de la oreja del conejo en la vena central. Se obtuvieron 10 ml de sangre.

Precipitacin de gamma globulina con sulfato de amonio

1. Se ajust a 7.8 el pH de una solucin saturada de sulfato de amonio con NaOH 2N.
2. Se adicion un volumen de suero, contenido en un tubo cnico, medio volumen de la solucin
saturada de sulfato de amonio para dejar el sulfato de amonio a una concentracin final de 33%.
3. Se continu la agitacin por 10-15 minutos, despus de terminada la adicin de sulfato de amonio.
4. Se centrifug a temperatura ambiente a 3,500 rpm por 15 minutos.
5. Se disolvi el sedimento en solucin salina a pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero.
6. Se repitieron los pasos 2-5 y posteriomente los pasos 2-4.
7. Se disolvi en SSRB el sedimento despus de la ltima centrifugacin hasta alcanzar la mitad o un
tercio del volumen original del suero.
8. Se dializ contra SSRB en fro a 4C y agitacin durante 3-5 das, realizando dos cambios diarios
de la solucin de dilisis hasta eliminar completamente el sulfato de amonio.
9. Se transfiri la gamma-globulian dializada a un tubo y se centrifug en fro a 2,500 rpm durante 10
minutos para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
10. Se determin la concentracin de protenas por espectrofotometra.

Precipitacin en capilar
1. Se hicieron una serie de diluciones dobles de antgeno en tubos eppendorf de la siguiente manera:
se depositaron 0.2 ml de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo se agregaron 0.2 ml de la
solucin concentrada de antgeno y se mezcl. De ste tubo se tomaron 0.2 ml y se transfirieron al
siguiente tubo. Se repiti el procedimiento hasta el tubo 10.
2. Se llen un tubo capilar con antisuero hasta la primer marca y se limpi el exterior del tubo con
papel absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas.
3. Se invirti el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario.
4. Se tom un volumen de antgeno de tal manera que el volumen en el capilar llegara hasta 2/3
partes.
5. Se mezcl el contenido por movimientos de rotacin e inversin repetidos del capilar. Se centr el
contenido del capilar y tap uno de los extremos del mismo con el dedo ndice y se introdujo el
extremo contrario en una gradilla de plastilina.
6. Se utilizacin como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero ms solucin salina y otro
conteniendo antgeno sin diluir ms solucin salina.
7. Se mantuvieron los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

Reacciones de Precipitacin en medio semislido

1. Se agreg una muestra de 50 l del antisuero al pozo central de un gel comercial, y se tomaron 10
l del antgeno en sus diferentes diluciones, as como dos muestras de antgeno diferentes.
2. Se dej reaccionar durante 48 h en condiciones de refrigeracin.

Resultados y discusin
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Antgeno

Figura 2. Curva tipo obtenida por el mtodo del reactivo de Bradford para determinacin
de protenas en suero. La medicin de absorbancia obtenida fue de 0.042 que
corresponde a 0.1142 mg/ml y que multiplicada por el factor de dilucin 6,000 da una
concentracin en suero de 68.5 mg/ml, valor que se ajusta a lo esperado para albmina
humana.

La medicin directa de las diluciones en suero dio una concentracin de C=(Abs-0.0131)/0.2531 = (0.042-
0.0131)/0.25310=0.1142 mg de albmina/ mL

Pero sta medicin tiene la siguientes diluciones:

iii) la diluy 6 veces
ii) La diluy 0 veces
i) La diluy 100 veces
Lo que nos da un factor de dilucin de 6,000 veces, lo que nos deja una concentracin inicial real en suero de
68.51 mg/mL,

COMPROBACIN

-Se tienen 68.51 mg/mL, se toman 100 microlitros, osea 6.85 mg de albumina
-Se aforan esos 6.85 mg de albumina a 10 ml
-Se toman 1 mL de alcuota, osea 0.685 mg
-Se adicionan 5 ml de biuret, lo que nos deja una concentracin de 0.685 mg/6mL=0.1142 mg/mL

Para la cuantificacin de las protenas sricas presente en el suero, se emple la reaccin de

Biuret debido a que al estar constituida por sulfato de cobre en una solucin alcalina (ya sea
hidrxido de sodio o hidrxido de potasio) van a formar un complejo entre los iones Cu 2+ y los
electrones no ocupados del nitrgeno que se encuentran presentes en los enlaces peptdicos (en
este caso la albumina humana es una protena), el resultado de lo anterior es la formacin de una
coloracin violeta. Presentan su mxima absorcin a 540nm (UNLP, n/a).
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Figura 3. Reaccin de Biuret, observndose la formacin del complejo entre el Cu2+ y los
electrones del nitrgeno.

La inmunogenicidad es la medida de antigenicidad de un material y est en funcin de la zona de

administracin y de la especie que es inmunizada (Rojas 2006).

Las protenas y carbohidratos al poseer estructuras qumicas complejas presentan un mayor grado de
inmunogenicidad (salvo ciertas excepciones) en comparacin con los polisacridos, lpidos y cidos
nucleicos. As mismo las molculas de composicin mixta (por ejemplo: las glicoprotenas, nucleoprotenas,
glicolpidos, lipopolisacridos y las lipoprotenas) son ms inmungenas que sus componentes individuales.
Tambin si los compuestos presentan estructura terciara o cuaternaria presentarn mayor inmunogenicidad
(Rojas 2006).

Las molculas que presentan pesos moleculares superiores a los 100kD son ms inmunognicas que aquellas
con pesos moleculares inferiores a los 20kD (Rojas 2006).

Adems Rojas (2006) menciona que los antgenos solubles son menos inminognicos que los particulados,
por lo que en el caso de los antgenos solubles es necesario emplear un adyuvante para incrementar su
inmunogenicidad debido a:

- Concentracin de la cantidad de antgeno administrado (por las micelas formadas).

- Retienen por ms tiempo al antgeno en el lugar de inoculacin, prolongando el tiempo de

estimulacin.

- Una vez que el antgeno ha sido particulado se presenta con mayor facilidad su captula por las
clulas fagocitarias procesadoras y presentadoras de antgeno.

Un adyuvante es aquella sustancia o conjunto de sustancias heterogneas e inespecficas que permiten

potenciar la respuesta inmune. Se caracterizan por contar con tres mecanismos de reaccin (Asociacin
Espaola de Vacunologa, 2013):

a) Formacin de un depsito con liberacin gradual del antgeno adsorbido, aumentando una mayor
interaccin CPA-antgeno. En modelos animales de monos, se ha podido recuperar aluminio hasta seis meses
despus de la administracin del mismo.

b) Presentacin de los antgenos de una manera multivalente particulada, que permite una internalizacin ms
eficiente por parte de las CPA.

c) Activacin del complemento y la formacin de un ambiente inflamatorio en el lugar de la inyeccin.

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d) No activan directamente los TLR (Toll-like receptors, receptores de los macrfagos que al reconocer
estructuras, generalmente de origen infeccioso, forman parte importante de la respuesta del sistema
inmunitario innato), pero facilitan la maduracin de los mismos,

i. citoquinas pro-inflamatorias.

ii. la expresin MHC clase II CD86

iii. CD14.

Para la eleccin de un adyuvante se toman en cuenta las siguientes caractersticas: composicin

qumica, caractersticas fsicas (dureza, pH, densidad, viscosidad, tamao de partcula y carga),
caractersticas bioqumicas, pureza, va de administracin, adems de la patologa o naturaleza del antgeno
(European Medicines Agency, 2013). Sin embargo, en esta experimentacin, no se utiliz adyuvante porque
como la va de administracin fue subcutnea y en esa va se asegura que el antgeno es retenido por ms
tiempo.

Con base a la informacin anterior, la albmina humana es poco inmunognica, ya que a pesar de que es una
protena (que es estable, de carcter cido y no cuenta con carbohidratos) es soluble y su peso molecular es de
66kD (Telijn, 2006) adems de que pudo haber generado tolerancia; por lo que para el desarrollo de la
prctica era necesario emplear un adyuvante (como el Freund completo o incompleto) para aumentar la
inmunogenicidad de la albmina.

Manejo de conejos
En primera instancia, se trat el aspecto del manejo adecuado de los animales. Si un procedimiento produce
dolor o estrs en los animales de laboratorio, las normas internacionales urgen a los usuarios a buscar nuevas
alternativas (Lobato-Garca, 2009). Tomando en cuenta esta recomendacin, se decidi establecer protocolos
de inmunizacin y prcticas de laboratorio que disminuyeran el sufrimiento del conejo utilizado.
Bsicamente, los esfuerzos se orientaron a disminuir el estrs del animal durante la obtencin de la muestra de
sangre y durante su inmunizacin. Para ello, se utiliz lidocana en pomada 15 minutos antes de cada puncin
y una zanahoria para ayudar a reducir el estrs.

Inmunizacin
Una vez capacitados en el manejo de los conejos, se inici la discusin sobre la mejor va de
inmunizacin con los antgenos. La inmunizacin puede realizarse a travs de la va oral, nasal,
intramuscular, intravenosa, intracardaca, subcutnea, intradrmica, intraperitoneal, etc. La
eleccin de la va depende, entre otras cosas, de la especie animal que se utilice y de las
caractersticas del antgeno. Originalmente se planeaba hacerlo por va intravenosa.

Esta va proporciona un contacto inmediato y directo del antgeno con las clulas inmunes; sin
embargo, la inoculacin del antgeno a travs de esta va requiere de amplia experiencia en la
canalizacin de venas o arterias. Dado que los protocolos de inmunizacin establecan
inoculaciones peridicas con los antgenos, el posible fallo de la inoculacin por va intravenosa
podra constituir una limitante para la estimulacin de una adecuada respuesta inmune. En este
sentido, la inoculacin de los antgenos por va intravenosa no es muy adecuada para los fines
didcticos que se persiguen con la produccin de anticuerpos. Sin embargo, esta va podra
utilizarse exitosamente si fuera precedida de un curso sobre toma de muestras en animales de
laboratorio.

Por otra parte, la va subcutnea es utilizada frecuentemente para la inmunizacin de antgenos

solubles como la albmina srica humana, por lo tanto se decidi utilizar esta va para la
inoculacin de estos antgenos. Para disminuir una reaccin local severa y abarcar una mayor
superficie de absorcin, cada dosis de antgeno fue distribuida en diferentes sitios (mximo ocho) a
lo largo del dorso torcico y lumbar. La inmunizacin subcutnea de los antgenos estimul una
fuerte respuesta de produccin de anticuerpos como se demostr en la pruebas de precipitacin.
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En ambos conejos, los inmunizados con suero o los inmunizados con albmina, se present una
reaccin inflamatoria que llev a la formacin de una costra en la zona de inoculacin, que
finalmente se descam sin dejar ninguna lesin posterior. La formacin de esta lesin podra estar
relacionada con el volumen de la dosis de antgeno inoculada. Sera interesante desarrollar nuevos
protocolos para determinar el volumen mnimo necesario para una adecuada produccin de
anticuerpos sin que se produzcan lesiones importantes. Durante el desarrollo del protocolo de
inmunizacin el conejo no present fiebre o alteracin de su estado general de salud.

Figura 4. Sitio de inmunizacin por va subcutnea del conejo. Se muestran dos costras y
algunas ppulas formadas despus de la inmunizacin. Imagen del da 11.

Pruebas
Se obtuvo una concentracin de protenas totales en el concentrado de suero de conejo dializado
de 0.818 mg/ml, alrededor de 80 veces menor que en suero humano sin dializar. La absorbancia
obtenida fue de 0.020 a 540 nm por la tcnica de reactivo de Biuret. Se disolvieron 100 L de
solucin de anticuerpos, 400 L de solucin salina y 2.5 ml de reactivo de Biuret. Factor de
dilucin: 30.

Veintin das despus de la primera inoculacin, los animales fueron sangrados siguiendo el
protocolo previamente establecido. La formacin de un precipitado abundante entre el antgeno y
su anticuerpo depende de que las concentraciones de ambos sean equivalentes (zona de
equivalencia); el exceso de alguno de stos disminuye e incluso inhibe la formacin del precipitado.
Con objeto de determinar la zona de equivalencia del antisuero contra albmina, se realiz una
serie de diluciones dobles de la albmina como se indica en la tabla (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64,
1:128, 1:256, 1:512, 1:1024). En este caso la concentracin del anticuerpo permaneci constante.
Como se esperaba, concentraciones muy bajas o muy altas del antgeno inhibieron la formacin
del complejo antgeno-anticuerpo (extremos de la curva). La zona de equivalencia para el
anticuerpo anti-albmina se present entre las diluciones 1:4 y 1:8 del antgeno (zona central de la
curva). Este resultado demostr que el protocolo de inmunizacin establecido fue adecuado para la
produccin de anticuerpos contra esta protena.
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Figura 5. Izquierda: agitacin y mezclado del capilar que contienen antgeno y anticuerpo.
Derecha: Puncin en gradilla de plastilina para posterior almacenaje hasta observar la
presencia de precipitado.

Figura 6. Tubos 1-10 y los controles A y Ao. A=antisuero + solucin salina. Ao=Antgeno
sin diluir + solucin salina.
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Figura 7. Resultados de precipitacin capilar a las 36 horas. Se observa slo precipitacin

en los tubos 1-4. Los tubos 5-10 se observan algo turbios pero sin precipitado. Los dos
controles, A y Ao no presentan precipitados ni turbidez.

Figura 8. Resultados de precipitacin capilar a las 48 horas. Se observaron precipitados

en todos los tubos. Los tubos control siguieron sin mostrar precipitados o turbidez.
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Figura 9. Resultados de precipitacin capilar de los tubos 1-6 a las 60 horas. Todos ellos
presentan precipitado.

Tabla 2. Resultados de precipitacin capilar en los tubos 1-10 y controles con las
diluciones indicadas a las 48 horas de estar en reposo.
Tubo Dilucin Precipitado
(+)
1 1:2 +++
2 1:4 ++++
3 1:8 +++++
4 1:16 ++++
5 1:32 +++
6 1:64 ++
7 1:128 ++
8 1:256 +
9 1:512 -
10 1:1024 -
A Testigo suero -
Ao Testigo -
antgeno
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Figura 10. Se muestra el grado de formacin de precipitado para cada tubo a las 48 horas
basado en la tabla anterior. El tubo con mayor reaccin de precipitacin fue el tubo 3.

En la realizacin de esta prueba se observan 2 zonas formadas respecto a la concentracin del

antgeno empleado (suero humano): en la primera ocurre un incremento de la formacin del
precipitado conforme se va reduciendo la concentracin del antgeno; la otra zona comienza
despus de la tercera dilucin (1:8) la cantidad de precipitado disminuye hasta llegar a un punto
(dilucin 1:512) en donde ya no hay precipitado.
Lo anterior se puede adecuar a la curva de inmunoprecipitacin (Ver figura 11) donde ocurre lo
mencionado previamente, adems se observa que hay una zona intermedia (en donde el
aumento/descenso del precipitado se da en una proporcin menor).

Para la primera etapa (Ver figura 10, inciso c) como lo menciona Fuentes (1998) al haber mayor
cantidad de antgeno los 2 centros de unin estn ocupados, mientras que en el caso de los
antgenos presentes sus eptopos no estn totalmente ocupados, por lo que no hay una formacin
de complejos grandes, haciendo que solamente hayan complejos pequeos y que sean solubles.
Conforme la concentracin del antgeno se va disminuyendo los eptopos se van combinando con
las zonas libres de los anticuerpos hasta ocupar las 2 zonas de unin de estos, con lo anterior se
forman inmunocomplejos grandes e insolubles formando los precipitados. A esta zona se le
denomina la zona de equivalencia (Ver figura 10, inciso b). En esta prueba se observa que en el
tubo 3 hay mayor precipitado, por lo que correspondera a esta zona. Para los tubos 1 y 2 si bien
hay inmunoprecipitado la cantida es menor por lo mencionado anteriormente (formacin de
pequeos complejos solubles).

Al seguir disminuyendo la concentracin del antgeno, estos se van a ir reduciendo, por lo que
varios anticuerpos se unirn en los diferentes eptopos, formando complejos solubles y de esa
manera se reduce la formacin del inmunoprecipitado (como en los tubos 9 y 10) (Fuentes, 1998).
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Figura 11. Reacciones entre una concentracin fija de anticuerpos y concentraciones

crecientes de antgeno en la prueba de inmunoprecipitacin (Fuentes, 1998).

Figura 12. Curva de la formacin del inmunoprecipitado en funcin de la concentracin de

antgeno (Fuentes, 1998).

Inmunodifusin
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Cuando al difundir por el gel el antgeno y el anticuerpo contactan, forman inmunocomplejos

estables, producindose una lnea de precipitacin que puede observarse a simple vista. La
formacin de una lnea de precipitacin indica una sola reaccin antgeno-anticuerpo, estando el
grosor de la lnea en relacin con la cantidad de antgeno presente en la precipitacin. Cuando la
lnea de precipitacin se cierra y se acerca al pocillo del anticuerpo, ello significa un exceso de
antgeno, mientras que cuando ocurre lo contrario se trata de un exceso de anticuerpo. En algunos
casos, si el exceso de uno de los dos es muy importante, la banda de precipitacin no llega a
formarse (Fuentes, et al, 1998).

Se nota en la Figura 13, que efectivamente se presentaron lneas de inmunoprecipitacin

(circunferencia ms opaca), para las diluciones 1:2 (a), 1:4 (b), 1.8 (c), as como para 1:128 (d),
1:256 (e) y 1:512 (f). Tambin se realiz la prueba con dos antgenos utilizados (R) y (E). Se
observa que a concentraciones iniciales se presentan varias bandas (lnea naranja).

Figura 13. Resultados de la prueba de inmunodifusin. Se inoculo al animal con el

antgeno.

Adems se observ que ms bandas aparecieron con el antgeno que ms se us para inocular,
posiblemente el anticuerpo reconoci un eptopo caracterstico de esta muestra. Mientras que el
antgeno que se us una vez no presento alguna banda, esto fue por dos causas: se present el
fenmeno de prozona (Exceso de antgeno) o la muestra estaba concentrada (postzona).

Al comparar los resultados con la teora se observa que (comparando con la Figura 14):

Figura 14. Patrones de precipitacin de la doble inmunodifusin A y B son los antgenos y

S son los anticuerpos.
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En la Figura 14y 13, se nota que en el primer caso (superior izquierdo) se produjo un anticuerpo
para slo un tipo de antgeno, y no se cruzan las bandas; mientras que cuando se promueve la
formacin de un anticuerpo con ms de dos antgenos se observa bandas compartidas es decir
una respuesta cruzada y finalmente la figura de abajo, es el mismo tipo de antgeno solo con
determinante diferente se observa un ligero cruce. En esta corrida experimental se observ el
primer tipo. Lo cual corrobora que las albminas humanas son muy parecidas entre individuos
diferentes de la misma especie.

Para tener una mayor confiabilidad es recomendable cuantificar y estandarizar la concentracin de

los anticuerpos, por ejemplo la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura establece
que la sensibilidad del ensayo de inmunodifusin doble es de 20 1 200 g/ml.

Conclusiones
Si hubo presencia de anticuerpos contra albmina srica humana como demostr la precipitacin
en capilar.
La dilucin 1:8 fue la que present mejor precipitacin a las 36 y 48 horas.
Se necesita de un control de muestra de sangre del conejo antes de las inmunizaciones para
corroborar que no tena anticuerpos antes y que fueron producto de los protocolos de
inmunizacin.
La concentracin de protenas en suero humano que se administr al conejo fue de 68 mg/ml y se
le administr en dosis crecientes de 0.5 ml hasta 2 ml para un total de cinco inmunizaciones
subcutneas con mximo 8 puntos.
Con la reaccin de inmunoprecipitacin se comprob que el anticuerpo producido por el conejo es
til para el antgeno administrado (suero albmina humana).
En la prueba de inmunoprecipitacin se observ la zona de equivalencia (relacin entre las
concentraciones de antgeno y anticuerpo para formar inmunocomplejos insolubles) en la dilucin
de albmina srica humana de 1:8.
La prueba de inmunodifusin doble fue positiva y se comprob la identidad del anticuerpo a las
concentraciones de 1:2, 1:4 y 1:8.
Es recomendable estandarizar la concentracin del antisuero para poder aceptar por completo el
ensayo de inmunoprecipitacin.

Bibliografa
Asociacin Espaola de Vacunologa. (7 de diciembre de 2013). Fundamento de los Adyuvantes
y nuevas perspectivas y usos. Espaa. Disponible en: http://www.vacunas.org/es/info-
profesionales/temas-del-mes/tm-anteriores/114969-fundamento-de-los-adyuvantes-y-nuevas-
perspectivas-y-usos [pgina consultada el 7 de diciembre de 2013.]
Bautista JJ.(2005). Factores que intervienen en la reaccin antgeno-anticuerpo.
Bledding and immunization techniques for polyclonal antibody production. [Citado en 2003].
Disponible
en: http://www.molbio.princeton.edu/facility/restricted/viv_restricted/rabbitbleed.htmlIACUC.
Antibody Production in Rabbits. [citado en 2003]; 1 (1): [24 screens]. Disponible
en: http://iacuc.yale.edu/policies/rabbits.htmlMarton B y cols.
European Medical Agency. (7 de diciembre de 2013). Guideline on Adjuvants in Vaccines for
human use Unin Europea. Disponible
en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC5000
03809.pdf [pgina consultada el 7 de diciembre de 2013.]
Extraccin de sangre de mamferos y aves de laboratorio. Primer informe del grupo de trabajo
BVA/FRAME/ RSPCA/UFAW sobre refinamiento. Anim Lab 1998; 27: 1-22.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura. (2013). Tcnicas de
Inmunoprecipitacin. Argentina. Disponible
 Tcnico en farmacutico industrial cets 32 alumno Francisco Lozano Gmez

en http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/LaboratorioN5.pdf [pgina
consultada el 7 de diciembre de 2013.]
FUENTES, X. (1998). Bioqumica clnica y patologa molecular (Volumen 1). Espaa. Editorial
Revert (2 edicin). p. 321-323.
University of Kentucky Medical Center. Standard operating procedure IACUC 103. Rabbit blood
collection protocol. 98 Jun [citado en 2003]; 1 (1): [24 screens]. Disponible
en: http://www.mc.uky.edu/dlar/resources/sop/rabbleed.html
ROJAS, O. (2006). Inmunologa (de memoria). Mxico. Editorial Mdica Panamericana (3
edicin). p. 93, 97, 99, 100, 104, 110.
Sanabria V.; Landa A. (2007). Anticuerpos: sus propiedades, aplicaciones y perspectivas. Mxico
D.F. Mxico: Departamento de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de Medicina. Universidad
Nacional Autnoma de Mxico.
TELIJN, J. (2006). Fundamentos de bioqumica estructural. Espaa. Editorial Tbar (2
edicin). p. 164, 165.

Produccin de anticuerpos contra albmina humana en

conejo
Objetivos
Ensayar las tcnicas de inmunizacin con conejos, practicando algunos de los esquemas de
inmunizacin ya establecidos.
Efectuar la purificacin de gamma globulina por precipitacin con sulfato de amonio a una
saturacin final del 33%.
Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reaccin de precipitacin que ocurre cuando
un antgeno soluble interacciona con su anticuerpo homlogo.

Introduccin
El sistema inmunolgico tiene como funcin principal proteger al organismo de
agentes extraos, est integrado por diferentes rganos, tejidos, clulas y
molculas que funcionan coordinadamente. Sus componentes ms importantes
son: la piel y las mucosas, los rganos linfoides como las amgdalas, las
adenoides, el bazo, el timo, los ganglios linfticos; numerosas clulas leucocitarias
(linfocitos) y sus productos de secrecin como citocinas, quimiocinas e
inmunoglobulinas entre otros. Este sistema tiene tres propiedades esenciales:
primera, tiene la habilidad de reconocer sustancias extraas denominadas
antgenos principalmente provenientes de patgenos, tales como bacterias, virus,
hongos.

Los anticuerpos, tambin llamados inmunoglobulinas, son glucoprotenas

producidas por clulas especficas del sistema inmunitario en respuesta a una
proteina extraa o antgeno. Inmunoglobulinas, trmino introducido por vez
primera por J. F. Heremans en 1959 para referirse a aquellas globulinas que se
asocian al sistema linforreticular y que a menudo son referidas como anticuerpos
que son producidas por las clulas plasmticas. El descubrimiento de los
anticuerpos fue el resultado global de un cmulo de conocimientos derivados de
observaciones cientficas recabadas a lo largo de varios siglos, desde las vacunas
rudimentarias de la antigua civilizacin China (variolizacin), hasta la primera
estructura resuelta por Edelman y Porter (Sanabria y Landa; 2007).
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En general los anticuerpos, independientemente de su especificidad tienen una

estructura comn, consistente de cuatro cadenas polipeptdicas: dos cadenas
pesadas idnticas de 55-70 kDa denominadas con la letra H (del ingls heavy),
unidas covalentemente a un oligosacrido, y un par idntico de cadenas livianas
no glicosiladas de 24 kDa denominadas con la letra L (del ingls light). Un puente
disulfuro y otras uniones no covalentes unen las cadenas pesadas con las livianas.
Las cadenas pesadas tambin estn unidas entre s por al menos un puente
disulfuro, tal unin est localizada en una regin conocida como bisagra, regin
formada por aproximadamente 12 residuos de aminocidos que proporciona una
gran flexibilidad a la molcula, stos residuos estn expuestos a la ruptura qumica
y enzimtica.

Clases o Isotipos

Existen diferentes clases de anticuerpos, las cuales son determinadas por el tipo
de cadena pesada. Hay cinco tipos de cadenas pesadas, denotados por las letras
griegas y para cada una de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgD,
IgE e IgM, respectivamente. En estas clases pueden existir cadenas livianas ya
sea de tipo kappa ) o tipo lambda (). Los genes que codifican para las distintas
variantes isotpicas estn presentes en todos los individuos sanos, es decir, stos
poseen los genes para las cadenas pesadas denominadas 1, 2, 3, 4, , 1,
2 localizados en el brazo largo del cromosoma 14 y para las cadenas livianas
y, en los cromosomas 2 y 22, respectivamente.

Factores que intervienen en la reaccin antgeno-anticuerpo

La reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta

inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formacin de un precipitado o
aglutinacin de partculas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las
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macromolculas est dado por varias fuerzas dbiles que disminuyen con la
distancia, como los puentes de hidrgeno, las fuerzas de Van Der Waals, las
interacciones electrostticas y las hidrofbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una
reaccin de complementariedad, por lo que se efecta a travs de mltiples
enlaces no covalentes entre una parte del antgeno y los aminocidos del sitio de
unin del anticuerpo. La reaccin se caracteriza por su especficidad, rpidez,
espontaneidad y reversibilidad: (Bautista;2005)

Especficidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura
similar. La unin dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos
qumicos con diferencias mnimas.
Rapidez: la velocidad con que ocurre la primera etapa de la reaccin Ag-Ac es del orden de
milsimas de segundo, y est limitada nicamente por la difusin. La segunda etapa, que es ms
larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interaccin,
tales como precipitacin, aglutinacin, neutralizacin, etctera.
Espontaneidad: la reaccin Ag-Ac no requiere energa adicional para efectuarse y es factible
explicarla en trminos de la ley de accin de masas.
Reversibilidad: dado que la reaccin se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en
consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporcin de Ag-Ac, el pH y la
fuerza inica.

Metodologa
Medicin de albmina en suero
A)
-La concentracin inicial de albumina srica bovina era 22%, equivalente a 220 mg/mL
-De ah se tomaron 272 microlitros, que equivalen a 60 mg de albumina
-Se aforaron a 10 mL

B)
-Se tomaron 5 mL de stos 10 mL (=30 mg de albumina) y se aforaron a 10mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=15 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=7.5 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL
-De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=3.75 mg de albuina) y se aforaron a 10 mL

C)
-De esos 5 ml restantes se tom una alcuota de 1 mL (=6 mg de albumina)
-se le adicion a esa alcuota de 1ml, 5 mL de biuret. Volumen final= 6mL.
-Se ley en el espectro, la concentracin de albmina era de 6mg/6mL=1 mg/mL

D)
-Se repiti ste ltimo procedimiento C) para los matraces 2,3,4 y 5.

Obtencin del antgeno

1. Se extrajo sangre de tres individuos sanos en un tubo sin anticoagulante por venopuncin.
2. Se dej coagular durante una hora a temperatura ambiente.
3. Se centrifug a 3,000 rpm durante 15 minutos para obtener el suero.
4. Se extrajo la fraccin del suero y se calent a 60C durante 15 minutos para obtener coagular el
suero.
5. Se inocul en el conejo.
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Inoculaciones del conejo

Se hizo va subcutnea:
1. Se rasur el lomo del conejo.
2. Se introdujo la aguja de 22x32 mm punta verde en la dermis del conejo con el bisel hacia arriba.
Una vez dentro de la piel, se gir 180 y se deposit el inculo. En el sitio de la inoculacin se
observ la formacin de una ppula que das despus evolucion en costra.
El programa de inoculacin fue el siguiente:

Tabla 1. Programa de inoculacin de suero humano en el conejo por va subcutnea.

Da Fecha Cantidad inoculada Nmero de
(ml) puntos
0 31-oct-13 0.5 2
4 4-nov-13 1.0 4
7 7-nov-13 1.5 6
11 11-nov-13 2.0 8
14 14-nov-13 2.0 8
19 19-nov-13 VIA INTRAVENOSA**
21 21-nov-13 SANGRADO**
*Se administr por va intravenosa 3 das antes del sangrado para asegurarse que presentara alta
concentracin de anticuerpos. Se administraron 0.8 ml correspondientes a 54 mg de albmina
srica humana.
**El sangrado se obtuvo de la oreja del conejo en la vena central. Se obtuvieron 10 ml de sangre.

Precipitacin de gamma globulina con sulfato de amonio

1. Se ajust a 7.8 el pH de una solucin saturada de sulfato de amonio con NaOH 2N.
2. Se adicion un volumen de suero, contenido en un tubo cnico, medio volumen de la solucin
saturada de sulfato de amonio para dejar el sulfato de amonio a una concentracin final de 33%.
3. Se continu la agitacin por 10-15 minutos, despus de terminada la adicin de sulfato de amonio.
4. Se centrifug a temperatura ambiente a 3,500 rpm por 15 minutos.
5. Se disolvi el sedimento en solucin salina a pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero.
6. Se repitieron los pasos 2-5 y posteriomente los pasos 2-4.
7. Se disolvi en SSRB el sedimento despus de la ltima centrifugacin hasta alcanzar la mitad o un
tercio del volumen original del suero.
8. Se dializ contra SSRB en fro a 4C y agitacin durante 3-5 das, realizando dos cambios diarios
de la solucin de dilisis hasta eliminar completamente el sulfato de amonio.
9. Se transfiri la gamma-globulian dializada a un tubo y se centrifug en fro a 2,500 rpm durante 10
minutos para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
10. Se determin la concentracin de protenas por espectrofotometra.

Precipitacin en capilar
1. Se hicieron una serie de diluciones dobles de antgeno en tubos eppendorf de la siguiente manera:
se depositaron 0.2 ml de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo se agregaron 0.2 ml de la
solucin concentrada de antgeno y se mezcl. De ste tubo se tomaron 0.2 ml y se transfirieron al
siguiente tubo. Se repiti el procedimiento hasta el tubo 10.
2. Se llen un tubo capilar con antisuero hasta la primer marca y se limpi el exterior del tubo con
papel absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas.
3. Se invirti el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario.
4. Se tom un volumen de antgeno de tal manera que el volumen en el capilar llegara hasta 2/3
partes.
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5. Se mezcl el contenido por movimientos de rotacin e inversin repetidos del capilar. Se centr el
contenido del capilar y tap uno de los extremos del mismo con el dedo ndice y se introdujo el
extremo contrario en una gradilla de plastilina.
6. Se utilizacin como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero ms solucin salina y otro
conteniendo antgeno sin diluir ms solucin salina.
7. Se mantuvieron los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

Reacciones de Precipitacin en medio semislido

1. Se agreg una muestra de 50 l del antisuero al pozo central de un gel comercial, y se tomaron 10
l del antgeno en sus diferentes diluciones, as como dos muestras de antgeno diferentes.
2. Se dej reaccionar durante 48 h en condiciones de refrigeracin.

Resultados y discusin
Antgeno

Figura 2. Curva tipo obtenida por el mtodo del reactivo de Bradford para determinacin
de protenas en suero. La medicin de absorbancia obtenida fue de 0.042 que
corresponde a 0.1142 mg/ml y que multiplicada por el factor de dilucin 6,000 da una
concentracin en suero de 68.5 mg/ml, valor que se ajusta a lo esperado para albmina
humana.

La medicin directa de las diluciones en suero dio una concentracin de C=(Abs-0.0131)/0.2531 = (0.042-
0.0131)/0.25310=0.1142 mg de albmina/ mL

Pero sta medicin tiene la siguientes diluciones:

iii) la diluy 6 veces
ii) La diluy 0 veces
i) La diluy 100 veces
Lo que nos da un factor de dilucin de 6,000 veces, lo que nos deja una concentracin inicial real en suero de
68.51 mg/mL,

COMPROBACIN

-Se tienen 68.51 mg/mL, se toman 100 microlitros, osea 6.85 mg de albumina
-Se aforan esos 6.85 mg de albumina a 10 ml
-Se toman 1 mL de alcuota, osea 0.685 mg
-Se adicionan 5 ml de biuret, lo que nos deja una concentracin de 0.685 mg/6mL=0.1142 mg/mL

Para la cuantificacin de las protenas sricas presente en el suero, se emple la reaccin de

Biuret debido a que al estar constituida por sulfato de cobre en una solucin alcalina (ya sea
hidrxido de sodio o hidrxido de potasio) van a formar un complejo entre los iones Cu 2+ y los
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electrones no ocupados del nitrgeno que se encuentran presentes en los enlaces peptdicos (en
este caso la albumina humana es una protena), el resultado de lo anterior es la formacin de una
coloracin violeta. Presentan su mxima absorcin a 540nm (UNLP, n/a).

Figura 3. Reaccin de Biuret, observndose la formacin del complejo entre el Cu2+ y los
electrones del nitrgeno.

La inmunogenicidad es la medida de antigenicidad de un material y est en funcin de la zona de

administracin y de la especie que es inmunizada (Rojas 2006).

Las protenas y carbohidratos al poseer estructuras qumicas complejas presentan un mayor grado de
inmunogenicidad (salvo ciertas excepciones) en comparacin con los polisacridos, lpidos y cidos
nucleicos. As mismo las molculas de composicin mixta (por ejemplo: las glicoprotenas, nucleoprotenas,
glicolpidos, lipopolisacridos y las lipoprotenas) son ms inmungenas que sus componentes individuales.
Tambin si los compuestos presentan estructura terciara o cuaternaria presentarn mayor inmunogenicidad
(Rojas 2006).

Las molculas que presentan pesos moleculares superiores a los 100kD son ms inmunognicas que aquellas
con pesos moleculares inferiores a los 20kD (Rojas 2006).

Adems Rojas (2006) menciona que los antgenos solubles son menos inminognicos que los particulados,
por lo que en el caso de los antgenos solubles es necesario emplear un adyuvante para incrementar su
inmunogenicidad debido a:

- Concentracin de la cantidad de antgeno administrado (por las micelas formadas).

- Retienen por ms tiempo al antgeno en el lugar de inoculacin, prolongando el tiempo de

estimulacin.

- Una vez que el antgeno ha sido particulado se presenta con mayor facilidad su captula por las
clulas fagocitarias procesadoras y presentadoras de antgeno.

Un adyuvante es aquella sustancia o conjunto de sustancias heterogneas e inespecficas que permiten

potenciar la respuesta inmune. Se caracterizan por contar con tres mecanismos de reaccin (Asociacin
Espaola de Vacunologa, 2013):

a) Formacin de un depsito con liberacin gradual del antgeno adsorbido, aumentando una mayor
interaccin CPA-antgeno. En modelos animales de monos, se ha podido recuperar aluminio hasta seis meses
despus de la administracin del mismo.

b) Presentacin de los antgenos de una manera multivalente particulada, que permite una internalizacin ms
eficiente por parte de las CPA.
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c) Activacin del complemento y la formacin de un ambiente inflamatorio en el lugar de la inyeccin.

d) No activan directamente los TLR (Toll-like receptors, receptores de los macrfagos que al reconocer
estructuras, generalmente de origen infeccioso, forman parte importante de la respuesta del sistema
inmunitario innato), pero facilitan la maduracin de los mismos,

i. citoquinas pro-inflamatorias.

ii. la expresin MHC clase II CD86

iii. CD14.

Para la eleccin de un adyuvante se toman en cuenta las siguientes caractersticas: composicin

qumica, caractersticas fsicas (dureza, pH, densidad, viscosidad, tamao de partcula y carga),
caractersticas bioqumicas, pureza, va de administracin, adems de la patologa o naturaleza del antgeno
(European Medicines Agency, 2013). Sin embargo, en esta experimentacin, no se utiliz adyuvante porque
como la va de administracin fue subcutnea y en esa va se asegura que el antgeno es retenido por ms
tiempo.

Con base a la informacin anterior, la albmina humana es poco inmunognica, ya que a pesar de que es una
protena (que es estable, de carcter cido y no cuenta con carbohidratos) es soluble y su peso molecular es de
66kD (Telijn, 2006) adems de que pudo haber generado tolerancia; por lo que para el desarrollo de la
prctica era necesario emplear un adyuvante (como el Freund completo o incompleto) para aumentar la
inmunogenicidad de la albmina.

Manejo de conejos
En primera instancia, se trat el aspecto del manejo adecuado de los animales. Si un procedimiento produce
dolor o estrs en los animales de laboratorio, las normas internacionales urgen a los usuarios a buscar nuevas
alternativas (Lobato-Garca, 2009). Tomando en cuenta esta recomendacin, se decidi establecer protocolos
de inmunizacin y prcticas de laboratorio que disminuyeran el sufrimiento del conejo utilizado.
Bsicamente, los esfuerzos se orientaron a disminuir el estrs del animal durante la obtencin de la muestra de
sangre y durante su inmunizacin. Para ello, se utiliz lidocana en pomada 15 minutos antes de cada puncin
y una zanahoria para ayudar a reducir el estrs.

Inmunizacin
Una vez capacitados en el manejo de los conejos, se inici la discusin sobre la mejor va de
inmunizacin con los antgenos. La inmunizacin puede realizarse a travs de la va oral, nasal,
intramuscular, intravenosa, intracardaca, subcutnea, intradrmica, intraperitoneal, etc. La
eleccin de la va depende, entre otras cosas, de la especie animal que se utilice y de las
caractersticas del antgeno. Originalmente se planeaba hacerlo por va intravenosa.

Esta va proporciona un contacto inmediato y directo del antgeno con las clulas inmunes; sin
embargo, la inoculacin del antgeno a travs de esta va requiere de amplia experiencia en la
canalizacin de venas o arterias. Dado que los protocolos de inmunizacin establecan
inoculaciones peridicas con los antgenos, el posible fallo de la inoculacin por va intravenosa
podra constituir una limitante para la estimulacin de una adecuada respuesta inmune. En este
sentido, la inoculacin de los antgenos por va intravenosa no es muy adecuada para los fines
didcticos que se persiguen con la produccin de anticuerpos. Sin embargo, esta va podra
utilizarse exitosamente si fuera precedida de un curso sobre toma de muestras en animales de
laboratorio.

Por otra parte, la va subcutnea es utilizada frecuentemente para la inmunizacin de antgenos

solubles como la albmina srica humana, por lo tanto se decidi utilizar esta va para la
inoculacin de estos antgenos. Para disminuir una reaccin local severa y abarcar una mayor
superficie de absorcin, cada dosis de antgeno fue distribuida en diferentes sitios (mximo ocho) a
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lo largo del dorso torcico y lumbar. La inmunizacin subcutnea de los antgenos estimul una
fuerte respuesta de produccin de anticuerpos como se demostr en la pruebas de precipitacin.
En ambos conejos, los inmunizados con suero o los inmunizados con albmina, se present una
reaccin inflamatoria que llev a la formacin de una costra en la zona de inoculacin, que
finalmente se descam sin dejar ninguna lesin posterior. La formacin de esta lesin podra estar
relacionada con el volumen de la dosis de antgeno inoculada. Sera interesante desarrollar nuevos
protocolos para determinar el volumen mnimo necesario para una adecuada produccin de
anticuerpos sin que se produzcan lesiones importantes. Durante el desarrollo del protocolo de
inmunizacin el conejo no present fiebre o alteracin de su estado general de salud.

Figura 4. Sitio de inmunizacin por va subcutnea del conejo. Se muestran dos costras y
algunas ppulas formadas despus de la inmunizacin. Imagen del da 11.

Pruebas
Se obtuvo una concentracin de protenas totales en el concentrado de suero de conejo dializado
de 0.818 mg/ml, alrededor de 80 veces menor que en suero humano sin dializar. La absorbancia
obtenida fue de 0.020 a 540 nm por la tcnica de reactivo de Biuret. Se disolvieron 100 L de
solucin de anticuerpos, 400 L de solucin salina y 2.5 ml de reactivo de Biuret. Factor de
dilucin: 30.

Veintin das despus de la primera inoculacin, los animales fueron sangrados siguiendo el
protocolo previamente establecido. La formacin de un precipitado abundante entre el antgeno y
su anticuerpo depende de que las concentraciones de ambos sean equivalentes (zona de
equivalencia); el exceso de alguno de stos disminuye e incluso inhibe la formacin del precipitado.
Con objeto de determinar la zona de equivalencia del antisuero contra albmina, se realiz una
serie de diluciones dobles de la albmina como se indica en la tabla (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64,
1:128, 1:256, 1:512, 1:1024). En este caso la concentracin del anticuerpo permaneci constante.
Como se esperaba, concentraciones muy bajas o muy altas del antgeno inhibieron la formacin
del complejo antgeno-anticuerpo (extremos de la curva). La zona de equivalencia para el
anticuerpo anti-albmina se present entre las diluciones 1:4 y 1:8 del antgeno (zona central de la
curva). Este resultado demostr que el protocolo de inmunizacin establecido fue adecuado para la
produccin de anticuerpos contra esta protena.
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Figura 5. Izquierda: agitacin y mezclado del capilar que contienen antgeno y anticuerpo.
Derecha: Puncin en gradilla de plastilina para posterior almacenaje hasta observar la
presencia de precipitado.

Figura 6. Tubos 1-10 y los controles A y Ao. A=antisuero + solucin salina. Ao=Antgeno
sin diluir + solucin salina.
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Figura 7. Resultados de precipitacin capilar a las 36 horas. Se observa slo precipitacin

en los tubos 1-4. Los tubos 5-10 se observan algo turbios pero sin precipitado. Los dos
controles, A y Ao no presentan precipitados ni turbidez.

Figura 8. Resultados de precipitacin capilar a las 48 horas. Se observaron precipitados

en todos los tubos. Los tubos control siguieron sin mostrar precipitados o turbidez.
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Figura 9. Resultados de precipitacin capilar de los tubos 1-6 a las 60 horas. Todos ellos
presentan precipitado.

Tabla 2. Resultados de precipitacin capilar en los tubos 1-10 y controles con las
diluciones indicadas a las 48 horas de estar en reposo.
Tubo Dilucin Precipitado
(+)
1 1:2 +++
2 1:4 ++++
3 1:8 +++++
4 1:16 ++++
5 1:32 +++
6 1:64 ++
7 1:128 ++
8 1:256 +
9 1:512 -
10 1:1024 -
A Testigo suero -
Ao Testigo -
antgeno
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Figura 10. Se muestra el grado de formacin de precipitado para cada tubo a las 48 horas
basado en la tabla anterior. El tubo con mayor reaccin de precipitacin fue el tubo 3.

En la realizacin de esta prueba se observan 2 zonas formadas respecto a la concentracin del

antgeno empleado (suero humano): en la primera ocurre un incremento de la formacin del
precipitado conforme se va reduciendo la concentracin del antgeno; la otra zona comienza
despus de la tercera dilucin (1:8) la cantidad de precipitado disminuye hasta llegar a un punto
(dilucin 1:512) en donde ya no hay precipitado.
Lo anterior se puede adecuar a la curva de inmunoprecipitacin (Ver figura 11) donde ocurre lo
mencionado previamente, adems se observa que hay una zona intermedia (en donde el
aumento/descenso del precipitado se da en una proporcin menor).

Para la primera etapa (Ver figura 10, inciso c) como lo menciona Fuentes (1998) al haber mayor
cantidad de antgeno los 2 centros de unin estn ocupados, mientras que en el caso de los
antgenos presentes sus eptopos no estn totalmente ocupados, por lo que no hay una formacin
de complejos grandes, haciendo que solamente hayan complejos pequeos y que sean solubles.
Conforme la concentracin del antgeno se va disminuyendo los eptopos se van combinando con
las zonas libres de los anticuerpos hasta ocupar las 2 zonas de unin de estos, con lo anterior se
forman inmunocomplejos grandes e insolubles formando los precipitados. A esta zona se le
denomina la zona de equivalencia (Ver figura 10, inciso b). En esta prueba se observa que en el
tubo 3 hay mayor precipitado, por lo que correspondera a esta zona. Para los tubos 1 y 2 si bien
hay inmunoprecipitado la cantida es menor por lo mencionado anteriormente (formacin de
pequeos complejos solubles).

Al seguir disminuyendo la concentracin del antgeno, estos se van a ir reduciendo, por lo que
varios anticuerpos se unirn en los diferentes eptopos, formando complejos solubles y de esa
manera se reduce la formacin del inmunoprecipitado (como en los tubos 9 y 10) (Fuentes, 1998).
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Figura 11. Reacciones entre una concentracin fija de anticuerpos y concentraciones

crecientes de antgeno en la prueba de inmunoprecipitacin (Fuentes, 1998).

Figura 12. Curva de la formacin del inmunoprecipitado en funcin de la concentracin de

antgeno (Fuentes, 1998).

Inmunodifusin
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Cuando al difundir por el gel el antgeno y el anticuerpo contactan, forman inmunocomplejos

estables, producindose una lnea de precipitacin que puede observarse a simple vista. La
formacin de una lnea de precipitacin indica una sola reaccin antgeno-anticuerpo, estando el
grosor de la lnea en relacin con la cantidad de antgeno presente en la precipitacin. Cuando la
lnea de precipitacin se cierra y se acerca al pocillo del anticuerpo, ello significa un exceso de
antgeno, mientras que cuando ocurre lo contrario se trata de un exceso de anticuerpo. En algunos
casos, si el exceso de uno de los dos es muy importante, la banda de precipitacin no llega a
formarse (Fuentes, et al, 1998).

Se nota en la Figura 13, que efectivamente se presentaron lneas de inmunoprecipitacin

(circunferencia ms opaca), para las diluciones 1:2 (a), 1:4 (b), 1.8 (c), as como para 1:128 (d),
1:256 (e) y 1:512 (f). Tambin se realiz la prueba con dos antgenos utilizados (R) y (E). Se
observa que a concentraciones iniciales se presentan varias bandas (lnea naranja).

Figura 13. Resultados de la prueba de inmunodifusin. Se inoculo al animal con el

antgeno.

Adems se observ que ms bandas aparecieron con el antgeno que ms se us para inocular,
posiblemente el anticuerpo reconoci un eptopo caracterstico de esta muestra. Mientras que el
antgeno que se us una vez no presento alguna banda, esto fue por dos causas: se present el
fenmeno de prozona (Exceso de antgeno) o la muestra estaba concentrada (postzona).

Al comparar los resultados con la teora se observa que (comparando con la Figura 14):

Figura 14. Patrones de precipitacin de la doble inmunodifusin A y B son los antgenos y

S son los anticuerpos.
 Tcnico en farmacutico industrial cets 32 alumno Francisco Lozano Gmez

En la Figura 14y 13, se nota que en el primer caso (superior izquierdo) se produjo un anticuerpo
para slo un tipo de antgeno, y no se cruzan las bandas; mientras que cuando se promueve la
formacin de un anticuerpo con ms de dos antgenos se observa bandas compartidas es decir
una respuesta cruzada y finalmente la figura de abajo, es el mismo tipo de antgeno solo con
determinante diferente se observa un ligero cruce. En esta corrida experimental se observ el
primer tipo. Lo cual corrobora que las albminas humanas son muy parecidas entre individuos
diferentes de la misma especie.

Para tener una mayor confiabilidad es recomendable cuantificar y estandarizar la concentracin de

los anticuerpos, por ejemplo la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura establece
que la sensibilidad del ensayo de inmunodifusin doble es de 20 1 200 g/ml.

Conclusiones
Si hubo presencia de anticuerpos contra albmina srica humana como demostr la precipitacin
en capilar.
La dilucin 1:8 fue la que present mejor precipitacin a las 36 y 48 horas.
Se necesita de un control de muestra de sangre del conejo antes de las inmunizaciones para
corroborar que no tena anticuerpos antes y que fueron producto de los protocolos de
inmunizacin.
La concentracin de protenas en suero humano que se administr al conejo fue de 68 mg/ml y se
le administr en dosis crecientes de 0.5 ml hasta 2 ml para un total de cinco inmunizaciones
subcutneas con mximo 8 puntos.
Con la reaccin de inmunoprecipitacin se comprob que el anticuerpo producido por el conejo es
til para el antgeno administrado (suero albmina humana).
En la prueba de inmunoprecipitacin se observ la zona de equivalencia (relacin entre las
concentraciones de antgeno y anticuerpo para formar inmunocomplejos insolubles) en la dilucin
de albmina srica humana de 1:8.
La prueba de inmunodifusin doble fue positiva y se comprob la identidad del anticuerpo a las
concentraciones de 1:2, 1:4 y 1:8.
Es recomendable estandarizar la concentracin del antisuero para poder aceptar por completo el
ensayo de inmunoprecipitacin.

Bibliografa
Asociacin Espaola de Vacunologa. (7 de diciembre de 2013). Fundamento de los Adyuvantes
y nuevas perspectivas y usos. Espaa. Disponible en: http://www.vacunas.org/es/info-
profesionales/temas-del-mes/tm-anteriores/114969-fundamento-de-los-adyuvantes-y-nuevas-
perspectivas-y-usos [pgina consultada el 7 de diciembre de 2013.]
Bautista JJ.(2005). Factores que intervienen en la reaccin antgeno-anticuerpo.
Bledding and immunization techniques for polyclonal antibody production. [Citado en 2003].
Disponible
en: http://www.molbio.princeton.edu/facility/restricted/viv_restricted/rabbitbleed.htmlIACUC.
Antibody Production in Rabbits. [citado en 2003]; 1 (1): [24 screens]. Disponible
en: http://iacuc.yale.edu/policies/rabbits.htmlMarton B y cols.
European Medical Agency. (7 de diciembre de 2013). Guideline on Adjuvants in Vaccines for
human use Unin Europea. Disponible
en: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC5000
03809.pdf [pgina consultada el 7 de diciembre de 2013.]
Extraccin de sangre de mamferos y aves de laboratorio. Primer informe del grupo de trabajo
BVA/FRAME/ RSPCA/UFAW sobre refinamiento. Anim Lab 1998; 27: 1-22.
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura. (2013). Tcnicas de
Inmunoprecipitacin. Argentina. Disponible
 Tcnico en farmacutico industrial cets 32 alumno Francisco Lozano Gmez

en http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/LaboratorioN5.pdf [pgina
consultada el 7 de diciembre de 2013.]
FUENTES, X. (1998). Bioqumica clnica y patologa molecular (Volumen 1). Espaa. Editorial
Revert (2 edicin). p. 321-323.
University of Kentucky Medical Center. Standard operating procedure IACUC 103. Rabbit blood
collection protocol. 98 Jun [citado en 2003]; 1 (1): [24 screens]. Disponible
en: http://www.mc.uky.edu/dlar/resources/sop/rabbleed.html
ROJAS, O. (2006). Inmunologa (de memoria). Mxico. Editorial Mdica Panamericana (3
edicin). p. 93, 97, 99, 100, 104, 110.
Sanabria V.; Landa A. (2007). Anticuerpos: sus propiedades, aplicaciones y perspectivas. Mxico
D.F. Mxico: Departamento de Microbiologa y Parasitologa. Facultad de Medicina. Universidad
Nacional Autnoma de Mxico.
TELIJN, J. (2006). Fundamentos de bioqumica estructural. Espaa. Editorial Tbar (2
edicin). p. 164, 165.