Semislidos: Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar

suele ser inferior al 5% pero siempre suelen presentar una cierta cantidad que
le proporcione una consistencia semislida. Son tiles para ciertas pruebas
bioqumicas, por ejemplo la prueba de oxidacin-fermentacin, que permite
conocer el tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo de la bacteria
problema.
Lquidos: Corresponden a los que tambin se denominan caldos, no contienen
agar y su composicin, adems de agua, suele contener al menos una fuente
de carbono, sales minerales, sales minerales y, en algunas ocasiones segn
las caractersticas del medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas,
ciertos aminocidos, etc. Son de gran utilidad para la realizacin de mltiples
pruebas bioqumicas, para la identificacin de bacterias, para la realizacin de
recuentos bacteriolgicos por turbidimetria, etc.
Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:

Cambio de pH: por ejemplo, agregando cido actico para favorecer el

crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil para la mayora de las
especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S.
faecalis a pH 9,6.
Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece ptimamente entre 20
C y 40 C. Los cultivos tpicos de S. Faecalis requieren 60 C de temperatura y los
de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4 C.
Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas un medio con
el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la seleccin de
bacterias halfilas como Staphylococcus spp. (7,5%).
Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de aerobios y
anaerobios.
Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos importantes
pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensin ms all de la atmosfrica.

1. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la
preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso
alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin.

Agua destilada o des ionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.

 Preparacin de Cultivos

Agar: El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios
de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que
acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas.
Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los
98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los
42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser
slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos
microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para
preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar
movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %.
Extractos: Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o
vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y
calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo.
Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la
confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de
malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee
sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de
levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono.
Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y
sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por
digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne,
gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y
aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales.
Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos.
Fluidos Corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el
cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por
tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano.
Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento,
sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de
algunas bacterias.
Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio
de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento
bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo
para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos

II
 Preparacin de Cultivos

bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una

desviacin del pH.
Indicadores de pH: Indicadores cido- base se aaden a menudo a los
medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.
Agentes reductores: Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores
que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el
desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios.
Agentes selectivos: La adicin de determinadas sustancias al medio de
cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los
medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, acida sdica,
telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIALES
o Probetas o Pabilo
o Erlenmeyer o Tijeras
o Tubos de ensayo o Gradilla
o Esptulas o Mechero bunsen
o Algodn o Encendedor
o Alcohol 70 o Bombillas
o Guantes asbesto o Pipetas
o Papel kraft o NaOH 0.1N y KCl .1N

MEDIOS DE CULTIVOS DESHIDRATADOS

o Caldo nutritivo
o Caldo BHI
o Agar plate count (APC)
o Agua peptonada (AP)

EQUIPOS
o Refrigeradora
o Autoclave
o Balanza analtica
o Hornilla elctrica

III
 Preparacin de Cultivos

Preparacin y esterilizacin de material de vidrio

Lavar material con detergente lquido, enjuagar con abundante agua de la llave
y al final con agua destilada.
Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al
aire.
Introducir los hisopos en un tubo de y tapar con algodn.
En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las
pipetas.
Introducir el material en un horno previamente calentado a 180C, esperar a
que la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar
el tiempo de esterilizacin (1 hora).

METODOLOGIA

PREPARACION DE MEDIOS DDE CULTIVO

Agar plate count (APC). (22.5 gr/l)

Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

Pesar 6.75 gr de APC y en un Erlenmeyer disolver con 300ml de agua
destilada.
Tapar el matraz con algodn y calentar en un Erlenmeyer de 500ml hasta
disolver totalmente, para ello agitar repetidamente y evitar que el medio de
cultivo hierva y se derrame.
Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego taparlo
con papel Kraft, ajustar bien con pabilo.
Llevar a la autoclave (121 por 15).
Dejar enfriar y cuando este a temperatura ambiente colocar a la refrigeradora
(4).

Agua peptonada (AP). (1gr/l)

Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

Pesar 0.15gr de AP y en un Erlenmeyer de 250 ml disolver con 150ml de agua
destilada, si es necesario calentar. Medir pH.
Tapar el matraz con algodn y calentar hasta disolucin total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.

IV
 Preparacin de Cultivos

Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego

repartir a los tubos de ensayo y a un Erlenmeyer de 250ml

- 90ml de AP en un matraz de 250ml

- 9ml de AP en 5 tubos de ensayo

Tapar matraz y tubos con tapn o algodn.

Colocar el material en una canastilla y llevar a autoclavar (121 por 15) luego
enfriar y conservar en la refrigeradora a (4).

Caldo nutritivo (CN). (8gr/l)

Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

Pesar 1.04gr del CN y disolverlo en un Erlenmeyer con 130ml agua destilada.
Medir pH.
Tapar el matraz con algodn y calentar hasta disolucin total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego
repartir a los tubos de ensayo.

- 10ml de CN en 12 tubos de ensayo.

Colocar el material en una canastilla y autoclavar (121 por 15) enfriar y

conservar en la refrigeradora a (4).

Caldo BHI. (37gr/l)

Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

Pesar 4.81gr del medio BHI y disolverlo en un Erlenmeyer con 130ml agua
destilada. Medir pH.
Tapar el matraz con algodn y calentar hasta disolucin total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego
repartir a los tubos de ensayo.

- 10ml del caldo BHI en 12 tubos de ensayo.

Colocar el material en una canastilla y autoclavar (121 por 15) enfriar y

conservar en la refrigeradora a (4).

V
 Preparacin de Cultivos

DISCUSIONES DE RESULTADOS

CONCLUSIONES
Por medio de esta prctica se aprendi la tcnica empleada para la
preparacin de medios de cultivo, as como la seleccin apropiada para el uso
que se les dar posteriormente.
De la misma manera se observ que de acuerdo al tipo de bacteria que se
requiera sembrar, ser el tipo de medio de cultivo.
Se aplic la tcnica de esterilizacin de vapor a presin (autoclave), para
medios de cultivo en agar y caldo nutritivo.
Se conoci el mtodo de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los
medios de cultivo.

RECOMENDACIONES

Observar cuidadosamente los materiales, no usar materiales rajados porque se

puede romper al momento de calentar.
Enfriar a 50C-60C, ya que el agar hirviendo es peligroso de manejar, puede
rajar el vidrio fro y dar lugar a condensaciones excesivas.
El agua que se utiliza para su mezclado o reconstitucin debe ser destilada o
desmineralizada.
Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar
agitar repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el
fondo del matraz y que se queme. Asimismo, evitar que hierva para evitar su
derrame.
Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de
verter los medios de cultivo en ellos.
Los cestos o las latas metlicas deben estar debidamente forradas con papel
kraft.
Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de
contaminantes.

Al momento de manipular las muestras de bacterias se debe realizar con

mucho cuidado ya que en algunas podra existir bacterias patgenas.

VI
 Preparacin de Cultivos

FUENTES DE INFORMACION

Manual de laboratorio Microbiologa. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniera.

Laboratorio de Microbiologia.2001.
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
Preparacin de medios de cultivo. Universidad Tecnolgica Nacional. Facultad de
Ingeniera Qumica. Catedra de Biotecnologa. 2009
Diagnostico Microbiolgico. Forbes. Sahm. Weissfeld. Editorial Medica Panamericana.

VII
 Preparacin de Cultivos

ANEXO

VIII
 Preparacin de Cultivos

APENDICE
Diagrama de flujo
Disolver la cantidad
adecuada de medio
con 100 ml de agua
destilada en un
matraz.

Dos tipos de medio.

Si el medio es
Si el medio es
lquido solo se
slido al momento
mezcla con agua y
de calentar no se
se vierte en tubos.
olvide de agitar
hasta que se
disuelva.

Se sella con tapa o

algodn los tubos y
matraces, luego se
proceder a colocar en
la autoclave por 15
minutos a una Retirar de la
temperatura de 121c. autoclave y
dejar enfriar.

En el caso del medio

solido se tiene que
verter a las placas
Petri antes de que
solidifique con todas
las condiciones de
asepsia para que no
se contamine.

Las placas y los

tubos estn listos
para sembrar.

IX
 Preparacin de Cultivos

Procedimiento calculo

Agar plate count (APC): (22.5 gr/l)

Suspender 6.75 g del polvo en 0.3 l de agua purificada. Mezcla a fondo.

Calentar con agitacin frecuente y hervir durante hasta disolver completamente el
polvo. Llevar a la autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Agua peptonada (AP): (1gr/l)

Suspender 0.15g de polvo en 0.15 litro de agua purificada. Mezclar calentando hasta
la ebullicin. Distribuir en recipientes apropiados. Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.

Caldo nutritivo (CN): (8gr/l)

Emplear 1.04 g de polvo por 0.13 litro de agua destilada. Si es necesario, calentar
hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos.

Caldo BHI: (37gr/l)

Mezclar 4.8 g del polvo en 0.13 L de agua purificada. Mezcla bien.
Caliente agitando frecuentemente hasta disolver completamente el polvo.
Autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Datos calculados

Pesar 6.75 gr de APC

22,5 g del polvo en 1 l de agua purificada
6.75 g ---------------0.3 l de agua purificada <> 300 ml de agua purificada

Pesar 0.15gr de AP
15g de polvo en 1 litro de agua purificada
0.15g ---------- 0.01litro de agua purificada <> 10 ml de agua purificada.

Pesar 1.04gr del CN

8 g de polvo por 1 litro de agua destilada.

X
 Preparacin de Cultivos

1.04gr------------- 0.13 litro de agua destilada <> 130ml de agua destilada.

Pesar 4.81gr del medio BHI

37 g del polvo de BHI en 1 L de agua purificada
4.81gr ------------------- 0.13 litro de agua destilada <> 130ml de agua destilada.

XI